WO1987000174A2 - 1-o-phosphono-saccharides, leur procede de production et d'utilisation - Google Patents

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WO1987000174A2
WO1987000174A2 PCT/EP1986/000366 EP8600366W WO8700174A2 WO 1987000174 A2 WO1987000174 A2 WO 1987000174A2 EP 8600366 W EP8600366 W EP 8600366W WO 8700174 A2 WO8700174 A2 WO 8700174A2
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hydrogen
group
formula
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hydroxytetradecanoyl
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PCT/EP1986/000366
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Ingolf Macher
Frank Michael Unger
Christian R. H. Raetz
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Sandoz-Erfindungen Verwaltungsgesellschaft M.B.H.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to saccharides, processes for their preparation, pharmaceutical preparations containing them and their use as pharmaceuticals.
  • the invention particularly relates to new saccharides of the formula
  • R ' 1 , R' 2 , R ' 3 and R' 4 are identical or different and each represent hydrogen or an optionally substituted acyl group and W, X, Y and Z are identical or different and each represent oxygen or the imino group , with the proviso that a) at least one of the substituents R ' 1 , R' 2 , R ' 3 and R' 4 represents an acyl group, and, b) when Z and X are imino, W and Y are oxygen, ⁇ ) R ' 1 and R' 2 do not simultaneously mean (R) -3-hydroxytetradecanoyl if R ' 3 and R' 4 are identical and for (R) -3-hydroxytetradecanoyl or R ' 4 for (R) -3-dodecan ⁇ yloxytetradecanoyl and R ' 3 for
  • R ' 2 is not hydrogen or (R) -3-hydroxytetradecanoyl is when R' 1 and R ' 3 are hydrogen and R' 3 are (R) -3-hydroxytetradecanoyl, and ⁇ ) R ' 3 not the - (CO) 2 .CH 2.
  • (CHOH) 4 .CH 2 OH group if the other substituents are hydrogen, in free form or in the form of their acid addition salts, process for their preparation and their use. According to the invention, the compounds of the formula are obtained
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are identical or different and each represent hydrogen or an optionally substituted acyl group, with the proviso that at least one of the substituents R 1 , R 2 , R 3 and R 4 represent an acyl group, in free form or in the form of their acid addition salts, by using a compound of the formula
  • W and Z have the above meaning, and have the same meaning as R 3 and R 4 except hydrogen and U represents uridine, with a compound of the formula
  • the enzymatic condensation is carried out, for example, in a buffered system, e.g. in the Tris buffer at pH 7, and at room temperature or elevated temperature, e.g. at 30 ° C.
  • the enzyme extract can be one from gram-negative bacteria, preferably from E. coli strains (Raetz, J. BioL Chem. 259/4852 [1984]) obtained preparation can be used. Strains are preferred which have been genetically manipulated to overproduce the desired enzyme.
  • the possibly subsequent sowing can be carried out according to methods known from the literature, the acylamidase reaction analogously to that of C.R. Verret et. al. in J. Biol. Chem. 257/10222 (1982).
  • the end products can be isolated from the reaction mixture and, if appropriate, purified by methods known per se.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same or different, preferably the same, and are hydrogen or an acyl group having, for example, 4 to 20, preferably 12 to 16 and in particular 14 carbon atoms, which are in the 3-position by OH, acetoxy or an acyloxy group as defined above may be substituted, the C-3 atom being R or S-configured.
  • R 1 , F 2 , R 3 and R 4 can therefore be in achiral form, in R, S or racemic form. this applies also for the compounds of the formulas II, III and IV.
  • the configuration remains unchanged during the course of the reaction, ie, starting from R- or S- or racemic starting products, the corresponding R- or S or raceric end compounds.
  • Preferred compounds of the formula Ia are those in which R 1 , R 2 , R 3 and R 4 represent an optionally substituted acyl group.
  • Compounds of the formula Ia are further preferred, in which, when R 1 , R 2 , R 3 and / or R 4 are hydrogen, Y, X, W and / or Z is oxygen.
  • the compounds of the formula Ia are preferably obtained as acid addition salts, hydrophilic basic compounds, for example tris (hydroxymethyl) aminomethane or L-lysine, preferably being used as the counterion to increase the water solubility.
  • the compounds of formula II can be prepared from the compounds of formula III by reaction with activated uridine 5'-monophosphate according to methods known per se.
  • R " 1 and R" 2 have the above meaning and either X 'and Y' are oxygen or Y 'is the imino group and X' is oxygen, in compounds of the formula
  • R " 1 , R" 2 , X 'and Y' have the above meaning and R represents a protective group which converts the unprotected OH group to a protected phosphate ester or
  • Process a) can be carried out, for example, by reacting a compound of formula IV in a solvent which is inert under the reaction conditions, e.g. in a cyclic ether, such as tetrahydrofuran, and at low temperature, e.g. at -70 ° C, with butyllithium in an aliphatic hydrocarbon, e.g. in hexane, and then dibenzyl phosphorochloridate is added.
  • the product can be isolated from the reaction mixture by known methods and, if necessary, purified.
  • the free OH groups of the phosphate residue are protected, e.g. through benzyl.
  • the protecting groups can be split off by known methods. For example, a protective group is split off as usual, e.g. with an aqueous acid (ion exchanger), or hydrogenolytically.
  • Process b) can be carried out, for example, by reacting a compound of the formula IIIc in a solvent which is inert under the reaction conditions, e.g. B. in a halogenated hydrocarbon, such as methylene chloride, together with the acylating agent, optionally with the addition of dicyclohexylcarbodiimide and 4-dimethylaminopyridine, dissolves and at low temperature, for. B. at about 4 ° C, can react.
  • the reaction product can be isolated from the reaction mixture and, if appropriate, purified by methods known per se.
  • the existing protective groups are then split off in a known manner.
  • the protective groups which are generally customary in saccharide chemistry can be used as protective groups. For example, both R together can mean the benzylidene or the isopropylidene group.
  • Known protective groups can also be used as protective groups of the phosphate residue, for example. the benzyl group.
  • the starting compounds of the formula IV can be obtained according to the following reaction schemes, it being possible for OH groups which do not take part in the respective reaction to be protected, if appropriate.
  • the further starting products are known or can be prepared by known methods or analogously to known methods or analogously as described in the examples.
  • the compounds of the formulas Ia and III show an influence on the non-specific antimicrobial resistance. This effect can be demonstrated using the following test methods, for example:
  • Endotoxin catalyzes the activation of a proenzyme in Limulus amebocyte lysate.
  • the elimination of p-nitroaniline from a colorless substrate is measured.
  • the extent of this cleavage is recorded photometrically, the correlation between absorption and endotoxin concentration (or activity in analogs) being linear in the range from 0.01 0.1 ng / ml endotoxin (comparison with the absorption values of a standard endotoxin).
  • a 1:10 dilution series is prepared from each sample (dissolved in pyrogen-free Aqua bidestillata sterilis). An empty sample is also carried along with each series of determinations.
  • the test detects the generation of an endotoxin shock or a clinically similar condition with a lethal outcome by LPS-like substances in galactosamine (GalN) sensitized mice.
  • Mice (6 animals per group) receive simultaneously ip 8 mg GalN, dissolved in 0.5 ml PBS, and 0.1 ⁇ g LPS from Salmonella abortus equi (Sigma), dissolved in 0.2 ml physiological saline. This treatment leads to the death of all animals within 6-12 hours (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 (1979) 5939-5943).
  • Test substances in various doses administered simultaneously with GalN or even before or after GalN treatment once parenterally or orally.
  • the evaluation of the result is based on a comparison of the lowest dose that results of all animals of a group to death, or by calculation of an LD 5 0 using the Spearman-Karber method.
  • This model allows the testing of a substance-related defense increase in microbially infected, new tropical mice.
  • 20 female B 6 D 2 F 1 mice each receive 1 x 200 mg / kg body weight of cyclophosphamide in 0.2 ml of distilled water. dissolved, administered sc on day 0. On day 3, if possible, the test substance is administered in physiological NaCl solution, but otherwise dissolved in another way (0.3 ml) parenterally (primarily ip) or even orally.
  • the compounds of the formulas Ia and III showed parenterally both in the experimental infections by gram-negative germs (e.g. Pseudomonas and E. coli) and in infections by gram-positive germs (e.g. Staph. Aureus) or yeasts (e.g. Candida albicans) Administration in terms of survival and survival rate significant improvements compared to the untreated infection control.
  • gram-negative germs e.g. Pseudomonas and E. coli
  • gram-positive germs e.g. Staph. Aureus
  • yeasts e.g. Candida albicans
  • Activation of human blood neutrophil oxidation metabolism Neutrophils (at least 95% purity) are incubated with the test substance in three different concentrations for 1 to 2 hours at 37 ° C. The Release of superoxide anions by the cells as an index for the activation is then measured as a superoxide dismutase-inhibitable reduction of cytochrome C. 1x10 6 neutrophils, pre-treated with test substance or not, are added to the cytochrome C (80 ⁇ mol), which contains formylmethionylleucylphenylalanine (10 -6 M). The controls also contain 50 ⁇ g of superoxide dismutase.
  • the reaction is stopped by placing the test tubes in an ice bath. They are then centrifuged rapidly at 400xg for 5 minutes to separate the cells. The reduction of cytochrome C, which is proportional to the amount of superoxide anion released, is measured photometrically at 550 nm.
  • the inhibitory effect of the test substances during PMN activation by LPS is measured as described, with the proviso that after the preincubation of the leukocytes, the cells continue to be incubated with a stimulating concentration of LPS.
  • the principle of the test is based on the fact that particles of the order of 200-250 ⁇ (e.g. cooling particles) can only be eliminated from the organism by phagocytosis by macrophages. In the case of intravenous administration of carbon particles, these are eliminated from the blood stream by phagocytosis of the macrophages in the liver (Kupffer's star cells) and spleen.
  • the RES activation of a substance is checked by single or repeated administration as an aqueous solution or as a suspension. The quantity of substance intended for the treatment is applied either in 4 daily single doses or ip or sc once 24 hours before the start of the test.
  • Ink suspension with a 10% gas black content is diluted with a 1% gelatin-NaCl solution to a content of 16 mg coal / ml.
  • Each mouse receives 0.2 ml / 20 g body weight administered intravenously. 3, 6, 9, 12 and 15 minutes after the intravenous administration, 25 ⁇ l of blood are drawn by puncturing the orbital plexus. The blood is distilled in 2 ml. Hemolyzed water. The coal concentration is determined photometrically. The animals are then sacrificed and the liver and spleen weights determined. 6.
  • Herpes infection of the mouse is diluted with a 1% gelatin-NaCl solution to a content of 16 mg coal / ml.
  • the model of intracutaneous herpes infection allows testing of a substance-related defense increase in mice infected with herpes viruses.
  • the course of the disease is prolonged and enables the observation of the sequential occurrence of several parameters.
  • Herpetic lesions appear at the site of infection, ulcerate them, the nearest leg is paralyzed and the paralysis continues until death.
  • Immune-competent hairless mice are infected intracutaneously on day 0 by intracutaneous administration of the respective inoculum in a volume of 0.025 ml (eg. 1x10 6 plaque-forming units herpes simplex type 1 / mouse).
  • the test substance is administered ip in solution, for example in physiological NaCl, (0.1 ml).
  • the model of systemic herpes infection allows testing of a substance-related defense increase in mice infected with herpes viruses.
  • Immune-competent NMRI mice are infected on day 0 by ip administration of the respective inoculum in a volume of 0.1 ml (for example 1.3x10 5 plaque-forming units herpes simplex type 1 / mouse).
  • the test substance is administered subcutaneously in solution, for example in physiological NaCl.
  • test animals are observed until the 20th day after infection and the lesions, paralyses and deaths that occur are recorded daily. In comparison to the infection control or the standard, the following parameters are evaluated: a) number of mice with lesions (cumulative) b) number of mice with paralysis (cumulative) c) average survival d) survival rate.
  • CSFs are mediators that are produced in the organism as a result of infections or toxins. Their biological functions are versatile, the evidence is provided by stimulating the proliferation of the hernopoietic system, especially the bone marrow cells.
  • B 6 D 2 F 1 mice are administered the test substances one or more times up to a dose of 50 mg / kg parenterally or orally. Serum is obtained from the test animals at variable intervals thereafter. The serum content of CSF activity is measured in a cell culture assay based on the proliferation rates of bone marrow cells from B 6 D 2 F 1 mice LD. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol.
  • Adherent macrophages are first obtained from mice, both resident and with thioglycolate "elicited macrophages". These are incubated in RPMI medium at various substance concentrations to be tested for 48 hours and the cell supernatants obtained. These supernatants are checked for thymocyte cultures of C 3 H / HeJ mice for IL-1 activity. If the supernatants of macrophages contain produced IL-1, the thymocytes are stimulated to proliferate during an incubation of 72 hours, which is measured by incorporating 3H-thymidine in the scintillation counter [J. Gery et.
  • mice were challenged at various times after the last treatment (1 day to 3 weeks) with an LPS challenge in a dose of 0.01 ⁇ g LPS + 8 mg galactosam in / mouse. subject. A higher percentage of animals survived this LPS exposure compared to the untreated challenge control, especially after three doses.
  • the compounds of the formulas Ia and III also have anti-inflammatory activity, in particular in the case of non-specific inflammations, in the case of immunologically induced inflammations, in the case of hypersensitively induced inflammations and in the case of allergic reactions.
  • This effect could be demonstrated by various test methods, for example by examining the influence of prostaglandin synthesis in vitro and in vivo.
  • the inhibition of LPS and zymosan-induced PGE 2 and PGF 1 ⁇ release was investigated in vitro. Thioglycolate-stimulated Peritoneal-M ⁇ from the NMRI mouse were incubated for 24 hours with LPS or test substance. After changing the medium and washing the cells three times, they were stimulated for 2 hours with LPS or 1 hour with Zymosan.
  • PCA procoagulant activity
  • the influence on the LPS-induced PCA of mouse peritoneal leukocytes could be shown as follows after pretreatment of the animals with test substance: BD 2 F 1 mice were treated on day 1, 2 and 3 with LPS or test substance, administered intraperitoneally. In addition, all animals received 1.5 ml of thioglycolate ip on day 3. Peritoneal M ⁇ were obtained on day 6, the sample of each animal was adjusted to 1 ⁇ 10 6 / ml cells and stimulated with LPS in DMEM medium without FCS for 24 hours. The PCA of these cells was determined as described above. Pretreatment with LPS or with test substance results in a significantly reduced PCA. A similar finding was found in preliminary experiments with rabbits. The PCA of peritoneal rabbit leukocytes after triggering the general Shwartzman reaction could be reduced by pretreatment with LPS or with test substance.
  • TNF tumor necrosis factor
  • L 929 cells are precultivated in microtiter plates to 3 ⁇ 10 4 cells / well / 100 ⁇ l overnight (37 ° C./5% CO 2 ), mixed with 100 ⁇ l of the respective sample and further diluted in series in 1: 2 steps. After the addition of 100 ⁇ l actinomycin D (8 ⁇ g / ml medium) in each well, the mixture is incubated for a further 18 hours at 37 ° C./5% CO 2 . After removing the supernatants, the remaining cell lawn is stained with Giemsa solution and the absorption at 620 nm is measured on the Titertek Multiskan Autoreader (Flow). One unit of TNF is defined as the activity which causes 50% lysis of the L 929 target cells. 2. B16F1 melanoma test:
  • B16F1 melanoma cells are grown in vitro for 5 days. One day before the experiment, the cells are synchronized with new medium by breaking up the monolayer into individual cells using EDTA trypsin and returning the total amount to the same bottle. The cells are counted and adjusted to 10 / ml medium. 0.1 ml of cell suspension (10 cells) are injected intravenously into the tail vein. The mice are sacrificed 21 days later and the number of tumors in the lungs is determined. B 6 D 2 F 1 mice are used for this test. The test substance is dissolved and injected intraperitoneally on days -6, -4 and -1.
  • the compounds of the formulas Ia and III can therefore be used as modulators of non-specific antimicrobial resistance, for systemically increasing the immune response and for increasing non-specific immunity.
  • Compounds of the formulas Ia and III are thus indicated, e.g. B. for the treatment or supportive treatment (ie together with other specific or supportive forms of therapy) of conditions with a reduced immune response, in particular with a reduced humoral immune response and / or reduced hypersensitivity reaction of the delayed type and for the treatment of conditions in which there is otherwise Modulation of the immune response is desirable.
  • compounds of the formulas Ia and III are indicated for the treatment or supportive treatment of disease states due to idiopathic immunodeficiencies or immunodeficiencies of the type which occur in geriatric patients or in patients with severe burns or generalized infections.
  • the compounds of the formulas Ia and III are also indicated for the treatment or supportive treatment of viral diseases (such as disseminated herpes, progressive Smallpox and disseminated varicella diseases) as well as Hodgkin's disease and other malignant tumors.
  • the compounds of formulas Ia and III are suitable for the prophylaxis of endotoxin shock, e.g. B for accidents, burns and surgery, as well as an anti-inflammatory agent.
  • the indicated parenteral dose is between about 0.1 mg and about 70 mg, administered once to achieve an adjuvant effect, e.g. B. with supportive treatment, or daily, in the latter case the dose is divided into 2 to 4 administrations per day or given in sustained release.
  • Indicated dose units for administration therefore contain between approximately 0.025 and approximately 35 mg of the formula Ia or III substance if administered daily, or up to 70 mg of the formula Ia or III substance if a single, adjuvant treatment is desired.
  • compounds of the formulas Ia and III are also suitable as adjuvants for vaccines.
  • an indicated dose between 0.5 and 100 mg, preferably approximately 70 mg, is administered on the day of vaccination with a possible repetition at the same dose 2 to 4 weeks later.
  • Pharmaceutical preparations containing the compounds of the formula Ia or III can be prepared according to standard pharmaceutical methods, e.g. B. by mixing with conventional, pharmaceutically acceptable diluents or carriers. Such preparations can be made, for example, in the form of injectable solutions and also form part of the invention.
  • the invention therefore also relates to a method for combating diseases and infections, as described above, by administering to the patient an effective amount of a compound of the formula Ia or III or a chemotherapeutically acceptable salt thereof, and to the compounds of the formula Ia or III for use as chemo therapeutic agents, in particular as immunomodulators, as antiviral agents and as anti-inflammatory agents.
  • EDTA means ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTE stands for 1,4-dithioerythritol
  • UDP for uridine phosphate
  • Tris for tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • Example 1 6-O- [2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyI] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoyIamido] -ß-D-glucopyranosyl] -2,3-di -O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • This enzyme extract can be obtained as follows:
  • the mixture is acidified to pH 2 with citric acid and centrifuged.
  • the pellet is taken up in chloroform / methanol / acetic acid / water (65/15/5/2) and chromatographed on silica gel using the same eluent.
  • the fractions containing the product are collected and evaporated until there are no more organic solvents and the rest lyophilized.
  • the lyophilisate is dissolved in tetrahydrofuran / water (8/2) and in this via a cation exchanger in the Tris form Solvent is converted into the Tris salt, the tetrahydrofuran is spun off and the residue is lyophilized. All Rf values are determined on silica gel plates.
  • Example 2 6-O- (2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxyt8tradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -ß-D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3 -O - [(S) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(S) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono- ⁇ -dglucopyranose:
  • the volume of the column used is approximately 20 times the sample application volume.
  • the pure product fractions are collected, concentrated in vacuo, suspended in pyrogen-free water and lyophilized.
  • Triton X-100 is removed by digesting with diethyl ether. After centrifugation, the pellet is dissolved in a mixture of chloroform / methanol (1/1), filtered and the solvents removed in vacuo.
  • Example 3 6-O- [2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -ß-D-glucopyranosyl] -2-deoxy-3 -O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -1-O-phosphono-2 - [(R) -3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido] - ⁇ -D-glucopyranose:
  • the pure product fractions are collected and, by shaking with 20 mM H 3 PO 4 in H 2 O, the 2-phenethylpicolonium bromide serving as ion pair former is removed.
  • Example 10 6-O- [2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - ⁇ -D-glucopyranosyl] -2-deoxy-1 -O-phosphono-3-otetradecanoyl-2-tetradecanoylamido- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Bedding 11 6-O- [2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - ⁇ -D-glucopyranosyl] -2-acetamido-2 -deoxy-3-O ⁇
  • Example 12 6-O- [2-Deoxy-2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] - ⁇ -D-glucopyranosyl] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 13 2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • the mother liquor is evaporated.
  • the residue and the pellet are dissolved together in a mixture of 300 ml of chloroform, 600 ml of methanol and 240 ml of water (pyrogen-free).
  • a further 300 ml of chloroform and 300 ml of 0.1N hydrochloric acid are added to this solution, the mixture is shaken gently and the phases are separated.
  • the chloroform phase is separated off and evaporated.
  • the residue consists of contaminated 2-deoxy-3-O - [(R) -3hydroxytetradecanoyl] -2- [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono ⁇ -D-glucopyranose.
  • the 2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose thus obtained is, as described above, treated with Tris and methanol in an ultrasonic bath and centrifuged. The solution is applied to a Sephadex LH 20 column and eluted with methanol. The appropriate fractions are pooled and evaporated. The mono-tris salt of the title compound is obtained.
  • Example 14 3-Deoxy-2-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -3 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 16 2-Deoxy-3-O - [(S) -3-hydroxytetradecanoyl] -2- [(S) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 17 2-Deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -1-O-phosphono-2 [(R) -3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido] - ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 18 2-Deoxy-1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 19 2-Deoxy-2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono3-O - [(R) -3-tetradecanoyloxytetradecanoyl] - ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 20 2-Deoxy-2 - [(R) -3-hydroxytetradecanoylamido] -1-O-phosphono3-O-tetradecanoyI- ⁇ -D-glucopyranose: a) 4,6-O-8enzyliden-2 - [(R) -3-benzyloxytetradecanoylamido] -2-daoxy-1-odibenzylphosphono-3-O-tetradecan ⁇ yl- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 21 2-Acetamido-2-deoxy-3-O - [(R) -3-hydroxytetradecanoyl] -1-ophosphono- ⁇ -D-glucopyranose:
  • Example 22 1-O-Phosphono-2,3-di-O - [(R) -3-tetradecanoyIoxytetradecan ⁇ ylj- ⁇ -D-glucopyranose
  • the lower phase is separated off and washed two more times with an upper phase of 100 ml of chloroform, 100 ml of methanol and 90 ml of water.
  • the solution is evaporated and dried in a high vacuum. The product thus obtained is used in the next step without further purification.
  • the mixture is stirred for a further 10 minutes at -70 °, 0.3 ml of acetic acid is added and the solution is concentrated to a quarter of its volume.
  • the solution is diluted with 200 ml of methylene chloride, extracted with 50 ml of water, 50 ml of dilute sodium hydrogen carbonate solution and 50 ml of sodium chloride solution, dried (sodium sulfate) and evaporated.
  • the anomeric silyl protective group is split off after about 1 hour at -40 °. 3 ml of methanol are added, the mixture is allowed to warm to room temperature and the solvents are then removed in vacuo. The residue is partitioned between methylene chloride and water, the organic phase is extracted once with water, then dried and evaporated. Another 1.52 g of the title compound are obtained as an anomer mixture.
  • the product is dissolved in 600 ml of dry tetrahydrofuran, the solution is cooled to -40 ° and 14 ml of a 1 M tetrabutylammonium fluoride solution are added. After 10 minutes, the reaction is stopped by adding 17 ml of methanol. The reaction mixture is evaporated, the residue is taken up in methylene chloride and extracted with water. The organic phase is dried and evaporated.

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1-0 PHOSPHONO-SACCHARIDE VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG UND IHRE VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Saccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und ihre Verwendung als Pharmazeutika.
Die Erfindung betrifft insbesondere neue Saccharide der Formel
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worin R'1, R'2, R'3 und R'4 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Maßgabe, daß a) mindestens einer der Substituenten R'1, R'2, R'3 und R'4 eine Acylgruppe bedeutet und, b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen, α) R'1 und R'2 nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeuten, wenn R'3 und R'4 gleich sind und für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder R'4 für (R)-3-Dodecanαyloxytetradecanoyl und R'3 für
Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen, β) R'2 nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn R'1 und R'3 für Wasserstoff und R'3 für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl stehen, und γ) R'3 nicht die -(CO)2.CH2.(CHOH)4.CH2OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel
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worin X, Y, W und Z obige Bedeutung besitzen und R1 , R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substiuierte Acylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R1, R2, R3 und R4 eine Acylgruppe bedeutet, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, indem man eine Verbindung der Formel
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worin W und Z obige Bedeutung besitzen,
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und
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die gleiche Bedeutung wie R3 und R4 außer Wasserstoff besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der Formel
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worin Y und X obige Bedeutung besitzen und R"1 und R"2 die gleiche Bedeutung wie R1 und R2 besitzen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Stubstituent R"1 oder R"2 nicht Wasserstoff bedeutet, enzymatisch kondensiert und gewünschten falls die erhaltenen Verbindungen einer Verseifung unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für Sauerstoff stehen, R1 , R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten oder gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Acylamidasereaktion unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für die Iminogruppe stehen, R1 , R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten, und die so erhaltenen Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.
Die enzymatische Kondensation wird beispielsweise in einem gepufferten System, z.B. im Tris-Puffer bei pH 7, und bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, zB. bei 30° C, durchgeführt. Als Enzymextrakt kann eine aus gramnegativen Bakterien, vorzugsweise aus E . coli-Stämmen (Raetz, J. BioL Chem. 259/4852 [1984]) erhaltene Präparation eingesetzt werden. Bevorzugt sind Stämme, die durch genetische Manipulation zur Überproduktion des gewünschten Enzyms angeregt wurden. Die eventuell anschließende Verse ifung kann nach literaturbekannten Methoden, die Acylamidasereaktion analog wie von C.R. Verret et. al. in J. Biol. Chem. 257/10222 (1982) beschrieben, durchgeführt werden. Aus dem Reaktionsgemisch können die Endprodukte nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.
R1, R2, R3 und R4 sind gleich oder verschieden, vorzugsweise gleich, und bedeuten Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH, Acetoxy oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel Ia können daher R1, F 2, R3 und R4 in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formeln II, III und IV. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktiαnsablaufs unverändert, d.h., ausgehend von R-, bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R-, bzw. S-oder racerπischen Endverbindungen.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel Ia, worin R1 , R2, R3 und R4 für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen. Weiters bevorzugt sind Verbindungen der Formel Ia, worin, wenn R1 , R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten, Y, X, W und/oder Z für Sauerstoff steht.
Die Verbindungen der Formel Ia werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.
Die Verbindungen der Formel II können aus den Verbindungen der Formel III durch Umsetzung mit aktiviertem Uridin-5'-monophosphat nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.
Die Verbindungen der Formel III, worin a) Y für O und X für NH stehen, wobei jedoch, α) wenn R"1 (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, R"2 nicht für (R)3-Hydroxytetradecanoyl oder (R)-3-Hexadecanoyloxytetradecanoyl steht, β) R"1 nicht für Wasserstoff steht, und γ) R"1 und R"2 nicht gleichzeitig für die Acetyl- oder -CO.(CH2)10.CH3-Gruppe stehen, b) Y für O und X für O und c) Y für NH und X für O stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y die Iminogruppe bedeutet, der an der Iminogruppe hängende Sustituent R'i oder R'λ nicht für Wasserstoff steht, sind neu und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung. Verbindungen der Formel III können erhalten werden, indem man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel
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worin R"1 und R"2 obige Bedeutung besitzen und entweder X' und Y' für Sauerstoff oder Y' für die Iminogruppe und X' für Sauerstoff stehen, in Verbindungen der Formel
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worin R"1 , R"2 , X' und Y' obige Bedeutung besitzen und R für eine Schutzgruppe steht, die ungeschützte OH-Gruppe zu einem geschützten Phosphatester umsetzt oder
b) zur Herstellung von Verbindungen der Formel
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worin R"1 und R"2 obige Bedeutung besitzen, Verbindungen der Formel
IIIC
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worin R"2 und R obige Bedeutung besitzen und R' für eine Schutzgruppe steht, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.
Das Verfahren a) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IV in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z.B. in einem cyclischen Ether, w ie Tetrahydrofuran, löst und bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei -70°C, mit Butyllithium in einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, z.B. in Hexan, versetzt und dann Dibenzylphosphorchloridat zugibt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Produkt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die freien OH-Gruppen des Phosphatrestes sind geschützt, z.B. durch Benzyl. Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Methoden ausgeführt werden. Beispielsweise wird eine Schutzgruppe wie üblich sauer abgespalten, z.B. mit einer wäßrigen Säure (Ionenaustauscher), oder hydrogenolytisch.
Das Verfahren b) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IIIc in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefer Temperatur, z. B. bei etwa 4° C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Anschließend werden die vorhandenen Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten. Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise könne beide R zusammen die Benzyliden- oder die Isopropylidengruppe bedeuten. Auch als Schutzgruppen des Phosphatrestes können bekannte Schutzgruppen eingesetzt werden, zB. die Benzylgruppe.
Die Ausgangsverbindungen der Formel IIIc sind neu und können nach folgendem Formelschema erhalten werden:
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Die Ausgangsverbindungen der Formel IV können nach folgenden Reaktionsschemata erhalten werden, wobei an der jeweiligen Reaktion nichtteilnehmende OH-Gruppen gegebenenfalls geschützt sein können. In diesen Reaktionsschemata haben die Substituenten folgende Bedeutung: R, R' = Schutzgruppen R5 = beide R5 sind gleich oder verschieden und haben die gleiche
Bedeutung wie R1 , R2, R3 oder R4 Ac = Acetylgruppe
TBDMS = tert. Butyldimethylsilyl
1. Herstellung von Verbindungen der Formel IVa
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2. Herstellung von Verbindungen der Formel IVb
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3. Herstellung von Verbindungen der Formel IVc
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Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar. Die Verbindungen der Formeln Ia und III zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:
1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat-Test
Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im LimulusAmoebozytenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01 0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1:10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 μl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 μl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37° C mit 200 μl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 μl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E.U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.
2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus.
Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 b1.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 μg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76(1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD5 0 mittels der Spearman-Kärber-Methode.
3. Mikrobielle Septikämie in der neu tropenischen Maus:
Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neu tropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B6D2F 1-Mäuse 1 x 200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginosa A 12: 1 x 105, E.coli Δ 120: 2 x 106, Staph. - aureus
Δ 113: 1x106, Candida albicans Δ 124: 1x104). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:
a) Durchschnittliche Überlebensdauer b) Überlebensrate
Die Verbindungen der Formeln Ia und III zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (zB. Pseudomonas und E.coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (zB. Staph. aureus) bzw. Hefen (zB. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.
4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus: Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1x106 Neutrophile, mit Testsubstanz vαrbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 μMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin (10-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 μg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.
5. Carbon Clearence Test
Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 Å (z. B. Kόhlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES -Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10 %igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1 %igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 μl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt. 6. Herpesinfektion der Maus:
Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (zB. 1x106 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1 / Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.
Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (zB. 1,3x105 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1 /Maus) infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.
Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektiαnskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet: a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ) b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ) c) Durchschnittliche Überlebensdauer d) Überlebensrate.
Die Verbindungen der Formel Ia und III zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle. 7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor):
CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haernopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B6D2F1 Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B6D2F1 Mäusen gemessen LD. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel Ia und III induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.
8. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)
Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zeilüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C3H/HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird [J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formeln Ia und III besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 μg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren. 9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz) Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotαxinschock-Induktion in der Maus).
Mit den Verbindungen der Formeln Ia und III konnte bereits nach einmaliger i.p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-Challenge in einer Dosis von 0,01 μg LPS + 8 mg Galactosam in/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.
Weiters besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE2- und PGF1 α - Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE2 und PGF1 α nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE2-Produktiαn der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE2-Freisetzung von Maus-MΦ nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-Mji gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE2-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.
In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen MΦ nach LPS-Behändlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen ShwartzmanReaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ von B6D2F1-Mäusen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-MΦ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten MΦ-Suspehsion wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.
In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von MausPeritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B.D2F1 -Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-MΦ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 x 106/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.
Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla Kaninchen am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i.v. bzw. i.p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 μg LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 μg LPS/kg i.v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.
Weiters besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:
1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF) Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF. Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1 x 106Zellen/ml in Medium [RPMI 1640 + 1 % Pen/Strep (5000 U/ml) + 1 % Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 μg bis 0,1 μg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37° C/5 % CO2inkubiert. Nach Filtration durch 0,45 μm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei -70°C eingeforen.
In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3 x 104 Zellen/Näpfchen/100 μl über Nacht vorkultiviert (37°C/5 % CO2), mit 100 μl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1:2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 μl Actinomycin D (8 μg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5 % CO2 inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50 %ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft. 2. B16F1 Melanom Test:
B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10 /ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10 Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B6D2F 1 Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel Ia und III immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.
Die Verbindungen der Formeln Ia und III können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formeln Ia und III sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. z usammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formeln Ia und III indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formeln Ia und III sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formeln Ia und III für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.
Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.
Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formeln Ia und III auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später. Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel Ia oder III, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenkiichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergesteüt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel Ia oder III oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindungen der Formel Ia oder III zur Verwendung als chemo therapeutisches Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. EDTA bedeutet Ethylendiamintetraessigsäure, DTE steht für 1,4-Dithioerythrit, UDP für Uridinphosphat und Tris für Tris(hydroxymethyl)aminomethan.
Beispiel 1: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyI]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoyIamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2,3-di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
2,03 mg UDP-2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose und 1,42 mg 2,3Di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose, beide als Tris-Salze, werden in 10 mM Tris-Puffer, pH 7, mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE gelöst und mit 60 μl Enzymextrakt bei 30° inkubiert.
Dieser Enzymextrakt kann folgendermaßen erhalten werden:
E. coli JB1104 wird in L-Broth angezüchtet (Vorkultur + 10 μg Ampicillin/ml bei 30° über Nacht; Hauptkultur bei 30° im Schüttelinkubator, ausgehend von OD550 nm = 0,1 bis OD55 0 nm = 1) . Die Zellen werden durch
Zentrifugation bei 10.800 g geerntet (10 Minuten/4°), das Pellet in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,0 + 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE suspendiert und erneut zentrifugiert (6000 g, 10 Minuten/4º). Anschließend wird das Pellet in obigen Puffer resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5 x 20 Sekunden/30 Sekunden Pause mit 120 Watt). Nach Zentrifugation (12.000 g, 10 Minuten/4º) zum Abtrennen der Zellreste wird ultrazentrifugiert (150.000 g, 90 Minuten/7º). Die oberen 2/3 des Überstandes werden gewonnen. Diese Fraktion wird einer fraktionierten Ammonsulfatfälϊung unterzogen. Als Enzympräparation verwendet wird der Bereich von 10 40 % Ammonsulfat. Das so gewonnene Pellet wird in obigem Puffer aufgenommen.
Nach beendeter Reaktion (Reaktionskontrolle über Dünnschichtchromatographie) wird mit Zitronensäure auf pH 2 angesäuert und zentrifugiert. Das Pellet wird in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (65/15/5/2) aufgenommen und über Kieselgel mit dem gleichen Laufmittel chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden gesammelt und eingedampft, bis keine organischen Lösungsmittel mehr vorhanden sind, und der Rest lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Tetrahydrofuran/Wasser (8/2) gelöst und über einen Kationenaustauscher in der Tris-Form in diesem Lösungsmittel in das Tris-Salz überführt, das Tetrahydrofuran abrotiert und der Rückstand lyophilisiert. Alle Rf-Werte werden auf Kieselgelplatten bestimmt.
Rf (in Chloroform/ Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,48
Beispiel 2: 6-O-(2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxyt8tradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-Dglucopyranose:
20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphonα-α-D-glucopyranose in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3-O-[(R)-3hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphonoα-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH=7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen einer Enzympräparation (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1 % Triton X-100 bei 30° 8 Stunden umgesetzt, wobei die Endkone zentratiαn an Triton X-100 auf 0,1 % eingestellt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, in etwa 1/3 des Ausgangsvolumens im Laufmittel für nachfolgende Chromatographie auf Molekulargewichtstrennung (Sephadex LH 20) gelöst (Laufmittel: Pyridin/Essigsäure/Wasser = 98/1/1) und filtriert. Das Volumen der verwendeten Säule ist etwa 20 x so groß wie das Probenauftragsvolumen. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, im Vakuum eingeengt, in pyrogenfreiem Wasser suspendiert und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wird Triton X-100 durch Digerieren mit Diethylether entfernt. Nach Zentrifugation wird das Pellet in einem Gemisch von Chloroform/Methanol (1/1) gelöst, filtriert und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zur waßrigen Suspension dieses Pellets wird die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM Lösung zugegeben und erneut lyophilisiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,44
Beispiel 3: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[ (R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose:
Je 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2-[(R)-3-tetradecanαyloxytetradecanoylamido]α-D-glucopyranose in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-Ophosphono-α-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH=7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen Enzymextrakt (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1 % Triton X-100 bei 30° 48 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentratiαn an Triton X-100 auf 0,1 % eingestallt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, mit Pyridin behandelt und filtriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und mit folgendem Laufmittel (Chloroform/Methanol/Wasser/2-Phenethylpicoloniumbromid = 800/175/22,5/2,5) auf Kieselgel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, und durch Ausschütteln mit 20 mM H3PO 4 in H2O wird das als lonenpaarbildner dienende 2-Phenethylpicoloniumbromid entfernt. Die organische Phase wird im Vakuum eingeengt, die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM Lösung zugegeben und lyophilisiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,53
Analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I erhalten werden, wobei je nach den eingesetzten Verbindungen der Formel II und III die Enzymmenge so gewählt wird, daß die Reaktion vorzugsweise in etwa 24 bis 48 Stunden abläuft::
Figure imgf000027_0001
Beispiel 10: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-1-O-phosphono-3-Otetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,50
Betspiel 11: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-acetamido-2-deoxy-3-O¬
[(R)-3-hydroxytetradecanoyI]-1-O-phosphono-α-D-qlucopyranose:
Man verfährt wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die
Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,32
Beispiel 12: 6-O-[2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
5 mg 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2,3-di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose werden in Chloroform/Methanol (1/1) gelöst und mit wäßrigem 25 %igen Ammoniak (1/3 des Volumens) versetzt. und über Nacht stehen gelassen. Nach Reaktionsende wird eingedampft, der Rückstand mit Diethylether zur Entfernung der abgespaltenen Fettsäuren digeriert, der Niederschlag abgesaugt und mit Ethar gewaschen. Der Rückstand wird mit Wasser und der berechneten Menge Tris zur Herstellung des Di-Trissalzes gelöst und lyophylisiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 25/15/2/4) = 0,45
Beispiel 13: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
a) 4,6-O-BenzyHden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoy ]-2-[(R)-3-benzy oxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose: Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 3,9 g 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3benzyIoxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzyIphosphono-α -D-glucopyranose, 2 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 50 mg 4-Dimethylaminopyridin in 20 ml Methylenchlorid werden 2 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in wenig Toluol/Essigester (8/2) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch chromatographiert. Fp: 96-98°
[α]D 20 = +33,3° (c = 1, Chloroform) Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,5
b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
4,2 g 4,6-O-Benzyliden-3-O-[XR)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose werden in 900 ml Tetrahydrofuran/Wasser (85/15) gelöst und mit 1,5 g 10 % Palladium auf Aktivkohle 2 Stunden bei 10 bar und 40° hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Tetrahydrofuran abgedampft und die wäßrige Suspension lyophilisiert.
[α]D 20 = +28,5° (c = 0,2, Chloroform + 1 Tropfen Methanol) Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,56 Die weitere Reinigung kann folgendermaßen durchgeführt werden:
10 g 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α -D-glucopyranose und 1,7 g Tris in 150 ml Methanol werden 12 Minuten bei 45° in einem Ultraschallbad beschallt. Die Suspension wird zentrifugiert und anschließend wird der klare Überstand vom Pellet dekantiert. Zu dieser Lösung gibt man 1,7 g Tris (gelöst in 20 ml Methanol), impft die Lösung an und läßt bei Raumtemperatur kristallisieren. Man erhält das Di-Tris-Salz der Titelverbindung.
Die Mutterlauge wird eingedampft. Der Rückstand und das Pellet werden gemeinsam in einem Gemisch aus 300 ml Chloroform, 600 ml Methanol und 240 ml Wasser (pyrogenfrei) gelöst. Zu dieser Lösung gibt man weitere 300 ml Chloroform und 300 ml 0,1 N Salzsäure, schüttelt vorsichtig und läßt die Phasen trennen. Die Chloroformphase wird abgetrennt und eingedampft. Der Rückstand besteht aus verunreinigter 2-Deoxy-3-O-[(R)-3hydroxytetradecanoyl]-2-[ (R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphonoα-D-glucopyranose.
Die so erhaltene 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose wird, wie oben beschrieben, mit Tris und Methanol im Ultraschallbad behandelt und zentrifugiert. Die Lösung wird auf eine Sephadex LH 20 Säule aufgegeben und mit Methanol eluiert. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält das Mono-Tris-Salz der Titelverbindung.
5,1 g dieses Mono-Tris-Salzss werden in 40 ml Methanol bei 45° im Ultraschallbad gelöst, eine Lösung von 0,74 g Tris in 10 ml Methanol zugegeben, beimpft und zunächst bei Raumtemperatur und dann bei 4° kristallisieren gelassen. Man erhält weiteres kristallines Di-Tris-Salz der Titelverbindung.
Der Rückstand der Mutterlauge und das Pellet der Zentrifugation können erneut einem Reinigungszyklus zugeführt werden. Fp: 183-185° (Zersetzung)
[α]D 20 = + 15° ((c = 1, Wasser)
Beispiel 14: 3-Deoxy-2-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
a) 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-daoxy-1-O-dibenzylphosphono-4,6-O-isopropyliden-α-D-qlucopyranose:
Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 4,85 g 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Dibenzylphosphorochloridat in 10 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuteri bei -70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3). Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58
b) 3-Deoxy-2-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-hydroxytetradacanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
Eine Lösung von 980 mg 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyIamido]-3-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-4,6-O-isopropyliden-α-D-glucopyranose in 100 ml Tetrahydrofuran wird etwa 1 Stunde mit 300 mg 10 % Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, Wasser (10 ml) und Dowex AG50WX8 H+ zugegeben und das Gemisch bis zur vollständigen Abspaltung der Isopropylidengruppe bei Raum temperatur gerührt. Der Ionentauscher wird abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und Tetrahydrofuran und Wasser am Rotavapor abgedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und über Sephadex LH 20 chromatographiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,65
Beispiel 15: 2,3-Di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-Dqiucopyranose:
a) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose
Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 1 g 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranose in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 0,9 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 420 mg Dibenzylphosphorchloridat in 4 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei -70° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 4/4/1). Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,65
b) 2,3-Di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose
230 mg 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose w erden in Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mii. 80 mg 10 % Palladium auf Aktivkohle ca. 5 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,65
Beispiel 16: 2-Deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[ (S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyIamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose: Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die
Titelverbindung.
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44
b) 2-Deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyI]-2-[(5)-3-hydroxytetradecanoyIamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 13b) beschrieben und erhält die
Titelverbindung mit einem Fp: 150-200° (Zers.)
Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1; untere Phase) = 0,5
Beispiel 17: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose:
a) 4,6-O-BenzyIiden-3-O-[(R)-3-benzyIoxytetradecanoyl]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α -D-qlucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 82-95° .
[α]D 20 = +24,1° (c = 1, Chloroform) Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,7
b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyIamido]-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die
Titelverbindung.
[α]D 20 = +14,3° (c = 1, Tetrahydro furan/Pyridin)
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,35
Beispiel 18: 2-Deoxy-1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose:
a) 4,6-O-BenzyIiden-2-deoxy-1-O-dibenzyIphosphono-3-O-tetradecanoyl-2tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose: Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäure und mit Toluol/Essigester (4/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung vom Fp: 123-129° Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,6
b) 2-Deoxy-1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-α-Dglucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die
Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,65
Beispiel 19: 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono3-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose:
a) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyIamido]-2-deoxy-1-Odibenzylphosphono-3-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-qlucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von (R)-3-Tetradecanoyloxytetradecansäure und mit Toluol/Essigester (4/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp:
89-90° .
[α]D 20 = +30,9° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1)
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,5
b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-3-O-[(R)3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose:
Man verfährt ananlog wie in Beispiel 21b) beschrieben. Das Lyophilisat wird in Methanol gelöst und mit dem gleichen Lösungsmittel über Sephadex LH 20 chromatographiert. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,32
Beispiel 20: 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono3-O-tetradecanoyI-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-8enzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-daoxy-1-OdibenzyIphosphono-3-O-tetradecanαyl-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäure und Toluol/Essigester (3/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 125.5 - 126.5° . Rf (Toluol/Essigester = 3/2) = 0,6
b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoyIamido]-1-O-phosphono-3-Q-tetradecanoyl-α-D-glucopyranose:
354 mg 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy1-O-dibenzyIphosphono-3-O-tetradecanoyl-α-D-glucopyranose werden in 30 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mit 200 mg Palladium auf Aktivkohle 10 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan auf pH 7,5 gebracht. Das Tetrahydrofuran wird am Rotavapor abgedampft und die wäßrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird noch zweimal mit Ether digeriert und dann getrocknet. Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,6
Beispiel 21: 2-Acetamido-2-deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-Ophosphono-α-D-glucopyranose:
a) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytstradecanoyl]-2deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α -D-glucopyranose:
Eine Lösung von 3,55 g 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose und 2,1 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure in 15 ml Methylenchlorid wird auf 0° gekühlt und mit 1,32 g Dicyclohexylcarbodiimid und p-Dimethylaminopyridin versetzt. Nach 2 Stunden bei dieser Temperatur ist die Reaktion beendet. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, eingedampft und einmal mit Methylenchlorid/Methanol (50/1) und ein zweites Mal mit Toluol/Essigester (2/1) über Kieselgel chromatographiert. Rf (Chloroform/Methanol = 20/1) = 0,7 b) 2-Acetamido-2-deoxy-3-O-C(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphonoα -D-glucopyranose:
2,08 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-gIucopyranose werden in Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und 3 Stunden mit 1 g 10 % Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat erst eingedampft und dann lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Methanol gelöst, mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan neutralisiert und mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.
[α]D 20 = + 43,3° (c = 1, Methanol) Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,4
Beispiel 22: 1-O-Phosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyIoxytetradecanσylj-α-D-glucopyranose
a) 4,6-Q-Benzyliden-1-O-dibenzylphosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose
Man verfährt analog wie im Beispiel 15a) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Ethar/Hexan (1/1) als Laufmittelgemisch gibt die Titelverbindung. Rf (Ether/Hexan = 1/1) = 0,5
b) 1-O-Phosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-Dglucopyranose
470 mg 4,6-O-Benzyliden-1-O-dibenzylphosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose werden in 47 ml Tetrahydrofuran gelöst und 1 Stunde mit 230 mg Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedamp ft und der Rückstand über Kieselgel (Chloroform/Methanol/Wasser/Triethylamin = 15/10/2/0,2) chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft; man erhält die Titelverbindung als Di-Triethylaminsalz. Rf (Chlorofrom/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,5 Beispiel 23: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-gIucopyranose
a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-gIucopyranose Man verfährt analog wie im Beispiel 13a) beschrieben.
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44
b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose
Man verfährt analog wie im Beispiel 13b) beschrieben.
Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1, untere Phase) = 0,5
Zur Charakterisierung der Verbindungen wurde Fast Atom Bombardement (FAB) Massenspektroskopie (negativer Modus) durchgeführt (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]). Beispiel Masse
1 1325
2 1324
3 1534
4 1323
5 1322
6 1325
7 1324
8 1323
9 1326
10 1292
11 1140
12 647
NMR-SPEKTREN
Bsp:
1 9.82 (d, 9 Hz, 1H); 6.65 (dd, 8,8 u. 3,5 Hz, 1H); 6.25 (t, 10 Hz, 1H);
(C5D5N) 5.83 (t, 10 Hz, 1H); 5.63 (d, 8,8 Hz, 1H); 5.35 (dd, 10 u. 2,5 Hz, 1H); 4.0 (t, 10 Hz, 1H); 3.83 (m 1H). 13 5.49 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.24 (dd, 9,5 u, 10,5 Hz, 1H);
(CD3OD) 4,17 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.0 (m, 3H); 3.90 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.75 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.71 (s, Tris); 3,63 (t, 10 Hz, 1H).
14 5.77 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, (CDCl3/ 1H); 4.38 (dd, 9,5 u. 10,5 Hz); 3.8 bis 4.1 (m, 4H); 3.73 (dd, CD3OD) 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.53 (t, 10 Hz, 1H).
15 5.71 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.48 (t, 10 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2, (CD3OD) 4 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.05 (m, 3H); 3.86 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.7 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.67 (s, Tris); 3.58 (t, 10 Hz, 1H).
16 5.58 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 4.19 (dt, 3 u. (CDCl3 / 10 Hz, 1H); 3.8 bis 4.1 (m, 4H); 3.7 (s, Tris u. dd, 1H); 3.46
CD3OD) (t, 10 Hz, 1H).
17 5.46 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 5.17 (m, 1H); (CEC13 / 4.19 (dt, 3 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 3H),- 3.7 (s, Tris); CD 3CD) 3.65 (dd, 1H); 3.51 (t, 10 Hz, 1H).
18/Stufe a) 7.38 (m, 15H); 5.70 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.63 (d, 9,5 Hz,
(geschützt) 1H); 5.50 (s, 1H); 5.26 (t, 10 Hz, 1H); 5.08 (m, 4H); 4.38 (m, (CDCl3 ) 1H). 4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.73
(t, 10 Hz, 1H); 3.69 (t, 10 Hz, 1H); 2.29 (m, 2H); 1.89 (m, 2H).
19/Stufe a) 7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.34 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 u.
(geschützt) 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.29 (t, 10 Hz, 1H); 5.14 (quintett, (CDCl3) 6 Hz. 1H); 5.0 (m, 4H). 4.51 u. 4.41 (AB, 12 Hz, 2H); 4.41 (m,
1H); 4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.58 u. 2.47 (ABX, 5,5, 7,5 u. 15,5 Hz, 2H). 20/Stufe a) 7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.29 (d, 9 Hz, 1H); 5.74 (dd, 3,5 u. (geschützt) 6 Hz, 1H). 5.49 (s, 1H). 3.30 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.52
(CDCl3) u. 4.42 (AB, 11 Hz, 2H); 4.44 (m, 1H); 4.03 (dd, 5 u. 10 Hz,
1H); 3.94 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.15 bis 2.35 (m, 4H).
21/Stufe a) 5.47 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.23 (dd, 9,5 u. 10,5 Hz, 1H); (geschützt) 4.18 (dd d, 2,5, 3,5 u.10,5 Hz, 1H); 3.90 (m, 3H). 3.85 (dd, 2
(CD3OD) u. 12 Hz, 1H); 3.72 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H). 3.68 (s, Tris); 3.61
(t, 10 Hz, 1H); 1.94 (s, 3H).
22/Stufe a) 7.3 bis 7.45 (rn, 15H); 5.92 (dd, 3,5 u. 6,7 Hz, 1H); 5.60 (t, 9,5 (geschützt) u. 10 Hz, 1H); 5.4 8 (s, 1H). 5.02 bis 5.22 (m, 6H); 4.95 (ddd,
(CDCl3) 2.5, 3,5 u. 9,5 Hz, 1H); 4.10 (dd, 4,5 u. 10 Hz, 1H); 3.96 (ddd,
5, 9 u. 10 Hz, 1H); 3.67 (t, 9,5 Hz, 2H); 2.60 (m, 2H); 2.38 (d, 6,5 Hz, 2H); 2.24 (t, 7,5 Hz, 2H); 2.12 (t, 7,5 Hz, 2H).
23/Stufe a) 7.2 bis 7.42 (m, 25H); 6.49 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 u. (geschützt) 6 Hz, 1H); 5.45 (s, 1R); 5.3 5 (t, 10 Hz, 1H). 5.0 (m, 4H); 4.54
(CDCl3) u. 4.40 (AB, 11 Hz, 2H); 4.47 u. 4.36 (AB, 11 Hz, 2H); 4.45
(m, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 2H); 3.6 bis 3.8 (m, 4H); 2.58 (dd, 6,5 u. 15,5 Hz, 1H); 2.34 (dd, 6 u. 15,5 Hz, 1H); 2.2 (m, 2H).
Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermaßen erhalten werden:
A) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyiamido]-2-deoxy-1-Odibenzylphosphono-α-D-glucopyranose (für Beispiel 13, 19 und 20):
a) 2-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose: Ein Gemisch von 5,4 g D-Glucosamin.Hydrochlorid, 10,8 g N-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyloxy]succinimid und 5 ml Düsopropylethylamin in 25 ml ab solutem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird weitgehend abgedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus 150 ml Chloroform, 300 ml Methanol und 120 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von weiteren 150 ml Chloroform und 150 ml Wasser trennt man die untere Phase ab und wäscht sie noch zweimal mit je einer oberen Phase aus 100 ml Chloroform, 100 ml Methanol und 90 ml Wasser. Die Lösung wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt.
Für analytische Zwecke wird eine geringe Menge Rohprodukt chromatographisch gereinigt (Toluol/Ethanol = 9/1). Fp: 150-158° .
[α]D 20 = +53 ° (c = 1, Dimethylformamid)
Rf (Chloroform/Msthanαl = 9/1) = 0,3
b) 4,6-O-BenzyIiden-2-((R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-Dglucopyranose:
Eine Lösung von 5,83 g 2-[(R)-3-8enzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-Dglucopyranose, 3 g Benzaldehyddimathylacetal und 500 mg p-Toluolsulfonsäure.Monohydrat in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Großteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml MeLhylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165° .
[α]D 20 = +5,5° (c = 1, Chloroform) Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,2
c) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyIamido]-2-deoxy-1-Odibenzylphosphono-α -D-glucopy ranose:
Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 4,85 g 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3benzyloxytetradecanαylamido]-2-deoxy-D-glucαpyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran wird 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Diben zylphosphorochloridat in 10 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei -70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3). Fp: 102-105° .
[α]D 20 = +31,7° (c = 1, Chloroform) Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32
B) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranose (für Beispiel 15):
a) Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid:
Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 2,34 g Penta-O-acetyl-D-glucopyranose in 9 ml Trichlorethanol gibt man 0,9 ml Bortrifluoridetherat und hält das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei dieser Temperatur. Danach wird die Lösung auf 100 ml Eiswasser gegossen, mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach chromatographischer Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1) kristallisiert das Produkt aus Essigester/Petrolether.
Fp: 138 - 140° Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,67
b) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-β-D-gIucopyranosid:
7,13 g Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid werden in einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und mit einer Natriummethanolatlösung (60 mg Natrium in 26 ml Methanol) versetzt. Nach 2 Stunden bei 0° wird mit Dowex AG 50 WX8 H+ neutralisiert, der Ionentauscher abfiltriert und die Lösungsmittel am Rotavapor entfernt. Der Rückstand wird in 60 ml Benzaldehyd gelöst, 4,1 g Zinkchlorid werden zugegeben und das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird auf Eiswasser gegossen, mit Ether extrahiert, die Etherlösung getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1). Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,60
c) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyI]ß-D-qlucopyranosid:
Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 800 mg Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-ß-D-glucopyranosid, 1,4 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 20 mg Dimethylaminopyridin in 10 ml Methylenchlαrid werden 930 mg Dicyclohexylcarbαdiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Hexan/Toluol/Essigester (12/5/1) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch chromatographiert. Rf (Hexan/Essigester = 5/1) = 0,52
d) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-qlucopyranose:
480 mg Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-ß-D-glucopyranosid werden in 50 ml eines Gemisches von Dioxan/Eisessig (1/1) gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit ZnStaub versetzt, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Danach wird filtriert, eingedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 2/5/1). Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,32
C) 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose (für Beispiel 14):
a) 3-Azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-gIucopyranose: 1,02 g 3-Azido-3-deoxy-D-glucopyranose werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, 940 μl 2-Methoxypropen und eine katalytische Menge p-Toluolsulfαnsäure.Monohydrat zugegeben und die Lösung ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die p-Toluolsulfonsäure wird mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Chloroform/Methanol = 9/1). Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,64
b) tert.-Butyldimethylsilyl 3-azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-ß-D-glucopyranosid:
Zu einer Lösung von 560 mg 3-Azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyIiden-D-glucopyranose und 310 mg Imidazol in 25 ml trockenem Methylenchlorid gibt man 345 mg tert.-Butyldimethylsilylchlorid und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird Imidazolhydrochlorid ab filtriert und das Filtrat zweimal mit je 10 ml Wasser geschüttelt, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 12/1). Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6
c) tert.-Butyldimethylsilyl 2-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3benzyIoxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-ß-D-glucopyranosid:
Eine. Lösung von 3,1 g tert.-Butyldimethylsilyl 3-azido-3-deoxy-4,6-0-iso¬propyHden-ß-D-glucdpyranαsid in 100 ml Methanol wird 2 Stunden mit 300 mg 10 % Palladium auf Aktivkohle hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird zusammen mit 5,35 g (R)-3-Benzyloxymyristinsäure und 100 mg Dimethylaminopyridin in 50 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und 4,1 g Dicyclohexylcarbodümid zugegeben. Nach ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur wird filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 9/1). Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,42
d) 2-O-[ (R)-3-Benzyl oxytetradecanoyI]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose:
Zu einer auf -60° gekühlten Lösung von 5 g tert.-Butyldimethylsilyl 2-O[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-de oxy-4,6-O-isopropyliden-β-D-gIucopyranosid in 100 ml absolutem Tetrahydrofuran tropft man 5,2 ml einer 1 m Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu. Man läßt auf -40° erwärmen und hält bei dieser Temperatur, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist (ca. 30 Minuten). Danach gibt man 5 ml Methanol zu, läßt auf Raumtemperatur kommen und dampft ein. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase wird getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel abgedampft. Chromatographische Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 3/1) ergibt die Titelverbindung als Anomerengemisch. Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,48 und 0,52
D) 4,6-O-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose (für Beispiel 16):
a) 2-[(S)-3-Benzyloxytetradscanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Aa) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol = 7/1) = 0,37
b) 4,6-O-Benzyliden-2-[(5)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Ab) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
[α]D 20 = -3,5° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,37
c) 4,6-O-Benzyliden-2-[(5)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-Odibenzylphosphono-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Ac) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
[α]D 20 = + 39,2° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,46 E) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido ]-α-D-gIucopyranose (für Beispiel 17):
a) 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-glucose:
Ein Gemisch aus 650 mg D-Glucosamin. Hydrochlorid, 1,9 g N-[(R)-3-Tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]succinimid und. 0,5 ml Düsopropylethylamin in 15 ml Dimethylformamid wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand über Kieselgel mit Essigester/Methanol (8/1) als Lösungsmittelgemisch chromatographiert.
[α]D 20 = + 25° (c = 1, Methanol) Rf (Essigester/Mβthanol = 6/1) = 0,5
b) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-gIucopyranose:
Eine Lösung von 5,83 g 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-glucose, 3 g Benzaldehyddimethylacetal und 500 mg p-Toluolsulfonsäure.Monohydrat in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Großteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml Methylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165°.
[α]D 20 = -1,5° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1) Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32
c) 4,6-O-BenzyIiden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyIoxytetradecanoylamido -α -D-glucopyranose:
Zu einer auf -40° gekühlten Lösung von 950 mg 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 1,25 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird eine Lösung von Dibenzylphosphorochloridat in Benzol zugetropft und noch weitere 5 Minuten bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird mit Essigsäure neutralisiert, die Lösung eingedampft und der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt. Man trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert über Kieselgel (Toluol/Essigester = 3/1).
[α]D 20 = + 19,3° (c = 1, Chloroform) Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6
F) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tstradecanoylamido-α-D-glucopyranose (für Beispiel 18):
a) 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose:
Ein Gemisch von 3 g D-Glucosamin. Hydrochlorid, 4,56 g N-Tetradecanoyloxysuccinimid und 2,8 ml Düsopropylethylamin in 40 ml trockenem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit Dimethylformamid und Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in die nächste Reaktion eingesetzt.
b) 4,6-O-Benzyliden-2-dsoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose:
4 g 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 55° in 320 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 2,6 ml Dimethoxytoluol und 400 mg p-Toluolsulfonsäure. Monohydrat zugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung, Wasser und Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und direkt in die nächste Reaktion eingesetzt.
c) 4,6-O-Benzylidgn-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-tstradecanoylamido-D-glucopyranose:
2,2 g 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 60° in 250 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 960 mg Imidazol und 2,13 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zugegeben und die Reaktion 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach Zugabe von 480 mg Imidazol und 1 g tert. Butyldimethylchlorsilan und weiteren 24 Stunden bei 60° ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird über Kieselgel mit einem Gradient von Toluol/Essigester (20/1 bis 2/1) chromatographiert. Man erhält zwei Hauptfraktiαnen: die Titelverbindung (650 mg) und die entsprechende 1,3-bis-Silylverbindung (1,82 g). Die bis-Silylverbindung wird in 25 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf -40° gekühlt und 2,5 ml einer 1 normalen Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zugetrαpft. Nach etwa 1 Stunde bei -40° ist die anomere Silylschutzgruppe abgespalten. Man gibt 3 ml Methanol zu, läßt auf Raumtemperatur erwärmen und entfernt anschließend die Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser extrahiert, dann getrocknet und eingedampft. Man erhält weitere 1,52 g der Titelverbindung als Anomerengemisch. Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,42
d) 4,6-O-Benzyliden-5-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose:
Zu einer auf -60° gekühlten Lösung von 2,46 g 4,6-O-Benzyliden-3-O(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucopyranose in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 3,12 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von Dibenzylphosphorochloridat in Benzol zugetropft. Es wird noch 5 Minuten bei -60° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und dann eingedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Aufarbeitung und Chromatographie über Kieselgel mit Toluol/Essigester (3/1) als Laufmittel ergibt die Titelverbindung. Rf (Toluol/Essigester = 7/4) = 0,75
e) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzyIphosphono-2-tetradecanoyIamido-α-D-glucopyranose: Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 2,05 g 4,6-O-Benzyliden-3-O (tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 2,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu und rührt 2 Stunden bei 0° . Danach gibt man 3 ml Methanol zu, dampft ein und verteilt zwischen Methylenchlorid und Wasser. Es wird wie üblich aufgearbeitet und mit Toluol/Essigester (3/2) über Kieselgel chromatographiert. Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,35
G) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-Dglucopyranose (für Beispiel 21):
a) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyO-2-deoxyD-glucopyranose:
Eine Lösung von 5.17 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyüden-2-deoxy-D-glucopyranose, 3,4 g Imidazol und 6,3 g tert.-Butyldimethylchlorsilan in 300 ml Dimethylformamid wird bei 60-70° gehalten. Nach 6 Stunden gibt man nochmals 500 mg Imidazol und 1 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zu und hält bei dieser Temperatur, bis die Reaktion beendet ist. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand durch Methylenchlorid/Wasser-Extraktion und anschließende Chromatographie mit Toluol/Essigester (5/1) gereinige. Zur Abspaltung der anomeren tert.-Butyldimethylsilylgruppe wird das Produkt in 600 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf -40° gekühlt und 14 ml einer 1 m Tetrabutylammoniumfluoridlösung zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 17 ml Methanol gestoppt. Die Reaktionsmischung wird eingedampft, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet und eingedampft. Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,5
b) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose: Man verfährt analog wie unter Ec) beschrieben und erhält nach Chromatographie mit Toluol/Essigester (1/1) als Lösungsmittel die Titelverbindung. Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58
c) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-Dglucopyranose:
Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 4,4 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-Dglucopyranose in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 6,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran und hält 2 Stunden bei 0° . Danach wird Methanol (7 ml) zugegeben und die
Lösung eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in Methylenchlorid wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,65
H) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-Dglucopyranose (für Beispiel 22):
a) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-ß-D-qlucopyranosid
Man verfährt analog wie unter Bc) beschrieben, unter Verwendung von (R)3-Tetrade canoyloxytetradecansäure als Acylierungsrnittel und Toluol/Essigester (98/2) als Laufmittelgemisch. Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,75
b) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyIoxytetradecanoyl]-Dglucopyranose
Man verfährt analog wie unter Bd) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Toluol/Essigester (15/1) als Laufmittelgemisch ergibt die Titelverbindung. Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,25
I) Synthese der UDP-2,3-diacyI-hexosen
1,4 g Uridin-5'-phosphoromorpholidat.N,N'-Dicyclαhexylcarboxamidinsalz werden in 25 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und durch zweimaliges Eindampfen und Wiederauflösen in je 25 ml trockenem Pyridin getrocknet. Zu dieser Lösung gibt man eine auf die gleiche Weise vorbehandelte Lösung von 1 g eines 2,3-Diacyl-hexose-1-phosphates in 25 ml Pyridin und läßt 24 Stunden bei 37° stehen. Das Reaktionsgemisch wird mit Eis gekühlt. Dann werden 50 ml Chloroform und 12 ml 90 % Ameisensäure zugegeben. Diese Lösung wird auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und unumgesetztes Ausgangsmaterial mit Chloroform/Pyridin/90 % Ameisensäure (30/30/7) eluiert. Die Säule wird mit Chloroform/Methanol (9/1) pyridinfrei gewaschen und anschließend wird das UDP-Derivat mit Chloroform/Methanol/Wasser (66/33/4) eluiert. Von der Peakfraktion wird Chloroform und Methanol im Vakuum abgedampft und die wäßrige Suspension filtriert. Der Niederschlag wird in 100 ml Tetrahydrofuran/Wasser (2/1) gelöst und 2 Stunden mit Dowex AG50WX8 (Trishydroxymethylaminomethan-Form) gerührt. Der Iαnentauscher wird abfiltriert, der Großteil des Tetrahydrofurans abgedampft und die wäßrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird ohne weitere Reinigung im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt.
Analog wie unter I) beschrieben können die Verbindungen der Formel II, ausgehend von den entsprechenden Verbindungen der Formel III, erhalten werden.
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000057_0002

Claims

Patentansprüche:
1. Neue Saccharide der Formel
Figure imgf000050_0001
worin R'1, R'2, R'3 und R'4 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Maßgabe, daß a) mindestens einer der Substituenten R'1 , R'2, R'3 und R'4 eine Acylgruppe bedeutet und b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen, α) R'1 und R'2 nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeuten, wenn R'3 und R'4 gleich sind und für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder R'4 für (R)-3-Dodecanoyloxytetradecanoyl und R'3 für Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen, ß) R'2 nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn R'1, und R'3 für Wasserstoff und R'4 für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl stehen, und γ) R'3 nicht die -(CO)2.CH2.(CHOH)4.CH2OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen, in freier Form und in Form ihrer Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung von Sacchariden der Formel
Figure imgf000050_0002
worin W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen und R1 , R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wassserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R1 , R2, R3 und R4 eine Acylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel
II
Figure imgf000051_0001
worin W und Z obige Bedeutung besitzen, R'3 und R"4 die gleiche Bedeutung wie R3 und R 4 außer Wasserstoff besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der Formel
III
Figure imgf000051_0002
worin Y und X obige Bedeutung besitzen und R"1 und R"2 die gleiche Bedeutung wie R1 und R2 besitzen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Stubstituent R"1 und/oder R"2 nicht Wasserstoff bedeutet, enzymatisch kondensiert und gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Verseifung unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für Sauerstoff stehen, R1 , R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten oder gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Acylamidasereaktion unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für die Iminogruppe stehen, R1 , R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten.
3. Neue Saccharide der Formel
III
Figure imgf000052_0001
worin R"2 und R"2 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und
a) Y für O und X für NH stehen, wobei jedoch, α) wenn R"1 (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, R"2 nicht für (R)3-Hydroxytetradecanoyl oder (R)-3-Hexadecanoyloxytetradecanoyl steht, ß) R"1 nicht für Wasserstoff steht, und γ) R"1 und R"2 nicht gleichzeitig für die Acetyl- oder -CO.(CH2)10.CH3-Gruppe stehen, b) Y für O und X für O und c) Y für NH und X für O stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten R"1 und R"2 für Acyl steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Susbstituent R"1 oder R"2 nicht Wasserstoff bedeutet.
4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel
III
Figure imgf000052_0002
worin R"1 und R"2 gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und a) Y für O und X für NH, b) Y für O und X für O und c) Y für NH und X für O stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten R1 und R2 für Acyl steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Susbstituent R"2 oder R"2 nicht Wasserstoff bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel
lIla
Figure imgf000053_0001
worin R"1 und R"2 obige Bedeutung besitzen und entweder X' und Y' für Sauerstoff oder Y' für die Iminogruppe und X' für Sauerstoff stehen, in Verbindungen der Formel
IV
Figure imgf000053_0002
worin R"1 , R"2 , X' und Y' obige Bedeutung besitzen und R für eine Schutzgruppe steht, die ungeschützte OH-Gruppe zu einem geschützten Phosphatester umsetzt oder b) zur Herstellung von Verbindungen der Formel
IIIb
Figure imgf000054_0001
worin R"1 und R"2 obige Bedeutung besitzen, Verbindungen der Formel R
IIIc
Figure imgf000054_0002
worin R"2 und R obige Bedeutung besitzen und R' für eine Schutzgruppe steht, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.
5. Eine chemische therapeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Verdünnungs- oder Trägermittel, enthält.
6. Eine chemische therapeutischs Zusammensetzung, die eine Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Verdünnungs- oder Trägermittel, enthält.
7. Eine Methode zur Beeinflussung der antimikrobiellen Resistenz, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder in Form eines chemo therapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
8. Eine Methode zur Beeinflussung der antimikrobiellen Resistenz, dadurch gekennzeichnet, daß man dam Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder in Form eines chemotherapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
9. Eine Methode zur Verhinderung der Endotoxinschocks, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder in Form eines chemotherapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
10. Eine Methode zur Verhinderung der Endotoxinschocks, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder in Form eines chemotherapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
11. Eine Methode zur Behandlung maligner Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder in Form eines chemαtherapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
12. Eine Methode zur Behandlung maligner Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kranken eine wirksame Menge einer Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder in Form eines chemotherapeutisch verträglichen Saäureadditionssalzes verabreicht.
13. Eine Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalze zur Verwendung als
Pharmazeutikum.
14. Eine Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalze zur Verwendung als Pharmazeutikum.
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