PL151036B1

PL151036B1 - A method of new carbohydrates production

Info

Publication number: PL151036B1
Application number: PL1986260328A
Authority: PL
Original assignee: Sandozerfindungen Verwaltungsgesellschaft Mbh
Priority date: 1985-06-28
Filing date: 1986-06-27
Publication date: 1990-07-31
Also published as: NL8601551A; GB8615617D0; PL151094B1; FI900588A0; PT82855A; AU4798990A; GB2179945B; AU5931386A; CH672789A5; PT82855B; IT1203816B; HU199494B; KR870000351A; WO1987000174A3; PL271248A1; AU596800B2; ES2000205A6; SE8602854D0; HUT42499A; IL91862A0

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 151 036 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 86 06 27 (P. 260328)

Pierwszeństwo: 85 06 28 dla zastrz. 2 Austria 86 05 07 dla zastrz. 1 Austria

Int. Cl.⁵ C07H 13/00

CZY ELNIA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 21

Opis patentowy opublikowano: 1990 12 31

U: edu PatFrnoweoO r v Ir ^: Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Sandoz AG, Bazylea (Szwajcaria)

Sposób wytwarzania nowych sacharydów

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych sacharydów, stosowanych do wytwarzania preparatów farmaceutycznych.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych związków o wzorze 1, w których Ri, R2, R3 i R4 niezależnie oznaczają atom wodoru lub ewentualnie podstawioną grupę acylową, zaś W, X, Y i Z niezależnie oznaczają atom tlenu lub grupę iminową pod warunkiem, że

a) co najmniej jedno z R1, R2, R3 i R4 oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową oraz

b) gdy Z i X oznaczają grupę iminową, a W i Y oznaczają atom tlenu, wtedy

a) R1 i R2 są różne w obu przypadkach od grupy /R/-3-hydroksytetradekanoilowej, o ile albo R3 i R4 są identyczne i oznaczają grupę /R/-3-hydroksytetradekanoilową albo R4 oznacza grupę /R/-3-dodekanoiloksytetradekanoilową i R3 oznacza grupę /R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilową,

β) R2 jest różne od atomu wodoru lub grupy /R/-3-hydroksytetradekanoilowej, o ile R1 i R3 oznaczają atom wodoru i R4 oznacza grupę /R/-3-hydroksytetradekanoilową oraz

χ) R3 jest różne od grupy -/CO/2-CH2-/CHOH/4-CH2OH, o ile inne podstawniki oznaczają atom wodoru, w postaci wolnej lub w postaci kwaśnych soli addycyjnych.

Sposób według wynalazku wytwarzania związków o wzorze 1, w którym podstawniki mają wyżej podane znaczenie, polega na enzymatycznej kondensacji związku o wzorze 2, w którym W i Z mają wyżej podane znaczenie, R3 i R4 z wyjątkiem wodoru mają wyżej podane znaczenie dla R3 i R4, a U oznacza urydynę, ze związkiem o wzorze 3, w którym X i Y mają wyżej podane znaczenie, a Ri i R2 mają znaczenie podane wyżej dla R1 i R2, pod warunkiem, że co najmniej jeden z dwóch podstawników oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową oraz gdy X lub Y oznacza grupę iminową, wtedy podstawnik Ri lub R'^z2 przyłączony do grupy iminowej jest różny od wodoru oraz, o ile jest to pożądane, hydrolizuje się otrzymany związek do odpowiedniego związku o wzorze 1, w którym gdy X, Y, Z i/lub W oznaczają atom tlenu, wtedy R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru albo, o ile jest to pożądane, poddaje się otrzymany związek reakcji acyloamidazowej dla otrzymania związku o wzorze 1, w którym, gdy X, Y, Z i/lub W oznaczają grupę iminową, wtedy

151 036

Ri, R2, R3 i/lub R4 oznacza atom wodoru i uzyskuje się związek o wzorze 1 w postaci wolnej lub w postaci kwaśnej soli addycyjnej.

W przypadku wytwarzania związku o wzorze 1, w którym R1, R2, R3 i R4 niezależnie od siebie oznaczają atomy wodoru albo ewentualnie podstawioną grupę acylową, a W, X, Y i Z niezależnie od siebie oznaczają atom tlenu lub grupę iminową, z tym, że a) co najmniej jeden spośród R1, R2, R3 i R4 oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową, b) gdy Y i/lub W oznacza grupę iminową, R1 i/lub R3 mają znaczenie inne niż atom wodoru i c) gdy R1, R2, R3 i R4 oznaczają grupę acylową, albo R2 i R4 oznaczają grupę acylową, a R1 , R3 oznaczają atomy wodoru, X i Z oznaczają grupę iminową i Y oznacza atom tlenu, wówczas W ma znaczenie inne niż tlen, w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami, związek o wzorze 2, w którym W i Z mają znaczenie wyżej podane, R3 i R'^z4 mają znaczenie podane wyżej dla R3 i R4 z wyjątkiem wodoru, a U oznacza grupę urydynową, poddaje się enzymatycznej kondensacji ze związkiem o wzorze 3, w którym X i Y mają znaczenie wyżej podane, a Ri i R2 mają znaczenie podane wyżej dla R1 i R2 z wyjątkiem wodoru i ewentualnie hydrolizuje się otrzymany związek do odpowiedniego związku o wzorze 1, w którym gdy X, Y, Z i/lub W oznaczają atom tlenu, wówczas R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru, albo otrzymany związek ewentualnie poddaje się reakcji acyloamidazowej, otrzymując związek o wzorze 1, w którym gdy X, Y, Z i/lub W oznacza grupę iminową, wówczas R1, R2, R3 i/lub R4 oznacza wodór i uzyskany związek wyodrębnia się w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami.

Kondensację enzymatyczną można np. prowadzić w zbuforowanym układzie, np. w trisbuforze przy wartości pH = 7. Reakcję można prowadzić w temperaturze pokojowej lub podwyższonej, np. w 30°C. Jako ekstrakt enzymatyczny można stosować preparat otrzymany z bakterii gram-ujemnych, korzystnie ze szczepów E.Coli (Raetz, J.Biol.Chem. 259 [1984] 4852). Najkorzystniejsze są szczepy, w których genetycznie wprowadzono zdolność do nadprodukcji żądanego enzymu.

Ewentualną hydrolizę prowadzi się w sposób analogiczny do metod opisanych w literaturze.

Reakcję acylamidazową można prowadzić w sposób analogiczny do sposobu opisanego przez

C.R.Verret i in. w J.Biol.Chem. 257 [1982] 10222.

Produkty otrzymane sposobem według wynalazku można wyodrębniać z mieszaniny reakcyjnej i, o ile jest to pożądane, oczyszczać znanymi sposobami.

Związki o wzorze 1 i 3 mogą występować w postaci wolnej lub, o ile potrzeba, w postaci soli addycyjnych z kwasami. Postać wolną można przekształcać w sól i odwrotnie, konwencjonalnymi sposobami.

R1, R2, R3 i R4 korzystnie są identyczne. Korzystnie oznaczają one atom wodoru lub grupę acylową np. o 4-20, korzystnie o 12-16, a zwłaszcza 14 atomach węgla. Mogą być one np. podstawione w pozycji 3 przez grupę hydroksylową, acetyloksylową lub acyloksylową, jak podano powyżej. Konfiguracja przy atomie węgla w pozycji 3 może być /R/ lub /S/. Tak więc R1, R2, R3 i R4 mogą być obecne w związku o wzorze 1 w postaci achiralnej, /R/, /S/ lub racemicznej. Stosuje się to też do związku o wzorze 2 i 3. Konfiguracja nie zmienia się w czasie procesu według wynalazku, a mianowicie, gdy jako substrat stosuje się związek w postaci /R/, /S/ lub racemicznej to otrzymuje się odpowiedni /R/ /S/ lub odpowiednio racemicznej produkt końcowy.

Korzystne są związki o wzorze 1, w których R1, R2, R3 i R4 stanowią ewentualnie podstawione grupy acylowe. Dalej, korzystne są związki o wzorze 1, w których, gdy R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru, wtedy Y, X, W i/lub Z oznaczają atom tlenu.

Związki o wzorze 1 korzystnie otrzymuje się w postaci kwaśnej soli addycyjnej. Dla zwiększenia rozpuszczalności w wodzie, korzystnie stosuje się hydrofilowe związki zasadowe, np. tris/hydroksymetylo/-aminometan lub L-lizynę.

Związki o wzorze 2 można otrzymać w znany sposób przez reakcję związku o wzorze 3 z aktywowanym urydyno-5'-monofosforanem.

Niektóre związki o wzorze 3 są związkami nowymi i sposób ich wytwarzania jest przedmiotem polskiego opisu patentowego nr 151094 (zgłoszenie P. 271 248).

Związki o wzorze 1 wykazują aktywność farmakologiczną. Wskazane są do zastosowania farmaceutycznego. Wywierają korzystny wpływ na nieswoistą-oporność antybakteryjną. Aktywność tę można np. wykazać w następujących metodach testowych.

151 036

1. Oznaczanie aktywności endotoksycznej w teście lizatu limulusamebocytowym. Endotoksyna katalizuje aktywację proenzymu w lizacie limulusamebocytowym. Mierzy się odszczepianie p-nitroaniliny z bezbarwnego podłoża. Zasięg tego odszczepiania wykrywa się fotometrycznie, przy czym zależność pomiędzy absorpcją i stężeniem endotoksyny (lub, odpowiednio, aktywność endotoksyny dla analogów) w zakresie od 0,01 do 0,1 ug/ml endotoksyny jest liniowa (porównanie z wartościami absorpcji standardowej endotoksyny). Z każdej próbki (rozpuszczonej w wolnej od pirogenów, sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie) sporządza się serię rozcieńczeń 1:10 do 100//1 testowanej próbki lub standardu odniesienia lub ślepej próbki i dodaje się 100/zl lizatu limulus-amebocytowego. Po 10 min inkubacji w 37° do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 200pl podłoża. Reakcję zatrzymuje się za pomocą 200μ1 50% kwasu octowego po dalszych 3 min inkubacji. Po mieszaniu próbki mierzy się absorpcję w spektrofotometrze przy 405 nm, odejmując wartość tła. Zawartość endotoksyny (aktywność endotoksyny) w próbce w jednostkach endotoksyny (E.U.) oblicza się na komputerze za pomocą liniowej regresji do wartości standardu endotoksyny.

2. Wywołanie wstrząsu endotoksynowego u myszy. Test obejmuje wywołanie wstrząsu endotoksynowego lub analogicznych letalnych stanów klinicznych za pomocą substancji LPSanalogicznych w myszy uczulonej galaktozaminą (GalN). Samcom czarnych myszy C57 (po 6 zwierząt w grupie) podaje się jednocześnie dootrzewnowo 8 mg GalN rozpuszczoną w 0,5 ml PBS oraz 0,1 pg LPS z Salmonella abortus equi (Sigma) rozpuszczoną w 0,2 ml soli fizjologicznej. Traktowanie takie zabija zwierzęta w ciągu 6-12 godz. (C.Galanos i in. Proc.Natl.Acad.Sei., USA, 76/1979/) 5939-5949. Zamiast LPS w standardowym traktowaniu podaje się testowane substancje w różnych dawkach albo jednocześnie z GalN albo pozajelitowo lub doustnie przed lub po traktowaniu za pomocą GalN. Przeprowadza się ocenę wyników przez porównanie najmniejszych dawek, które są śmiertelne dla wszystkich zwierząt w grupie lub przez komputerowe obliczanie LD50 przy zastosowaniu metody Spearman-Karbera.

3. Bakteryjna posocznica u myszy neutropenicznych. Próba ta pozwala na oznaczenie związanego z substancję wzrostu reakcji odpornościowej u zakażonych bakteryjnie neutropenicznych myszy. W celu wywołania neutropenii, czyli zmniejszenia liczby krwinek białych, obojętnochłonnych we krwi, podaje się jednorazowo podskórnie, grupom po 20 samic myszy B6D2F1 200 mg/kg ciężaru ciała cyklofosfamidu rozpuszczonego w 0,2 ml wody destylowanej, w dniu 0. Na 3 dzień testu substancję podaje się pozajelitowo (głównie dootrzewnowo) lub doustnie, o ile możliwe, rozpuszczoną w fizjologicznym roztworze chlorku sodu lub rozpuszczoną w jakiś inny sposób (0,3 ml). Zakażenia przeprowadza się na 4 dzień po dożylnym podaniu odpowiedniego inokulum w objętości 0,2ml (liczba drobnoustrojów, np. na mysz: Pseudomonas aeruginosa, Δ 12:1 X 10⁵; E.coli Δ 120:2 X 10⁶; Staph.aureus Δ 113; 1 X 10⁶; Candida albicans Δ 124:1 X 10⁴). Testowane zwierzęta obserwuje się do 10 dnia po zakażeniu i co dzień rejestruje się przypadki śmierci. Oblicza się na komputerze następujące parametry w odniesieniu do kontrolnych zakażeń lub do standardów; odpowiednio:

a) średni czas przeżycia, b) wskaźnik przeżycia.

Związki o wzorach 1 dają znacznie lepsze wyniki dotyczące czasu i wskaźnika przeżycia w stosunku do nietraktowanych zakażonych prób kontrolnych przy doświadczalnych zakażeniach czynnikiem gram-ujemnymi (np. Pseudomonas i E.coli) jak również przy zakażeniach czynnikami gram-dodatnimi (np. Staph.aureus) lub drożdżami (np. Candida albicans), po podaniu pozajelitowym.

4. Aktywacja utleniającego metabolizmu neutrofilów w krwi ludzkiej. Neutrofile (o czystości co najmniej 95%) inkubuje się testowaną substancją w 3 różnych stężeniach w ciągu 1-2 godz. w 37°C. Następnie mierzy się uwalnianie anionów nadtlenowych przez komórki jako wskaźnik aktywacji; pomiar prowadzi się mierząc hamowanie dysmutazy nadtlenowej redukcji cytochromu C.l X 10⁶ neutrofili albo traktowanych wstępnie badaną substancję albo nie, dodaje się do roztworu zawierającego cytochrom C (80 u Mol) oraz formylomethionyloleucylofenyloalaninę (10^_6M). Próba kontrolna zawiera dodatkowo 50 ug dysmutazy nadtlenowej. Po 15 min. inkubacji w 37°C reakcję zatrzymuje się przez chłodzenie testowanych próbek w kąpieli lodowej. Testowane próbki wiruje się przy 400 g w ciągu 5 min. w celu usunięcia komórek. Redukcję cytochromu C,

151 036 która jest proporcjonalna do ilości uwolnionego nadtlenowego anionu, mierzy się fotometrycznie przy 550 nm. Wpływ hamujący testowanej substancji na aktywację PMN przez LPS mierzy się jak opisano powyżej, przy czym po wstępnej inkubacji leukocytów. Komórki inkubuje się dalej ze stymulującymi stężeniami LPS.

5. Test usuwania węgla. Test ten opiera się na zasadzie, że cząstki o wymiarach 200-250 A (np. cząstki węgla) mogą być usunięte z organizmu tylko przez fagocytozę makrofagów. Po dożylnym podawaniu, cząstki węgla są usuwane z obiegu krwi za pomocą fagocytozy makrofagów w wątrobie (gwiaździste komórki Kupffera) oraz w śledzionie. Oznaczenie aktywacji RES substancji prowadzi się przez jednorazowe lub powtarzane podawanie w roztworze wodnym lub w postaci zawiesiny. Substancje testowane podaje się dootrzewnowo lub podskórnie w 4 dawkach dziennych lub raz na 24 godz. przed rozpoczęciem testu. Zawiesinę zawierającą 10% sadzy rozcieńcza się 1 % roztworem żelatynowym chlorku sodu do zawartości 16 mg węgla/ml. Każda mysz otrzymuje 0,2/20 g ciężaru ciała dożylnie. Pobiera się 25μΐ krwi przez nakłucie splotu orbitalnego w okresie 3,6,9,12 i 15 min. po dożylnym podaniu. Krew hemolizuje się w 2 ml wody destylowanej. Oznacza się stężenie węgla fotometrycznie. Wtedy zabija się zwierzęta i oznacza się ciężary wątroby i śledziony.

6. Zakażenie opryszczkowe (mysz). Podskórne zakażenie opryszczkowe pozwala na oznaczenie wzrostu reakcji odpornościowej, pod wpływem substancji, myszy zakażonej wirusami opryszczki. Przebieg choroby jest przewlekły i umożliwia obserwację kolejnego pojawienia się szeregu parametrów. Zmiany opryszczkowe pojawiają się na miejscu zakażenia, następnie zamieniają się w owrzodzenie, wreszcie sąsiadująca noga staje się sparaliżowana i paraliż stopniowo wzrasta do śmierci. Immunokompetentna „naga (bez włosów) mysz zostaje śródskórnie zakażona w dniu 0 przez śródskórne podanie badanego inokulum w objętości 0,025 ml (np. 1 X 10⁶ tworzących płytki jednostek Herpes simplex typl/mysz). Testowaną substancję podaje się dootrzewnowo w roztworze, np. w soli fizjologicznej (0,1 ml).

Systemiczne zakażenie opryszczkowe również pozwala oznaczyć wzrost reakcji odpornościowej, pod wpływem substancji, myszy zakażonej wirusami opryszczki. Immunokompetentne myszy NMRI zakaża się w dniu 0 przez dootrzewnowe podanie badanego inokulum w objętości 0,1 ml (np. 1,3 Χ10⁵ tworzących płytki jednostek Herpes simplex typ 1/mysz). Testowaną substancję podaje się podskórnie w roztworze, np. w soli fizjologicznej.

Testowane zwierzęta obserwuje się do 20 dnia po zakażeniu i rejestruje się zmiany, paraliż i śmierć. Mierzy się następujące parametry i porównuje się je z kontrolnymi zakażeniami lub ze standardami: a) Liczba myszy ze zmianami (kumulatywnie), b) Liczba myszy z paraliżem (kumulatywnie), c) Średni czas przeżycia, d) Wskaźnik przeżycia.

Przy doświadczalnym zakażeniu HSV-1, związki o wzorach la i 3 powodują znaczne polepszenie w przebiegu choroby, czasie i wskaźniku przeżycia w stosunku do nietraktowanych prób kontrolnych. Efekt ten obserwuje się po jednokrotnym dootrzewnowym lub odpowiednio, podskórnym podaniu pomiędzy dniem 0 lub -1 i+6.

7. Indukcja CSF (czynnik stymulujący kolonie). Czynniki CSF stanowią substancje pośredniczące wytwarzane przez organizm w następstwie zakażeń lub pod wpływem toksyn. Ich działanie biologiczne jest złożone, są one wykrywane przez stymulację proliferacji układu hemopoetycznego, zwłaszcza komórek szpiku kostnego. Myszom B6D2F1 podaje się jednokrotnie lub wielokrotnie, pozajelitowo lub doustnie, badane substancje do dawki 50 mg/kg. Pobiera się osocze z testowanych zwierząt po różnych kolejnych odstępach czasu. Mimo aktywności CSF osocza mierzy się w próbie hodowli komórek za pomocą wskaźników proliferacji komórek szpiku kostnego myszy B6D2F1 [D.Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Faclors, 1984, Elserier, T.Mosmann, J.Immunol.Methods, 65 (1983) 55-63; L.M.Green in. J.Immunol.Methods, 70 (1984) 257-268].

Związki o wzorze 1 wprowadzają w różnym stopniu czynniki CSF u myszy, przy czym obserwuje się również różnice czasowo-kinetyczne w aktywnościach CSF może być korzystne w zastosowaniu terapeutycznym.

8. Indukcja Interleukin-1 (L-l). Oznaczanie stymulacji komórek, pod wpływem substnacji do wytwarzania L-l głównie przeprowadza się w próbach kultur tkankowych. Najpierw odzyskuje się makrofagi zarówno stałe jak i ujawnione za pomocą tioglikolanu, w postaci przylegających makrofagów. Te makrofagi inkubuje się w środowisku RPM w ciągu 48 godz. z różnymi stężeniami testowanej substancji i zbiera się supernatanty komórkowe. Są one sprawdzone na aktywność L-l

151 036 w kulturach tymocytów z myszy CaH/HeJ. Wywołuje się proliferację tymocytów z tych supernatantów zawierających L-l wytwarzaną przez makrofagfi, w ciągu 72 godz. inkubacji. Proliferację mierzy się przez wprowadzanie tymidyny 3H, w liczniku scyntylacyjnym (J.Gery i in., J.Exp.Med. 196 (1972), 128-142; J.Oppenheim i in. Cellular Immunol. 50 (1980) 71-81).

Związki o wzorze 1 wykazują w różnych zakresach (w stężeniach 0,l-50pg/ml) zdolność wywoływania produkcji L-l w makrofagach.

9. Indukcja tolerancji na LPS (endotoksynę) (tolerancja na śmiertelność). Tak zwana tolerancja może być wywołana u myszy za pomocą pozajelitowego podawania LPS jedno -trzykrotnie w ciągu dnia. Tolerancja ta chroni zwierzęta przed śmiertlenymi skutkami LPS po podaniu galaktozaminy (patrz wywoływanie wstrząsów endotoksycznych u myszy powyżej).

Związki o wzorze 1 wywołują tę tolerancję już po jednorazowym dootrzewnowym podaniu 0,25 mg/mysz wstępnie traktowaną (tolerancyjną) mysz poddaje się działaniu LPS w dawkach 0,01 /yg LPS + 8 mg galaktozaminy/mysz, dootrzewnowo w różnych czasach (1 dzień do 3 tygodni) po ostatnim traktowaniu. Większa część zwierząt przeżywa to podanie LPS, zwłaszcza po powtarzanym (3 razy) podaniu, w porównaniu z nietraktowanymi wstępnie kontrolnymi zwierzętami.

Ponadto związki o wzorze 1 również wykazują działanie przeciwzapalne, zwłaszcza w zapaleniu nieswoistym, w zapaleniu wywołanym immunologicznie i w zapaleniu wywołanym przez nadwrażliwość oraz w reakcjach alergicznych. Działanie to można wykazać w różnych metodach testowych np. przez badanie wpływu na syntezę prostaglandyny in vitro i in vivo. Badano in vitro hamowanie uwalniania PGE2 i PGFićr wywołanego przez LPS i przez zymosan. Otrzewnowe leukocyty myszy NMR 1, stymulowane tioglikolanem, inkubuje się 24 godz. z LPS lub z testowaną substancją. Po zmianie środowiska i trzykrotnym przemyciu komórki stymuluje się 2 godz. z LPS lub 1 godz. z zymosanem. W tych supernatantach oznacza się PGE2 i PGFi_a. Stwierdza się hamowanie wytwarzania PGE2 wywołane przez LPS lub zymosan.

Mierzy się hamowanie uwalniania PGE2 przez leukocyty otrzewnowe myszy po wstępnym traktowaniu testowanymi substancjami in vivo. Grupy po 3 myszy NMRI traktuje się dootrzewnowo, w dniach 1,2 i 3 za pomocą LPS lub o odpowiednio, testowaną substancję. W 4 dniu podaje się tym zwierzętom i grupie kontrolnej 1,5 ml tioglikolanu, dootrzewnowo; na 7 dzień zbiera się otrzewnowe leukocyty myszy i stymuluje się je LPS. Stwierdza się znaczne obniżenie uwalniania PGE2 w porównaniu z próbami kontrolnymi.

W następnym teście bada się wpływ na działanie prokoagulacyjne (PCA). Po stymulacji za pomocą LPS ludzkie komórrki śródbłonkowe syntetyzują PCA, co stwierdza się przez skrócenie czasu koagulacji plazmy. Otrzewnowe leukocyty myszy po traktowaniu LPS i otrzewnowe leukocyty (otrzymane z królików) po wyzwoleniu uogólnionej reakcji Schwartzmana również skracają czas koagulacji ponownie zwapnionej plazmy. W celu zbadania wpływu na PCA wywołanego przez LPS in vitro, otrzewnowe leukocyty myszy z myszy B6D2F1H, stymulowane przez tioglikolan, traktuje się przez noc samym LPS lub odpowiednio, LPS i testowaną substancją w środowisku DMEM pozbawionym osocza z embrionu cielęcia (FCS). (Projekt testu a).

W projekcie testu b) otrzewnowe leukocyty myszy traktuje się w ciągu 24 godz. LPS lub, odpowiednio badaną substancją. Po zmianie środowiska komórki stymuluje się przez noc LPS. Czas koagulacji ponownie zwapnionej ludzkiej plazmy kontrolnej mierzy się metodą Hakena po dodaniu zawiesiny otrzewnowych leukocytów myszy, którą uprzednio wielokrotnie zamrażano i traktowano ultradźwiękowi.

Dodanie testowanej substancji obniża PCA wywołaną przez LPS, w porównaniu do wartości kontrolnych co objawia się wzrostem czasu koagulacji. Wstępne traktowanie testowaną substancją podobnie wywołuje obniżenie PCA.

In vivo można wykazać wpływ wywoływanej przez LPS PCA w otrzewnowych leukocytach myszy, po wstępnym traktowaniu testowaną substancją w następujący sposób: myszy B6D2F1 traktuje się dootrzewnowo w dniach 1, 2 i 3, za pomocą LPS lub odpowiednio, testowaną substancją. Na 3 dzień wszystkie zwierzęta ponadto dostały 1,5 ml tioglikolanu, dootrzewnowo. Na 6 dzień, zebrano otrzewnowe leukocyty, próbki z każdego zwierzęta nastawiono na 1 X 10® komórek/ml i stymulowano 24 godz. za pomocą LPS w środowisku DMEM, pozbawionym FCS. Wstępne traktowanie LPS lub, odpowiednio, testowaną substancją wywołuje znaczne obniżenie PCA. Podobne obniżenie można stwierdzić w królikach. PCA otrzewnowych leukocytów królika

151 036 można obniżyć po wywołaniu uogólnionej reakcji Schwartzmanna oraz przez wstępne traktowanie za pomocą LPS lub testowaną substancją, odpowiednio w celu zbadania hamowania lokalnej reakcji Schwartzmanna traktuje się wstępnie grupy po trzy króliki Chinchilla, dożylnie lub dootrzewnowo, za pomocą LPS lub testowaną substancją, odpowiednio w dniach 1, 2 i 3. Na 6 dzień podaje się LPS śródskórnie: (40; 20; 10; 5; 2,5 i 1,25 //g). Na 7 dzień wyzwala się reakcję za pomocą 2//g LPS/kg, dożylnie. Doświadczenie ocenia się półilościowo przez badanie martwic skóry. Obserwuje się prawie całkowite hamowanie reakcji Schwartzmanna po wstępnym traktowaniu LPS lub testowaną substancją, odpowiednio.

Następnie, związki o wzorze 1 również wykazują działanie przeciwnowotworowe, co wykazują następujące testy:

1. Indukcja czynnika martwicy nowotworowej (TNF). W celu stymulowania makrofagów szpiku kostnego myszy rozcieńcza się komórki szpiku kostnego z myszy BDFi (około 10-13 dniowe, indukowane CSF) do 1 X 10⁶ komórek/ml w środowisku [RPMI 1640+1% Pen/Strep/5000 jedn./ml/ +1% glutaminy] i inkubuje się je w płaskich płytkach do mikromiareczkowania z testowanymi substancjami w roztworze o stężeniu końcowym rzędu ΙΟΟχ/g - 0,1 μg ml/etapy rozcieńczania 1:10/ w ciągu 4 godz. w 37°C/5% CO2. Po przesączeniu przez filtry 0,45 μιη supernatanty zamraża się w -70°C aż będą potrzebne.

Hoduje się wstępnie komórki L 929 przez noc (37°C, 5% CO2) w płytkach do mikromiareczkowania przy 3Χ10⁴ komórkach (otwór/ΙΟΟμΙ, następnie dodaje się 100μΐ z każdej próbki i kulturę dalej rozcieńcza się w etapach 1:2. Dodaje się 100μ1 aktynomycyny D (8μ1 środowiska) i dalej inkubuje się w ciągu dalszych 18 godz. w 37°C/5% CO2. Po usunięciu supernatantów pozostałą warstwę komórek planu zabarwia się roztworem Giemsa i mierzy się absorpcję przy 620 nm za pomocą urządzenia Titertek Multiscan Autoreader (z przepływem). Jako jedną jednostkę TNF przyjmuje się działanie które daje 50% lizy traktowanych komórek L929.

2. Test na czerniaka B16F1. Komórki czerniaka B16F1 hoduje się 5 dni in vitro. Komórki synchronizuje się dzień przed testem przez przerwanie monowarstwy na pojedyncze komórki stosując EDTA trypsynę i zawracając całą ilość do tej samej butelki ze świeżym środowiskiem. Komórki liczy się i doprowadza się do 10⁶ komórek/ml środowiska. 0,1 ml zawiesiny komórek (10⁵komórek) wstrzykuje się dożylnie do żyły ogonowej myszy B6D2F1. Po 21 dniach myszy zabija się i liczy się ilość nowotworów płuc. Testowaną substancję przeprowadza się w roztwór i wstrzykuje się dootrzewnowo w dniach -6 -4 i -1.

Stwierdzono, że związki o wzorze 1 wykazują działanie immunoprofilaktyczne; co objawia się w obniżeniu ilości przerzutów czerniaka B16F1 w płucach. W dalszym teście na aktywność terapeutyczną, myszy traktuje się na 3, 6, 8, 10, 13 i 15 dzień po zaszczepieniu komórek nowotworowych. Tu także obserwuje się znaczne zredukowanie ilości przerzutów.

Związki o wzorze 1 są więc wskazane do stosowania jako modulatory nieswoistej oporności antybakteryjnej, w systemicznym zwiększaniu reakcji odpornościowej oraz w zwiększaniu nieswoistej odporności. Związki o wzorze 1 są więc wskazane do stosowania w leczeniu lub w leczeniu wspomagającym (to jest razem z innymi specyficznymi lub wspomagającymi postaciami terapeutycznymi) w warunkach związanych z obniżoną reakcją odpornościową zwłaszcza ze zmniejszoną humoralną reakcją odpornościową i/lub z obniżoną reakcją nadwrażliwość typu opóźnionego oraz w leczeniu stanów, w których ogólnie wskazana jest modulacja reakcji odpornościowej. Szczególnie, związki o wzorze 1 są wskazane do zastosowania w leczeniu lub leczeniu wspomagającym stanów patologicznych opartych na samoistnych niedoborach immunologicznych lub niedoborach immunologicznych typu spotykanego u pacjentów geriatrycznych lub u pacjentów z ciężkimi poparzeniami lub z uogólnionymi zakażeniami. Związki o wzorze 1 są również wskazane do zastosowania w leczeniu lub w leczeniu wspomagającym chorób wirusowych (takich jak rozsiana opryszczka, postępująca ospa i rozsiane choroby varicella) choroby Hodgkina i dalszych złośliwych nowotworów. Ponadto, związki o wzorze 1 są wskazane w przeciwdziałaniu wstrząsom endotoksycznym, np. w wypadkach, oparzeniach i interwencjach chirurgicznych oraz jako środki przeciwzapalne. Dla powyższych zastosowań dawka będzie się wahać, oczywiście, zależnie od użytego związku, sposobu podania i żądanego leczenia. Na ogół uzyskuje się zadowalające wyniki przy podawaniu dawki dziennej lub w postaci jednorazowego podania, dla osiągnięcia efektu

151 036 wspomagającego, np. w leczeniu wspomagającym, przy dawce od około 0,0015 mg/kg do około 1 mg/kg ciężaru ciała zwierzęcia. Podaje się np. pozajelitowo, korzystnie dootrzewnowo. Dla większych ssaków wskazana dawka dzienna wynosi od około 0,1 mg do około 70 mg, odpowiednio podana, np. w przypadku dawki dziennej a w dawkach podzielonych 2-4 razy dziennie dawki w postaci jednostkowej zawierającej od około 0,025 do około 35 mg domieszanych związków lub w postaci o przedłużonym działaniu. Wskazana całkowita dawka pojedyncza o charakterze pomocniczym jest rzędu do 70 mg związku.

Ze względu na działanie immonomodulujące związki o wzorze 1 są również wskazane jako środki pomocnicze w szczepionkach. Wskazana do tego celu dawka wynosi od około 0,5 mg do około 100 mg, korzystnie około 70 ug. podana w szczepienia, korzystnie z powtórzeniem tej samej dawki 2-4 tygodnie później.

Preparaty farmaceutyczne zawierające związek o wzorze 1 mogą być sporządzane według typowych sposobów galenowych, np. przez zmieszanie z konwencjonalnymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami lub nośnikami. Mogą być one wytwarzane np. w postaci roztworów do wstrzykiwań. Stanowią również część wynalazku. Wynalazek dotyczy również sposobu leczenia chorób i zakażeń, które opisano powyżej, przez podanie pacjentom potrzebującym takiego leczenia terapeutycznie skutecznej ilości związku o wzorze 1 lub, o ile jest korzystne, jego fizjologicznie dopuszczalnej soli.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek. Wszystkie temperatury są w stopniach Celsjusza. EDTA oznacza kwas etylenodiaminotetraoctowy, DTA oznacza 1,4-ditioerytryt, UDP oznacza fosforan urydynowy, a tris oznacza tris/hydroksymetylo/aminometan.

Przykład 1.6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-2,3-di-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfono-a-Dglukopiranoza.

2,03 mg UDP-2-dezoksy-3-0[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranozy i 1,42 mg 2,3-di-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfonoσ-D-glukopiranozy, obu w postaci soli tris, rozpuszcza się w 10 mM tris-buforze, o wartości pH = 7; z 0,2 mM EDTA i 0,2 mM DTE i inkubuje się z 60μΐ ekstraktu enzymatycznego w 30°.

Ekstrakt enzymatyczny otrzymuje się następująco. E.coli JB 1104 hoduje się w L-bulionie (hodowla wstępna+10//g ampioiliny/ml w 30°C przez noc; główna hodowla w 30°C w inkubatorze z mieszaniem, wychodząc z ODssonm = 0,1 do ODssonm = 1/. Komórki zbiera się przez wirowanie w 10,800 g (10 min/4°), otrzymaną masę bakteryjną w formie palet zawiesza się w 10 mM tris-buforze, przy pH = 7,0, dodaje się 0,2 XmN MEDTA i 0,2 mM DTE i ponownie wiruje się (6000 g, 10min/4°). Masę w formie palet zawiesza się ponownie w powyższym buforze i rozdrabnia ultradźwiękowo (5X20 sekund/30 sekund przerwy przy 120 watach). Fragmenty komórek oddziela się przez wirowanie (12000 g, 10 min/4°) i roztwór poddaje się ultra wirowaniu (150 000 g, 90 min/7°). Górne 2/3 supernatantu odzyskuje się. Frakcję tę poddaje się frakcyjnemu strącaniu siarczanem amonu. Stosuje się około 10-40% siarczan amonu. Otrzymaną masę bakteryjną w formie palet zawiesza się w powyższym buforze.

Po zakończeniu reakcji (co sprawdza się chromatografią cienkowarstwową) zakwasza się roztwór do pH = 2 kwasem cytrynowym i wiruje. Masę w formie palet zawiesza się w mieszaninie chloroform/metanol/kwas octowy/woda /65/15/5/2) i chromatografuje na żelu krzemionkowym stosując ten sam eluent. Frakcje zawierające produkt zbiera się razem i odparowuje do momentu zniknięcia rozpuszczalnika organicznego, po czym pozostałość liofilizuje się. Liofilizat rozpuszcza się w mieszaninie tetrahydrofuran/woda/8/2/ i w tym roztworze przekształca się w sól tris na wymieniaczu kationów w postaci tris. Tetrahydrofuran odparowuje się i pozostałość poddaje się liofilizacji. Wszystkie wartości Rf oznacza się na płytkach z żelu krzemionkowego. Rf (w mieszaninie chloroform/metanol/kwas octowy/woda 65/25/5/5) = 0,48.

Przykładu. 6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-2-dezoksy-3-0-[/S/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/S/-3hydroksytetradekanoiloamido]-1 -O-fosfono-a-D-glukopiranoza.

części objętościowych 5mM roztworu 2-<łezoksy-3-0-[/S/-3-hydroksytetradekanoilo]-2[/S/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranozy w 10 mM tris/HCl-buforu (pH = 7) z 0,2 mM EDTA; 0,2 mM DTE, 20 części 5 mM roztworu UDP-2-dezoksy-3-0-[/R/-38

151 036 hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranozy w tym samym buforze i 20 części 100 mM tris/HCl-buforu (pH = 7) z 2 mM EDTA, 0,2 mM DTE poddaje się reakcji z 40 częściami preparatu enzymatycznego (przygotowanego jak w przykładzie I) w 10 mM tris/HCl-buforu (pH — 7) z 2 mM EDTA, 2 mM DTE i 0,1% Tritton Χ-100 w 30° w ciągu 8 godz., przy czym końcowe stężenie Tritonu Χ-100 nastawia się na 0,1%.

Mieszaninę reakcyjną liofilizuje się, rozpuszcza w około 1/3 początkowej objętości w eluencie do następnej chromatografii dla rozdzielenia według ciężaru cząsteczkowego (Sephadex LH 20) (eluent: pirydyna/kwas octowy/woda 98/1/1) i filtruje. Objętość kolumny jest około 20 razy większa niż objętość próbki. Zbiera się frakcje z czystym produktem, zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem, zawiesza w wodzie wolnej od pirogenów i liofilizuje. Po liofilizacji usuwa się Triton Χ-100 za pomocą ługowania na ciepło eterem dietylowym. Po dalszym wirowaniu masę w formie palet rozpuszcza się w mieszaninie chloroform/metanol (1/1), filtruje i usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Dla otrzymania soli z mono-L-lizyną, dodaje się obliczoną stechiometryczną ilość L-lizyny (wolna zasada) w formie wodnego 100 mM roztworu do wodnej zawiesiny pozostałości, a następnie mieszaninę ponownie się liofilizuje. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 65/25/5/5/ = 0,44.

Przykład III.6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfono-2-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranoza.

części objętościowych 5 mM roztworu 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetrądekanoilo]-l-0fosfono-a-2-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranozy w 10 mM tris/HCl-buforu (pH = 7) z 0,2 mM EDTA i 0,2 mM DTE, 20 części 5 mM roztworu UDP-2-dezoksy-30-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranozy w tym samy buforze i 20 części 100 mM tris/HCl-buforu (pH = 7) z 2 mM EDTA i 0,2 mM DTE poddaje się reakcji z 40 częściami ekstraktu enzymatycznego (przygotowanego jak w przykładzie I) w 10 mM tris/HCl-buforu (ph = 7) z 2 mM EDTA, 2 mM DTE i 0,1% Tritonu Χ-100 w 30° w ciągu 48 godzin, przy czym końcowe stężenie Tritonu Χ-100 nastawia się na 0,1%. Mieszaninę liofilizuje się, traktuje się pirydynę i filtruje się, przesącz zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografuje się na żelu krzemionkowym przy użyciu jako eluentu mieszaniny chloroform/metanol/woda/bromek 2-fenetylopikoloniowy 800/175/22,5/2,5. Frakcje z czystym produktem zbiera się, a bromek 2-fenetylopikoloniowy, służący jako czynnik tworzący pary jonów, usuwa się przez wytrząsanie z 20 mM H3PO4 w wodzie. Zatęża się fazę organiczną pod zmniejszonym cieśnieniem i w celu uzyskania soli z mono-L-lizyną dodaje się obliczoną stechiometryczną ilość L-lizyny (wolna zasada) i mieszaninę liofilizuje się. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 65/25/5/5) = 0,53.

W sposób analogiczny jak w przykładach I-III otrzymuje się następujące związki o wzorze 1, przy czym, w zależności od zastosowanych związków o wzorze 2 i 3, dobiera się ilości enzymów tak, że reakcja przebiega korzystnie w ciągu około 24-48 godzin.

Tabela 1

R1 = R2 = R3 = R4 = /R/-3-hydroksytetradekanoil

Przykład	w	Z	Y	X	Rf
IV	0	NH	NH	NH	0,45
V	NH	NH	NH	NH	0,40
VI	0	0	0	NH	0,49
VII	0	NH	NH	0	0,39
VIII	NH	NH	0	NH	0,41
IX	0	0	0	0	0,48

Przykład X. 6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/5-D-glukopiranozylo]-2-dezoksy-l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-2-tetradekanoiloamido-or-D-glikopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładów I-III. Rf /chloroform/metanol/kwas octowy/woda 65/25/5/5/ = 0,50.

151 036

Przykład XI.6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-2-acetamido-2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-1 -0-fosfono-ćr- D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładów I-III. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 65/25/5/5) = 0,32.

Przykład XII. 6-0-[2-dezoksy-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-l-O-fosfono-a-D-glukopiranoza.

mg 6-0-[2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-/3-D-glukopiranozylo]-2,3-di-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfono-cr-D-glikopiranoży rozpuszcza się w mieszanienie chloroform/metanol (1/1/, poddaje się reakcji z 25% wodnym roztworem amoniaku (1/3 objętości) i pozostawia na noc. Po zakończeniu reakcji mieszaninę odparowuje się do suchości, pozostałość rozciera się eterem dietylowym w celu usunięcia odszczepionych kwasów tłuszczowych, osad odsącza się i przemywa eterem. Pozostałość rozpuszcza się w wodzie i wytwarza się sól di-tris przez dodanie obliczonej ilości tris. Produkt liofilizuje się. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 25/15/2/4) = 0,45.

Przykład XIII.2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-1 -O-fosfono-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-2-dezoksy-1 -O-dibenzylofosfono-a-D-glukopiranoza.

Do roztworu 3,9 g 4,6-0-benzylideno-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-2-dezoksy1-0-dibenzylofosfono-a-D-glukopiranozy, 2g kwasu /R/-3-benzyloksy tridekanokarboksylowego-1 i 50 mg 4-dimetyloaminopirydyny w 20 ml chlorku metylenu, ochłodzonego do -10° dodaje się 2g dicykloheksylokarbodiimidu i mieszaninę reakcyjną utrzymuje się w 4° przez noc. Następnie mieszaninę odsącza się, przesącz odparowuje do suchości, pozostałość rozpuszcza w małej ilości mieszaniny toluen/octan etylu (8/2) i chromatografuje się tym samym rozpuszczalnikiem. Temperatura topnienia 96-98°. [a]²°D —+33,3° (c = 1, chloroform). Rf (toluen/octan etylu 2/1) = 0,5.

b) 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]1 -O-fosfono-a-D-glukopiranoza.

4,2 g 4,6-0-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-2-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-a-D-glukopiranozy rozpuszcza się w 900 ml mieszaniny tetrahydrofuran/woda (85/15) i uwodarnia się z 1,5 g 10% palladu na węglu drzewnym w ciągu 2 godzin pod ciśnieniem 10· 10⁵ Pa i w 40°, katalizator odsącza się, tetrahydrofuran odparowuje się, a wodną zawiesinę liofilizuje się.

[cr]^2OD = +28,5° (c = 0, chloroform + 1 kropla metanolu).

Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20) = 0,56.

Dalsze oczyszczanie można prowadzić następująco. 10 g 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranozy i 1,7 g tris w 150 ml metanolu poddaje się działaniu ultradźwięków w kąpieli sonikatorowej w ciągu 10 min. w 45°. Zawiesinę wiruje się i przezroczysty supernatant dekantuje się znad palety. Do tego roztworu dodaje się 1,7 g tris (rozpuszczonego w 20 ml metanolu), roztwór zaszczepia się i pozwala się na wystąpienie krystalizacji w temperaturze pokojowej. Otrzymuje się sól di-tris związku tytułowego.

Ług macierzysty odparowuje się do suchości. Pozostałość i paletę rozpuszcza się razem w mieszaninie 300 ml chloroform, 600 ml metanolu i 240 ml wody (wolnej od pirogenów). Dodaje się dalsze 300 ml chloroformu i 300 ml 0,lN kwasu solnego, ostrożnie miesza się i pozostawia się do rozdzielenia faz. Oddziela się fazę chloroformową i odparowuje do suchości. Pozostałość stanowi zanieczyszczoną 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranozę. Otrzymany produkt traktuje się ultradźwiękowo z tris i metanolem, jak opisano powyżej i wiruje się. Roztwór chromatografuje się na kolumnie Sephadex LH20 z metanolem jako eluentem. Frakcje z produktem odparowuje się do suchości. Otrzymuje się sól mono-tris związku tytułowego.

5,1 g tego produktu rozpuszcza się w 45° w 40 ml metanolu w kąpieli sonikatorowej, dodaje się roztwór 0,74 tris w 10 ml metanolu, roztwór zaszczepia się i pozostawia do krystalizacji najpierw w tempeaturze pokojowej, potem w 4°. Otrzymuje się dalsze ilości krystalicznych soli di-tris związku tytułowego. Pozostałość z ługu macierzystego i paletę z wirowania można poddać następnemu

151 036 cyklowi oczyszczania. Temperatura topnienia: 183-185° (z rozkładem [α]²% =+ 15° (c=l w wodzie)

Przykład XIV. 3-dezoksy-2-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-3-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-cr-D-glukopiranoza. '

a) 2-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-3-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-3-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-4,6-0-izopropylideno-a-D-glukopiranoza.

Do roztworu 4,85 mg 2-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-3-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-3-dezoksy-4,6-0-izoprpylideno-D-glukopiranozy w 40 ml bezwodnego tetrahydrofuranu, ochłodzonego do -70° dodaje się 8 ml 1,6 M butylolitu w heksanie. Po 5 min. dodaje się roztwór 3,8 g chlorku dibenzylofosforowego w 10 ml benzenu, w tej samej temperaturze. Miesza się dalsze 10 min. w -70°, dodaje się 0,3 ml kwasu octowego i roztwór zatęża się do 1/4 początkowej objętości. Roztwór rozcieńcza się 200 ml chlorku metylenu, ekstrahuje 50 ml wody, 50 ml rozcieńczonego roztworu kwaśnego węglanu sodu i 50 ml roztworu chlorku sodu, suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje do suchości. Pozostałość chromatografuje się (toluen/octan etylu 7/3!.

Rf (toluen/octan etylu 2/1) = 0,58.

b) 3-dezoksy-2-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-3-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]I-O-fosfono-a-D-glikopiranoza. Roztwór 980 mg 2-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-3-[/R/-3benzyloksytetradekanoiloamido]-3-dezoksy-l-0-dibenzylofosfono-4,6-0-izopropylideno-a-Dglukopiranozy w 100 ml tetrahydrofuranu uwodornia się około 1 godz bl-D-glukopiranozy z 300 mg 10% palladu na węglu drzewnym, pod atmosferycznym ciśnieniem. Następnie odsącza się katalizator, dodaje wodę (10 ml) i Dewox AG50WX8H⁺ i całość miesza się w temperaturze pokojowej do całkowitego odszczepienia grupy izopropylidenowej. Wymieniacz jonowy odsącza się, roztwór zobojętnia się tris i odparowuje się tetrahydrofuran i wodę pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu i chromatografuje się na Sephadex LH20. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 25/75/10/20) — 0,65.

a) 4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-1 -O-dibenzylofosfono-cr-Dglukopiranoza.

Do roztworu 1 g 4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-D-glukopiranozy w 10 ml suchego tetrahydrofuranu, ochłodzonego do -70° wkrapla się 0,9 ml 1,6 M butylolitu w heksanie. Po 5 min. w tej temperaturze wkrapla się roztwór 420 mg chlorku dibenzylofosforowego w 4 ml benzenu. Miesza się dalej 10 min. w -70°, roztwór zobojętnia się kwasem octowym i odparowuje do suchości. Pozostałość chromatografuje się (żel krzemionkowy, heksan/toluen/octan etylu 4/4/1). Rf (toluen/octan etylu 6/1) = 0,65

b) 2,3-di-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-1 -O-fosfono-cr-D-glikopiranoza.

230 mg 4,6-0-benzylideno-2,3-di-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-l-0-dibenzylofosfonoσ-D-glukopiranozy rozpuszcza się w mieszaninie tetrahydrofuran/woda (9/1) i uwodornia w ciągu około 5 godz. pod atmosferycznym ciśnieniem z 80 mg 10% palladu na węglu drzewnym. Katalizator odsącza się, roztwór zobojętnia tris i odparowuje się do suchości. Pozostałość chromatografuje się metanolem na Sephadex LH 20. Rf (chlorform/metanol/kwas octowy/woda (25/75/10/20) = 0,65.

Przykład XVI.2-dezoksy-3-0-[/S/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-/S/-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzylideno-3-0-[/S/-3-benzyloksytetradekanoilo]-2-[/S/-3-benzyloksytetradekanoiloamido]-2-dezoksy-1 -O-dibenzylofosfono-cr-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIa). Rf (toluen/octan etylu 4/1) = 0,44

b) 2-dezoksy-3-0-[/S/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/S/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/S/3hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIb). Temperatura topnienia: 150-200° (z rozkładem). Rf (chlorek metylenu/metanol/amoniak 1/1/1; niższa faza) = 0,5.

Przykład XVIII.2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfono-2-]/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamido]-cr-D-glikopiranoza.

151 036 11

a) 4,6-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo]-2-dezoksy-1 -O-dibenzylofosfono— 2[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamido]-a-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIa). Temperatura topnienia: 82-95° [α]²⁰οι =+24,1° (c= 1, chloroform). Rf (toluen/octan etylu 2/1) = 0,7

b) 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-1 -0-fosfono-2- [/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoiloamido]—ff-D-glikopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu XXIb. [α]²% =+14,3° (c=l, tetrahydrofuran/pirydyna). Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 80/25/5/5/= 0,35

Przykład XVIII.2-dezoksy- l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-2-tetradekanoiloamido-a-Dglukopiranoza.

a) 4,6-0-benzyliden-2-dezoksy-1 -O-dibenzylofosfono-3-0-tetradekanoilo-2-tetradekanoiloamido-a-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu XIIIa) stosując kwas tetrakaprynowy i jako eluent toluen/octan etylu 4/1. Temperatura topnienia: 123-129°. Rf (toluen/octan etylu 2/1) = 0,6.

b) 2-dezoksy-l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-2-tetradekanoiloamido-a-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do przykładu XXIb. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20 = 0,65.

Przykład XIX.2-dezoksy-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-3-0-[/R/3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzylideno-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido] -2-dezoksy-1 -0-dibenzylofosfono-3-0- [/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-a-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIa), stosując kwas /R/-3tetradekanoiloksytridekanokarboksylowy-1 i jako rozpuszczalnik mieszaninę toluen/octan etylu 4/1. Temperatura topnienia 89-90°C,[cr]^2OD — +30,9° (c= 1, chloroform/metanol 1/1). Rf (toluen/octan etylu 4/1) = 0,5.

b) 2-dezoksy-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-3-0-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-a-D-glikopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XXIb. Liofilizat rozpuszcza się w metanolu i chromatografuje na Sephadex LH20 stosując ten sam rozpuszczalnik. RF (chloroform/metanol/kwas octowy/woda. 80/25/5/5) = 0,32

Przykład XX.2-dezoksy-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzylideno-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido] -2-dezoksy-1 -0-dibenzylofosfono-3-0-tetradekanoilo-ff-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIa), stosując kwas tridekanokarboksylowy-1; jako rozpuszczalnik mieszaninę toluen/octan etylu (3/1). Temperatura topnienia: 125,5-126,5°C. Rf (toluen/octan etylu 3/2) = 0,6.

b) 2-dezoksy-2-[/R/-3-hydroksytetradekanoiloamido]- l-0-fosfono-3-0-tetradekanoilo-a-Dglukopiranoza.

354 mg 4,6-0-benzylideno-2-[/R/-3-benzyloksytetradekanoiloamido] -2-dezoksy-1 -0-dibenzylofosfono-3-0- [/R/-3-tetradekanoilo]-cr-D-glukopiranozy rozpuszcza się w 30 ml mieszaniny tetrahydrofuran/woda (9/1) i uwodornia się z 20 mg palladu na węglu drzewnym w ciągu 10 godz pod atmosferycznym ciśnieniem. Katalizator odsącza się, a roztwór doprowadza się do pH = 7,5 za pomocą tris/hydroksymetylo/aminometanu. Odparowuje się tetrahydrofuran pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizuje się wodny roztwór. Liofilizat rozciera się na proszek dwukrotnie eterem i suszy. Rf (chloroformy9metanol/kwas octowy/woda. 125/75/10/20) = 0,6.

Przykład XXI.2-acetamido-2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-l-0-fosfonoa— D-glukopiranoza.

a) 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo] -2-dezoksy-1 -0-dibenzylofosfono-a-D-glukopiranoza.

Roztwór 3,55 g 2-acetamido-4,6-0-benzylideno- 2-dezoksy-1-O-dibenzylofosfono-a-D-glukopiranozy i 2,1 g kwasu /R/-3-benzyloksytridekanokarboksylowego-l w 15 ml chlorku metanolu

151 036 ochładza się do 0° i dodaje się 1,32 g dicykloheksylokarbodiimidu i p-dimetyloaminopirydynę. Po 2 godz. w tej temperaturze reakcja jest zakończona. Mieszaninę odsącza się, odparowuje do suchości i chromatografuje na żelu krzemionkowym najpierw mieszaninę chlorek metylenu/metanol (50/1) a następnie mieszaninę toluen/octan etylu (2/1). Rf (chloroform/metanol 20/1) = 0,7.

b) 2-acetamido-2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-1 -0-fosfono-cr-D-glukopiranoza.

2,08 g 2-acetamido-4,6-0-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo] -2-dezoksy-l-0dibenzylofosfono-cr-D-glukopiranozy rozpuszcza się w mieszaninie tetrahydrofuran/woda (9/1) i uwodornia się 3 godz z lg 10% palladu na węglu drzewnym pod atmosferycznym ciśnieniem. Katalizator odsącza się i przesącz najpierw odparowuje się do suchości, a następnie liofilizuje się. Liofilizat rozpuszcza się w metanolu, zobojętnia tris/hydroksymetylo/aminometanem i chromatografuje metanolem na Sephadex LH 20. [a]²⁰D = +43,3° (c = 1, metanol). Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 125/75/10/20) = 0,4.

Przykład XXII. l-0-fosfono-2,3-di-0-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzyliden-1 -0-dibenzylofosfono-2,3-di-0-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]σ-D-glukopiranoza.

Związek tytułowy otrzymuje się analogicznie do przykładu XVa), przy oczyszczaniu chromatograficznym na żelu krzemionkowym stosując eter/heksan (1/1) jako eluent. Rf (eter/heksan 1/1) = 0,5.

b) l-0-fosfono-2,3-di-0-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-«-D-glukopiranoza.

470 mg4,6-0-benzylideno-l-0-dibenzylofosfono-2,3-di-0-[/R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilo]-cr-D-glukopiranozy rozpuszcza się w 47 ml tetrahydrofuranu i uwodornia się 1 godz. z 230 mg palladu na węglu drzewnym pod atmosferycznym ciśnieniem, Katalizator odsącza się, przesącz zatęża do suchości i pozostałość chromatografuje się na żelu krzemionkowym (chloroform/metanol/woda/trietyloamina 15/10/2/0,2). Frakcje z produktem zbiera się i odparowuje do suchości. Związek tytułowy otrzymuje się w postaci soli di-trietyloaminowej. Rf (chloroform/metanol/kwas octowy/woda 80/25/5/5) = 0,5.

Przykład XXIII. 2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/S/-3-hydroksytetradekanoiloamido]-l-0-fosfono-a-D-glukopiranoza.

a) 4,6-0-benzylideno-3-0-[/R/-3-benzyloksytetradekanoilo] -2-[/S/-3-benzyloksytetradekanoiloamidoj-dezoksy-1 -O-dibenzylofosfono-cr-D-glukopiranoza.

Związek ten otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIa). Rf (toluen/octan etylu 4/1) = 0,44

2-dezoksy-3-0-[/R/-3-hydroksytetradekanoilo]-2-[/S/ -3-hydroksy tetradekanoiloamido]-1 -0fosfono-a-D-glukopiranoza.

Związek ten otrzymuje się analogicznie do przykładu XIIIb). Rf (chlorek metylenu/metano1/amoniak 1/1/1, niższa faza) = 0,5

W celu dalszego sprecyzowania związków stosowano spektroskopię masową opartą na bombardowaniu prędkimi atomami (Fast Atomie Bombardmeht - FAB) (mod ujemny) - (Raetz, J.Biol.Chem. 259/4852(1984).

Tabela 2

151 036 Tabela 3

Przykład nr	Widma NMR
1	2
I (C₅DsN)	9.82 (d, 9Hz, 1H); 6.65 (dd, 8,8 u. 3,5 Hz, 1H); 6.25 (t, 10 Hz, 1H); 5.83 (t, 10 Hz, 1H); 5.63
XIII (CD₃OD)	(d, 8,8 Hz, 1H); 5.35 (dd, 10 u. 2,5 Hz, 1H); 4.0 (t, 10 Hz, 1H); 3.83 (m, 1H). 5.49 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.24 (dd, 9,5 u, 10.5 Hz, 1H); 4,17 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.0 (m, 3H); 3.90 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.75 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.71 (s, Tris); 3,63 (t, 10 Hz, 1H).
XIV (CDCI3/CD3OD)	5.77 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.38 (dd, 9,5 u. 10,5 Hz); 3,8 bis 4.1 (m, 4H); 3.73 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H);
XV (CD3OD)	3.53 (t, 10 Hz, 1H). 5.71 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.48 (t, 10 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2,4 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.05 (m, 3H); 3.86 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.7 (dd, 5.5 u.
XVI (CDC13/CD3OD)	12 Hz, 1H); 3.67 (s, Tris); 3.58 (t, 10 Hz, 1H). 5.58 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 4.19 (dt, 3 u. 10 Hz, 1H); 3.8 bis 4.1 (m, 4H); 3.7 (s, Tris dd, 1H); 3.46 (t, 10 Hz, 1H);.
XVII (CDCU/CD3OD)	5.46 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 5.17 (m, 1H); 4.19 (dt, 3 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 3H); 3.7 (s, Tris); 3.65 (dd, 1H); 3.51
XVII(etap a) (zabezpieczony) (CDCls)	(t, 10 Hz, 1H). 7.38 (m, 15H); 5.70 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.63 (d, 9,5 Hz, 1H); 5.50 (s, 1H); 5.26 (t, 10 Hz, 1H); 5.08 (m, 4H); 4.38 (m, 1H); 4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.73 (t, 10 Hz, 1H);
XIX (etap a) (zabezpieczony) (CDCls)	3.69 (t, 10 Hz, 1H); 2.29 (m, 2H); 1.89 (m, 2H). 7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.34 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.29 (t, 10 Hz, 1H); 5.14 (ąuintett, 6 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.51 u. 4.41 (AB, 12 Hz, 2H); 4.41 (m, 1H);
XX (etap a) (zabezpieczony) (CDCla)	4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3,7 (m, 3H); 2.58 u. 2.47 (ΑΒΧ, 5,5, 7,5 u. 15,5 Hz, 2H) 7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.29 (d, 9 Hz, 1H); 5.74 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.30 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.52 u. 4.42 (AB, 11 Hz, 2H); 4.44 (m, 1H) 4.03 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.94 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.15 bis 2.35 (m, 4H).
XXI (etap a) (zabezpieczony) (CDOD)	5.47 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.23 (dd, 9.5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.18 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 3.90 (m, 3H); 3.85 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.72 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.68 (s, Tris); 3.61 (t, 10 Hz, 1H); 1.94 (s, 3H).

1	2
XXII (etap a)	7.3 bis 7.45 (m, 15H); 5.92 (dd, 3,5 u. 6,7 Hz,
(zabezpieczony)	1H); 5.60 (t, 9,5 u. 10 Hz, 1H); 5.48 (s, 1H);
(CDCla)	5.02 (bis 5.22 (m, 6H); 4.95 (ddd, 2,5, 3,5 u. 9,5 Hz, 1H); 4.10 (dd, 4,5 u. 10Hz, 1H); 3.96 (ddd, 5,9 u. 10 Hz, 1H); 3.67 (t, 9,5 Hz, 2H); 2.60 (m, 2H); 2.38 (d, 6,5 Hz, 2H); 2.24 (t, 7,5 Hz, 2H); 2.12 (t, 7,5 Hz, 2H).
XXIII (etap a)	7.2 bis 7.42 (m, 25H); 6.49 (d, 9 Hz, 1H);
(zabezpieczony)	5.77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.45 (s, 1H);
(CDCU)	5.35 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.54 u. 4.40 (AB, 11 Hz, 2H); 4.47 u. 4.36 (AB, 11Hz, 2H); 4.45 (m, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 2H); 3.6 bis 3.8 (m, 4H); 2.58 (dd, 6,5 u. 15,5 Hz, 1H); 2.34 (dd, 6 u. 15,5 Hz, 1H) 2.2 (m, 2H);

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1.Sposób wytwarzania nowych sacharydów o wzorze 1, w którym Ri, R2, R3 i R4 niezależnie oznaczają atom wodoru lub ewentualnie podstawioną grupę acylową, a W, X, Y i Z niezależnie oznaczają atom tlenu lub grupę iminową, pod warunkiem, że

b) gdy Z i X oznaczają grupę iminową, a W i Y oznaczają atom tlenu, wtedy α/Ri i R2 są różne od, w obu przypadkach, grupy /R/-3-hydroksytetradekanoilowej, o ile albo R3 i R4 są identyczne i oznaczają grupę /R/-3-hydroksytetradekanoilową albo R4 oznacza grupę /R/-3-dodekanoiloksytetradekanoilową, a R3 oznacza grupę /R/-3-tetradekanoiloksytetradekanoilową, /5/R2 jest różne od atomu wodoru lub grupy /R/-3-hydroksytetradekanoilowej, o ile R1 i R3 oznaczają atom wodoru i R4 oznacza grupę /R/-3-hydroksytetradekanoilową oraz y/R3 jest różne od grupy -/CO/2-CH2-/CHOH/4-CH2OH, o ile inne podstawniki oznaczają atom wodoru, w postaci wolnej lub ewentualnie w postaci kwaśnej soli addycyjnej, znamienny tym, że związek o wzorze 2, w którym W i Z mają wyżej podane znaczenie, R3 i R4 mają wyżej podane znaczenie dla R3 i R4 z wyjątkiem atomu wodoru, a U oznacza urydynę, poddaje się enzymatycznej kondensacji ze związkiem o wzorze 3, w którym X i Y mają wyżej podane znaczenie, a Ri i R2 mają wyżej podane znaczenie dla R1 i R2, pod warunkiem, że co najmniej jeden z dwóch podstawników oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową oraz, gdy X lub Y oznacza grupę iminową, wtedy podstawnik Ri lub R'2, przyłączony do grupy iminowej jest różny od wodoru oraz ewentaulnie hydrolizuje się otrzymany związek do odpowiedniego związku o wzorze 1, w którym, gdy X, Y, Z i/lub W oznaczają atom tlenu, wtedy R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru albo ewentualnie poddaje się otrzymany związek reakcji acyloamidazowej, przy czym otrzymuje się związek o wzorze 1, w którym X, Y, V, Z i/lub W oznaczają grupę iminową, wtedy R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru oraz wyodrębnia się otrzymany związek w postaci wolnej lub w postaci kwaśnej soli addycyjnej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze 1, w którym R-ι, R2, R3 i R4 niezależnie od siebie oznaczają atomy wodoru albo ewentualnie podstawioną grupę acylową, a W, X, Y i Z niezależnie od siebie oznaczają atom tlenu lub grupę iminową, z tym, że a) co najmniej jeden spośród R1, R2, R3 i R4 oznacza ewentualnie podstawioną grupę acylową, b) gdy Y i/lub W oznacza grupę iminową, R1 i/lub R3 mają znaczenie inne niż atom wodoru i c) gdy R1, R2, R3 i R4 oznaczają grupę acylową, albo R2 i R4 oznaczają grupę acylową, a R1 i R3 oznaczają atomy wodoru, X i Z oznaczają grupę iminową i Y oznacza atom tlenu, wówczas W ma znaczenie inne niż tlen, w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami, związek o wzorze 2, w którym W i Z mają znaczenie wyżej podane, R^zz3 i R^zz4 mają znaczenie podane wyżej dla R3 i R4 z wyjątkiem wodoru, a U oznacza grupę urydynową, poddaje się enzymatycznej kondensacji ze związkiem o wzorze 3, w którym X i Y mają znaczenie wyżej podane, a Ri i R₂ mają znaczenie podane wyżej dla R1 i R2 z wyjątkiem wodoru, i ewentualnie hydrolizuje się otrzymany związek do odpowiedniego związku o wzorze 1, w którym gdy X, Y, Z i/lub W oznaczają atom tlenu, wówczas R1, R2, R3 i/lub R4 oznaczają atom wodoru, albo otrzymany związek ewentualnie poddaje się reakcji acyloamidazowej, otrzymując związek o wzorze 1, w którym gdy X, Y, Z i/lub W oznacza grupę iminową, wówczas R1, R2, R3 i/lub R4 oznacza wodór, i uzyskany związek wyodrębnia się w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnej z kwasami.

WZÓR 1

WZÓR 2

WZÓR 3 r; r; WZÓR 3a

HO—ζ 0

OH

O NH r; r;

WZÓR 3b