PL151094B1

PL151094B1 - Method of obtaining novel derivatives of glucose

Info

Publication number: PL151094B1
Application number: PL1986271248A
Authority: PL
Original assignee: Sandozerfindungen Verwaltungsgesellschaft Mbh
Priority date: 1985-06-28
Filing date: 1986-06-27
Publication date: 1990-07-31
Also published as: GB2179945A; FR2584076A1; WO1987000174A2; IL79247A0; PT82855B; DE3621122A1; FI862723A0; KR870000351A; PT82855A; CH672789A5; ES2000205A6; IT8648204A0; AU596800B2; WO1987000174A3; IT1203816B; GB2179945B; PL151036B1; SE8602854D0; LU86491A1; DK304286A

Description

OPIS PATENTOWY

151 094

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr-Zgłoszono: θθ 06 27

Pierwszeństwo? ^{85 06 28 *}86 05 07 /P. 271248/ dla zastrz.3 dla zastrz.l,2

Austria

Zgłoszenie ogłoszono: ⁸⁹ 01

Opis patentowy opublikowano:

1991 01 31

IHędu Pols-iToweoo l·^{* 1} · * ^i;

Int. Cl.⁵C07H 13/00

Twórca wynalazku

Uprawniony z patentu: Sandoz AG®, Bazylea /Szwajcaria/

SPOSÓB WYTWARZANIA NOWYCH POCHODNYCH GLUKOZY

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych pochodnych glukozy, stosowanych do wytwarzania preparatów farmaceutycznych oraz do wytwarzania nowych sacharydów o właściwościach farmaceutycznych.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania związków o wzorze 3, w którym X oznacza tlen lub grupę iminowąja Y oznacza tlen albo X oznacza tlen, a Y oznacza grupę iminową, R*^ i R*₂ niezależnie od siebie oznaczają wodór lub ewentualnie podstawioną grupę acylową, pod warunkiem, że a/ co najmniej jeden z podstawników i R*2 oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową, b/ gdy X lub Y oznacza grupę Iminową, to podstawnik R” i R₂ przyłączony do grupy iminowej Jest inny niż wodór.

Związki o wzorze 3, w których:

a/ Y oznacza atom tlenu, a X oznacza grupę NH pod warunkiem, te e(/ gdy oznacza /R/-3-hydroksytetradakanoll, wtedy R₂ Jest różne od /R/-3-hydroksytatradekanoilu lub /R/-3-heksadekanoiloksytetradekanoilu, /3/ R*! jest różne od atomu wodoru i

2fZ R“_x i R“₂ różna od zarówno grupy acetylowej jak i grupy -CO/CH^/^gCHg, b/ Y i X oznaczają atom tlenu lub c/ Y oznacza NH 1 X oznacza atom tlenu, pod warunkiem, że co najmniej jeden z dwóch podstawników stanowi grupę acylową 1 gdy X lub Y oznacza grupę iminową, wtedy podstawnik R·^ lub R*₂ związany z grupą iminową Jest różny od atomu wodoru, aą związkami nowymi.

Związki o wzorze 3 mogą występować w postaci wolnej lub o ile potrzeba, w postaci soli addycyjnych z kwasami. Postać wolną można przekształcać w sól i odwrotnie, konwancjonal nymi sposobami.

151 094

R*₂ korzystnie eą identyczne· Korzystnie oznaczają one atoa wodoru lub grupą acylowę, np. o 4-20, korzystnie o 12-16, a zwłaszcza 14 atoaach węgla· Mogą być one np· podstawione w pozycji 3 przez grupę hydroksylową, acetylokeylową lub acylokeylową, jak podano powyżej· Konfiguracja przy atoaie wągla w pozycji 3 aoże być /R/ lub /S/· Tak więc R*! 1 R₂ aogą być obecne w związku o wzorze 3 w postaci achiralnej, /R/, /S/ lub raceaicznej · Stosuje elę to też do związku o wzorze 4· Konfiguracja nie żalenia slą w czasie procesu według wynalazku, a ianowiele, gdy jako aubstrat stosuje eią związek w postaci /3/, /S/ lub racaalcznej to otrzywuje elą odpowiedni /R/,/S/ lub odpowiednio racaalcznej produkt końcowy·

Sposób według wynalazku wytwarzania związków o wzorze 3 polega na tya, ża odszczapia eię grupy ochronne, ze związku o wzorze 4, w którya R oznacza grupą zabezpieczającą, X*i Y* aa ją znaczenia podane wyżej dla X 1 Y z podany· warunkiem, R·^ 1 R*₂ aają wyżej podane znaczenie z podanya warunkiem,a grupa OH jest zabezpieczona fosforanową grupą estrową, albo ze związku o wzorze 3c, w którya R₂ 1 R aają wyżej podane znaczenie, R* oznacza grupę zabezpieczającą, a grupa hydroksylowa jeet podstawiona rodnikiem acylowya, a następnie otrzyaany związek ewentualnie przekształca slą w sól addycyjną z kwasea·

Związki o wzorze 3 aożna otrzyaać sposobem polegający· net a/ w przypadku wytwarzania związków o wzorze 3a, w którya R·* 1 R₂ aają wyżej podane znaczenie 1 albo X* i Y* oznaczają etosy tlenu albo Y* oznacza grupę iainową i X* oznacza atoa tlenu, przekształca eię w związkach o wzorze 4, w którya R·^ R*2· 1 Y* mają wyżej podane znaczenie, a R oznacza grupę zabezpieczającą, niezabezpieczoną grupą hydroksylową w zabezpieczoną fosforanową grupą estrową lub b/ w przypadku wytwarzania związków o wzorze 3b, w którym R*^ i R2 maję wyżej podane znaczenie, acyluje się odpowiadające związki o wzorze 3c, w którym R^ i R mają wyżej podane znaczenie i R oznacza grupę zabezpieczającą, a następnie odszczepia się grupy zabezpieczające·

Wariant a/ sposobu można np· prowadzić rozpuszczając związek o wzorze 4 w obojętnym rozpuszczalniku, np· w cyklicznym eterze takim jak tetrahydrofuran i poddając go reakcji w niższej temperaturze, np· w -70°C, z butylolitem w alifatycznym węglowodorze takim jak heksan, a następnie dodając chlorek dibenzylofosforowy· Produkt można wyodrębnić z mieszaniny reakcyjnej i o ile jest to pożądane, oczyszczać w znany sposób. Wolne grupy hydroksylowe reszty fosforanowej są zabezpieczone np. za pomocą grupy benzylowej. Odszczepienie grup zabezpieczających można również prowadzić w znany sposób· Tak np· odszczepić grupę zabezpieczającą w konwencjonalny sposób w warunkach kwasowych, np· za pomocą wodnego roztworu kwasu /wymieniacz jonowy/ lub hydrogenolltycznie·

Wariant b/ sposobu można prowadzić rozpuszczając związek o wzorze 3c w obojętnym rozpuszczalniku, np· w chlorowanym węglowodorze takim jak chlorek metylenu, razem ze środkiem acylującym, korzystnie z dodaniem dlcykloheksylokarbodilmidu i 4-dlmetyloaminopirydyny, przy czym reakcję prowadzi elę w niższych temperaturach, np· około 4°C· Produkt może być wyodrębniony z mieszaniny reakcyjnej 1 o ile Jeet to pożądane, oczyszczony w znany sposób· Następnie, grupy zabezpieczające odezczepia eią w znany sposób·

Jako grupy zabezpieczające można stosować dowolne grupy stosowane powszechnie do zabezpieczania w chemii eacharydów· Tak np· oba podstawniki R mogą razem oznaczać grupę benzyli* denową lub izopropylidenową· Ponadto, jako grupy zabezpieczające dla grupy fosforanowej można stosować znane grupy zabezpieczające takie jak benzyl· ^wiązki o wzorze 3c możne otrzymać za poaocą szeregu reakcji przedstawionych na schemacie 1, w którym TBDMS oznacza grupą tert-butylodimetylosililową. Związki o wzorze 4 można otrzymać zgodnie z sekwencjami reakcji przedstawionymi na schematach 2, 3 i 4, w których grupy hydroksylowe nie biorące udziału w opisanych reakcjach korzystnie występują w postaci zabezpieczonej· Podstawniki mają następujące znaczenia· R, R* oznaczają grupy zabezpieczające, R_g oba niezależnie od siebie mają znaczenie podana powyżej dla R^, R₂, R^ lub R^, Ac oznacza grupą acetylową, TBDMS oznacza grupę tert-butylodimetylosililową·

Otrzymywania związków o wzorze 4a przedstawiono na schemacie 2, związków o wzorze 4b na schemacie 3, a związków o wzorze 4c na schemacie 4·

Jeżeli sposób wytwarzania poszczególnych substancji wyjściowych nie jeet specjalnie opisany, jest on znany lub można prowadzić go konwencjonalnie lub w sposób analogiczny do

151 094 sposobów opisanych w przykładach.

Zwięzki o wzorze 3 wykazuję aktywność faroakologicznę· Wskazane sę do zastosowania farmaceutycznego♦ Wywieraję korzystny wpływ na nieswolstę oporność antybakteryjnę. Aktywność tę można np. wykazać w następujęcych metodach testowych.

1. Oznaczanie aktywności endotoksycznej w teście lizmatu limulusamebocytowym. Endotoksyna katalizuje aktywację proenzymu w lizacle limulusamebocytowym· Mierzy się odszczepianie p-nitroaniliny z bezbarwnego podłoża. Zasięg tego odszczepiania wykrywa się fotomatrycznie, przy czym zależność pomiędzy absorpcję i stężeniem endotoksyny /lub, odpowiednio, aktywność endotoksyny dla analogów/ w zakresie od 0,01 do 0,1 ^jg/ml endotoksyny jest liniowa /porównanie z wartościami absorpcji standardowej endotoksyny/· Z każdej próbki /rozpuszczonej w wolnej od pirogenów, sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie/ sporzędza się serię rozcieńczeń 1:10 do 100 jul testowanej próbki lub standardu odniesienia lub ślepej próbki i dodaje się 100 ^il lizatu limulueamebocytowego· Po 10 minutach Inkubacji w 37° do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 200 jul podłoża. Reakcję zatrzymuje eię za pomocę 200 >j1 50% kwasu octowego po dalszych 3 minutach inkubacji. Po mieszaniu próbki mierzy eię absorpcję w spektrofotometrze przy 405 nm, odejmujęc wartość tła. Zawartość endotoksyny /aktywność endotoksyny/ w próbce w jednostkach endotoksyny /Ε·υ®/ oblicza się na komputerze za pomocę liniowej regresji do wartości standardu endotoksyny.

2. Wywołanie wstrzęsu endotoksynowego u myszy· Test obejmuje wywołanie wstrzę6u endotoksynowego lub analogicznych letelnych stanów klinicznych za pomocę substancji LPS-analogicznych w myszy uczulonej galaktozarainę /GalN/· Samcom czarnych myszy C57 /po 6 zwlarzęt w grupie/ podaje się jednocześnie dootrzewnowo 8 mg GalN rozpuszczone w 0,5 ml PBS oraz 0,1/Ug LPS z Salmonella abortus equl /Sigma/ rozpuszczonę w 0,2 ml soli fizjologicznej. Traktowanie takie zabija zwierzęta w cięgu 6-12 godz· /C.Galanos i in· Proc· Natl. Acad. Sci·, USA, 76 /1979/ 5939-5949. Zamiast LPS w standardowym traktowaniu podaje się testowane substancje w różnych dawkach albo jednocześnie z GalN albo pozajelitowo lub doustnie przed lub po traktowaniu za pomocę GalN. Przeprowadza się ocenę wyników przez porównanie najmniejszych dawek, które sę śmiertelne dla wszystkich zwisrzęt w grupie lub przez komputerowe obliczanie LD₅q przy zastosowaniu metody Spearman-Korbere·

3. Bakteryjna posocznica u myszy neutropenicznych· Próba ta pozwala na oznaczenie związanego z substancję wzrostu reakcji odpornościowej u zakażonych bakteryjnie neutropenicznych myszy. W celu wywołania neutropenil, czyli zmniejszenia liczby krwinek białych, obojętnochłonnych we krwi, podaje się jednorazowo podskórnie, grupom po 20 samic myszy Βθϋ₂ 200 mg/kg ciężaru ciała cyklofoefamldu rozpuszczonego w 0,2 ml wody destylowanej, w dniu 0. Na 3 dzień testu substancję podaje się pozajelitowo /głównie dootrzewnowo/ lub doustnie, o ile możliwe, rozpuszczonę w fizjologicznym roztworze chlorku sodu i rozpuszczonę w jakiś inny sposób /0,3 ml/ Zakażenia przeprowadza się na 4 dzień po dożylnym podaniu odpowiedniego inokulum w objętości 0,2 ml /liczba drobnoustrojów, np· na mysz: Pseudomona aeruglnosa, A 12:1 x 10$: E.coli A 120:2 x 10} Staph. auraua A 113: 1 x 10 : Candida albicane A 124:1 x 10/· Testowane zwierzęta obserwuje się do 10 dnia po zakażeniu i co dzień rejestruje się przypadki śmierci· Oblicza eię na komputerze następujęce parametry w odniesieniu do kontrolnych zakażeń lub do standardów, odpowiednio: a/ średni czas przeżycia, b/ wskaźnik przeżycia.

Zwięzki o wzorze 3 daję znacznie lepeze wyniki dotyczęce czasu 1 wskaźnika przeżycia w stosunku do nietraktowanych zakażonych prób kontrolnych przy doświadczalnych zakażeniach czynnikiem gram-ujemnymi /np. Pseudomonas i E.coli/ jak również przy zakażeniach czynnikami gram«dodatniki /np.Staph. aureus/ lub drożdżami /np. Candida albicans/, po podaniu pozajelitowym ·

4. Aktywacja utleniajęcego metabolizmu neutrofilów w krwi ludzkiej. Neitrofile / o czyś tości co najmniej 95%/ inkubuje się testowanę substancję w 3 różnych stężeniach w cięgu

1-2 godzin w 37°C. Następnie mierzy się uwalnianie anionów nadtlenowych przez komórki jako wskaźnik aktywacji; pomiar prowadzi się mierzęc hamowanie dysmutazy nadtlenowej redukcji cytochromu C. 1 x 10θ neutrofili albo traktowanych wstępnie bedanę substancję albo nie, dodaje się do roztworu zawierajęcego cytochrom C /80 yU Mol/ oraz formylomethionyloleucylofenyloalaninę /10 ^θΜ/. Próba kontrolna zawiera dodatkowo 50 /jg dysmutazy nadtlenowej. Po 15 minutach

151 094 inkubacji w 37°C reakcją zatrzymuje sią przez chłodzenie testowanych próbówek w kąpieli lodowej· Testowane próbówki wiruje sią przy 400 g w ciągu 5 minut w celu usunięcia komórek· Redukcję cytochromu C, która jest proporcjonalna do ilości uwolnionego nadtlenowego anionu, mierzy się fotometrycznie przy 550 nm· Wpływ hamujący testowanej substancji na aktywacją PMN przez LPS mierzy eią jak opisano powyżej, przy czym po wstępnej inkubacji leukocytów· Komórki inkubuje się dalej ze stymulującymi stężeniami LPS·

5· Test usuwania węgla· Test ten opiera się na zasadzie, że cząstki o wymiarach 200-250 X /np· cząstki węgla/ mogą być usunięte z organizmu tylko przez fagocytozą makrofagów.

Po dożylnym podawaniu, cząstki węgla są usuwane z obiegu krwi za pomocą fagocytozy makrofagów w wątrobie /gwiaździste komórki Kupffera/ oraz w śledzionie· Oznaczenie aktywacji RES substancji prowadzi sią przez jednorazowe lub powtarzane podawanie w roztworze wodnym lub w postaci zawiesiny· Substancje testowane podaje sią dootrzewnowo lub podskórnie w 4 dawkach dziennych lub raz na 24 godz· przed rozpoczęciem testu· Zawiesiną zawierającą 10% sadzy rozcieńcza się 1% roztworem żelatynowym chlorku sodu do zawartości 16 mg węgla/ml· Każda mysz otrzymuje 0,2/20 g ciężaru ciała dożylnie· Pobiera sią 25/ul krwi przez nakłucie splotu orbitalnego w okrasie 3, 6, 9, 12 i 15 min· po dożylnym podaniu· Krew hemolizuje sią w 2 ml wody destylowanej· Oznacza sią stężenie węgla fotometrycznie· Wtedy zabija się zwierzęta i oznacza sią ciężary wątroby i śledziony·

6· Zakażenie opryszczkowe /mysz/· Podskórnie zakażenie opryszczkowe pozwala na oznaczenie wzrostu reakcji odpornościowej, pod wpływem substancji myszy zakażonej wirusami opryszczki· Przebieg choroby jest przewlekły i umożliwia obserwacją kolejnego pojawienia się szeregu parametrów· Zmiany opryszczkowe pojawiają sią na miejscu zakażenia, następnie zamieniają się w owrzodzenie, wreszcie sąsiadująca noga staje sią sparaliżowana i paraliż stopniowo wzrasta do śmierci· Immunokompetentna naga /bez włosów/ mysz zostaje śródskórnle zakażona w dniu 0 przez śródskórne podanie badanego inokulum w objętości 0,025 ml /ηρ· 1 χ 10& tworzących płytki jednostek Herpes simplex typ i/raysz/· Testowaną substancją podaje sią dootrzewnowo w roztworze, np. w soli fizjologicznej /0,1 ml/·

Systemiczne zakażenie opryszczkowe również pozwala oznaczyć wzrost reakcji odpornościowej, pod wpływem substancji myszy zakażonej wirusami opryszczki· Immunokompetentne myszy NMRI zakaża się w dniu 0 przez dootrzewnowe podanie badanego inokulum w objętości 0,1 ml /np·

1,3 χ 10⁵ tworzących płytki jednostek Herpes simplex typ 1/mysz/· Testowaną substancją podaje się podskórnie w roztworze, np· w soli fizjologicznej·

Testowane zwierzęta obserwuje się do 20 dnia po zakażeniu 1 rejestruje się zmiany, paraliż 1 śmierć· Mierzy się następujące parametry 1 porównuje sią je z kontrolnymi zakażeniami lub ze standardami: a/ liczba myszy ze zmianami /kumulatywnie/, b/ liczba myszy z paraliżem /kumulatywnie/, c/ średni czas przeżycia, d/ wskaźnik przeżycia· Przy doświadczalnym zakażeniu HSV-1, związki o wzorze 3 powodują znaczne polepszenie w przebiegu choroby, czasie 1 wskaźniku przeżycia w stosunku do nietraktowanych prób kontrolnych· Efekt ten obserwuje sią po jednokrotnym dootrzewnowym lub odpowiednio, podskórnym podaniu pomiędzy dniem 0 lub -1 1 *6·

7. Indukcja CSP /czynnik stymulujący kolonie/· Czynniki XSF stanowią substancje pośredniczące wytwarzane przez organizm w następstwie zakażeń lub pod wpływem toksyn· Ich działanie biologiczne jest złożone, są one wykrywane przez stymulację proliferacji układu hamopoetycznego, zwłaszcza komórek szpiku kostnego· Myszom BgDgF^ podaje się jednokrotnie lub wielokrotnie, pozajelitowo lub doustnie, badane substancje do dawki 50 mg/kg· Pobiera sią osocze z testowanych zwierząt po różnych kolejnych odstępach czasu· Miano aktywności XSF osocza mierzy się w próbie hodowli komórek za pomocą wskaźników proliferacji komórek szpiku kostnego myszy ^B6^D2^F1 ZD*W®t-^calf, The Hemopoletic Colony Stimulating Faclors, 1984, Elserier, T.Mosmann, □•Immunol. Methods, 65 /1983/ 55-63; L.M. Green ln· I«Immunol· Methods, 70 /1984/ 257-268J.

Związki o wzorze 3 wprowadzają w różnym stopniu czynniki CSF u myszy, przy czym obsorwu* Je elę również różnice czasowo-kinetyczne w aktywnościach XSF może być korzystne w zastosowaniu terapeutycznym·

8· Indukcja Interleukin-1 /11-i/· Oznaczania stymulacji komórek, pod wpływem substancji do wytwarzania 11-1 głównie przeprowadza się w próbach kultur tkankowych· Najpierw odzyskuje elę makrofagl zarówno etałe Jak i ujawniona za pomocą troglikolanu, w postaci przylegających

151 094 makrofagów· Te makrofagi inkubuje eię w środowisku RPM w cięgu 48 godzin z różnymi stężeniami testowanej substancji i zbiera się eupernatanty komórkowe· Sę one sprawdzone na aktywność 11-1 w kulturach tymocytów z myszy C3H/hs3· Wywołuje się proliferację tymocytów z tych supernatantów zawierających 11-1 wytwarzaną przez makrofagi, w cięgu 72 godzin inkubacji· Proliferencję mierzy się przez wprowadzanie tymidyny 3H. w liczniku scyntylacyjnym /3«Gery i in·., 3·Εχρ· Med · 196, /1972/, 128-142; J.Oppenheim i in. Cellular Immunol. 50 /1980/ 71-81 /.

Zwięzki o wzorze 3 wykazuję w różnych zakresach /w stężeniach 0,1 - 50 jug/ml/ zdolność wywoływania produkcji II-1 w makrofagach·

9· Indukcja tolerancji na LPS /endotoksynę/ /tolerancja na śmiertelność/· Tak zwana tolerancja może być wywołana u myszy za pomocę pozajelitowego podawania LPS Jedno- trzykrotnie w cięgu dnia· Tolerancja ta chroni zwierzęta przed śmiertelnymi skutkami LPS po podaniu galaktozaminy £ patrz wywoływanie wstrzęsów endotoksycznych u myszy powyżej/·

Zwięzki o wzorze 3 wywołuję tę tolerancję już po jednorazowym dootrzewnowym podaniu 0,25 mg/mysz wstępnie traktowaną /tolerancyjnę/ mysz poddaje się działaniu LPS w dawkach 0,01 /ig LPS + 8 mg galaktozamlny/mysz,dootrzewnowo w różnych czasach/1 dzień do 3 tygodni/ po ostatnim traktowaniu· Większa część zwlerzęt przeżywa to podanie LPS, zwłaszcza po powtarzanym /3 razy/ podaniu, w porównaniu z nletraktowanyml wstępnie kontrolnymi zwierzętami·

Ponadto, zwięzki o wzorze 3 również wykazuję działanie przeciwzapalne, zwłaszcza w zapaleniu nieswoistym, w zapaleniu wywołanym immunologicznie i w zapaleniu wywołanym przez nadwrażliwość oraz w reakcjach alergicznych· Działanie to można wykazać w różnych metodach testowych np· przez badanie wpływu na syntezę prostaglandyny in vitro i in vivo· Badane in vitro hamowanie uwalniania PBE₂ 1 PGF^oć wywołanego przez LPS i przez zymosan· Otrzewnowe leukocyty myszy NMRL, stymulowane tioglikolanem, inkubuje się 24 godz· z LPS z testowaną eubstan cję· Po zmianie środowiska 1 trzykrotnym przemyciu komórki stymuluje się 2 godz· z LPS lub 1 godz· z zymosanem odpowiednio· W tych supernatantach oznacza się PGE₂ 1 PGF^oć· Stwierdza się hamowanie wytwarzania PGE₂ wywołane przez LPS lub zymosan·

Mierzy się hamowanie uwalniania PGE^ przez leukocyty otrzewnowe myszy po wstępnym traktowaniu testowanymi substancjami in vivo· Grupy po 3 myszy NMRI traktuje się dootrzewnowo, w dniach 1, 2 i 3 za pomocę LPS lub o odpowiednio testowanę substancję· W 4 dniu podaje się tym zwierzętom i grupie kontrolnej 1,5 ml tiogllkolanu, dootrzewnowo: na 7 dzień zbiera alę otrzewnowe leukocyty myszy 1 stymuluje się je LPS· Stwierdza się znaczne obniżenie uwalniania PGE₂ w porównaniu z próbami kontrolnymi·

W następnym teście bada eię wpływ na działanie pokoagulacyjne /PCA/· Po stymulacji za pomocę LPS ludzkie komórki śródbłonkowe syntetyzuję PCA, co stwierdza się przez skrócenie czasu koagulacji plazmy· Otrzewnowe leukocyty myszy po traktowaniu LPS i otrzewnowe leukocyty /otrzymane z królików/ po wyzwoleniu uogólnionej reakcji Schwartznana również ekracaję czas koagulacji ponownie zwapnionej plazmy· W celu zbadania wpływu na PCA wywołanego przez LPS in vltro, otrzewnowe leukocyty myszy z myszy ΒθΟ^^Η, stymulowane przez tioglikolan, traktuje się przez noc samym LPS lub odpowiednio· LPS i testowanę substancję w środowisku DMEM pozbawionym osocza z ambrionu cielęcia /FCS/· /Projekt testu a/· W projekcie testu b/ otrzewnowe leukocyty myszy traktuje się w cięgu 24 godzin· LPS lub odpowiednio badanę substancję· Po zmianie środowiska komórki stymuluje się przez noc LPS· Czas koagulacji ponownie zwapnionej ludzkiej plazmy kontrolnej mierzy się metodę Hakena po dodaniu zawiesiny otrzewnowych leukocytów myszy, którę uprzednio wielokrotnie zamrażano i traktowano ultradźwiękami·

Dodanie testowanej substancji obniża PCA wywołane przez LPS, w porównaniu do wartości kontrolnych, co objawia się wzrostem czasu koagulacji· Wstępne traktowanie testowanę substancję podobnie wywołuje obniżenie PCA·

In vlvo można wykazać wpływ wywoływanej przez LPS PCA w otrzewnowych leukocytach myszy, po wstępnym traktowaniu testowanę substancję, w następujący sposób: Myszy BgD₂ ^Fl traktuje się dootrzewnowo w dniach i, 2 1 3, za pomocę LPS lub odpowiednio, testowanę substancję· Na 3 dzień wszystkie zwierzęta ponadto dostały 1,5 ml tiogllkolanu dootrzewnowo· Na 6 dzień, zebrano otrzewnowo leukocyty, próbki z każdego zwierzęta nastawiono na 1 x 10 komórek/ml 1 stymulowano 24 godz· za pomocę LPS w środowisku DMEM, pozbawionym FCS· Wstępne traktowanie LPS lub odpowiednio, testowanę substancję wywołuje znaczne obniżenie PCA· Podobne obniżenie można stwierdzić w

151 094 królikach. PCA otrzewnowych leukocytów królika nożna obniżyć po wywołaniu uogólnionej reakcji Schwartzmana oraz przez wstępne traktowanie za pomocę LPS lub testowanę substancję, odpowiednio w celu zbadania hamowania lokalnej reakcji Schwartzmanna traktuje się wstępnie grupy po trzy króliki Chinchilla, dożylnie lub dootrzewnowo, za pomocę LPS lub testowanę substancję, odpowiednio w dniach 1, 2 i 3. Na 5 dzień podaje się LPS śródskórnie: /40, 20,

10, 5, 2,5 i 1,25 >ig/· Na 7 dzień wyzwala eię reakcję za pomocę 2 jig LPS/kg, dożylnie.

Doświadczanie ocenia się półllościowo przez badanie martwic skóry. Obserwuje się prawie całkowite hamowanie reakcji Schwartzmanna po wstępnym traktowaniu LPS lub testowanę substancję, odpowiednio·

Następnie, zwięzki o wzorze 3 również wykazuję działanie przeciwnowotworowe, co wykazuję następujęce testy:

1. Indukcja czynnika martwicy nowotworowej /TNF/· W celu stymulowania makrofagów szpiku kostnego myszy rozcieńcza się komórki szpiku kostnego z myszy SOF^ /około 10-13 dniowe, indukowane CSF/ do 1 x 10⁶ konórek /nl w środowisku /RPMI 1640 ♦ 1% Pan/Strep /5000 Jedn/nl/ ♦ 1% glutaminy_7 1 Inkubuje się Ja w płaskich płytkach do aikroalareczkowania z testowanymi substancjami w roztworze o stężeniu końcowym rzędu 100 >ug - 0,1 /jg/ml/etapy rozcieńczania 1:10/ w cięgu 4 godz. w 37°C/5% C0₂· Po przssęczsniu przez filtry 0,45 /jm supernatanty zamraża się w -70°C aż będę potrzebna.

Hoduje się wstępnie komórki 1. 929 przez noc /37°C, 5% C0₂/ w płytkach do mikroraiaraczkowania przy 3 x 10 komórkach /otwór/100 jul, następnie dodaje się 100 /j1 z każdej próbki i kulturę dalej rozcieńcza się w etapach 1:2. Dodaje się 100 jul aktynomycyny D /8 jug/ml/ środowiska/ i dalej inkubuje eię w cięgu dalszych 18 godz. w 37°C /5% C02· Po usunięciu suparnatantów pozostałę warstwę komórek planu zabarwia się roztworem Giemaa i mierzy się absorpcję przy 620 nm za pomocę urzędzenia Tietertek Multiscan Autoreader /z przepływem/· Jako jednę jednostkę TMF przyjmuje się działanie, które daje 50% lizy traktowanych komórek L 929.

2, Test na czerniaku 816F1. Komórki czerniaka 816F1 hoduje się 5 dni in vitro. Komórki synchronizuje się dzień przed testem przez przerwanie monowarstwy na pojedyńcze komórki stosujęc EDTA trypsynę i zawrecajęc całę ilość do tej samej butelki ze świeżym środowiskiem. Komórki liczy się i doprowadza do 1Οθ komórek/ml środowiska. 0,1 ml zawiesiny komórek /10® komórek/ wstrzykuje się dożylnie do żyły ogonowej myszy ^{Po 21} dniach myszy zabija się i liczy ilość nowotworów płuc· Testowanę substancję przeprowadza się w roztwór i wstrzykuje się dootrzewnowo w dniach -6,-4 i -1.

Stwierdzono, że zwięzki o wzorze 3 wykazuję działanie immunoprofilaktycznę: co objawia się w obniżeniu ilości przerzutów czerniaka B1GF1 w płucach· w dalszym teścia na aktywność terapeutycznę, myszy traktuje się na 3,6,8,10,13 i 15 dzień po zaszczepieniu komórek nowotworowych· Tu także obserwuje się znaczne zredukowanie ilości przerzutów·

Zwięzki o wzorze 3 sę więc wskazane do stosowania jako modulatory nieswoistej oporności antybakteryjnej, w systemicznym zwiększaniu reakcji odpornościowej oraz w zwiększaniu nieswoistej odporności· Zwięzki o wzorze 3 eę więc wskazana do stosowania w leczeniu lub w leczeniu wspomagajęcym /to jest razem z innymi specyficznymi lub wspomagajęcymi postaciami terapeutycznymi/ w warunkach zwięzanych z obnlżonę reakcję odpornośclowę,zwłaszcza ze zmniejszonę humoralnę reakcję odpornośclowę i/lub z obnlżonę reakcję nadwrażliwości typu opóźnionego oraz w leczeniu stanów,w których ogólnie wskazane jest modulacja reakcji odpornościowej· Szczególnie, zwięzki o wzorze 3 sę wskazane do zastosowania w leczeniu lub leczeniu wspomagajęcym stanów patologicznych opartych na samoistnych niedoborach immunologicznych lub niedoborach immunologicznych typu spotykanego u pacjentów geriatrycznych lub u pacjentów z ciężkimi poparzeniami lub z uogólnionymi zakażeniami· Zwięzki o wzorze 3 sę również wskazane do zastosowania wleczeniu lub w leczeniu wspomagajęcym chorób wirusowych /takich jak rozsiana opryszczka, postępujęca ospa i rozsiane choroby varicellay< choroby Hodgkina i dalszych złośliwych nowotworów· Ponadto, zwięzki o wzorze 3 sę wskazane w przeciwdziałaniu wstrzęsom endotoksycznym, np. w wypadkach, oparzeniach i interwencjach chirurgicznych oraz jako środki przeciwzapalne· Dla powyższych zastosowań dawka będzie się wahać, oczywiście, zależnie od użytego zwięzku, sposobu podania 1 żędanego leczenia· Na ogół uzyskuje się zadowalajęce wyniki przy podawaniu dawki dziennej lub w postaci jednorazowego podania, dla osięgnięcia efektu wspomagajęcego, np. w leczeniu wspomagajęcym, przy dawce od około 0,0015 mg/kg

151 094 do około 1 mg/kg ciężaru ciała zwierzęcia· Podaje się np· pozajelitowo, korzystnie dootrzewnowo· Dla większych ssaków wskazana dawka dzienna wynosi od około 0,1 mg do około 70 mg, odpowiednio podana, np. w przypadku dawki dziennej, a w dawkach podzielonych 2-4 razy dziennie dawki w postaci jednostkowej zawierającej od około 0,025 do około 35 mg domieszanych związków lub w postaci o przedłużonym działaniu. Wskazana całkowita dawka pojedyńcza o charakterze pomocniczym jest rzędu do 70 mg związku.

Ze względu na działanie immunomodulujące związki o wzorze 3 są również wskazane jako środki pomocnicze w szczepionkach. Wskazane do tego celu dawka wynosi od około 0,5 mg do około 100 mg, korzystnie około 70 mg podana w szczepienia, korzystnie z powtórzeniem tej eamej dawki

2-4 tygodnie później.

Preparaty farmaceutyczne zawierające zwięzek o wzorze 3 mogę być sporządzane według typowych sposobów galenowych, np. przez zmieszanie z konwencjonalnymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami lub nośnikami. Mogę być one wytwarzane np. w postaci roztworów do wstrzykiwać. Stanowię również część wynalazku. Wynalazek dotyczy również sposobu leczenia chorób i zakażeń, które opisano powyżej, przez podanie pacjentom potrzebującym takiego leczenia terapeutycznie skutecznej ilości zwięzku o wzorze 3 lub, o ile jeet korzystne, jego fizjologicznie dopuszczalnej soli.

Następujęce przykłady ilustruję wynalazek. Wszystkie temperatury sę w stopniach Celsjusza. EOTA oznacza kwas stylenodlaminotstraoctowy, OTA oznacza 1,4-ditioerytryt, UDP oznacza fosforan urydynowy, a tris oznacza tris/hydroksymetylo/aminometan.

Przykład I. 2-dezoksy-3-O-//R/-3-hydroksytetradekanoilo^7-2-//R/-3-hydroksytet radekanoiloamidoJ-1-0-fosfono- oĆ -D-glukopiranoza· a/ 4,6-0-benzylideno-3-0-/“/R/-3-benzylokeytet radekanoilo_7-2-/”/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido^-2-dezoksy-1-0-dibanzylofosfono- -D-glikopiranoza· Do roztworu 3,9 g 4,6-0benzylideno-2-//R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido _7-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono- oC -D-glukopiranozy, 2 g kwasu /R/-3-benzyloksytrldekanokarbokeylowego-l i 50 mg 4-dimetyloaminopirydyny w 20 ml chlorku metylenu, ochłodzonego do -10° dodaje się 2 g dicykloheksylokarbodlimidu 1 mieszaninę reakcyjnę utrzymuje się w 4° przez noc. Następnie mieszaninę odsęcza się, przesęcz odparowuje do suchości, pozostałość rozpuszcza w małej ilości mieszaniny toluen/octan etylu/8/2/ 1 chromatografuje się tym rozpuszczalnikiem. Temperatura topnienia 96 - 98°. /oć_7o°. * 33,3° /c a 1, chloroform/ Rf /toluen/octan etylu 2/1/ « 0,5.

b/ 2-dezoksy-3-O-/” /R/-3-hydroksytet radekanoilo _7-2-/“ /R/-3-hydroksy tet radekanoiloamido .7-1-0-fosfono--D-glukopiranoza. 4,2 g 4,6-0-benzylideno-3-0-/~/R/-3-benzyloksytetradekanoilo_7“2-//R/-3-benzyloksytatradekanoiloamido_7-2-dezoksy-l-0-dlbenzylofosfono- oC-D-glukoplranozy rozpuszcza się w 900 ml mieszaniny tetrahydrofuran/woda /85/15/ i uwodarnia się z

1,5 g 10% palladu na węglu drzewnym w cięgu 2 godzin pod ciśnieniem 10·10⁵ Pa 1 w 40°, katalizator odsęcza się, tetrahydrofuran odparowuje się, a wodną zawiesinę liofilizuje się. /oć/^ w * 28,5° /c 0, chloroform ψ l kropla metanolu/ Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20/ - 0,56.

Dalsze oczyszczania można prowadzić następująco: 10 g 2-dezoksy-3-0-//R/-3-hydroksytet radekanoilo _7-2-/ /R/-3-hydrokeytat radekanoiloamido _7-l-0-f osf ono- oć -D-glukoplranozy i 1,7 g tris w 150 ml metanolu poddaje się działaniu ultradźwięków w kąpieli sonikatorowej w cięgu 10 min. w 45°. Zawiesinę wiruje się i przeźroczysty supernatant dekantuja się znad palety. Do tego roztworu dodaje się 1,7 g tris /rozpuszczonego w 20 ml metanolu/, roztwór zaszczepia się i pozwala się na wystąpienie krystalizacji w temperaturze pokojowej. Otrzymuje się sól dl-tris zwięzku tytułowego.

Ług macierzysty odparowuje się do suchości. Pozostałość i paletę rozpuszcza się razem w mieszaninie 300 ml chloroform, 600 ml metanolu 1 240 ml wody /wolnej od pirogenów/. Dodaje się dalsze 300 ml chloroformu i 300 ml O,1N kwasu solnego, ostrożnie miesza się i pozostawia eię do rozdzielenia faz. Oddziela się fazę chloroformowę i odparowuje do suchości. Pozostałość stanowi zanieczyszczoną 2-dezoksy-3-0-//R/-3-hydroksytetradekanoilo_-7-2-//R/-3-hydrokaytetradekanoiloamldo^7-1-0-fosfono- oć-glukoplranozę.

Otrzymany produkt traktuje eię ultradźwiękowo z tris 1 metanolem, jak opisano powyżej 1 wiruje się. Roztwór chromatografuje się na kolumnie Sephadex LH20 z metanolem jako eluentem.

151 094

Frakcjo z produktem odparowuje alę do suchości. Otrzymuje się sól mono-tris zwięzku tytułowego. 5,1 g tego produktu rozpuszcza się w 45° w 40 ml metanolu w kąpieli sonikotorowej, dodaje się roztwór 0,74 tris w 10 ml metanolu, roztwór zaszczepia sią i pozostawia do krystalizacji najpierw w temperaturze pokojowej, potem w 4°· Otrzymuje sią dalsze ilości krystalicznych soli di-tris związku tytułowego·

Pozostałość z ługu macierzystego i paletę z wirowania można poddać następnemu cyklowi oczyszczania· Temperatura topnienia: 183-185° z rozkładem /”ο£/οθ « *15° /c «Iw wodzie/·

Przykład II. 3-dezoksy-2-0-//R/-3-hydroksytetradekanoilo /-3-/ /R/-3-hydrokaytet radekanolloamido /-1-0-fosfono- oć -O-glukopiranoza.

a/ 2-0-/*/R/-3-benzyloksytetradekanoilo/-3-//R/-3-benzylokaytetradekanoiloamido/-3dozoksy-l-O-dibanzylofosfono-4,6-0-izopropylideno- oć-O-glukopiranoza· Do roztworu 4,65 mg 2-0/~/R/-3-benzylokaytetradekanoilo /-3-/ /R/-3-benzyloksytat radakanoiloamldo /-3-dezokay-4,6-Oizopropylldano-O-glukoplranozy w 40 1 bezwodnego tetrahydrofuranu, ochłodzonego do -70° dodaje aię 8 al 1,6 M butylolitu w heksanie· Po 5 min· dodaje się roztwór 3,8 g chlorku dlbanzylofosforowego w 10 ml benzenu, w tej samej temperaturze· Miesza się dalszo 10 min· w -70°, dodaje się 0,3 ml kwasu octowego 1 roztwór zatęża się do 1/4 początkowej objętości· Roztwór rozcieńcza eię 200 ml chlorku metylenu, ekstrahuje 50 ml wody, 50 al rozcieńczonego roztworu kwaśnego węglanu sodu i 50 ml roztworu chlorku sodu, suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości· Pozostałość chromatografuje się /toluen/octan etylu 7/3/· RF /toluen/octan etylu 2/1/ 0,58· b/ 3-dezoksy-2-0-//R/-3-hydroksytetradekanoilo/-3-//R/-3-hydroksytatradakanoiloamldo / -1-0-fosfono- oć-D-glukopiranoza· Roztwór 980 mg 2-0-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo/-3-//R/3-benzyloksytatradekanolloamido/-3-dezoksy-l/o-dibenzylo-fosfono-4,6-0-izopropylideno- OC-Dglukopiranozy w 100 ml tetrahydrofuranu uwodornia aię około 1 godz· 300 mg 10% palladu na węglu drzewnym, pod atmosferycznym ciśnieniem· Następnie odsącza się katalizator, dodaje wodę /10 ml/ i Dowax AG50WX8 Η* 1 całość miesza się w temperaturze pokojowej do całkowitego odszczapienia grupy izopropylidanowej. Wymieniacz jonowy odsącza się, roztwór zobojętnia się tris 1 odparowuje się tetrahydrofuran i wodę pod zmniejszonym ciśnieniem· Pozostałość rozpuszcza się w metanolu i chromatografuje się na Sephadax LH20. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda /25/75/10/20

0,65.

Przykład III. 2,3-di-0-//R/-3-hydroksytat radakanoilo/-l/o-f osf ono- oC-Dglukoplranoza· a/ 4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo/- oć-1-0-dibanzylofosfono--D-glukopiranoza. Do roztworu 1 g 4,6-0-banzylidano-2,3-di-0-//R/-3-banzyloksytetredekanoilo/-D-glukopiranozy w 10 ml suchego tetrahydrofuranu, ochłodzonego do -70° wkrapla alę 0,9 ml 1,6 M butylolitu w heksanie. Po 5 min. w taj temperaturze wkrapla się roztwór 420 mg chlorku dibenzylofosforowego w 4 ml benzenu. Miesza się dalej 10 min. w -70° roztwór zobojętnia się kwasem octowym 1 odparowuje do suchości. Pozostałość chromatografuje się /żel krzemionkowy, heksan/toluen/octan etylu 4/4/1/. Rf /toluen/octan etylu 6/1/ 0,65.

b/ 2,3-di-0-//R/-3-hydroksytst radekanoilo /-1-0-f osf ono- oć-O-glukopiranoza · 230 mg 4,6-0-banzylideno-2,3-di-0-/ /R/-3-banzyloksytetradekanoilo /-1-0-dibenzylofoefono-oć-D-glukopiranozy rozpuszcza się w mieszaninie tetrahydrofuran/woda /9/1/ 1 uwodornia w ciągu około 5 godz. pod atmosferycznym ciśnieniem z 80 mg 10% palladu na węglu drzewnym. Katalizator odsącza się, roztwór zobojętnia tris i odparowuje się do suchości. Pozostałość chromatografuje się metanolem na Sephadex LH 20. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 25/75/10/20/ 0,65.

Przykład IV. 2-dszoksy-3-0-//S/-3-hydroksytatradakanoilo /-2-/S/-3-hydroksytatradekanolloamido /-1/o-fosfono- ©C-D-glukopiranoza· a/ 4,6-O-banzylidano-3-O-/*/S/-3-benzyloksytetradekanoilo/-2//S/-3-banzyloksytatradakanoiloamldo /-2-dezoksy-l/o-dibenzylofosfono- oC-O-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu la. Rf /toluen/octan etylu 4/1/ « 0,44.

b/ 2-dezoksy-3-0-//S/-3-hydroksytetradekanoilo/-2-//S/-3-hydroksytetradekanoilo/-2/”/S/-3-hydroksytatradakanoiloamldo /-1/o-fosfono- <<-D-glukopiranoza. Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu Ib/· Temperatura topnienia: 150-200° /z rozkładem/. Rf /chlorek metylenu/metanol/amoniak /1/1/1, niższa faza/ 0,5.

151 094

Przykład V· 2-dezoksy-3-0-//R/~3-hydroksy tet radekanoilo ,7-1/o-f osf ono-2/*/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloaraido_7- oC -D-glukopiranoza · a/ 4,6-0-benzylidano-3-0-/ /R/-3-benzyloksytat radekanoilo ,7-2-dezoksy-l-O-dibenzylofosfono-2-/^-/R/-3-tetradekanoil ksytetradekanoiloamido^/- oć -D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje sią analogicznie do przykładu la/· Temperatura topnienia: 82-95° /oć_/§° · +24,1 /c 1, chloroform/· Rf /toluan/octan etylu 2/1/ a 0,7· b/ 2-dezoksy-3-O-//R/-3-hydroksytetradekanoilo _e7-l-0-fosfono-2-//R/-3-tetradekanoilokśytetradekanolloamido_/- OC -D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje sią w sposób analogiczny do przykładu IX b/· +14,3° /c a l, tetrahydrofuran/pirydyna/· Rf /chloro form/metanol/kwas octowy/woda 80/25/5/5/ a 0,35·

Przykład VI· 2-dezoksy-l-O-fosf ono-3-0-te t radekanoilo-2-tet radekanoiloamido

- oC-D-glukopirenoza· ‘ a/4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-3-O-tet rade kanoilo-2- tet radekanoiloamido- oć -D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje sią analogicznie do przykładu 1 a/ stosując kwas tetrakaprynowy i jako eluent toluan/octan etylu 4/1· Temperatura topnienia: 123-129° Rf /toluan/octan etylu 2/1/ a 0,6· b/ 2-dezoksy-l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-2-tetradekanoilo-amido- oć -D-glukopiranoza. Związek tytułowy otrzymuje sią analogicznie do przykładu IX b/· Rf /chloroform/metanol/ kwas octowy/woda 125/75/10/20/ 0,65·

Przykład VII· 2-dezoksy-2-//R/-3-hydroksytet radekanoiloamido /-1-0-fosfono3-0-//R/-3-tetradekanoiloksytatradekanoilo J- oć-G-glukopiranoza · a/ 4,6-benzylidano-2-//R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido J^-2-dezoksy-l-O-dibenzylofosfono-3-0-//R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilooć-D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu I a/, stosując kwas /R/-3-tetradekanoiloksytridekanokarboksylowy-l i jako rozpuszczalnik mieszaninę tolusn/octan etylu 4/1· Temperatura topnienia 89-90 /θ£_7θθ + 30,9° /c 1, chloroform/metanol 1/1/· Rf /toluan/octan etylu 4/1/ 0,5· b/ 2-dezoksy-2-//R/-3-hydroksytet radekanoiloamido _y-l-0-f os fono-3-0-/” /R/-3-tetradeka noiloksytetradekanoilo_7~ oć-D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu IX b/. Liofilizat rozpuszcza się w metanolu i chroma tog rafuje na Sephadex LII 20 stosując ten sam rozpuszczalnik. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 80/25/5/5/ » 0,32.

Przykład VIII. 2-dezoksy-2-/“/R/-3-hydroksytet radekanoiloamido _7-l-0-fosfono3-0-tetradekanoilo- oć-D-glukopiranoza.

a/ 4,6-O-benzylideno-2-//R/-3-banzyloksytet radekanoiloamido ^7-2-dezoksy-l-O-dibenzylofosfono-3-O-tetradekanoilo- oC -D-glukopiranoza. Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu I a/, stosując kwas tridekanokarboksylowy-l; Jako rozpuszczalnik mieszaniną toluen/octan etylu /3/1/. Temperatura topnienia 125,5-126,5° Rf /toluan/octan etylu 3/2/ « 0,6.

b/ 2-dezoksy-2-//R/-3-hydroksytetradekanoiloamido,7-1-O-f os fono-3-O-tet radekanoilo- oć-D-glukopiranoza. 354 mg 4,6-0-banzylideno-2-/'/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido_-7-2dezoksy-l-O-dibenzylofosfοηο-3-O-tatradekanoilo- oć -D-glukopiranozy rozpuszcza sią w 30 ml mieszaniny tetrahydrofuran/woda /9/1/ i uwodornia się z 20 mg palladu na węglu drzewnym w ciągu 10 godz· pod atmosferycznym ciśnieniem. Katalizator odsącza się, a roztwór doprowadza się do pH = 7,5 za pomocą tris/hydroksymetylo/aminometanu· Odparowuje się tetrahydrofuran pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizuje się wodny roztwór. Liofilizat rozciera się na proszek dwukrotnie eterem i suszy. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20/ 0,6.

Przykład IX. 2-ace tamido-2-dezoksy-2-0-/~/R/-3-hyd roksyt et radekanoilo _7“1/ o-fosfono- oć-D-glukopiranoza· e/ 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-3-0-/'/R/-3-benzyloksytetradekanoilo_7-2-dezoksy1-0-dibenzylofosfono-oć-D-glukopiranoza· Roztwór 3,55 g 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-2dazoksy-l/o-dibenzylofosfono-oć-D-glukopiranozy i 2,1 g kwasu /R/-3-benzyloksytridekanokarboksylowy-ί w 15 ml chlorku metanolu ochładza się do 0° i dodaje się 1,32 g dicykloheksylokarbodiimidu i p-dlmetyloaminoplrydynę· Po 2 godz. w tej temperaturze reakcja jest zakończona· Mieszaninę odsącza sią, odparowuje do suchości 1 chromatografuje sią na żelu krzemionkowym ίο

151 094 najpierw mieszaniną chlorek metylenu/metanol /50/1, a następnie mieszaninę toluen/octan etylu /2/1/· Rf /chloroform/metanol 20/1/ 0,7.

b/ 2-acetamido-2-dezoksy-3-0-/*/R/-3-hydroksytetradekanoilo^7-1/o-fosfono-oć -Dglukopiranoza· 2,08 g 2-acetamido-3,6-0-benzylideno*3-0-/“ /R/-3-benzyloksytetradekenoilo_7-2dezoksy-l/o-dibenzylofosfono--D-glukopiranozy rozpuszcza się w mieszaninie tetrahydrofuran/woda /9/1/ i uwodornia się 3 godz· z 1 g 10% palladu na węglu drzewnym pod atmosferycznym ciśnieniem· Katalizator odsącza się i przesącz najpierw odparowuje eią do suchości, a następnie liofilizuje się· Liofillzat rozpuszcza się w metanolu, zobojętnia tris/hydroksymetylo/ aminome tanem i chromatograf uje metanolem na Sephadex LH 20· /oć ♦ 43,3 /c 1-metanol/·

Rf /chloroform/matanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20/ 0,4·

Przykład X· 1-0-foefono-2,3-di-0-//R/-3-tatradakanoiloksytatradekanoiloJ

- oć-D-glukopiranoza· a/ 4,6-0-benzyliden-l-0-dibenzylofosfono-2,3-di-0-//R/-3-tetradekanoilokeytetradekanoiloJ- oć-D-glukopiranoza· Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu III a/, przy oczyszczaniu chromatograficznym na żelu krzemionkowym stosując eter/hekean /1/1/ Jako eluent· Rf /eter/hekean 1/1/ 0,5· b/ 1-0-foefono-2,3-di-0-//R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo^/- oć -D-glukopiranoza. 470 mg 4,6-O-benzylideno-l-O-dibenzylofosfono-2,3-di-0-/”/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloJ

- Oć-D-glukopiranozy rozpuszcza slą w 47 ml tetrahydrofuranu i uwodornia się 1 godz· z 230 ag palladu na węglu drzewnym pod ciśnieniem· Katalizator odsącza się, przesącz zatęża do suchości i pozostałość chromatografuja się na żelu krzemionkowym /chloroform/ metanol/woda/trietyloaaiine 15/10/2/0,2/· Frakcje z produktem zbiera się i odparowuje do suchości· Związek tytułowy otrzymuje się w postaci soli di-trietyloaminowej. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 80/25/5/5 » 0,5·

Przykład XI·- 2-dezoksy-3-0-//R/-3-hydroksytetradekanoilo_7-2-//S/-3-hydroksytetradekanoiloamido^7-1-0-fosfono- oć -D-glukopiranoza· a/ 4,6-0-benzylideno-3-0-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo _7-2-/ /S/-3-benzylokeytetradekanoiloamido_7-2-dezoksy-l/o-dibenzylofosfono--D-glukopiranoza· Związek ten otrzymuje eię analogicznie do przykładu I a/. Rf /toluen/octan etylu /4/1/ 0,44· b/ 2-dezoksy-3-0-//R/-3-hydroksytetradekanoilo_/-2-/~/S/-3-hydroksytatradekanoiloamido_7-l-0-fosfono-oć-D-glukopiranoza. Związek ten otrzymuje się analogicznie do przykładu I b/· Rf /chlorek metylenu/metanol/amoniak 1/1/1, niższa faza/ 0,5·

Tablica

Przykład nr I /CD₃0D/

II / CDCI3/ cd₃od/

III /cd₃oo/

IV /CDCI3/

CD3OD/

Widma NMR

5,49 /dd, 3,5 u, 7,5 Hz, 1H/; 5,24 /dd, 9,5 u, 10,5 Hz, lH/j 4,17 /ddd, 2,5, 3,5 u, 10,5 Hz, 1H/; 4.0 /m, 3H/j 3.90 /dd, 2 12 Hz, 1H/: 3,75 /dd, 5,5 u, 12 Ηζ, lH/> 3.71 /a. Trie/j 3,63 /t, 10 Hz. 1H/.

u.

5,77 /dd. 3,5 u. 7,5 Hz, iH/> 4,77 /ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H/; 4,38 /dd, 9,5 u. 10,5 Hz/; 3,8 bis 4,1 /m, 4H/, 3,73 /dd,

5,5 u. 12 Hz, 1H/, 3,53 /t, 10 Hz, 1H/.

5,71 /dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H/; 5,48 /t. 10 Hz, 1H/. 4,77 /ddd,

2,4 u· 10 Ηζ· 1H/, 3,9 bis 4,05 /m, 3H/, 3,86 /dd, 2 u. 12 Hz, 1H/, 3,7 /dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H/, 3,67 /e. Tris/, 3,58 /t, 10 Hz, 1H/.

5,58 /dd, 3 u. 7 Hz, 1H/; 5,22 /t, 10 Hz, 1H/, 4,19 /dt, 3 u. 10 Hz. 1H/. 3,8 bis 4,1 /m, 4H/, 3,7 /s, Tris dd, 1H/, 3.46 /t, 10 Hz, 1H/.

151 094

Tablice - c.d.

Przykład nr

V /CDCI3/ cd₃od/

VI /etap a/ /zabezpieczony/ /COClg/

Widna NMR r - - 5,46 /dd, 3 u. 7 Hz. 1H/, 5,22 /t, 10 Hz, 1H/, 5,17 /bi, 1H/, 4,19 /dt, 3 u. 10 Hz, 1H/, 3,9 bis /4,1 /, 3H/, 3.7 /s, Tria/, 3,65 /dd, 1H/, 3,51 /t, 10 Hz, 1H/.

7,38 /οι, 15H/, 5.70 /dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H/, 5,63 /d, 9,5 Hz, 1H/, 5,50 /s, 1H/, 5,25 /t, 10 Hz, 1H/ 5,08 /., 4H/, 4,36 /a, 1H/, 4,08 /dd. 5 u, 10 Hz, 1H/, 3,95 /dt, 5 u. 10 Hz, 1H/, 3.73/t, 10Hz, 1H/, 3,69/t, 10Hz, lH/,2,29 /m, 2H/,

1,89 /m, 2H/.

VII /etap a/ /zabezpieczony/ /CDCI3/

VIII /etap a/ zabezpieczony/

CDCI3/

IX /etap a/ zabezpieczony/ /CDOD/ /etap a/ zabezpieczony/ /cociy

XI /etap a/ zabezpieczony/ /COCI3/

7,2 bis 7,45 /1», 20H/, 6,34 /d, 9 Hz, 1H/, 5,77 /dd, 3,5 u.

Hz, 1H/, 5,49 /s, 1H/, 5,29 /t, 10 Hz, 1H/, 5,14 /quintett, 6 Hz, 1H/, 5,0 /., 4H/, 4,51 u. 4,41 /AB, 12 Hz, 2H/, 4,41 /η, 1H/, 4,08 /dd, 5 u. 10 Hz, 1H/, 3,95 /dt, 5 u. 10 Hz, 1H/ 3,7 /β, 3H/, 2,58 u. 2,47 /ΑΒΧ. 5,5, 7,5 u, 15,5 Hz, 2H/.

7.2 bis 7,45 /., 20H/, 6,29 /d, 9Hz, 1H/, 5.74 /dd, 3,5 u.

Hz, 1H/, 5,49 /s, 1H/, 5,30 /t, 10Hz, 1H/, 5,0 /β, 4H/,

4,52 u. 4,42 /AB, 11 Hz, 2H/, 4,44 /bi, 1H/, 4,03 /dd, 5 u.

Hz, 1H/, 3,94 /dt, 5 u. 10 Hz, 1H/, 3,7 /β, 3H/, 2,15 bis 2,35 /bi, 4H/.

5,47 /dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H/, 5,23 /dd, 9,5 u. 10,5 Hz, 1H/, 4,18 /ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H/, 3,90 /m, 3H/, 3,85 /dd.

u. 12 Hz, 1H/, 3,72 /dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H/, 3,68 /s, Tris/, 3.61 /t, 10 Hz, 1H/, 1,94 /s, 3H/.

7.3 bis 7,45 /m, 15H/, 5,92 /dd, 3,5 u. 6,7 Hz, 1H/, 5,60 /t, 9,5 u, 10 Hz, 1H/, 5,48 /s, 1H/, 5,02 /bis 5,2 /bi, 6H/, 4,95 /ddd, 2,5, 3,5 u. 9,5 Hz, 1H/, 4,10 /dd, 4,5 o. 10 Hz, 1H/. 3,95 /ddd, 5,9 u. 10 Hz, 1H/, 3,67 /t, 9,5 Hz, 2H/,

2,60 /bi, 2H/, 2,38 /d, 6,5 Hz, 2H/, 2,24 /t, 7,5 Hz, 2H/,

2,12 /t, 7,5 Hz, 2H/.

7.2 bis 7,42 /m, 25H/, 6,49 /d. 9Hz, 1H/, 5,77 /dd, 3,5 u.

Hz, 1H/, 5,45 /s, 1H/, 5,35 /t, 10 Hz, 1H/, 5.0 /β, 4H/, 4,54 u. 4,40 /AB, 11 Hz, 2H/, 4,47 u. 4,36 /AB, 11 Hz, 2H/, 4,45 /ra, 1H/, 3,9 bis 4,1 /m, 2H/, 3,5 bis 3,8 /, 4H/,

2,58 /dd, 6,5 u. 15,5 Hz, 1H/, 2,34 /dd, 6 u. 15,5 Hz, 1H/,

2.2 /bi, 2H/.

Zwięzki stosowane Jako substancje wyjściowe mogę być wytwarzane sposobami opisanymi w poniższych przykładach.

Przykład A. 4,6-0-benzylideno-2-/“/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamidoJ -2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-o£-D-glukopiranoza /do przykładów I, VII, VIII/· a/ 2-/-/R/-3 -benzyloksytetradekanoiloamido_-7-2-dezoksy-D-glukopiranoza· Mieszaninę 5,4 chlorowodorku O-glukozaraony, 10,8 g /N-//R/-3-bsnzyloksytetradekanoiloksy^/ sukcynimidu i 5 ml diizopropyloetyloaminy w 25 ml suchego dimetyloformamidu miesza się 24 godz· w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik oddestylowuje się, a pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie 150 ml chloroformu, 300 ml metanolu i 120 ml wody. Po dodaniu dalszej porcji 150 ml chloroformu i 150 ml wody oddziela się niższę fazę i przemywa dwukrotnie górnę fazę składajęcę się ze 100 ml chloroformu, 100 »1 metanolu i 90 ml wody. Roztwór odparowuje się

151 094 do sucha i suszy pod wysokę próżnię· Uzyskany produkt stosuje się w następnym etapie bez dalszego oczyszczania·

Do analizy oczyszcza się chromatografleżnie małę część surowego produktu /toluen/ etanol 9/1/. Temperatura topnienia 150 - 158° £« + 53° /c 1, dimetyloformamid/

Rf /chloroform/metanol 9/1/ 0,3· b/ 4,6-0-benzylideno-2-/*/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido_7-2-dezoksy-Dglukopiranoza. Roztwór 5,83 g 2-/'/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido_7-2-dezoksy-D-glukopiranozy, 3 g benzaldehydodimetyloacetalu i 500 mg jednowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego w 200 ml bezwodnego dimetyloformamidu utrzymuje się w cięgu około 3 godz· w 55-60° 1 pod 2 2 ciśnieniem 30*10 -40*10 Pa w wyparce obrotowej· Nie pozostaje po tym nic z substancji wyjściowej· Większość dimetyloformamidu oddestylowuje się, dodaje się 500 ml chlorku metylenu i roztwór ekstrahuje się dwukrotnie 200 ml rozcieńczonym roztworem kwaśnego węglanu sodu i 200 ml wody· Roztwór suszy się nad siarczanem sodu, odparowuje do suchości, a pozostałość chromatografuje się /toluen/octan etylu 6/4/· Temperatura topnienia 162 - 165° /oćL7q° * +5,5° /c 1, chloroform/· Rf /toluen/octan etylu 1/1/ « 0,2· c/ 4,6-O-benzylideno-2-/' /R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido y-2-dezoksy-l/odibenzylofosfono- oś -D-glukopiranoza· Oo roztworu 4,86 g 4,6-0-benzylideno-2-//R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido ./-2-dezoksy-O-glukopiranozy w 40 ml bezwodnego tetrahydrofuranu ochłodzonego do -70° wkrapla się 8 ml 1,6 M butylolitu w heksanie· Po 5 minutach w tej temperaturze wkrapla się roztwór 3,8 g chlorku dibenzylofosforu w 10 ml benzenu. Po dalszym mieszaniu w cięgu 10 min w -70 dodaje się 0,3 ml kwasu octowego i roztwór zatęża się do 1/4 jego poczętkowej objętości. Roztwór rozcieńcza się 200 ml chlorku metylenu, ekstrahuje 50 ml wody, 50 ml rozcieńczonego roztworu kwaśnego węglanu sodu i 50 ml roztworu chlorku sodu, suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości. Pozostałość chroma tog rafuje się /toluen/octan etylu 7/3/. Temperatura topnienia 102 - 105°. /oć/³⁰ +31,7° /_c » 1, chloroform/ Rf /toluen/ octan etylu 1/1/ 0,32.

Przykład B. 4,6-0-benzylideno-2,3-di-O-/ /R/-3-benzyloksytetradekanoilo_7-D-glukopiranoza /dla przykładu III/· a/ trichloroetylo-2,3,4,6-tetra-O-acetylo- β -O-glukopiranozyd. Do chłodzonego lodem roztworu 2,34 g penta-O-acetylo-D-glukopiranozy w 9 ml trichloroetanolu dodaje się 0,9 ml eteratu trifluorku boru i otrzymuje się roztwór w tej temperaturze w cięgu 4 godz. Następnie roztwór wylewa się do 100 ml lodowatej wody, ekstrahuje się 100 ml chlorku metylenu, oddziela się fazę organicznę, przemywa 50 ml roztworu kwaśnego węglanu sodu i 50 ml wody, suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości. Po chromatograficznym oczyszczeniu /żel krzemionkowy, toluen/octan etylu/ 4/1/ produkt krystalizuje z octanu etylu/eteru naftowego· Temperatura topnienie 138 - 14O°C· Rf /toluen/octan etylu 1/1/ 0,67· b/ trichloroetyło 4,6-0-benzylideno- β -D-glukoplranozyd· 7,13 g trichloroetylo2,3,4,6-tetra-O-acetylo- β -D-glukopiranozydu rozpuszcza się w mieszaninie metanolu 1 chlorku metylenu, roztwór ochładza eię lodem i poddaje się reakcji z roztworem metanolanu sodu /60 mg sodu w 26 ml metanolu/· Po 2 godz· w 0°C roztwór zobojętnia się za poaocę Dowex AG WX8 H*, odsęcza się wymieniacz jonowy 1 usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem· Pozostałość rozpuszcza się w 60 ml benzaldehydu, dodaje się 4,1 g chlorku cynku 1 całość miesza się 10 godz· w temperaturze pokojowej· Mieszaninę następnie wylewa się na lodowatę wodę, ekstrahuje eię eterem, roztwór eterowy suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości· Pozostałość chromatografuje się /żel krzemionkowy, toluen/octan etylu 4/1/· Rf /chloroform/ metanol 9/1/ 0,60· c/ trichloroetylo-4,6-0-benzylideno-2,3-0//R/-3-benzyloksytetradekanoilo_7- β -Dglukoplranozyd· Do roztworu 800 mg trlchloroetylo-4,6-0-benzylideno- β -D-glukopiranozydu,

1,4 g kwasu /R/-3-benzyloksytridekanokarboksylowego-1 i 20 mg dimetyloaminopirydyny w 10 ml chlorku metylenu ochłodzonego do 0° dodaje się 930 mg dicykloheksylokarbodilmidu, po czym mieszaninę reakcyjnę utrzymuje się przez noc w 4°· Mieszaninę reakcyjnę następnie odsęcza się, przesęcz odparowuje do suchości, pozostałość rozpuszcza się w hsksanie/toluenie/octanie etylu /12/5/1 1 chromatografuje się tę sarnę mieszaninę rozpuszczalników· Rf /heksan/octan etylu 5/1/ - 0,52.

151 094 d/ 4,6-0-benzylideno-2,3-di-O-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo _7-D-glukopiranoza. 480 mg trichloroetylo-4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-/“/R/-3-banzyloksytetradekanoilo/- £$ -Dglukopiranozydu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny dioksanu i kwasu octowego /1/1/ i przereagowuje się w porcjach w temperaturze pokojowej ze sproszkowanym cynkiem do zużycia wszystkich substancji wyjściowych· Mieszaninę reakcyjnę odsęcza się, odparowuje do suchości, a pozostałość chromatografuje się żel krzemionkowy, haksan/toluen/oćtan etylu 2/5/1/· Rf /toluen/octan etylu 9/1/ 0,32·

Przykład C· 2-O-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo /-3-/ /R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido/-3-dezokey-4,6-0-izopropylideno-0-glukopiranoza /dla przykładu II/· a/ 3-azydo-3-dazoksy-4,6-0-izopropylideno-D-glukopiranoza· 1,02 g 3-azydo-3-dezoksy-O-glukopiranozy rozpuszcza się w 10 ml suchego dimetyloformamidu, dodaje się 940 >il 2-metokeypropenu i katalitycznę ilość monowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego i roztwór utrzymuje się w temperaturze pokojowej w cięgu 2 godz· Kwas p-toluenosulfonowy zobojętnia się kwaśnym węglanem sodu, roztwór odparowuje się do suchości, a pozostałość chromatografuje się /żel krzemionkowy, chloroform/metanol 9/1/· Rf /chloroform, metanol 9/1/ 0,64· b/ tert-butylodimetylosililo-3-azydo-3-dezoksy-4,6-0-izopropylideno-β -O-glukopiranozyd. Do roztworu 560 mg 3-azydo-3-dezoksy-4,6-0-lzopropylideno-0-glukopiranozy i 310 mg imidazolu w 25 ml suchego chlorku metylenu dodaje się 345 mg chlorku tert-butylomstylosililowego i mieszaninę miesza się 2 godz· w temperaturze pokojowej· Nadmiar chlorku imidazolu odsęcza się, a przesęcz wytrzęsa się dwukrotnie, 10 ml wody, suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości· Pozostałość chromatografuje się /żel krzemionkowy, toluen/octan etylu /2/1/·

Rf /toluen/octan etylu 1/1/ 0,5· c/ tert-butylodimetylosililo-2-0-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo /-3-//R/-3benzyloksytetradekanoiloamido /-3-dezoksy-4,6-0-izopropylideno- fi -D-glukopiranozyd· Roztwór 3,1 g tert-butylodimetylosililo-3-azydo-3-dezoksy-4,6-0-izopropylideno- fi -O-glukopiranozydu w 100 ml metanolu uwodornia się w cięgu 2 godzin z 300 mg 10% palladu na węglu drzewnym· Katalizator odsęcza się i przesęcz odparowuje do suchości· Pozostałość rozpuszcza się w 5,35 g kwasu /R/-3-benzyloksytridekanokarboksylowego i w 100 ml 50 ml suchego chlorku metylenu, roztwór chłodzi się lodem i dodaje eię 4,1 g dicykloheksylokarbodiimidu· Po około 3 godz· w temperaturze pokojowej roztwór odsęcza się, rozpuszczalnik odparowuje i pozostałość chromatografuje /żel krzemionkowy, toluen/octan etylu /9/1/· Rf /toluen/octan etylu 6/1/ » 0,42· d/ 2-0-/“/R/-3-benzyloksytatradekanoilo_7-3_Z/R/-3-benzylokeytetradekanoiloamido_7 -3-dezoksy-4,6-0-izopropylideno-D-glukopiranoza· Oo roztworu 5 g tert-butylodimetylosililo-20-//R/-3-benzyloksytetradekanoilo /-3-//R/-3-benzyloksy tet radekanoiloamido _7-3-dezoksy-4,60-izopropylideno- fi -O-glukopiranozydo w 100 ml bezwodnego tetrahydrofuranu ochłodzonego do -60° wkrapla się 5,2 ml roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w tetrahydrofuranie· Ten roztwór pozostawia się do ogrzania do -40° i utrzymuje eię w tej temperaturze do momentu zniknięcia substancji wyjściowej /około 30 min·/· Następnie dodaje eię 5 ml metanolu, temperaturę doprowadza się do pokojowej i odparowuje się rozpuszczalnik· Pozostałość ekstrahuje eię mieszaninę chlorku metylenu i wody, fazę organicznę suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje się rozpuszczalnik· Po oczyszczaniu chromatograficznym /żal krzemionkowy, toluen, octan etylu 3/1 zwięzek tytułowy otrzymuje się w postaci mieszaniny monomerów· Rf /toluen/octan etylu 1/1/

0,48 i 0,52·

Przykład 0· 4,6-0-benzylideno-2-//S/-3-benzyloksytat radekanoilo/-2dezoksy-l-O-dibenzylofosfono-oó-D-glukopiranoza /dla przykładu IV/· a/ 2-//S/-3-benzyloksytetradekanoiloamido/-2-dezoksy-D-glukopiranoza· Zwięzek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu Aa/ Rf /chloroform/metanol 7/1/

0,37.

b/ 4,6-0-benzylideno-2-//S/-3-benzyloksytetradekanoiloamido/-2-dezoksy-D-glukopiranoza. Zwlęzek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu Ab/ /oĆ/²^ -3,5° /c 1, chloroform/ Rf /toluen/octan etylu 1/1/ 0,37.

c/ 4,6-0-benzylideno-2-/ /S/-3-benzyloksytet radekanoiloamido /-2-dezoksy-l-0dibenzylofosfono- oć -D-glukopiranoza. Zwięzek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu Ac/ · +39,2° /c 1, chloroform/ Rf /toluen/octan etylu 1/1/ - 0.46.

151 094

Przykład E. 4,6-0-benzylidano-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-2£/R/-3-tetredekanoiloksytetradekanoiloamldooć-D-glukopiranoza /dla przykładu V/· a/ 2-dazoksy-2-/*/R/-3-tatradakanoiloksytatradekanoiloamido_7-D-glukoza· Mieszaninę 650 mg chlorowodorku D-glukozaminy, 1,9 g N-/~/R/-3-tetradakanoiloksytatradekanoiloksy_7sukcynimidu i 0,5 ml dilzopropyloetyloaminy w 15 ml dimetyloformamidu miesza się w cięgu 20 godz· w temperaturze pokojowej· Następnie rozpuszczalnik oddestylowuje się 1 pozostałość chromatografuje się na żelu krzemionkowym stosujęc jako eluent octan etylu/-metanol /8/1/.

Z* +25° /c » 1, metanol/ Rf /octan atylu/metanol 6/1/ 0,5· b/ 4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-2-/·/R/-3-tetradakanoiloksytatradekanoiloamidoJD-glukopiranoza· Roztwór 5,83 g 2-dezoksy-2-/“/R/-3-tetradekanoiloamido_/-D-glukozy, 3 g banzaldehydodimetyloacetalu i 500 mg monowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego w 200 ml suchego dimetyloformamidu utrzymuje się w wyparce obrotowej 3 godz· w temperaturze 55-60° i pod ciśnieniem 30·10²-40·10²Pa. Po tym czasie nia ma Już materiału wyjściowego· Na wstępie oddestylowuje się większość dimetyloformamidu, dodaje się 500 ml chlorku metylenu i roztwór ekstrahuje się dwukrotnie 200 ml rozcieńczonego roztworu kwaśnego węglanu sodu i 200 ml wody· Po wysuszeniu nad siarczanem sodu i odparowaniu do suchości pozostałość chromatografuje się /toluen/ octan etylu 6/4/· Temperatura topnienia 162-165°. £&CJq* « -1,5° /c i, chloroform/metanol 1/1 Rf /toluen/octan etylu 1/1/ 0,32· c/ 4,6-0-benzyłideno-2-dezoksy-l-0-dibenzylofoafono-2-//R/-3-tetradekanoiloksytetra dekenoiloamido^- OĆ-D-glukopirenoza. Do roztworu 950 mg 4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-2-/~/R/-3tetradakanoiloksytatradekanoiloamido^-D-glukopiranozy w 40 ml suchego tetrahydrofuranu ochłodzonego do -40° wkrapla się 1,25 ml butylolitu 1,6 M w heksanie. Po 5 min. wkrapla się roztwór chlorku dibenzylofosforowego w benzenie i mieszanie utrzymuje się 5 min. w tej temperaturze. Następnie roztwór zobojętnia się kwasem octowym, mieszaninę odparowuje się do suchości i pozostałość ekstrahuje się mieszaninę chlorek metylenu/woda· Suszy się fazę organicznę nad siarczanem sodu, odparowuje do suchości i pozostałość chromatografuje się na żelu krzemionkowym /toluen/octan etylu 3/1/. £oCj^ · + 19,3° / c 1, chloroform/ Rf /toluen/octan etylu 1/1/ - 0,6.

Przykład F. 4,6-0-banzylideno-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-2-tetradekanoiloamido- oC -D-glukopiranoza /dla przykładu VI/· a/ 2-dezoksy-2-tatradekanoiloamido-D-glukoza· Mieszaninę 3 g chlorowodorku D-glukozaminy, 4,56 g N-tetradekanoilosukcynimidu i 2,8 ml dilzopropyloetyloaminy w 40 ml suchego dimetyloformamidu utrzymuje się w temperaturze pokojowej w cięgu 24 godz. Produkt następnie odsęcza eię, przemywa dimetyloformamidem i wodę, auszy się pod zmniejszonym ciśnieniem i stosuje w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

b/ 4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-2-tetradekanoiloamido-D-glukoza. 4 g 2-dezoksy-2tetradekanoiloamido-D-glukozy rozpuszcza się w 55° w 320 ml wysuszonego dimetyloformamidu,

2,6 ml dimetoksytoluenu i dodaje się 400 mg monowodzianu kwasu p-toluenosulfonowego, po czym mieszaninę utrzymuje eię w wyparce obrotowej 4 godz. w 55-60° i pod ciśnieniem 30·10 -40.10 Pa. Następnie oddestylowuje się rozpuszczalnik, pozostałość przemywa eię rozcieńczonym roztworem kwaśnego węglanu sodu, wodę i etanolem, suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem 1 bezpośrednio stosuje się w następnym etapie.

c/ 4,6-O-benzylideno-3-O-/tert-butylodimetylo9llilo/-2-dezoksy-2-tetradekanoiloamido-O-glukopiranoza· 2,2 g 4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-2-tetradekanoiloamido-D-glukozy rozpuszcza się w 60° w 250 ml suchego dimetyloformamidu, 960 mg imidazolu 1 dodaje się 2,13 g tert-butylodieetylochlorosllanu oraz reakcję utrzymuje się w cięgu 24 godz. w tej temperaturze. Po dodaniu 480 mg imidazolu lig tert-butylodlmetylochloroeilanu 1 po następnych 24 godzinach w 60° nie jest już obecny, materiał wyjściowy. Rozpuszczalnik oddestylowuje się, pozostałość ekstrahuje się mieszaninę chlorek metylenu/woda, fazę organicznę przemywa się wodę jeden raz, suszy nad siarczanem sodu 1 oddestylowuje. Pozostałość chromatografuje się nad żelem krzemionkowym przy gradiencie toluen/octan etylu 20/1 do 2/1. Otrzymuje się dwie główne frakcje: zwięzek tytułowy /650 mg/ i odpowiedni zwięzek 1,3-bis-sililowy /1,82 g/· Zwięzek ble-sililowy rozpuszcza eię w 25 ml suchego tetrahydrofuranu, roztwór ochładza eię do -40° 1 wkrapla eię 2 ml IN roztworu fluorku tetrebutyloamonlowego w tetrahydrofuranie· Po około 1 godzinie w -40° odszczepianie enomerycznej eilllowej grupy zabezpieczajęcej Jest zakończone. Dodaje

151 094 się 3 ml metanolu, doprowadza się temperaturę do temperatury pokojowej 1 usuwa elę rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem· Pozostałość ekstrahuje się mieszaninę chlorek metylenu/ woda, fazę organicznę ekstrahuje się raz wodę, suszy i oddestylowuje· Otrzymuje się dolnę ilość 1,52 g zwlęzku tytułowego w postaci mieszaniny anomerycznej· Rf /toluen/octan etylu 1/1/ - 0,42.

d/ 4,6-0-benzylideno-3-0-/tert-butylodimetylosililo/-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-2-tetradekanoiloamido-oć-D-glukopiranoza. Do roztworu 2,46 g 4,6-0-benzylideno-3-0-tertbutylodimetylosililo/-2-dezoksy-2-tetradekanoiloamido-D-glukopiranozy w 100 ml tetradekanoiloamido-O-glukopiranozy w 100 ml suchego tetrahydrofuranu ochłodzonego do -60° wkrapla się 3,12 ml 1,6 M butylolitu w heksanie. Po 5 min. w tej temperaturze wkrapla się roztwór chlorku dibsnzylofosforonowego w benzenie. Miesza się dalej 5 min. w -60°, zobojętnię się roztwór kwasem octowym 1 odparowuje do suchości. Pozostałość rozpuszcza się w chlorku metylenu i ekstrahuje wodę. Po obróbce i chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem mieszaniny toluen/ octan etylu /3/1/ jako eluentu otrzymuje się zwięzek tytułowy. Rf /toluen/octan etylu 7/4/

0,75.

e/ 4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-2-tetradekanoiloamido- oć-0glukopiranoza. Do roztworu 2,05 g 4,6-o-benzylideno-3-0-/tert-butylodimetylosllilo/-2-dezoksyl-0-dibenzylofosfono-2-tetradekanoiloamido- oć-o-glukopiranozy w 40 ml suchego tetrahydrofuranu w -10° wkrapla się 2,5 ml IN roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w tetrahydrofuranie i miesza się 2 godz w 0°. Następnie dodaje się 3 ml metanolu, roztwór odparowuje się do suchości i pozostałość ekstrahuje się mieszaninę chlorek metylenu/woda. Po zwykłej obróbce i chromotografii na żelu krzemionkowym przy użyciu mieszaniny toluen/octan etylu /3,2/ jako eluentu otrzymuje się tytułowy zwięzek. Rf /toluen/octan etylu 1/1/ 0,35.

Przykład G. 2-acetemido-4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-i-0-dibenzylofosfono-oCD-glukopiranoza /dla przykładu IX/.

a/ 2-acetaraido-4,6-0-benzylideno-3-0-/tert-butylodimetylosililo/-2-dezoksy-D-glukopiranoza. Roztwór 5,17 g 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-D-glukopiranozy, 3,4 g imidazolu i 6,3 g tert-butylodimetylochlorosilanu w 300 ml dimetyloformamidu utrzymuje się w 60-70°. Po upływie 6 godz. dodaje się 500 mg imidazolu i 1 g tert-butylodimetylochlorosilanu i mieszaninę utrzymuje się w tej temperaturze do zakończonej reakcji. Rozpuszczalnik odparowuje się, pozostałość ekstrahuje się mieszaninę chlorek metylenu/woda i oczyszcza się chromatograficznie mieszaninę toluen/octan etylu /5/1/. W celu odszczepienia anomerycznej grupy tertbu tylodimetylosililowej produkt rozpuszczę 9ię w 600 ml suchego tetrahydrofuranu, roztwór ochładza się do -40° i dodaje się 14 ml IM roztworu fluorku tetrąbutyloamoniowego· Po 10 min. reakcję zatrzymuje się dodając 17 ml metanolu. Mieszaninę odparowuje się do suchości, pozostałość rozpuszcza się w chlorku metylenu i ekstrahuje wodę. Fazę organicznę suszy się i oddestylowuje się rozpuszczalnik. Rf /chlorek/metanol 9/1/ « 0,5.

b/ 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-3-0-/tert-butylodimetyloeililo/-2-dezoksy-l-0dibenzylofosfono- oć -D-glukopiranoza. Zwięzek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu Ec/ i po chromatografii aluentem toluen/octan etylu /1/1/. Rf /toluen/octan etylu 2/1/ « 0,58.

c/ 2-acetamido-4,6-O-benzylideno-2-dezoksy-l/o-dibenzylofosfono- oć-D-glukopiranoza. Do roztworu 4,4 g 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-3-0-/tert-butylodimetylosililo/-2-dezoksy1-0-dibenzylofosfono-oć-D-glukopiranozy w 200 ml suchego tetrahydrofuranu ochłodzonego lodem wkrapla się 6,5 ml IN roztworu fluorku tetrabutyloamoniowego w tetrahydrofuranie i mieszaninę utrzymuje się 2 godz. w 0°. Roztwór pozostałości w chlorku metylenu przemywa się wodę, suszy i odparowuje do suchości. Rf /chloroform/metanol 9/1/ 0,65.

Przykład H. 4,40-0-benzylideno-2,3-di-0-/'/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo7 -D-glukopiranoza /dla przykładu X/· a/ trichloroetylo-4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-/“/R/-3-tet ra-dekanoiloksytetradekanoilo_7- oC-O-glukopiranozyd· Zwięzek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu Bc/ stosujęc kwas /R/-3-tetradekanoiloksytridekanokarboksylowy-l jako środek acylujęcy i mieszani· nę toluen/octan etylu /98/2/ jako eluent. Rf /toluen/octan etylu 9/1/ 0,75.

b/ 4,6-0-benzylidsno-2,3-di-0-/”/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo^-D-glukopiranoza. Zwięzek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu Bd/ po chromatograficznym

151 094 oczyszczaniu na żalu krzemionkowym stosując mieszaniną toluen/octan etylu /15/1/ jako eluent· Rf /toluen/octan etylu /9/1/ 0,25·

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1· Sposób wytwarzania nowych pochodnych glukozy»o wzorze 3, w którym X oznacza tlen lub grupą Iminową, a Y oznacza tlen albo X oznacza tlen, a Y oznacza grupą iminową, i R**^ niezależnie od siebie oznaczają wodór lub ewentualnie podstawioną grupą acylową, pod warunkiem, że a/ co najmniej jeden z podstawników R·^ i R*₂ oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową, b/ gdy X lub Y oznacza grupę iminową, to podstawnik R·^ i R₂ przyłączony do grupy iminowej jast inny niż wodór, w postaci wolnej lub soli addycyjnej z kwasem, znamienny tym, że odszczapia się grupy ochronna za związku o wzorze 4, w którym R oznacza grupę zabezpieczającą, X* i Y* mają znaczenie podana wyżej dla X i Y z podanym warunkiem, R*_x i R“₂ mają wyżej podane znaczenia z podanym warunkiem, a grupa OH jest zabezpieczona zabezpieczoną fosforanową grupą estrową,albo ze związku o wzorze 3c,w którym R₂ i R mają wyżej podane znaczenie,R*oznacza grupę zabezpieczającą,a grupa hydroksylowa jeat podstawiona rodnikiem acylowym, a następnie otrzymany związek ewentualnie przekształca się w sól addycyjną z kwasem·
2· Sposób według zastrzel, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze 3, w którym R_x i R*₂ niezależnie od 9iebia oznaczają atom wodoru lub ewentualnie podstawioną grupę acylową oraz a/ Y oznacza atom tlenu, a X oznacza grupę NH, pod warunkiem, że OĆgdy R_x oznacza grupę /R/-3-hydroksytetradekanoilową, wtedy R₂ jast różna od grupy /R/-3-hydroksytatradekanoilowej lub grupy /R/-3-heksanodakanoiloksytetradekanoilowej· /3R*_x jest różne od atomu wodoru oraz *JTr*1 i R₂ są różna niż w obu przypadkach grupa acatylowa lub grupa -CO/CH₂/jgCH^, b/ X i Y oznaczają atom tlenu lub c/ Y oznacza grupę NH i X oznacza atom tlenu, pod warunkiem, że co najmniej jeden z podstawników R_x i R₂ oznacza grupę acylową i, gdy X lub Y oznacza grupę iminową, wtedy podstawnik R^ i R*₂, przyłączony do grupy iminowej jest różny od atomu wodoru, w postaci wolnej lub ewentualnie w postaci kwaśnej soli addycyjnej, odszczepia się grupy ochronne za związku o wzorze 4, w którym R oznacza grupę zabezpieczającą, X* i Y* mają znaczenia podane wyżej dla X i Y z podanym warunkiem, R“₁ 1 R₂ mają wyżej podana znaczenie z podanym warunkiem, a grupa OH jest zabezpieczona fosforanową grupą estrową, albo ze związku o wzorze 3c, w którym R“₂ i R mają wyżej podane znaczenie, R^z oznacza grupę zabezpieczającą,a grupa hydroksylowa jest podstawiona rodnikiem acylowym, a następnie otrzymany związek ewentualnie przekształca się w sól addycyjną z kwasem·
3· Spoeób według zastrz.l, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze 3, w którym X i Y mają znaczenia podane w zastrz.l,a R*^ i R₂ oznaczają ewentualnie podstawione grupy acylowe, w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami, odszczepia się grupy ochronne ze związku o wzorze 4, w którym R, X*, Y*, R₁ i R₂ mają znaczenie podane w zastrz.l, a grupa OH jest zabezpieczona fosforanową grupą estrową, po czym uzyskany związek wyodrębnia się w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami.

HOHO

Wzór 3 >Ά __pH ⁰

I I

Ri^R2

OH “OH

151 094

HO/ ⁰

HO—( /-OP i“i Y X’ i i

R|^R2 _r/^0Hł^OH O

RO—.

/Λ Z'

R°—\ /-OK ł^XOR'

HO NH ⁰I ^R2

Wzór 3c

OR*

ROWzór 3 a

HO—

O NH Rf R₂

ROOH

OH /-°X \_/“ i i Y’ X' r; r₂

Wzór 4

-O

HO—( /-OH /“\

HO NH₂

HOHO— >-°x •oh

Wzór 3b acylowanle —OH \_/ / \

HO NHR zabezpieczanie

RO — —O

RO—( /^-0H / \ ho nhr:

Wzór 3c zabezpieczanie

Schemat 1 cz. 1

Schemat 1 cz.2

151 094 — 0—

Ο - ' '-ο ^χ-^ζ / \ Ο2Ν Ν₃

AcO~> Ac Ο \_/ / \ ο₂ν ν₃

ΌΑί

ΗΟ—

-Ο

ΗΟ—/ ^Κ— OH <- ^kontrolowana/~\ redukcja

Ο2Ν

ΝΗ2 zabezpieczenie (ροζ. 2)

ΟοΝ ν₃ redukcja

HOHO—

0^

Ο / \ \_/ / \

-ΟΗ

NHR redukcja

Schemat 2 cz.1

Ο

HO—( OH η₂ν /

ΝΗ acylowania

ΗΟ— * >-0

ΗΟ— \ \__/ / \ h^N NHR

ΟΗ

ΗΟ—. * ο

HO-/J· / \ r₅hn

ΟΗ

NHRg zabezpieczanie (ροζ.4+6

ΗΟ—\ /—⁰

ΗΟ-/ ΟΗ

RcHN

NHR usuwanie grupy zabezpieczającej (ροζ. 2)

RO /-°

RO—( /—OH /“\ r₅hn nhr₅ (oba Rg Identyczne) Wzór 4 a

Schemat 2 cz. 2 i

HO—. * \ r

151 094

Z”⁰ ho—/ /“°n r₅hn / \ nh₂

HO—\ ♦ /-°x acylowanle

HO— ^R5 RO \_/ / , \

RO

-OH

NHR_C zabezpieczanie (poz. 4*6)

OH \_/ z \

RgHN NHRg (oba Rg różne )

Wzór 4 a

Schemat 2 cz. 3

HO;-o HO—( )·—OH i^-i n₃ oh zabezpieczanie (poz. 4*6) l i N3OH zabezpieczanie ( ροζ. 1 )

RO )- O

RO—\ )—OTBDMS i^-i N3OH i 1. redukcja pQ ψ 2. acylowanle >-0

RO—( )— OTBDMS

R₅HN - or₅

RO—. * >-0

RO-/ \_0H

R₅hn or₅

Wzór 4 b usuwanie grupy zabezpieczającej (ροζ 1)

Schemat 3

151 094

AcO —

Ζ°κ AcO—( '-OAc /~\

AcO OAc zabezpieczanie ( ροζ. 1 )

AcO—

RO — *

-o

AcO— ( OCH₂CCl₃ ;-o RO —f ' / \

AcO OAc _χ /-“°'^CH2^CC13

Π

HO OH

HO usuwanie grupy zabezpieczającej (poz. Z 3.4.6

RO acy Iowa nie

\..Q

HO—( OCH₂CCl₃

Π

HO OH zabezpieczanie (poz. 4*6)

Schemat 4 cz.1

RO’ r₅o \_₀

OCH₂CCl₃ /’ \

ORc usuwanie grupy zabezpieczającej (ροζ. 1 \—o ^R°—( }-0H r₅° Wzór 4 c

ORc

Schemat 4 cz.2

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł