AT387780B

AT387780B - Verfahren zur herstellung neuer saccharide

Info

Publication number: AT387780B
Application number: AT901786A
Authority: AT
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1986-06-24
Filing date: 1986-06-24
Publication date: 1989-03-10
Also published as: ATA901786A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel
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worin Rl und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Acylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH oder Acyloxy substituiert sein kann, stehen und entweder X und Y für Sauerstoff, oder X für die Iminogruppe und Y für Sauerstoff stehen.

In der WO-A1-84/04526 werden Verbindungen beschrieben, worin X für Sauerstoff und Y für die Iminogruppe stehen, insbesondere Lipid X und Lipid Y.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel
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ester, umsetzt und anschliessend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel (II) in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel,
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und dann Dibenzylphosphorchloridat zugibt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Endprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die freien OH-Gruppen des Phosphatrestes können ebenfalls geschützt sein, z. B. durch Benzyl ; diese Schutzgruppen können anschliessend hydrogenolytisch abgespalten werden. Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Methoden ausgeführt werden. Beispielsweise wird eine Schutzgruppe wie üblich sauer abgespalten, z. B. mit einer wässerigen Säure (Ionenaustauscher), oder hydrogenolytisch.

Die Ausgangsverbindungen der Formel (II) sind neu und können nach folgenden Formelschemata erhalten werden :

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Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formel (II). Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufes unverändert, d. h., ausgehend von R- bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R- bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.

Die Ausgangsverbindungen sind entweder bekannt oder analog zu bekannten Verfahren bzw. wie im Beispiel beschrieben, herstellbar.

Die Verbindungen der Formel (I) besitzen immunstimulierende Aktivität. Diese immunstimulierende Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden :
1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat-Test
Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat.

Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmass dieser Abspaltung wird photometrisch erfasst, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0, 01 bis 0, 1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestilleta sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei
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10 min Inkubation bei 370C mit 200 fil Substrat versetzt. Nach weiteren 3 min Inkubation wird die Reaktion mit 200 111 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen.

Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E. U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.

2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus
Der Test erfasst die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin- (GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i. p. 8 mg GalN, gelöst in 0, 5 ml PBS, und 0, 1 gag LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0, 2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 5 bis 9 h (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 [1979] 5939 bis 5943).

An Stelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt an Hand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD 50 mittels der Spearman-Kärber-Methode.

3. Mikrobielle Septikämie in der neutropenischen Maus
Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B-DF.-Mäuse l x200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0, 2 ml Wasser destilliert gelöst, s. c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0, 3 ml) parenteral (vorrangig i. p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i. v.

Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0, 2 ml (Keimzahl pro Maus
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bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet : a) Durchschnittliche Überlebensdauer b) Überlebensrate
Die Verbindungen der Formel (I) zeigen sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus
Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 h bei 37 C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduk-
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dann schnell bei 400 xg für 5 min zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Massgabe, dass nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.

5. Carbon Celarence Test
Das Prinzip des Tests beruht darauf, dass Partikel in einer Grössenordnung von 200 bis 250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wässerige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in vier täglichen Einzeldosen oder einmal 24 h vor Testbeginn i. p. oder s. c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruss wird mit einer l% igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt.

Jede Maus erhält 0, 2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3,6, 9,12 und 15 min nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 il Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml destilliertem Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt.

Anschliessend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus
Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0, 025 ml (z. B. 1 x 106 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ l/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0, 1 ml) i. p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i. p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0, 1 ml (z. B.

1, 3 x 105 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ l/Maus) infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet : a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ) b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ) c) Durchschnittliche Überlebensdauer d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel (I) zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i. p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor)
CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B6 D. H. Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay an Hand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus BeD, F. Mäusen gemessen (D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier ; T. Mosmann, J. Immunol.

Methods 65,55 bis 63 [1983] ; L. M. Green et al., J. Immunol. Methods 70,257 bis 268 [1984]).

Verbindungen der Formel (I) induzieren in unterschiedlich starkem Ausmass CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.

8. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)
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mär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat"elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 h inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C3H/HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 h zur Proliferation angeregt, die duch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird (J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136,128 bis 142 [1972] ; J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50,71 bis 81 [1980]).

Substanzen der Formel (I) besitzen in unterschiedlichem Masse (konzentrationsbezogen 0, 1 bis 50 lig/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.

9. Induktion einer LPS- (Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)
Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formel (I) konnte bereits nach einmaliger i. p. Verabreichung von je 0, 25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-Challenge in einer Dosis von 0,01 lug LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i. p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel (I) auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE -und PGF. -Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Me aus der NMRI-Maus wurden 24 h mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert.

Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 h mit LPS bzw.

1 h mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE2 und PGF 1a nachgewiesen. Dabei
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am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i. p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1, 5 ml Thioglycolat i. p., am Tag 7 wurden Peritoneal-Me gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der"procoagulant activity" (PCA) untersucht.

Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung

der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen M nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Me von B D F-Mäusen in einem Versuchs- 6 2 1 design a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-M 24 h lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert.

Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanem Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingeforenen und ultrabeschallten M#-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermassen gezeigt werden:B.D.F-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1, 5 ml Thioglycolat i. p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-M# gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 x 106 /ml Zellen eingestellt und 24 h lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt.

Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninachen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla Kaninchen am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i. v. bzw. i. p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40,20, 10,5, 2, 5 und zig LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 Ilg LPS/kg i. v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel (I) auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte :
1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF)
Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF1 -Mäusen (zirka 10 bis 13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1 x 105 Zellen/ml in Medium (RPMI 1640 + 1% Pen/Strep (5000 U/ml) + 1% Glutamin) verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 bis 0, 1 Ilg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stufen bei 37 C/5% C02 inkubiert.

Nach Filtration durch 0, 45 um Filter werden
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vorkultiviert (37 C/5% C02 ), mit 100 111 der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 il Actinomycin D (8 gg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 h bei 37 C/5% C02 inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.

2. B16F1 Melanom-Test
B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von
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Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B6 D2 Fl-Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intra-

peritoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemässen Substanzen der Formel (I) immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurden verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt.

Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formel (I) können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel (I) sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit andern spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist.

Im speziellen sind Verbindungen der Formel (I) indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen auf Grund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen.

Die Verbindungen der Formel (I) sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und andern malignen Tumoren. Ausserdem eignen sich die Verbindungen der Formel (I) für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen zirka 0, 1 und zirka 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen zirka 0, 025 und zirka 35 mg Substanz der Formel (I), wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel (I), wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.

Auf Grund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel (I) auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0, 5 und 100 mg, vorzugsweise zirka 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später, vorteilhaft.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel (I), können gemäss galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden.

Für diesen Verwendungszweck eignen sich besonders die 3-Deoxy-2-0- [ (R)-3-hydroxytetra- decanoyl] -3- [ (R) -3-hydroxytetradeconylamido] -1-0-phosphono-a -D-glucopyranose und die 2, 3-Di- - 0- [ (R)-3-hydroxytetradecanoyl] -1-0-phosphono-a-D-glucopyranose.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel 1 : 2, 3-Di-0-[ (R) -3-hydroxytetradecanoyl]-1-0-phosphono-a-D-glucopyranose a) 4, 6-0-Benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl] -1-0-dibenzylphosphono- - a-D-glucopyranose
Zu einer auf-70 C gekühlten Lösung von 1 g 4, 6-0-Benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-benzyl- oxytetradecanoyl]-D-glucopyranose in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 0, 9 ml 1, 6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 min wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 420 g Dibenzylphosphorchloridat in 4 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 min bei-70 C gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 4/4/1).

Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0, 65

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Palladium auf Aktivkohle zirka 5 h bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0, 65
Beispiel 2 : 1-0-Phosphono-2, 3-di-0- [ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl a-D-glucopyrano- se a) 4, 6-0-Benzyliden-l-0-dibenzylphosphono-2, 3-di-0- [ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]- - a-D-glucopyranose
Man verfährt analog wie im Beispiel 1 a) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Äther/Hexan (1/1) als Laufmittelgemisch gibt die Titelverbindung.

Rf (Äther/Hexan = 1/1) = 0, 5.
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3-di-0- [ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glucopyranosedecanoyl]-a-D-glucopyranose werden in 47 ml Tetrahydrofuran gelöst und 1 h mit 230 mg Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand über Kieselgel (Chloroform/Methanol/Wasser/Triäthylamin = = 15/10/2/0, 2) chromatographiert.

Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft ; man erhält die Titelverbindung als Di-Triäthylaminsalz.
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Zu einer auf-70 C gekühlten Lösung von 4, 85 g 2-0- [ (R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]- - 3- [ (R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4, 6-0-isopropyliden-D-glucopyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 8 ml 1, 6m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 min wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3, 8 g Dibenzylphosphorochloridat in 10 ml Benzol zugetropft. Es wird nach 10 min bei -700 gerührt, 0, 3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt.

Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3).

Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0, 58. b) 3-Deoxy-2-0- [ (R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3- [ (R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1- - 0-phosphono-ot-D-glucopyranose
Eine Lösung von 980 mg 2-0- [ (R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3- [ (R)-3-benzyloxytetra- decanoyiamido]-3-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-4, 5-0-isopropyliden-ot-D-glucopyranose in 100 ml Tetrahydrofuran wird etwa 1 h mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, Wasser (10 ml) und Dowex AG50WX8 H zugegegen und das Gemisch bis zur vollständigen Abspaltung der Isopropylidengruppe bei Raumtemperatur gerührt. Der Ionentauscher wird abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und Tetrahydrofuran und Wasser am Rotavapor abgedampft.

Der Rückstand wird in Methanol gelöst und über Sephadex LH 20 chromatographiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0, 65.

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spiel 1) a) Trichloräthyl-2, 3, 4, 6-tetra-0-acetal-ss -D-glucopyranosid
Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 2, 34 g Penta-O-acetyl-D-glucopyranose in 9 ml Trichloräthanol gibt man 0, 9 ml Bortrifluoridätherat und hält das Reaktionsgemisch 4 h bei dieser Temperatur. Danach wird die Lösung auf 100 ml Eiswasser gegossen, mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach chromatographischer Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1) kristallisiert das Produkt aus Essigester/Petroläther.

Fp. 138 bis 140
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0, 67 b) Trichloräthyl-4, 6-0-benzyliden- ss-D-glucopyranosid
7, 13 g Trichloräthyl-2, 3, 4, 6-tetra-0-acetyl-ss-D-glucopyranosid werden in einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und mit einer Natriummethanolatlösung (60 mg Natrium in 26 ml Methanol) versetzt. Nach 2 h bei 00 wird mit Dowex AG 50 WX8 H+ neutralisiert, der Ionentauscher abfiltriert und die Lösungsmittel am Rotavapor entfernt. Der Rückstand wird in 60 ml Benzaldehyd gelöst, 4, 1 g Zinkchlorid werden zugegeben und das Gemisch 10 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird auf Eiswasser gegossen, mit Äther extrahiert, die Ätherlösung getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft.

Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1).

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0, 60 c) Trichloräthyl-4, 6-0-benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl] - ss -D-glucopy- ranosid
Zu einer auf 0 gekühlten Lösung von 800 mg Trichloräthyl-4, 6-0-benzyliden- ss -D- - glucopyranosid, 1, 4 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 20 mg Dimethylaminopyridin in 10 ml Methylenchlorid werden 930 mg Dicyclohexylcarbodiimid zuzgegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 40 gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Hexan/Toluol/Essigester (12/5/1) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittel chromatogra- phiert.

Rf (Hexan/Essigester = 5/1) = 0, 52
EMI9.3

6-0-Benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranose- D-glucopyranosid werden in 50 ml eines Gemisches von Dioxan/Eisessig (1/1) gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit Zn-Staub versetzt, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Danach wird filtriert, eingedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 2/5/1).

Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0, 32
B) 4, 6-0-Benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranose (für Bei- spiel 2) a) Trichloräthyl-4, 6-0-benzyliden-2, 3-di-0- [ (R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl ] - - ss-D-glucopyranosid
Man verfährt analog wie unter A c) beschrieben, unter Verwendung von (R)-3-Tetradecanoyloxytetradecansäure als Acylierungsmittel und Toluol/Essigester (98/2) als Laufmittelgemisch.

Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0, 75
EMI10.1
an Kieselgel mit Toluol/Essigester (15/1) als Laufmittelgemisch ergibt die Titelverbindung.

Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0, 25
C) 2-0- [ (R)-3-Benzyloxytetradecanoyl] -3- [ (R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4, 6-
EMI10.2

1,02 g 3-Azido-3-desoxy-D-glucopyranose werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, 940 (il Dimethoxypropen und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure. Monohydrat zugegeben und die Lösung zirka 2 h bei Raumtemperatur gehalten. Die p-Toluolsulfonsäure wird mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Chloroform/Methanol = 9/1).

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,64
EMI10.3
und 310 mg Imidazol in 25 ml trockenem Methylenchlorid gibt man 345 mg t-Butyldimethylsilylchlorid und rührt 2 h bei Raumtemperatur. Danach wird Imidazolhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat zweimal mit je 10 ml Wasser geschüttelt, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft.

Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 12/1).

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0, 6
EMI10.4
[ (R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3- [ (R)-3-benzyloxytetradeca-- ss-D-glucopyranosid in 100 ml Methanol wird 2 h mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird zusammen mit 5, 35 g 3 (R)-Benzyloxymyristinsäure und 100 mg Dimethylaminopyridin in 50 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und 4, 1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach zirka 3 h bei Raumtemperatur wird filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 9/1).

Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0, 42.
EMI10.5
pyranose in 100 ml absolutem Tetrahydrofuran tropft man 5,2 ml einer Im Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu. Man lässt auf -400 erwärmen und hält bei dieser Temperatur, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist (zirka 30 min). Danach gibt man 5 ml Methanol zu, lässt auf Raumtemperatur kommen und dampft ein. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase wird getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel abgedampft. Chromatographische Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 3/1) ergibt die Titelverbindung als Anomerengemisch.

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0, 48 und 0, 52.

Claims

PATENTANSPRUCHE : Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel EMI11.1 worin Rl und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Acylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH oder Acyloxy substituiert sein kann, stehen und entweder X und Y für Sauerstoff, oder X für die Iminogruppe und Y für Sauerstoff stehen, EMI11.2 EMI11.3 EMI11.4 diphenylester, Chlorphosphonsäuredi-(4-nitrophenyläthyl)-ester oder Pyrophosphorsäuretetrabenzylester, umsetzt und anschliessend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.