NL8601551A - Nieuwe saccharides, hun bereiding en farmaceutische samenstellingen, die hen bevatten. - Google Patents

Description

. ^ * r

Nieuwe saccharides, him bereiding en. farmaceutische samenstellingen, die hen bevatten.

De uitvinding heeft Betrekking op saccharides, hun Bereiding, farmaceutische samenstellingen die hen Bevatten en hun gebruik als farmaceutica.

In het Bijzonder voorziet de uitvinding in een 5 nieuwe verbinding van de formule I, waarin Rj, R^, R^, en R^ onafhankelijk van elkaar waterstof of een eventueel gesubstitueerde acyigroep zijn en ¥, X, Y en Z onafhankelijk van elkaar zuurstof of imino zijn, mits a) tenminste één van de groepen Rj - een eventueel gesub-10 stitueerde acyigroep is en B] wanneer Z en X imino zijn en ¥ en Y zuurstof , en «). Rj.en R^ anders zijn dan Beide (R)-hydroxytetrade-canoyl, insofar R^ en R^ identiek zijn en (R)-3-hydroxytetrade-canoyl of R| is (R)-3-dodecanoyloxytetradecanoyl en R^ is 15 (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl, g) R^ anders is dan waterstof of (R)-3-hydroxytetradecanoyl, insofar R’ en R^ waterstof zijn en R^ is (R)-3-hydroxy-tetradecanyl en γ) R^ anders is dan een groep -(CO^-C^-CCHOH)^-20 CB^OH, in zover als de andere substituenten waterstof zijn.

Volgens een verder aspect voorziet de uitvinding in een werkwijze ter bereiding van een verbinding van de formule Ia, waarin X, Y, ¥ en Z de eerder gegeven betekenis hebben en R^_^ onafhankelijk van elkaar waterstof of een 25 eventueel gesubstitueerde acyigroep zijn mits tenminste één van de groepen R^_^ een eventueel gesubstitueerde acyigroep is, waarbij men enzymatisch een verbinding van de formule II, waarin ¥ en Z de eerder gegeven betekenis hebben, R" en R^ met uitzondering van waterstof de boven aangegeven 3Q betekenis hebben voor R^ en R^ en ïï is uridine, condenseert meteen verbinding van de formule III, waarin X en Y de weergegeven betekenis hebben en R"j en R^ de Boven aangegeven §80'551 - 2 - ΐ $ iÉ> betekenis hebben voor R^ en R^, mits tenminste ëën van de twee substituenten een eventueel gesubstitueerde acylgroep is en wanneer X of Y imino is, de substituent R" of R” gebonden aan de iminogroep anders is dan waterstof, en desgewenst de 5 verkregen verbinding hydrolyseert tot een overeenkomstige verbinding van de formule Ia, waarin wanneer X, Y, Z en/of W zuurstof is, R,, R„, R. en/of R, waterstof is, of desgewenst 1 L· 5 4 een verkregen verbinding onderwerpt aan een acylamidasereactie ter verkrijging van een verbinding van de formule Ia, waarin JO X, Y, Z en/of ¥ imino is, dan R^, R^, R^ en/of R^ waterstof is.

De enzymatische condensatie kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd in een gebufferd systeem bijvoorbeeld in een tris-buffer, bij pH 7. De reactie kan worden bewerkstelligd bij 15 kamertemperatuur of verhoogde temperatuur, bijvoorbeeld bij 30°C. Een preparaat verkregen uit gram negatieve bacteriën, bij voorkeur uit D. coli stammen (Raetz, J. Biol.Chem. 259 {1984} 4852} kan worden gebruikt als een enzymextract.

Stammen die geïnduceerd zijn door genetische manipulatie 20 tot overproduktie van het gewenste enzym verdienen de voorkeur.

De eventuele hydrolyse kan worden bewerkstelligd op een wijze analoog aan methodes beschreven in de literatuur.

De acylamidase reactie kan worden bewerkstelligd op een wijze analoog aan die beschreven door C.R, Verret 25 et al. in J. Biol. Chem. 257 {1982} 10 222.

De produkten van de werkwijze volgens de uitvinding kunnen worden geïsoleerd uit het reactiemengsel en desgewenst gezuiverd volgens bekende procedures.

De verbindingen van de formule Ia en III kunnen 3Q hestaan in een vrije vorm of indien geschikt in 'zuuradditie-vorm. Een vrije vorm kan worden omgezet in een zoutvorm op conventionele wijze en omgekeerd.

Rj_^ zijn bij voorkeur identiek. Zij zijn bij voorkeur waterstof of een acylgroep met bijvoorbeeld 4-20, 35 bij voorkeur 12 - 16, in het bijzonder 14 koolstof atomen.

8601551 d a - 3 -

Zij kunnen bijvoorbeeld gesubstitueerd zijn op de 3-plaats door een hydroxy, acetoxy of acyloxygroep als boven gedefinieerd.

De configuratie aan het koolstofatoom op de 3-plaats kan zijn (R) of (S). kunnen dus aanwezig zijn in een verbinding 5 van de formule Ia in achirale, (R), (S) of racemische vorm.

Dit geldt ook. voor een verbinding van de formule 2, 3 en 4.

De configuratie blijft onveranderd gedurende de werkwijze van de uitvinding, dat wil zeggen wanneer een verbinding in (R), (S) of racemische vorm gebruikt wordt als uitgangs- 30 materiaal, wordt een overeenkomstig (R), (S) respectievelijk racemisch eindprodukt verkregen.

De voorkeur verdienende verbindingen van de formule Ia, waarin Rj_^ een eventueel gesubstitueerde acylgroep is. Verder verdienen de voorkeur de verbindingen 15 van de formule Ia waarin, wanneer R,, R , R„ en/of R, 12 3 4 waterstof is, Y, X, W en/of Z zuurstof is.

Een verbinding van de formule Ia wordt bij voorkeur verkregen in de vorm van een zuuradditiezout. Voor de toename van de oplosbaarheid in water worden bij voorkeur hydrofiele basische verbindingen gebruikt, bijvoorbeeld tris(hydroxymethyl) -20 aminomethaan of L-lysine.

Een verbinding van de formule II kan worden verkregen op bekende wijze door reactie van een verbinding van de formule III met geactiveerd uridine 5’-monofosfaat.

Een verbinding van de formule III, waarin 25 al Y zuurstof is en X is NH. mits «} wanneer R” is (R}-3-hydroxytetradecanoyl, R” anders is dan (R)-3-hydroxytetradecanoyl of (R]-3-hexadecanoyl-oxytetradecanoyl, g) R" anders is dan waterstof en 3Q γΐ Rj en R|J anders zijn dan beide acetyl of de groep -CHOCCH^jqCRj, b) Y en X zuurstof zijn of c) Y is NH en X is zuurstof, mits tenminste ëên van de twee substituenten een acylgroep is en 6δδ1551 ? * s - 4 - wanneer X of Y is imino, de substituent R” of R” gebonden aan de iminogroep anders is dan waterstof, is nieuw en vormt ook een deel van de uitvinding.

Een verbinding van de formule III kan worden 5 verkregen volgens een werkwijze, waarbij men al ter productie van een verbinding van de formule lila waarin R” en R£ de eerder gegeven betekenis hebben hetzij X' en Y' zuurstof zijn, of Y’ is imino en X' is zuurstof, in een verbinding van de formule IV, waarin IQ R", R^, X’ en Yr de eerder gegeven betekenis hebben en R een beschermende groep is, de onbeschermde hydroxygroep omzet in een beschermde fosfaatestergroep of b) ter productie van een verbinding van de formule Illb, waarin R" en R£ de eerder gegeven betekenis hebben, een 15 overeenkomstige verbinding van de formule IIIc, waarin R^ en R de eerder gegeven betekenis hebben en R’ een beschermende groep is, acyleert, en daarna de beschermings-groepen afsplitst.

Procesvariant a) kan bijvoorbeeld worden bewerk-20 stelligd door een verbinding van de formule IV op te lossen in een inert oplosmiddel, bijvoorbeeld een cyclische ether zoals tetrahydrofuran en bij lagere temperatuur, bijvoorbeeld bij -70°G, te laten reageren met hutyllithium in een alifatische koolwaterstof, zoals hexaan, en daarna dibenzylfosforchlori-25 daat toe te voegen. Het produkt kan worden gewonnen uit een reactiemengsel en desgewenst gezuiverd op bekende wijze.

De vrije hydroxygroepen van het fosfaatresidu worden beschermd, bijvoorbeeld door benzyl. Het afsplitsen van de heschermings— groepen kan ook worden bewerkstelligd op bekende wijze.

30 Men kan bijvoorbeeld een beschermingsgroep afsplitsen op bekende wijze onder zure omstandigheden, bijvoorbeeld met waterig zuur (ionenuitwisselaar1 of hydrogenolytisch.

Procesvariant b) kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door een verbinding van de formule IIIc op te lossen 35 in een inert oplosmiddel, bijvoorbeeld in een koolwaterstof SS ö 15 3 f -5.-

Jt * 5 zoals methyleenchloride, samen, met een acyleringsmiddel, geschikt onder toevoeging van dicyclohexylcarhodiimide en 4-dimethylaminopyridine, waarna men de reactie laat plaatsvinden bij lagere temperaturen, bijvoorbeeld bij ongeveer 4°C. Het 5 produkt kan worden geïsoleerd uit het reactiemengsel en desgewenst gezuiverd op bekende wijze. Daarna worden de aanwezige beschermingsgroepen op bekende wijze afgesplitst.

Als beschermingsgroep kan men elke groep die men gewoonlijk gebruikt voor bescherming in de saccharideindustrie-JO gebruiken. Beide R substituenten kunnen bijvoorbeeld samen de benzylideen of isopropylideengroep vormen. Ook kan men als beschermingsgroepen voor de fosfaatrest bekende beschermingsgroepen, zoals benzyl, gebruiken.

De verbindingen van de formule IIIc zijn nieuw 15 en kunnen worden verkregen volgens het reactieschema A op het formuleblad.

De verbindingen van de formule XV kan men verkrijgen volgens de reactieschema's B, C en D op het formuleblad, waarbij de hydroxygroepen, die niet deelnemen 20 aan de aangegeven reactie, geschikt in beschermde vorm kunnen zijn. De substituenten hebben de volgende betekenissen: R, RT = beschermende groepen R^ = beide onafhankelijk van elkaar de boven aangegeven betekenis voor Rj, R^, R^ of R^ 25 Ac = acetyl TBDMS = tertiair butyldimethylsilyl J. Bereiding van de verbindingen van de formule XVa: zie reactieschema B.

2. Bereiding van de verbinding van de formule IVb: zie 3Q reactieschema C.

3. Bereiding van de verbinding van formule IVc; zie reactieschema D.

Voorzover de bereiding van enig bepaald uitgangsmateriaal niet in het bijzonder is beschreven, is deze 35 bekend of kan worden uitgevoerd op conventionele wijze of op 8 6 Ö1551 * * * - 6 - analoge wijze als beschreven in de voorbeelden.

De volgende voorbeelden illustreren de uitvinding. Alle temperaturen zijn in graden Celcius. EDTA betekent ethyleendiaminetetra-azijnzuur, DTA is 1,4-dithioerythriet, 5 UDP staat voor uridinefosfaat en tris is tris(hydroxymethyl)-aminomethaan.

Voorbeeld 1: 6-Q-{2-deoxy-3-0-{(B.)-3-hydroxytetradecanoylj~2- {(R) }-3-hydroxytetradecanoylamido}—g-D-glucopyrano-syl}-2,3-di-0-{(R)}-3-hydroxytetradecanoyll· 1-0-jq fosfono q-D-glucopyranose

Men lost 2,03 mg UDP-2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetra- decanoyl}-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-1-O-fosfaan-a-D- glycopyranose en 1,42 mg 2,3-di-0-{ (R)_-3-hydroxytetradecanoyl}- 1-0-phosphono-a-D-glycopyranose beide in de vorm van triszouten

^ op in 10 mM trisbuffer van pïï. 7 met 0,2 mM ETA en 0,2 mM DTE

en incubeert -met 60 pl enzymextract bij 30°C.

Het enzymextract kan worden bereid als volgt:

Men cultiveert E. coli JB 1104 in L-bouillon (procultuur + 10 pg ampicilline/ml bij 3Q°G gedurende de 20 nacht; hoofdcultuur bij 30°C ia geroerde incubator, uitgaande van 0D._. = 0,1 tot 0D,.cn = 1). De cellen worden ver- 550nm 550nm

zameld door centrifugering bij 10,800 g (10 min./4 C), de pil gesuspendeerd in 10 mM trisbuffer van pH 7,0 + 0,2 mM EDTA

en 0,2 mM DTE en weer gecentrifugeerd (6000 g, 10 min./4°C).

25

De pil wordt dan weer gesuspendeerd in bovengenoemde buffer en ultrasonisch gefragmenteerd ( 5 x 20 sec./30 sec. pauze bij 120 watt}. De celfragmenten worden gescheiden door centrifugering (12000 g, 10 min./4°C) en de oplossing wordt geültracentrifugeerd (150.000 g, 90 min./7°C). Het

Of} bovenste 2/3 deel van de bovenstaande vloeistof wordt gewonnen. Deze fractie wordt onderworpen aan fractionele ammoniumsulfaat-precipitatie. Men gebruikt het traject van 10-40% ammonium sulfaat. De verkregen pil wordt gesuspendeerd in de bovengenoemde buffer.

860 1551 * * i - 7 -

Nadat de reactie is beëindigd (nagegaan met dunne laag chromatografie) zuurt men de oplossing aan tot pH 2 met cirtoenzuur en centrifugeert, De pil wordt gesuspendeerd in chloroform/methano1/azijnzuur/water (65/15/5/2) en gechro— 5 matografeerd over silicagel onder toepassing van hetzelfde elutiemiddel. De fracties, die het produkt bevatten, worden samengevoegd en verdampt totdat geen organisch oplosmiddel is achtergebleven en het resterende deel wordt gelyofiliseerd.

Het lyofilisaat wordt opgelost in tetrahydrofuran/water 8/2) 10 en in dat oplosmiddel omgezet in het triszout over een kationenuitwisselaar in trisvorm. Het tetrahydrofuran wordt verdampt en het residu gelyofiliseerd. Alle waarden worden bepaald op silicagel platen. (in chloroform/methanol/ azijnzuur/water 65/25/5/5) * 0,48.

15 Voorbeeld 2: 6-0-£2-deoxy3-0~{ (R)-3-hydroxytetradecanoylj— 2-( (R)-3-hydroxytetradecanoylamido }-g-D-glucopyra- nosyl}-2-deoxy-3-0-{(S)—3-hydroxytetradecanoyl}— 2-{(S)-3-hydroxytetra-decanoylamido}-l-Q—fosfaan— q-D-glucopyranose 20

Men laat 20 vol. dln van een 5 mM oplossing van 2-deoxy-3-0-{(S)-3-hydroxytetradecanoyl}—2—{(S)—3-hydroxytet ra— decanoylamino }}-l-0-f os f aan-ct-D-glycopyranose in 10 mM tris/HCl buffer (pH 7) met Q,2 mM EDTA en 0,2 mM DTE, 20 delen van 25 een 5 mM oplossing van UDP—2-deoxy—3-0-{(R)}—3-hydroxytatra— decanoyl)-2-((R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-1-0-fos fono-a— D—glycopyranose in dezelfde buffer en 20 dln van een 100 mM tris/HCl buffer (pH 7) met 2 mM EDTA en 0,2 mM DTE reageren met 40 dln van een enzym preparaat (bereid als beschreven in voor-30 beeld l)is 10 mM tris/HCl buffer (pH 7) met 2 mM EDTA, 2 mM DTE en 0,1% Triton X-100 bij 30°C gedurende 8 uur, waarbij de eindconcentratie van Triton X 100 wordt ingesteld op 0,2%. Het reactiemengsel wordt gelyofeliseerd, opgelost in ongeveer 1/3 van het beginvolume in het elutiemiddel voor de hierop volgende

- 35 ?!7i/ffei6aftïiP

. ____treerd. Het volume van de kolom is ongeveer,2Q_maal groter____ 8601551 ï * ï.

- 8 - dan liet monstervolume. De fracties met het zuivere produkt worden verzameld, geconcentreerd onder verminderde druk, gesuspendeerd in pyrogeen vrij water en gelyofiliseerd.

Na lyofilisering wordt het Triton X 100 verwijderd door 5 digereren met diethylether. Na verder centrifugeren wordt de pil opgelost in een mengsel van chloroform/methanol (l/l), gefiltreerd en het oplosmiddel verwijderd onder verminderde druk. Ter verkrijging van het mono-L-lysine zout voegt men de berekende stoechiometrische hoeveelheid L-lysine (vrije base) 10 toe in de vorm van een waterige 100 mM oplossing aan een waterige suspensie van het residu en lyofiliseert het mengsel weer. R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 65/25/5/5) = 0,44. Voorbeeld 3: 6-0-{2-deoxy-3-0-{(R)-3~hydroxytetradecanoyl}-2- {(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-g-D-glucopyrano-15 syl}-2-deoxy-3-Q—{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-1- Q-fosfono-2—[ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl-amido}-q-D-glucopyranose

Men laat 20 vol. dln van een 5 mM oploysing van 2-deoxy-3-Q-{(R)-3-hydroxy-tetradecanoyl}-l-Q-phosphono-2- 20 {(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl-amido}-a-D-glucopyranose

in IQ mM tris/HCl buffer (pH 7) met 0,2 mM EDTA en 0,2 mM

DTE, 20 delen van een 5 mM oplossing van UDP-2-deoxy-2-0— · {(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}~ 1-0-phosphono-ct-D-glucopyranose in dezelfde buffer en ^ 20 dln van een 100 mM tris/HCl buffer (pH 7) met 2 mM EDTA en Q,2 mM DTE reageren met 40 dln enzym extract (bereid als beschreven in voorbeeld 1} in 10 mM tris/HCl buffer (pH 7) met 2 mM EDTA, 2 mM DTE en 0,1% Triton X 1Q0 bij 30°C gedurende

48 uur, waardoor de eindconcentratie van Triton X 100 wordt 3Q

ingesteld op 0,1%. Het mengsel wordt gelyofiliseerd, behandeld met pyridine en gefiltreerd, het filtraat geconcentreerd onder verminderde druk en gechromatografeerd over silicagel onder toepassing van chloroform/methano1 /water/2- phenethylpicoloniumbromide 800/175/22,5/2,5 als elutiemiddel.

35 8601551 *"§r ' - 9 -

De fracties met het zuivere produkt worden verzameld en het 2-fenethylpicoloniumbromide, dat dient als een ionpaar

vormingsmiddel wordt verwijderd door roeren met 20 mM

fosforzuur in water. De organische fase was geconcentreerd 5 onder verminderde druk en ter verkrijging van het mono-L-lysine zout wordt de berekende stoechiometrische hoeveelheid L-lysine (vrije base} toegevoegd en het mengsel gelyofiliseerd.

R_ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 65/25/5/5) = 0,53. r

Op een wijze analoog aan de voorbeelden 1-3 10 worden de volgende verbindingen van de formule I verkregen, waarbij afhankelijk van de gebruikte verbindingen van de formule II en III de hoeveelheden enzym zodanig worden ingesteld, dat de reactie verloopt in bij voorkeur 24-48 uur.

TABEL

15 Rj = = (R}~3~hydroxytetradecanoyl yoorheeld No. W Z Y X Rf 4 0 NH NH NE 0,45 5 NE NH NE NE 0,40 20 6 0 Ö Q NH 0,49 7 Q NH NH 0 0,39 8 NH NE Q NH 0,41 9 0 0 0.0 0,48 25 Voorbeeld 10: 6-Q-{2-deoxy—3-Q-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-2- {(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-g-D-glycopyrano-sy13~2-deoxy-1-0-fo s fono-3-0-tetradecanoy1-2-te-tradecanoylamldo-a-D-glucopyranose

De titelverbinding wordt verkregen op een wijze ^ analoog aan de voorbeelden 1-3. R^ (chloroform/methanol/azijn- zuur/water (65/25/5r5) = Q,50.

yoorheeld 11: 6-0-{2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-2- {(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-g-D-glucopyrano— sy1}-2-acetamido-2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetra- 8601551 ï 4·® *· - 10 - decanoyl}-J-0-fo sfοοη-α-D-glycopyranose De titelverbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan de voorbeelden 1 - 3. R^ (chloroform/methanol/azijn-zuur/water 65/25/5/5) = 0,32 5 Voorbeeld 12: 6,0-{2-deoxy-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}- g-D-glucopyranosyl}-1-0-fosfono-a-D-glycopyranose

Men lost 5 mg 6-0-{2-deoxy-3,0-{(R)-3-hydroxytetra- decanoyl}-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-g-D-glycopyrano- syl}-2,3-di-Ö-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-1-0-fosfono-a-D- jq glucopyranose op in chloroform/methanol (1/1), laat reageren met waterige 25%'s ammonia (.1/3 van bet volume) en laat staan gedurende de nacbt. Nadat de reactie is voltooid, men dampt/het mengsel droog, digereert bet residu met diethyl-etber om de afgesplitste vetzuren te verwijderen, zuigt J5 bet neerslag af en wast met ether, Men lost bet residu op in water en Bereidt bet di-triszout door toevoeging van de berekende hoeveelheid tris. Het produkt wordt gelyofiliseerd.

R^ £hloroform/metbano1/azijnzuur/water 25/J5/2/4) = 0,45.

Voorbeeld 13; 2-deoxy-3-0—{(R)-3-bydroxytatradecanoyl}-2-{ (R)-20 benzyl-oxytetradecanoylamido}-2-deoxy-I-Q-dihenzyl- fosfono-q-D-glucopyranose a) 4,6-0-henzyliden-3-0-{ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl}- 2-{ (R)~3-benzyl-oxytetradecanoylamido}-2-deoxy-l ,0-dibenzylfos-fono-q-D-glucopyranose 25 Aan een oplossing van 3,9 g 4,6-0-benzyliden-2—Γ(R)- benzyloxytetradecanoyl-amido }-2-deoxy-1 -0—dib enzy 1 f o s fono-a-D-glycopyranose, 2 g (R) 3-henzyloxytetradecaanzuur en 50 mg 4-dimethylaminopyridine in 2Q ml methyleenehloride, gekoeld tot -10°C, voegt men 2 g dieyclohexylcarbodizmide toe en houdt bet reactiemengsel gedurende de nacbt op 4°C. Men filtreert bet mengsel dan, dampt bet filtraat droog, neemt bet residu op in een kleine hoeveelheid tolueen/azijnzuurester (8/2) en chromatografeert met hetzelfde oplosmiddel. Smeltpunt 96—98°C.

8601551 - 11 - 20 o {α}^ = +33,3 (c = 1 chloroform) B.£ (tolueenazijnzuur 2/1) = 0,5 B) 2-deoxy-3-0-{ (R)-3-hydroxytetradecanoyl}-2-{ (R)--3-hydroxytetradecanoylamido]—1-0-fosfono-a-D-glycopyranose ^ Men lost 4,2 g 4,6-0-Benzyliden-3-0-{(R)-3-

Benzyloxytetradecanoylamido}-2-deoxy-1-Q-diBenzylfo sfono-cHD-glucopyranose op in 900 ml tetrahydrofuran/water (85/15) en hydrogeneert met 1,5 g 10%’s palladiumrop-kool gedurende twee uur Bij 10 Bar en 4Q°C. Men filtreert de katalysator ^ dan af, verdampt het tetrahydrofuran en lyofiliseert de waterige suspensie.

{a}^ = +28,5° (c = 0,2, chloroform + 1 druppel methanol) R.£ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 125/75/10/20) = 0,56

Verdere zuivering kan worden Bewerkstelligd 15 als volgt:

Men Behandelt 10 g 2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetrade-canoyl}-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-l-0-fosfono-a-D-glycopyranose en 1,7 g tris in 150 ml methanol gedurende 10 min. Bij 45°C in een ultrasoon Bad. Men centrifugeert 20 de suspensie en decanteert de heldere Bovenstaande vloeistof van de koek af. Men voegt 1,7 g tris (opgelost in 20 ml methanol) toe aan deze oplossing, Bezaait de oplossing en laat kristalliseren Bij kamertemperatuur. Men verkrijgt het di-tris-zout van de titelverBinding.

25 De Bovenstaande vloeistof wordt drooggedampt.

Het residu en de koek worden samen opgelast in een mengsel van 300 ml chloroform, 600 ml methanol en 240 ml pyrogeen vrij water. Men voegt nog 300 ml chloroform en 300 ml 0,1 N zoutzuur toe, roert vooerzichtig en laat de fasen zich scheiden. Men 3Q scheidt de chloroformfase af en dampt droog. Het residu

Bestaat uit onzuiver 2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-2-£(R)-3-hydroxytetradecanylamido}-l-Ofosfono-a-D-glucopyranose.

Het verkregen produkt wordt ultrasoon Behandeld met tris en methanol als Boven Beschreven en gecentrifugeerd.

660 1 5 5 f ► **»'' 'v - 12 -

De oplossing wordt gechromatografeerd over een Sephadex LH 20 kolom en geëlueerd met methanol. De overeenkomstige fracties worden samengevoegd en drooggedampt. Men verkrijgt het mono-tris-zout van de titelverbinding.

o 5 Men lost 5,1 g van dit produkt op bij 45 C in 40 min. methanol in het ultrasone bad, voegt een oplossing van 0,74 tris in 10 ml methanol toe, bezaait de oplossing en laat uitkristalliseren eerst bij kamertemperatuur en daarna bij 4°C. Men verkrijgt verdere kristallijne 10 hoeveelheden di-tris-zout van de titelverbinding. Het residu van de bovenstaande vloeistof en de centrifugerings-koek kunnen aan een verdere zuiveringsronde worden onderworpen.

SM.Pt: 183-185° (ontl.)

2Q

{«}p - +15° (c=l,Q in water) 15 Voorbeeld 14: 3-deoxy-2-Q-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-3-{(R)- 3-hy droxytetradecanoylamido}-1-0-fosfono-q-D-glycopyranose a) 2-0-{(R)-3-benzloxytetradecanoy}-3-{(R)-3-benyloxy-20 tetradecanoyl-amido}-3-deoxy-1,0-dibenzylfosfono-4,6,0-iso- pronyliden-a-D-glucopyranose

Aan een oplossing van 4,85 g 2—0—{(R)-henzyloxytetra-decanoyl}—3—{(R)-3-benzyloxytetradecanylamido}-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-D-glycopyranose in 40 ml absolute tetrahydrofuran, 25 gekoeld tot -7Q°C, voegt men 8 ml 1,6 M butyllithium in hexaan toe. Na 5 min. voegt men een oplossing toe van 3,8 g dibutylfosforchloridaat in 10 ml benzeen bij dezelfde temperatuur. Men zet het roeren bij -70°c nog gedurende 10 min. voort, voegt 0,3 ml azijnzuur toe en concentreert de oplossing 30 tot 1/4 van het beginvolume. Men verdunt de oplossing met 200 ml methyleenchloride, extraheert met 50 ml water, 50 ml yerdunde natrium-Bicarbonaat-oplossing en 50 ml natriumchloride-oplossing, droogt boven natriumsulfaat en dampt droog. Men chromatografeert het residu (tolueen/azijnzuurester 7/3).

35 R^ (tolueen/azijnzuurester 2/1) = 0,58.

8601551 - 13 - b) 3-deoxy-2-0-{ (R)-3-hydroxytetradecanoyl 3—3-{ (R)- 3-hydroxytetra-decanoylamido }-1 -0-f o s fono-a-D-glycopyranose

Men hydro geneert een oplossing van 980 mg 2-0-{ (R)-5 3-benzyloxytetradecanoyl }-3-{ (R).-3-henzyl-oxytetradecanyl- amido}-3-deoxy-l-Q-dibenzylfosfono-l,6,O-isopropyliden-a-D-glycopyranose in. 100 ml tetrahydrofuran gedurende ongeveer 1 uur met 30Q mg 10%fs palladium-op-koal onder normale druk. Daarna filtreert men de katalysator af, voegt 10 ml water 10 toe en Dowex AG5GWX8 H+ en roert het mengsel hij kamertempe ratuur, totdat de isopropylideengroep volledig is afgesplitst. Men filtreert de ionenuitwisselaar af, neutraliseert de oplossing met tris en dampt het tetrahydrofuran en water onder verminderde druk af. Men lost bet residu op in methanol en 15 chromatografeert over Sephadex LH 20.

R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 125/75/10/20) = 0,65 Voorbeeld 15: 2,3-di-0—[ (R)-3-hydroxytetradecanoyll—1-0-fosfono-a-D-glucopyranose a) 4,6-0-benzyliden-2,3-di-Ó—f(R)—3-benzyloxytetra— 20 decanoyl}-1-0-dibenzylfosfono-a-D~glueopyranose

Aan een oplossing van 1 g 4,6-0-benzyllden—2,3-di-0-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyl} - D-glucopyranose in 10 ml absolute tetrahydrofuran gekoeld tot -70°C voegt men druppelsgewijs 0,9 ml 1,6 M butyllithium in hexaan toe. Ha 25 5 min. op die temperatuur voegt men druppelsgewijs een op lossing toe van 42Q mg dibenzylfosforchloridaat in 4 ml benzeen. Men zet het roeren nog gedurende. 10 min. voort bij -70°C, neutraliseert de oplossing met azijnzuur en dampt droog. Men chromatografeert het residu (silicagel, 30 hexaan/tolueen/azijnzuurester 4/4/1).

R^ (tolueenazijnzuur 6/1) * 0,65 b) 2,3-di-0-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-1-Q-fos-fono-ct-D-glucopyranose

Men lost 23Q mg 4,6-0 benzyliden-2,3-di-0-{R)-3-35 8601351 * > -14- benzylo.xytetradecanoyl}-l-0-l-dibenzylfosfono-a-D-glycopyranose op in tetrahydrofuran/water (9/1) en hydrogeneert gedurende ongeveer 5 uur onder normale druk met 80 mg 10% palladium-op-kool. Men filtreert de katalysator af, neutraliseert de 5 oplossing met tris en dampt droog. Men chromatografeert het residu met methanol oyer Sephadex LH 20. R^ (chloroform/ methanol/azijnzuur/water 125/75/1Q/20) = 0,65.

Voorbeeld 16; 2-deoxy-3,0-{(S)-3-hydroxytetradecanoy1}-2-{(S)- 3-hydroxytetradecanoylamido}-l-Q-fosfono-a-D-JQ glucopyranose a) 4,6-0-benzyliden-3~0-{(S)-3-benzyloxytetradeca-noyl }-2-{(S)-3-6enzyl-oxytetradeeanoylamidoi-2-deoxy-1 -Q-dibenzylfosfono-ct-D-glucopyranose

De titelverbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorbeeld J3a. R tolueenazijnzuur 4/1) =0,44 f b) 2-deoxy-3-0-{(S)-3-hydroxytetradecanoyl}-2-{(S)- 3-hydroxytetradecanoylamido}-1-0-fosfono-a-D-glucopyranose 2Q De titelverhinding wordt verkregen op een werkwijze analoog aan voorbeeld 13b.

SM.Pt. 150—2Q0°C (ontl.).

R^ (methyleenchloride/methanol/ammonia 1/1/1; onder fase = 0,5 Voorbeeld 17; 2-deoxy-3-Q-{(R)-3-hydroxytetradecanoyl}-1-0-25 fosfono-2-{(R)-3—tetradecanoyloxytetradecanoyl- amidoj-a-D-glycopyranose a) 4,6-0-benzyliden-3-0-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyl3~ 2-deoxy-l-Q-d£benzylfosfono-2H[(R)-3-tetradecanoyloxytetrade-canoylamido}-a-D-glycopyranose 30 De titelverbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorbeeld I3a, SM.Pt. 82-95°C , >2Q o jj “ +24,1 (c=l, chloroform). R^ (tolyeenazijnzuurester 2/1) = 0,7 8601551 r » - 15 - b] 2-deoxy-3-Q-{ (R). -3-bydroxytetradecanyl }~1 -0-fosfono-2-ί (Rl-3-tetradecanoylo.xytetradacanoylamido }-g-D-glu-copyranose

De titelverbinding wordt verkregen op een wijze 5 analoog aan voorbeeld 21b.

20 o {a}^ = +14,3 (c~l, tetrabydrofuran/pyridine) R^ (cbloroform/metbanol/azijnzuur/water 80/25/5/5/1=0,35 Voorbeeld 18: 2-deoxy^-l-O-fosfono—3-0—tetradecanoyl-2-tetra-decanoyl-amido-q-D-glucopyrano se 10 al 4,6-Q-benzyliden-2-deoxy-l -0-dibenzylfosfono- 3-0-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-a-glneopyranose

De titelverbinding wordt verkregen door op een wijze analoog aan voorbeeld 13a onder toepassing van tetradecaanzuur en met tolueen/azijnzuurester 4/1 als 15 elutiemiddel. Smeltpunt 123-129°C.

(tolueenazijnzuurester 2/1) =0,6 b) 2-deoxy—l-0-fos£ono-3-0-tetradecanoyl—2-tetrade-canoylamido-a-D-glucopyranose

De titelverbinding wordt verkregen op een wijze 20 analoog aan voorbeeld 21b. (cbloroform/metbanol/azijnzuur/ water 125/75^0/201 - 0,65.

Voorbeeld 19; 2-deoxy~2-{R)-3-bydroxytetradecanoylamido}-l-Q- £osfono-3-0-{(R)-3-tetradeeanoylQxytetradecanoyl}— q-D-glucopyranose 25 a) 4,6-0-benzyliden—2-{ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl— am£do}-2-deoxy-l-Q-dibenzylfos£ono-3-0~{(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl}-q-D-glucopyranose

De titelverbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorbeeld 13a onder toepassing van (R)-3-tetra-3Q decanoyloxytetradecaanzuur en met tolueen/azijnzuurester 4/1 als oplosmiddel. Smeltpunt 89-90°C. {q}^ = +30,9° (c=l, cbloroform/metbanol l/l). R^ (tolueenazijnzuurester 4/1) = 0,5.

b) 2-deoxy—2—{ R}-3-hydroxytetradecanoylamido}—1-Q~ 860 1 551 • 16 - fosfono-3-0-{(R)-3-tetradecanoyl}oxytetradecanoyl}-et-D-glucopyranose

De titelverBinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorBeeld 21b. Het lyofilisaat wordt opgelost 5 in methanol en gechromatografeerd over Sephadex LH 20 onder toepassing van Hetzelfde oplosmiddel.

R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 80/25/5/5) = 0,32 VoorBeeld 20: 2-deoxy-2-{(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-1-0-fosfono-3-0-tetradecanoyl-ct-D-glycopyranose ^ a} 4?6-0-Benzyliden-2-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyl- amldo}T-2-deoxy-l-0-dlbenzylfosfono-3-0-tetra-__ decanoyl-a-D-glycopyranose De titelverbinding wordt verkregen analoog aan voorBeeld 13a, onder toepassing van tetradecaanzuur en ]5 tolueen/azijnzuurester (3/1) als oplosmiddelmengsel. Smeltpunt 125,5-126,5°C.

R^ (tolueenazijnzuurester 3/2) = Q,6 B) 2-deoxy-2—£(R)-3-hydroxytetradecanoylamido}-l-0-fosfono-3-O-tatradecanoyl-q-D-glyeopyranose 20 Men lost 354 mg 4,6-0-benzyliden-2-{(R)-3-benzyl- oxytetradecanoylamido]—2—deoxy-l-0-dibenzylfos£ono-3-Q-tetra-decanoyl-a-D-glycopyranose op in 30 ml tetrahydrofuran/water (9/1) en hydrogeneert met 200 mg palladium-op-kool gedurende 10 uur onder normale druk. Men filtreert de katalysator 25 dan af en brengt de oplossing op pH 7,5 met tris(hydroxy- methyl)aminomethaan. Men verdampt het tetrahydrofuran onder verminderde druk en lyofiliseert de waterige oplossing. Het lyofilisaat wordt twee maal gedigereerd met ether en gedroogd.

30 R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 125/75/10/20) = 0,6

Voorbeeld 21: 2-acetamido-2-deoxy-3-0-{(R)-3-hydroxytetrade- canoyl }-l -0-f osf ono-ot-D-glucopyranos e a) 2-acetamido-4,6,0-benzyliden-3, -0-{ (R) -3-benzyl- oxytetradecanoyl }-2-deoxy-l -0-dibenzylfosf ono-ct-35 D-glycopyranose 860 1 55 1 P v - 17 -

Men koelt een oplossing van 3,55 g 2-acetamido-4,6-Q-benzyliden-2-deoxy-J-O-dibenzylfosfono-a-D-glucopyranose en 2,1 g (R)-3-benzyloxytetradecaanzuur in 15 ml methyleen-chloride en laat reageren met 1,32 g dicyclohexylcarbodiïmide 5 en p-dime thylaminopyr idine. Na 2 uur op deze temperatuur wordt de reactie beëindigd. Men filtreert bet mengsel, dampt bet droog, en cbromatografeert over silicagel eerst met methyleenchloride/methanol (50/1) en dan met tolueen/ azijnzuurester (2/1}.

10 R^ (chloroform/methanol 20/1} = Q,7 hl 2-acetamido—2-deoxy—3-Q-I (R) —3-hydroxytetra— decanoyl }-l-0—fosfono-α—D-glycopyranose

Men lost 2,08 g 2-acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0- { (R)-3-henzyloxytetradecanoyl}-2-deoxy-l-Q-dihenzylfosfono-a- 15 D-glucopyranose op in tetrahydrofuran/water (9/1) en hydro- geneert gedurende 3 uur met I g 10%'s palladium-op-fcool onder normale druk. Men filtreert de katalysator af en dampt bet filtraat eerst droog en lyofiliseert daarna.

Men lost bet lyofilisaat op in methanol, neutraliseert met 20 tris (hydroxymethyl laminomethaan en chromatografeert met methanol over Sephadex LH 20.

{ct}^ » +43,3° (c**l, methanol)

D

R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/water 125/75/10/20) = 0,4 Voorbeeld 22; J-0-fosfono-2,3-di-0-{(R)-3-tetradecanoyloxy-25 tetradecanoyl}-a-D-glucopyranose a) 4,6-Q-henzyliden-~l-0-dibenzylfosfono-2,3-di-0-{(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl}-ct-D-glucopyranose

De titelverbinding wordt verkregen analoog aan voorbeeld 15a onder chromatografische zuivering over silicagel 30 met ether/hexaan (1/1) als elutiemiddel.

R^ (ether/hexaan 1/1} - 0,5 h) l-Q-fosfono-2,3-di-0~{(R)-3-tetradecanoyloxytetra-decanoyl3—q-D-glucopyranose

Men lost 470 mg 4,6,0-benzyliden-l-0~dibenzylfosfono- 8601551 - 18 - 2,3-di-0-{(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl.}-a-D-glycopyranose op in 47 ml tetrahydrofuran en hydrogeneert 1 uur met 230 mg palladium-op-kool onder normale druk. Men filtreert de katalysator af, dampt liet filtraat droog en chromatografeert 5 het residu over silicagel (chloroform/methanol/water/triethyl- amine 15/10/2/0,2). De relevante fracties worden samengevoegd en drooggedampt. Men verkrijgt de titelverhinding als di-triethylaminezout. R^ (chloroform/methanol/azijnzuur/ water 8Q/25/5/5/) = 0,5.

10 Voorbeeld 23: 2-deoxy-3-Q-{(R^-3-hydroxytetradecanoyl}-2- { (S)-3-hydroxytetradecanoylamido }-1 -0-fosfono-ct- a) 4,6-0-benzyliden-3,0-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyl}--2-{ (S)-3-benzyl-oxytetradecanoylamido}-2-deoxy- 15 1-Q-dihenzylfosfono-a-D-glucopyranose

De verbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorbeeld 13a. R^ (tolueenazijnzuurester 4/1) = 0,44 b) 2-deoxy—3-Q—{ (R).-3-bydroxytetradecanoyl}-2-{ (S)-3-h.ydroxytetradecanoylamido}-Q-fosfono-a-D- 20 glucopyranose

De verbinding wordt verkregen op een wijze analoog aan voorbeeld 13b. R^ (methyleenchloride/methanol/ammonia 1/1/1, onderfase). = Q,5.

Ter verdere kenmerking van de uitvinding wordt 25 een snel atoomborbardement (FAB) massaspectroscopy (negatieve modus) bewerkstelligd (Raetz, J.Bio}. Cbem. 259/4852 {1984}).

"Voorbeeld Nó. Massa 1 1325 2 1324 30 3 1534 4 1323 5 1322 6 1325 7 1324 8601551 - 19 - vervolg tabel:

Voorbeeld No. Massa 8 1323 9 1326 5 10 1292 11 1140 12 647

Yoorbeeld No: NMR-Spectra 10 j 9,82 (d, 9 Hz, 1H); 6,65 (dd, 8,8 u. 3,5 (C_D_N) Hz, 1H); 6,25 (t, 10 Hz, IH); 5,83 (t, 10 Hz, IH); 5,63 (d, 8,8 Hz, IH); 5,35 (dd, 10 u. 2,5 Hz, IH); 4,0 (t, 10 Hz, 1H); 3,83 (m 1H).

15 13 5,49 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5,24 (dd, (CD30D 9,5 u, 10,5 Hz, IH}; 4,17 (ddd, 2,5, 3,5 u.

10.5 Hz, IH); 4,0 (m, 3K); 3,90 (dd, 2u.

12 Hz, IH); 3,75 (dd, 5,5 u. 12 Hz, IH); 3,71 (s, Tris); 3,63 (t, 10 Hz, IH).

20 14 5,77 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, IH); 4,77 (ddd, (CDC1/ 2,5, 3,5 u* 10,5 Hz, IH); 4,38 (dd, 9,5 u.

CD 0D) 10,5 Hz); 3,8 bis 4,1 (m, 4H); 3,73 (dd, 3 5.5 u. 12 Hz, IH; 3,53 (t, 10 Hz, IH).

15 5,71 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, IH); 5,48 (t, 10 25 (CD30D) Hz, IH); 4,77 (ddd, 2, 4 u. 10 Hz, IH); 3,9 bis 4,05 (m, 3H); 3,86 (dd, 2 u. 12 Hz, IH); 3,7 (dd, 5,5 u. 12 Hz, IH); 3,67 (s, Tris); 3,58 (t, 10 Hz, IH).

16 5,58 (dd, 3 u. 7 Hz, IH); 5,22 (t, 10 Hz, 3Q (CDC1/ IH; 4,19 (dt, 3 u. 10 Hz, IH); 3,8 bis 4,1 CD30D) (m, 4H); 3,7 (s, Tris tt. dd, IH); 3,46 (£, 10 Hz, IH).

17 5,46 (dd, 3 u. 7 Hz, IH); 5,22 (t, 10 Hz, CDC1/ IH); 5,17 (m, IH); 4,19 (dt, 3 u. 10 Hz, 35 CD30D) IH); 3,9 bis 4,1 (m, 3H); 3,7 (s, Tris); 8601551 - 20 - 3,65 (dd, IE); 3,51 (t, 10 Hz, 1H).

18/stap a) 7,38 (m, 15H); 5,70 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); (beschermd) 5,63 (d, 9,5 Hz, 1H); 5,50 (s, 1H); 5,26 (CDClg) (t, 10 Hz, 1H); 5,08 (m, 4H); 4,38 (m, 5 IH); 4,08 (dd, 5 u. 10 Hz, IH); 3,95 (dt 5 u. 10 Hz, IH); 3,73 (t, 10 Hz, IH; 3,69 (t, 10 Hz, IH); 2,29 (m, 2H); 1,89 (m, 2H). 19/stap a) 7,2 bis 7,45 (m, 20H); 6,34 (d, 9Hz, IH); (beschermd) 5,77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, IH); 5,49 (s, IH); 10 (CDC13) 5,29 (t, 10 Hz, IH); 5,14 (quintett, 6 Hz, 1 H); 5,0 (m, 4H); 4,51 u. 4,41 (AB, 12 Hz, 2H); 4,41 (m, IH); 4,08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1 H); 3,95 (dt, 5 u. 10 Hz, IH); 3,7 (m, 3H); 2,58 u. 2,47 (ABX, 5,5 7,5 vu 15,5 15 Hz, 2H).

2Q/stap a) 7,2 bis 7,45 (m, 20H); 6,29 (d, 9 Hz, IH); (beschermd) 5,74 (dd, 3,5 u. 6 Hz, IH); 5,49 (s, IH); (CDCI3) 5,30 (t, 10 Hz, IH); 5,0 (m, 4H); 4,52 u.

4,42 (AB, 11 Hz, 2H); 4,44 (m, IH); 4,03 20 (dd, 5 u. 10 Hz, IH); 3,94 (dt, 5 u. 10 Hz, 1 H); 3,7 (m, 3H); 2,15 bis 2,35 (m, 4H).

21/stap a) 5,47 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, IH); 5,23 (dd, 9,5 (beschermd) u. 10,5 Hz, IH); 4,18 (ddd, 2,5, 3,5 u.

(CD30D) 10,5 Hz, IH); 3,90 (m, 3H); 3,85 (dd, 2 u.

25 12 Hz, IH; 3,72 (dd, 5,5 u. 12 Hz, IH); 3,68 (s, Tris); 3,61 (t, 10 Hz, IH); 1,94 (s, 3H).

22/stap al 7,3 bis 7,45 (m, 15E); 5,92 (dd, 3,5 u.

(beschermd) 6,7 Hz, IH); 5,60 (t, 9,5 u. 10 Hz, IH); 30. (CDC13) 5,48 (s, IH); 5,02 bis 5,22 (m, 6H); 4,95 (ddd, 2,5, 3,5 u. 9,5 Hz, IH); 4-10 (dd, 4,5 u. 10 Hz, IH); 3,96 (ddd, 5,9 u. 10 Hz, IH); 3,67 (t, 9,5 Hz, 2H); 2,60 (m, 2H); 2,38 (d, 6,5 Hz, 2H); 2,24 (t, 7,5 Hz, 2H); 8601531 - 21 - 2,12 (t, 7,5 Hz, 2H).

23/stap a) 7,2 bis 7,42 (m, 25H); 6,49 (d, 9 Hz, (beschermd) 1H); 5,77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5,45 (CDC13) (s, 1H); 5,35 (t, 10 Hz, 1H; 5,0 (m, 4H); 5 4,54 u. 4,40 (AB, 11 Hz, 2H); 4,47 u. 4,36 (AB, 11 Hz, 2H); 4,45 (m, 1H); 3,9 bis 4,1 (m, 2H); 3,6 bis 3,8 (m, 4H); 2,58 (dd, 6,5 u. 15,5 Hz, 1H); 2,34 (dd, 6 u.

15,5 Hz, 1H; 2,2 (m, 2H).

10 De als uitgangsmaterialen gebruikte verbindingen kunnen worden verkregen als volgt: A) 4,6-‘0-benzyliden-2-{(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido}-2-deoxy-l-O-dibenzylfosfono-q-D-glucopyranose (voor voorbeelden 13, 19 en 20) 15 a) 2-{(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido}-2-deoxy-D-glycopyranose

Men roert een mengsel van 5,4 g D-glycosamine-hydrochloride, 10,8 g N-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyloxyJ succinimide en 5 ml diisopropylethylamine in 25 ml absolute 2Q dimtefiylformamide gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.

Men destilleert het oplosmiddel in hoofdzaak af en lost het residu op in een mengsel van 150 ml chloroform, 300, ml methanol en 120 ml water. Na toevoeging van een verdere portie van 15Q ml chloroform en 150 ml water, scheidt men de 25 onderste fase af en wast twee maal met een Bovenfase, bestaande uit 100 ml chloroform, 100 ml methanol en 90 ml water. Men dampt de oplossing droog en droogt onder hoog vacuum. Men gebruikt het verkregen produkt bij de volgende trap zonder verdere zuivering.

3Q Ter analyse zuivert men een klein deel ruw product chromatografisch (tolueen/ethanol 9/1). Smeltpunt iso^c.

{alp = +53 (c = 1, dimethylformamide) S.£ (chloroform/methanol 9/1) = 0,3 35 k) 4,6-Q-benzyliden—2-{(R)—3-benzyloxytetradecanoyl- 8601331 * * - 22 - amido}-2-deoxy-D-glucopyranose

Men houdt een oplossing 5,83 g 2-{(R)-3-benzyloxy-tetradecanoylamido}-2-deoxy-D-glycopyranose, 3 g benzalde-hydedimethylacetaal en 500 mg p-tolueensulfonzuurmonohydraat 5 in 200 ml absolute dimethylformamide gedurende ongeveer 3 uur op 55-60°G en 30-40 mbar in een Rotavapor. Daarna blijft geen uitgangsmateriaal achter. Het grootste deel van het dimethylformamide wordt afgedestilleerd,50mL methyleenchloride toegevoegd en de oplossing twee maal geëxtraheerd met 10 200 ml verdunde natriumdicarbonaatoplossing en 200 ml water.

Men droogt de oplossing met natriumsulfaat, dampt droog en chromatografeert het residu (tolueen/azijnzuurester 6/4).

Sm. Pt 162-J65°C

{a}^ - +5,5° (c ** 1, chloroform) 15 R^ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,2 c) 4,6-0-benzyliden-2-{(R)-3-henzyloxytetradecanoyl-amido}-2-deoxy-l-0-dibenzylfosfono-a-D-glucopyranose

Aan een oplossing van 4,86 g 4,6-0-benzyliden-2-{(R) -3-benzyloxytetradecanoyl-amido }-2-deoxy-D-glycopyranose 20 in 40 ml tetrahydrofuran gekoeld tot -70°C voegt men druppels gewijs 8 ml 1,6 M butyllithium in hexaan toe. Na 5 min. op die temperatuur voegt men druppelsgewijs een oplossing toe van 3,8 g dihenzylfosforehloridaat in 10 ml benzeen.

Na verder roeren gedurende 10 min. bij -7Ö°C voegt men 25 0,3 ml azijnzuur toe en concentreert de oplossing tot 1/4 van het beginvolume. Men verdunt de oplossing met 200 ml methyleenchloride, extraheert met 70 ml water, 50 ml verdunde natriumhicarhonaatoplossing en 5Q ml natriumchlorideoplossing, droogt boven natriumsulfaat en dampt droog. Men chromato-3Q grafeert het residu (tolueen/azijnzuurester 7/3). Smeltpunt 10254Q5°C.

= +31,7° (c 1, chloroform) R^ (tolueenazijnzuurester 1/1) = 0,32 8601551 - 23 - B) 4,6-Q-ben2ylideii-2,3-di~0-{ (R)-3-benzyloxytetra-decanoyl}-D-glucopyranose (voor voorbeeld 15) a) trichloorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-g-D-glu-copyranoside 5 Aan een ijsgekoeldeoplossiigvan2,34 g penta-O-acetyl D-glycopyranose in 9 ml trichloorethanol voegt men 0,9 ml horiumtrifluorideëtharaat toe en houdt de oplossing gedurende 4 uur op die temperatuur. Dan giet men de oplossing op 100 ml ijswater, extraheert met 100 ml methyleenchloride, scheidt 10 de organische fase af, wast met 50 ml natriumbicarbonaat-oplossing en 50 ml water, droogt boven natriumsulfaat en dampt droogt. Na chromatografische zuivering (silicagel, tolueen/azijnzuurester 4/1) kristalliseert, het produkt uit azijnzuurester/petroleumether. Smeltpunt 138-140°C.

15 R.£ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,67 b) trichloorethyl 4,6-Q-henzyliden-g-D-glucopyrano- side

Men lost 7,13 g trichloorethyl 2,3,4,6-tetra-D-acetyl—g-D-glucopyranoside op in een mengsel van methanol 20 en methyleenchloride, koelt de oplossing met ijs en laat reageren met een oplossing van natriummethanolaat (60 mg natrium in 27 ml methanol). Na 2 uur bij 0°C neutraliseert men de oplossing met Dowex AG 50 WXS H+, filtreert de ionenuitwisselaar af, en verwijdert het oplosmiddel onder 25 verminderde druk. Men lost het residu op in 60 ml benzaldehyde, voegt 4,1 g zinkchloride toe en roert het mengsel gedurende 10 uur bij kamertemperatuur. Men giet het mengsel dan uit op ijswater, extraheert met ether, droogt de etheroplossing boven natriumsulfaat en dampt droogt. Men chromatografeert 30 het residu (silicagel, tolueen/azijnzuurester 4/1). (chloroform/methanol 9/1) = 0,60 c) trichloorethyl 4,6-0-benzyliden-2,3-di-Q-{(R)-3-benzyloxytetradecanoyl}-g-D-glycopyranoside

Aan een oplossing van 800 mg trichoorethyl 4,6-Q- 8601551 * λ - 24 - benzyliden-g-D-glucopyranoside, 1,4 g (R)-3-benzyloxytetra-decaanzuur en 20 mg dimethylaminopyridine in 10 ml methyleen-chloride, gekoeld tot 0°C, voegt men 930 mg dicyclohexyl-carbodiïmide toe en houdt het reactiemengsel gedurende 5 de nacht op 4°C. Men filtreert het reactiemengsel dan af, dampt het filtraat droog, lost het residu op in hexaan/tolueen/ azijnzuurester (12/5/1) en chromatografeert met hetzelfde oplosmiddelmengsel.

R^ (hexaan/azijnzuurester 5/1) = Q,52 10 d) 4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-{(R)-3-benzyloxytetra- decanoylj—D-glycopyranose

Men lost 480 mg trichloorethyl 4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-{ (R)-3-henzyloxytetradecanoyl}-g'-D-glycopyranoside op in 50 ml van een mengsel van dioxan en azijnzuur (1/1) 15 en laat in porties reageren bij kamertemperatuur met zink- poeder, totdat alle uitgangsmateriaal is verbruikt. Men filtreert het reactiemengsel, dampt droog en chromatografeert het residu (silicagel, hexaan/tolueen/azijnzuurester 2/5/1).

R^ (tolueen/azijnzuurester 9/1) = Q,32 2Q C) 2-0-{(R)-3-henzyloxytetracecanoyl}-3-{(R)-3-ben- zyloxytetradecanoylamido}-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-D-glycopyranose (voor voorbeeld 14) a) 3-azido-3-deoxy-4,6~0—isopropyliden-D—glycopyra- nose 25 Men lost 1,02 g 3-azido 3-deoxy D-glucopyranose op in 10 ml absolute dimethylformamide, voegt 940 μΐ 2-methoxy-propeen en een katalytische hoeveelheid p—tolueensulfonzuur-monohydraat toe en houdt de oplossing op kamertemperatuur gedurende ongeveer 2 uur. Men neutraliseert het p-tolueen— 30 sulfonzuur dan met natriumbicarbonaat, dampt de oplossing droog en chromatografeert het residu (silicagel, chloroform/ methanol 9/1).

R^ (chloroform/methanol 9/1) = 0,64.

860 1 551 - 25 - b) tert-hutyldimeth.ylsilyl-3-az£dQ-3-deo:gy-4,6-Q-isopropyliden-g-D-glycopyranoside

Aan een oplossing van 56Q mg 3—az£do-3-deoxy- 4,6-Q-isopropyliden-D-glycopyranose en 33 Q mg imidazool in 5 25 ml droge methyleenchloride voegt men 345 mg t-butyldimethyl- silylcliloride toe en roert het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Men filtreert de overmaat imidazoolchloride af en schudt het filtraat twee maal met IQ ml water, droog boven natriumsulfaat en dampt droog. Men chromatogra-10 feert het residu (silicagel, tolueen/azijnzuurester 12/1).

R^ (tplueenazijnzuurester 1/3) = Q,6.

c) tert-hutyldimethylsilyl—2-0—{ (R)—3-beazyloxyte-tradecanoyl }-3-{ (R) -3-benzyloxytetradecanoylamido }-3-deoxy-4,6,Q-isoprpyliden-g-D-glucopyranoside 15 Men hydrogeneert een oplossing van 3,1 g tert-hutyl- dime thylsily1-3-az ido-3-deoxy-4,6-Q-isopropyliden-g-D-glycopy-ranoside in JQO ml methanol gedurende 2 uur met 3Q0 mg 10%’s palladium-op-kool. Men filtreert de katalysator af en dampt het filtraat droog. Men lost het residu op met 5,35 g (R}-3-20 benzyloxymyrist inezuur en 10.0 ml dimethylaminopyridine in 50 ml droge methyleenchloride, koelt de oplossing met ijs en yoegt 4,1 g dicyclohexylcarhodiïmide toe. Na ongeveer 3 uur bij kamertemperatuur filtreert men de oplossing af, verdampt het oplosmiddel en chromatografeert het residu 25 (silicagel, tolueen/azijnzuurester 9/1).

R^ (tolueai&zijnzuurester 6/1) = Q,42 d) 2-0-{(Rl~3-benzyloxytetradecanoyl}-3-{(R)-3-henzyloxyt etradec anoy1amido}-3-deoxy-4,6~Q-isoprpyliden-D-glucopyTanose 30 Aan een oplossing van 5 g tert-butyldimethylsilyl— 2—Q—{ (R)—3—benzyloxytetradecanoyl}-3—{ (R)—3-benzyloxytetra— decanoylamido }—3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-g-D—glucopyranoside in 10Q ml absolute tetrahydrofuran, gekoeld tot -6Q°C, voegt men druppelsgewijs 5,2 ml toe van een oplossing van 3501551 - 26 - tetrabutylammoniumfluoride in tetrahydrofuran. Men laat dit opwarmen tot -40°C en houdt op deze temperatuur, totdat alle uitgangsmateriaal is verbruikt (ongeveer 30 min.). Men voegt dan 5 ml methanol toe, brengt de temperatuur 5 op kamertemperatuur en verdampt het oplosmiddel. Men extraheert het residu met een mengsel van methyleenchloride en water, droogt de organische fase boven natriumsulfaat en verdampt het oplosmiddel. Na chromatografische zuivering (silicagel, tolueen/azijnzuurester 3/1) verkrijgt men de 10 titelverhinding als een mengsel van anomeren.

R.£ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,48 en 0,52.

D) 4,6-Q-henzyliden-2-{(S)-3-benzyloxytetradecanoyl3-2-deoxy-i-b-dihenzylfosfono-q-D-glucopyranose (voor voorbeeld 16) D-glucopyranose

Men verkrijgt de titelverbinding op een wijze analoog aan voorbeeld Aa). R^ (chloroform/methanol 7/1) = 0,37.

b) 4,6-0-benzyliden-2—{(S)-3-benzyloxytetradecanoyl-20 amido}-2-deoxy-D-glucopyranose

Men yerkrijgt de titelverbinding op een wijze analoog aan voorbeeld Ab).

r ,20 o {a>D =-3,5 (c = 1, chloroform) (tolueen/azijnzuur 1/1) = 0,37.

25 c) 4,6-0-henzyliden-2-{(S)-3-benzyloxytetradecanoyl- amido}-2-deoxy-l-0-dlhenzylfosfono-cHD-glucopy-__ ranose

Men verkrijgt de titelverbinding op een wijze analoog aan voorbeeld Ac). oc\ 30 {«} = +39,2° (c = 1, chloroform) R^ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,46 E) 4,6-0-benzyliden-2-deoxy-l-0-dibenzylfosfono-2- i (R)—3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido }-ot-_ D-glucopyranose (voor voorbeeld 17) 8§ö1551 - 27 - a.) 2-deoxy—2-{ (R) -3-tetradecanoyloxytetradecanoyl-amido}-D—glucose

Men roert een mengsel van 650 mg D-glycosamine-hydrochloride, 1,9 g N-{(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl-5 axyjsuccinimide en 0,5 ml diisopropylethylamine in 15 ml dimethylformamide gedurende 20 uur bij kamertemperatuur.

Dan destilleert men het oplosmiddel af en chromatograf eert het 'residu óver silicagel onder toepassing van azijnzuurester/ methanol (8/1) als elutiemiddel.

10 {a}^ = +25° (c = 1, methanol) R^ (azijnzuurestermethanol 6/1) = 0,5 b) 4,6-0-benzyliden-2-deoxy-2-{(R)-3-tetradecanoyl-oxytetradecanoylamido}-D-glyeopyranose

Een oplossing van 5,83 g 2-deoxy-2-{(R)-3-tetra-15 decanoyloxytetradecanoylamido}-D-glucose, 3 g benzaldehydedi- methylacetaal en 500 mg p—tolueensulfonzuurmonohydraat in 200 ml absolute dimethylformamide wordt in de Rotavapor gehouden 3 uur op 55-60°C en 30-40 mbar. Het uitgangsmateriaal is dan verbruikt. Men destilleert dan de grootste hoeveelheid 20 dimethylformamide af, voegt 5 ml methyleenchloride toe en extraheert de oplossing twee maal met 200 ml verdunde natriumhicarbonaatoplossing en 200 ml water. Na drogen boven natriumsulfaat en droogdampen chromatografeert men het residu (tolueen/azijnzuurester 6/4). Smeltpunt 162-165°C.

25 {a- -1,5° (c = 1, chloroform/methanol 1/1) R^ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,32.

c) 4,6-0-henzyliden—21deoxy—1-0-dibenzylfosf ono—2— {(R)—3-tetra-decanoyloxytetradecanoylamido}-a-D-glycopyranose

Aan een oplossing van 950 mg 4,6-0-benzyliden—2-30 deoxy-2-{ (R) -3-te tradecanoyloxytetradecanoylamido }-D-glucopyra— nose in 40 ml droge tetrahydrofuran, gekoeld tot -40°G, voegt men druppelsgewijs 1,25 ml butyllithium 1,6 M in hexaan toe.

Na 5 voegt men druppelsgewijs een oplossing toe van dihenzyl-fosfonochloridaat in henzeen en zet het roeren nog 5 min.

35 voort bij deze temperatuur. Men neutraliseert de oplossing dan 860 1 55! - 28 - met azijnzuur, dampt het mengsel droog en extraheert het residu met methyleenchloride/water. Men droogt de organische fase boven natriumsulfaat, dampt droog en chroma-feografeert het residu over silicagel (tolueen/azijnzuurester 5 3/¾ {αλρ =+19,3° (c = 1, chloroform) K.£ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,6 F) 4,6-Q-henzy1iden-2-deoxy-1-Q-dibenzylfosfono-2-tetradecanyl-amido-q-D-glycopyranose (voor *® voorbeeld 18) a) 2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose Men houdt een mengsel van 3 g D-glucosamine- hydrochloride, 4,56 g N-tetradecanoyloxysuccinimide en 2,8 ml diisopropylethylamine in 40 ml droge dimethylforma-15 mide op kamertemperatuur gedurende 24 uur. Men filtreert het produkt dan af, wast met dimethylformamide en water, droogt in vacuo en gebruikt voor de volgende stap zonder verdere zuivering.

b) 4,6-0-benzyliden-2-deoxy—2-tetradecanylamido-

Men lost 4 g 2-deoxy 2-tetradecanoylamido D-glucose bij 55°C op in 320 ml gedroogde dimethylformamide, voegt 2,6 ml dimethoxytolueen en 40Q mg p-tolueenazijnzuurmonohy-draat toe en houdt het mengsel in de Rotavapor gedurende 25 4 uur op 55-6Q°C en 3Q-40 mbar. Dan destilleert men de oplossing af, wast het residu met verdund natriumhicarbonaat-oplossing, water en ethanol, droogt in vacuo en gebruikt direct voor de volgende trap.

c) 5,6-Q-henzyliden-3-0--(tert-hutyldimethylsilyl)- 30 2-deo.xy-2-tetradecanoylamido-D-glycopyranose

Men lost 2,2 g 4,6-Q-benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose bij 60°C op in 250 ml droge dimethylformamide, voegt 960 mg imidazooïαι2τ 13 g t-butyldimethylchlrosilaan toe en houdt de reactie 24 uur op die temperatuur. Na toevoeging 8601551 - 29 - van 480 mg imidazool en ï g t-butyldimethylchloorsilaan

O

en nog 24 uur bij 60 C is liet uitgangsmateriaal verbruikt.

Hen destilleert het oplosmiddel af, extraheert het residu met methyleenchloride/water, wast de organische fase ëën maal 5 met water, droogt Boven natriumsulfaat en destilleert af.

Hen chromatografeert het residu boven silicagel met een gradiënt van tolueen/azijnzuurester van 20/1 tot 2/1.

Hen verkrijgt twee hoofdfracties: de titelverb inding (650 mg) en de overeenkomstige 1,3-his-silylverbinding (1,82 g). Hen 10: lost de bis-silylverbinding op in 25 ml droge tetrahydrofuran, koelt de oplossing tot -40°C en voegt druppelsgewijs 3,5 ml toe van een 1 N oplossing van tetrabutylammonium-fluoride in tetrahydrofuran. Na ongeveer 1 uur wordt bij -40°C de anomere silylbeschermingsgroep afgesplitst, 3 ml 15 methanol toegevoegd en de temperatuur op kamertemperatuur gebracht en het oplosmiddel dan verwijderd in vacuo. Men extraheert het residu met methyleenchloride/water, extraheert de organische fase ëën maal met water, droogt daarna en destilleert af. Men verkrijgt een verdere hoeveelheid van 20 1,52 g van de titelverbinding in de vorm van een anomeer mengsel* R- (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,42 r d) 4,6-0-henzyliden-3-Q-(tert-5.utyldimethylsilyi]- 2-deoxy-l-Q-debenzylfosfono—2-tetradecanoyl-_ 25 amido-ct-D-glycopyranose

Aan een oplossing van 2,46 g 4,6-Q-benzyliden-3-Q-(tert-hutyldimethylsilyl)2-deoxy—2-tetradecanoylamido-D-glyco-pyranose in 1QQ ml droge tetrahydrofuran, gekoeld tot -60°C, voegt men druppelsgewijs 3,12 ml 1,6 H Butyllithium in 3Q hexaan toe. Na 5 min. bij deze temperatuur voegt men druppelsgewijs een oplossing toe van diBenzylfosforchloridaat in henzeen. Men zet het roeren nog voert bij -60°C gedurende 5 min., neutraliseert de oplossing dan met azijnzuur en dampt droog. Men neemt het residu op in methyleenchloride 35 en extraheert met water. Na opwerken en chromatografie over 8601551 * + - 30 - silicagel onder toepassing van tolueen/azijnzuurester (3/1) als elutiemiddel verkrijgt men de titelverbinding.

B.£ (tolueen/azijnzuurester 7/4) = 0,75.

e) 4,6-0-benzyliden-2-deoxy-1-0-dibenzylfosfono-2- 5 tetradecanoyl-amido-ct-D-glycopyranose__

Aan een oplossing van 2,05 g 4,6-0-benzyliden-3“Q-(tért-butyldimethylsilyi)-2-deoxy-l-0-dibenzylfosforio-2-tetra-decanoy1amido-a-D-glycopyrano s e in 40 ml droge tetrahydrofuran voegt men bij -10°C druppelsgewijs 2,5 ml toe van een 10 IN oplossing van tetrabutylammoniumfluoride in tetrahydro furan en zet het roeren nog 2 uur voort bij 0°C. Dan voegt men 3 ml methanol toe, dampt de oplossing droog en extraheert het residu met methyleenchloride/water. Na opwerken als gebruikelijk en chromatografie over silicagel onder toepassing 15 van tolueen/azijnzuurester (3/2) als elutiemiddel, verkrijgt men de titelverbinding.

B.£ (tolueen/azijnzuurester 1/1) = 0,35 G) 2-acetamido-47-0-benzy 1 iden-2-deoxy-1 -0-diben-zylfosfono-a-D-glycopyranose (voor voorbeeld 21) 20 a) 2-acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(tert-butyldi- methylsilyl)-2-deoxy-D-glucQpyranose Men houdt een oplossing van 5,17 g 2-acetamido- 4,6-Q-b.enzyliden-2-deoxy-D-glucopyranose, 3,4 g imidazool en 6,3 g t-hutyldimethylchloorsilaan in 300 ml dimethylformamide 25 op 60-7Q°C. Na 6 uur voegt men 500 mg imidazool en 1 g t-butyl- dimethylchloorosilaan toe en houdt het mengsel op die temperatuur, totdat de reactie voltooid is. Men dampt het oplosmiddel af, extraheert het residu met methyleenchloride/water en zuivert door chromatografie met tolueen/azijnzuurester (5/1).

30. Voor het afsplitsen van de anomere t-butyldimethylsilylgroep, lost men het produkt op in 600 ml droge tetrahydrofuran, o koelt de oplossing tot -40 C en voegt 14 ml van een 1 M tetrabutylammoniumfluoride oplossing toe. Na 10 min. zet men de reactie stop'door toevoeging van 17 ml methanol.

35 Men dampt het mengsel droogt, neemt het residu op in methyleen- 8601551 - 31 - chloride en.extraheert met water. Men droogt de organische fase en destilleert af.

K.£ (chloroform methanol) 9/1) = 0,5 b) 2-acetamido-4,6-0-benzy1iden-3-0(tert-butyldi-5 methylsily1)-2-deoxy-1-0-dihenzylfosfono-a-D-glycopyranose

Men verkrijgt de titelverbinding op een wijze analoog aan voorbeeld Ec) en na chromatografie met tolueen/ azijnzuurester (1/1) als elutiemiddel.

R.£ (tolueen/azijnzuurester 2/1) = 0,58 10 c) 2-acetamido-4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-1-Q-diben- zylfosfono-ct-D-glycopyranose Aan een oplossing van 4,4 g 2-acetamido-4,6-0-ben-zyliden-3-0-(tert-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-0-dibenzyl-fosfono-a-D-glucopyranose £n 200 ml droge tetrahydrofuran, gekoeld met ijs, voegt men'druppelsgewijs 6,5 ml van een 1 N oplossing van tetrabutylammoniumfluoride in tetrahydrofuran toe en men houdt het mengsel gedurende 2 uur op 0°C.

Dan voegt men 7 ml methanol toe en dampt de oplossing droog. Men wast een oplossing van het residu in methyleenchloride 20 met water, droogt en dampt droog.

B.£ (chloroform/methano 9/1) - 0,65 H) 4,6-0-henzyliden-2,3-di-Q-{(R)-3-tetradecanoyl-oxy-tetradecanoy1}-D-glycopyranose (voor voorbeeld 22) 25 a) trichloorethyl-4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-{(R)-3-side

Men verkrijgt de titelverbinding analoog aan voorbeeld Be) onder toepassing (R)-3-tetradeeanoyloxytetra-30 decaanzuur als acyleringsmiddel en tolueen/azijnzuurester (98/2) als een elutiemiddel.

(tolueen/azijnzuurester 9/1) = 0,75 b) 4,6-Q-henzyl iden-2,3-di-Ö-{ (E.) -3-tetradecanoyl-oxytetradecanoyl}-D-glucopyranose

O O

8601551 » *· - 32 - D-glueopyranose

Hen verkrijgt de titelverbinding analoog aan voorbeeld Bd) na chromatografische zuivering over silicagel onder toepassing van tolueen/azijnzuurester (15/1) als elutiemiddel.

5 (tolueen/azijnzuur 9/1) = 0,25 I) synthese van UDP-2,3-diacyl-hexoses

Men lost 1,4 g uridine—5T-fosformorfolidaat-N,N'-di-cyclohexylcarboxamidine zout op in 25 ml watervrije pyridine en droogt twee maal door verdampen en weer oplossen in 25 ml 10 droge pyridine. Aan deze oplossing voegt men een oplossing toe van 1 g van een 2,3-diacyl-hexose 1-fosfaat in 25 ml pyridine, die op dezelfde wijze is voorbehandeld, en laat 24 uur staan bij 37°C. Men koelt bet mengsel met ijs. Dan voegt men 50 ml chloroform en 12 ml 90%Ts mierezuur toe. Men chromatografeert 15 deze oplossing over silicagel en elueert niet in reactie getreden uitgangsmateriaal met chloroform/pyridine/90% mierezuur (30/30/7). Men maakt de kolom vrij van pyridinen met chloroform/methanol 9/1 en elueert het UDP derivaat dan met cliloroform/methanol/water (66/33/4). Men verdampt 2Q chloroform en methanol van de piêkfractie in vacuo en filtreert de resterende waterige suspensie. Men lost het neerslag op in 100 ml tetrahydrofuran/water (2/1) en roert de oplossing gedurende 2 uur met Dowex AG50WX8 (in tris-hydroxy-methylaminomethaanvorm). Men filtreert de ionenuitwisselaar 25 af, destilleert de grootste hoeveelheid van het tetrahydrofuran af en lyofiliseert de waterige oplossing. Men gebruikt het lyofilisaat bij de volgende trap zonder verdere zuivering.

Men kan de verbinding van de formule II verkrijgen op een wijze analoog aan die beschreven onder I) hierboven, 30 uitgaande van de overeenkomstige verbinding van de formule III.

De verbindingen van de formule Ia en III bezitte j. farmacologische activiteit. Zij worden aangeduid voor gebruik als farmaceutica. Zij oefenen een heilzame invloed uit op niet specifieke antimicrobiële weerstand. Deze activiteit 35 kan bijvoorbeeld worden aangetoond met de volgende proefmethodes: 8601551 - 33 - I. Bepaling van de endotoxische activiteit bij de limulus-amoeBocytes lysaatproef

Endotoxine katalyseert de activiteit van een proënzym in lumulusamoebocytes lysaat. De afsplitsing van 5 p-nitroaniline uit een kleurloos substraat wordt gemeten.

De mate van deze afsplitsing wordt fotometrisch, nagegaan, waarbij de-correlatie tussen absorptie en endotoxineconcentra-tie (of respectievelijk, endotoxine activiteit Voor analogen) in bet traject van 0,10 — 0,1 ng/ml endotoxine lineair is 10 (in vergelijking met de absorptievaarden van een staadaard- endotoxine). Van elk monster (opgelost in pyrogeenvrij steriel duhbelgedestilleerd water) wordt een verdunningsreeks 1:10 bereid en vervolgens wordt een blanco monster, 100 μΐ proefmonster of referentiestandaard of blanco monster in reactie 15 gebracht met 1Q0 pl limulus amoehocytes lysaat. Na 10 min.

incubatie bij 37°C laat men het reactiemengsel reageren met 2Q0 pl substraat. De reactie wordt gestopt met 200 pl 50%Ts azijnzuur na nog 3 min. incubatie. Na roeren van het monster wórdt de absorptie gemeten in een spectrofotometer bij 405 nm, 20 waarbij men de achtergrondwaarde aftrekt. De endotoxinegehaltes (de endotoxineactiviteit) van het monster in endotoxine-een-heden (E.D.) wordt berekend door lineaire terugzetting met de waarden van het standaardendotoxine.

2. Inductie van____endotoxineshock in de muis 25 De proef bestaat uit het induceren van een endotoxine shock of een analoge clinische toestand met lethaalresultaat met LFS-analoge stoffen in met galactosamine (GaIN) gesensibiliseerde muizen. Mannelijke C57 bl-muizen (6 dieren per groep) wordt intraperitonêaal gelijktijdig 8 mg GalN 3Q gegeven, opgelost in 0,5 ml PBS, en 0,1 pg LPS uit Salmonella abortus equi (sigma) opgelost in 0,2 ml fysiologische zoutoplossing. Deze behandeling doodt alle dieren binnen 6-12 uur (C. Galanos c.s. Froc. Natl. Acad. Sci,, USA 76(1979)5939-5943. In plaats van LPS in de standaardbehandeling worden de 8601551 - 34 - standaardstoffen een maal toegediend in verschillende doseringen hetzij gelijktijdig met GalN of parenteraal of oraal voor of na Behandeling met GalN. De waardering van de resultaten wordt gedaan door vergelijking van de kleinste 5 doses, die lethaal zijn voor alle dieren in een groep of door Berekening van een LD^^ onder toepassing van de

Spearman-Karher methode.

3. HicroBiële septicemia in de neutropene muis

Dit model stelt in staat de Bepaling van een 10 stofverwante toename van de imune response in microbieel geïnfecteerde neutropene muizen. Voor de inductie van neutropene groepen van 20 vrouwelijke B,D„F muizen wordt

o L J

één maal 20Q mg/kg lichaamsgewicht gegeven aan cyclofosfamide opgelost in 0,2 ml gedestilleerd water op dag 0. Op de derde 15 dag wordt de proef stijf ' parenteraal toegediend (primair intra™ perito&eaaL) of per oraal in zover als mogelijk opgelost in fysiologische zoutoplossing of opgelost op enige andere wijze (0,3 ml).. Infectie treedt op op dag 4 door intraveneuze toediening van het relevante inoculaat in een volume van 0,2 ml 20 (aantal kiemen Bijvoorbeeld Psuedomonas aeruginosa, per muis Δ 12:1 x IO^jE. coli'“£120:2 x 10^; Staph, aureus Δ 113:1x10^; . 4

Canida albicans Δ124:1 χ 10 ). De proefdieren worden geobserveerd tot op de tiende dag na infectie en het dodental wordt dagelijks geregistreerd. De volgende parameters worden 25 Berekend aan de hand van de infectiebestrijding respectievelijk de standaard: a) . gemiddelde overlevingsduur b) overlevingsgetal

De verbindingen van de formules Ia en III vertonen 30 opmerkelijke verbeteringen in overlevingsduur en getal Boven onbehandelde infectie blanco1s bij experimentele infecties met gramnegatieve middelen (Bijvoorbeeld Pseudomonas en E. Coli) evenals bij infecties met grampositieve middelen ^bijvoorbeeld Staph, aureus) of gisten (bijvoorbeeld Candida albicans) 880 1 551 - 35 - na parenterale toediening.

4. Activering van het neutrofiele oxydatiemetabolisme van mensenbloed

Neutrofielen (tenminste 95% zuiver) worden 5 gexncubeerd met de proefsubstantie in drie verschillende concentraties gedurende 1 - 2 uur Bij 37°C. Het vrijkomen door de cellen van superoxydeanionen als een indicatie van activering wordt dan gemeten in de vorm van superoxydedismu- 6 taseinhihitie van de reductie van cytochroom C. 1x10 neutro-10 fielen, hetzij voorBehandeld met proef substantie of niet, worden toegevoegd aan het cytochroom C (80 pmol) dat formyl-methionylleucylfenylalanine (10 M) bevat. De bianco’s bevatten verder 50 pg superoxydismutase. Na 15 min. incubatie bij 37°C stopt men de reactie door de proefbuizen in een ijsbad 15 te zetten. De proefbuizen worden dan gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. om de cellen af te scheiden.

De reductie van cytochroom C, die evenredig is aan de hoeveelheid vrijgekomen superoxydeanion, wordt fotometrisch gemeten bij 550 nm. Het inhihitore effect van de proefstof PMN 20 activering door LPS wordt gemeten als boven beschreven, waardoor na preincuhering van de leucocyten de cellen verder worden gexncubeerd met een stimulerende concentratie LPS.

5. Koolstofzuiveringsproef

Deze proef is gebaseerd op het principe dat 25 deeltjes in een afmeting van 200 - 250 £ (bijvoorbeeld koolstofdeeltjes) kunnen worden geëlimineerd uit het organisme slechts door fagocytosis door macrofagen. Bij intraveneuze toediening van koolstofdeeltjes worden deze geëlimineerd uit de bloedstroom door macrofage fagocytosis 30 in de lever (Kupffer stellatie cellen) en milt. De bepaling van SES-activering van een stof wordt bewerkstelligd door enkelvoudige of herhaalde toediening in waterige oplossing of als een suspensie. De hoeveelheid van een stof, die men voorziet voor de behandeling, wordt toegediend intraperi- 0501551 » * - 36 - tioneaal of subcutaan in 4 dagelijkse doses of ineens 24 uur voor het begin van de proef. Een suspensie die 10% gas roet bevat wordt verdund met een 1%'s gelatineuze natrium-chlorideoplossing tot een gehalte van 16 mg koolstof/ml. Elke 5 muis ontvangt 0,2 ml/20 g lichaamsgew. intraveneus en men verzamelt 25 pi bloed door puutie van de oogkasbloedvaten 3,6,9,12 en 15 min. na intraveneuze toediening. Het bloed wordt gehemolyseerd in 2 ml gedestilleerd water.

De koolstofconcentratie wordt fotometrisch bepaald. De 10 dieren worden dan gedood en de gewichten van lever en milt gemeten.

6. Herpesinfectie (muis)

Intracutane herpesinfectie stelt in staat tot de bepaling van de mate van toename in immune response 15 bij muizen geïnfecteerd met herpesvirussen. Het verloop van de ziekte wordt verlengd en maakt de ohservering van het achtereenvolgens verschijnen van verscheidene parameters mogelijk. Herpetische lesies verschijnen op de plaats van infectie, die zweren vormen, het dichtst bijzijnde been 20 wordt verlamd, en de verlamming neemt geleidelijk toe tot de dood er op volgt. Immunocompetente "naakte" (haarlo^o) muizen worden intracutaan geïnfecteerd op dag 0 door intra— cutane toediening van de te onderzoeken entstof in een volume g van 0,025 ml (bijvoorbeeld 1x10 plakvormende eenheden 25 van Herpes simplex type 1/muis). He proefstof wordt intrapöd>- tonéaal toegediend in de oplossing, bijvoorbeeld in fysiologische zoutoplossing (0,1 mm).

Systemische herpesinfectie stelt ook in staat tot de bepaling van de mate van toename in immune response 3Q bij muizen geïnfecteerd met herpes virussen. Immunocompetente NMRI-müizen worden geïnfecteerd op dag 0 door interperitoneaal toediening van de te onderzoeken entstof in een volume van 0,1 mm (bijvoorbeeld 1,3 x 10^ plakvormende eenheden van Herpes simplex type 1/muis). De proefstof wordt subcutaan 35 toegediend in oplossing bijvoorbeeld in fysiologische zoutop- 860 1 551 - 37 - lossing.

De proefdieren worden geobserveerd tot op dag 20 na de infectie en de verschijning van lesies, verlamming en dood geregistreerd. De volgende parameters worden gemeten 5 en vergeleken met infectieblanco’s of een standaard: a) aantal muizen met lesies ( cumulatief) b) aantal muizen met verlamming ( cumulatief) c) gemiddelde overlevingsduur d) overlevingsgetal 10 De verbindingen van de formule Ia en III vertonen opmerkelijke verbeteringen met betrekking tot bet verloop van de ziekte, de overlevingsduur en bet overlevingsgetal boven onbehandelde blanco's, na een enkelvoudige intraperito-neale respectievelijk subcürtane toediening tussen dagen 15 0 of -1 en +6 bij de experimentele overdracht HSV-l-infectie.

7. CSF inductie (kolonie stimuleringsfactor)

De CSF’s zijn middelaars geproduceerd in het organisme na infecties of vergiftigingseffecten. Hun biologische effecten zijn complex, zij worden opgespoord via 20 stimulering van de proliferatie van het hemo-poïetische systeem, in het bijzonder van beenmergcellen. Men geeft de proefstoffen dén maal of herhaaldelijk parenteraal of oraal aan B-D-F., muizen tot aan een dosering van 50 mg/kg.

O Z 1

Serum wordt verzameld uit de proefdieren bij verschillende 25 hieropvolgende tijdintervallen. De CSF-activiteit titer van het serum wordt gemeten in een celcultuurproef door de maten van proliferatie van beenmergcellen uit muizen {D. Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol·. Methods, 65 (1983) 55—63; 30 L.M. Green et al., J. Immunol. Methods, 70 (1984) 257-268}.

De verbindingen van formule la en III induceren CSF’s tot verschillende maten in muizen, waardoor ook tijds-kinetische verschillen in CSF-activiteiten worden waargenomen, die voordelig zouden kunnen zijn in therapeutisch gebruik.

1601551 - 38 - 8. Inductie van Interleukin-1 (IL-1)

De bepaling of een stof cellen stimuleert tot IL-1 productie wordt primair uitgevoerd in celcultuurproef. Eerst worden aanhechtende macrofagen van muizen gewonnen, zowel 5 inwonende macrofagen als macrofagen vrijgemaakt met thiogly-colaat. Deze worden geïncubeerd in RPMI-medium gedurende 48 uur met verschillende concentraties aan proefstof en de bovenstaande cel vloeistoffen verzameld. Deze worden beproefd op IL-1-activiteit in culturen van thymocyten uit 10 C^H/ïïeJ muizen. De thymocyten van deze bovenstaande vloeistoffen, die IL-1 bevatten, geleverd door macrofagen, worden geïnduceerd om te proliferen gedurende een incubatie van 72 uur. Proliferatie wordt gemeten door opname van 3H-thymidine, in een flikkering teller (J, Gery et al., J. Exp. Med. 136 (1972) 128-142; 15 J. Oppenheim et al., Cellular Immunol. 50 (1980) 71-81).

De verbindingen van de formule Ia en III bezitten in verschillende maten (in concentraties van 0,1 - 50 pg/ml) het vermogen om IL-1 produktie te induceren in macrofagen.

9. Inductie van LPS (endotoxine) tolerantie (sterfte- 2Q tolerantie)

Een zo genoemde tolerantie kan worden geïnduceerd in muizen door parenterale toediening van LPS één tot drie maal per dag. Deze tolerantie beschermt de dieren tegen de Iietbale effecten van het LPS* na toediening van galactosamine (verge-25 lijk inductie van endotoxine shockjin muizen hiervoor).

De verbindingen van de formule Ia en III maken deze tolerantie reeds vrij na enkelvoudige intraperitonéale toediening van 0,25 mg per muis. Voorbehandelde (tolerante) muizen) worden blootgesteld aan een LPS-uitdaging bij een 30. dosering van 0,01 pg LPS + 8 mg galactosamine/muis intraferi-tonéaal op verschillende tijden (J dag tot 3 weken) volgend op de laatste behandeling. Een grote hoeveelheid dieren overleeft deze LPS uitdaging, in het bijzonder wanneer de toediening drie maal wordt herhaald, in vergelijking met niet voorbehandel-35 de uitgedaagde blanco’s.

«601551 .k, « - 39 -

Verder bezitten de verbindingen van de formule Ia en III ook antiontstekingsactiviteit, in het bijzonder in niet-specifieke, in immunologisch geïnduceerde en in hypersensitief geïnduceerde ontsteking en allergische reacties.

5 Deze activiteit kan worden gedemonstreerd in verschillende proefmethodes, bijvoorbeeld door onderzoek van de invloed op prostaglandinesynthese in vitro en in vivo. In vitro wordt de inhibitie van LPS- en Zymosan-geïnduceerde PGE^- en PGF, vrijmaking onderzocht. Thioglycolaat gestimuleerde lot 10 perltcneale leueocyten uit NMRI-muizen worden geïncubeerd gedurende 24 uur met LPS of proefsubstantie. Na een verandering van medium en drie maal wassen van de cellen, worden zij gestimuleerd gedurende 2 uur met LPS of respectievelijk 1 uur met Zymosan. In deze bovenstaande vloeistoffen worden 15 PGE£ en PGF^ bepaald. Een inhibitie van PGE^-produktie door de cellen, gestimuleerd door LPS evenals Zymosan, werd gevonden. Men meet in vivo de inhibitie van LPS geïnduceerde PGE^ vrijmaking door peritoneale leueocyten van de muis na voorbehandeling met proefstoffen.

20 Groepen van 3 NMRI-muizen worden behandeld infcrasperitonéaal op dagen J, 2 en 3 met LPS of respectievelijk de proef/erb inding.

Op dag 4 geeft men aan deze dieren en een blanco groep 1,5 ml thioglycolaat intr-aperitonèaal, op dag 7 verzamelt men peritoneaal muizenleucocyten en stimuleert met LPS.

25 Er blijkt een opmerkelijke afname in PGE2~vrijmaking in vergelijking met de blanco’s.

Bij een verdere proef wordt de invloed op procoagu-lante activiteit (PCA) gemeten. Na stimulering met LPS synthetiseren menselijke endotheliale cellen PCA, zoals opge-30 spoord door een verkorting inplasmacoaguleringsduur. Peritoneale leueocyten van de muis verkorten na LPS-behandeling en peritoneale leueocyten (verkregen uit konijnen) na vrijmaking van de gegeneraliseerde Shwartzmanreactie ook de coaguleringsduur van gerecalcifieerde plasma. Voor het onderzoek van de 35 invloed op PCA geïnduceerd door LPS in vitro, behandelt men asc 7551 t < - 40 - peritoneale muisleucocyten van ~ muizen gestimuleerd door thioglycolaat gedurende de nacht met LPS alleen of respectievelijk met LPS en proefsubstantie in DMEM medium gespeend van fetaal kalfserum (FCS) (proefontwerp a). In een 5 proefontwerp b] worden muisperitoneale leucocyten behandeld gedurende 24 uur met LPS of respectievelijk proefverbinding en na een wisseling in medium gédurende de nacht gestimuleerd met LPS. De coaguleringsduur van gerecalcifieerd' menselijk blanco plasma wordt gemeten met de „Hackchenmethode na toe- 10 diening van de muis peritoneale leucocyte suspensie, die tevoren herhaaldelijk is bevroren en ultrasoon behandeld.

De toevoeging van proefverbinding reduceert het PCA vrijgemaakt door LPS in vergelijking met de blanco waarde (toename in eoaguleringsduur). Voorbehandeling met 15 proefverbinding brengt evenzo een reductie van PCA.

In vivo kan de invloed van LPS geïnduceerde PCA door muisperitoneale leucocyten na voorbehandeling met proefsuhstantie worden aangetoond als volgt: men behandelt B,D„F -muizen intraperitoneaal op dagen 1, 2 en o^l 20 3 mét LPS of respectievelijk proefverbinding. Alle dieren ontvangen verder op‘dag 3 1,5 ml thioglyeolaat ^intraperitoneaal.

Op dag 6 worden peritoneale leucocyten verzameld, het monster 6 van elk dier ingesteld op 1x10 cellen/ml en gestimuleerd gedurende 24 uur met LPS in DMEM medium gespeend van FCS.

25 De PCA van deze cellen wordt bepaald als hoven beschreven.

Voorbehandeling met. LPS of respectievelijk stof induceert een opmerkelijk gereduceerde PCA. Iets dergelijks vindt men bij konijnen. De PCA van konijn peritoneale leucocyten kan worden gereduceerd na inductie van de gegeneraliseerde 30. Shwartzmannreactie door voorbehandeling met LPS of repectieve- lijk met proefverbinding.

Bij de inhibitie van de lokale Shwartzmannreactie worden groepen van 3 Chinchilla konijnen voorbehandeld intraveneus of respectievelijk intraperitoneaal met 35 LPS respectievelijk proefverbinding op dagen 1, 2 en 3.

8 S C15 51 - 41 -

Op dag 6 worden 40, 20, 10, 5, 2,5 en 1,25 pg LPS intraderm toegediend. Op dag 7 wordt de reactie getriggerd met 2 pg LPS/kg intraveneus. De waardering wordt bewerkstelligd semiquantitatief door onderzoek van de huidnecrosen.

5 Een bijna volledige inhibitie van de Shwartzmannreactie wordt waargenomen na voorbehandeling met IP’S respectievelijk de proefverbinding.

Verder bezitten de verbindingen van de formules Ia en III ook activiteit tegen tumoren, zoals blijkt uit de 10 volgende proeven: 1. Inductie van tumor necrosis factor (TNF)

Om müisbeenmerg macrofagen te stimuleren worden beenmergcellen uit BDF1 uit muizen (ca. 10-13 dagen oud, geïnduceerd met CSF) verdund tot lxl0 cellen/ml in medium 15 ?BPMI 1640 + 1% Pen/Strep (50QQ U/ml) + 1% glutamine} en geïncuheerd in platte microtiter platen met de proefverbindingen in oplossing in het traject van 100 pg tot 0,1 pg/ml eind-concentratie (yerdunningstrappen 1:10) gedurende 4 uur bij 37°C/5% C0^. Na filtratie door 0,45 pm filters worden de 2Q bovenstaande vloeistoffen bevroren bij -70 C, totdat zij nodig zijn voor de TNF proef.

L 929 cellen worden gedurende de nacht voorgekweekt (37°C, 5% C021 in mierotiterplaten bij 3x10 cellen/kraaltje/

1QQ pi, dan voegt men 100 pl van elk monster toe en verdunt 25 de cultuur verder in 1:2 trappen. 100 pl actinomycine D

(8 pg/ml medium) worden toegevoegd en incubatie hernieuwd gedurende nog 18 uur bij 37°C/5% CO^· Na een verwijdering van de bovenstaande vloeistoffen wordt het resterende cel-oppervlak gekleurd met Giemsa oplossing en de absorptie 3Q . gemeten bij 620 nm met een Titertek Multiscan Autoreader (stroming!. Eén eenheid?van TNF wordt gedefinieerd als de activiteit, die leidt tot een 50% lysis van de doel· L 929 cellen.

2. BIGFI melanoma test i § C 1 5 31 - 42 -

Men kweekt BIGFI melanoma cellen gedurende 5 dagen in vitro. De cellen worden gesynchroniseerd een dag voor het uitvoeren van de proef door de monolaag te scheuren in afzonderlijke cellen onder toepassing van EDTA trypsine en 5 de totale hoeveelheid weer in dezelfde fles te doen met 6 vers medium. De cellen worden geteld en gezorgd voor 10 cellen/ml medium. 0,1 ml celsuspensie (10J cellen), wordt intraveneus geïnjecteerd in de staartader. 21 Dagen later worden de muizen gedood en het aantal longtumoren geteld.

10 Men gebruikt BJhF, muizen. De proefstof wordt in oplossing gebra'cht en op dagen -6, -4 en -1 intraperitoneaal geïnjecteerd.

Gebleken is dat de verbindingen van de formule Ia en III iqjinunoprofylactische activiteit bezitten, het aantal BIGFI melanoma metastasen in de longen neemt af. Als 15 een verdere beproeving van de therapeutische activiteit worden de muizen behandeld op dag 3, 6, 8, 10, 13 en 15 na enting van de tumorcellen. Ook hier wordt een opmerkelijke afname in metastasevorming waargenomen.

De verbindingen van de formule Ia en III worden 20 daarom aangeduid voor gebruik als modulatoren van ongespeci ficeerde antimicrobiële weerstand, voor de systemische verhoging van immune response en voor de bevordering van niet specifieke immuniteit. De verbindingen van de formule Ia en III worden dus geïndiceerd voor gebruik bij de behandeling of onder-25 steunende behandeling (dat wil zeggen samen met andere specifieke of ondersteunende therapeutische vormen) van condities die samengaan met afgenomen immune response, in het bijzonder afgenomen humorale immune response en/of afgenomen overgevoeligheidsreactie van het vertraagde type, 30. en voor de behandeling van omstandigheden, waarin in het algemeen een modulatie van immune response wordt aangeduid,

In het bijzonder worden de verbindingen van de f o mule Ia en III aangegeven voor gebruik bij de behandeling of ondersteunende behandeling van pathologe omstandigheden gebaseerd op 35 idiopatische immunologe deficiënties of immunologe deficiënties 8501551 - 43 - van het type, dat men ontmoet bij geriatrische patiënten, of bij patiënten met zware brandwonden of gegeneraliseerde infecties. De verbindingen van de formule Ia en XIX worden ook aangeduid voor gebruik bij de behandeling of ondersteunende 5 behandeling van virale ziekten (zoals uitgezaaide herpes, progressieve pokken en uitgezaaide varicella ziektes) of de ziekte van Hodgkin^en van verdere kwaadaardige® tumoren. Verder worden de verbindingen van de formule Ia en III aangeduid voor gebruik ter voorkoming van endotoxine shock, IQ bijvoorbeeld bij ongelukken, verbrandingen en chirurgische ingrepen, en als anti-ontstekingsmiddelen.

Zoals aangegeven is een dagelijkse dosering of een éénmalige toediening ter verkrijging van een bijdragend effect bijvoorbeeld in ondersteunende behandeling, van 15 ongeveer 0,1 mg tot ongeveer 70 mg, geschikt toegediend bijvoorbeeld parenteraal, bij voorkeur intraperitoneaal, in het geval van een dagelijkse dosering, in de verdeelde doses 2 tot 4 maal daags in eenheidsdoseringsvorm, die ongeveer 0,025 — 35 mg van de verbinding bevat gemengd of 20 in langzaam vrijkomende vorm. Een aangegeven totale éénmalige hulpdosis ligt in het traject van maximaal 70 mg van de verbindingen.

Met het oog op een immuno modulerende activiteit worden de verbindingen van de formule Ia en III ook aangegeven 25 voor gebruik als toevoegsels in'vaccins. Voor dit gebruik is een aangegeven dosis van ongeveer 0,2 mg tot ongeveer 1QQ mg, bij voorkeur ongeveer 70 mg, toegediend op de dag van vaccinatie met geschikt een herhaling in dezelfde dosering 2 tot 4 weken later.

30 Farmaceutische samenstellingen die een verbinding van de formule Ia of III bevatten kunnen worden bereid volgens standaard galenische methodes, bijvoorbeeld door mengen met conventionele farmaceutisch aanvaardbare verdunnings-middelen of dragers. Zij kunnen worden bereid bijvoorbeeld in 35 de vorm van injecteerbare oplossingen. Zij maken ook deel uit $60 1 55 1 ψ * - 44 - van de uitvinding.

De uitvinding voorziet ook in een werkwijze voor het bestrijden van ziektes en infecties als boven beschreven door toediening aan een pati'ént, die een dergelijke behandeling 5 nodig heeft, van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een formule Ia of III of, waar geschikt, een fysiologisch aanvaardbaar zout ervan. De uitvinding voorziet ook in de verbinding van de formule Ia of III voor gebruik als een farmaceuticum, in het bijzonder als een immunomodulator, IQ als een antiviraal middel en als een anti-ontstekingsmiddel.

§ & 01h% 1

Claims (9)

1. Farmaceutische samenstelling, die een verbinding bevat van de formule Ia, waarin R onafhankelijk van 1-4 elkaar waterstof of een eventueel gesubstitueerde acylgroep en W, X, Y en Z onafhankelijk van elkaar zuurstof of iminc 5 zijn met dien verstande dat tenminste ëén van de groepen Rj ^ een eventueel gesubstitueerde acylgroep is, in vrije vorm of waar geschikt in farmaceutisch aanvaardbare zuuradditie-zoutvorm, samen met een farmaceutische drager of verdunnings-middel.

2. Werkwijze voor het moduleren van antimicrobiële weerstand, het verhogen van de Immune response en niet specifieke immuniteit, het voorkomen van endotoxine shock of voor het behandelen van kwaadaardige tumoren en ontsteking, met het kenmerk, dat men aan een dier dat 15 een dergelijke behandeling nodig heeft een therapeutisch effectieve hoeveelheid toedient van een verbinding van conclusie 1 in vrije vorm of waar geschikt in farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezoutvorm.

3. Verbinding van de formule I, waarin 2Q onafhankelijk van elkaar waterstof of een eventueel gesubstitueerde acylgroep voorstellen en W, X, Y en Z de in conclusie J gegeven betekenis hebben, met dien verstande dat a) tenminste ëén van de groepen een eventueel 25 gesubstitueerde acylgroep is en L) wanneer Z en X imino zijn en W en Y zuurstof zijn, a) R’ en R' anders zijn dan beide i £e (Rj-3-hydrorytetradecanoyl, voorzover R^ en R^ identiek zijn 30 en (R)-3-hydroxytetradecanoyl zijn of R^ is (R)-3-dodecanoyloxy- tetradecanoyl en R^ is (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl, g) is anders dan waterstof of (R)-3-hydroxytetradecanoyl, in zover als Rj en waterstof zijn en R^ is (Rj-3-hydroxytetradecanoyl en 8301551 9 - 46 - γ)ΙΙ^ anders is dan een groep -(COJ^-CH^-CCHOHJ^-CH^OH in zover als de andere substituenten waterstof zijn, in vrije vorm of waar geschikt in zuuradditie-zoutvorm.

4. Werkwijze ter bereiding van een verbinding van de formule Ia als gedefinieerd in conclusie 1, met het kenmerk, dat men een verbinding van de formule II waarin W en Z de in conclusie J gegeven betekenis hebben, en R^ met uitzondering van waterstof de betekenis 10 hebben aangegeven in conclusie 1 voor R^ en R^ en U is uridine enzymatisch condenseert met een verbinding van de formule III, waarin X en Y de in conclusie 1 gegeven betekenis hebben en Rj en R"^ de in conclusie 1 gegeven betekenis hebben voor R^ en R^ met dien verstande 15 dat tenminste van de twee substituenten een eventueel gesubstitueerde acylgroep is en, wanneer X of Y imino is, de substituent R” of R'^ gebonden aan de iminogroep anders is dan waterstof, en desgewenst een verkregen verbinding hydrolyseert tot een overeenkomstige verbinding van de 20 formule Ia waarin, wanneer X, Y, Z en/of W zuurstof is, Rj, R£, R3 en/of R^, waterstof is of desgewenst een verkregen verbinding onderwerpt aan een acylamidase reactie om een verbinding te verkrijgen van de formule Ia waarin, wanneer X, Y, Z en/of W imino is, Rj, R£, R^ en/of R^ 25 waterstof is, en de verkregen verbinding in vrije vorm wint of waar geschikt in zuuradditiezoutvorm.

5, Farmaceutische samenstelling, met het kenmerk, dat deze een verbinding bevat van de formule III waarin X en Y de in conclusie 1 gegeven betekenis hebben, en 30. Rj en R” de in conclusie 1 aangeduide betekenis hebben voor Rj en R^ met dien verstande dat tenminste ëën van de twee substituenten een eventueel gesubstitueerde acylgroep is en, wanneer X of Y imino is, de substituent R^ of R^ gebonden aan de iminogroep anders is dan waterstof, in 35 vrije vorm of waar geschikt in farmaceutisch aanvaardbare 8601551 .= ·♦ - 47 - zuuradditiezoutvorm samen, met een farmaceutische drager of verdunningsmiddel.

6. Ferkwij ze voor het moduleren van antimicrobiële weerstand, het verhogen van immune response en niet specifieke 5 immuniteit, endotoxine shock of ter behandeling van kwaad aardige tumoren en ontsteking, met het kenmerk, dat men aan een dier dat een dergelijke behandeling nodig heeft een therapeutisch effectieve hoeveelheid toedient van een verbinding van de conclusie 5 in vrije vorm of waar geschikt IQ in farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezoutvorm.

7. Verbinding van de formule III, waarin Rj en R” onafhankelijk van elkaar waterstof of een eventueel gesubstitueerde acylgroep zijn en a) Y zuurstof is en X is NEt met dien verstande 15 dat et} wanneer R" is (R)-3-hydroxytetradecanoyl, R^ anders is dan (R)-3-hydroxytetradecanoyl of (R) -3-hexadeca-noyloxytetradecanoyl, g) Rj anders is dan waterstof en 2Q γ} R" en R^ anders zijn dan beide acetyl of de groep -C0(CH2) jqCH^ h) Y en X zuurstof zijn of c} Y is M en X is zuurstof, met dien verstande dat tenminste één van de 25 twee substituenten R" en R” een acylgroep is en wanneer X en Y imino is, de substituent R'j' of R^ gebonden aan de iminogroep anders is dan waterstof, in vrije vorm of waar geschikt in zuuradditiezoutvorm.

8. Ferkwijze voor de produktie van een verbinding 3Q van de formule III als gedefinieerd in conclusie 5, met het kenmerk, dat men a) ter bereiding van een verbinding van de formule lila waarin R^ en R2 de in conclusie 5 gegeven betekenis hebben en zowel X1 als Y' zuurstof zijn of YT is imino en 35 X’ is zuurstof, in een verbinding van de formule IV, waarin 5601551 i * - 48 - R" en R'^ de in conclusie 5 gegeven Betekenis hebben, X' en Y' de in deze conclusie gegeven betekenis hebben en Y een beschermende groep is, de onbeschermde hydroxygroep omzet in een beschermde fosfaatestergroep of 5 h) ter bereiding van een verbinding van de. formule lllh waarin R" en R^ de in conclusie 5 gegeven betekenis hebben, een overeenkomstige verbinding van de formule IIÏc, waarin R de in deze conclusie gegeven betekenis heeft, R'^ de in conclusie 5 gegeven betekenis heeft en R' een 10 beschermende groep is, acyleert en daarna de beschermende groepen afsplitst en de verkregen verbinding in vrije vorm wint of waar geschikt in zuuradditiezoutvorm.

9. Verbinding van de formule Ia als gedefinieerd in conclusie 1 of een verbinding van formule III als gedefinieerd 15 in conclusie 5, in vrije vorm of waar geschikt in farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezoutvorm, voor gebruik als een farmaceuticum. G gt Λ Λ 5 *- o öy1 3 5 ; Ψ 'S Η0">^ Η0^ OH HO—\ V—0—CHa y—O / nu VY •^-o /oh ho-tVo-p; ?H w z HO_y \—ο-p. W v o—p—u R r! π r0H w z o T R3 ^ y x o '| 0 1, 1, r R R* R, R, Γ I HO—\ Η0Λ^"°'\ π Η0Λ-0 -OH 1. ho^3-o-p( H H0_V“°'P}\)h r2 rji rf r oh y x o γ x 0 ij Ia R, Re Rl R* IE HO—i HO—v. "°^HC H0^/_o'pr™ Y' x' O O NH 0 l 1 II p'1 Li ri Rz 3Ta 1 Ra je b Y~f INdr' ho—\>-oh HO NH 0 HU I O NH I. _ II Rt Wc R(“ R» Ί5Γ SANDOZ AG, te BASEL, Zwitserland 8601551 —Από—λ Vo π ο —\)—οη ΗΟ ΝΗ^ Υ acy lering ΗΟ-λ /—Ο ΗΟ—^ V— ΟΗ η/Λ-hr; 'r bescherming ( ü + 6 plaats) R0>* ho/^nhr* bescherm inq / / \ R0-\ \ \—O \ RO—OH \. /\ \ TBDMS-0 , nhr" \ ' \ "°>V “Λ-Ο ,or' R0-yr°-.%* — r°-&-°-?<or, TBDMS-0 NHR" ° H0 NHR* O BE c TBDMS - tert-bufytdimethylsilyl SAHDQZ AG, te BASEL, Zwitserland _ 8601551 — B— /^Λ P AcO—\ \\ /)—( V-0 /—O '—' O—( \—OH -&- AcO—( \—O Ac Oal/^N3 OiN N3 H0A n HO-\( _ gestuurde HO-{ V-OH -— - HO—( V- OH \ / reductie \ / Ο.,ν'^Η* o2n'^^n3 u bescherming( 2 plaats) .r reductie H0_\_O ΗζμΛ_η H0~\_}-0H HO-Y^V-OH °*N NHR HtN NH, reductie ,r acylering HO—HO—y HO*~y^ H2N NHR RfHN NHRg- y acylering bescherming HQ RQ t C^6plaats) HO—/~VoH RO—P OH RrHN NHR Rj-H N NHRj- ir ontscherming / 2 plaats) ~Π7~3 (beide Rg- identiek ) RsHNNHa 0Cy,erm9 RcHN ^NHRf it6Plaats RjHN NHRg-8 6 0 1 55 1 ^ ^'^verschillend) GAHDOZ AG, te BAGEL, Zwitserland * ____ -, ir — C- HO~Vo HO—O-0H n3 oh bescherming (4+6 plaats) Ί RO-v RO-\— OH N3 OH bescherming (1 plaats) RO ..........v Vo RO-( \—O-TBDMS Nj OH 1. reductie RO-, I 2' acylering RO-/~Λ—O-TBDMS R5H ti^0Rs Rq_ f ontscherming (1 plaats ) R0 ~O~0H RrHN ORs- 1Tb 8601551 QAATTW7 fin ώαοπτ r* · - * — D- AcO—. AcO—/^~\_OAc AcO O Ac bescherming (1 plaats) AcO—v V-o Ac0—V )-O -CHjC Ci3 AcO o Ac H0 f ontscherming (2,3,4,6 plaats) H°—0-CHi CCU HO OH ,, bescherming (4+6plaats) RO-v ' R0-(3~Ο-0Ηε0013 HO OH RO_ T acylering Vo R0—()— o-CHjCa, R<rO ORf ,, ontscherming (1 plaats) RO-v RO —/ \—OH R50 OR5 TVc 8 6 0 1 5 5 1 SAEDOZ AG, te BASEL, Zwitserland