DE4123366A1 - Acylpentanoylamidoglycinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Acylpentanoylamidoglycinderivate der Formel

worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel 1, indem man aus Verbindun­ gen der Formel

worin R₁ und R₂ obige Bedeutung besitzen und R₃ für eine Schutzgruppe steht, die Schutzgrup­ pe nach bekannten Methoden abspaltet.

Als Schutzgruppen können allgemein übliche Schutzgruppen verwendet werden, beispielswei­ se die Triphenylmethyl-, die tert. Butoxycarbonyl- oder die Benzylgruppe. Die Abspaltung der vorhandenen Schutzgruppen kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise kann die Benzylgruppe durch Hydrieren in Gegenwart eines Katalysators ent­ fernt werden.

Die Verbindungen der Formel 11 können nach folgendem Formelschema erhalten werden:

In diesem Reaktionsschema besitzen R₁, R₂ und R₃ obige Bedeutung. R₄ steht für eine Amino­ schutzgruppe, R₅ für eine Carboxylschutzgruppe. R₁′ und R₂′ besitzen die gleiche Bedeutung wie R₁ und R₂, wobei jedoch eventuell vorhandene Hydroxygruppen durch eine Hydroxyschutz­ gruppe geschützt sein können.

Die Acylierung kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine entsprechende Aus­ gangsverbindung in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmit­ tel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefen Temperaturen, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsge­ misch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenen­ falls gereinigt werden.

R₁ und R₂ sind gleich oder verschieden und bedeuten eine Acylgruppe, vorzugsweise eine Alkylcarbonylgruppe, mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, monosubstituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S- konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel 1 können daher R₁ und R₂ in achiraler Form, in R-, S- oder racemi­ scher Form vorliegen. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfigura­ tion während des Reaktionsablaufs unverändert, d h., ausgehend von R-, bzw. S- oder race­ mischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.

Die Verbindungen der Formel (werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris (hydroxymethyl) aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.

Die Verbindungen der Formel 1 zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:

1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat-Test

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat. Gemes­ sen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endoto­ xinkonzentration (bzw. -aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis.) wird eine Verdünnungsreihe 1:10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Stan­ dard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl- Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendo­ toxins.

2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus

Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS oder LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin- (GaIN) -sensi­ bilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GaIN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 (1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GaIN bzw. auch vor oder nach der GaIN-Behandlung einmal parenteral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman- Kärber-Methode. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen ergab sich eine LD₅₀ von etwa 50 bis 400 µ g/kg.

3. Steigerung der unspezifischen Resistenz gegen mikrobielle Septikämien in der neutropenischen Maus

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten unspezifischen Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆ D₂ F₁-Mäuse 1·200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) paren­ teral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums In einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ12: ca. 3x10⁵, E. coli Δ120: ca. 2·10⁶, Staph. aureus Δ113: ca. 2·10⁶, Candida albicans Δ124: ca. 2·10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards wird die Überlebensrate am Tag 5 nach Infektion als Para­ meter ausgewertet:

Die Verbindungen der Formel 1 zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gram­ negative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabrei­ chung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1·10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionyl­ leucylphenylalanin (10^-6M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 µg Superoxiddismu­ tase, Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhr­ chen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400 xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freige­ setztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen, mit der Maßgabe daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulie­ renden Konzentration von LPS inkubiert werden.

5. Carbon Clearence Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose der Markophagen eliminiert wer­ den können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozy­ tose der Makrophagen in Leber (Kupffer′sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom elimi­ niert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbe­ ginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igem Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g Körpergewicht intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1·10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0.1 ml (z. B. 1,3·10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die Prüfsub­ stanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftre­ tenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:

• a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ),
• b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ),
• c) Durchschnittliche Überlebensdauer,
• d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel 1 zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, vergli­ chen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor)

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus für die Aufrechterhaltung der Haemopoese verant­ wortlich sind und darüber hinaus vielseitige biologische Funktionen im Netzwerk der Immunab­ wehrreaktionen besitzen. Die biologische Eigenschaft von Substanzen, CSFs zu induzieren, wird als mögliches therapeutisches Potential angesehen, das zur Behandlung von Patienten zur Steigerung der zellulären Immunabwehr oder zur beschleunigten Rekonstitution des Blutes nach immunsuppressiver Behandlung eingesetzt werden kann. Zur experimentellen Prüfung von CSF induzierenden Eigenschaften werden die Substanzen parenteral (i.p., i.v.) in Dosie­ rungen von 0,2-50 mg/kg Körpergewicht an B₆ D₂ F₁-Mäuse appliziert. 4-6 Stunden nach der Therapie werden die Tiere entblutet, das Serum gewonnen und auf CSF-Aktivität untersucht. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay bestimmt, bei dem Maus-Knochenmarkszellen aus B₆ D₂ F₁-Mäusen mit verschiedenen Serumkonzentrationen für 7 Tage inkubiert und anschließend die Proliferationsraten der Zellen im Vergleich zu Negativ­ kontrollen bestimmt werden (D. Metcalf, The haemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)).

Verbindungen der Formel 1 zeigen nach parenteraler Verabreichung in Dosierungen von 0,2 bis 50 mg/kg Körpergewicht nach ein- oder mehrmaliger Applikation Induktion hoher CSF-Aktivitä­ ten in Mäusen.

8. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1 -Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Me­ dium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 24-48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/HeJ Mäusen auf IL-1 -Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation ange­ regt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird (J. Gery et al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)). Substanzen der Formel 1 besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1 -Produktion in Makrophagen zu induzieren.

9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)

Durch ein- bis dreimalige parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (siehe auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formel 1 konnte bereits nach einmaliger i p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS- Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung (täglich eine Verabreichung) ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel 1 auch antiinflammatorische Wirkung, insbeson­ dere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konn­ te durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersu­ chungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF₁ α-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF₁ α nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-M® nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüf­ substanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thiogly­ colat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-MΦ gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkür­ zung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen MΦ nach LPS-Behandlung sowie Peri­ tonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ von B₆ D₂ F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign (a) über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüf­ substanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign (b) wurden ebensolche Maus-MΦ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem huma­ nen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten MΦ-Su­ spension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B₆ D₂ F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, Intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal- MΦ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1·1 0⁶/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrie­ ben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringer­ te PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel 1 auch Wirkung gegen Tumore, wie in den fol­ genden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:

1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF)

Die TNF-Induktion wurde in Maus-Knochenmark-Zellkulturen untersucht. Hierfür wurden Kno­ chenmarkszellen von BDF₁ Mäusen für 8-10 Tage in Teflonsäckchen in Proliferationsmedium (DMEM H21 + 10% FCS + 5% Pferdeserum + 15% L 929 Zellüberstand = CSF + Penicillin 10 Units/ml und Streptomycin 100 µg/ml) kultiviert. Durch Zentrifugationsschritte wurden die Zel­ len anschließend gewaschen und im Induktionsmedium (RPMI 1640 + 5% FCS + Penicillin 10 U/ml + Streptomycin 100 µg/ml + 1% Glutamin) auf 1·10⁶ Zellen/ml verdünnt, je 1 ml/Vertiefung in Costarplatten mit 24 Vertiefungen aufgeteilt und 24 Stunden mit und ohne rm Interferon gamma (100 units/ml) bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Die Zellkulturen wurden jetzt mit Induktionsmedium ohne FCS 2× gewaschen und für 4 Stunden mit den im gleichen Medium verdünnten Substanzen im Konzentrationsbereich von 0,1-100 µg/ml (1:10 Verdünnungsstufen) inkubiert. Die Überstände werden geerntet und bei -70°C eingefroren oder direkt auf TNF-Aktivität un­ tersucht (Sayers, T.J. et al., J. Immunol. 136, 2935-2940 (1987)).

Die Substanzen der Formel 1 zeigen im Vergleich zu Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella abortus equi relativ hohe TNF-α Induktion, was auf ein relativ hohes endotoxisches Potential schließen läßt aber auch eine hohe Aktivierung der Makrophagen für die Immunabwehr anzeigt.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3·1 0⁴ Zellen/Näpfchen/100 µl über Nacht vorkulti­ viert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1:2 Stufen weiter­ verdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (1 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der ver­ bliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft. Als positive Kontrolle wird in jedem Assay ein TNF-Standard (rec. murine TNF from Genzyme) mit einer Ausgangskonzentration von 1000 units TNF/ml mitgeführt. Angaben in internationalen unit TNF human beziehen sich auf Verglei­ che mit TNF-human (rec. DNA) code number 86/659 from W.H.O. international laboratory for biological standards, Herdfordshire, EN 6 3QG.

2. B16F1 Melanom Test

B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium syn­ chronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspen­ sion (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆ D₂ F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6,-4 und -1 intra­ peritoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formel 1 können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiel­ len Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Stei­ gerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel 1 sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeits­ reaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel 1 indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei ge­ riatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder general­ isierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel 1 sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Be­ handlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel 1, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel 1, wenn eine einzelne, adjuvante Be­ handlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel 1 auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wie­ derholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Insbesondere bevorzugt für die oben angeführten Verwendungsarten ist das N-(4(S)-(3(R)-Hydroxytetradecanoylamido)-5-(3(R)-tetradecanoyloxytet-radecanoyloxy)­ pentanoylamido)glycin.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel 1, können gemäß gale­ nischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen. pharmazeutisch un­ bedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen, hergestellt werden. Solche Berei­ tungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bil­ den ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektio­ nen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Ver­ bindung der Formel 1 oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kran­ ken, sowie die Verbindungen der Formel 1 zur Verwendung als chemotherapeutische Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.

Im nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel N-[4(S)-[3(R)-Hydroxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyloxytet-rade­ canoyloxy]pentanoylamido]glycin

245 mg N-[4(S)-[3(R)-Hydroxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyloxytet-radeca­ noyloxy]pentanoylamido]glycinbenzylester werden in 80 ml Tetrahydrofuran über 150 mg Palladium-Aktivkohle (10%) über Nacht hydriert. Man filtriert, dampft ein und chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol/Wasser/Eisessig = 80/8/1/1).

Rf (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1) = 0,40
¹H-NMR (CDCl₃): 7,2 (t, 1 H, NH); 6,85 (d, 1 H, NH); 5,21 (m, 1 H, HCOCO); 4,25 (m, 1 H, Hα); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).

Der als Ausgangsprodukt benötigte N-[4(S)-[3(R)-Hydroxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-te­ tradecanoyloxytetradecanoyloxy]pentanoylamido]glycinbenzylester kann folgendermaßen erhalten werden:

A) 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl-oxy]pentansäu­ rebenzylester

970 mg 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-hydroxypentansäurebenzylester und 1,46 g 3(R)-Tetradecanoyloxytetradecansäure, gelöst in 40 ml trockenem Methylenchlorid, werden bei 0° mit 660 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid und einer Spatelspitze 4-Dimethylaminopyridin versetzt. Nach 2 Stunden entfernt man die Kühlung und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man filtriert, dampft ein und chromatographiert (Toluol/Essigester = 9/1).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,6.
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 5 H, H_arom); 5,2 (m, 1 H, HCOCO); 5,13 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,68 (d, 1 H, NH); 4,08 (m, 1 H, Hα); 3,87 (m, 1 H, OCH₂Bn); 1,44 (s, 9 H, tert.-Bu); 0,89 (t, 6 H, 2×CH₃).

B) 4(S)-Amino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]pentansäurebenzy-lester

Eine Lösung von 2,2 g 4(S)-tert.-Butoxycarbonylamino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradeca­ noyloxy]pentansäurebenzylester und 5 ml Trifluoressigsäure in 100 ml Methylenchlorid wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Das Rohprodukt wird ohne Reinigung sofort weiter umgesetzt.

Rf (Chloroform/Methanol = 15/1) = 0,34.

C) 4(S)-[3(R)-Benzyloxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetr-adecanoyl­ oxy]pentansäurebenzylester

Eine Lösung von 2,1 g 4(S)-Amino-5-[3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]pentansäurebenzy-lester (Rohprodukt), 1,24 g 3(R)-Benzyloxytetradecansäure-hydroxysuccinimidester und 0.6 ml N-Ethyldiisopropylamin in 15 ml trockenem Dimethylformamid wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen chromatographiert man (Toluol/Essigester = 14/1).

Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,48
¹H-NMR (CDCl₃): 7,3 (m, 10 H, H_arom); 6,39 (d, 1 H, NH); 5,19 (m, 1 H, HCOCO); 5,1 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,53 (d, 2 H, OCH₂Ph); 4,22 (m, 1 H, Hα); 3,85 (m, 1 H, CHOBn); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).

D) 4(S)-[3(R)-Hydroxytetradecanoylamldo] -5-[3(R)-tetradecanoyioxytetradecanoyl­ oxy]pentansäure:

1,77 g 4(S)-(3(R) -Benzyloxytetradecanoylamido)-5-(3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl­ oxy) pentansäurebenzylester werden in 400 ml Tetrahydrofuran über 500 mg Palladium-Aktiv­ kohle (10%) über Nacht hydriert. Zur Reinigung wird chromatographiert (Methylenchlorid/Me­ thanol/Eisessig/Wasser = 93/7/0,5/0,5).

Rf (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser = 80/8/1/1) = 0,47
¹H-NMR (CDCl₃/CD₃OD = 1/1): 5,23 (m, 1 H, CHOCO); 4,1 (m, 1 H, Hα); 3,95 (m, 1 H, CHOH); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).

E) N[4(S)-(3(R)-Hydroxytetradecanoylamido]-5-[3(R)-tetradecanoyioxytetr-adecanoyl­ oxy]pentanoylamido]glycinbenzylester:

477 mg 4(S)-(3 (R)Hydroxytetradecanoylamido)-5-(3(R)-tetradecanoyloxytetradecanoyl­ oxy)pentansäure werden in 15 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, bei 0° mit 330 µl N-Me­ thylmorpholin und 78 µl Chlorameisensäure-i-butylester versetzt und 90 Minuten gerührt. Dann fügt man 202 mg Glycinbenzylester zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft ein und chromatographiert (Chloroform/Methanol = 19/1).

Rf (Chloroform/Methanol = 15/1) = 0,4
¹H-NMR (CDCl₃): 7,4 (m, 5 H, H_arom); 7,1 (t, 1 H, NH); 6,65 (d, 1 H, NH); 5,2 (m, 1H, HCOCO); 5,19 (s, 2 H, COOCH₂Ph); 4,3 (m, 1 H, Hα); 3,58 (d, 1 H, OH); 0,89 (t, 9 H, 3×CH₃).

Claims (2)

1. Acylpentanoylamidoglycinderivate der Formel worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung von Acylpentanoylamidoglycinderivaten der Formel worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man aus Verbindungen der Formel worin R₁ und R₂ obige Bedeutung besitzen und R₃ für eine Schutzgruppe steht, die Schutzgrup­ pe nach bekannten Methoden abspaltet.