DE3730905A1 - Phosphorylierte acylglykoside, deren herstellung und deren verwendung - Google Patents
Phosphorylierte acylglykoside, deren herstellung und deren verwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Verbindungen der Formel
worin R₁ für eine der Gruppen der Formeln
steht, wobei R₄ Wasserstoff, ein Metalläquivalent oder eine Alkylgruppe
bedeutet, X und Y gleich oder verschieden sind und für Sauerstoff oder die
Iminogruppe stehen, R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und eine
gegebenenfalls substituierte Acylgruppe bedeuten, Verfahren zu ihrer Herstellung
und ihre Verwendung.
Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem
man
- a) eine Verbindung der Formel worin R₂, R₃, X und Y obige Bedeutung besitzen und R₅ für eine Schutzgruppe steht, mit einer Verbindung der FormelR₁′-Z (IV)worin R₁′ die gleiche Bedeutung wie R₁ besitzt, wobei jedoch die vorhandenen Hydroxylgruppen geschützt sind und die gegebenenfalls in R₁′ enthaltene Gruppe R₄′ für eine Alkyl- oder eine Schutzgruppe steht, und Z eine Abgangsgruppe bedeutet, zu Verbindungen der Formel worin R₁′, R₂, R₃, R₅, X und Y obige Bedeutung besitzen, umsetzt, und anschließend in diese Verbindungen der Formel V die Phosphatgruppe einführt oder
- b) eine Verbindung der Formel worin R₂, R₃, R₅, X und Y obige Bedeutung besitzen und R₆ für eine Schutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel IV umsetzt und aus den erhaltenen Verbindungen der Formel worin R₂, R₃, R₅, R₆, R₁′, X und Y obige Bedeutung besitzen, die Schutzgruppen abspaltet.
Die erfindungsgemäße Umsetzung einer Verbindung der Formeln III oder VI
mit einer Verbindung der Formel IV wird in einem unter den Reaktionsbedingungen
inerten Lösungsmittel, z. B. in einem chlorierten Kohlenwasserstoff,
wie Dichlormethan, unter Feuchtigkeitsausschluß vorzugsweise bei
Raumtemperatur durchgeführt. Zur Einführung der Phosphatgruppe in Verbindungen
der Formel V nach der Verfahrensvariante a) löst man eine
Verbindung der Formel V in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten
Lösungsmittel, z. B. in einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Dichlormethan,
oder in einem cyclischen Ether, wie Tetrahydrofuran, bei tiefer
Temperatur bis zu Raumtemperatur und setzt dann ein geschütztes Phosphorchloridat
zu. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Produkt nach an sich
bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die
Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Verfahren in einer oder
mehreren Stufen durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine Schutzgruppe
sauer abgespalten, z. B. mit einer wäßrigen Säure (Ionenaustauscher),
oder hydrogenolytisch.
Als Schutzgruppe können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen
Schutzgruppen eingesetzt werden, beispielsweise die Benzyl-, Allyl-,
Chloracetyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Silylgruppe.
Auch als Schutzgruppe des Phosphatrestes können bekannte Schutzgruppen
eingesetzt werden, z. B. die Benzyl- oder Phenylgruppe.
R₂ und R₃ sind gleich oder verschieden und bedeuten eine Acylgruppe mit
beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14
Kohlenstoffatome, die in der 3-Position durch OH, Acetoxy oder eine
Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert sein kann, wobei das
C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbidnungen der Formel I
können daher R₂ und R₃ in achialer Form, in R-, S- oder racemischer
Form vorliegen. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt
die Konfiguration während des Reaktionsablaufs unverändert, d.h., ausgehend
von R-, bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man
die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.
Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze
gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt
hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)-
aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.
Z steht für eine Abgangsgruppe, vorzugsweise für Halogen, insbesondere
für Chlor oder Fluor.
Die Ausgangsverbindungen der Formel IV sind teilweise neu und können
erhalten werden, indem man Verbindungen der Formel
R₁′-Z′ (IVa)
worin R₁′ obige Bedeutung besitzt und z′ für eine Acyloxy-, insbesondere
eine 4-Nitrobenzoyloxygruppe, oder die Hydroxygruppe steht, mit einem
Halogenwasserstoff oder einer Lewissäure umsetzt, beispielsweise mit HCl,
HBr, Vilsmeyer-Chlorid oder -Bromid, Thionylchlorid, TiCl₄, TiBr₄ oder
Diethylaminoschwefeltrifluorid (= DAST).
Die Ausgangsverbindungen der Formel III und VI sind bekannt oder analog
zu bekannten Verfahren bzw. analog wie in den Beispielen beschrieben
herstellbar.
Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen
antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit
folgenden Testmethoden gezeigt werden:
Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat.
Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem
farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch
erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration
(bzw. -Aktivität bei Analoge) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin
linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-
Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata
sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe
wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw.
Standard oder Leerwert mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat
versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit
200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die
Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe
wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen
Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität)
der Probe als Endotoxin-Units (E. U.) erfolgt durch Berechnung
einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.
Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch
ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in
Galactosamin-(GaIN)-sensibilierten Mäusen. Männliche C57-bl.-Mäuse
(6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GaIN, gelöst in 0,5 ml
PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml
physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller
Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 76(1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden
Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GaIN bzw. auch
vor oder nach der GaIN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht.
Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches
der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder
durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode.
Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung
in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung
einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1 × 200 mg/kg
Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s. c. am Tag 0
verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer
NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst
(0,3 ml) parenteral (vorrangig i. p.) oder auch peroral verabreicht. Die
Infektion erfolgt am Tag 4 durch i. v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums
in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas
aeruginosa Δ 12 : 1 × 10⁵, E. coli Δ 120 : 2 × 10⁶, Staph. aureus
Δ 113 : 1 × 10⁶, Candida albicans Δ 124 : 1 × 10⁴). Die Versuchstiere werden
bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden
Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu
Standards werden folgende Parameter ausgewertet:
- a) Durchschnittliche Überlebensdauer.
- b) Überlebensrate.
Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen
Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie
auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw.
Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich
Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen
mit der unbehandelten Infektionskontrolle.
Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei
verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die
Freisetzung von Superoxidationen durch die Zellen als Index für die
Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von
Cytochrom C gemessen. 1 × 10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt
oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin
(10-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich
50 µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C
wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet.
Sie werden dann schnell bei 400 µg für 5 Minuten zentrifugiert, um die
Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der
Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm
gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung
durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der
Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden
Konzentration von LPS inkubiert werden.
Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung
von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose
durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser
Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der
Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom
eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt
durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder
als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird
entweder in 4täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn
i. p. oder s. c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an
Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von
16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös
verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung
werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das
Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird
photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber-
und Milzgewichte bestimmt.
Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer
substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen.
Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung
des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische
Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene
Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente
haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung
des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1 × 10⁶
Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert.
Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer
NaCl, (0,1 ml) i. p. verabreicht.
Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer
substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen.
Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i. p. Verabreichung
des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z. B. 1,3 × 10⁵
Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die
Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan
verabreicht.
Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet
und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert.
Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende
Parameter ausgewertet:
- a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ).
- b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ).
- c) Durchschnittliche Überlebensdauer.
- d) Überlebensrate.
Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0
bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i. p. bzw.
subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer
und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten
Infektionskontrolle.
CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder
Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind
vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des
haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt.
B₆D₂F₁-Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer
Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen
Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der
Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand
der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B₆D₂F₁-Mäusen gemessen
[D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984,
Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L. M. Green et
al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel I
induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch
zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die
bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.
Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren
können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente
Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit
Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei
verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert
und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen
von C₃H/HeJ-Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die
Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten
während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die
durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird
[J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al.,
Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formel I besitzen in
unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit,
IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.
Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an
Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen
die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch
Endotoxinschock-Induktion in der Maus).
Mit den Verbindungen der Formel I konnte bereits nach einmaliger i. p.
Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst
werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten
nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-Challenge in
einer Dosis von 0,01 µg LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i. p. unterworfen. Es
überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz
der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten
Challenge-Kontrolle.
Weiter besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische
Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch
induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen
und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene
Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen
der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In
vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosen-induzierten PGE₂- und
PGF1α -Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-
MΦ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz
inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen
wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In
diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF1α nachgewiesen. Dabei zeigte
sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan
stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der
LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-MΦ nach Vorbehandlung mit
Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3
mit LPS bzw. Prüfsubstanz i. p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere
und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i. p., am Tag 7 wurden Peritoneal-MΦ
gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche
Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.
In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity"
(PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen
PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma.
Ebenso verkürzen MΦ nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten
(gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman-
Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung
der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden
Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign
a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in
DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign
b wurden ebensolche Maus-MΦ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz
behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert.
Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma
nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten MΦ-Suspension
wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz
reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes
(Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz
zu einer Reduzierung der PCA.
In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-
Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen
gezeigt werden: B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit
LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich
erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i. p. Am Tag 6 wurden
Peritoneal-MΦ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 × 10⁶/ml Zellen
eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS
stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt.
Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich
verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit
Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten
nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch
Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.
Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla
Kaninchen am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i. v.
bzw. i. p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung
von je 40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 µg LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde
die Reaktion mit 2 µg LPS/kg i. v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion
erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte
sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch
LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.
Weiter besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen
Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden
konnte:
Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen
von BDF₁-Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf
1 × 10⁶ Zellen/ml in Medium [RPMI 1640 + 1% Pen/Strep (5000 U/ml) +
1% Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen
im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml Endkonzentration
(1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach
Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung
des TNF-Tests bei -70°C eingefroren.
In Mikrotiterplatten werden L 929-Zellen zu 3 × 10⁴ Zellen/Näpfchen/
100 µl über Nacht vorkultiviert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der
jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiterverdünnt. Nach
Zugabe von 100 µl Actinomycin D (8 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird
weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der
Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und
die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow)
gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine
50%ige Lyse der L 929-Targetzellen hervorruft.
B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor
dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in
einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der
Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die
Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension
(10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage
danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der
Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆D₂F₁-Mäuse eingesetzt. Die
Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal
injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der
Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der
B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung
der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und
15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich
eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.
Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen
antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen
Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität.
Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung
oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen
oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort,
insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort
und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten
Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine
Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen
der Formel I indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung
von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen
oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten
auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten
Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert
für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie
disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte
Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen
malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel I
für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen
und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.
Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen
ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines
Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im
letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder
in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung
enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der
Formel I, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der
Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.
Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen
der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart
ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg,
verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei
gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.
Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I,
können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit
konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder
Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise
in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden
ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von
Erkrankungen und Infektionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung
einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines
chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die
Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutische
Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als
antiinflammatorische Mittel.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren
Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben
in Celsiusgraden.
270 mg Benzyl-2-desoxy-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradeca-namido]-
β-D-glucopyranosid werden gut vorgetrocknet und in 50 ml
trockenem Dichlormethan (destilliert über P₂O₅) gelöst. Dazu gibt man 3 g
gepulvertes Drierite® (vorher im Hochvakuum auf 160°C erhitzt) und 2 g
Silbercarbonat. Danach wird unter kräftigem Rühren eine Lösung von 2,3,5-
Tri-O-benzyl-1-chloro-1-desoxy-α-D-arabinofuranose (frisch hergestellt
aus 600 mg 2,3,5-Tri-O-benzyl-1-O-4-nitrobenzoyl-α,β-D-arabinofuranose)
in 50 ml trockenem Dichlormethan zugetropft. Auf strengsten Feuchtigkeitsausschluß
ist zu achten. Die Reaktion ist nach ca. 2 Stunden beendet
(DC-Kontrolle: Rf = 0,54 [in Toluol/Essigester = 2/1]). Die Feststoffe
werden von der klaren Lösung abfiltriert, das Lösungsmittel verdampft und
der Rückstand auf zwei in Serie geschalteten Merck-Lobar-Kieselgelsäulen,
Größe B aufgetrennt; Laufmittel linearer Gradient je 800 ml Toluol/Essigester
(7/1) nach Toluol/Essigester (3/1).
1 g Benzyl-6-O-(2,3,5-tri-O-benzyl-α-D-arabinofuranosyl)-2-desoxy-3-O-
tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-b-D-glucopyranosid
wird mehrmals mit trockenem Benzol einrotiert und im 30 ml frisch
(von P₂O₅) destilliertem Dichlormethan aufgenommen. Dazu gibt man
278 mg 4-Dimethylaminopyridin (3 × mit trockenem Benzol eingedampft)
und 1 ml frisch destilliertes, trockenes Pyridin. Dann werden unter Argon
direkt in die Lösung 810 ml Diphenylphosphorchloridat zugesetzt. DC-Kontrolle
(Toluol/Essigester = 5/1) zeigt nach 3 bis 4 Stunden praktisch kein
Ausgangsmaterial (Rf = 0,20) mehr. Zur Aufarbeitung wird gegen Kaliumhydrogensulfat
und Natriumbicarbonat, schließlich gegen Wasser ausgeschüttelt,
die organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet und
eingedampft. Der Rückstand wird auf einer Kieselgelsäule (Merck Lobar
Typ C) chromatographiert (Toluol/Essigester = 5/1, Rf = 0,4).
100 mg Benzyl-6-O-(2,3,5-tri-O-benzyl-α-D-arabinofuranosyl)-2-desoxy-4-
O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetra-decanamido]-
β-D-glucopyranosid werden in 15 ml absolutem Ethanol suspendiert
und in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle (10%) bei Raumtemperatur
und Atmosphärendruck 8 Stunden hydriert. Dabei geht das Ausgangsprodukt
allmählich in Lösung. Der Katalysator wird schließlich über
Celit abfiltriert und das Lösungsmittel eingedampft. Fp: 87-92° (aus
Methanol). Rf = 0,46 (in Essigester).
30 mg 6-O-(α-D-Aarabinofuranosyl)-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-
tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranose
werden in 5 ml Eisessig aufgenommen. 15 mg Platinoxid werden hinzugegeben
und ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck hydriert.
Nach dieser Zeit ist die Bande des Ausgangsproduktes (Rf ≈ 0,93)
im DC nicht mehr sichtbar und eine neue Bande erscheint bei Rf ≈ 0,55
(in Chlorform/Methanol/Eisessig/Wasser = 16/5/1/1).
1 g Benzyl-2-desoxy-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradeca-namido]-
β-D-glucopyranosid wird in 50 ml frisch über P₂O₅ destilliertem
Dichlormethan aufgenommen und 3 g gepulvertes Drierite ® (8 Stunden
getrocknet bei 160° am Hochvakuum) und 6 g Silbercarbonat hinzugegeben.
Unter Lichtausschluß wird dann das aus 3,07 g 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-1-O-
4-nitrobenzoyl-D-glucopyranose gewonnene Glycosylhalogenid dem Reaktionsgemisch
langsam zugetropft (ca. 50 ml). Nach je 1 Stunde werden noch
je 3 g Silbercarbonat zugesetzt und insgesamt ca. 24 Stunden reagieren
gelassen. Danach filtriert man von den Feststoffen ab, dampft ein und
chromatographiert auf einer 50 × 6 cm Mitteldrucksäule (Gradient: Je
800 ml Toluol/Essigester = 7/1 und Toluol/Essigester = 3/1). Dabei wird die
Titelverbindung zusammen mit 2,3,4,6-Tetra-O-benzylglucose als Mischfraktion
eluiert. Die Trennung erfolgt auf einer Kieselgelsäule Merck
Lobar, Typ C (konditioniert mit Hexan/Essigester = 3/1) durch zwei aufeinanderfolgende
Gradientenelutionen:
- 1) Je 800 ml Hexan/Essigester = 3/1 und Hexan/Essigester = 2/1.
- 2) je 800 ml Hexan/Essigester = 2/1 und Hexan/Essigester = 1/1.
700 mg Benzyl-6-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-2-desoxy-
3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid
werden in 20 ml frisch von Phosphorpentoxid destilliertem Dichlormethan
gelöst. Dazu gibt man 184 mg 4-Dimethylaminopyridin und 1 ml
frisch destilliertes Pyridin. Dann werden unter Argon direkt in die Lösung
517 ml Diphenylphosphorsäurechlorid zugesetzt und bei Raumtemperatur
72 Stunden gerührt. Die Umsetzung ist nicht vollständig. DC: Rf ≈ 0,39 (in
Toluol/Essigester = 5/1). Zur Aufarbeitung wird dem Gemisch 1 ml Wasser
zugesetzt und, nach 10 Minuten Rühren, gegen Natriumhydrogensulfat und
Natriumbicarbonat ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden über
Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand
auf einer Merck Lobar Kieselgelsäule, Typ C, chromatographiert
(1200 ml Toluol/Essigester = 6/1; dann 800 ml Toluol/Essigester = 3/1).
150 mg Benzyl-6-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl)-2-desoxy-
4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytet-radecanamido]-
b-D-glucopyranosid werden in 40 ml 96% Ethanol suspendiert
und 33 mg 10% Palladium auf Aktivkohle hinzugegeben. Dann hydriert man
ca. 7 Stunden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Der Katalysator
wird über Celit abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält die
Titelverbindung als farblosen Sirup. Rf ≈ 0,78 (in Chloroform/Methanol/Eisessig/
Wasser = 16/5/1/1).
80 mg 2-Desoxy-4-O-diphenylphosphono-6-O-α-D-glucopyranosyl-3-O-tetradecanoyl-
2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-D-glucopyranose
werden in 25 ml Eisessig gelöst. Dann fügt man 40 mg Platinoxid hinzu und
hydriert ca. 80 Minuten bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Dann
wird der Katalysator abfiltriert, der Eisessig durch dreimaliges Eindampfen
mit Toluol entfernt, der Rückstand in 40 ml 96% Ethanol aufgenommen und
14,7 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan (= Tris) hinzugegeben. Nach Zugabe
von 50 ml Toluol ist alles gelöst. Man dampft ein und rotiert noch
zweimal mit wenig absolutem Ethanol ein. Rf = 0,63 (Chloroform/Methanol/
Eisessig/Wasser = 16/5/1/1).
98 mg 4,5,7,8-Tetra-O-chloracetyl-2,3-didesoxy-2-fluor-α,β-D-manno-2-
octulopyranosonsäuremethylester und 100 mg Benzyl-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-
3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-
β-D-glucopyranosid werden in 2 ml trockenem Dichlormethan geöst. Dazu
gibt man 200 mg gepulvertes Molekularsieb 4 Å und, nach Abkühlen auf 0°,
ca. 3 Tropfen Bortrifluoridetherat (BF₃ · OEt₂). Danach wird das Gemisch
30 Minuten bei 0° und noch 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt
(Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/Ether = 7/1). Anschließend wird das
Gemisch in eiskalte wäßrige Natriumbikarbonatlösung gegossen, mit Dichlormethan
extrahiert, die organischen Phasen über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird auf Kieselgel
chromatographiert (a: Dichlormethan; b:Dichlormethan/Methanol = 500/1).
Man erhält so zuerst die α-Verbindung als die schneller eluierende Komponente
und dann die β-Verbindung, Fp = 47-50°.
α-Verbindung: [α] D = 9,4° (c = 0,36 in Chloroform).
β-Verbindung: [α] D = 4,0° (c = 0,55 in Chloroform).
α-Verbindung: [α] D = 9,4° (c = 0,36 in Chloroform).
β-Verbindung: [α] D = 4,0° (c = 0,55 in Chloroform).
30 mg Benzyl-6-O-[methyl(tetra-O-chloracetyl-3-desoxy-α,β-D-manno-2-
octulopyranosyl)ono]-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoy-l-
2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid werden in
0,6 ml Eisessig gelöst und 1,2 ml 2,6-Lutidin hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch
wird auf 0° gekühlt und unter Rühren 0,48 ml Hydrazindithiocarbonat
zugegeben. Anschließend wird 2 Stunden bei 0° gerührt (Dünnschichtkontrolle:
Dichlormethan/Methanol = 10/1) und dann bei 30-35° Badtemperatur
gemeinsam mit Toluol eingedampft. Der Rückstand wird mit
Dichlormethan extrahiert, die Lösung jeweils in der Kälte mit verdünnter
Salzsäure, Wasser, verdünnter Sodalösung und Eiswasser gewaschen, getrocknet
und eingedampft. Der Rückstand wird auf einer Kieselgelsäule
chromatographiert (a: Dichlormethan; b: Dichlormethan/Methanol = 100/1;
c: Dichlormethan/Methanol = 50/1). Man erhält so die Titelverbindung.
Fp = 54-56°, [α] D = -1,7° (c = 0,24 in Chloroform).
Fp = 54-56°, [α] D = -1,7° (c = 0,24 in Chloroform).
Ein Gemisch von 51 mg Benzyl-6-O-[methyl(3-desoxy-α-D-manno-2-octulopyranosyl)
ono]-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-
tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid, 1 ml Eisessig und
2 ml 2,6-Lutidin wird mit 0,8 ml Hydrazindithiocarbonatlösung, wie unter
b) beschrieben, behandelt.
Fp = 62-65°, [α] D = 4,3° (c = 0,35 in Chloroform).
Fp = 62-65°, [α] D = 4,3° (c = 0,35 in Chloroform).
Benzyl-6-O-[methyl(3-desoxy-b-D-manno-2-octulopyranosyl)ono]-2-desoxy-
4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytet-radecanamido]-
β-D-glucopyranosid wird in Ethanol/Methanol über Palladium-
Aktivkohle hydriert.
Fp = 58-60°, [α] D = 22° (c = 0,31 in Chloroform).
Fp = 58-60°, [α] D = 22° (c = 0,31 in Chloroform).
6-O-[Methyl(3-desoxy-β-D-manno-2-octulopyranosyl)ono]-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-
3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-
α,β-D-glucopyranose wird in Ethanol gelöst und über Platinoxid (Adams'-
Katalysator) hydriert. Man erhält so die Titelverbindung.
Fp = 138-139°; [α] D = 26° (c = 0,26 in Ethanol/Chloroform = 3/1).
Fp = 138-139°; [α] D = 26° (c = 0,26 in Ethanol/Chloroform = 3/1).
Eine Lösung von 146 mg [3,5-dedesoxy-7,8-O-isopropyliden-4-O-(3-desoxy-
4,5:7,8-di-O-isopropyliden-α-D-manno-2-octulopyranosyl)-onsäuremethylester-
α-D-manno-2-octulopyranosyl]onsäuremethylester in absolutem Dichlormethan
wird mit 64 mg Chlormethylendimethyliminiumchlorid (Vilsmeier-
Reagens) versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die
Lösung wird rasch mit eiskalter gesättigter NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt,
über MgSO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml
absolutem Dichlormethan gelöst und zu einer Suspension von 574 mg
2-Desoxy-4-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxyte-tradecanamido]-
D-glucopyranose 76 mg Hg(CN)₂, 36 mg HgBr₂ und 0,5 g Molekularsieb
4 Å in 5 ml absolutem Dichlormethan zugetropft. Nach 48 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur wird filtriert und der nach Eindampfen
erhaltene Rückstand mit Toluol/Ethylacetat (2/1) über Kieselgel chromatographiert.
Man erhält die Titelverbindung als farblosen Sirup.
¹H-NMR: 7,45-7,09 (m, 15H, arom); 5,73 (d, 1H, JNH,2∼9,5, N-H); 5,24
(dd, 1H, J2,3∼11,0, J3,4∼9,0, H-3); 5,03 (dddd, 1H, CH-OR); 4,92 und
4,62 (JAB∼12,5, C₆H₅CH₂O); 4,59 (d, 1H, J1,2∼8,5, H-1); 4,51 (ddd, 1H,
J4′′,5′′∼8,0, J4″,3″e∼4,5, J4′′,3′′a∼3,0, H-4′′); 4,47 (dd, 1H, J4,5∼9,5, H-4);
4,43-4,36 (m, 2H, H-4′, 7′′); 4,29 (dd, 1H, J5′′,6′′∼2,0, H-5′′); 4,14 (dd, 1H,
J8′′a,8′′b∼9,0, J8′′a,7′′∼6,0, H-8′′a); 4,07 (dd, 1H, J8′′b,7′′∼5,0, H-8′′b);
4,08-3,67 (m, 7H); 3,63 (dd, 1H, H-6′′); 3,59 (s, 3H, CH₃OCO); 3,56 (s, 3H,
CH₃OCO); 2,95 (dd, 1H, J3′′e, 3′′a∼15,0, H-3′′e); 2,43 (dd, 1H,
J3′e,3′a∼15,0, J3′e,4′∼5,0, H-3′e); 2,36-1,96 (m, 6H, CH₂-CO); 1,90 (dddd,
1H, H-5′e); 1,09 (dd, 1H, H-3′′a); 1,73-1,00 (m, 82H, H-3′a, 5′a, (CH₂) n ,
(CH₃)₂C); 0,87 (t, 12H, CH₃).
Die sukzessive Abspaltung der Benzyl- und Phenylschutzgruppen aus Benzyl-
2-desoxy-6-O-[4-O-(3-desoxy-4,5:7,8-diisopropyliden-α-D-manno-2-octulopyranosyl)-
onsäuremethylester-3,5-didesoxy-7,8-isopropyliden-D-arabino-
2-octulopyranosylonsäuremethylester]-4-O-diphenylphosphono-3-O-tetra-decanoyl-
2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid
wird, analog wie in den Beispielen 1 bis 3 angegeben, durchgeführt. Dabei
erfolgt gleichzeitig die säurekatalysierte Hydrolyse der Isopropylidengruppen;
die resultierende Titelverbindung hat [α] +3,2° (c = 0,2 in Chloroform/
Methanol = 2/1).
280 mg 2,3-Di-O-benzyl-5-O-[(3-desoxy-4,5:7,8-diisopropyliden-α-D-manno-
2-octulopyranosyl)onsäuremethylester]-D-arabinofuranose (getrocknet
über Calziumsulfat im Hochvakuum) werden in 10 ml trockenem Dichlormethan
gelöst. In eine Suspension von 0,5 g Molekularsieb 4 Å, (getrocknet
bei 180° über Calziumsulfat im Hochvakuum) in einem Gemisch aus 25 ml
trockenem Dichlormethan und 2 ml trockenem Acetonitril gibt man 120 mg
Chlormethylendimethyliminiumchlorid (Vilsmeyer-Reagens) und rührt
10 Minuten unter Feuchtigkeitsausschluß. Dieser Suspension wird nun die
zunächst hergestellte Lösung des Ausgangsproduktes in Dichlormethan
hinzugefügt und wieder 10 Minuten rühren gelassen. Die Umsetzung des
reduzierten Disaccharidderivats zum Halogenid wird verfolgt, indem
man die jeweiligen dünnschichtchromatographischen Proben im analytischen
Maßstab mit Methanol/Silbercarbonat zum Methylglycosid reagieren
läßt. Sobald die Bildung des Disaccharidhalogenids abgeschlossen ist, wird
der Ansatz in kalte gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung eingetragen
und sofort gegen Dichlormethan ausgeschüttelt. Die organische Phase wird
über Magnesiumsulfat getrocknet, eingedampft und der entstandene Sirup
noch im Hochvakuum über Kalziumsulfat getrocknet. 250 mg Quecksilbercyanid,
80 mg Quecksilberbromid, 2 g Molekularsieb 4 Å und 1,7 g Benzyl-
2-desoxy-4-O-(diphenyl)phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradec-anoyloxytetradecanamido]-
β-D-glucopyranosid, alles gepulvert und getrocknet
über Calziumsulfat im Hochvakuum, werden in 40 ml trockenem Benzol
suspendiert. Es werden noch 20 ml Benzol abdestilliert. Zu dieser Suspension
wird nach Abkühlen eine Lösung des zunächst hergestellten
Disaccharidchlorids in 25 ml trockenem Benzol/Dichlormethan (1/1) hinzugefügt
und das Ganze unter Feuchtigkeitsausschluß 18 Stunden gerührt.
Dann filtriert man die Feststoffe über Celite ab, dampft die Lösung ein und
trennt die Produkte durch Säulenchromatographie über Kieselgel (Gradient:
Toluol/Essigester = 5/1 → 2/1). In Toluol/Essigester (2/1) hat das α-
Ara-Produkt Rf = 0,44; [α] = +12,4° (c = 0,44 in Chloroform); das β-
Ara-Produkt: Rf = 0,36.
Die sukzessive Abspaltung der Benzyl- und Phenylschutzgruppen aus Benzyl-
2-desoxy-6-O-[2,3-di-O-benzyl-5-O-[(3-desoxy-4,5:7,8-diisopropyliden--
α-D-manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester]-α-D-arabinofuranosyl]-
4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytet-radecanamido]-
β-D-glucopyranosid wird analog, wie in den Beispielen 1 bis
3 angegeben, durchgeführt. Dabei erfolgt gleichzeitig die säurekatalysierte
Hydrolyse der Isopropylidengruppen; die resultierende Titelverbindung hat
[α] +1,4° (c = 0,5 in Dichlormethan/Methanol = 1/1).
Ein Gemisch aus 0,13 g Benzyl-2-[3-(R)-3-(benzyloxymethoxy)tetradecanamido]-
2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecan-oyl]-
β-D-glucopyranosid (M. Kiso et. al., Carbohydr. Res., 162,
247-256 [1987]), 1 ml trockenem Dichlormethan, 0,1 g Molekularsieb 4 Å,
55 mg Quecksilbercyanid und 19 mg Quecksilberbromid wird 3 Stunden bei
Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Dann wird eine
Lösung von 0,1 g (3-Desoxy-4,5,7,8-tetra-O-chloracetyl-D-manno-2-octulopyranosylbromi-d)-
onsäurebenzylester in trockenem Dichlormethan hinzugefügt
und das Reaktionsgemisch 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Beendigung der Reaktion (Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/Ether
7/1) wird vom Festkörper abfiltriert und mit Dichlormethan nachgewaschen.
Filtrat und Waschlösungen werden vereinigt, gegen wäßrige Natriumbicarbonatlösung
ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der
Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert (Dichlormethan und Dichlormethan/
Methanol = 500/l); [a] = +12°C (c=1,8 in Dichlormethan).
Zu einer Lösung von 30 mg Benzyl-6-O-[(3-desoxy-4,5,7,8-tetra-O-chloracetyl-
α-D-manno-2-octulopyranosyl)onsäurebenzylester]-2-[3-(R)-(benzyloxyme-thoxy)-
tetradecanamido]-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-[3-(R)-
tetradecanoyloxytetradecanoyl]-β-D-glucopyranosid in 1,8 ml 2,6-Lutidin/
Essigsäure (2/1) gibt man bei 0° 0,48 ml frisch bereitetes Hydrazindithiocarbonat.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0° gerührt und dann bei 35°
Badtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform
aufgenommen und nacheinander mit eiskalter 1 M Salzsäure, Wasser,
wäßrigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, die Lösung getrocknet
und eingedampft. Der Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert (a:
Dichlormethan; b: Dichlormethan/Methanol = 100/1; c: Dichlormethan/Methanol =
50/1); [α] = +8° (c = 1,0 in Dichlormethan).
78 mg Benzyl-6-O-[(3-desoxy-α-D-manno-2-octulopyranosyl)onsäurebenzylester-
2-[3-(R)-(benzyloxymethoxy)tetradecanamido]-2-desoxy-4-O-diphenylpho-sphono-
3-O-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-β-D-glucopyranosid
in 20 ml Ethanol/Methanol (3/2) werden in Gegenwart von 80 mg 10%
Palladium auf Aktivkohle bei 40° hydriert. Nach Beendigung der Reaktion
(Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/Methanol = 10/1 und 2/1) wird der
Katalysator abfiltriert und mit Ethanol/Methanol/Dichlormethan gewaschen.
Filtrat und Waschlösungen werden vereinigt und eingedampft. Man
erhält so die Titelverbindung. Fp: 138-140°; [α] = +23° (c = 0,6 in
Ethanol/Dichlormethan = 3/1).
Zu einer Lösung von 35 mg 2-Desoxy-6-O-[(3-desoxy-α-D-manno-2-octulopyranosyl)-
onsäure]-4-O-diphenylphosphono-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-
3-O-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-D-glucose in 15 ml Ethanol gibt
man 30 mg vorreduzierten Adams-Platinkatalysator und rührt das Gemisch
bei Raumtemperatur. Der Katalysator wird nach beendeter Reaktion über
Celite abfiltriert und mit Ethanol/Methanol/Dichlormethan nachgewaschen.
Filtrat und Waschlösungen werden vereinigt und eingedampft. Nach
Reinigung mittels präparativer Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/
Methanol = 2/1) enthält man so die Titelverbindung. Fp: 162-164°
[α] = +26° (c = 0,5 in Dichlormethan/Ethanol = 1/1).
Analog wie in Beispiel 6a) beschrieben, erhält man aus Benzyl-2-desoxy-4-
O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetra-decanamido]-
β-D-glucopyranosid und (3-Desoxy-4,5,7,8-tetra-O-chloracetyl-D-
manno-2-octulopyranosylbromid)onsäurebenzylester die Titelverbindung.
Fp: 32-33°; [a] D = +10° (c = 1,3 in Dichlormethan).
Fp: 32-33°; [a] D = +10° (c = 1,3 in Dichlormethan).
Man verfährt analog wie in Beispiel 6b) beschrieben. Fp: 56-58°
[α] D = +2° (c = 1,6 in Dichlormethan).
[α] D = +2° (c = 1,6 in Dichlormethan).
Man verfährt analog wie in Beispiel 1c) beschrieben. Fp: 114-115°
[α] D = +13° (c = 1,3 in Ethanol/Dichlormethan = 3/1).
[α] D = +13° (c = 1,3 in Ethanol/Dichlormethan = 3/1).
Man verfährt analog wie in Beispiel 1d) beschrieben. Fp:168-169°
[α] D = +22° (c = 1 in Methanol/Dichlormethan = 1/1).
[α] D = +22° (c = 1 in Methanol/Dichlormethan = 1/1).
Analog wie in Beispiel 6a) beschrieben, erhält man aus Benzyl-2-desoxy-4-
O-diphenylphosphono-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-3-O-[3--(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-
β-D-glucopyranosid und (3-Desoxy-4,5,7,8-
tetra-O-chloracetyl-D-manno-2-octulopyranosylbromid)onsäurebenzylest-er
die Titelverbindung. [α] D = +12° (c = 1,8 in Dichlormethan).
Man verfährt analog wie in Beispiel 6b) beschrieben.
[a] D = +8° (c = 1 in Dichlormethan).
[a] D = +8° (c = 1 in Dichlormethan).
Man verfährt analog wie in Beispiel 1c) beschrieben. Fp: 138-140°.
[α] D = +23° (c = 0,6 in Ethanol/Dichlormethan = 3/1).
[α] D = +23° (c = 0,6 in Ethanol/Dichlormethan = 3/1).
Man verfährt analog wie in Beispiel 1d) beschrieben. Fp: 162-164°.
[α] D = +26° (c = 0,5 in Ethanol/Dichlormethan = 1/1).
[α] D = +26° (c = 0,5 in Ethanol/Dichlormethan = 1/1).
Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermaßen
erhalten werden:
500 mg Benzyl-2-desoxy-4,6-O-isopropyliden-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-
tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid werden in 80 ml
frisch destilliertem Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man bei Raumtemperatur
portionenweise unter kräftigem Rühren ein Gemisch aus 2 ml 40%
Flußsäure und 4 ml Tetrahydrofuran. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch
verfolgt und ist nach ca. 24 Stunden beendet. Rf ≈ 0,28 (in
Toluol/Essigester = 1/1).
Bei Eisbadtemperatur werden 2 g Benzyl-2-desoxy-4,6-O-isopropyliden-3-
O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid
in 20 ml 90% Trifluoressigsäure gelöst und ca. 7 Minuten bei dieser
Temperatur gehalten. Danach ist die Reaktion praktisch beendet. DC-
Kontrolle: Rf 0,28 (in Toluol/Essigester = 1/1). Ein Großteil der Trifluoressigsäure
wird bei niedriger Temperatur abgedampft und der Rückstand
zwischen Dichlormethan und Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die organischen
Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, eingedampft und
der Rückstand auf einer Kieselgelsäule chromatographiert (Gradient: je
400 ml Toluol/Essigester = 2/1 und reiner Essigester).
600 mg 2,3,5-Tri-O-benzyl-1-O-4-nitrobenzoyl-α,β-D-arabinofuranose werden
in 50 mg trockenem Dichlormethan gelöst und so lange trockenes
Chlorwasserstoffgas eingeleitet, bis keine weitere Fällung von 4-Nitrobenzoesäure
erfolgt. Die Vollständigkeit der Umsetzung wird dünnschichtchromatographisch
festgestellt. Die gefällte 4-Nitrobenzoesäure wird sodann
abfiltriert, rasch mit trockenem Dichlormethan gewaschen, die Dichlormethanlösung
rasch mit kalter Natriumbicarbonatlösung ausgeschüttelt,
über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und direkt zur Glycolysierung
eingesetzt.
Der Grad der Hydrolyse des Glycosylhalogenids kann wie folgt bestimmt
werden: Eine DC-Probe wird in einen Tropfen trockenen Methanols eingetragen
und eine Spur Silbercarbonat zugesetzt. Man schüttelt innerhalb
5 Minuten mehrmals und trägt dann auf die DC-Platte auf. Aus ursprünglich
vorhandenem Halogenid bildet sich quantitativ das Methylglycosid:
(Rf ≈ 0,37 (in Toluol/Essigester = 10/1). Demgegenüber bleibt die 1-OH-
Verbindung unverändert (Rf ≈ 0,11).
2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-1-O-4-nitrobenzoyl-D-glucopyranose wird analog
wie unter C) beschrieben, in Dichlormethan gelöst und trockenes HCl-Gas
eingeleitet (2 Stunden bei Eisbadtemperatur einleiten, dann 24 Stunden
stehen lassen). DC: Rf (Nitrobenzoat) ≈ 0,44; Rf (Chlorid) ≈ 0,5 (in Toluol/
Essigester = 10/1). Nach quantitativer Umsetzung wird von der 4-Nitrobenzoesäure
abfiltriert, das Filtrat durch Eindampfen am Rotavapor
vom Großteil des HCl-Gases befreit, rasch gegen eiskalte Natriumbicarbonatlösung
ausgeschüttelt, über Magnesiumsulfat getrocknet und direkt zur
Glycosylierung eingesetzt. Die Ausbeute ist praktisch quantitativ, die zur
Glycosylierung benötigten Mengen werden als 4-Nitrobenzoat eingewogen.
1,19 g 4,5,7,8-Tetra-O-acetyl-3-desoxy-D-manno-2-octulopyranosonsäuremethyl-ester
werden in 10 ml Aceton gelöst und die Lösung auf 0°
abgekühlt. Nach Zugabe von 2,5 ml 1 M wäßriger Natriumbikarbonatlösung
wird noch 30 Minuten bei 0° gerührt (Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/
Ether = 5/1). Danach wird das Aceton durch Eindampfen entfernt und
der Rückstand mit Dichlormethan ausgeschüttelt. Die organische Phase
wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und zu einem Sirup eingedampft.
Chromatographie auf Kieselgel (Hexan/Essigester = 2/1) ergibt die Titelverbindung.
[a] D = 50,7° (c = 1,08 in Chloroform).
Zu einer Lösung von 0,917 g 4,5,7,8-Tetra-O-acetyl-3-desoxy-D-manno-2-
octulopyranosonsäuremethylester in Dichlormethan werden 0,99 ml Dihydropyran,
eine katalytische Menge von o-Toluolsulfonsäuremonohydrat und
Molekularsieb 4 Å gegeben. Dann wird das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Anschließend neutralisiert man die Säure durch Zugabe
von Natriumbikarbonatlösung und filtriert von den Feststoffen ab. Das
Filtrat wird eingedampft und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert
(Hexan/Essigester = 3/2). Man erhält so die Titelverbindung.
[α] D = 69,5° (c = 1,26 in Chloroform).
[α] D = 69,5° (c = 1,26 in Chloroform).
Zu einer Lösung von 0,4 g 4,5,7,8-Tetra-O-acetyl-3-desoxy-α-D-manno-2-
O-(tetrahydropyran-2-yl)-2-octulopyranosonsäuremethylester in 3 ml trockenem
Methanol wird bei 0° unter Rühren eine katalytische Menge
Natriummetall gegeben. Nach Beendigung der Reaktion (Dünnschichtkontrolle:
Dichlormethan/Methanol = 4/1) wird mit Amberlite IR 120 (H⁺)
neutralisiert, das Harz abfiltriert und mit Methanol nachgewiesen. Filtrat
und Waschlösungen werden vereinigt, eingedampft, und man erhält so die
Titelverbindung als Sirup. [α] D = +75° (c = 1,05 in Chloroform/Methanol =
10/1). Die Verbindung ist dünnschichtchromatographisch als 1/1-Gemisch
der diastereomeren Tetrahydropyranylether zu erkennen.
Einer Lösung von 1,14 g 3-Desoxy-α-D-manno-2-O-(tetrahydropyran-2-yl)-
2-octulopyranosonsäuremethylester in 5 ml Dichlormethan werden 6,5 ml
trockenes 2,6-Lutidin und 2,05 ml Triethylamin hinzugefügt. Die Lösung
wird auf 0° abgekühlt und 3,5 g Chloressigsäureanhydrid zugegeben. Nach
20 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch erneut
abgekühlt, Methanol zur Zerstörung des überschüssigen Reagens zugegeben
und schließlich zum Sirup eingedampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan
gelöst. Die Lösung wird nacheinander mit eiskalter 2 M Salzsäure,
Wasser und verdünnter Bikarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und eingedampft. Das Produkt wird durch Chromatographie
über Kieselgel gereinigt (Hexan/Essigester = 2/1) und als Sirup erhalten.
Die beiden diastereomeren Tetrahydropyranylether sind chromatographisch
trennbar. Die schneller eluiertende Komponente hat [α] D = 77,2° (c = 0,5 in
Chloroform); die langsamer eluierende Komponente hat [α] D = 56,4° (c =
56,4 in Chloroform).
Eine Lösung von 1,90 g 4,5,7,8-Tetra-O-chloracetyl-3-desoxy-2-O-(tetrahydropyran-
2-yl)-α-D-manno-2-octulopyranosonsäuremethylester in 50 ml
Eisessig wird auf 45° erwärmt. Dann werden 5 ml Wasser zugetropft und
das Gemisch 5 bis 6 Stunden bei 45° gehalten (Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/
Methanol = 50/1). Anschließend wird das Gemisch lyophilisiert
und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert (Hexan/Essigester =
2/1). Man erhält so die Titelverbindung. [α] D = 40,8° (c = 0,93 in Chloroform).
323 mg 4,5,7,8-Tetra-O-chloracetyl-3-desoxy-α-D-manno-2-octulopyranosonsäuremethylester
werden in 2 ml Toluol gelöst und die Lösung auf -60°
abgekühlt. Dann wird eine Lösung von 0,5 ml Diethylaminoschwefeltrifluorid
in 2 ml Toluol hinzugefügt und das Gemisch 10 Minuten bei -60°
gerührt. Anschließend wird Eiswasser zugesetzt, das Gemisch mit wäßriger
Natriumbikarbonatlösung versetzt und mit Dichlormethan ausgeschüttelt.
Die organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und
eingedampft. Der sirupartige Rückstand wird über Kieselgel chromatographiert
(Hexan/Essigester = 2/1), und man erhält so die Titelverbindung
dünnschichtchromatographisch einheitlich (Dichlormethan/Ether = 7/1).
[a] D = 57,3° (c = 0,51 in Chloroform).
[a] D = 57,3° (c = 0,51 in Chloroform).
Eine Lösung von 7,5 g (3,5-Didesoxy-2,4,7,8-tetra-O-acetyl-α-D-manno-2-
octulopyranosid)onsäuremethylester in 30 ml Dichlormethan wird bei 0°
mit 10 g TiBr₄ versetzt und über Nacht bei 4° aufbewahrt. Die Lösung wird
mit Chloroform verdünnt, mit eiskalter NaHCO₃-Lösung extrahiert, getrocknet
und eingedampft. Der erhaltene gelbliche Sirup wird in Nitromethan
gelöst und bei 0° einer Suspension von 5 ml Allylalkohol, 4,5 g
Hg(II)cyanid und 3 g Molekularsieb 3 Å in Nitromethan zugetropft. Nach
10 Stunden wird filtriert, eingedampft und über Kieselgel mit Toluol/Ethylacetat
(3/1) chromatographiert. Eindampfen der Fraktionen mit Rf = 0,46
(Toluol/Ethylacetat = 2/1) ergibt die Titelverbindungen als Sirup. [α] =
+70,2 (c = 0,9 in Chloroform).
Eine Lösung von 4,3 g (Allyl-3,5-didesoxy-4,7,8-tri-O-acetyl-α-D-manno-2-
octulopyranosid)onsäuremethylester und Methyl(allyl-3,5-didesoxy-4,7,8-
tri-O-acetyl-β-D-manno-2-octulopyranosid)onsäuremethylester in 50 ml absolutem
Methanol wird mit einer Lösung von 70 mg Natrium in 10 ml
Methanol 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit Dowex 50 (H⁺)
Ionenaustausch-Harz neutral gestellt, filtriert und eingedampft. Der Rückstand
wird in absolutem Pyridin aufgenommen, mit 5 g p-Nitrophenylchlorameisensäureester
versetzt und 20 Stunden gerührt. Die Lösung wird eingedampft,
der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen, mit gesättigter
NaHCO₃-Lösung extrahiert, getrocknet und eingedampft. Chromatographie
an Kieselgel mit Ethylacetat als Eluens ergibt die Titelverbindungen als
Sirup. [α] = +23,2° (c = 1,4 in Chloroform) und [α] = +53,7° (c = 1,0
in Chloroform).
Eine Lösung von 1,7 g KDO-bromid in absolutem Nitromethan wird einer
Suspension von 0,58 g (Allyl-7,8-O-carbonyl-3,5-didesoxy-α-D-manno-2-
octulopyranosid)onsäuremethylester, 1,25 g Hg(CN)₂ und 1 g Molekularsieb
3 Å zugetropft und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch
wird filtriert, eingedampft und an Kieselgel mit Toluol/Ethylacetat
(2/1) gereinigt. Man erhält die Titelverbindung als farblosen Sirup.
[α] = +90,3 (c = 2,2 in Chloroform).
[α] = +90,3 (c = 2,2 in Chloroform).
¹H-NMR: 5,85 (m, 1H, =CH-); 5,37 (breites Signal, 1H, H-5′); 5,30-5,15 (m,
2H, CH₂=); 5,25 (ddd, 1H, J4′,5′∼3,0, J4′,3′e∼5,0, J4′,3′a∼12,5, H-4′); 5,19
(ddd, 1H, J7′,8′a∼3,0, J7′,8′b∼3,5, J7′,6′∼9,5, H-7′); 4,78 (dd, 1H,
J8′a, 8′b∼12,5, H-8′a); 4,61 (ddd, 1H, J7,8a∼8,0, J7,8b∼5,0, J7,6∼11,0,
H-7); 4,54 (t, 1H, J8a,8b∼8,0, H-8a); 4,54 (dd, 1H, H-8b); 4,32 (m, 1H,
H-4); 4,16 (dd, 1H, J6′,5′∼1,5, H-6′); 4,04 (dd, 1H, H-8′b); 3,95 (m, 2H,
OCH₂-CH=); 3,85 (ddd, 1H, J6,5e∼5,0, J6,5a∼12,5, H-6); 3,83 (s, 3H,
CH₃OCO); 3,79 (s, 3H, CH₃OCO); 2,40 (ddd, 1H, J3e,5e∼2,0, J3e,4 ∼ 5,0,
J3e,3a∼12,5, H-3e); 2,21 (dd, 1H, J3′e,3′a∼13,0, H-3′e); 2,06 (t, 1H,
H-3′a); 2,11 (s, 3H); 2,07 (s, 3H); 1,98 (s, 6H, CH₃CO); 1,93 (dddd, 1H,
J5e,4∼5,0, H-5e); 1,69 (dd, 1H, J3a,4∼11,0, H-3a); 1,31 (t, 1H,
J5a,4∼11,0, H-5a).
Eine Lösung von 1,24 g [Allyl-7,8-O-carbonyl-3,5-didesoxy-4-O-(3-desoxy-
4,5,7,8-tetra-O-acetyl-α-D-manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester-a-
D-manno-2-octulopyranosid]onsäuremethylester in 30 ml absolutem Methanol
wird mit einer Lösung von 50 mg Natrium in 50 ml Methanol versetzt
und 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Neutralisieren mit
Dowex 50 (H⁺) wird filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml
absolutem Dimethylformamid gelöst, mit 10 mg p-Toluolsulfonsäure und 5
ml Acetondimethylacetat versetzt und 48 Stunden bei 60° unter schwachem
Unterdruck gerührt. Nach Eindampfen der Lösung wird über Kieselgel mit
Toluol/Ethylacetat (1/1) chromatographiert. Man erhält die Titelverbindung
als farblosen Sirup. [α] = 54,9° (c = 1,2 in Chloroform).
Eine Lösung von 400 mg [Allyl-3,5-didesoxy-7,8-O-isopropyliden-4-O-(3-
desoxy-4,5:7,8-di-O-isopropyliden-α-D-manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester-
α-D-manno-2-octulopyranosid]onsäuremethylester in 10 ml absolutem
Tetrahydrofuran wird unter Stickstoff mit 10 mg
[Ir(COD)[PCH₃(C₆H₅)₂]₂]PF₆
versetzt, mit Wasserstoff aktiviert und
90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird mit Dichlormethan
verdünnt, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung extrahiert, getrocknet und
eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml Tetrahydrofuran/Wasser (4/1)
gelöst, mit 250 mg Jod versetzt und 20 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Verdünnen mit 100 ml Dichlormethan wird mit 5%iger
NaHCO₃-Lösung extrahiert, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung neutralisiert,
getrocknet und eingedampft. Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/
Ethylacetat (1/1) ergibt die Titelverbindung.
¹H-NMR: 4,52 (ddd, 1H, J4′,5′∼8,0, J4′,3′e∼3,7, J4′,3′e∼2,5, H-4′); 4,38
(m, 1H, J4,5a∼11,0, J4,5e∼4,0, J4,3e∼5,0, J4,3a∼11,0, H-4); 4,38 (m, 1H,
J7′,6′∼7,5, J7′,8′a∼6,0, J7′,8′b∼4,5, H-7′); 4,28 (dd, 1H, J5′,6′∼2,0,
J5′,4′∼8,0, H-5′); 4,14 (dd, 1H, J8′a,8′b∼9,0, H-8′a); 4,04 (dd, 1H, H-8′b);
3,99 (dd, 1H, J8a,8b∼7,5, J8a,7∼6,0, H-8a); 3,91 (ddd, 1H, J7,8b∼4,5,
J7,6∼7,5, H-7); 3,80 (dd, 1H, H-8b); 3,80 (ddd, 1H, J6,5e∼2,0, J6,5a∼11,0,
H-6); 3,76 (d, 1H, J3a,OH∼2,0,); 3,82 (s, 3H, CH₃OCO); 3,78 (s, 3H,
CH₃OCO); 3,58 (dd, 1H, H-6′); 2,99 (dd, 1H, J3′a,3′e∼15,5, H-3e′); 2,06
(ddd, 1H, J3e,3a∼12,5, J3e,5e∼1,7, H-3e); 1,94 (dd, 1H, H-3a); 1,92 (ddd,
1H, J5e,5a∼12,5, H-5e); 1,79 (dd, 1H, H-3′a); 1,44, 1,38, 1,36, 1,32 (s, 18H,
CH₃); 1,29 (t, 1H, H-5a).
Eine Lösung von 10 g 2,3,5-Tri-O-benzyl-1-O-p-nitrobenzoyl-D-arabinofuranose
in 150 mg trockenem Acetanhydrid wird auf 10° abgekühlt. Dann
wird ein Gemisch aus 15 ml Acetanhydrid und 100 ml 95-97% Schwefelsäure
dazugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Nach neuerlichem Abkühlen auf 10° werden noch einige Tropfen
Schwefelsäure zugegeben und wieder 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird vorsichtig in Eiswasser eingetragen
und 10 Minuten gerührt. Man neutralisiert mit gesättigter, gekühlter
Natriumhydrogencarbonatlösung. Bei pH 7,5-8 wird die wäßrige Phase mit
3 × 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach Chromatographie über
Kieselgel erhält man die Titelverbindung. Rf = 0,39 (Toluol/Essigester =
5/1).
1 g 1,5-Di-O-acetyl-2,3-di-O-benzyl-D-arabinofuranose wird in 5 ml Eisessig
gelöst, und bei Raumtemperatur werden 20 ml mit Chlorwasserstoffgas
gesättigter Eisessig dazugegeben. Nach 20 Minuten wird mit 35 ml Dichlormethan
und 100 ml Eiswasser versetzt und ausgeschüttelt. Die wäßrige
Phase wird mit 35 ml Dichlormethan gegengewaschen, die vereinigten
organischen Phasen mit 40 ml kalter, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung
zügig gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Anschließend wird im Vakuum eingeengt, wobei man die Titelverbindung
als Sirup erhält. Rf = 0,33 (Toluol/Essigester = 5/1).
Unter einer Argonatmosphäre gibt man in einen Rundkolben 40 ml Dichlormethan
(getrocknet über P₂O₅), 1,2 g Calziumsulfat (gepulvert, getrocknet
bei 120° im Feinvakuum), 4,5 g Silbercarbonat (getrocknet über Calziumsulfat
im Feinvakuum) und 0,4 ml Allylalkohol. Unter Lichtausschluß werden
innerhalb 45 Minuten 0,9 g 5-O-Acetyl-1-chloro-1-desoxy-2,3-di-O-
benzyl-α-D-arabinofuranose, gelöst in P₂O₅-getrocknetem Dichlormethan,
zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Dann wird die Suspension über Celite® filtriert, einmal mit
Dichlormethan nachgewaschen und im Vakuum eingeengt. Man erhält die
Titelverbindung durch Chromatographie über Kieselgel. Rf = 0,54 (Toluol/
Essigester = 5/1).
2 g Allyl-5-O-acetyl-2,3-di-O-benzyl-α-D-arabinofuranosid werden in
100 ml Methanol (frisch destilliert über Mg-Spänen) gelöst. Dann gibt man
von einer Standardlösung (5 ml Methanol, 50 mg Na-Metall) 2 ml hinzu und
läßt bei Raumtemperatur eine Stunde stehen. Dann wird mit Dowex®
50-H⁺ in kleinen Portionen neutralisiert, das Harz abfiltriert und die Lösung
eingeengt. Der Sirup wird in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit
Pentan zur Kristallisation gebracht. Fp: 61-62°, Rf = 0,43 (Toluol/Essigester =
2/1).
3,6 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-α-D-arabinofuranosid werden in 40 ml Nitromethan
(getrocknet über Molekularsieb 3 Å) gelöst. Dazu gibt man 15 g
gepulvertes Molekularsieb (getrocknet bei 160°/13 Torr) und 3,15 g Quecksilbercyanid
(gepulvert, getrocknet über Calziumsulfat im Feinvakuum).
Unter Rühren tropft man innerhalb von 6 Stunden 6,5 g 3-Desoxy-4,5,7,8-
tetra-O-acetyl-α-D-manno-2-octulopyranosylbromid)onsäuremethylester
(getrocknet im Feinvakuum, gelöst in 12 ml absolutem Nitromethan) zu und
läßt weitere 18 Stunden rühren. Dann wird mit 130 ml Dichlormethan
verdünnt, 30 Minuten gerührt, die Feststoffe über Celite® abfiltriert und
die Lösung im Vakuum zum Sirup eingeengt. Dieser wird säulenchromatographisch
getrennt (Kieselgel, Gradient: Toluol/Essigester = 7/1 → 2/1).
Die Fraktionen mit Rf = 0,35 werden gesammelt und eingedampft. Sie
bestehen aus dem gewünschten Ketosidgemisch ( α,β ) sowie aus nicht
umgesetztem Alkohol. Der gut getrocknete Sirup wird in 40 ml trockenem
Pyridin gelöst; bei Eisbadtemperatur werden 6 ml Acetanhydrid in die
Lösung getropft. Nach 6 Stunden wird der Ansatz bei 0° mit 5 ml Methanol
versetzt. Nach 30 Minuten engt man im Vakuum ein, vertreibt restliche
Mengen mit Toluol und nimmt in Dichlormethan auf. Diese Lösung wird
gegen Natriumbisulfat-, Natriumbicarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt
und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Eindampfen
erhaltene Rückstand wird über Kieselgel chromatographiert (Gradient:
Toluol/Essigester = 4/1 → 2/1). Das dabei eluierte acetylierte Aglycon
erhält man bei Rf = 0,66 (Toluol/Essigester = 2/1). Das Ketosidgemisch
erhält man bei Rf = 0,35.
7,07 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-5-O-[4,5,7,8-tetra-O-acetyl-3-desoxy-a,β-D-
manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester]-α-D-arabinofuranosid
werden bei Raumtemperatur in absolutem Methanol gelöst. Es werden 2 ml
0,1 N Natriummethanolat zugegeben. Nach 1 Stunde wird mit Dowex 50H⁺
neutralisiert, das Herz abfiltriert und die Lösung eingedampft. Die Titelverbindung
wird als Sirup erhalten. Rf = 0,08 (Toluol/Essigester = 1/1).
5,5 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-5-O-[(3-desoxy-α,β-D-manno-2-octulopyranosyl)-
onsäuremethylester]-α-D-arabinofuranosid werden in 350 ml trockenem
Pyridin gelöst und die Lösung auf -35° abgekühlt. Dann wird unter starkem
Rühren eine Lösung von 1,2 ml Chlorameisensäuretrichlormethylester in
40 ml trockenem Benzol zugetropft. Nach 1,5 Stunden bei -35° läßt man
auf Raumtemperatur erwärmen und ermittelt dünnschichtchromatographisch
die Vollständigkeit der Umsetzung (Toluol/Essigester = 1/1).
Rf-Werte: Ausgangsmaterial∼0,08; α KDO α ara (di-O-carbonyl) = 0,31;
β KDO α ara (di-O-carbonyl) = 0,15.
Nach beendeter Reaktion werden 5 ml Ethanol zugetropft. Das Gemisch
wird im Vakuum eingeengt und noch dreimal zusammen mit Toluol eingedampft.
Man wäscht eine Dichlormethanlösung des Rückstandes mit Natriumhydrogencarbonatlösung
und Wasser, trocknet über Magnesiumsulfat
und verdampft das Lösungsmittel. Die Trennung der KDO-anomeren Verbindungen
auf Kieselgel (Toluol/Essigester = 2/1) ergibt die Titelverbindungen.
α KDO-Disaccharid: [α] = -7,1° (c = 4,8 in Chloroform). β-KDO-
Disaccharid: [α] = -5,2° (c = 2,1 in Chloroform); Fp: 146-148°.
2,4 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-5-O-[(4,5:7,8-di-O-carbonyl-3-desoxy-α-D-
manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester]-α-D-arabinofuranosid
werden bei Raumtemperatur in 40 ml trockenem Methanol gelöst. Es
werden 2 ml 0,1 N Natriummethanolat zugegeben. Nach 3 Stunden neutralisiert
man mit Dowex 50H⁺, filtriert und verdampft das Lösungsmittel im
Vakuum. Rf = 0,08 (Toluol/Essigester = 1/1).
0,8 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-5-O-[(3-desoxy-α-D-manno-2-octulopyranosyl)-
onsäuremethylester]-α-D-arabinofuranosid werden in 100 ml Dimethylformamid
(destilliert über Molekularsieb 4 Å) gelöst und eine katalytische
Menge Toluol-4-sulfonsäure zugegeben. In diese Lösung gibt man mittels
einer Injektionsspritze direkt 0,49 ml 2-Methoxypropen und verschließt
sofort. Nach 5 Stunden gibt man nochmals 0,49 ml 2-Methoxypropen zu und
läßt noch 18 Stunden stehen. Man neutralisiert mit festem Natriumcarbonat,
entfernt das Lösungsmittel im Vakuum und erhält die Titelverbindung
nach Säulenchromatographie auf Kieselgel (Toluol/Essigester = 2/1).
Rf ≈ 0,43; [α] = -9,3 (c = 3,3 in Chloroform).
1,6 g Allyl-2,3-di-O-benzyl-5-O-[(3-desoxy-4,5:7,8-diisopropyliden-α-D-
manno-2-octulopyranosyl)onsäuremethylester-α-D-arabinofuranosid
werden in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man 3,2 g
1,5-Cyclooctadien-bis-[methyldiphenylphosphin]iridiumhexafluorphosph-at.
Die Apparatur wird sorgfältig mit Argon gespült (99,996%) und die Lösung
3 Minuten unter sauerstofffreiem Argon gerührt. Dann wird zur Aktivierung
des Katalysators 2- bis 3mal mit Wasserstoff gespült. Nach 5 Minuten spült
man erneut mit Argon und läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Das
Reaktionsgemisch wird in 150 ml Tetrahydrofuran/Wasser (4/1) gegeben,
1,5 g Jod hinzugefügt und 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann
wird mit 1,2 l Wasser verdünnt, gegen Chloroform ausgeschüttelt, die
organische Phase zweimal mit je 500 ml 5%iger Natriumpyrosulfitlösung
gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der erhaltene Sirup wird säulenchromatographisch auf Kieselgel getrennt
(Gradient: Toluol/Essigester = 3/1 → 1/1). Rf = 0,58 (Toluol/Essigester =
1/2); [α] = +33,2° (c = 1,6 in Chloroform).
10 g Glucosamin.Hydrochlorid werden in 47 ml 1 N Natronlauge gelöst. Zu
der Lösung werden 5,7 ml Anisaldehyd zugetropft, wobei ein kristalliner
Niederschlag entsteht. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei Eisbadtemperatur
gehalten. Man filtert und wäscht die Kristalle mit eiskaltem
Wasser und Alkohol/Ether (1/1). Anschließend trocknet man an der Luft.
Fp: 161-164° (Zers.).
10 g 2-Anisylidenamino-2-desoxy-D-glucose werden in 10 ml absolutem
Pyridin gelöst. Dazu tropft man bei Eisbadtemperatur 60 ml eines Gemisches
aus Pyridin und Essigsäureanhydrid (1/1). Nach 2 Stunden läßt man
auf Raumtemperatur erwärmen und über Nacht stehen. Dann gießt man das
Gemisch auf Eiswasser, wobei das Produkt sofort auskristallisiert. Die
Kristalle werden abfiltriert und aus Dichlormethan/Pentan umkristallisiert.
Fp: 180-182°.
10 g 2-Anisylidenamino-2-desoxy-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranose
werden in 400 ml Aceton gelöst und zum Rückfluß erhitzt. Dazu gibt man
1 Moläquivalent 5 N Salzsäure (tropfenweise), wonach die Titelverbindung
sofort ausfällt. Nach dem Abkühlen gibt man 300 ml Diethylether dazu,
rührt kräftig 30 Minuten und filtriert ab. Die Kristalle werden mit Diethylether
gewaschen und im Exsiccator über Calciumsulfat getrocknet.
Fp: 220° (Zers.).
17,7 g 2-Amino-2-desoxy-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranose.Hydrochlorid
werden in wenig Wasser gelöst. Man gibt 16,34 g Natriumacetat zu
und rührt bei Raumtemperatur 30 Minuten. Dann schüttelt man 5mal mit
je 50 ml Dichlormethan aus, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat
und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Die Titelverbindung
wird aus heißem Ethanol kristallisiert. Fp: 132-134°.
22 g 3-(R)-Hydrotetradecansäure werden in 1 l Essigester gelöst und auf
4° abgekühlt. Dazu gibt man 10,35 g N-Hydroxysuccinimid und 18,54 g
Dicyclohexylcarbodiimid und rührt kräftig, wobei Dicyclohexylharnstoff
auszufallen beginnt. Nach 3 bis 4 Stunden wird das Gemisch auf Raumtemperatur
erwärmt und über Nacht gerührt. Dann wird Cyclohexylharnstoff
abfiltriert und das Lösungsmittel eingedampft. Der sirupöse Rückstand
wird in wenig Methanol bei 40° gelöst und die Lösung langsam auf 4°
abgekühlt, wobei die Titelverbindung kristallisiert. Fp: 103-104°.
10 g 2-Amino-2-desoxy-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranose werden in
60 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man 14,7 g
N-[3-(R)-Hydroxytetradecanoyloxy]succinimid und rührt 48 Stunden unter
Rückfluß. Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum eingedampft. Aus
dem Rückstand wird die Titelverbindung durch Chromatographie auf Kieselgel
erhalten. Rf = 0,47 (Toluol/Essigester = 1/2); Fp: 143-145°.
Eine Suspension von 2,03 g Eisen(III)-chlorid (wasserfrei) und 3,9 g wasserfreiem
Kalziumsulfat in 65 ml trockenem Dichlormethan wird 10 Minuten
gerührt. Dann gibt man 7,8 ml frisch destillierten Benzylalkohol und 4,68 g
2-Desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-g-lucopyranose
zu und läßt die Suspension 96 Stunden bei Raumtemperatur
rühren. Dann gießt man in eiskalte, gesättigte Natriumcarbonatlösung
und extrahiert 6mal mit je 100 ml Dichlormethan. Die organische Phase
wird mit Wasser gegengewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im
Vakuum eingedampft. Man erhält die Titelverbindung durch Chromatographie
auf Kieselgel (Gradient: Toluol/Essigester = 2/1 → 1/2 a 900 ml). Fp:
150-152°; Rf = 0,48 (Toluol/Essigester = 1/2).
4 g Benzyl-2-desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-3,4,6-tri-O-acetyl-
β-D-glucopyranosid werden in 100 ml trockenem Methanol gelöst. Dazu
gibt man 3 ml einer Lösung von 5 mg Natriummetall in 5 ml Methanol.
Nach 1 Stunde wird das Gemisch mit Dowex 50H⁺ neutralisiert, das Harz
abfiltriert und die Lösung eingedampft. Die Titelverbindung hat Rf = 0,71
(Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 16/5/1/1).
3 g Benzyl-2-desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-β-D-glucopyranosid
werden in 40 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Dazu gibt
man 1 bis 2 Spatelspitzen Toluol-4-sulfonsäuremonohydrat und 1,3 ml
Isopropenylmethylether. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird mit
festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert (10 Minuten Rühren). Das
Lösungsmittel wird im Hochvakuum abgedampft und der Rückstand noch
mit 3 × 20 ml Toluol eingedampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan
gelöst, Ungelöstes durch Filtration entfernt, die Lösung mit Wasser gewaschen,
über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand
wird im Vakuum zu einem amorphen Pulver getrocknet. Rf = 0,43 (Essigester).
3,4 g Benzyl-2-desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-4,6-O-isopropyliden--
β-D-glucopyranosid werden in 50 ml eines Gemisches aus trockenem
Dichlormethan und frisch destilliertem Pyridin (2/1) gelöst. Dazu gibt man
eine Spatelspitze Dimethylaminopyridin und kühlt auf Eisbadtemperatur ab.
Nun wird ein Gemisch aus 5,2 ml Tetradecanoylchlorid und 5 ml Dichlormethan
zugetropft und 48 Stunden bei Eisbadtemperatur Rühren gelassen.
Dann wird 5 ml Methanol zugetropft, mit 25 ml Toluol verdünnt und im
Vakuum eingedampft. Man dampft noch mehrmals mit Toluol ein, um
restliches Pyridin zu entfernen, und chromatographiert über Kieselgel
(Toluol/Essigester = 10/1); Rf = 0,32.
0,5 g Benzyl-2-desoxy-4,6-O-isopropyliden-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetra-decanoyloxytetradecanamido]-
β-D-glucopyranosid werden in 10 ml eisgekühlter
90% Trifluoressigsäure ungefähr 7 Minuten stehen gelassen. Das
Reagens/Lösungsmittel wird dann im Vakuum abgedampft, der Rückstand
in Dichlormethan gelöst und die Lösung gegen gesättigte Natriumbicarbonatlösung
ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat
getrocknet und das Produkt nach Chromatographie auf Kieselgel erhalten
(Gradient: Toluol/Essigester = 2/1 → Essigester). Rf = 0,22 (Toluol/Essigester =
1/1).
15 g Benzyl-2-desoxy-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyltetradecanam-ido]-
β-D-glucopyranosid werden in 1,3 l Acetonitril gelöst und die
Lösung auf 60° erwärmt. Dazu gibt man portionsweise 4 × 5 g Tritylpyridiniumtetrafluoroborat.
Die Bildung des Produktes wird mittels Dünnschichtchromatographie
verfolgt (Rf = 0,43 in Toluol/Essigester = 5/1).
Sobald die Umsetzung abgeschlossen ist, wird das Lösungsmittel verdampft,
der Rückstand in Dichlormethan gelöst und die Lösung mit Wasser gewaschen.
Man trocknet über Magnesiumsulfat und reinigt mittels Säulenchromatographie
(Toluol/Essigester = 11/1).
330 mg Benzyl-2-desoxy-3-O-tetradecanoyl-2-[3-(R)-tetradecanoyloxytetradeca-namido]-
6-O-triphenylmethyl-β-D-glucopyranosid werden sorgfältig
getrocknet und in 50 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Dazu gibt man
107 mg Dimethylaminopyridin, 1 ml absolutes Pyridin und 300 ml Diphenylphosphorsäurechlorid
und rührt das Gemisch 90 Stunden bei Raumtemperatur.
Dann verdünnt man mit Dichlormethan, schüttelt gegen gesättigte
Natriumbicarbonatlösung aus, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat
und erhält das Produkt durch Chromatographie über Kieselgel
(Gradient: Toluol/Essigester = 11/1 → 9/1). Rf = 0,34 (Toluol/Essigester =
10/1).
120 mg Benzyl-2-desoxy-4-O-diphenylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2-[3-
(R)-tetradecanoyloxytetradecanamido]-6-O-triphenylmethyl-β-D-glucopyranosid
werden in Dichlormethan gelöst. Bei Eisbadtemperatur wird so lange
90% Trifluoressigsäure zugegeben, bis die gelbe Färbung der Lösung nicht
mehr verschwindet. Dann trägt man die Lösung in gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung
ein und schüttelt aus. Die organische Phase wird über
Magnesiumsulfat getrocknet, eingedampft und der Rückstand über Kieselgel
chromatographiert (Gradient: je 500 ml Toluol/Essigester =
6/1 → 3/1). Rf = 0,45 (Toluol/Essigester = 2/1).
Zu einer Lösung von 1,14 g 3-Desoxy-2-O-(tetrahydropyran-2-yl)-D-manno-
2-octulopyranosonsäurebenzylester in 20 ml trockenem Dioxan gibt man
26,9 M Kaliumhydroxid und läßt das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur
rühren. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie
verfolgt (Dichlormethan/Methanol = 2/1). Das Gemisch wird dann zur
Entfernung der Base mit Amberlite IR-120(H⁺) behandelt. Das Harz wird
abfiltriert und mit Methanol/Wasser (10/1) gewaschen. Filtrat und Waschlösungen
werden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml
N,N-Dimethylformamid gelöst und mit 0,373 g Kaliumcarbonat und 1,4 g
Benzylbromid 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird
Eiswasser zugegeben u 05029 00070 552 001000280000000200012000285910491800040 0002003730905 00004 04910nd das Produkt mit Essigester und Dichlormethan
extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, eingedampft und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert
(Dichlormethan/Methanol = 30/1). Das Produkt ist ein Diastereomerengemisch
der Tetrahydropyranether; die Komponenten laufen eng beisammen
im Dünnschichtchromatogramm (Dichlormethan/Methanol = 3/1).
Das schneller laufende Isomer: Fp: 30°, [α] = +40° (c = 0,64 in
Dichlormethan); das langsamer laufende Isomer: Fp: 39-40°, [α] = +44°
(c = 2,2 in Dichlormethan).
0,3 g 3-Desoxy-2-O-(tetrahydropyran-2-yl)-D-manno-2-octulopyranosonsäurebe-nzylester,
1,9 ml 2,6-Lutidin und 0,59 ml Triethylamin werden in 5 ml
trockenem Dichlormethan gelöst und 1 g Chloressigsäureanhydrid wird nach
und nach zugegeben. Das Gemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Dann gibt man eine kleine Menge Eis zu und verdampft das
Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgenommen
und nacheinander mit eiskalter 1 M Salzsäure, Wasser, wäßrigem
Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und getrocknet. Der Rückstand
nach dem Eindampfen wird über Kieselgel chromatographiert (Dichlormethan).
Das so erhaltene Zwischenprodukt löst man in 20 ml Acetonitril, fügt
0,1 ml 42% wäßrige Tetrafluorborsäure zu und rührt das Gemisch kräftig
15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann gibt man 0,1 ml Triethylamin zu
und verdampft das Lösungsmittel. Der Rückstand wird auf Kieselgel
chromatographiert (Dichlormethan), wobei man die 2-OH-Verbindung erhält;
[α] = +30° (c = 0,72 in Dichlormethan). Diese wird in 4,5 ml
Dichlormethan/2,6-Lutidin (2/1) gelöst und eine Lösung von 0,1 ml Acetylchlorid
in 3 ml Dichlormethan hinzugefügt. Das Gemisch wird über Nacht
gerührt (20°) und dann in eiskalte, wäßrige Natriumbicarbonatlösung gegossen.
Das Produkt wird mit Dichlormethan extrahiert, der Extrakt mit
eiskalter 1 M Salzsäure und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert (Dichlormethan)
und ergibt die amorphe Titelverbindung. [α] = +47°.
Zu einer Lösung von 0,1 g 2-O-Acetyl-3-desoxy-4,5,7,8-tetra-O-chloracetyl-
D-manno-2-octulopyranosonsäurebenzylester in 2 ml trockenem Dichlormethan
wird bei 0° eine Lösung von 0,35 g Titantetrabromid in einem
Gemisch von 2,5 ml trockenem Dichlormethan und trockenem Essigester
(10/1) zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt. Nach
beendeter Reaktion (Dünnschichtkontrolle: Dichlormethan/Ether = 15/1)
werden 15 ml trockenes Dichlormethan zugegeben und das Gemisch mit
wasserfreiem Natriumacetat unter kräftigem Rühren behandelt. Die Suspension
wird durch Celite filtriert und das Filtrat bei 20° im Vakuum
eingedampft. Der Rückstand wird aus trockenem Dioxan lyophilisiert und
direkt in die Glycosidierungsreaktion eingesetzt.
Eine Lösung von 8 g 2-Desoxy-D-ribose und 50 mg Natriumbicarbonat in
43 ml destilliertem Wasser wird mit Natronlauge auf pH = 11 eingestellt.
Dazu gibt man portionenweise 3 g Oxalessigsäure und hält das pH 2 Stunden
möglichst genau bei 11. Dann erwärmt man die Lösung auf 50° und fügt
Dowex-50-H⁺-Harz bis pH ca. 5,7 hinzu. Man hält dann 2 Stunden bei 50°.
Das pH steigt dabei auf ca. 6,2 an. Anschließend wird vom Harz abfiltriert
und auf eine Säule (80 × 3 cm) von Dowex-1×8 (Bicarbonatform) aufgetragen.
Man wäscht mit 500 ml Wasser und eluiert dann mit einem linearen
Gradienten (800 ml Wasser und 800 ml 0,3 M Ammoniumbicarbonat). Anschließend
wird mit 800 ml 0,3 M Ammoniumbicarbonat weiter eluiert.
Während der gesamten Elution sammelt man Fraktionen von ca. 5 ml.
Dünnschichtchromatographische Analyse der Fraktionen zeigt das Vorhandensein
der gewünschten 3,5-Didesoxy-D-arabino-2-octulosonsäure in den
Fraktionen 175-220 an (Methanol/Chloroform/Wasser = 10/10/3). Diese
Fraktionen werden vereinigt, mittels Biorex-70-(H⁺)-Harz vom Bicarbonat
befreit, mit einigen Tropfen 30% Ammoniak auf pH 8,5 gebracht und
lyophilisiert. Das Lyophilisat wird, wie für 3-Desoxy-D-manno-2-
octulosonat beschrieben (F. M. Unger, D. Stix und G. Schulz, Carbohydr.
Res. 80, 191 [1980]), acetyliert, und die resultierende 3,5-Didesoxy-
2,4,7,8-tetra-O-acetyl-D-arabino-2-octulosonsäure ebenfalls, wie dort beschrieben,
in den Methylester übergeführt. Rf = 0,28 (Toluol/Essigester =
2/1).
Claims (2)
1. Neue Verbindungen der Formel
worin R₁ für eine der Gruppen der Formeln
steht, wobei R₄ Wasserstoff, ein Metalläquivalent oder eine Alkylgruppe
bedeutet, X und Y gleich oder verschieden sind und für Sauerstoff oder die
Iminogruppe stehen, R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und eine
gegebenenfalls substituierte Alcylgruppe bedeuten.
2. Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel
worin R₁ für eine der Gruppen der Formeln
steht, wobei R₄ Wasserstoff, ein Metalläquivalent oder eine Alkylgruppe
bedeutet, X und Y gleich oder verschieden sind und für Sauerstoff oder die
Iminogruppe stehen, R₂ und R3 gleich oder verschieden sind und eine
gegebenenfalls substituierte Acylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) eine Verbindung der Formel worin R₂, R₃, X und Y obige Bedeutung besitzen und R₅ für eine Schutzgruppe steht, mit einer Verbindung der FormelR₁′ -Z (IV)worin R₁′ die gleiche Bedeutung wie R₁ besitzt, wobei jedoch die vorhandenen Hydroxygruppen geschützt sind und R₄′ für eine Alkyl- oder eine Schutzgruppe steht, und Z eine Abgangsgruppe bedeutet, zu Verbindungen der Formel worin R₁′, R₂, R₃, R₅, X und Y obige Bedeutung besitzen, umsetzt, und anschließend in diese Verbindungen der Formel V die Phosphatgruppe einführt oder
- b) eine Verbindung der Formel worin R₂, R₃, R₅, X und Y obige Bedeutung besitzen und R₆ für eine Schutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel IV umsetzt und aus den erhaltenen Verbindungen der Formel worin R₂, R₃, R₅, R₆, R₁′, X und Y obige Bedeutung besitzen, die Schutzgruppen abspaltet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873730905 DE3730905A1 (de) | 1986-09-23 | 1987-09-15 | Phosphorylierte acylglykoside, deren herstellung und deren verwendung |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3632202 | 1986-09-23 | ||
| DE19873730905 DE3730905A1 (de) | 1986-09-23 | 1987-09-15 | Phosphorylierte acylglykoside, deren herstellung und deren verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3730905A1 true DE3730905A1 (de) | 1988-03-24 |
Family
ID=25847722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19873730905 Withdrawn DE3730905A1 (de) | 1986-09-23 | 1987-09-15 | Phosphorylierte acylglykoside, deren herstellung und deren verwendung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3730905A1 (de) |
-
1987
- 1987-09-15 DE DE19873730905 patent/DE3730905A1/de not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |