HU199494B

HU199494B - Process for producing new saccharides and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU199494B
Application number: HU862535A
Authority: HU
Inventors: Ingolf Macher; Frank M Unger; Christian R Raetz
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1985-06-28
Filing date: 1986-06-16
Publication date: 1990-02-28
Also published as: GB2179945A; FR2584076A1; PL151094B1; WO1987000174A2; IL79247A0; PT82855B; DE3621122A1; FI862723A0; KR870000351A; PT82855A; CH672789A5; ES2000205A6; IT8648204A0; AU596800B2; WO1987000174A3; IT1203816B; GB2179945B; PL151036B1; SE8602854D0; LU86491A1

Description

A találmány tárgya eljárás új szacharidok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány az (1) általános képletű új vegyületek és bázisokkal alkotott sóik elő- 5 állítására vonatkozik; a képletben

R,, Rj, R₃ és R₄14 szénatomos alkanoilcsoport, amely adott esetben hidroxilcsoporttal vagy 14 szénatomos alkanoiloxicsoporttal monoszubsztituált, 10

W, X, Y és Z egymástól függetlenül oxigénatom vagy iminocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Z és X iminocsoport és W és Y oxigénatom, akkor R,, R₂, R₃és R₄ jelentése más, mint azonosan (R)-3- 15

-hidroxi-tetradekanoilcsoport.

A találmány szerint az (I) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy egy (11) általános képletű vegyületet — a képletben R₃, R₄, W és Z a fenti jelentésűek, és 20 U uridilcsoport — enzimatikusan kondenzálunk egy (III) általános képletű vegyülettel — a képletben X és Y a fenti jelentésűek,

R”, és R”₂ jelentése azonos R, és R₂ fenti jelentésével —, és a kapott vegyületet szabad 25 alakban vagy bázissal alkotott sójaként izoláljuk.

Az enzimatikus kondenzációt pufferolt rendszerben, például 7 pH-értékű trisz-pufferben végezzük. A reakciót végezhetjük szó- 30 bahőfokon vagy magasabb, például 30°C hőmérsékleten. Enzim-extraktumként Gram-negativ baktériumokból, például E.coli törzsekből előállított készítményt, előnyösen lipid-A-szintázt használhatunk [Raetz, J. Bioi. Chem. 35 259 4852 (1984)]. Előnyösek azok a törzsek, amelyeknél genetikai manipulációval a szükséges enzim fokozott termelését idéztük elő.

A találmány szerinti eljárással előállított termékeket a reakciókeverékből izoláljuk és 40 kívánt esetben ismert eljárások szerint tisztítjuk.

Az (I) általános képletű vegyületek előfordulhatnak szabad formában vagy — ahol ez célszerű — só formájában. A vegyületek kiszabad formái a szokásos módon sóformákká alakíthatók és fordítva.

A 3-helyzetű szénatom konfigurációja (R) vagy (S) lehet. így R,, R_2> R₃ és R₄ az (I) általános képletű vegyületben jelen lehetnek a 50 királis, (R), (S) vagy racémformában.

Ugyanez vonatkozik a (II), (Hl) és (IV) általános képletű vegyületekre is. A konfiguráció a találmány szerinti eljárás alatt változatlan marad, vagyis ha egy (R), (S) vagy ra- 55 cém formájú vegyületet használunk kiindulási anyagként, akkor a megfelelő (R), (S), illetve racém végterméket kapjuk.

Az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen bázisokkal képzett sók alakjában ál- __ Htjuk elő. A vegyületek vízoldhatóságának növelésére előnyösen hidrofil bázisos vegyületeket, például trisz (hidroxi-metil )-amino-metánt vagy L-lizint használunk.

A (II) általános képletű vegyületeket ismert módon előállíthatjuk úgy, hogy egy (III) 65 2 általános képletű vegyületet aktivált uridin· -5’-monofoszfáttaI reagáltatunk.

Újak azok a (III) általános képletű vegyületek, amelyek képletében:

a) Y oxigénatom és X iminocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha R|” (R)-3-hidroxi-tetradekanoilcsoport, akkor R₂” más, mint (R)-3-hidroxi-tetradekanoilcsoport,

b) Y iminocsoport és X oxigénatom,

A (III) általános képletű kiindulási vegyületeket a kővetkező eljárásokkal állíthatjuk elő:

a) A (Illa) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R,” és R₂” a fenti jelentésűek és X’ vagy Y’ oxigénatom vagy Y’ iminocsoport és X’ oxigénatom, egy (IV) általános képletű vegyületben — a képletben R,” és R₂” és Y’ a fenti jelentésűek és R védőcsoport — a nem védett hidroxilcsoportot védett foszfát-észtercsoporttá alakítjuk; vagy

b) a (Illb) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R,” és R₂” a fenti jelentésűek, egy megfelelő (lile) általános képletű vegyületet — a képletben R₂” és R a fenti jelentésűek és R’ védőcsoport — acilezünk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk.

Az a) szerinti eljárást végezhetjük úgy, hogy a (IV) általános képletű vegyületet iners oldószerben, például ciklusos éterben, így tetrahidrofuránban feloldjuk és alacsony hőmérsékleten, például —70°C-on, alifás szénhidrogénben, így hexánban butil-litiummal reagáltatjuk, majd dibenzil-foszfor-kloridátot adunk hozzá. A terméket a reakciókeverékből eltávolítjuk és kívánt esetben ismert módon tisztítjuk. A foszfátcsoport szabad hidroxicsoportjait például benzilcsoporttal megvédjük. A védőcsoportok lehasítását ugyancsak ismert módon végezzük. így például egy védőcsoportot lehasíthatjuk a szokásos módon savas körülmények között, például vizes savval (ioncserélővel) vagy hidrogénezéssel.

A b) eljárás szerint egy (lile) általános képletű vegyületet iners oldószerben, például szénhidrogénben, így metilén-dikloridban, egy acilezőszerrel együtt feloldunk, célszerűen diciklohexil-karbodiimidet és 4-dimetil-amino-piridint adunk az oldathoz, a reakciót alacsony hőmérsékleten, például körülbelül 4°Con végezve. A terméket a reakciókeverékből izoláljuk és kívánt esetben ismert módon tisztítjuk. Ezután a jelenlévő védőcsoportokat ismert módon lehasítjuk.

Védőcsoportként bármely, a szacharid-kémiában általában alkalmazott védőcsoport használható. így például a két R szubsztituens lehet együtt benzilidén- vagy izopropilidéncsoport. A foszfátcsoport védőcsoportjai is az ismert védőcsoportok lehetnek, például benzilcsoportok.

A (lile) általános képletű vegyületek újak és az [A] reakcióvázlat szerint állíthatók elő.

-2HU 199494 Β

A reakcióvázlaton TBDMS = terc-butil-dimetil-szililcsoport.

A (IV) általános képletű vegyületeket a [B], [C] és [D] reakcióvázlatok szerint állítjuk elő, amelyeknél a szemléltetett reakcióban részt nem vevő hidroxilcsoportok megfelelő védett formában lehetnek. A reakcióvázlatokon szereplő ‘szubsztituensek a következő jelentésűek:

R, R’ védőcsoportok,

R₅ egymástól függetlenül mindegyik azonos jelentésű, mint R,, R₂, R₃ és R«.

Ac acetilcsoport,

TBDMS terc-butil-dimetil-szililcsoport.

A (IVa) általános képletű vegyületeket a [B] reakcióvázlat szerint, a (IVb) általános képletű vegyületeket a [C] reakcióvázlat szerint és a (IVc) általános képletű vegyületeket a [DJ reakcióvázlat szerint állítjuk elő.

Amennyiben valamely speciális kiindulási anyag előállítását nem írjuk le egyedileg, úgy az ismert vegyület vagy a szokásos módon vagy a példákban leírtakhoz hasonló eljárásokkal előállítható.

Az (I) általános képletű vegyületek farmakológiai hatásokkal rendelkeznek, s így mint gyógyszerek alkalmazhatók. A fenti vegyületek előnyös hatással vannak a nem-specifikus mikróbaellenes rezisztenciára. Ezt a hatást az alábbi kísérletek szemléltetik.

1. Endotoxinos aktivitás meghatározása limulus amőbocita-lizátum tesztben

Az endotoxin katalizálja egy proenzim aktiválását limulus-amőbocita lizátumban. A p-nitro-anilin lehasadását mérjük egy színtelen szubsztrátumból.. Ennek a lehasadásnak a mértékét fotometriásan állapítjuk meg. Az összefüggés az abszorpció és az endotoxin-koncentráció (illetve analógiásán az endotoxin-aktivítás) között 0,01—0,1 ng/ml endotoxin tartományban lineáris (egy standard endotoxin abszorpció értékeivel összehasonlítva). A pirogén anyagoktól mentes steril, kétszer desztillált vízben feloldott mindegyik mintából 1:10 higítási sorozatot készítünk és készítünk egy vakpróbát. 100 μΙ kísérleti mintát vagy referencia standard mintát vagy vakpróbát reagáltatunk 100 μΐ limulus-amőbocita lizátummal. A reakciókeveréket 10 percig 37°C-on inkubáljuk, majd 200 μΐ szubsztrátummal reagáltatjuk, további 3 percig inkubáljuk, és a .reakciót 200 μΐ 50%-os ecetsavval leállítjuk. A mintát megkeverjük és az abszorpciót spektrofotométer 405 nm-en mérjük, levonva belőle a háttérértéket. A minta endotoxin-tartalmát (az endotoxin aktivitását) lineáris regressziós analízissel számítjuk ki, a standard endotoxin értékeivel.

2. Endotoxin-sokk előidézése egérben

A kísérlet abból áll, hogy endotoxin sokkot vagy más, halált okozó hasonló klinikai állapotot idézünk elő LPS-analóg anyagokkal (LPS=lipopoliszacharid), galaktózaminnai (GalN) szenzibilizált egerekben.

Csoportonként 6 darab, hím C57 bl egérnek i.p. beadunk egyidejűleg 8 mg galaktóz5 amint 0,5 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldva és Salmonella a bor tus equi-ből (SIGMA) származó 0,1 pg lipopoliszacharidot (LPS) 0,2 ml fiziológiás sóoldatban oldva. Ez a kezelés 6—12 órán belül valamennyi állatott megöli. [C.Galanos és munkatársai: Proc.Natl.Acad.Sci., USA 76, 5939—5943 (1979)]. A standard kezelésben az LPS helyett a kísérleti anyagokat adjuk be egyszer, különböző dózisokban, egyidejűleg a galak15 tózaminnal; vagy pedig parenterálisan vagy orálisan a galaktózaminnai végzett kezelés előtt vagy után. Az eredményeket úgy értékeljük ki, hogy összehasonlítjuk a legkisebb dózisokat, amelyek egy csoport valamennyi állatára halálosak; vagy az LD_S0-értékeket Spearman-Karber módszerével számítjuk ki.

3. Mikróbás szeptikémia neutropéniás egerekben

Ez a modell lehetővé teszi az immunválasz anyagfüggő növekedésének a meghatározását mikróbásan fertőzött neutropéniás egerekben. Neutropénia előidézésére 20 darab nőstény B₆D₂F,-egérből álló csoportoknak beadunk egyszer s.c. 200 mg/kg testtömeg ciklofoszfamidot 0,2 ml desztillált vízben feloldva a 0. napon. A harmadik napon a kísérleti anyagot beadjuk parenterálisan, elsősorban i.p. vagy orálisan, amennyiben lehetséges fiziológiás nátrium-klorid-oldatban oldva vagy más módon feloldva (0,3 ml). A fertőzés a 4. napon történik, a szóbanforgó inokulum i.v. beadásával 0,2 ml térfogatban (csíraszám például: Pseudomonas aerugino40 sa/egér Δ12:1X10⁵; E.coli Δ12Ο:2Χ1Ο⁶; Staph. aureus Δ113:1Χ1Ο⁶; Candida albicans Δ124:

: 1X10*). A kísérleti állatokat a fertőzést követő 10. napig megfigyeljük, és elpusztulásukat naponta feljegyezzük. A kontroll vagy standard egerek fertőzésével kapcsolatban a ⁴⁵ következő paramétereket számítjuk ki:

a) átlagos túlélési idő,

b) túlélési arágy.

Az (1) általános képletű vegyületekkel kezelt állatok jelentősen jobb túlélési időket és túlélési arányokat mutatnak, mint a kezeletlen kontrollok, Gram-negativ baktériumokkal (például Pseudomonas és E.coli) végzett kísérleti fertőzéseknél, valamint Gram₅_ -pozitív baktériumokkal (például Staph.aureus) vagy élesztőkkel (például Candida albicans) végzett fertőzéseknél parenterálisan beadás után.

4. Humán vér-neutrofil oxidációs meta⁶⁰ hólizmusának aktiválása

Legalább 95% tisztaságú neutrofileket egy találmány szerinti vegyűlettel három különböző koncentrációban 1—2 órán át 37°C-on inkubálunk. Ezután mérjük a sejtekből fel65 szabaduló szuperoxid-anionokat, mint az akti3

-3HU 199494 Β válás mértékét, a citokróm-C redukciójának szuperoxid-diszmutáz által történő gátlása formájában. 10^-6 mól formil-metionil-leucil-fenilalanint tartalmazó 80, pmól citokróm-C-hez ÍXIO⁶, a kísérleti vegyülettel előkezelt 5 vagy kezeletlen neutrofilt adunk. A kontrollok még 50 pg szuperoxid-diszmutázt is tartalmaznak. A reakciókeveréket 15 percig 37°Con inkubáljuk, majd a kémcsövet jégfürdőbe helyezve a reakciót leállítjuk. Ezután a 10 kémcsöveket a sejtek elválasztása céljából 15 percig centrifugáljuk (400 g). A citokróm-C redukcióját, amely a felszabadult szuperoxid-anion mennyiségével arányos, 550 nm-en fotometriásan mérjük. A kísérleti vegyület 15 inhibitorhatását az LPS-nak a PMN-re (PMN=polimorfonukleáris neutrofil leukocita) gyakorolt aktivitására a fenti módon mérjük, emellett a leukociták előinkubálása után a sejteket tovább inkubáljuk az LPS egy sti- 20 muláló koncentrációjával.

5. Szén klirensz teszt

Ez a kísérlet azon az elven alapszik, hogy a 20,0—25,0 nm méretű részecskék (például 25 szénszemcsék) a szervezetből csak makrofágok által végzett fagocitózissal távolíthatók cl. Szénszemcséket intravénásán beadva, ezeket a véráramból a makrofágok a májban (Kupífer sejt) és a lépben fagocitózissal tá- 30 volítják el. Egy anyag RES-aktiválásának (RES= retikuloendoteliá 1 is rendszer) a meghatározását egyszeri vagy ismételt beadással, vizes oldatban vagy szuszpenzióban végezzük.

Egy anyagnak a kezeléshez előre megálla- 35 pított mennyiségét i.p. vagy s.c. adjuk be napi négy dózisban vagy egyszerre, 24 órával a kísérlet megkezdése előtt. 10% gázkorom tartalmú szuszpenziót 1%-os zselatinos nátrium-klorid-oldattal 16 mg szén/ml koncentráció- 40 ra hígítunk. Mindegyik egér 0,2 ml/20 g testtömeg szuszpenziót kap i.v. Az i.v. beadás után 3,6,9,12 és 15 perccel az orbitális plexusból punkcióval 25 μΙ vért veszünk. A vért 2 ml desztillált vízben hemolizáljuk. A széntartalmú fotometriásan meghatározzuk. Az állató- ⁵kát ezután leöljük és májuk és lépük súlyát megmérjük.

6. Herpeszfertőzés (egérben) 50

Az intrakután herpeszíertőzés lehetővé teszi, hogy megállapítsuk a herpeszvirusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. A betegség lefolyása elhúzódó és lehetővé teszi, hogy megfigyel- gg jük több paraméter egymást követő megjelenését. Herpeszes léziók jelentkeznek a fertőzés helyén, amelyek elfekélyesednek, a közelebb lévő láb megbénul és a bénulás fokozódik, végül halált okozva. Immunkompetens „csupasz (szőrtelen) egereket a 0. napon ⁶⁰intrakután megfertőzük, a kísérleti inokulumot 0,025 ml térfogatban (például a Herpes-simplex 1 típus 1X16⁶ plakképző egységét/egér) beadva. A kísérleti vegyületet oldva adjuk be i.p., például 0,1 ml fiziológiás só- 65 4 oldatban. A szisztémás herpeszfertőzés tehát azt is lehetővé teszi, hogy meghatározzuk herpeszvirusokkal megfertőzött egereknél az immunválasz növekedésének fokát. Az immunkompetens NMRI egereket a 0. napon megfertőzünk, a kísérleti inokulumot 0,1 ml térfogatban i.p. beadva (például a Herpes-simplex 1 típus 1.3X10⁵ plakképző egységét/egér). A kísérleti vegyületet oldatban,éldául fiziológiás sóoldatban s.c. adjuk be.

A kísérleti állatokat a fertőzés utáni 20. napig megfigyeljük, a léziók és bénulás megjelenését és a halál beálltát feljegyezzük. Mérjük az alábbi paramétereket, és ezeket a fertőzés kontrolljának vagy egy standardnak az adataival összehasonlíjuk:

a) az egerek száma, amelyeknél lézió lépett fel (kumulálódó);

b) az egerek száma, amelyeknél bénulás lépett fel (kumulálódó);

c) átlagos túlélési idő;

d) túlélési arány.

Az (I) általános képletű vegyületekkel kapott értékek a betegség lefolyását, a túlélési időt és a túlélési arányt tekintve, lényegesen jobbak, mint a kezeletlen kontrolloknál kapott értékek, a kísérleti Herpes-simplex vírus-1 fertőzés napját alapul véve a 0. vagy —1. és a +6. napok között, egyetlen

i.p., illetve s.c. dózis beadása után.

7. CSF (colony stimulating faktor) indukció

A CSF-ok mediátorok, amelyek fertőzéseket vagy toxinhatásokat követően a szervezetben képződnek. Biológiai hatásuk komplex, ezt a vérképző rendszer, elsősorban a csontelősejtek szaporodásának a stimuláiásával mutatjuk ki.

B₆D₂F! egereknek beadjuk a kísérleti vegyületeket, egyszer vagy ismételten, parenterálisan vagy orálisan, legfeljebb 50 mg/kg dózisban. Egymás után különböző időintervallumokban a kísérleti állatokból szérumot veszünk le. A szérum CSF-aktivitásának titerét sejttenyésztéses vizsgálattal, a B₆D₂F, egerek csontvelősejt-szaporodásának a sebességével mérjük. [D. Metcalf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, 1984, Elsevier;

T. Mosmann; J. Immunoi. Methods, 65, 55—63 (1983); L.M.Green és munkatársai: j.lmmunol.Methods, 70, 257—268 (1984)].

Az (I) általános képletű vegyűletek különböző mértékben indukálják egérben a CSFokat, így a CSF-aktivitásoknál mutatkozó idő-kinetikai különbségeket is megfigyeljük, s ez a terápiás alkalmazásnál hasznos lehet.

8. Interleukin-1 (IL-1) indukció

Annak meghatározását, hogy egy anyag stimulálja-e a sejteket TL-1 termelésre, elsősorban sejttenyésztéses vizsgálattal végezzük. Először egerek adherens makrofágjait izoláljuk, mint a rezidens makrofágokat, mind a tioglikoláttal eltávolított makrofágokat. Ezeket a kísérleti vegyületeket különböző kon-4HU 199494 Β centrációval 48 órán át RPMI táptalajban inkubáljuk, és a sejt-felüluszókat elkülönítjük. Ezeket IL-1 aktivitásra megvizsgáljuk C₃H/Hej egerek timocita tenyészeteiben. A makrofágok által termelt IL-l-et tartalmazó felülúszók timocitái 72 órás inkubálás alatt szaporodni kezdenek. A szaporodást 3H-timidin beépítésével mérjük, szcintillációs számlálóban [J.Gery és munkatársai: J.Exp.Med. 136, 128—142 (1972); J.Oppenheim és munkatársai: Callular Immunoi. 50, 71—81 (1980)].

Az (I) általános képletű vegyületek különböző arányokban (0,1—50 μg/ml koncentrációkban) képesek inkubálni IL-1 termelést makrofágokban.

9. LPS (endotoxin) tolerancia (halálozási tolerancia) indukció

Az úgynevezett tolerancia indukálható egerekben, LPS-ot 1—3-szor naponta parenterálisan beadva. Ez a tolerancia megvédi az állatokat a galaktózamin beadását követően beadott LPS halálos hatásai ellen (endotoxin-sokk előidézését egerekben lásd fent).

Az (I) általános képletű vegyületek azt a tolerenciát már egyetlen, 025 mg/egér i.p. dózis beadása után előidézik. Előkezelt (toleráns) egerek LPS kiváltó dózist kapnak, 0,01 pg LPS+8 mg galaktózamin/egér menynyiségben, i.p., különböző időintervallumokban (1 nap — 3 hét) az utolsó kezelést követően. Az állatok nagyobb hányada túléli az LPS kiváltó dózist, főképpen három alkalommal ismételt beadás után, mint az előre nem kezelt, kiváltó dózist kapott kontrollok.

Az (I) általános képletű vegyületek gyulladásgátló hatásúak is, elsősorban nem-specifikus, immunológiásan indukált és magas vérnyomás által előidézett gyulladásoknál és allergiás reakcióknál. Ez a hatásuk különböző kísérleti eljárásokkal bizonyítható, például vizsgálva hatásukat a prosztaglandin szintézisre in vitro és in vivő. In vitro vizsgáljuk az LPS- és zymosan-indukált PGE₂és PGF,</-felszabaduIás gátlását. NMRI egerekből származó, tioglikoláttal stimulált peritoneális leukocitákat LPS-dal vagy egy kísérleti anyaggal 24 órán át inkubálunk. Táptalajt változtatva és a sejteket háromszor mosva, ezeket 2 órán át LPS-dal, illetve 1 órán át zymosannal stimuláljuk. Ezekben a felüluszókban a PGF₂-t és a PGF,_a-t meghatározzuk. Azt találjuk, hogy az LPS-dal, illetve a zymosannal stimulált sejtek a PGE₂-termelést gátolják.

In vivő a kísérleti anyagokkal előkezelt egerek peritoneális leukocitáinak gátló hatását mérjük az LPS-indukálta PGE₂-felszabadulásra. Három NMRI egerekből álló csoportokat az 1., 2. és 3. napon LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal kezelünk i.p. A 4. napon ezek az állatok és a kontrollcsoport egerei

i.p. 1,5 ml tioglikolátot kapnak, a 7. napon az egerek peritoneális leukocitáit elkülönítjük és LPS-dal stimuláljuk. A kontrollokkal összehasonlítva a PGE₂-felszabadulás jelentős csökkenése figyelhető meg.

Egy következő kísérletben mérjük a prokoagulánsaktivitásra (PCA) gyakorolt hatást. LPS-dal végzett stimulálás után a humán endoteliális sejtek PCA-t szintetizálnak, amint ez a plazma rövidebb alvadási idejéből megállapítható. Egerek peritoneális leukocitái LPS-kezelés után és nyulakból izolált peritoneális leukociták a generalizált Shwartzman-reakció kiváltása után rekalcifikált plazma alvadási idejét ugyancsak megrövidíti.

In vitro, az LPS által indukált PCA-ra gyakorolt hatáS vizsgálatához tioglikoláttal stimulált B₈D₂F, egerek peritoneális leukocitáit éjszakán át LPS-dal egyedül, illetve LPS-dal és a kísérleti anyaggal kezeljük magzati borjuszérumtól (FCS) mentes DMEM táptalajban (a) kísérlet. Egy másik b) kísérletben egerek peritoneális leukocitáit 24 órán át LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal kezeljük, és a táptalaj megváltoztatása után éjszakán át LPS-dal stimuláljuk. Mérjük a rekalcifikált humán kontroll plazma koagulációs idejét a Hackchen-eljárással, az egér peritoneális leukocita-szuszpenziójának hozzáadása után, amit előzetesen ismételten kifagyasztottunk és ultrahanggal kezeltünk.

A kísérleti anyag hozzáadása az LPS által kiváltott PCA-t, a kontrollokkal összehasonlítva csökkentette (az alvadási idő növekedett). A kísérleti anyaggal való előkezelés hasonlóan csökkenti a PCA-t.

In vivő, egerek peritoneális leukocitáinak LPS-indukálta PCA-ra gyakorolt hatást a kísérleti anyaggal való előkezelés után a következőképpen vizsgáljuk:

B₆D₂F, egereket az L, 2. és 3. napon i.p. kezelünk LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal. Valamennyi állat a 3. napon kap még

1,5 ml tioglikolátot i.p. A 6. napon a peritoneális leukocitákat elkülönítjük, valamennyi állatból vett mintát IXI0⁶ sejt/ml koncentrációra beállítjuk, és 24 órán x magzati borjuszérumtól mentes DMEM táptalajban LPSdal stimuláljuk. A sejtek PCA termelését a fentiek szerint meghatározzuk. LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal végzett előkezelésnél a PCA jelentősen csökken. Ugyanerre a megállapításra jutunk nyulaknál is. A nyúl peritoneális leukocitái által termelt PCA a szokásos Shwartzmann-reakció kiváltása után csökken, ha az állatokat LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal előkezeljük.

A lokális Shwartzmann-reakció gátlására három csincsillanyulat előkezelünk i.v., illetve

i.p., LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal, az L, 2. és 3. napon. A 6. napon az állatoknak LPS/kg i.v. beadásával kiváltjuk. A kiértékelést félig kvantitative végezzük, vizsgálva a bőrelhalást. Azt találtuk, hogy LPS-dal, illetve a kísérleti anyaggal előkezelve, az állatoknál a Shwartzmann-reakció csaknem tökéletesen megállapítható.

-5HU 199494 Β

Az (I) általános képletű vegyületek tumorok ellen is hatásosak, amint azt az alábbi kísérletek bizonyítják.

1. Tumor nekrózis faktor (TNF) indukció

Abból a célból, hogy egerek csontvelő makrofágjait stimuláljuk, körülbelül 10—13 napos, CSF-ral (colony stimulating faktor) indukált BDF! egerek csontvelősejtjeit táptalajban (RPMI+1% Pen/Strep (5000 egység/ml) +1 % glutamin) ÍXIÖ⁶ sejt/ml-re hígítjuk és lapos mikrotitráló lemezeken inkubáljuk a kísérleti anyagokkal oldatban, 100 pg-0,1 pg/ml végső koncentrációban (hígítási műveletek 1:10) 4 órán át 37°C-on/5% CO₂. A felüluszót 0,45 pm-es szűrőn megszűrjük és —70°C-on fagyasztva tartjuk, amig a TNF teszthez szükség lesz rá.

L 929 sejteket előtenyésztünk éjszakán át (37°C 5% CO₂) mikrotitráló lemezeken, 3X10⁴ sejt/üreg/100 pl koncentrációban, majd minden egyes minta 100 pl-ét hozzáadjuk és tenyészeteket 1:2 arányban tovább hígítjuk. Ezután hozzáadunk 100 pl aktinomicin D-t (8 pg/ml táptalaj) és tovább inkubáljuk 18 órán át 37°C-on/5% CO₂” A felüluszókat eltávolítjuk, a visszamaradó sejtek felületét Giemsa-oldattal megfestjük, és az abszorpciót 620 nm-en mérjük (Titertek Multiscan Autoreader, flow). A TNF egysége az az aktivitás, amely a szőbanforgó L 929 sejtek 50%-os lizisét eredményezi.

2. B16F1 melanoma teszt

B16F1 melanomasejteket 5 napig in vitro tenyésztünk. A sejteket szintkronizáljuk egy nappal azelőtt, hogy a kísérletet elvégezzük, úgy, hogy EDTA-tripszin alkalmazásával az egysejtréteget különálló sejtekre bontjuk, és az egészet visszatesszük ugyanabba a palacki ba friss táptalajjal. A sejteket megszámoljuk és beállítjuk 10⁶ sejt/ml táptalaj koncentrációra. A sejtszuszpenzió 0,1 ml-ét (10® sejt) intravénásán beadjuk az egerek farkvénájába. 21 nap múlva az egereket leóljük és a tüdőtumorokat megszámoljuk. A kísérlethez B₆D₂F, egereket használunk. A kísérleti vegyületeket feloldva a —6: —4. és —1. napon intraperitoneális injekcióban adjuk be.

Azt találtuk, hogy az (I) általános képletű vegyületek immunprofilaktikus aktivitással rendelkeznek, a B16F1 egerek melanóma-áttételei a tüdőben csökkennek. A terápiás hatás egy további ellenőrzéseképpen az egereket a 3., 6., 8., 10., 13. és 15. napon kezeljük a tumorsejtek beoltása után. fgy is megfigyelhető az áttételek képződésének jelentős csökkenése.

Az (I) általános képletű vegyületek ezért javalltak, mint nem-specifikus mikróbaellenes rezisztencia modulátorok, továbbá az immunválasz szisztémás fokozására, és a nem-specifikus immunitás növelésére. Az (I) általános képletű vegyületek így javalltak csökkent immunválasszal kapcsolatos állapotok kezelésére vagy kisegítő kezelésére (vagyis más 6 specifikus vagy kisegítő terápiás formákkal együtt), így elsősorban a csökkent humorális (testnedvi) immunválasz és/vagy az elhúzódó típusú csökkent túlérzékenységi reakció és olyan állapotok kezelésére, amelyeknél általában javallt az immunválasz modulálása. Az (I) általános képletű vegyületek elsősorban javalltak olyan káros állapotok kezelésére vagy kisegítő kezelésére, amelyek elsődleges immunológiai defektusokon vagy olyan immunológiai fogyatékosságokon alapszanak, amely típusok idős pacienseknél vagy súlyos égésekben vagy általános fertőzésekben szenvedő betegeknél észlelhetők. Az (I) általános képletű vegyületek javalltak továbbá virusbetegségek (így disszeminált herpesz, súlyosbodó himlő- és disszeminált bárányhimlő betegségek) Hodkin-kór és más rosszindulatú tumorok kezelésére vagy kisegítő kezelésére. Az (I) általános képletű vegyületek javalltak továbbá például baleseteknél elforduló endotoxin-sokk megelőzésére, égéseknél és sebészeti beavatkozásoknál és mint gyulladásgátló szerek.

A javasolt napi dózis vagy egyetlen alkalmazás adjuváns hatás elérésére, például kisegítő kezelésnél körülbelül 0,1—70 mg, célszerűen például parenteráüsan, előnyösen i.p. beadva napi dózis esetében, osztott dózisokban 2—4-szer naponta egységdózis formájában, amely a bekevert hatóanyagból körülbelül 0,025—35 mg-ot tartalmaz, vagy a hatóanyagot késleltetett formában tartalmazza. Egy javasolt teljes egyetlen adjuváns dózis legfeljebb 70 mg hatóanyagot tartalmaz.

Immunmoduláló hatásukat tekintve az (I) általános képletű vegyületek javalltak adjuvánsokként alkalmazva vakcinákban is. Erre a felhasználásra a javasolt dózis körülbelül 0,5—100 mg, előnyösen kb. 70 mg, beadva a vakcinálás napján, és megfelelő ismétléssel ugyanebben a dózisban 2—4 héttel ezután.

Az (I) általános képletű vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények a szokásos galenusi eljárásokkal előállíthatok, például a szokásos, gyógyszerészetileg elfogadható hígítókkal vagy hordozókkal végzett keveréssel. A készítmények előállíthatok például injektálható oldatok alkjában. Ezeknek előállítása ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartozik.

A találmány tárgyát képezi továbbá az (I) általános képletű vegyületek alkalmazása gyógyszerek elsősorban immunmodulátorok, virusok elleni szerek és gyulladásgátló szerek hatóanyagaként.

A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a példák szemléltetik. A példákban előforduló rövidítések:

EDTA etiléndiamin-tetraecetsav,

DTE 1,4-ditioeritrit,

UDP uridinfoszfát és trisz trisz (hidroxi-metil) -amino-metán.

1. példa

6-0- [2-Dezoxí-3-0- [ ( R )-3-hidroxi-tetradeka-6HU 199494 Β noil]-2-[(R)-3-hldroxi-tetradekanoil-amido]-β-D-glükopiranozil] -2,3-di-O- [(R)-3-hidroxi-tetradekartoil]-1-0-foszfono-a-D-glükopiranóz

2,03 mg UDP-2-dezoxi-3-0- [ (R) -3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [(R) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1 -O-íoszfono-a-D-glükopiranózt és6,42 mg 2,3-di-O- ](R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -1-0-foszfono-a-D-glükopiranózt, mindkettőt trisz só formájában 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 7 pH-értékü 10 mM trisz-pufferban feloldunk és 60 μΐ enzimextraktummal 30°C-on inkubálunk.

Az enzimextraktumot a következőképpen készítjük el:

E.coli JB 1104 sejteket tenyésztünk L-levesben (előtenyészet + 10 pg ampicillin/ml, 30°C-on éjszakán át; főtenyészet 30°C-on, keverős inkubátorban; a kiindulási sűrűség OD_55onm=0,l, a végső OD_{550 nm}=l). A sejteket kicentrifugáljuk (10.800 g, 10 perc/4°C), az üledéket 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTEet tartalmazó 7 pH-értékű 10 mM trisz-pufferban szuszpendáljuk és újra centrifugáljuk (6000 g, 10 perc/4°C). Az üledéket a fenti pufferban újra szuszpendáljuk és ultrahanggal fragmentáljuk (5X20 mp/30 mp-es szünetekkel, 120 wattal). A sejtfragmentumokat kícentrifugáljuk (12.000 g, 10 perc/4°C) és az oldatot ultracentrifugáljuk (150.000 g 90 perc/7°C). A felüluszó .felső 2/3 részét elkülönítjük. Ezt a frakciót ammónium-szulfáttal frakcionált kicsapásnak alávetjük. Ehhez 10— 40% ammónium-szulfátot használunk. A kapott üledéket a fenti pufferban szuszpendáljuk.

Miután a reakció végbement (ellenőrizzük vékonyréteg-kromatográfiával) az oldatot citromsavval 2 pH-értékre savanyítjuk és centrifugáljuk. Az üledéket kloroform/metanol/ecetsav/víz 65:15:5:2 arányú keverékében szuszpendáljuk és ugyanezzel az eluenssel kovasavgélen kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk, amig szerves oldószer már nem marad vissza, és a maradékot liofilizáljuk. A liofilizátumot tetrahidrofurán/víz 8:2 arányú keverékében feloldjuk és ebben az oldószerben trisz-formában lévő kationcserélőn trisz sóvá alakítjuk. A tetrahidrofuránt lepároljuk, és a maradékot liofilizáljuk. Az R/-értékeket kovasavgél-lemezeken határozzuk meg. Rf=0,48 (kloroform/metanol/ecetsav/víz, 65:25:5:5). Kitermelés 29%.

2. példa

6-0-[ 2-Dezoxi-3-0-f (R )-3-h i d roxi-tét r a d e k anoll J -2- [(R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -β-D-glükopiranozil] -2-dezoxi-3-0- [(S)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2-( S)-3-hidroxl-tetradekanoil-amido]-1-0-foszfono-a-D-glükopiranóz

2-dezoxi-3-0- [ (S) -3-hidroxi-tetradekanoil] -2- [ (S) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1 -0-foszfono-a-D-glükopiranóz 20 térfogatrész 5 mM oldatát 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM

DTE-et tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7), UDP-2-dezoxi-3-0-t(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2- {(R) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -I -O-foszfono-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát a fenti pufferban és 2 mM EDTA-t és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 20 rész 100 mM trisz-HCI puffért reagáltatunk 40 rész 1. példa szerint előállított enzimkészitménnyel 2 mM EDTA-at, 2 mM DTE-et és 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7) 30°C-on 8 órán át, miközben a Triton X-100 végső koncentrációját 0,1%-ra állítjuk be. A reakciókeveréket liofilizáljuk, feloldjuk az eluens kezdeti térfogatának körülbelül 1/3 részében, amit az ezután következő, a molekulatömeg szerinti szétválasztás céljából végzett kromatografáláshoz használunk (Sephadex LH 20, eluens: piridin/ecetsav/víz, 98:1:1) és megszűrjük. Az oszlop térfogata körülbelül 20-szor nagyobb, mint a minta térfogata. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat elkülönítjük, csökkentett nyomáson koncentráljuk, pirogén anyagoktól mentes vízben szuszpendáljuk és liofilizáljuk. Liofilizálás után a Triton Χ-100-at dietil-éterrel kezelve eltávolítjuk. Újabb centrifugálás után az üledéket kloroform-metanol 1:1 arányú keverékében feloldjuk, megszűrjük és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A mono-L-lizin só előállítása céljából az L-lizin (szabad bázis) számított sztöchiometrikus mennyiségét 100 mM vizes oldat formájában a maradék vizes szuszpenziójához adjuk és a keveréket újra liofilizáljuk. R/=0,44 (kloroform/metanol-ecetsav/víz, 65:25:5:5). Kitermelés 42%.

3. példa

6-0- {2-Dezoxi-3-0- [ (R)-3-hid roxi-tetradekanoil] -2- [ (R)-3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -β-D-glükopiranozil] -2-dezoxi-3-0- [(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -1 -0-foszfono-2- [ (R)-3-tetradekanoil-oxi-tetradekanoil-amido] -a-D-glükopiranóz

2-dezoxi-3-0- ](R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -1 -0-foszfono-2- [ (R) -3-tetradekanoil-oxi-tetradekanoil-amido]-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát 0,2 mM EDTA-at és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7), UDP-2-dezoxi-3-0-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoil] -2- {(R) -3-hidroxi-tetradekanoil-amido] -1 -0-foszfono-a-D-glükopiranóz 20 rész 5 mM oldatát a fenti pufferban és 2 mM EDTA-et és 0,2 mM DTE-et tartalmazó 20 rész 100 mM trisz-HCI puffért (pH=7) reagáltatunk 40 rész 1. példa szerint előállított enzimextráktummal, 2 mM EDTA-at, 2 mM DTE-et és 0,1% Triton Χ-100-at tartalΧ-100-at tartalmazó 10 mM trisz-HCI pufferban (pH=7) 30°C-on 48 órán át, miközben a Triton X-100 végső koncentrációját 0,1-re beállítjuk. A keveréket liofilizáljuk, piridinnel kezeljük és szűrjük, a szürletet csökkentett nyomáson koncentráljuk és kovasavgélen kromatografáljuk, eluensként kloroform/metanol/viz/2-fenetil-pikoIinium-bromid 80:175:

-7πυ ι d :22,5:2,5 arányú keverékét használva. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és a 2-fenetil-pikolinium-bromidot, ami ionpár képző szerként van jelen, 20 mM foszforsavat tartalmazó vízzel keverve eltávolítjuk. A szer- 5 vés fázist csökkentett nyomáson koncentráljuk, és a mono-L-lizin só előállítása céljából a számított sztöchiometrikus mennyiségű L-lizin szabad bázist a keverékhez adjuk és liofilizáljuk. Rf=0,53 (kloroform/metanol//ecetsav/víz, 65:25:5:5). Kitermelés 30%.

Az 1—3. példákban leírtakhoz hasonló módon állítjuk elő az alábbi (I) általános képletű vegyületeket, a megfelelő (II) és (III) általános képletű vegyületeket használva. Az énzimmennyiségeket úgy állítjuk be, hogy a reakció előnyösen körülbelül 24—48 óra alatt végbemenjen.

Táblásat

R^ .= R^ “ = (R) “3~hidroxi*-tetradekanoilcs oport

P6 Ida száma	•í Z	V	X		Atcjr m e. 1 as* *7o
4.	0	NH	NH	NH	o,45	40
5.	NH	NH	NH	NH	0,40
6 , (ί.-1.·2.ίη.*>ό^	O	O	O	NH	0,49	40
7,	0	NH	NH	0	0,39	O
8.	NH	NH	O	NH	• 0,41
9.	0	0	0	O	0,43

10. példa

6-0- [2-dezoxi-3-0- [(R)-3-hidroxi-tetradekano- ⁴⁰il]-2-[(R)-3-hidroxi-tetradekanoiI-amído] -B-D-glükopiranozii] -2-dezoxi-l-0-foszfono-3-0-tetradekanoil-2-tetradekanoil-amido-a-glukopiranóz

A cim szerinti vegyület L-lizinsóját az 1—3. 45 példákban leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő. Kitermelés 21%.

Rf=0,50 (kloroform/metanol/ecetsav/víz, 65: :25:5:5).

A vegyületek további jellemzésére a „Fást 50 atomic bombardment (FAB) tőmegspektroszkópiát (negativ mód) végeztük [Raetz: J.Biol.Chem. 259, 4852 (1984) ], továbbá NMR vizsgálatokat végeztünk.

Példa szám 1.

2.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Tömeg

1325

1324 1534

1323

1322

1325

1324

1323

1326 1292

Példa NMR-spektrumok száma

9,82 (d, 9 Hz, ÍH); 6,65 (dd, 8,8 u.

3,5 (Hz, ÍH); 6,25 (t, 10 Hz, ÍH);

(C₅D₅N) 5,83 (t, 10 Hz, 1H); 5,63 (d, 8,8 Hz,

1H); 5,35 (dd, 10 u. 2,5 Hz, ÍH); 4,0 (T, 10 Hz, ÍH); 3,83 (m, ÍH).

Claims

1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására — a képletben R,, R₂, R₃ és R₄ egymástól függetlenül 14 szénatomos alkanoilcsoport, amely adott esetben hidroxilcsoporttal vagy 14 szén atomos alkanoilcsoporttal monoszubsztituált, és

W, X, Y és Z egymástól függetlenül oxigénatom vagy iminocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Z és X iminocsoport, W és Y oxigénatom, akkor R„ R₂, R₃ és R₄ jelentése más, mint azonosan (R)-3-hidroxi-tetradekanoilcsoport — szabad formában vagy bázissal alkotott só formájában, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű vegyűletet — a képletben R₃, R4, W és Z a fenti jelentésűek, és U uridinocsoport — enzimatikusan — előnyösen

-8HU 199494 Β lipid-A szintázzal — kondenzálunk egy (III) általános képletű vegyülettel — a képletben X és Y a fenti jelentésűek és R,” és R₂” azonosak R, és R₂ fenti jelentéseivel — és az előállított vegyületet szabad formában vagy 5 bázissal alkotott só formájában izoláljuk.

2. Eljárás (I) általános képletű vegyületet — W, X, Y, Z, R„ R₂, R₃ és R₄ az 1. igénylő pontban megadott — vagy bázissal alkotott sóját hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljáxssal előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítmények szokásos hordozó-, hígító-, töltő- és/vagy egyéb segédanyagaival együtt elkészítjük.