CH672789A5 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Saccharide und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Die Erfindung betrifft neue Saccharide der Formel

HO—

45

50

\_

HO_/

\_/

\. \

■0 — CH.

\

OH

w

1

Z

1

l

R'

i

R<

3

4

HO-.'

■—O.P.

/ \

\ / pOH

i I O

y x

1 1

*2 I

worin R[', R2', R3' und R4' gleich oder verschieden sind und 55 jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Massgabe, dass a) mindestens einer der Substituenten Ri', R2', R3' und R4' 60 eine Acylgruppe bedeutet und,

b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen, a) Ri' und R2' nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradeaanoyl bedeuten, wenn R3' und R4' gleich sind und für (R)-3-Hydroxyte-tradecanoyl oder R4' für (R)-3-Dodecanoyloxytetradecanoyl und 65 R3' für Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen,

ß) R2' nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn Rj' und R3' für Wasserstoff und R4' für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl stehen, und

3

672 789

y) R3' nicht die -(CO)2-CH2-(CHOH)4-CH2OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze.

Mit dem Disclaimer a) werden Verbindungen ausgeschlossen, die teilweise bekannt sind und ausserdem kein Interesse besitzen, mit dem Disclaimer b) werden ebenfalls Verbindungen ausgeschlossen, die in der Literatur beschrieben sind, allerdings nicht durch enzymatische, sondern durch chemische Synthese gewonnen sind.

Man gelangt zu den Verbindungen der Formel I in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, indem man eine Verbindung der Formel

HO—,

HO—'

\ /

\

\ /'

— O.P.

S

0H OH

0 - P - ü

*

o

II

w

R3

worin R3', R4', W und Z obige Bedeutung besitzen, und U für einen Uridinrest steht, mit einer Verbindung der Formel

HOHO-.'

\ /

\ / \—-O. p„

OH

III

\_/ iN«

I 1

T *

R" 1

R» 2

gleich, und bedeuten Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH, Acetoxy oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert 5 sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel I können daher Ri, R2, R3 und R4 in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formeln II, III und IV. Bei den hierin beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration io während des Reaktionsablaufs unverändert, d.h., ausgehend von R- bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R- bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin Ri, R2, R3 und R4 für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen. 15 Weiter bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin, wenn Ri, R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten, Y, X, W und/oder Z für Sauerstoff steht.

Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der 20 Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)-aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.

Die Verbindungen der Formel II können aus den Verbindungen der Formel III durch Umsetzung mit aktiviertem Uridin-25 5'-monophosphat nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel III sind neu und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindungen.

Verbindungen der Formel III können erhalten werden, indem 30 man a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel

HO

worin R^' und R2", X und Y die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung besitzen, enzymatisch kondensiert und gewünschten-falls die erhaltenen Verbindungen einer Verseifung unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/ oder W für Sauerstoff stehen, Rh R2, R3 und/oder R4Wasserstoff bedeuten oder gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Açylamidasereaktion unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für die Iminogruppe stehen, Ri, R2, R3 und/oder R4 Wasserstoff bedeuten, und die so erhaltenen Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.

Mit dem Disclaimer werden Verbindungen ausgeschlossen, die z.B. aus WO 85/4881 oder als Lipid-X und Lipid-Ybekannt sind.

Die enzymatische Kondensation wird beispielsweise in einem gepufferten System, z.B. im Tris-Puffer bei pH 7, und bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, z.B. bei 30 °C, durchgeführt. Als Enzymextrakt kann eine aus gramnegativen Bakterien, vorzugsweise aus E. coli-Stämmen (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]) erhaltene Präparation eingesetzt werden. Bevorzugt sind Stämme, die durch genetische Manipulation zur Überproduktion des gewünschten Enzyms angeregt wurden. Die eventuell anschliessende Verseifung kann nach literaturbekannten Methoden, die Açylamidasereaktion analog wie von C.R. Verret et. al. in J. Biol. Chem. 257/10222 (1982) beschrieben, durchgeführt werden. Aus dem Reaktionsgemisch können die Endprodukte nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.

Ri, R2, R3 und R4 sind gleich oder verschieden, vorzugsweise

HO—

\_

/

\_ Y'

.0 OH

\ O.P.

/

1

lila

R!| R£

worin Rj" und R2" obige Bedeutung besitzen und entweder X' und Y für Sauerstoff oder Y für die Iminogruppe und X' für Sau-50 erstoff stehen, in Verbindungen der Formel

RO-.

\

• —

-O

RO_/

\

\

1

/

mrnm •

I

1

- Y' 1

1

XV

1

*î

R2

. — OH

IV

65

worin r]", R2", X' und Y obige Bedeutung besitzen und R für eine Schutzgruppe steht, die ungeschützte OH-Gruppe zu einem geschützten Phosphateter umsetzt oder

672 789

4

b) zur Herstellung von Verbindungen der Formel

HO — .

\ • '

HO-/ \

°H

■° / \_o.PC

è oh

Illb

/

WH

M

worin Rj" und R2" obige Bedeutung besitzen, Verbindungen der Formel

RO-.

\ —— O • I

/ \ /O.R

RO_/ \-O.P

\ /

INOR'

IIIc

HO

NH"

1

R"

2

worin R2" und R obige Bedeutung besitzen und R' für eine Schutzgruppe steht, acyliert und anschliessend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

Das Verfahren a) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IV in einem unter den

Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z.B. in einem cycli-schen Ether, wie Tetrahydrofuran, löst und bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei - 70 °C, mit Butyllithium in einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, z.B. in Hexan, versetzt und dann 5 Dibenzylphosphorchloridat zugibt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Produkt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die freien OH-Gruppen des Phosphatrestes sind geschützt, z.B. durch Benzyl. Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Methoden ausgeführt 10 werden. Beispielsweise wird eine Schutzgruppe wie üblich sauer abgespalten, z.B. mit einer wässrigen Säure (Ionenaustauscher), oder hydrogenolytisch.

Das Verfahren b) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IIIc in einem unter den 15 Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z.B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicy-clohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefer Temperatur, z.B. bei etwa 4 °C, reagieren lässt. Aus dem 20 Reaktionsgemisch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Anschliessend werden die vorhandenen Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten.

Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allge-25 mein üblichen Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise können beide R zusammen die Benzyliden- oder die Isopropyli-dengruppe bedeuten. Auch als Schutzgruppen des Phosphatrestes können bekannte Schutzgruppen eingesetzt werden, z.B. die Ben-zylgruppe.

30 Die Ausgangsverbindungen der Formel IIIc sind neu und können nach folgendem Formelschema erhalten werden:

ho—

Acylieren

Schützen ro_.

\

ro_/ \_oh \ /

V

nhr;

tbdms.o ro—. \

Schützen (Pos. 4+6)

or'

ro_/ \_o.p^

J ^\)R'

TBDMS.c/ \HR!J

ro—

\ n 0R'

•—Q /

ro—j vo.p.,.,

\ / £N0R

/ \ O

ho nhr£

IIIc

5

672

Die Ausgangsverbindungen der Formel IV können nach folgenden Reaktionsschemata erhalten werden, wobei an der jeweiligen Reaktion nichtteilnehmnde OH-Gruppen gegebenenfalls geschützt sein können. In diesen Reaktionsschemata haben die Substituenten folgende Bedeutung:

R,R' Schutzgruppen

R5 beide R5 sind gleich oder verschieden und haben die gleiche Bedeutung wie Ri, R2, R3 öder R4 Ac Acetylgruppe 5 TBDMS tert. Butyldimethylsilyl

1. Herstellung von Verbindungen der Formel IVa

/ \

W //•

\

—0

!_/

\—oh

\

/

/

\

02n n3

AcO—.

\ O

AcO — / \-OAc ho

\—-O

ho—/ \.

\_/ / \

oh

Kon t roXlie^5

'Reduktion ho.

o2N

\

nh.

— 0

ho—/ \ \ / / s nhr

Schützen (Fos. 2) — OH

02n ho

h-n ho

\

•

Jlo

)_/

\

\

/"

/

\

\

HO_/ \

/

R^-HN

V — O

Reduktion nhr

Acylieren

\ — oh

/

•

N

nhr

Entschiitzen (Pos. 2)

\

°2N'j"

y n-

h0-

\

ho—/ \

02n

\ — oh /

\

n-,

Reduktion ho y

\—0

ho / oh

\—/

/ \

nh-

h2N

ho —

x4.

Acylieren s 0

ho-/ oh

\ /

• *

/. \

r5hn ro.

nhr,

ro

Schützen (Pos. 4+6)

\]Lo

/ \_ oh v /

r5hn

\

nhr.

IVa (beide Rg gleich)

HO—..

• 0

ho-/ \_ oh

\ /

/ I N

RgHN NH2

HO— Y Acylieren —O

ho ' \-0h

• ammiM / , \

rj-hn nhr«.

RO I

Vn Schützen (Pos. 4 + 6)

ro—/ \_ oh

\ /

/ \

r5hn nhrs

IVa (beide Rg nicht gleich)

672 789

2. Herstellung von Verbindungen der Formel IVb

6

3. Herstellung von Verbindungen der Formel IVc ho. ho

\

0

/ \ • <

\

I

"N.

/

»•

I

oh"

-oh ro

V Y X — O

/

\

\

/

i

"Ï

N3

OH

Schützen (Pos. 4+6)

—oh ro-

Schützen (Pos. 1)

V— O

RO / \ -O. TBDMS

\ /

i i

N.

ro. ro.

oh

RgHNi

1. Reduktion

2. Acylieren

_/ \-0. TBDMS / \

ro. ro.

or.

\

Entschützen (Pos. 1)

RjHN.

/ \

.-10

\-0H /

*\

ORc

IVb

AcO

\.

ACO / Y

\ /

"—o

/

AcO

OAC

•

0

/

\ /

/ N

AcO

OAC

20

25

HO 1

\_/

i i ho o.h

• 1

N._Io ro — / \—o.ch.cc1,. \ / 2 3

ho ro

■ OAC

Schützen (Pos. 1)

d.ch2cci3

Entschützen (Pos. 2, 3,

4, 6)

o.ch2ccl3

Schützen (Pos. 4+6)

l l ho ,oh a\j i ro y

Acylieren

35

40

45

R5O I

RO—. Y

\ O

ro / \-o.ch-cc1,

\ / 2 3

• mmmmm

/ . \

or5

Entschützen.(Pos. 1)

0

ro — / \ — oh \ /

/ \

rso ors

IVc

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.

Die Verbindungen der Formeln Ia und III zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:

1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat-Test

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozylenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmass dieser Abspaltung wird photometrisch erfasst, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endoto-xins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1:10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgefuhrt. 100

p.1 Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 jxl Limu-5o lus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37 °C mit 200 ul Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 [il 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leer-55 wert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endo-toxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E.U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Stan-dardendotoxins.

60 2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus

Der Test erfasst die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhal-65 ten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 (ig LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung fuhrt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Nati.

7

672 789

Acad. Sci., USA, 76 (1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe fuhrt,

oder durch Berechnung einer LD50 mittels der Spearman-Kärber-Methode.

3. Mikrobielle Septikämie in der neutropenischen Maus

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B6D2FrMäuse 1 x 200 mg/kg Körpergewicht Cyclophospha-mid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z.B. Pseudomonas aeruginosa A12:l x IO5, E. coli À 120:2 x IO6, Staph. aureus A 113:1 x 106, Candida albicans A124:l x 104). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:

a) Durchschnittliche Überlebensdauer b) Überlebensrate

Die Verbindungen der Formeln Ia und III zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z.B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z.B. staph. aureus) bzw. Hefen (z.B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37 0 C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1 x 106 Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 uMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin (IO-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 jig Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37 ° C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Massgabe, dass nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS iiikubiert werden.

5. Carbon Clearence-Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, dass Partikel in einer Grössenordnung von200-250 À (2,0-2,5 x 10~nm) (z.B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffersche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wässrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruss wird mit einer l%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3,6,9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 |il Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschliessend werden die Here getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Her-pesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z.B. 1 x 106 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Her-pesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z.B. 1,3 x 105 Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die Priif-substanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfalle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:

a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ)

b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ)

c) Durchschnittliche Überlebensdauer d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel Ia und III zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. — 1 und + 6 in der experimentellen HSV-l-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor)

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkzellen, geführt. B6D2FrMäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zell-kulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkzellen aus B6D2F!-Mäusen gemessen [D. Metealf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immu-nol. Methods 65, 55-63 (1983); L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel Ia und III induzieren in unterschiedlich starkem Ausmass CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672 789

8

8. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat «elicited macrophages». Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thy-mozytenkulturen von C3H/HeJ-Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillaüonszähler gemessen wird [J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cel-lular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formeln Ia und III besitzen in unterschiedlichem Masse (konzentrationsbe-zogen 0,1-50 (ig/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.

9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)

Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formeln Ia und III konnte bereits nach einmaliger i.p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-Challenge in einer Dosis von 0,01 ug LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiter besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussimg der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-indu-zierten PGE2- und PGFia-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte:?eritoneal-M0 aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPs bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE2 und PGFia nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE2-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE2-Freisetzung von Maus-Mo nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1,2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-M0 gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE2-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der «procoagu-lant activity» (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen Mo nach LPS-Behandlungen sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPs generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Mo von B6D2FrMäu-sen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw.

mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-Mo 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanem Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten Mo-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendennassen gezeigt werden: B6D2Fr Mäuse wurden am Tag 1,2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tîere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-Mo gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 x 106/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla-Kaninchen am Tag 1,2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i.v. bzw. i.p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40,20,10, 5,2,5 und 1,25 ug LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 ug LPS/kg i.v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.

Weiter besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:

1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis-Faktor (INF)

Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarkmakrophagen werden Knochenmarkzellen von BDFrMäusen (ca. 10—13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1 x 106 Zellen/ml in Medium [RPMI 1640 + 1% Pen/Step (5000 U/ml) + 1% Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 (ig bis 0,1 ug/ml Endkonzentration (1:10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37 °C/5 % C02 inku-biert. Nach Filtration durch 0,45 um Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei - 70 °C eingefroren.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3 x 104 Zellen/ Näpfchen/100 jj.1 über Nacht vorkultiviert (37 °C/5 % C02), mit 100 (j.1 der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1:2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 ul Actinomycin D (8 ug/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37 °C/5% C02 inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Mulüskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.

2. B16F1 Melanom-Test

B16F1 Melanom-Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Tiypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Fla-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

sehe mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezs alt und auf 106/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspen-sior (105 Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B6D2Fi-Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6,-4 und — 1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt,

dass die erfmdungsgemässen Substanzen der Formel Ia und III immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formeln Ia und III können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formeln Ia und III sind somit indiziert, z.B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d.h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formeln Ia und III indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatri-schen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formeln Ia und III sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Marbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Ausserdem eignen sich die Verbindungen der Formeln Ia und III für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z.B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z.B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formeln Ia und III auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Pharmazeutsiche Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäss galenischen Standardverfahren, z.B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft die Verbindungen der Formel I oder III als chemotherapeutisches Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sol672 789

len, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. EDTA bedeutet Ethylendiamintetraessigsäure, DTE steht für 1,4-Dit-hioerythrit, UDP für Uridinphosphat und Tris für Tris(hydroxy-methyl)aminomethan.

Beispiel 1:6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyI]-2,3-di-0[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1 -O-phosphono-a-D-glucopy-ranose

2,03 mg UDP-2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-glu-copyranose und 1,42 mg 2,3-Di-0-[(R)-3-hydroxytetradeca-noyl]-l-0-phosphona-a-D-glucopyranose, beide als Tris-Salze, werden in 10 mM Tris-Puffer, pH 7, mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE gelöst und mit 60 ul Enzymextrakt bei 30° inkubiert.

Dieser Enzymextrakt kann folgendermassen erhalten werden:

E. coli JB1104 wird in L-Broth angezüchtet (Vorkultur +10 ug Ampidllin/ml bei 30° über Nacht; Hauptkultur bei 30° im Schüttelinkubator, ausgehend von OD55o nm = 0>1 bis OD550nm = 1). Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10 800 g geerntet (10 Minuten/40), das Pellet in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,0 + 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE suspendiert und erneut zentri-fugiert (6000 g, 10 Minuen/4°). Anschliessend wird das Pellet in obigem Puffer resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5 x 20 Sekunden/30 Sekunden Pause mit 120 Watt). Nach Zentrifugation (12 000 g, 10 Minuten/4°) zum Abtrennen der Zellreste wird ultrazentrifugiert (150 000 g, 90 Minuten/70). Die oberen 2A des Überstandes werden gewonnen. Diese Fraktion wird einer fraktionierten Ammonsulfatfällung unterzogen. Als Enzympräparation verwendet wird der Bereich von 10-40% Ammonsul-fat. Das so gewonnene Pellet wird in obigem Puffer aufgenommen.

Nach beendeter Reaktion (Reaktionskontrolle über Dünnschichtchromatographie) wird mit Zitronensäure auf pH 2 angesäuert und zentrifugiert. Das Pellet wird in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (65/15/5/2) aufgenommen und über Kieselgel mit dem gleichen Laufmittel chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden gesammelt und eingedampft, bis keine organischen Lösungsmittel mehr vorhanden sind, und der Rest lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Tetrahydrofuran/Wasser (8/2) gelöst und über einen Kationenaustauscher in der Tris-Form in diesem Lösungsmittel in das Tris-Salz überführt, das Tetrahydrofuran abrotiert und der Rückstand lyophilisiert. Alle Rf-Werte werden auf Kieselgelplatten bestimmt.

Rf (in Chloroform/Methanol/Eissgsäure/Wasser = 65/ 25/5/5) = 0,48

Beispiel 2: 6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl] -2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetrade-canoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-glucopyranose

20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoyIa-mido]-l-'0-phosphono-a-D-glucopyranose in 10 mMTris/HCl-Puffer (pH = 7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-a-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH = 7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen einer Enzympräparation (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1% Triton X-100 bei 30° 8 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf 0,1% eingestellt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, in etwa des Ausgangsvolumens im Laufmittel für nachfolgende Chromatographie auf Molekulargewichtstrennung (Sephadex LH 20) gelöst (Laufmittel:

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672 789

Pyridin/Essigsäure/Wasser = 98/1/1) und filtriert. Das Volumen der verwendeten Säule ist etwa 20 x so gross wie das Probenauftragsvolumen. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, im Vakuum eingeengt, in pyrogenfreiem Wasser suspendiert und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wird Triton X-100 durch Digerieren mit Diethylether entfernt. Nach Zentrifu-gation wird das Pellet in einem Gemisch von Chloroform/Methanol (1/1) gelöst, filtriert und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zur wässrigen Suspension dieses Pellets wird die stöchiome-trisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wässrigen 100 mM Lösung zugegeben und erneut lyophilisiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/ 25/5/5) = 0,44

Beispiel 3:6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-l-0-phosphono-2-[(R)3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-a-D-glucopyranose

Je 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1 -0-phosphono-2[(R)-3-tetradeca-noyloxyteradecanoylamido]-a-D-glucopyranose in 10 mMTris/ HCl-Puffer (pH = 7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DIE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3hydroxytetradecanoyla-mido]-l-0-phosphono-a-d-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH = 7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen Enzymextrakt (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1% Triton X-100 bei 30° 48 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf 0,1% eingestellt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, mit Pyridin behandelt und filtriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und mit folgendem Laufmittel (Chloroform/Methanol/Wasser/2-Phenethylpicolonium-bromid = 800/175/22,5/2,5) auf Kieselgel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, und durch Ausschütteln mit 20 mM H3P04 in H20 wird das als Ionenpaarbild-ner dienende 2-Phenethylpicoloniumbromid entfernt. Die organische Phase wird im Vakuum eingeengt, die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wässrigen 100 mM Lösung zugegeben und lyophilisiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/ 25/5/5) = 0,53

Analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I erhalten werden, wobei je nach den eingesetzten Verbindungen der Formel II und III die Enzymmenge so gewählt wird, dass die Reaktion vorzugsweise in etwa 24 bis 48 Stunden abläuft:

Tabelle rj = r2 = r3 = r, = (R)-3-Hydroxytetradecanoyl

Beispiel

W

z

Y

X

Rf

4

O

NH

NH

NH

0,45

5

NH

NH

NH

NH

0,40

6

O

O

O

NH

0,49

7

O

NH

■NH

O

0,39

8

NH

NH

O

NH

0,41

9

O

O

O

O

0,48

Beispiel 10: 6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(Rj-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-1 -0-phosphono-3-0-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-a-Dglucopyranose

10

Man verfährt analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die Utelverbindung.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/ 25/5/5) = 0,50

5

Beispiel 11: 6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyränosyl]-2-ace-tamido-2-deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose io Man verfahrt wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die Utelverbindung.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/ 25/5/5) = 0,32

15 Beispiel 12:6-0-[2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoyla-mido]-ß-D-glucopyranosyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose

5 mg 6-0-[2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2,3-di-0-[(R)-3hydroxytetradecanoyl]-1 -O-phosphono-a-D-glucopy-20 ranose werden in Chloroform/Methanol (1/1) gelöst und mit wässrigem 25%igen Ammoniak ('/3 des Volumens) versetzt und über Nacht stehen gelassen. Nach Reaktionsende wird eingedampft, der Rückstand mit Diethylether zur Entfernung der abgespaltenen Fettsäuren digeriert, der Niederschlag abgesaugt und 25 mit Ether gewaschen. Der Rückstand wird mit Wasser und der berechneten Menge Tris zur Herstellung des Di-Trissalzes gelöst und lyophylisiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 25/ 15/2/4) = 0,45

30

Beispiel 13:2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-](R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-ghico-pyranose a) 4,6-0-Benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-35 2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1 -O-dibenzyl-phosphono-a- D-glucopyranose :

Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 3,9 g 4,6-O-Benzy-liden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1 -O-diben-zylphosphono-a-D-glucopyranose, 2 g (R)-3-Benzyloxytetrade-40 cansäure und 50 mg 4-Dimethylaminopyridin in 20 ml Methylenchlorid werden 2 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in wenig Toluol/Essigester (8/2) aufgenommen und mit dem gleichen 45 Lösungsmittelgemisch chromatographiert. Fp: 96-98° [a]o° = +33,3° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,5

b) 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxyte-5o tradecanoylamido]- 1-O-phosphono-a-D-glucopyranose 4,2 g 4,6-0-Benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noyl]-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1 -O-diben-zylphosphono-a-D-glucopyranose werden in 900 ml Tetrahydro-furan/Wasser (85/15) gelöst und mit 1,5 g 10% Palladium auf 55 Aktivkohle 2 Stunden bei 10 bar und 40° hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Tetrahydrofuran abgedampft und die wässrige Suspension lyophilisiert.

[cx]d = + 28,5° (c = 0,2, Chloroform + 1 Tropfen Methanol)

60 Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/ 75/10/20) = 0,56

Die weitere Reinigung kann folgendermassen durchgeführt werden:

10 g 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-65 hydroxytetradecanoylamido]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose und 1,7 g Tris in 150 ml Methanol werden 12 Minuten bei 45° in einem Ultraschallbad beschallt. Die Suspension wird zentrifugiert und anschliessend wird der klare Überstand vom Pellet dekan

tiert. Zu dieser Lösung gibt man 1,7 g Tris (gelöst in 20 ml Methanol), impft die Lösung an und lässt bei Raumtemperatur kristallisieren. Man erhält das Di-Tris-Salz der Titelverbindung.

Die Mutterlauge wird eingedampft. Der Rückstand und das Pellet werden gemeinsam in einem Gemisch aus 300 ml Chloroform, 600 ml Methanol und 240 ml Wasser (pyrogenfrei) gelöst. Zu dieser Lösung gibt man weitere 300 ml Chloroform und 300 ml 0,1 N Salzsäure, schüttelt vorsichtig und lässt die Phasen trennen. Die Chloroformphase wird abgetrennt und eingedampft. Der Rückstand besteht aus verunreinigter 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -0-phosphono-a-I>glucopyranose.

Die so erhaltene 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradeca-noyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose wird, wie oben beschrieben, mit Tris und Methanol im Ultraschallbad behandelt und zentrifugiert. Die Lösung wird auf eine Sephadex LH 20 Säule aufgegeben und mit Methanol eluiert. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält das Mono-Tris-Salz der Utelverbindung.

5,1 g dieses Mono-Tris-Salzes werden in 40 ml Methanol bei 45° im Ultraschallbad gelöst, eine Lösung von 0,74 g Tris in 10 ml Methanol zugegeben, beimpft und zunächst bei Raumtemperatur und dann bei 4° kristallisieren gelassen. Man erhält weiteres kristallines Di-Tris-Salz der Titelverbindung.

Der Rückstand der Mutterlauge und das Pellet der Zentrifu- • gation können erneut einem Reinigungszyklus zugeführt werden.

Fp: 183-185° (Zersetzung)

[<x]d = +15° (c = 1, Wasser)

Beispiel 14: 3-Deoxy-2-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-gluco-pyranose a) 2-0-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxyte-tradecanoylamido]-3-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-4,6-0-iso-propyliden-a-D-glucopyranose

Zu einer auf — 70° gekühlten Lösung von 4,85 g 2-0-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noylamido]-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-D-glucopyranosein 40 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Dibenzylphosphorochloridat in 10 ml Ben-.zol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei - 70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3). Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58

b) 3-Deoxy-2-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-glucopyranose

Eine Lösung von 980 mg 2-0-[(R)-3-Benzyloxytetradeca-noyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-l-0-diben-zylphosphono-4,6-0-isopropyliden-a-D-glucopyranose in 100 ml Tetrahydrofuran wird etwa 1 Stunde mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, Wasser (10 ml) und Dowex AG50WX8 H+zugegeben und das Gemisch bis zur vollständigen Abspaltung der Isopropylidengruppe bei Raumtemperatur gerührt. Der Ionentauscherwird abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und Tetrahydrofuran und Wasser am Rotavapor abgedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und über Sephadex LH 20 chromatographiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/ 75/10/20) = 0,65

11 672 789

Beispiel 15:2,3-Di-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose a) 4,6-0-Benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noyl]-1 -Odibenzylphosphono-a-D-glucopyranose

5 Zu einer auf — 70° gekühlten Lösung von 1 g 4,6-O-Benzyli-den-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranosein 10 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 0,9 ml 1,6 m Butylli-thium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 420 mg Dibenzylphosphorchloridat in io 4 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei — 70° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 4/4/1).

Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,65 15 b) 2,3-Di-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose

230 mg 4,6-0-Ben2yliden-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytetrade-canoylJ-I-O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose werden in Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mit 80 mg 10% Palla-20 dium auf Aktivkohle ca. 5 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser= 125/ 25 75/10/20) = 0,65

Beispiel 16:2-Deoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-gluco-pyranose

30 a) 4,6-0-Benzyliden-3-0-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-l-0-dibenzyl-phosphono-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

35 Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44

b) 2-Deoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie in Beispiel 13b) beschrieben und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 150-200° (Zers.) 40 Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1; untere Phase) = 0,5

Beispiel 17: 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-l-0-45 phosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-a-D-glucopyranose a) 4,6-0-Benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetra decanoylamido]-a-D-glucopyranose

50 Man verfahrt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 82-95°.

[a® = +24,1° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,7

b) 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]- l-O-

55 phosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

[a]o = +14,3° (c = 1, Tetrahydrofuran/Pyridin) 60 Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,35

Beispiel 18:2-Deoxy-l-0-phosphono-3-0-tetradecanoyl-2-tetra-decanoylamido-a-D-glucopyranose 65 a) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-a-D-glucopyranose

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäure und mit Toluol/Essigester

672 789

(4/1) als Lösungmittelgemisch, und erhält die Utelverbindung vom Fp: 123-129°

Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,6 b) 2-Deoxy-l-0-phosphono-3-0-tetradecanoyl-2-tetradeca-noylamido-a-D-glucopyranose :

Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/ 75/10/20) = 0,65

Beispiel 19:2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-l-0-phosphono-3-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glucopyranose:

a) 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-3-0-[(R)-3-tetra-decanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von (R)-3-Tetradecanoyloxytetradecansäure und mit Toluol/Essigester (4/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 89-90°.

Md = +30,9° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1) Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,5

b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-l-0-phosphono-3-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glu-copyranose:

Man verfahrt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben. Das Lyophilisat wird in Methanol gelöst und mit dem gleichen Lösungsmittel über Sephadex LH 20 chromatographiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/ 25/5/5) = 0,32

Beispiel 20:2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-

1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-cc-D-glucopyranose a) 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-3-0-tetradecanoyl-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäure und Toluol/Essigester (3/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 125,5-126,5°.

Rf (Toluol/Essigester = 3/2) = 0,6

b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]- l-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-a-D-glucopyranose:

354 mg 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-3-O-tetradecanoyl-a-D-glucopyranose werden in 30 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mit 200 mg Palladium auf Aktivkohle 10 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan auf pH 7,5 gebracht. Das Tetrahydrofuran wird am Rotavapor abgedampft und die wässrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird noch zweimal mit Ether digeriert und dann getrocknet.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/ 75/10/20) = 0,6

Beispiel 21:2-Acetamido-2-deoxy-3-0[(R)-3-hydroxytetradeca-noyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose:

a) 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyloxytetra-decanoyl]-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose Eine Lösung von 3,55 g 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-

2-deoxy-l-O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose und 2,1 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure in 15 ml Methylenchlorid wird auf 0° gekühlt und mit 1,32 g Dicyclohexylcarbodiimid und p-Dimethylaminopyridin versetzt. Nach 2 Stunden bei dieser Temperatur ist die Reaktion beendet. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, eingedampft und einmal mit Methylenchlorid/Methanol (50/1) und ein zweites Mal mit Toluol/Essigester (2/1) über Kieselgel chromatographiert.

12

Rf (Chloroform/Methanol = 20/1) — 0,7

b) 2-Acetamido-2-deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradeca-noyl]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose:

2,08 g 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyl-5 oxytetradecanoyl]-2-deoxyl-1 -O-dibenzylphosphono-a-D-gluco-pyranose werden in Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und 3 Stunden mit 1 g 10% Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Ritrat erst eingedampft und dann lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Methanol io gelöst, mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan neutralisiert und mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.

[a]o = +43,3° (c = 1, Methanol)

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/ 75/10/20) = 0,4

15

Beispiel 22: l-0-Phosphono-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyloxyte-tradecanoyl]-a-D-glucopyranose a) 4,6-O-Benzyliden-1 -0-dibenzylphosphono-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glucopyranose

20 Man verfahrt analog wie im Beispiel 15a) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Ether/Hexan (1/1) als Laufmittelgemisch gibt die Utelverbindung.

Rf (Ether/Hexan = 1/1) = 0,5

b) l-0-Phosphono-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetrade-25 canoyl]-a-D-glucopyranose

470 mg 4,6-O-Benzyliden-1-O-dibenzylphosphono-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-a-D-glucopyranose werden in 47 ml Tetrahydrofuran gelöst und 1 Stunde mit 230 mg Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird 30 der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand über Kieselgel (Chloroform/Methanol/Wasser/Triethyl-amin = 15/10/2/0,2) chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft; man erhält die Utelverbindung als Di-Triethylaminsalz. 35 Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/ 25/5/5) = 0,5

Beispiel 23:2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-40 [(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-gluco-pyranose a) 4,6-0-Benzyliden-3-0-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(S) -3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1 -O-dibenzyl-phosphono-a-D-glucopyranose

45 Man verfährt analog wie im Beispiel 13a) beschrieben.

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44

b) 2-Deoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1 -O-phosphono-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie im Beispiel 13b) beschrieben, so Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1, untere Phase) = 0,5

Zur Charakterisierung der Verbindungen wurde Fast Atom Bombardement (FAB) Massenspektroskopie (negativer Modus) durchgeführt (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]).

Beispiel

Masse

Beispiel

Masse

1

1325

7

1324

2

1324

8

1323

3

1534

9

1326

4

1323

10

1292

5

1322

11

1140

6

1325

12

647

NMR-Spektren

Beispiel 1 (C5D5N)

9.82 (d, 9 Hz, 1H); 6.65 (dd, 8,8 u. 3,5 Hz, 1H); 6.25 (t, 10 Hz,

13

672 789

1F); 5.83 (t, 10 H, 1H); 5.63 (d, 8,8 Hz, 1H); 5.35 (dd, 10 u. 2,5 K, lH);4.0(t, 10 Hz, 1H); 3.83 (m 1H).

Beispiel 13 (CD3OD)

5.49 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.24 (dd, 9,5 u, 10,5 Hz, 1H); 4,17 (ddd, 2,5,3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.0 (m, 3H); 3.90 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.75 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.71 (s, Tris); 3,63 (t, 10 Hz, 1H).

Beispiel 14 (CDC13/CD30D)

5.77 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, IH); 4.77 (ddd, 2,5, 3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.38 (dd, 9,5 u. 10,5 Hz); 3.8 bis 4.1 (m, 4H); 3.73 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.53 (t, 10 Hz, IH).

Beispiel 15 (CD3OD)

5.71 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.48 (t, 10 Hz, 1H); (ddd, 2,4 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.05 (m, 3H); 3.86 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.7 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.67 (s, Tris); 3.58 (t, 10 Hz, 1H).

Beispiel 16 (CDa3/CD3OD)

5.58 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 4.19 (dt, 3 u. 10 Hz, 1H); 3.8 bis 4.1 (m, 4H); 3.7 (s, Tris u. dd, 1H); 3.46 (t, 10 Hz, 1H).

Beispiel 17 (CDCl3/CD3OD)

5.46 (dd, 3 u. 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 5.17 (m, 1H); 4.19 (dt, 3 u. 10 Hz, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 3H); 3.7 (s, Tris); 3.65 (dd, IH); 3.51 (t, 10 Hz, 1H).

Beispiel I8/Stufe a) (geschützt) (CDC13)

7.38 (m, 15H); 5.70 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.63 (d, 9,5 Hz, 1H);

5.50 (s, 1H); 5.26 (t, 10 Hz, 1H); 5.08 (m, 4H); 4.38 (m, 1H);

4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.73 (t, 10 Hz, 1H); 3.69 (t, 10 Hz, 1H); 2.29 (m, 2H); 1.89 (m, 2H).

Beispiel 19/Stufe a) (geschützt) (CDC13)

7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.34 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.29 (t, 10 Hz, 1H); 5.14 (quintett, 6 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.51 u. 4.41 (AB, 12 Hz, 2H); 4.41 (m, 1H); 4.08 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.95 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.58 u. 2.47 (ABX, 5,5, 7,5 u. 15,5 Hz, 2H).

Beispiel 20/Stufe a) (geschützt) (CDC13)

7.2 bis 7.45 (m, 20H); 6.29 (d, 9 Hz, 1H); 5.74 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.30 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.52 u. 4.42 (AB, 11 Hz, 2H); 4.44 (m, 1H); 4.03 (dd, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.94 (dt, 5 u. 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.15 bis 2.35 (m, 4H).

Beispiel 21/Stufe a) (geschützt) (CD3OD)

5.47 (dd, 3,5 u. 7,5 Hz, 1H); 5.23 (dd, 9,5 u. 10,5 Hz, 1H); 4.18 (ddd, 2,5,3,5 u. 10,5 Hz, 1H); 3.90 (m, 3H); 3.85 (dd, 2 u. 12 Hz, 1H); 3.72 (dd, 5,5 u. 12 Hz, 1H); 3.68 (s, Tris); 3.61 (t, 10 Hz, 1H); 1.94 (s, 3H).

Beispiel 22/Stufe a) (geschützt) (CDC13)

7.3 bis 7.45 (m, 15H); 5.92 (dd, 3,5 u. 6,7 Hz, 1H); 5.60 (t, 9,5 u. 10 Hz, 1H); 5.48 (s, 1H); 5.02 bis 5.22 (m, 6H); 4.95 (ddd, 2,5, 3,5 u. 9,5 Hz, 1H); 4.10 (dd, 4,5 u. 10 Hz, 1H); 3.96 (ddd, 5,9 u. 10 Hz, 1H); 3.67 (t, 9,5 Hz, 2H); 2.60 (m, 2H); 2.38 (d, 6,5 Hz, 2H); 2.24 (t, 7,5 Hz, 2H); 2.12 (t, 7,5 Hz, 2H).

Beispiel 23/Stufe a) (geschützt) (CDC13)

7.2 bis 7.42 (m, 25H); 6.49 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 u. 6 Hz, 1H); 5.45 (s, 1H); 5.35 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.54 u. 4.40 (AB, 11 Hz, 2H); 4.47 u. 4.36 (AB, 11 Hz, 2H); 4.45 (m, 1H);

3.9 bis 4.1 (m, 2H); 3.6 bis 3.8 (m, 4H); 2.58 (dd, 6,5 u. 15,5 Hz, 1H); 2.34 (dd, 6 u. 15,5 Hz, 1H); 2.2 (m, 2H).

Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermassen erhalten werden:

A) 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose(für Beispiel 13,19 und 20)

a) 2-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-gluco-pyranose

Fin Gemisch von 5,4 g D-Glucosamin-Hydrochlorid, 10,8 g N-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyloxy]succinimid und 5 ml Diiso-propylethylamin in 25 ml absolutem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird weitgehend abgedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus 150 ml Chloroform, 300 ml Methanol und 120 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von weiteren 150 ml Chloroform und 150 ml Wasser trennt man die untere Phase ab und wäscht sie noch zweimal mit je einer oberen Phase aus 100 ml Chloroform, 100 ml Methanol und 90 ml Wasser. Die Lösung wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt.

Für analytische Zwecke wird eine geringe Menge Rohprodukt chromatographisch gereinigt (Toluol/Ethanol = 9/1). Fp: 150-158°.

[a]r? = + 53° (c = 1, Dimethylformamid) Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,3

b) 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-D-glucopyranose

Eine Lösung von 5,83 g 2-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-D-glucopyranose, 3 g Benzaldehyddimethylace-tal und 500 mg p-Toluolsulfonsäure. Monohydrat in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Grossteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml Methylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165°.

[cc]d = + 5,5° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,2

c) 4,6-0-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose

Zu einer auf — 70° gekühlten Lösung von 4,85 g 4,6-O-Ben-zyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-gluco-pyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran wird 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Dibenzylphosphorochlori-dat in 10 ml Benzol zugetropft Es wird noch 10 Minuten bei — 70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3). Fp: 102-105°

[a]o = +31,7° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32

B) 4,6-0-Benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noyl]-D-glucopyranose (für Beispiel 15)

a) Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acedtyl-ß-D-glucopyranosid Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 2,34 g Penta-O-acetyl-

D-glucopyranose in 9 ml Trichlorethanol gibt man 0,9 ml Bortri-fluoridetherat und hält das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei dieser Temperatur. Danach wird die Lösimg auf 100 ml Eiswasser gegossen, mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Natriumhydrogencarbonatlö-sung und 50 ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getroeknet und eingedampft. Nach chromatographischer Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1) kristallisiert das Produkt aus Essig-ester/Petrolether.

Fp: 138-140°

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,67

b) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-ß-D-glucopyranosid

7,13 g Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosid werden in einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und mit einer Natriummetha-nolatlösung (60 mg Natrium in 26 ml Methanol) versetzt. Nach 2 Stunden bei 0° wird mit Dowex AG 50 WX8 H+ neutralisiert, der Ionentauscher abfiltriert und die Lösungsmittel am Rotavapor

5

to

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672 789

entfernt. Der Rückstand wird in 60 ml Benzaldehyd gelöst, 4,1 g Zinkchlorid werden zugegeben und das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird auf Eiswasser gegossen, mit Ether extrahiert, die Etherlösung getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1).

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,60

c) Trichlorethyl 4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3-benzyl-oxytetradecanoyl]-ß-D-glucopyranosid

Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 800 mg Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-ß-D-glucopyranosid, 1,4 g ( R) - 3 - B enzyloxyte-tradecansäure und 20 mg Dimethylaminopyridin in 10 ml Methylenchlorid werden 930 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Hexan/Toluol/Essigester (12/5/1) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch chromatographiert.

Rf (Hexan/Essigester = 5/1) = 0,52

d)4,6-0-Ben2yliden-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noyl]-D-glucopyranose

480 mg Trichlorethyl 4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3-ben-zyloxytetradecanoyl]-ß-D-giucopyranosid werden in 50 ml eines Gemisches von Dioxan/Eisessig (1/1) gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit Zn-Staub versetzt, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Danach wird filtriert, eingedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 2/5/1).

Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,32

Q2-0-[(R)-3-Beiizyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetra-decanoylamido]-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-D-glucopyranose (für Beispiel 14):

a) 3-Azido-3-deoxy-4,6-0-isopropyIiden-D-glucopyranose

1,02 g 3-Azido-3-deoxy-D-glucopyranose werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, 940 |il 2-Methoxypropen und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugegeben und die Lösung ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die p-Toluolsulfonsäure wird mit Natriumhydrogencar-bonat neutralisiert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Chloroform/Methanol = 9/1).

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,64

b) tert.-Butyldimethylsilyl-3-azido-3-deoxy-4,6-0-isopropyli-den-ß-D-glucopyranosid:

Zu einer Lösung von 560 mg 3-Azido-3-deoxy-4,6-0-isopro-pyliden-D-glucopyranose und 310 mg Imidazol in 25 ml trockenem Methylenchlorid gibt man 345 mg tert-Butyldimethylsilyl-chlorid und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird Imidazolhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat zweimal mit je 10 ml Wasser geschüttelt, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 12/1).

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6

c) tert.-Butyldimethylsilyl-2-Ó-[(R)-3-benzyloxytetradeca-noyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-ß-D-glucopyranosid

Eine Lösung von 3,1 g tert.-Butyldimethylsilyl-3-azido-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-ß-D-glucopyranosid in 100 ml Methanol wird 2 Stunden mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Ritrat eingedampft. Der Rückstand wird zusammen mit 5,35 g (R)-3-Benzyloxymyristinsäure und 100 mg Dimethylaminopyridin in 50 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und 4,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur wird filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 9/1).

Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,42 d) 2-0-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxyte-tradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-D-glucopyra-nose

Zu einer auf - 60° gekühlten Lösung von 5 g tert.-Butyl-dimethylsilyl-2-0-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyl-oxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-0-isopropyliden-ß-D-gluco-pyranosid in 100 ml absolutem Tetrahydrofuran tropft man 5,2 ml einer 1 m Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu. Man lässt auf — 40° erwärmen und hält bei dieser Temperatur, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist (ca. 30 Minuten). Danach gibt man 5 ml Methanol zu, lässt auf Raumtemperatur kommen und dampft ein. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase wird getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel abgedampft. Chromatographische Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 3/1) ergibt die Utelverbindung als Anomerengemisch. Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,48 und 0,52

D) 4,6-0-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-l-O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose (für Beispiel 16)

a) 2-[(S)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-gluco-pyranose

Man verfahrt analog wie unter Aa) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

Rf (Chloroform/Methanol = 7/1) = 0,37

b) 4,6-0-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie unter Ab) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

[a]i> = - 3,5° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,37

c) 4,6-0-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl-amido]-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie unter Ac) beschrieben und erhält die Titelverbindung.

[a]o = + 39,2° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,46

E) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-1 -0-diben2ylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-cc-D-glucopyranose (für Beispiel 17)

a) 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyla-mido]-D-glucose

Ein Gemisch aus 650 mg D-Glucosamin-Hydrochlorid, 1,9 g N-[(R)-3-Tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]succinimid und 0,5 ml Diisopropylethylamin in 15 ml Dimethylformamid wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand über Kieselgel mit Essigester/Methanol (8/1) als Lösungsmittelgemisch chromatographiert.

[cc]d = + 25° (c = 1, Methanol)

Rf (Essigester/Methanol = 6/1) = 0,5

b) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetra-decanoylamido]-D-glucopyranose

Eine Lösung von 5,83 g 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxyte-tradecanoylamido]-Dglucose, 3 g Benzaldehyddimethylacetal und 500 mg p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat in 200 ml absolutem dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Grossteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml Methylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165°.

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[a]o - - 1,5° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1) Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32 c) 4,6-0-BenzyIiden-2-deoxy-l-0-dibenzyIphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-a-D-glucopyranose

Zu einer auf - 40° gekühlten Lösung von 950 mg 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecano-ylamido]-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 1,25 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird eine Lösung von Dibenzylphosphorochloridat in Benzol zugetropft und noch weitere 5 Minuten bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird mit Essigsäure neutralisiert, die Lösung eingedampft und der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt. Man trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert über Kieselgel (Toluol/Essigester = 3/1).

[cì]d = + 19,3° (c = 1, Chloroform)

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6

F) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy- l-O-dibenzylphosphono-2-tetrade-canoylamido-a-D-glucopyranose (fur Beispiel 18)

a) 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose

Ein Gemisch von 3 g D-Glucosamin-Hydrochlorid, 4,56 g N-Tetradecanoyloxysuccinimid und 2,8 ml Diisopropylethylamin in 40 ml trockenem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit Dimethylformamid und Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in die nächste Reaktion eingesetzt.

b) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glu-cose

4 g 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 55° in 320 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 2,6 ml Dime-thoxytoluol und 400 mg p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung, Wasser und Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und direkt in die nächste Reaktion eingesetzt.

c)4,6-0-Benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethyIsilyl)-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucopyranose

2,2 g 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 60° in 250 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 960 mg Imidazol und 2,13 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zugegeben und die Reaktion 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach Zugabe von 480 mg Imidazol und 1 g tert.-Butyldimethylchlorsilan und weiteren 24 Stunden bei 60° ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird über Kieselgel mit einem Gradient von Toluol/Essigester (20/1 bis 2/1) chromatographiert. Man erhält zwei Hauptfraktionen: die Utelverbindung (650 mg) und die entsprechende 1,3-bis-Silyl-verbindung (1,82 g). Die bis-Silylverbindung wird in 25 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf - 40° gekühlt und 2,5 ml einer 1 normalen Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zugetropft. Nach etwa 1 Stunde bei — 40° ist die anomere Silylschutzgruppe abgespalten. Man gibt 3 ml Methanol zu, lässt auf Raumtemperatur erwärmen und entfernt anschliessend die Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser extrahiert, dann getrocknet und eingedampft. Man erhält weitere 1,52 g der Titelverbindung als Ano-merengemisch.

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,42

d) 4,6-0-Benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-a-D-gIuco-pyranose:

15 672 789

Zu einer auf - 60° gekühlten Lösung von 2,46 g 4,6-0-Benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-tetrad-ecanoylamido-D-glucopyranose in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 3,12 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft, s Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von Dibenzylphosphorochloridat in Benzol zugetropft. Es wird noch 5 Minuten bei - 60° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und dann eingedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Aufarbeitung und Chro-lo matographie über Kieselgel mit Toluol/Essigester (3/1) als Laufmittel ergibt die Titelverbindung.

Rf (Toluol/Essigester = 7/4) = 0,75 e) 4,6-0-Benzyliden-2-deoxy- l-O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-a-D-glucopyranose 15 Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 2,05 g 4,6-O-Ben-zyliden-3-0-(tert.-butyIdimethyIsilyl)-2-deoxy-l-0-dibenzyl-phosphono-2-tetradecanoylamido-a-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 2,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu und rührt 2o 2 Stunden bei 0°. Danach gibt man 3 ml Methanol zu, dampft ein und verteilt zwischen Methylenchlorid und Wasser. Es wird wie üblich aufgearbeitet und mit Toluol/Essigester (3/2) über Kieselgel chromatographiert.

Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,35

30 G) 2-Acetamido-4,6-0-ben2yliden-2-deoxy-l-0-dibenzyl-phosphono-a-D-glucopyranose (für Beispiel 21)

a) 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethylsi-lyl)-2-deoxy-D-glucopyranose

Eine Lösung von 5,17g2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-35 2-deoxy-D-gIucopyranose, 3,4 g Imidazol und 6,3 g tert.-Butyldi-methylchlorsilan in 300 ml Dimethylformamid wird bei 60-70° gehalten. Nach 6 Stunden gibt man nochmals 500 mg Imidazol und 1 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zu und hält bei dieser Temperatur, bis die Reaktion beendet ist. Das Lösungsmittel wird 40 abgedampft und der Rückstand durch Methylenchlorid/Wasser-Extraktion und anschliessende Chromatographie mit Toluol/Essigester (5/1) gereinigt. Zur Abspaltung der anomeren tert.-Bu1yldimethylsilylgruppe wird das Produkt in 600 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf — 40° gekühlt und 45 14 ml einer 1 m Tetrabutylammoniumfluoridlösung zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 17 ml Methanol gestoppt. Die Reaktionsmischung wird eingedampft, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet und einge-5o dampft.

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,5

b) 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethylsi-lyl)-2-deoxy-1 -O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie unter Ec) beschrieben und erhält 55 nach Chromatographie mit Toluol/Essigester (1/1) als Lösungsmittel die Utelverbindung.

Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58

c) 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-1 -O-dibenzyl-phosphono-a-D-glucopyranose eo Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 4,4 g 2-Acetamido-4,6-0-benzyliden-3-0-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-l-0-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 6,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran und hält 2 Stunden bei 65 0°. Danach wird Methanol (7 ml) zugegeben und die Lösung eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in Methylenchlorid wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.

Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,65

672 789

H)4,6-0-Benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyIoxytetradeca-noyl]-D-ghicópyranose (fur Beispiel 22)

a) Trichlorethyl-4,6-0-benzyliden-2,3-di-0-[(R)-3tetradeca-noyloxytetradecanoyl]-ß-D-glucopyranosid

Man verfahrt analog wie unter Bc) beschrieben, unter Verwendung von (R)-3-Tetradecanoyloxytetradecansäure als Acylierungs-mittel und Toluol/Essigester (98/2) als Laufmittelgemisch. Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,75

b) 4,6-0-Ben2yliden-2,3-di-0-[(R)-3-tetradecanoyloxytetrade-canoyl]-D-glucopyranose

Man verfahrt analog wie unter Bd) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Toluol/Essigester (15/1) als Laufmittelgemisch ergibt die Titelverbindung. Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,25

I) Synthese der UDP-2,3-diacyl-hexosen

1,4 g Uridin-5'-phosphoromorpholidat-N,N'-Dicyclohexyl-carboxamidinsalz werden in 25 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und durch zweimaliges Eindampfen und Wiederauflösen in je 25 ml trockenem Pyridin getrocknet. Zu dieser Lösung gibt man

16

eine auf die gleiche Weise vorbehandelte Lösung von 1 g eines 2,3-Diacyl-hexose-l-phosphates in 25 ml Pyridin und lässt 24 Stunden bei 37° stehen. Das Reaktionsgemisch wird mit Eis gekühlt. Dann werden 50 ml Chloroform und 12 ml 90% Amei-5 sensäure zugegeben. Diese Lösung wird auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und unumgesetztes Ausgangsmaterial mit Chloro-form/Pyridin/90% Ameisensäure (30/30/7) eluiert. Die Säule wird mit Chloroform/Methanol (9/1) pyridinfrei gewaschen und anschliessend wird das XJDP-Derivat mit Chloroform/Methanol/ io Wasser (66/33/4) eluiert. Von der Peakfraktion wird Chloroform und Methanol im Vakuum abgedampft und die wässrige Suspension filtriert. Der Niederschlag wird in 100 ml Tetrahydrofuran/ Wasser (2/1) gelöst und 2 Stunden mit Dowex AG5QWX8 (Tris-hydroxymethylaminomethan-Form) gerührt. Der Ionentauscher 15 wird abfiltriert, der Grossteil des Tetrahydrofurans abgedampft und die wässrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird ohne weitere Reinigung im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt.

Analog wie unter I) beschrieben können die Verbindungen der Formel II, ausgehend von den entsprechenden Verbindungen 2o der Formel III, erhalten werden.

Claims (9)

1. 672 789

   PATENTANSPRÜCHE 1. Sacchäride der Formel

   HOHO—'

   \_

   / \-

   W

   R'

   3

   \ /

   R'

   4

   • 0 — CH-

   HO-/ \

   Y I

   *1

   -0 OH

   \-0.P^ / j OH

   "Î o

   X I

   *2

   worin Ri', R2', R3' und R4' gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acyl-gruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Massgabe, dass a) mindestens einer der Substituenten Rt', R2', R3' und R4' eine Acylgruppe bedeutet und b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen, a) R/ und R2' nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeuten, wenn R3' und R4' gleich sind und für (R)-3-Hydroxyte-tradecanoyl oder R4' für (R)-3-Dodecanoyloxytetradecanoyl und R3' für Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen,

   ß) R2' nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn R/ und R3' für Wasserstoff und R4' für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl stehen, und y) R3' nicht die -(co)2. CH2 • (CHOH)4 • CH2OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen, in freier Form und in Form ihrer Säureadditionssalze.
2. 2. Eine Verbindung der Formel I gemäss Anspruch 1, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, als Pharmazeutikum.
3. 3. Saccharide der Formel

   HOHO—'

   OH

   /

   ■ O.P.

   S OH

   III

   \_0

   / \

   \ /

   1 I

   Y ?

   R» R" 1 2 •

   worin R/' und R2" gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und a) Y für O und X für NH stehen, wobei jedoch,

   a) wenn R^' (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, R2" nicht für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder (R)-3-Hexadecanoyloxyte-tradecanoyl steht,

   ß) R[" nicht fiir Wasserstoff steht, und y) Ri" und R2" nicht gleichzeitig für die Acetyl- oder -CO • (CH2) 10 • CH3-Gruppe stehen,

   b) Yfür O und X für O und c) Y für NH und X für O stehen,

   mit der Massgabe, dass mindestens einer der beiden Substituenten R^' und R2" für Acyl steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Substituent Ri" oder R2" nicht Wasserstoff bedeutet, in freier Form und in Form ihrer chemotherapeutisch verträglichen Säureadditionssalze.
4. 4. Eine Verbindung der Formel III gemäss Anspruch 3, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, als Pharmazeutikum.
5. 5. Die Verbindung gemäss Anspruch 3, in der

   5 Y Sauerstoff,

   X Imino,

   R2" 3(R)-Hydroxytetradecanoyl,

   Ri" 3(R)-Tetradecanoyloxytetradecanoyl bedeuten und der Ring die Konfiguration der a-D-glucopyranose

   10 besitzt.
6. 6. Eine chemische therapeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I, definiert in Anspruch 1, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Verdün-

   15 nungs- oder Trägermittel, enthält.
7. 7. Eine chemische therapeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel III, definiert in Anspruch 3, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Ver-

   20 dünnungs- oder Trägermittel, enthält.
8. 8. Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 1 in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, zur Herstellung von Mitteln zur Modulation der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz, zur systemischen Steigerung der

   25 Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität.
9. 9. Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 3, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, zur Herstellung von Mitteln zur Modulation der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz, zur systemischen Steigerung der

   30 Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität.

   35 BESCHREIBUNG