DE4035538A1 - Glutaminsaeureacylderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Glutaminsäureacylderivate der Formel

worin R₁ R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Alkylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man aus einer Ver­ bindung der Formel

worin R₁ bis R₃ obige Bedeutung besitzen, R₄, R₅ und R₆ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Schutzgruppe stehen, die Schutzgruppen nach an sich bekannten Methoden abspaltet.

Als Schutzgruppen können allgemein übliche Schutzgruppen verwendet werden, beispielsweise die Triphenylmethyl-, die tert.Butoxycarbonyl- oder die Benzylgruppe. Die Abspaltung der vorhandenen Schutzgruppen kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden. Je nach Art der Schutzgruppe kann die Abspaltung in einem einzigen Reaktionsschritt oder in mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionsschritten erfolgen.

Die Verbindungen der Formel II können nach folgendem Formelschema erhalten werden:

In diesem Reaktionsschema besitzen R₁ bis R₆ obige Bedeutung, R₇, R₈ und R₉ können gleich oder verschieden sein und bedeuten jeweils eine Schutzgruppe.

Die Acylierung kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man die entsprechende Verbin­ dung in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefen Temperaturen, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.

R₁, R₂ und R₃ sind gleich oder verschieden und bedeuten eine Alkylgruppe mit beispielsweise 1 bis 17, vorzugsweise 9 bis 13 und insbesondere 11 Kohlenstoffatomen. Die C-Atome, an die diese Alkylgruppen gebunden sind, können R- oder S-konfiguriert sein. In den Verbindungen der Formel I können daher R₁, R₂ und R₃ in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufs unverändert, d. h., ausgehend von R-, bzw. S- oder racemischen Aus­ gangsprodukten erhält man die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbin­ dungen.

Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindun­ gen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.

Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden.

1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat-Test

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml En­ dotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis.) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E . U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.

2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus

Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zus­ tandes mit letalem Ausgang durch LPS oder LPS-ähnliche Substanzen in Galac­ tosamin- (GalN) -sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) er­ halten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76(1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen ergab sich eine LD₅₀ von etwa 50 bis 400 µg/kg.

3. Steigerung der unspezifischen Resistenz gegen mikrobielle Septikämien in der neutropenischen Maus

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten unspezifischen Ab­ wehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1·200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in an­ derer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ 12: ca. 3·10⁵, E. coli Δ120: ca. 2·10⁶, Staph. aureus Δ113: ca. 2·10⁶, Candida albicans Δ124: ca. 2·10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards wird die Überlebensrate am Tag 5 nach Infektion als Parameter ausgewertet: Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gram­ negative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1·10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucyl­ phenylalanin (10^-6M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400 xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hem­ mwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen, mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.

5. Carbon Clearence Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose der Markophagen eliminiert wer­ den können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer′sche Sternzellen) und Milz ,aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Be­ handlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igem Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g Körpergewicht intravenös verabreicht. 3,6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekon­ zentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1·10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRl-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z. B. 1,3·10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infek­ tionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet;

a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ).
b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ).
c) Durchschnittliche Überlebensdauer.
d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1 -Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor):

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus für die Aufrechterhaltung der Haemopoese verantwortlich sind und darüber hinaus vielseitige biologische Funktionen im Netzwerk der Immunabwehrreaktionen besitzen. Die biologische Eigenschaft von Substanzen, CSFs zu In­ duzieren, wird als mögliches therapeutisches Potential angesehen, das zur Behandlung von Patienten zur Steigerung der zellulären Immunabwehr oder zur beschleunigten Rekonstitution des Blutes nach immunsuppressiver Behandlung eingesetzt werden kann. Zur experimentel­ len Prüfung von CSF induzierenden Eigenschaften werden die Substanzen parenteral (i.p., i.v.) in Dosierungen von 0,2-50 mg/kg Körpergewicht an B₆D₂F₁-Mäuse appliziert. 4-6 Stun­ den nach der Therapie werden die Tiere entblutet, das Serum gewonnen und auf CSF-Aktivität untersucht. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay bestimmt, bei dem Maus-Knochenmarkszellen aus B₈D₂F₁-Mäusen mit verschiedenen Serumkon­ zentrationen für 7 Tage inkubiert und anschließend die Proliferationsraten der Zellen im Vergleich zu Negativkontrollen bestimmt werden (D. Metcalf, The haemopoietic colony stimu­ lating factors, 1984, Elsevier; L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)).

Verbindungen der Formel I zeigen nach parenteraler Verabreichung in Dosierungen von 0,2 bis 50 mg/kg Körpergewicht nach ein- oder mehrmaliger Applikation Induktion hoher CSF-Ak­ tivitäten in Mäusen.

8. Induktion von Interleukin-1 (lL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMl- Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 24-48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃ H/ HeJ Mäusen auf IL-1 -Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Prolif­ eration angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird [J. Gery et al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße (kon­ zentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1 -Produktion in Makrophagen zu in­ duzieren.

9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)

Durch ein- bis dreimalige parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (siehe auch Endotoxinschock-lnduktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formel I konnte bereits nach einmaliger i.p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS- Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung (täglich eine Verabreichung) ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische Wirkung, in­ sbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündun­ gen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF₁α-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-M aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Was­ chen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF₁ o nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-M nach Vor­ behandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-M gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der ′′procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verk­ ürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen M nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MQ von B₆ D₂ F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign (a) über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Ver­ suchsdesign (b) wurden ebensolche Maus-M 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten M-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Pr­ üfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verl­ ängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden; B₆ D₂ F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-M gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1×10⁶/ml Zellen einges­ tellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Ausl­ ösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte.

1. Untersuchung der lnduktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF)

Die TNF-lnduktion wurde in Maus-Knochenmark-Zellkulturen untersucht. Hierfür wurden Knochenmarkszellen von BDF₁ Mäusen für 8-10 Tage in Teflonsäckchen in Proliferationsmedium (DMEM H2 1 + 10% FCS + 5% Pferdeserum + 15% L 929 Zellüberstand = CSF + Penicillin 10 Units/ml und Streptomycin 100 µg/ml) kultiviert. Durch Zentrifugationsschritte wurden die Zellen anschließend gewaschen und im Induktionsmedium (RPMI 1640 + 5% FCS + Penicillin 10 U/ml + Streptomycin 100 µg/ml + 1% Glutamin) auf 1×10⁶ Zellen/ml verdünnt, je 1 ml/Vertiefung in Costarplatten mit 24 Vertiefungen aufgeteilt und 24 Stunden mit und ohne rm Interferon gamma (100 units/ml) bei 37⁰ C/5% CO₂ inkubiert. Die Zellkulturen wurden jetzt mit Induktionsmedium ohne FCS 2× gewaschen und für 4 Stunden mit den im gleichen Medium verdünnten Substanzen im Konzentrationsbereich von 0,1-100 µg/ml (1 : 10 Verdünnungsstufen) inkubiert. Die Überstände werden geerntet und bei -70°C eingefroren oder direkt auf TNF-Aktivität untersucht [Sayers, T.J. et al., J. Immunol. 136, 2935-2940 (1987)].

Die Substanzen der Formel I zeigen im Vergleich zu Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella abortus equi relativ hohe TNF-α Induktion, was auf ein relativ hohes endotoxisches Potential schließen läßt aber auch eine hohe Aktivierung der Makrophagen für die Immunabwehr an­ zeigt.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3×104 Zellen/Näpfchen/100/l über Nacht vorkul­ tiviert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (1 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft. Als positive Kontrolle wird in jedem Assay ein TNF-Standard (rec. murine TNF from Genzyme) mit einer Ausgangskonzentration von 1000 units TNF/ml mitgeführt. Angaben in internalen unit TNF human beziehen sich auf Vergleiche mit TNF-human (rec. DNA) code number 86/659 from W.H.O. international labora­ tory for biological standards, Herdfordshire, EN 6 30G.

2. B16F1 Melanom Test

B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁸/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆ D₂ F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetas­ tasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimik­ robiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Im­ munantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herab­ gesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zust­ änden, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung oder supportiven Be­ handlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immun­ defizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizel­ lenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außer­ dem eignen sich die Verbindungen der Formel I für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mit­ tel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Be­ handlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. lndizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel I, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Be­ handlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der lmpfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Insbesondere bevorzugt für die oben angeführten Verwendungsarten ist die

N-[3(R)-[3(R)-[3(R)-Hydroxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetrade-canoyl]glutaminsäure.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen. pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen, hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infek­ tionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutische Mit­ tel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.

Im nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel N-[3(R)-[3(R)-[3(R)-Hydroxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetrade-canoyl]glutaminsäure

250 mg N-[3(R)-[3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetra-decan­ oyl]glutaminsäuredibenzylester werden in 50 ml Tetrahydrofuran über 100 mg Palladium-Ak­ tivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (CHCl₃/CH₃OH/H₂O/ Essigsäure = 80/8/1/1).

Rf (CHCl₃/CH₃OH/H₂O/Essigsäure=80/8/1/1)=0.23
¹H-NMR (CD₃OD/CDCl₃=1/1) : 5.25 (m, 2H, 2×OCOCH); 4.2 (m, 1H, Hα); 4.0 (m, 1H, HCO); 0.90 (t, 9H,3×CH₃).

Der als Ausgangsprodukt benötigte N-[3(R)-[3(R)-[3(R) -Benzyloxytetradecanoyl­ oxy]tetradecanoyloxy]tetradecanoyl]glutaminsäuredibenzylester kann folgendermaßen er­ halten werden.

a) 3(R)-Benzyloxytetradecansäure-tert.butylester

In eine siedende Lösung von 33,45 g 3(R)-Benzyloxymyristinsäure in 250 ml abs. Benzol wer­ den innerhalb von 20 Minuten 96 ml N,N-Dimethylformamid-di-tert.butylacetal zugetropft. Nach weiteren 30 Minuten kühlt man ab, wäscht mit Wasser und Natriumbikarbonatlösung, trocknet die organische Phase und dampft ein. Das Rohprodukt wird über Kieselgel chromatographiert (Hexan/Essigester = 9/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.89
¹H-NMR (CDCl₃): 7.5 (m, 5H, H_arom); 4.55 (d, 2H, PhCH₂O); 3.9 (m, 1H, HCO); 1,45 (s, 9H, tert.Bu); 0.88 (t, 3H,CH₃).

b) 3(R)-Hydroxytetradecansäure-tert.butylester

17,68 g 3(R)-Benzyloxytetradecansäure-tert.butylester werden in 500 ml tetrahydrofuran mit 6,2 g Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Hexan/Essigester = 7/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.6
¹H-NMR (CDCl₃): 3.9 (m, 1H, HCOH); 3.05 (d, 1H, OH); 1,45 (s, 9H, tert.Bu); 0.88 (t, 3H, CH₃).

c) 3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecansäure-tert.butylester-

Man löst 11,5 g 3(R) -Hydroxytetradecansäure-tert . butylester und 12,9 g 3(R) -Ben­ zyloxymyristinsäure in 500 ml trockenem Methylenchlorid und fügt 7,96 g Dicyclohexylcar­ bodiimid und eine Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin zu. Nach 2 Stunden erwärmt man auf Raumtemperatur, rührt über Nacht, filtriert und chromatographiert (Hexan/Essigester = 10/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.9
¹H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 5H, H_arom); 5.22 (dt, 1H, OCOCH); 4,54 (d, 2H, PhCH₂O); 3.87 (dt, 1H, CHO); 1.42 (s, 9H, tert.Bu); 0.88 (t, 3H, CH₃).

d) 3(R)-[3(R)-Hydroxytetradecanoyloxy]tetradecansäure-tert.butylester-

2,7 g 3(R)-[3(R) -Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecansäure-tert . butylester werden in 150 ml Tetrahydrofuran über 0.8 mg Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Hexan/Essigester = 5/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.58
¹H-NMR (CDCl₃): 5.26 (m, 2H, 2×CHOC=O); 4.0 (m, 1H, CHOH); 3.12 (d, 1H, OH); 1.24 (s, 9H, tert.Bu); 0.88 (t, 6H, 2×CH₃).

e) 3(R)-[3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoylory]tetradecanoyloxy]tetradec-ansäure- tert.butylester

Man löst 2,05 g 3(R)-[3(R)-Hydroxytetradecanoyloxy]tetradecansäure-tert.butylester und 1,34 g 3(R)-Benzyloxymyristinsäure in 50 ml trockenem Methylenchlorid und fügt 0,85 g Dicyclohexylcarbodiimid und eine Spatelspitze 4-N, N-Dimethylaminopyridin zu. Nach 2 Stun­ den erwärmt man auf Raumtemperatur, rührt über Nacht, filtriert und chromatographiert (Hexan/Essigester = 10/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.8
¹H-NMR (CDCl₃): 7.33 (m, 5H, H_arom); 5.2 (m, 2H, 2×CHOC=O); (d, 2H, PhCH₂O); 3.87 (m, 1H, CHOBn); 1.43 (s, 9H, tert.Bu); 0.88 (t, 9H, 3×CH₃).

f) 3(R)-[3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetradec-ansäure

2,276 g 3(R)-[3(R)-[3(R) -Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetradecansäure- tert.butylester und 3 ml Trifluoressigsäure in 40 ml trockenem Methylenchlorid werden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird chromatographiert (Hexan/Essigester = 2/1) .

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.3
¹H-NMR (CDCl₃): 7.34 (m, 5H, H_arom); 5.3 (m, 2H, 2×CHOC=O); 4,32 (d, 2H, PhCH₂O); 4.0 (m, 1H, CHOBn); 0.89 (t, 9H, 3×CH₃).

g) N-[3(R)-[3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetra-decanoyl]glu­ taminsäuredibenzylester

0.390 g 3(R)-[3(R)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoyloxy]tetradecanoyloxy]tetradec-ansäure werden in 15 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, bei 0° mit 275 /l N-Methylmorpholin und 65 µl Chlorameisensäure-i-butylester versetzt und 90 Minuten gerührt. Dann fügt man 160 mg Glutaminsäuredibenzylester zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft ein und chromatographiert (Toluol/Essigester = 9/1).

Rf (Hexan/Essigester=4/1)=0.5
¹H-NMR (CDCl₃): 7.3 (m, 15H, H_arom); 6.4 (d, 1H, NH); 5.2-5.0 (m, 6H, 2×OCOCH, 2×OCOCH₂Ph); 4.64 (m, 1H, Hα); 4.53 (d, 2H, PhCH₂O); 3.86 (m, 1H, CHOBn); 0.88 (t, 9H, 3×CH₃).

Claims (2)

1. Glutaminsäureacylderivate der Formel worin R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Alkylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäureacylderivaten der Formel worin R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und jeweils für eineAlkylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Verbindung der Formel worin R₁ bis R₃ obige Bedeutung besitzen, R₄, R₅ und R₆ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Schutzgruppe stehen, die Schutzgruppen nach an sich bekannten Methoden abspaltet.