DE3030892A1

DE3030892A1 - Mittel zur steuerung der herstellung und des stoffwechsels von prostaglandin in saeugetieren

Info

Publication number: DE3030892A1
Application number: DE19803030892
Authority: DE
Inventors: Takao Tokyo Ando; Takayoshi Tokyo Fujii; Fumio Tokyo Hirose; Masanori Tachikawa Tokyo Ikuzawa; Kenichi Matsunaga; Minoru Ohhara; Yoshio Funabashi Chiba Ohmura; Chikao Kunitachi Tokyo Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1980-07-03
Filing date: 1980-08-14
Publication date: 1982-01-28
Also published as: DE3051068C2; SE453637B; FR2485926A1; CA1158163A; GB2056856B; GB2056856A; BE887260A; ZA804723B; AU538455B2; PH15186A; JPH0222047B2; CH644018A5; IT8024185A0; FR2485926B1; SE8005575L; AU6100880A; IT1132413B; JPS5716898A

Description

tose gebildet worden ist, und R em Wasserstoff atom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein pharmazeutisch verträgliches Metall ist, und (b) einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel dafür.

In neuerer Zeit ist eine Gruppe von Verbindungen, die allgemein als Prostaglandine bezeichnet werden (nachfolgend als PG oder PGs (Plural) abgekürzt) in den Vordergrund aufgrund der verschiedenen physiologischen Funktionen in lebenden Säugetierkörpern getreten. Da jedoch einige der PGs kurze Halbwertszeiten besitzen oder nicht stabil sind, sind Probleme aufgetreten, PGs als Pharmazeutika zu verwenden.

Es existiert eine Methode zur Steuerung von PGs, die in lebenden Säugetierkörpern erzeugt werden, beispielsweise durch Verabreichung von Aspirin (vgl. Nature, Nr. 239: 33 bis 34, 1972). Aspirin ist jedoch ein Inhibitor von Cyclooxygenase, die an einer früheren Stufe des Stoffwechsels von PGs teilnimmt, so daß Aspirin ein Blocker für alle PGs ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß Aspirin als Regulator für die Erzeugung von allen PGs bezeichnet werden kann und es

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keine Aktivität im Hinblick auf eine Steigerung der Erzeugung eines bestimmten PG oder bestimmter PGs ausübt, so daß eine natürliche Grenze bezüglich der Aktivität von Aspirin als Regulator von PGs gegeben ist. Ferner übt Aspirin insofern Nebenreaktionen aus, als in Säugetieren Störungen des Magen- und Darmtraktes auftreten, so daß Probleme bei einer Langzeitverabreichung von Aspirin die Folge sind.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Verbindung zu schaffen, mit der es möglich ist, PGs zu regulieren, wobei weitgehendst Nebenwirkungen ausgeschaltet werden. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß eine Reihe von Aminobenzoesäurederivaten der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (I) in wirksamer Weise Pgs zu steuern vermag.

Die vorstehend erwähnten Aminobenzoesäurederivate, die erfindungsgemäß als Wirkstoff eingesetzt werden, sind chemisch und physikalisch bekannte Verbindungen. Inoue et al. beschreiben die chemische Synthese der vorstehend genannten Verbindungen (vgl. J. Agr. Chem. Soc. Japan, Band 25, Seiten 59 bis 63 und 291 bis 293 (1951), und Chemical Abstracts, Band 48, Spalten 2001d und 2001Ϊ (1954)). Einige physikalische Eigenschaften der Verbindungen werden in J. Agr. Chem. Soc. Japan, Band 26, Seiten 329 bis 331 (1952) sowie in Chemical Abstracts Band 48, Säule 2003a (1954) beschrieben.

In den vorstehend genannten Literaturstellen findet man jedoch keinen Hinweis auf die physiologischen oder pharmazeutischen Eigenschaften der genannten Verbindungen. Darüber hinaus liegen bisher keine Veröffentlichungen vor, welche ' die physiologischen und/oder pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) beschreiben.

Durch die Erfindung wird ein pharmazeutisches Mittel geschaffen, das Prostaglandine (PGs) neben den Säugetierkörpern zu steuern vermag, welches eineoder mehrere der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthält.

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Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Wirkung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs auf die Aggregation von Plättchen durch Arachidonsäure;

Fig. 2 die Wirkung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs auf die Aggregation von Plättchen durch Adenosindiphosphat (ADP);

Fig. 3 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen durch Kollagen;

Fig. 4 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen durch Epinephrin;

Fig. 5 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen durch Ristocetin;

Fig. 6 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen durch Thrombin;

Fig. 7 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an cyclischem Adenosinmonophosphat (cyclischem AMP) in den Plättchen;

Fig. 8 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Erzeugung von Malondialdehyd (MDA) in den Plättchen;

Fig. 9 die Wirkung von Indomethacin auf die hypotensive Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz;

Fig. 10 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an cyclischen AMP in Krebszellen;

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Fig. 11 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Erzeugung von Prostaglandin I- (PGI-) in 3T3-Fibroblasten;

Fig. 12 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an Prostaglandin F- (PGF₀ „ );

Fig. 13 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an Prostaglandin E (PGE);

Fig. 14 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an PGs in dem Plasma von Ratten, an welche eine erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist;

Fig. 15 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Verhinderung der Aggregation von durch ADP induzierten Plättchen und

Fig. 16 die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz zur

Herabsetzung des Gehaltes an PGE in einer cerebrospinalen Flüssigkeit, erzeugt durch pyrogene Mikroben

Der Wirkstoff des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels (nachfolgend als erfindungsgemäße Substanz bezeichnet), ist eine Verbindung der folgenden Formel (I)

COOR²

NH-R¹

worin R für eine Restgruppe steht, die durch Entfernen von OH von der 1 (CX)- oder 1 (ß)-Position von Arabinose, Xylose, Rhamnose, Glucose, Galactose, Mannose oder Fructose gebil-

2
det worden ist, R ein Wasserstoffatom, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein pharmazeutisch vertragliches Metall darstellt.

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Da die erfindungsgemäßen Substanzen, wie nachfolgend näher erläutert wird, eine extrem geringe akute orale Toxizität besitzen und keine Mutagenizität zeigen, werden die zellulare und humorale Immunität des Wirtstieres nicht beeinflußt und ferner die gastrointestinale Bakterienflora infolge des Fehlens von antibakterieller Aktivität nicht gestört. Eine derartige Substanz kann oral während einer langen Zeitspanne verabreicht werden, ohne daß dabei die Gefahr einer Mutagenese oder Allergie besteht.

Daher sind die erfindungsgemäßen Substanzen sichere Pharmazeutika.

In der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) bedeutet R den Rest eines Monosaccharids, wobei das Monosaccharid entweder in der D-Form oder in der L-Form und entweder ein ÖC-Anomeres oder ß-Anomeres oder eine Mischung aus diesen Anomeren vorliegen kann. Daher können die erfindungsgemäßen Substanzen selbst entweder OC-Anomere oder ß-Anomere oder eine Mischung aus den Anomeren sein.

In der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (I) ist

2
R ein Wasserstoffatom, ein pharmazeutisch verträgliches

Metall, wie Na, K, 1/2 Ca, 1/2 Mg, 1/3 Al oder Alkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl.

Die Methode zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substanzen ist beispielsweise folgende:

Eine Mischung aus 5 g p-Aminobenzoesäure, 5 bjis 6 g eines Monosaccharids, wie L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose oder D-Fructose, und 0,1 bis 0,5 g Ammoniumchlorid, Magnesiumchlorid, Ameisensäure, Essigsäure oder Chlorwasserstoffsäure wird in 40 bis 90 ml eines zu 95 bis 100 % reinen Methanols oder Äthanols unter einem Rückflußkühler zur' Induzierung einer Kondensation erhitzt. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Reaktions-

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gemisch bei Zimmertemperatur oder an einer kühlen Stelle stehen gelassen, worauf die abgeschiedenen Kristalle durch Filtrieren der Reaktionslösung abfiltriert werden. Die Kristalle werden mit Wasser, Äthanol oder Äthyläther gewaschen und dann aus Methanol, Äthanol oder einer wäßrigen Lösung von Methanol oder Äthanol umkristallisiert.

Um das Wasserstoffatom der Carboxylgruppe einer auf diese Weise hergestellten Verbindung unter Verwendung einer Base zu ersetzen, ist es vorzuziehen, eine bekannte Methode anzuwenden. Die Verbindung, beispielsweise p-Aminobenzoesäure-N-pyranosid, wird in einer wäßrigen äthanolischen Lösung aufgelöst und ein anorganisches Salz der Lösung zur ßewirkung einer Substitution zugegeben.

Die physikalischen Eigenschaften einiger erfindungsgemäßer Substanzen (Wirkstoffe der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel), die nach den vorstehend beschriebenen Methoden hergestellt worden sind, gehen aus der Tabelle I hervor. Die in der Tabelle I zusammengefaßten erfindungsgemäßen Substanzen werden nachfolgend als die Proben 1 bis 11 bezeichnet.

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Tabelle I Physikalische Eigenschaften der Wirkstoffe

Pro- Bezeichnung der erfindungsgemäßen Schmelz- spezifische be Substanz punkt, ⁰C Drehung

Nr. f<X]_D20

Elementar analyse (%)

UV-Absorptionsmaxiinum (Millimikron)

Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 157-163 -9 in 48,5

(Zersetzung) Wasser (48,6 5,2

5,0

4,4 4,4)*

317, 248,

Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid

152 - 162 +54 in 51,0

(Zersetzung) Wasser (51,1

5,4
5,2

4,9 4,6)

320, 249,

Natrium-m-aminobenzoat-N-D-mannosid

4R c 130 - 145 +5 (H₂O) $* 5,0
5,0

4,2 4,4)

274

Natrium-p-aminobenzoat-N-D-mannosid

185 - 196 -2 in 46,1 (Zersetzung) Wasser (46,0 5,5
5,3

4,0 4,1)

274

Natrium-p-aminobenzoat-N-D-glucosid 145 - 160

-55 in Wasser

5,2
5,3

4,3 4,1)

274

to 6 Natrium-p-aminobenzoat-N-D-galactose 150-162 +10 in

Wasser 46,0 : 5,6
(46,0 : 5,3

: 4,1 : 4,1)

275

Natrium-p-aminobenzoat-N-D-xylosid

149-158 0 in Wasser 49,3 : 4,9
(49,5 : 4,8

: 4,8 : 4,8)

274

Natrium-p-aminobenzoat-N-Ir-rhamnosid 173-178 +80in

(Zersetzung) Wasser.

51,0:5,1 :4,8 (51,1 : 5,2 : 4,6)

273

Natrium-p-aminobenzoat-N-D-fructosid 180 - 205 - 4 in ' Wasser

48,8 : 4,9
(48,6 : 5,0

: 4,3 : 4,4)

290

Tabelle I (Fortsetzung)

Pro be Nr.	Bezeichnung der erfindungsgemäßen Schmelz- Substanz ' punkt, ⁰C	spezifische Drehung r«.]_D20	Elementar ana lyse (%) . C : H : N	: 4,2 . : 4,2	.: 4,7 : 4,8)	UV-Absorptionsmaximum (Millimikron)
10	Natrium-p-aminobenzoat-N-L-arabinosid 163 - 173 (Zer setzung)	-41 in Was ser	50,0 (49,8	: 6,1 : 6,6	: 4,3 : 4,0)	274
11	Methyl-o-arainobenzoat-N-D-mannosid 177 - 178	-54 in Ätha nol	49,1 (48,1	330, 251

Anmerkungen: *Die in Klammer stehenden Werte sind die theoretischen Werte von C, H und N (%)

(1) Schmelzpunkt: bestimmt unter Verwendung einer Mikroschmelzpunktbestimmungsvorrichtung der Yanagimoto Works, Japan

(2) Spezifische Drehung: bestimmt unter Einsatz eines direkt ablesbaren Polarimeter Modell OR-50 der Yanagimoto Works, Japan, wobei eine wäßrige äthanolische Lösung mit einer Dicke von 50 mm des sauren aktiven Wirkstoffs und eine wäßrige Lösung des Natriumsalzes des sauren aktiven Wirkstoffs verwendet wird

(3) Molekülzusammensetzung: die Elementaranalyse wird unter Verwendung eines CHN-Coder Modells MT 2 der Yanagimoto Works, Japan durchgeführt

(4) UV-Absorpitonsspektrum: es wird unter Verwendung eines selbstaufzeichnenden Spektrophotometers (Modell PS-3T) der Hitachi Works, Japan unter Verwendung einer wäßrigen äthanolischen Lösung des sauren aktiven Wirkstoffs und einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes des sauren aktiven Wirkstoffs des pharmazeutischen Mittels aufgenommen.

Nachfolgend werden die physiologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen zusammengefaßt, und zwar in der folgenden Reihenfolge:

(1) Akute Toxizität, (2) antimikrobielle Aktivität, (3) Mutagenizität, (4) verzögerte intrakutane Reaktion, (5) Antikörper-erzeugende Aktivität und (6) Wirkung auf den Magen

(1) Akute orale Toxizität:

Die akute orale Toxizität der erfindungsgemäßen Substanzen wird unter Verwendung ,yon Gruppen von ICR-JCL-Mäusen unter-

sucht, an die oral representative Beispiele für erfindungsgemäße Substanzen erzwungenermaßen als wäßrige Lösung in destilliertem Wasser oder als wäßrige Suspension ebenfalls in destilliertem Wasser in vorherbestimmten Dosierungen verabreicht werden. Nach einem Beobachten der toxikologischen Symptome, falls derartige Symptome überhaupt auftreten, während 6 Tagen und einem Aufzeichnen deif Mortalität bis zum 7. Tag nach der Verabreichung wird die LD₁-Q (akut oral) nach der Methode von Litchfield-Wilcoxon berechnet. Dann wird eine Autopsie der toten und lebenden Mäuse zur Gewinnung von Informationen durchgeführt.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle II hervor. Wie aus der Tabelle II ersichtlich ist, ist die LD (akut oral) repräsentativer Beispiele erfindungsgemäßer Substanzen sehr groß, woraus hervorgeht, daß diese Substanzen eine extrem geringe Toxizität besitzen.

Tabelle II

Akute orale Toxizität von repräsentativen erfindungsgemäßen

Substanzen

Probe Nr. Bezeichnung der erfindungsgemäßen Substanz LD₅₀ (g/kg) p.o.

1. Natrium-o-aminobenzoat-N-D-galactosid 6,10

2. Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 12,50

3. Natrium-m-aminobenzoat-N-D-mannosid >10

4. Natrium-p-aminobenzoat-N-D-inannosid >10

5. Natrium-p-aminobenzoat-N-D-glucosid >15

6. Natrium-p-aminobenzoat-N-D-galactosid 14,55

7. Natrium-p-aininobenzoat-N-D-xylosid ' 11,75

8. Natrium-p-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 12,80

9. Natrium-p-aminobenzoat-N-D-fructosid ^10

10. Natriurtr-p-aminobenzoat-N-L-arabinosid 10,80

11. Methyl-o-aminobenzoat-N-D-itiannosid > 7,5

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Bei einer Autopsie von toten und lebenden Tieren wurden keine abnormalen Befunde festgestellt.

(2) Antimikrobiell Aktivität:

Die erfindungsgemäßen Substanzen werden in destilliertem Wasser in einer Reihe eines Zweifachverdünnungssystems aufgelöst. Diese verdünnten Lösungen werden mit einem Agarmedium in dem 9-fachen Volumen vermischt und die Mischung in eine Petrischale gegossen. Ein Herzinfusionsagarmedium wird für Bakterien und Sabouraud-Agarmedium für Pilze verwendet. Nach einem Bestreichen mit der Vorkultur werden die beimpften Platten bei 37⁰C 20" bis 24 h im Falle von Bakterien und bei 25⁰C während 3 bis 7 Tagen im Falle von Pilzen bebrütet, worauf das Wachstum untersucht wird. Es werden folgende Mikroorganismen zur Ermittlung der antimikrobiellen Aktivität der erfindungsgemäßen Substanzen verwendet:

Pseudomonas aeruginosa IAM 1514 Escherichia coli IFO 12734 Staphylococcus aureus 209 P Bacillus subtilis IAM 1069 Saccharomyces cerevisiae IAM 4207 Candida albicans ATCC 752 Trichophyton meiitagrophytes IFO 6124 Aspergillus niger IAM 3001

Als Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Tests wird festgestellt, daß keine der getesteten Wirkstoffe eine Wachstumsinhibierung aller Mikroorganismen bei einer Konzentration von 1 mg/ml zeigt.

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(3) Mutagenizität:

In einer ersten Stufe werden die erfindungsgemäßen Substanzen durch Rec-assay (i) und in einer zweiten Stufe durch Reversions-assay (ii) getestet.

(i) Ein Stamm von Bacillus subtilis M 45, welcher eine Rekombination nicht zu heilen vermag, und ein wilder

Stamm von Bacillus subtilis H 17, der eine die Rekombination reparierende Aktivität aufrechtzuerhalten vermag, werden, ohne daß sich ihre Aufstriche kreuzen, am Startpunkt einer B-2 Agarkulturplatte aufgeimpft (hergestellt durch Auflösen von 10g Fleischextrakt, 10g Polypepton, 5 g Natriumchlorid und 15 g Agar in 1000 ml destilliertem Wasser mit einem pH von 7,0). Dann wird eine Papierscheibe mit einem Durchmesser von 8 mm, die 0,04 ml einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz in sterilisiertem Wasser absorbiert hat, auf die Oberfläche der Agarplatte in der Weise gelegt, daß sie den Startpunkt der vorstehend erwähnten Bakterienkulturstreifen überdeckt. Die beimpfte B-2 Agarplatte wird bei 37⁰C über Nacht gehalten und die Länge der Wachstumsinhibierten Region gemessen. Kanamycin wird als negative Vergleichsprobe und Mitomycin als positive Vergleichsprobe verwendet. Die Ergebnisse der Rec-assay gehen aus der Tabelle III hervor.

(ii) Die Stämme von TA 98 und TA 100 (welche beide Histidin

erfordern) von Salmonella typhimurium werden zur Umkehrung der Reversionsassay verwendet.

i In 2 ml eines weichen Agarkulturmediums (das Medium selbst enthält 6 .g Natriumchlorid und 6 g Agar in 1000 ml destilliertem Wasser), dem 0,1 Volumina einer wäßrigen Lösung von 0,5 mM Biotin und 0,5 mM Histidin zugesetzt worden sind, werden 0,1 ml der Bakteriensuspension und 0,1 ml einer wäßrigen Lösung einer erfindungsgemäßen Substanz zugemischt, worauf man die Mischung auf das Minimumagarkulturmedium aufschich-

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tet. Nach 2-tägiger Bebrütung bei 37⁰C wird die Anzahl der umgekehrten Kolonien gezählt. Furylfuramid (AF-2) wird als positive Vergleichsprobe verwendet. Die Ergebnisse des Reversionsassay gehen aus der Tabelle IV hervor.

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, zeigen die erfindungsgemäßen Substanzen eine schwache Mutagenität nur bei einer hohen Konzentration von 5000 Mikrogramm/Scheibe. Wie aus
der Tabelle IV ersichtlich ist, ist bezüglich der Rate des Auftretens von Mutationen durch die erfindungsgemäßen Substanzen kein Unterschied zu der Rate der Vergleichsprobe
festzustellen, der keine Substanz zugesetzt worden ist,
und zwar in einer hohen Konzentration von 5000 \Mikrogramm/ Platte. Diese Erkenntnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Substanzen im Hinblick auf die Mutagenizität sicher sind.

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Tabelle III Ergebnis der Rec-Assay

O O cn

CO

Probe Nr.	Bezeichnung der erfindungsgemäßen Substanz	Konzentration (μ g/ Scheibe)	tiänqe der In hibierung	Unterschied der Wachstums- zone * (mm)
1.	Näfertran-o-aminobenzoate-N-D-galactosid	500 5,000	M 45 H 17 (mm) (mm)	0 5
2.	Natrium- o-aminobenzoate-N-L-rhamnosid	500 5,000	0 0 6 1	0 4
3.	Natrium-m-aminobenzoate-N-D-mannosid	500 5,000	0 0 6 2	0 6
4.	Natrium-p-aminobenzDate-N-D-mannoaid	500 5,000	0 0 7 1	0 0
5.	Natrium-p-aminobenzoate-N-D-glucosid	500 5,000	0 0 0 0	0 0
6.	Natrium-p-aminobenzoate-N-D-galactosid	500 5,000	0 0 0 0 '	0 0
7.	Natrium-p-aminobenzoate-N-D-xylosid	500 5,000	0 0 0 0	0 0
0 0 0 0

σι l

<3 OJ O CX) CD JSJ

tabelle III (Fortsetzung)

ca ο ο a>

8.	Natrium- p-aminobenzoate-N-L-rhamnosid	500 5,000	0 0 0 0	0 0
9.	Natriüm-p-aminobenzoate-N-D-fructosid	500 5,000	0 0 0 0	0 0
10.	Natrium-p-aminobenzoate-N-L-arabinosid	500 5,000	0 0 0 0	0 0
11.	Methyl-o-arainobenzoate-N-D-mannosid	500 5,000	0 0 7 3	0 4
	Kanamycin Mitomycin C	10 Ό.05	5 ' 4 12 2	1 10

Bemerkungen: "^Unterschied = Länge der Inhibierungszone von M 45 minus Länge der Inhibierungszone von H

O OJ Q OO CO

O O σι

CO

Tabelle IV Ergebnisse der Reversionsassay

Probe NC.	Bezeichnuna der erfindungsqemäßen Substanz	. Konzentration (yg/Platte)	Anzahl der umkehrenden Kolonien (Anzahl pro Platte)	TA 98
1.	Natrium- o-aminobenzoate-N-D-galactosid	5,000	TA 100	6
2.	Natrium- o-aminobenzoate-N-L-rhamnosid	5,000	151	9
3.	Natrium- m-aminobenzoate-N-D-mannosid	5,000	61	6
4.	Natrium- p-aminobenzoäte-N-D-mannosid	5,000	90	5
5.	Natrium- p-aminobenzoate-N-D-glucosid	5,000	, 138	11
6.	Natrium- p-aminobenzoate-N-D-galactosid	5,000	104	7
7.	Natrium- p-aminobenzoate-N-D-xylosid ,	5,000 ,	51	4
8.	Natrium -p-aminobenzoate-N-L-rhamnosid	5,000	- 58	4
9.	Natrium- p-aminobefizoate-N-D-fruotosid	5,000	73	5
10.	Natrium- p-aminobenzoate-N-L-arabinosid	5,000	95	3
11.	Methyl-o-aminobenzoate-N-D-mannosid	5,000	51	8
	Purylfuramid- Vergleich (nichts zugesetzt)	0.1	95	167 13
911 149

OO

OJ O CJ CD CO

(4) Verzögerte intrakutane Reaktion:

Um die Wirkungen der erfindungsgemäßen Substanzen auf die Zellimmunität zu erfahren, wurde der Fußpfotenreaktionstest unter Verwendung von ICR-JCL-Mäusen als Versuchstiere und Eryhtrocyten von Schafen als Antigen durchgeführt.

Zunächst wird eine Maus durch Einspritzen von 0,2 ml einer wäßrigen 10 %igen Suspension von Erythrocyten von Schafen in einer physiologischen Kochsalzlösung in die Schwanzvene einer ersten Sensibilisierung unterzogen, worauf 7 Tage nach der ersten Sensibilisierung 0,05 ml einer wäßrigen 40 %igen Suspension von Erythrocyten von Schafen in einer physiologischen Kochsalzlösung in die Fußpfote zur Bewirkung einer zweiten Sensibilisierung eingespritzt werden. Die Dicke der Fußpfote wird am nächsten Tag bestimmt. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgt in einer Dosierung von 250 mg/kg/Tag einmal am Tag während aufeinanderfolgenden 5 Tagen, gerechnet von dem Tag an, an dem die erste Sensibilisierung durchgeführt worden ist.

Die Zunahme der Dicke der Fußpfote der Maus, an welche eine erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, zeigt keinen merklichen Unterschied zu der Zunahme bei der Mäusegruppe, an die kein Wirkstoff verabreicht worden ist.

(5) Antikörper-erzeugende Aktivität:

Um die Wirkungen der erfindungsgemäßen Substanzen auf die humorale Immunität zu ermitteln, wurde der Hämagglutinierungstest unter Verwendung von ICR-JCL-Mäusen durchgeführt, die mit Erythrocyten von Schafen sensibilisiert worden sind.

Eine Maus wurde durch Einspritzen von 0,2 ml einer wäßrigen 10 %igen Lösung von Erythrocyten von Schafen in einer physiologischen Kochsalzlösung in die Schwanzvene sensibilisiert. 7 Tage nach der Sensibilisierung wird eine Blutprobe für

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den Hämagglutinierungstest zur Bestimmung der Antikörpererzeugenden Aktivität entnommen. Die erfindungsgemäßen Substanzen wurden fünf aufeinanderfolgende Tage verabreicht, beginnend mit dem Tag der Sensibilisierung, und zwar intraperitoneal in einer Dosierung von 250 mg/kg/Tag.

Es wurde kein merklicher Unterschied des Agglutinierungsausmaßes zwischen der Gruppe, an welche die erfindungsgemäßen Substanzen verabreicht worden sind, und der Vergleichsgruppe festgestellt.

(6) Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen auf den Magen:

5 g der erfindungsgemäßen Substanzen (jeweils der Proben 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 11) und Aspirin werden jeweils an Beagles mit einem Körpergewicht von 9 bis 12 kg in Form einer wäßrigen Suspension in destilliertem Wasser, eingestellt auf einen pH von 3, verabreicht. 90 Minuten nach der Verabreichung wird der Hundemagen auf eine Blutung untersucht. Man stellt fest, daß nur eine Blutung in den Mägen der Hunde festzustellen ist, an die Aspirin verabreicht worden ist, während keine Blutung in den Mägen der Hunde gefunden werden kann, an die eine der Proben 1 bis 11 verabreicht worden ist.

Nachfolgend werden pharmazeutische Besonderheiten der erfindungsgemäßen Substanzen, die insbesondere auch aus den Beispielen hervorgehen, erläutert. j

(1) Steuerung von Prostaglandin

Die erfindungsgemäßen Substanzen steuern PGs, wie PGA, PGB, PGC, PGD, PGE, PGF, PGG, PGH, PGI, TXA und TXB sowie deren Stoffwechselprodukte. Ferner steuern die erfindungsgemäßen Substanzen nicht nur eines der vorstehend erwähnten PGs, sondern auch verschiedene Arten von PGs.

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Die regulierende Funktion der erfindungsgemäßen Substanzen auf die Erzeugung von PGs sowie ihrer Stoffwechselprodukte gehen aus folgenden Tatsachen hervor:

(a) Unterdrückung einer Aggregation von Plättchen

Es ist bekannt, daß die Aggregation von Plättchen hauptsächlich durch PGG₉, PGH₉ und TXA„ reduziert wird. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen die Aggregation der Plättchen zu unterdrücken vermögen (vgl. die Beispiele 2 und 5).

ibt Erhöhung von cyclischem Adenosinmonophosphat

Es ist bekannt, daß cyclisches Adenosinmonophosphat (cyclisches AMP) in einer engen Verwandtschaft zu PGs, insbesondere zu PGD, PGE und PGI steht. Die erfindungsgemäßen Substanzen zeigen eine Funktion im Hinblick auf eine Erhöhung des Gehaltes an cyclischem AMP in Plättchen und der Zellen in einer Kultur (vgl. die Beispiele 3, 6 und 8).

(c) Unterdrückung der Erzeugung von Malondialdehyd

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen eine inhibierende Wirkung auf die Erzeugung von Malondialdehyd (MDA) in den Plättchen ausüben, wobei MDA als Stoffwechselprodukt von PGs (vgl. Beispiel 4) bekannt ist.

(d) Beschleunigung der Erzeugung von PGI„

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen beschleunigend auf die Erzeugung von PGI₂ in Zellen wirken, die in vitro gezüchtet worden sind (vgl. Beispiel 7).

(e) Untersuchungen betreffend die Erzeugung von einigen PGs

Experimentelle Ergebnisse bezüglich des Stoffwechsels von PGs in vitro unter Verwendung von Arachidonsäure als Aus-

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gangsrnaterial haben gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Sub stanzen die Erzeugung von PGD_, PGE₂, 6-Keto-PGF.. sowie ^PGF2-iX (^¹* Beispiel 1) beeinflussen).

(f) Wirkung auf die Biosynthese von PGE und

In einem in vitro-Kulturversuch von Zellen konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Substanzen eine Wirkung auf die Biosynthese von PGE und PGF__~ zeigen (vgl. die Beispiele 9 und 10).

(g) Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen

Die Untersuchung der Proliferation von Tumorzellen sowie der Gehalt von Intratumorzellen-PGE auf Tumor aufweisende Versuchstiere, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, zeigt eine Inhibierung der Proliferation der Tumorzellen sowie eine Erhöhung des Gehaltes an PGE in Tumorzellen der Tiere, an welche eine erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist (vgl. die Beispiele 11, 12, 13 und 14).

(h) Verstärkende Wirkung bezüglich der Pxgmentübertragung

Bei einem Versuch, bei dessen Ausführung eine erfindungsgemäße Substanz an Tumore aufweisende Versuchstiere verabreicht worden ist, wobei das Ausmaß der Übertragung eines Farbstoffs in das Tumorgewebe des Tieres untersucht worden ist, wird eine verstärkende Wirkung der Übertragung des exogenen Farbstoffs festgestellt, was eine Blutgefäß-erweiternde Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen nahelegt (vgl. das Beispiel 15).

(i) Inhibierung einer Metastase von Tumoren

Bei einem Versuch, bei welchem eine erfindungsgemäße Substanz an Versuchstiere vor und nach der Transplantation von Tumorzellen in die Versuchstiere verabreicht worden ist,

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wurde eine Wirkung bezüglich der Inhibierung einer Metastase der transplantierten Tumorzellen festgestellt (vgl. Beispiel 16).

(j) Herabsetzung des Gehaltes von 6-Keto-PGF. _

Im Falle von Tumor-tragenden Tieren wurde festgestellt, daß der Gehalt an 6-KStO-PGF₁ in ihrem Plasma merklich erhöht ist im Vergleich zu Tieren, die keinen Tumor haben, es wurde jedoch festgestellt, daß ein einmal angehobener Gehalt auf den normalen Gehalt durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz abgesenkt wird (vgl. Beispiel 17).

Im allgemeinen haben sich PGs in verschiedenen Organen des ganzen Körpers angefunden, woraus ihre enge Verwandtschaft zu den Funktionen der Organen hervorgeht. Es ist ferner bekannt, daß die physiologischen und pharmakologisehen Funktionen der PGs einen extrem breiten Bereich umfassen. Dies bedeutet, daß die PGs hauptsächlich auf die Erweiterung und Zusammenziehung von Blutgefäßen aufgrund ihrer pharmakologischen Wirkung auf das Kreislaufsystem wirken, wobei PGE und PGI bezüglich der Ausdehnung stärker wirken und demgegenüber TXA die Arterie zusammenzieht. Diese Funktionen bewirken eine Erhöhung oder Herabsetzung des Blutdrucks, was eine heilende Wirkung auf Stenocardie und Arrhythmie bedeutet.

Obwohl das zu starke Fortschreiten der Wirkung einer Aggregation der Plättchen eine Arteriosklerose, einen zerebralen Infarkt, eine myokardiale Infarktion und eine zerebrale Apoplexie verursacht, üben die PGs eine starke Wirkung auf die Plättchen aus. Dies bedeutet, daß PGD, PGE und PGI eine antagonistische Funktion gegenüber der Wirkung einer Aggregation von Plättchen ausüben. TXA₂/ ^PGG ₂' ^PGH2 ^{und PGE}2 ^{ut>en e:}*-^ne induzierende oder beschleunigende Wirkung auf die Aggregation aus. Daher ist durch eine entsprechende Einstellung der PGs eine Behandlung und Verhinderung der vorstehend erwähn- · ten Krankheiten möglich.

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Von Diabetikern wurde berichtet, daß die Erzeugung von in dem vaskulären System der Patienten, die an Diabetes leiden, begrenzt ist, oder der Gehalt an PGE und PGF„ hoch ist, so daß eine Beziehung zwischen dieser Krankheit und den PGs feststeht.

Die Funktionen von PGs in dem Atmungssystem wurden ebenfalls untersucht. Es ist bekannt, daß PGE die Widerstandsfähigkeit der Luftwege vermindert. Daher fungiert PGE als Antiasthmamittel, beschleunigt die Atmung, dient als Hustenmittel sowie als schleimlösendes Mittel.

Die unterdrückende Wirkung der Freisetzung einer langsam reagierenden Substanz einer Anaphlaxe wird im Falle von PGI₂ und seinen StoffWechselprodukten festgestellt, ferner besitzt PGs eine antiallergische Wirkung und eine antianaphlaxe Wirkung, wobei es sehr wahrscheinlich ist, daß die PGs zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten aufgrund einer Autoimmunisation wirksam sind, insbesondere zur Behandlung von intraktablen Krankheiten, wie Rheumatismus.

Es ist bekannt, daß der derzeit im Handel erhältliche antiinflammatorische Wirkstoff Indomethacin die Cyclooxygenase auf dem Stoffwechselweg von PGs betrifft und verschiedene Arten von PGs mit der inflammatorisehen Wirkung in Beziehung stehen. Es steht daher zu erwarten, daß durch die Steuerung des Stoffwechsels von PGs eine antiinflammatorische Wirkung erzielt wird.

Andererseits zeigen PGs eine starke Wirkung auf das Verdauungssystem. So unterdrücken PGE und PGI die Sekretion von Magensaft, so daß sie eine Wirkung gegen Magengeschwüre entfalten. Die Wirkung ist insbesondere im Falle von PGI ausgeprägt.

Was die Niere betrifft, so ist es bekannt, daß PGI„ hauptsächlich eine diuretische Wirkung zeigt. Von den im Handel

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erhältlichen antihypertensiven Mitteln ist die Position, die von den Diuretika eingenommen wird, immer noch wichtig, so daß eine erhöhte Erzeugung von PGI₂ im Hinblick auf die Wirkung als Diuretikum und als antihypertensives Mittel von Bedeutung ist.

Die pharmakologische Wirkung von PGs auf das Genitalsystem ist ebenfalls bekannt. PGs erleichtern eine Wirkung auf die Uterusbewegung und Uterusspannung oder umgekehrt eine unterdrückende Wirkung auf die Uterusspannung. Diese Funktionen sind die Grundlage für die Untersuchungen von PGs als beschleunigendes Mittel für eine Niederkunft, als Empfängnis-verhütendes Mittel sowie als Mittel zur Unterbrechung einer Schwangerschaft.

Ferner werden PGs als psychonervale Wirkstoffe angesehen. In den Zerebralzellen ist eine erhebliche Menge an PGD verteilt. Derzeit wird eine Beziehung zwischen Epilepsie und PGD beobachtet.

Ec ist bekannt, daß die Lipidperoxidatxon durch Altern und Arteriosklerose beschleunigt wird, so daß die Aktivität von PGI/synthetischem Enzym unterdrückt wird. Ferner ist es bekannt, daß dieses PGI eine stabilisierende Wirkung auf die Lysosommembran ausübt. Diese Tatsachen zeigen den Wert von PGI als antiperoxidisches Lipidmittel, wobei sich die Möglichkeit erschließt, Strahlungsstörungen und Altern zu verhindern.

In neuerer Zeit wurde PGs im .Zusammenhang mit, Krebsen Aufmerksamkeit geschenkt. Es wurden insbesondere Studien unter Einsatz von PGD, PGE und PGI auf dem vorstehend erwähnten Gebiet durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß diese PGs eine unterdrückende Wirkung auf die Proliferation von Krebszellen, die Normalisierung von Krebszellen, die Metastase von Krebsen etc. ausüben. Diese Tatsachen machen es wahrscheinlich möglich, die Proliferation von Krebs zu unterdrücken und die Metastase von Krebs zu verhindern.

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Wie bereits erwähnt wurde, decken die pharmakologischen Funktionen von PGs verschiedene Gebiete ab, so daß es keine Übertreibung ist zu behaupten, daß die PGs mit allen diesen Krankheiten in einem Zusammenhang stehen. Daher läßt die Tatsache, daß die erfindungsgemäßen Substanzen PGs regulieren, die Erwartung zu, daß PGs zur Verhinderung und zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Krankheiten geeignet sind.

Beispielsweise ist eine Antitumoraktivität gegenüber L-ZeI-len von PGE bekannt (D. R. Thomas et al., Experimental Cell Research 84, 40 - 46 (1974)). Ferner ist es bekannt, daß eine Zunahme und Abnahme von PGD mit der Metastase und der Proliferation von Tumoren in Verbindung steht (F. A. Fitzpatrik et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76 (4), 1965 - 1769 (1979)), und daß PGI unterdrückend auf die Proliferation von Tumoren wirkt. Diese Information zeigt nur, daß jedes Prostaglandin eine Antitumoraktivität als eine seiner physiologischen Aktivitäten besitzt. Andererseits geht aus Beispiel 1 hervor, daß die erfindungsgemäßen Substanzen eine Funktion bezüglich der Veränderung der Menge sowohl an PGD als als PGE in Zellen ausüben, d. h. eine Funktion zur Steuerung von PGs ausüben, die voneinander in der gleichen Zelle verschieden ist. An einem anderen Beispiel wird gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen unterdrückend oder beschleunigend auf die TXA und PGI wirken. Diese Tatsache zeigt deutlich, daß die erfindungsgemäßen Substanzen nicht nur ein einzelnes Prostaglandin verändern, sondern auch gleichzeitig verschiedene PGs verändern.

Eine derartige Substanz, die viele Arten von Prostaglandinen gleichzeitig verändert, ist bisher nicht bekannt gewesen. Eine derartige Eigenschaft ist spezifisch für die erfindungsgemäßen Substanzen.

Nachfolgend wird die Formulierung der Wirkstoffe zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln gemäß vorliegender Erfindung erläutert.

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Wird das pharmazeutische Mittel als PGs regulierendes Mittel eingesetzt, dann kann man auf eine pharmazeutische Zubereitung zurückgreifen/ die bezüglich der Art und der Symptome der Krankheit geeignet ist. Darüber hinaus kann der Wirkstoff als solcher oder in Mischung mit einem Verdünnungsmittel, das für pharmazeutische Zwecke verträglich ist, oder mit anderen Arzneimitteln verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel werden oral oder parenteral verabreicht, so daß sie in jeder Form formuliert werden können, die für eine orale oder parenterale Verabreichung geeignet ist.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel können in Form einer Einheitsverabreichung angeboten werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel können in Form von Pulvern, Granulaten, Tabletten, mit Zucker überzogenen Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Suspensionen, Lösungen, emulgierfähigen Konzentraten, in Form von Ampullen, Injektionslösungen etc. formuliert werdend Als Verdünnungsmittel kommt jeder Feststoff, jede Flüssigkeit und jeder Halbfeststoff6 in Frage, beispielsweise Verstreckungsmittel, Bindemittel, Benetzungsmittel, Zerfalls-fordernde Mittel, grenzflächenaktive Mittel, Linderungsmittel, Dispergiermittel, Pufferungsmittel, Parfüms, Schutzmittel, Lösungshilfsmittel und Lösungsmittel verwenden. Darüber hinaus kann man eines oder mehrere dieser Hilfsmittel in Kombination oder in Mischung einsetzen.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel können nach jeder bekannten Methode formuliert werden, wqbei die Menge des Wirkstoffs (erfindungsgemäße Substanz) in dem Mittel (Zubereitung) im allgemeinen zwischen 0,01 und 100 Gew.-% schwankt.

Die pharmazeutischen Mittel gemäß vorliegender Erfindung können oral oder parenteral an Menschen oder Tiere verabreicht werden, wobei jedoch der orale Verabreichungsweg bevorzugt wird. Eine sublinguale Verabreichung fällt unter den Begriff

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der oralen Verabreichung. Eine parenterale Verabreichung umfaßt eine subkutane, intramuskuläre sowie intravenöse Injektion und' eine Injektion nach der Tropfenmethode.

Die Dosis eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels hängt von dem Alter, der Person sowie dem Krankheitszustand sowie von der Tatsache ab, ob es sich um einen Menschen oder um ein Tier handelt, wobei im allgemeinen folgende Dosen eingehalten werden: für Menschen beträgt die orale Dosis 0,1 bis 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag und vorzugsweise 1 bis 500 mg/kg/Tag und die parenterale Dosis 0,01 bis 200 mg/kg/ Tag und vorzugsweise 0,1 bis 100 mg/kg/Tag, aufgeteilt in 1 bis 4 Teile, wobei 1 Teil auf einmal verabreicht wird.

Nachfolgend werden die Formulierungen , die Herstellung sowie die physiologischen Aktivitäten der pharmazeutischen Zubereitungen gemäß vorliegender Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Formulierungsbeispiel 1 (Teil bedeutet Gewichtsteil)

Die folgenden Komponenten werden gleichmäßig vermischt, worauf die Mischung zu einer pulverförmigen Formulierung mit einer mittleren Größe von weniger als 350 μ pulverisiert oder fein granuliert wird.

(1) Natrium-p-aminobenzoat-N-D-galactosid: 10 Teile'

(2) Schweres Magnesiumoxid - : 15 Teile

(3) Galactose : 75 Teile

Die auf diese Weise hergestellte Formulierung wird in der vorliegenden Form oder nach einer Einkapselung verwendet.

Formulierungsbeispiel 2

Die folgenden Komponenten werden gleichmäßig vermischt, pulverisiert und zu einem feuchten Granulat verarbeitet. Dann erfolgt ein Trocknen und ein Aussieben der Körner mit einer Größe von 177 bis 1410 μ:

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(1) Natrium-p-aminobenzoat-N-D-xylosid 45 Teile

(2) Stärke 15 Teile

(3) Galactose 16 Teile

(4) Kristalline Zellulose 21 Teile

(5) Polyvinylalkohol 3 Teile und

(6) Wasser, das zur Herstellung des

feuchten Granulats verwendet wird 30 Teile

Formulierungsbeispiel 3

Anstelle von Natrium-p-aminobenzoat-N-D-xylosid im Falle des Formulierungsbeispiels 2 wird Natrium-o-aminobenzoat-N-L-rhamnosid zur Herstellung einer körnigen Formulierung wie im Formulierungsbeispiel 2 verwendet. Zu 96 Teilen der auf diese Weise hergestellten körnigen Formulierung werden 4 Teile Calciumstearat zugegeben, worauf die Mischung zu Tabletten mit einem Durchmesser von 10 mm kompressionsverformt wird.

Formulierungsbeispiel 4

Zu 90 Teilen der gemäß Formulierungsbeispiel 2 hergestellten körnigen Formulierung werden 10 Teile kristalliner Zellulose und 3 Teile Calciumstearat zugegeben, worauf die auf diese Weise hergestellte Mischung zu Tabletten mit einem Durchmesser von 3 mm kompressionsverformt wird. Die auf diese Weise hergestellten Tabletten werden mit einer gemischten Suspension aus Sirup und Gelatine und ausgefälltem Calciumcarbonat zur Erzeugung von mit Zucker überzogenen Tabletten beschichtet.

Formulierungsbeispiel 5

Die folgenden Komponenten werden unter Erwärmen gut vermischt, worauf die Mischung in einerAmpulle eingefüllt und für In-

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jektionszwecke sterilisiert wird:

(1) Natrium-m-aminobenzoat-N-L-rhamnosid 0,6 Teile

(2) nichtionisches grenzflächenaktives

Mittel 2,4 Teile und

(3) wäßrige physiologische Kochsalzlösung 97 Teile

Beispiel 1

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf den PGs-Stoffwechsel von Arachidonsäure, die in Lymphocyten eingebracht worden ist.

Nach einem Einstellen der Lymphocyten, die aus der Milz einer BALB/C-Maus entnommen worden ist, auf eine Konzentra-

7 3

tion von 1x10 Zellen/ml werden 2 μθϊ H-Arachidonsäure zugesetzt und die Mischung bei einer Temperatur von 37°C während 90 Minuten bebrütet. Die bebrüteten Lymphocyten werden dreimal mit dem Kulturmedium gewaschen. Nach einer erneuten Einstellung der Zellen auf eine Konzentration von 1x10 Zellen pro ml wird die Kultur in 4 mit Silicon ausgekleidete Reagensgläser in einer Menge von 2 ml/Rohr eingefüllt. Zwei Reagensgläser werden zum Vergleich verwendet. In jedes der restlichen zwei Reagensgläser werden 500 μg der erfindungsgemäßen Substanz, in diesem Beispiel der Probe Nr. 7, zugegeben, worauf die vier Reagensgläser bei 37⁰C 60 Minuten bebrütet werden. Nach der Bebrütung werden die Reagensgläser bei 0⁰C 5 Minuten mit 1200 üpm zentrifugiert, i

Die auf diese Weise erhaltenen Zellpellets werden in eine Phiole eingefüllt, die 2 ml Kulturmedium enthalten. Nach der Zugabe von 5 ml Petroläther wird die Phiole geschüttelt und die Ätherschicht entfernt. Die zurückbleibende wäßrige Schicht wird auf einen pH von 3,5 mit einer wäßrigen 0,5 η Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt.

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Die wäßrige saure Lösung wird dreimal mit jeweils 5 ml Äther extrahiert und der Ätherextrakt zur Gewinnung eines Feststoffs getrocknet. Das feste Material wird mit einer Lösung von Diazomethan verestert. Die veresterte Reaktionsmxschung wird einer Dünnschichtchromatographie unterzogen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Äthylacetat, Isooctan, Essigsäure und Wasser (90*50:20: 100, bezogen auf das Volumen) entwickelt. Die Identifizierung der auf diese Weise auf dem Chromatogramm auftretenden Flecken wird unter Verwendung von authentischen Proben von PGD₃, PGE₃, PGF_2-Q, und 6-Keto-PGF.j _-(χ durchgeführt. Die Silicagelschicht des abgetrennten Chromatogramms wird abgekratzt und in einer Flüssigkeit für einen Flüssigkeitsszintilationszähler aufgelöst. Aus der Veränderung der Zählungen wird die Veränderung der PGs bestimmt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle V hervor.

Tabelle V

Veränderung der Prostaglandine in der Zellkultur

in vitro

^^-\^^ PGS Menge. ^~\^^	6-Keto-PGF_n 1-a	^PGF2-a	PGE₂	PGD₂
0	_²>	-	-	-
500	_±3)	+		+

Bemerkungen: 1) Menge, in welcher die erfindungsgemäße

Substanz zugesetzt wird, Probe Nr. 7 (g/ml)

2) Es wird keine Veränderung beobachtet

3) Es wird eine leichte Veränderung beobachtet

4) Es wird eine deutliche Veränderung beobachtet

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Ähnliche Ergebnisse werden in den Fällen erhalten, in denen die Proben 1 bis 6 und 8 bis 10 in einer Menge von 500 μg/IIll eingesetzt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die jeweiligen Substanzen gemäß vorliegender Erfindung den Stoffwechsel von PGs, und zwar auch in einem in vitro-Test, regulieren.

Beispiel 2

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen

Da festgestellt worden ist, daß die Aggregation von Plättchen hauptsächlich durch PGG2/ ^PGH₂ ^und TXA₂ , die jeweils in eine ·PGs-Reihe fallen, induziert wird, wurde die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Aggregation von Plättchen wie folgt untersucht:

Als Antikoagulans wurde eine wäßrige Gitratlösung für die Bestimmung der Erythrocytensedimentation verwendet. Zu 1 Teil der Citratlösung wurden 9 Teile frisch gesammeltes menschliches Blut gegeben. Die Mischung wurde 6 Minuten bei 400XG zentrifugiert und die überstehende Schicht zur Herstellung eines an menschlichen Plättchen reichen Plasma (PRP) verwendet. Der Rest wurde weiter 20 Minuten lang mit 700XG zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit als plättchenarmes Plasma (PPP) eingestuft. Die Veränderung der Durchlässigkeit von PRP wird in einem Agrigometer (Typ PAP-3, hergestellt von der Biodata Co.)_;zur Bestimmung des Ausmaßes der Aggregation der Plättchen gemessen, wobei die Aggregation durch Zugabe eines Agglutinierungsmittels bewirkt wird.

Die eingesetzten Agglutinierungsmittel bestehen aus Arachidonsäure (1,64 mMol), Adenosindiphosphat (50 μΜοΙ), Collagen (0,26 mg/ml), Epinephrin (0,11 mMol), Ristocetin (2,0 mg/ml) und Thrombin (0,5 Einheiten pro ml). Jedes der

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Mittel wird dem PRP 2 Minuten nach der Zugabe einer der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 1 bis 8) zugesetzt.

Die Ergebnisse gehen aus den Fig. 1 bis 6 hervor. Wie aus diesen Fig. zu ersehen ist, zeigt jede getestete erfin-

dungsgemäße Substanz eine inhibierende Wirkung gegenüber der Aggregation der Plättchen, die durch jedes Agglutinierungsmittel verursacht worden ist. Die vorstehend erwähnte Erscheinung zeigt, daß jede der erfindungsgemäßen Substanzen die Erzeugung von PGs steuert, insbesondere die Erzeugung von PGG„, PGH₂ und TXA₂.

Beispiel 3

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an cyclischen! Adenosinmonophosphat (cyclischem AMP)

Cyclisches AMP steht in einer engen Beziehung zu PGs, wobei es ferner als intracellularer Bote bekannt ist. Die Beziehung ist enger zu PGD, PGE und PGI. Daher wird in dem folgenden Beispiel der Einfluß einer erfindungsgemäßen Substanz auf cyclisches AMP in den Plättchenzellen In der folgenden Weise untersucht:

Ein PRP (ein plättchenreiches Plasma) wird nach der vorstehend angegebenen Methode hergestellt und 20 Minuten bei 700XG zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit, die als PPP (plättchenarmes Plasma) bezeichnet w,ird, zentrifugiert. Der Niederschlag wird erneut in dem 1/3-fachen Volumen an PPP zur Herstellung eines dreifach konzentrierten PRP verteilt.

Zu dem auf diese Weise hergestellten konzentrierten PRP wird jeweils eine wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen Substanz in einer vorherbestimmten Konzentration (in diesem Falle die Proben 4, 7 und 8) und eine wäßrige physiologische

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Kochsalzlösung zugesetzt, worauf die Mischung bei Zimmertemperatur 5 Minuten bebrütet wird. Dann wird in der angegebenen Reihenfolge gekocht, homogenisiert und zentrifugiert, wobei 50 μΐ der überstehenden Flüssigkeit für die Messung von cyclischem AMP verwendet werden. Die Messung wird nach der Methode von Gilman durchgeführt. Als positive Vergleichsprobe wird PGE₁ verwendet. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 7 hervor. Wie aus Fig. 7 hervorgeht, wird im vorliegenden Falle eine Erhöhung des Gehaltes an Intraplättchen-zellularem cyclischem AMP festgestellt, wobei aus dieser Tatsache zu entnehmen ist, daß die erfindungsgemäße Substanz den Stoffwechsel von PGs beeinflußt.

Beispiel 4

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt von Malondialdehyd (MDA) von Plättchen:

PRP, das aus menschlichem Blut gesammelt worden ist, wird zentrifugiert und zur Gewinnung von "gewaschenen Plättchen" gewaschen. Nach der Zugabe einer der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 4, 7 und 8) zu den gewaschenen Plättchen wird Caionophore A-23187 zugesetzt und die Mischung 5 Minuten bei 37⁰C bebrütet. Dann wird Thiobarbitursäure der bebrüteten Mischung als Farbentwickler zugegeben, worauf die Mischung mit einer Lösungsmittelmxschung aus Methanol und Butanol extrahiert wird. Die Absorption bei 535 nm wird colorimetrisch zur Bestimmung der Menge an Malondialdehyd (MDA) durchgeführt. Die Ergebnisse gehen aus

der Fig. 8 hervor. Die erfindungsgemäße Substanz unterdrückt die Erzeugung von MDA. Aus dieser Tatsache ist ferner die Teilnahme der erfindungsgemäßen Substanz am Stoffwechsel von PGs wahrscheinlich.

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Beispiel 5

Wirkung von Indomethacin auf die hypotensive Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz

Es ist bekannt, daß PGs aus Arachidonsäure erzeugt werden und Cyclooxygenase an der Umwandlung von Arachidonsäure in PGG~ teilnimmt, daß Indomethacin die vorstehend erwähnte Cyclooxygenase inaktiviert und daß der Stoffwechsel von PGs vollständig durch Zugabe von Indomethacin abgestoppt wird.

Daher wird der Übergang des Blutdrucks von spontan hypertensiven (SHR) männlichen Ratten 30 bis 40 Wochen nach der Geburt in beiden Fällen verglichen, wobei (1) nur die erfindungsgemäße Substanz in einer Menge von 100 mg/kg verabreicht wurde und (2) Indomethacin zweimal in einer Menge von 2,5 mg/kg/Zeitpunkt vor und nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz verabreicht wird. Die erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe Nr. 7, wird in destilliertem Wasser aufgelöst oder in einer 2 %igen wäßrigen Lösung von Carboxymethylcellulose dispergiert und unter Zwang oral verabreicht. Indomethacin wird in einer wäßrigen 2 %igen Lösung von Carboxymethylcellulose dispergiert und die Dispersion unter Zwang oral 1 Stunde vor und nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz verabreicht. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 9 hervor. Die hypotensive Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz verschwindet in dem Falle, in welchem Indomethacin vor und nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz verabreicht wird. Berücksichtigt man, daß Indomethacin ein Inhibitor für den Stoffwechsel von Prostaglandin ist, dann ist die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz bezüglich der Herabsetzung des Blutdrucks auf seine enge Beziehung zu Prostaglandin zurückzuführen.

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Beispiel 6

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt
von cyclischen AMP in Tumorzellen von Sarkom 180

Die erfindungsgemäße Substanz wird zu 100 μΐ von Ascites-Tumoren gegeben, die aus der Bauchhöhle von Sarkom 180 enthaltenden Mäusen entnommen worden sind, und zwar bis zu einer vorherbestimmten Konzentration. In diesem Falle wird die Probe Nr. 7 verwendet und die Mischung bei Zimmertemperatur während 5 Minuten bebrütet. Nach der Bebrütung wird die Kultur gekocht, homogenisiert und zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die auf diese Weiseerhaltene überstehende Flüssigkeit wird auf cyclisches AMP nach der Methode von Gilman untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 10 hervor. Eine Funktion der erfindungsgemäßen Substanz zur Erhöhung des Gehaltes an cyclischen! AMP in den Tumorzellen von Sarkom 180 wird festgestellt. Die Teilnahme der erfindungsgemäßen Substanz am
Stoffwechsel von PGs läßt sich aus dieser Tatsache ableiten.

Beispiel 7

Einfluß der erfindungsgemäßen Substanz auf die PGI₃-PrC
duktivität von 3T3-Fibroblasten

Der Einfluß einer erfindungsgemäßen Substanz auf die ₃ Produktivität der 3T3-Fibroblasten einer Maus wird untersucht. Zum Vergleich wird eine Kultur verwendet, in der
Arachidonsäure, der Vorläufer von PGs, einem Kulturmedium von Mäuse-3T3-Fibroblasten zugesetzt worden ist. Die Mischung wird 5 Minuten bei 37⁰C zur Erzeugung von PGI₂
bebrütet.

Andererseits werden jeweils 30 mMol einer der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben 1, 3, 4 und 7 bis 11) 4 ml ei-

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nes Kulturmediums von 3T3-Zellen zugesetzt, worauf die Mischung 2 Minuten bei 37⁰C bebrütet wird. Nach der Zugabe von Arachidonsäure zu der bebrüteten Kultur wird diese erneut wie im Falle des Vergleichsversuchs zur Erzeugung von PGI₂ bebrütet. Die gerade erwähnte Kultur wird als "behandelte Gruppe" bezeichnet.

Nach der Gewinnung der jeweiligen überstehenden Flüssigkeiten der Kulturen werden die Vergleichsprobe sowie die behandelte Gruppe bezüglich ihrer Produktivitäten von PGI2
verglichen, wobei die unterdrückende Wirkung auf die Aggregation der Plättchen als Indikator verwendet wird, die
durch die Zugabe von 2,43 mMol Arachidonsäure induziert
wird.

Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 11 hervor. Wie die Fig. 11 zeigt, wird zwar eine Unterdrückung einer Plättchenaggregation in einem gewissen Ausmaße im Falle der Vergleichsprobe 5 Minuten nach der Zugabe von Arachidonsäure als Vorläufer von PGs festgestellt, eine merkliche Unterdrückung wird jedoch im Falle der behandelten Gruppe ermittelt, woraus
die erhöhte Produktivität von PGI₂ durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanz manifestiert wird.

Beispiel 8

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf den Stoffwechsel von cyclischem AMP und cyclischem Guanosinmonophosphat in Krebs-tragenden Mäusen i

Ehrlich-Krebszellen werden in den Bauchraum von weiblichen ICR/JCL-Mäusen 5 Wochen nach der Geburt in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Tier transplantiert. Während die Mäuse gefüttert werden, wird die erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe Nr. 7, intraperitoneal an die Mäuse jeden Tag anschließend an den Tag der Transplantation 5 Tage lang in einer Menge von 200 mg/kg/Tag verabreicht. Am sechsten

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" ³⁸ " 30308^2

Tag werden die Mäuse mit Äther getötet, wobei jeweils 5 ml Ascites gesammelt werden. Nach einer Zugabe von Tetranatriumäthylendiamintetraacetat in die auf diese Weise gesammelten Ascites wird die Mischung 10 Minuten bei einer Temperatur von 4⁰C sowie bei 1500 Upm zur Abtrennung einer überstehenden Flüssigkeit sowie der Krebszellen zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird erneut bei 4⁰C und 3000 Upm 15 Minuten zentrifugiert. Die abgetrennten Krebszellen werden mit Hank'scher Lösung gewaschen und dann erneut 5 χ mit 800 üpm jeweils 5 Minuten zur Entfernung von Verunreinigungen, wie Eryhtrocyten etc., zentrifugiert. Nach

einer Homogenisierung von 1x10 Krebszellen in 3 ml einer wäßrigen 6 %igen Lösung von Trichloressigsäure bei einer Temperatur von 0⁰C wird das Homogenat 20 Minuten bei 300OXG zur Gewinnung eines flüssigen Extrakts zentrifugiert. Nach der Zugabe von 10 Gew.-% einer wäßrigen 1n Lösung von Chlorwasserstoffsäure zu dem flüssigen Extrakt wird dieser 5 χ mit jeweils dem zweifachen Volumen Äther zur Entfernung von Trichloressigsäure extrahiert. Nach einer vollständigen Entfernung des Äthers durch Erwärmen der zurückbleibenden Flüssigkeit auf einem Wasserbad mit 80⁰C wird der Rückstand gefriergetrocknet.

Zu der überstehenden Ascitesflüssigkeit wird eine gleiche Menge einer wäßrigen 10 %igen Lösung von Trichloressigsäure zugesetzt. Nach einem Stehenlassen während 15 Minuten bei einer Temperatur von 0⁰C wird 20 Minuten mit 3000XG zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltene überrstehende Flüssigkeit wird mit 0,1 ml einer wäßrigen 1n Lösung von Chlorwasserstoff säure versetzt. Nach einem Entfernen der Trichloressigsäure mit dem zweifachen Volumen Äther wird der Äther vollständig auf einem Wasserbad mit eine:r Temperatur von 80⁰C entfernt und der Rückstand gefriergetrocknet.

Beide gefriergetrockneten Proben, die aus den Krebszellen bzw. der überstehenden Ascitesflüssigkeit stammen, werden jeweils in 1 ml einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH

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gereicht]

•ACHGEREICHT

von 4,0, die 50 mMol Essigsäure enthält, aufgelöst und einer Radioimmunoassay unter Verwendung von anticyclischem AMP Antikörper und anticyclischem Guanosinmonophosphat (GMP)-Antikörper zur Bestimmung von cycli schein AMP bzw. cyclischen! GMP in den Krebszellen sowie in der überstehenden Ascitesflüssi.gkeit unterzogen. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle Va hervor. Es wird eine Erhöhung des Gehaltes an cyclischem AMP und cyclischem GMP in den Krebszellen festgestellt, wobei die Krebszellen auf eine Ratte zurückgehen, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist. Aus dieser Tatsache läßt sich der Einfluß der erfindungsgemäßen Substanz auf den Stoffwechsel in vivo von cyclischem AMP und cyclischem GMP der Krebszellen, die auf die transplantierten Krebszellen in dem Mäusekörper zurückgehen, feststellen.

Tabelle Va

Grad an cyclischem AMP und cyclischem GMP

Einheit: pM

Gruppe

cyclisches AMP pro cyclisches GMP pro

10 Krebszellen

Vergleich

erfindungsgemäße Substanz

19,5

21,2

0,59

0,72

Beispiel 9 ,

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Menge an PGs in einem Kulturmedium, in welchem menschliche Leukämiezellen gezüchtet werden

Auf jeweils 10 ml eines Kulturmediums, hergestellt durch

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Zugabe von 10 % Rinderfötusserum und einer der erfindungsgemäßen Substanzen, und zwar der Probe Nr. 7, in einer Konzentration von 50, 500 oder 5000 μg/ml zu einem Eagle-Kulturmedium, das in einem Polystyrolkolben mit einer Bodenoberfläche von 75 cm² vorliegt, werden 5 χ 10 gezüchtete Zellen eines menschlichen zweikernigen Leukämie-J-111-Stamms aufgeimpft und bei 37°C unter einer gemischten Atmosphäre aus 5 Volumen-% gasförmigem Kohlenmonoxid und 95 Volumen-% Luft 7 Tage gezüchtet. Während des Züchtens wird das Kulturmedium am zweiten Tag und am vierten Tag durch ein frisches Medium ersetzt. Jedes verbrauchte Medium wird so bald wie möglich bei einer Temperatur von 4⁰C mit 1500 Upm zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit des Kulturmediums zentrifugiert. Der Gehalt an PGE und PGF„_/y in jeder überstehenden Flüssigkeit wird mittels eines -%-Prostaglandin-E-Radioimmunoassay Kits und eines H-Prostaglandin-F-Radioimmunoassay Kits (hergestellt von der Clinical Assay Co. U.S.A.) bestimmt.

Die Ergebnisse gehen aus den Fig. 12 und 13 hervor. Wie aus Fig. 12 hervorgeht, steigt die kumulierte Menge an PGF-A/ im Verlaufe der Zeit an. Der Fig. 13 ist zu entnehmen, daß die kumulierte Menge an PGE im allgemeinen im Verlaufe der Zeit abnimmt. Die Zunahmerate an ^PGF

mit steigender Konzentration der erfindungsgemäßen Substanz erhöht, und die Abnahmerate an PGE mit steigender Konzentration der erfindungsgemäßen Substanz gesteigert. In jedem Falle wird eine Teilnahme der erfindungsgemäßen Substanz an dem Stoffwechsel von PGs aus den Fig. 12 und 13 festgestellt. j

Beispiel 10

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Menge an PGs in einem Kulturmedium, in dem menschliche Uteruskrebszellen gezüchtet werden

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3Q3Q892

Zu jeweils 10 ml eines Kulturmediums, hergestellt durch Zugabe von 10 % Rinderfötusserum und einer der erfindungsgemäßen Substanzen, und zwar der Probe Nr. 7, in einer Konzentration von 0 (Vergleichsprobe), 10, 100, 500, 1000 oder 5000 μg/ml zu eine Eagle Kulturmedium in einem Polystyrolkolben mit einer Bodenoberfläche von 75 cm², werden gezüchtete HeLa S3 Zellen eines menschlichen Uteruskrebses in einer Menge von 5x10 Zellen/Kolben gegeben, worauf bei 37⁰C während 2 Tagen unter einer gemischten Atmosphäre von 5 Volumen-% gasförmigem Kohlendioxid und 95 Volumen-% Luft gezüchtet wird. Nachdem die Bebrütung beendet ist, wird das ganze Kulturmedium bei einer Temperatur von 4⁰C mit 1500 üpm zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit des gezüchteten Mediums zentrifugiert. Der Gehalt an PGE in der überstehenden Flüssigkeit wird mittels eines H-Prostaglandin-E-Radioimmunoassay Kits ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VI hervor.

Wie aus der Tabelle VI ersichtlich ist, wird die Menge an PGE in dem Kulturmedium (ohne Krebszellen) durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanz herabgesetzt. Diese Tatsache zeigt die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf den Stoffwechsel von PGs.

	Tabelle VI	Zellen)	+120
Gehalt an PGE in dem	Kulturmedium (ohne	Konzentration von PGE Veränderung der nach dem Züchten Konzentration (pg/ml) von PGE während des Züchtens (pg/ml)	-152
Konzentration der erfin dungsgemäßen Substanz ^g/ml)		312	-112
0 (Vergleich)	40	-144
10	80	-167
100	48	-167
500	25
1000	25
5000

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- ⁴² - 3030882

Beispiel 11

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf PGE in Krebszellen und in Ascites von Mäusen, in die Ehrlich-Krebszellen transplantiert worden sind

In eine Gruppe von weiblichen ICR-JCL-Mäusen werden 5 Wochen nach ihrer Geburt Ehrlich-Krebszellen intraperitoneal in einer Menge von 1x10 Zellen/Tier transplantiert, worauf eine der erfindungsgemäßen Substanzen, und zwar die Probe Nr. 7/ intraperitoneal an die Mäuse jeden Tag, beginnend vom auf die Transplantation folgenden Tag, während 5 Tagen in einer Menge von 200 mg/kg/Tag verabreicht wird. Die Mäuse werden mit Äther am 6. Tag nach der Transplantation getötet und die Ascites gesammelt. Nach der Zugabe von Tetranatriumäthylendiamintetraacetat mit 1 Gew.-% Aspirin zu den Ascites wird das Material 10 Minuten bei 1500 üpm sowie bei einer Temperatur von 4⁰C zur Abtrennung der Krebszellen und der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird weiter bei 4°C und 3000 Upm 15 Minuten zentrifugiert. Die abgetrennten Krebszellen werden mit einer Hank¹ sehen Lösung gewaschen und dann fünfmal mit 800 Upm jeweils 5 Minuten zur Entfernung von Verunreinigungen, wie Erythrocyten etc., zentrifugiert. Die auf diese Weise gereinigten Krebszellen (1x10) werden bei 0⁰C nach der Zugabe von 7 ml Methanol homogenisiert, worauf das Homogenat mit Filterpapier filtriert wird. Nach der Zugabe von 14 ml Chloroform zu dem Filtrat und einem Vermischen läßt man die Mischung 30 Minuten bei einer Temperatur von 4⁰C stehen. Dann wird ausgefälltes Protein durch Saugfiltration entfernt und das auf diese Weise erhaltene Filtrat in einen Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft. Das getrocknete feste Material wird in einen Scheidetrichter zusammen mit Chloroform, Methanol und einer wäßrigen verdünnten Lösung von Chlorwasserstoffsäure mit einem pH von 2 eingefüllt. Nach einem gründlichen Vermischen löst es sich in der unteren wäßrigen Schicht in Form einer Lösung von 2 ml. Der Gehalt

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an PGE in der Lösung sowie in der überstehenden Flüssig-

3 keit der Ascites wird mittels eines H-Prostaglandin-E-

Radioimmunoassay Kits bestimmt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VII hervor. Im Falle der Tiere, in welche Krebszellen transplantiert worden sind, und an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, ist PGE in einer größeren Menge in den Krebszellen enthalten und liegt in einer kleineren Menge in der überstehenden Ascitesflüssigkeit vor im Vergleich zu den Tieren, in welche die gleichen Krebszellen transplantiert worden sind, an die jedoch nicht die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist. Diese Tatsache zeigt deutlich die Beziehung zwischen der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz und dem Stoffwechsel von PGs.

Tabelle VII

Gehalt an PGE in Krebszellen und Ascites (überstehende Flüssigkeit)

Gruppe Gehalt an PGE in 10 Zellen Gehalt an PGE in der überste-

(ng) herden Ascitesflüssigkeit

(ngj

Vergleich 2,36 0,26

erfindungsgemäße Substanz 3,06 0,12

Beispiel 12

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf, die Menge an PGE in Ehrlich-Krebszellen sowie gegenüber einer Tumorproliferation

Ehrlich-Krebszellen werden subkutan in Gruppen von weiblichen C57BL/6-Mäuse 9 Wochen nach ihrer Geburt in einer Menge von 1x10 eintransplantiert. Während die Mäuse gefüttert werden, wird die erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Pro-

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be Nr. 7, intraperitoneal an die Mäuse verabreicht, und zwar jeden Tag beginnend von dem Tag nach der Transplantation in einer Menge von 100 mg/kg. Am 14. Tag nach der Transplantation werden die Mäuse mit Äther zur Entnahme des Tumorgewebes getötet. Nach einem feinen Homogenisieren des Tumorgewebes mit Scheren unter Zugabe von 7 ml Methanol pro Gramm des "Tumorgewebes bei einer Temperatur von O⁰C wird das Homogenat mit Filterpapier zur Gewinnung eines Filtrats filtriert. Nach der Zugabe des zweifachen Volumens an Chloroform zu dem Filtrat wird die Mischung gut vermischt und 30 Minuten bei 4°C stehengelassen. Dann wird die kalte Mischung der in Beispiel 11 beschriebenen Methode zur Bestimmung des Gehaltes an PGE in dem Tumorgewebe unterzogen. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VIII hervor. Der Gehalt an PGE in dem Tumorgewebe ist größer im Falle der Tiere, in welche die Krebszellen transplantiert worden sind, und an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, als im Falle der Vergleichstiere, in welche die gleichen Krebszellen transplantiert worden sind, an welche jedoch nicht die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist. Diese Tatsache liefert eine Information bezüglich der Teilnahme der erfindungsgemäßen Substanz an dem Stoffwechsel von PGs.

Tabelle VIII Gehalt an PGE im Tumorgewebe

Gruppe Gewicht des Tumorge- Gehalt an PGE in dem webes (g) Tumorgewebe (ng/g)

. 1,77 3,98

Vergleich	1,30
erfindungsgemäße
Verbindung	0,75

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Beispiel 13

Wiederholung des Versuchs gemäß Beispiel 12 unter leicht abweichenden Bedingungen

Ehrlich-Krebszellen werden subkutan in Gruppen von weibliehen C57BL/6-Mäusen 8 Wochen nach ihrer Geburt transplantiert. Während die Mäuse gefüttert werden, wird eine erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe 7, oral an jede Maus verabreicht, und zwar jeden Tag in einer Menge von 1 g/kg/Tag. Am siebten oder am vierzehnten Tag nach der Transplantation werden die Mäuse mit Äther zur Herausnahme des Tumors getötet. Der Tumor wird nach der in Beispiel 11 beschriebenen Methode zur Bestimmung des Gehaltes an PGE behandelt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IX hervor. Die Konzentration an PGE in dem Tumor ist größer im Falle der Tiere, in welche die Zellen transplantiert worden sind, und an welche die- erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, als im Falle der Vergleichstiere, in welche die gleichen Zellen transplantiert worden sind, an die jedoch nicht die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist. Ferner stellt man fest, daß der Gehalt an PGE in beiden Gruppen im Verlaufe der Zeit abnimmt, und daß die Abnahmegeschwindigkeit kleiner ist im Falle der Gruppe, in welche die Zellen transplantiert worden sind, und an welche die Substanz verabreicht worden ist, als im Falle der Vergleichsgruppe, in welche die Zellen transplantiert worden sind, an die jedoch keine Substanz verabreicht worden ist. Diese Tatsache liefert eine Information darüber, daß die erfindungsgemäße Substanz an dem Stoffwechsel von PGE teilnimmt.

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"⁴⁶~ 3030882

Tabelle IX

Gehalt an PGE im Tumor

Gruppe	Zeitpunkt der Herausnahme nach der Transplantation	Gewicht Tumors	des (g)	Gehalt an PGE in dem Tumor (ng/q)
Vergleich	7. Tag 14. Tag	0,09 0,84		2,59 1,16
erfindungsge mäße Substanz	7. Tag 14. Tag	0,08 0,67		2,80 1,65

Beispiel 14

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an PGE in dem Tumor von Adenokarzinom 755 sowie gegen dessen Proliferation

Adenokarzinom-755-Tumorzellen werden subkutan in Gruppen von weiblichen C57BL/6-Mäusen 8 Wochen nach ihrer Geburt transplantiert. Während die Mäuse gefüttert werden, wird eine erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe 7, oral jeden Tag verabreicht, und zwar beginnend am Tag nach der Transplantation in einer Menge von 1 g/kg/Tag. Die Mäuse werden am 7. oder 14. Tag nach der Transplantation zur Herausnähme des Tumors getötet. Der herausgenommene Tumor wird nach der in Beispiel 11 beschriebenen Methode zur Bestimmung des Gehaltes an PGE in dem Turner untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle X hervor. Wie aus der Tabelle X ersichtlich ist, nimmt der Gehalt an PGE in dem Tumor im Verlaufe der Zeit in beiden Gruppen ab, wobei beide Gruppe eine Transplantation erfahren haben und an eine die Verbindung verabreicht worden ist. Der PGE-Gehalt ist reproduzierbar höher in der Gruppe, an welche die erfindungsgemäße Verbindung verabreicht worden ist, und zwar gegenüber der Vergleichsgruppe. Diese Tatsache zeigt die Teilnahme der erfindungsgemäßen Verbindung an dem Stoffwechsel von Prostaglandin.

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Tabelle X

PGE-Gehalt in dem Tumor

Gruppe Zeitpunkt der Heraus- Gewicht des Tumors Gehalt an PGE in

nähme nach der Trans- (g) dem Tumor

plantation (ng/g)

Vergleich 7. Tag 1,34 0,67

14. Tag 4,01 0,34

erfindungsgemäße 7. Tag 1,04 2,83 Substanz ₁₄

Beispiel 15

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die Wanderung eines Farbstoffs von dem injizierten Abschnitt zu dem transplantierten Tumor

Auf den Rücken einer Donryu-Ratte wird ein Teil eines Sato-Lungenkrebses mit einer Größe von 5 mm subkutan trans- _t plantiert.

Auf den Achselteil einer ICR-Maus werden 10 Sarkom 180-Zellen subkutan transplantiert. Während beide Tiere gefüttert werden, wird die erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe 7, unter Zwang oral in einer Portion in einer Menge von 1000 mg/kg am 16. Tag nach der Transplantation verabreicht. Eine wäßrige 2 %ige Lösung von Lissamine Green (ein Farbstoff, der von der Imperial Chem. Ind. Co. hergestellt wird) wird in die Schwanzvene des Tieres in einer Menge von 1 ml pro Ratte und 0,5 ml pro Maus injiziert.

Eine Stunde nach der Injektion werden die Tiere zur Herausnahme des proliferierten Tumors getötet. Der Tumor der Ratte wird fein zerschnitten und mit einer wäßrigen 50 %igen

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Lösung von Äthanol homogenisiert. Nach einem Verdünnen des Homogenats durch Zugabe einer Lösung ζμΓ Einstellung eines Gesamtvolumens von 50 ml wird die Flüssigkeit 15 Minuten bei 1000 Upm zur Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Der Farbstoffgehalt wird in der überstehenden Flüssigkeit selbst oder nach einer Verdünnung durch Spektrophotometrie unter Anwendung des Absorptionsmaximum von 630 nm bestimmt. Der Tumor der Maus wird aufgeschnitten und das Vorliegen des Farbstoffs mit dem bloßen Auge an dem Querschnitt des Tumors beobachtet.

Die Farbstoffmenge, die in dem Sato-Lungenkrebs pro Gramm Krebs vorliegt, geht aus der Tabelle XI hervor.

Tabelle XI

Gruppe Färbstoffmenge ^g/g Tumor)

Vergleich 30,0

erfindungsgemäße ^_{1 n}

Substanz '

Durch visuelle Beobachtung wird eine merkliche Sedimentation des Farbstoffs in dem zentralen Teil des Tumors im Falle von Sarkom 180 in den Mäusen festgestellt, an welche die erfindungsgemäße Substanz verfüttert worden ist. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Substanz ein Antikrebswirkstoff zur Bekämpfung eines Tumors ist, wobei ersichtlich ist, daß die Substanz an dem Stoffwechsel von PGE teilnimmt. '

Beispiel 16

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Verhinderung einer Metastase eines transplantierten Tumors

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MH-134 Tumorzellen werden in eine C,H/He-Maus in die Schwanzvene in einer Menge von 2x10 Zellen pro Tier eingebracht. Die erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe 7, wird an die Maus 6, 3 bzw. 1 Stunde vor sowie 1, 3 bzw. 6 Stunden nach der Transplantation auf einmal in einer Menge von 1000 mg/kg erzwungenermaßen p. o. verabreicht.

Die Maus wird am 14. Tag nach der Transplantation zur Herausnahme der Lungen und zur Bestimmung der Anzahl der metastatischen Verletzungen getötet. Das Ausmaß einer positiven Metastase sowie die Anzahl der metastatischen Verletzungen gehen aus der Tabelle XII hervor.

Tabelle XII

Gruppe Ausmaß der positiven Metastase Anzahl der meta-

(%) statischen Verletzunqen

verabreicht

6 h vor 10/10 (100 %) 2,3

3 h'vor 8/9 (88,9 %) 1,9

1 h vor 7/9 (77,8 %) 2,2

1 h nach 7/10 (70 %) 2,6

3 h nach 9/10 (90 %) 3,0

6 h nach 10/10 (100 %) 3,5

keine Verab- 6/6 (100 %) 4,5

reichung

Da einige Informationen bezüglich der Teilnahme von PGs, insbesondere PGD~, an der Metastase eines transplantierten Tumors vorliegen, legen die vorstehenden Werte die Vermutung nahe, daß eine inhibierende Wirkung der" erfindungsgemäßen Substanz gegenüber der Metastase eines implantierten 33umors über PGs existiert.

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Beispiel 17

Veränderung des Gehaltes an PGs in dem Blut von Tieren, an welche eine erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist.

Sarkom-Zellen, die durch Methylcholanthren induziert worden sind, werden auf den Rücken einer Gruppe von spontan hypertensiven Ratten (SHR) subkutan in einer Menge von 1x10 Zellen/Tier transplantiert. Während die Ratten gefüttert werden, wird eine erfindungsgemäße Substanz, und zwar die Probe Nr, 7, täglich intraperitoneal während aufeinanderfolgender 6 Tage, gerechnet 24 Stunden nach der Transplantation, in einer Menge von 500 mg/kg/Tag verabreicht. Zwei Wochen nach Beendigung der Verabreichung wird das ganze Blut zur Gewinnung einer Plasmafraktion gesammelt. Der Ätherextrakt des Plasmas wird durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt. Nach einer Umwandlung des Extrakts in ein Methyloxymesilylderivat wird die Veränderung des Gehaltes an 6-Keto PGF^in-dem Extrakt gaschromatographisch und massenspektroskopisch untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 14 hervor.

Der Fig. 14 ist zu entnehmen, daß im allgemeinen der Gehalt von 6 Keto-PGF.. in dem Blut einer Ratte, die von Krebs befallen ist, höher ist als im Blut einer Ratte mit einem normalen Blutzustand, während der Gehalt in einer von Krebs befallenen Ratte, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, praktisch der gleiche ist wie im Falle einer normalen Ratte. Man nimmt an, daß die erfindungsgemäße Substanz den erhöhten Gehalt auf den normalen Gehalt reduziert hat.

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Beispiel 18

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Krebsproliferation und die PGE-Menge in den Krebszellen

Nach der in Beispiel 12 beschriebenen Methode werden die Antikrebswirkung gegenüber transplantiertem Ehrlich-Krebs in C57BL/6-Mäusen und die PGE-Menge in Krebszellen, die in dem lebenden Körper der Maus proliferieren, in den Fällen untersucht, in denen jeweils eine Verbindung gemäß vorliegender Erfindung, und zwar die Proben 1, 2, 3, 4', 5, 6, 8, 9, 10 und 11 intraperitoneal jeden Tag, gerechnet von dem Tag, der auf die Transplantation folgt, insgesamt sechsmal in einer Dosierung von 100 mg/kg verabreicht wird.

Die Ergebnisse der Untersuchung des Gewichts des aus den getöteten Mäusen am 14. Tag nach der Transplantation der Krebszellen, und zwar 1x10 pro Tier, entnommenen Krebses sowie der Gehalt an PGE in dem entnommenen Krebs gehen aus der folgenden Tabelle XIII hervor.

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Tabelle XIII

Gewicht des Krebses (g) und Gehalt an PGE in dem

Krebs (ng/g)

Verbindung

Gewicht des Krebses (g)

Gehalt an PGE in dem Krebs (ng/g)

Vergleich Probe Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6 Nr. 7 Nr. 8 Nr. 9 Nc. 10 Nr. 11

2)

1,30 0,63 0,81 0,74 0,56 0,70 0,65 0,75 0,72 0,80 0,70 0,69

1,77 4,10 3,88 4,23 4,19 3,20 3,66 3,98 4,03 4,32 4,14 4,20

Bemerkungen: 1) Tiere, die einer Transplantation unterzogen worden sind, an die jedoch keine Verbindung verabreicht worden ist

2) Ergebnisse von Beispiel

Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß zwar einige Unterschiede zwischen den Verbindungen bestehen, jedoch alle Verbindungen bezüglich der Inhibierung des Wachstums des Krebses sowie der Erhöhung des Gehaltes"an PGE in den Krebszellen wirksam sind.

Beispiel

Wirkung von Aspirin auf die hypotensive Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz

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Es ist bekannt, daß PGs aus Arachidonsäure gebildet werden und die Umwandlung von Arac. Cyclooxygenase vermittelt wird.

den und die Umwandlung von Arachidonsäure zu PGG₉ durch

Es ist ferner bekannt, daß Aspirin Cyclooxygenase inaktiviert, und daß der Stoffwechsel von PGs vollständig durch die Verabreichung von Aspirin an ein Säugetier abgestoppt wird.

Es wurde daher folgendes Experiment durchgeführt: An Gruppen männlicher SHR-Ratten wird 30 bis 4 0 Wochen nach der Geburt (a) eine der erfindungsgemäßen Substanzen unter Zwang oral in einer Menge von 100 mg/kg in Form einer Lösung in destilliertem Wasser oder in Form einer wäßrigen Suspension in einer 2 %igen Carboxymethylcellulose oder (b) Aspirin unter Zwang oral 1 Stunde vor oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz in einer Menge von 200 mg/kg verabreicht. Der Blutdruck der auf diese Weise behandelten Ratten wird in Abhängigkeit von dem Zeitverlauf gemessen.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XIV hervor. Wie der Tabelle XIV zu entnehmen ist, tritt die hypotensive Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 4, 7 und 8), die in der Gruppe (a) auftritt, nicht in der Gruppe (b) auf. Die Ergebnisse zeigen, daß die hypotensive Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf PGs zurückgeht.

Tabelle XIV

Hypotensive Wirkung, die durch Aspirin inhibiert wird

Verbindung Veränderung des Blutdruckes (mmHg)' ' Fall (a) Fall (b)

Vergleich'	0	0
Probe Nr. 4	-20	-5
Nr. 7	-20	0
Nr. 8	-15	0

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Bemerkungen: 1) Nach 6-stündiger Verabreichung der

erfindungsgemäßen Substanz

2) Es wird nur destilliertes Wasser zum gleichen Zeitpunkt verabreicht, an dem Aspirin und die erfindungsgemäße Substanz verabreicht wird

Beispiel 20

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf den Gehalt an PGs in dem Blut von spontan hypertensiven Ratten (SHR)

Nach einer Zwangsverabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 4, 7 und 8) pro Tag während aufeinanderfolgender 14 Tage in einer Menge von 100 mg/kg/Tag auf oralem Wege an männliche SHR-Ratten wird ihr ganzes Blut am 15. Tag zur Gewinnung einer Plasmafraktion gesammelt. Der Ätherextrakt der Plasmafraktion wird abgetrennt und durch Dünnschichtchromatographie isoliert. Nach einer Umwandlung der isolierten Fraktion in Methyloxymesilylderivate wird die Veränderung von 6-Keto PGF-, durch Gaschromatographie und Massenspektroskopie untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XV hervor. Im Falle der Gruppe, an. welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, ist der Gehalt an 6-Keto-PGF.-^ in Kombination mit einem reduzierten Blutdruck höher als im Falle der Vergleichsgruppe. Diese Parallelität der Wirkungen führt zu der Annahme, daß die Wirkung der vorliegenden Erfindung durch Prostaglandin vermittelt wird.

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Tabelle XV

Blutdruck und Gehalt an PGs in dem Blut, das 14 Tage nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 4, 7 und 8) gesammelt worden ist

Vergleich

Probe Nr. 4

Blutdruck (mmHg)

195

155

Nr. 7

160

Nr. 8

150

Gehalt an 6-Keto-Q£ im Blut

(ng/ml)

6,5

Beispiel 21

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die Herstellung von PGI2 -*-^{n Ra}tten, die an Diabetes mellitus leiden

Gruppen männlicher Sprague-Dowley-Ratten mit einem Korpergewicht von ungefähr 200 g werden für die Versuche verwendet. An einige Gruppen der Ratten wird intravenös Streptozotozin in einer Menge von 80 mg/kg 1 bis 3 Monate vor dem Beginn des vorliegenden Versuchs verabreicht, damit sich die Ratten im Zustand von Diabetes mellitus befinden. Ratten des gleichen Stammes, des gleichen Geschlechts und des gleichen Alters, an die kein Streptozotozin verabreicht worden ist, werden als Vergleichstiere verwendet.

Die erfindungsgemäßen Substanzen (Proben Nr. 4, 7 und 8) werden jeweils an Gruppen von Ratten verabreicht,'die an künstlicher Diabetes mellitus leiden, wobei die Verabreichung oral erzwungen in einer Menge von 100 mg/kg in Form einer wäßrigen Lösung in destilliertem Wasser erfolgt.

6 Stunden nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen werden Blutproben aus den Ratten, die mit Äther anästhe-

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siert worden sind, in einer Menge von 0,5 ml/Tier gesammelt und der Gehalt des Blutzuckers nach der enzymatischen Methode gemessen.

Dann wird die Menge an Prostaglandin I₂, das in dem Arteriengewebe erzeugt worden ist, in der folgenden Weise gemessen:

Die Thoraxaorten der Ratten werden schnell herausgenommen, mit Krebs'scher Pufferlösung bei einer Temperatur von 4°C gewaschen und zu dünnen Ringen mit einem Gewicht von 1 bis 2 mg zerschnitten. Dann werden in 200 Mikroliter der Krebs'sehen Pufferlösung 60 mg der auf diese Weise zerschnittenen Aorta zugegeben und die Mischung 3 Minuten bei 22⁰C bebrütet.

Die Menge an Prostaglandin Ϊ-, (PGI₂) , die durch die herausge-. schnittene Aorta erzeugt wird, wird in der überstehenden Flüssigkeit (1 bis 10 Mikroliter) der vorstehend erwähnten bebrüteten Kultur in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt, wobei die unterdrückende Wirkung der Plättchenaggregation als Index verwendet wird, wobei jedoch Adenosindiphosphat als Agglutinierungsmittel verwendet wird. Nach der Herstellung einer Standardeichkurve unter Verwendung einer authentischen Probe von PGI₂ wird der Gehalt an PGI- in der .vorstehend erwähnten überstehenden Flüssigkeit aus der Standardkurve in ng/mg des Feuchtgewichts des Arteriengewebes erhalten. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XVI hervor.

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Tabelle XVI

PGI- Menge und Blutzucker

Rattengruppe PGI„ Blutzucker

(ng/mg Feuchtgewebe) (mg/100 ml)

normale Ratten 0,26 +_ 0,06 . 76,7 +_ 5,0

Ratten im Zustand von künstlicher Diabetes mellitus

Ratten, an die die erfindungsgemäße Substanz nicht verabreicht worden ist 0,07 +_ 0,01 412,1 +_ 15,1

Ratten, an die die Probe Nr. 4 verabreicht worden ist 0,19 +_ 0,04 133,6 +_ 8,3

Ratten, an die die Probe Nr. 7 verabreicht worden ist 0,22 +_ 0,02 165,0 ;+ 11,0

Ratten, an die die Probe Nr. 8 verabreicht worden ist 0,18 + 0,04 110,1 + 5,5

Wenn auch die Erzeugung von PGI₂ in dem Aortagewebe der
Ratten, die künstlich in den Zustand von Diabetes mellitus versetzt worden sind, geringer!ist als im Falle der normalen Ratten, so hat dennoch eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen an die Ratten, die künstlich in den Zustand von Diabetes mellitus versetzt worden sind, eine
Erhöhung der Fähigkeit des Gewebes bezüglich der Erzeugung von PGI-, zusammen mit einer Verminderung des Gehaltes an
Blutzucker zur Folge.

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Beispiel 22

Dies ist ein anderes Beispiel, welches die Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf die Erzeugung von PGI„ zeigt

Nach dem Herausschneiden der Halsaorta einer SD-Ratte unter Anästhesie wird die Aorta mit Krebs-Linger-Bicarbonatpufferlösung gewaschen und zu dünnen Ringen zerschnitten. Die Schnittstücke werden in der vorstehend erwähnten Pufferlösung in einer Menge von 1 mg der feuchten'· Schnitt stücke pro 0,5 ml zur Erzeugung von PGI₂ gehalten.

In 500 Mikroliter der auf diese Weise hergestellten Mischung werden 50 Mikroliter einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung, die 2 Gew.-% der erfindungsgemäßen Substanz (jeweils der Proben Nr. 4, 7, 8) in gelöster Form enthält, zugesetzt. Da die Erzeugung von PGI~ im allgemeinen ihr Maximum nach 10 Minuten dauerndem Stehenlassen erhält, wird eine überstehende Flüssigkeit (2,5 μΐ) · der Mischung 10 Minuten nach der Zugabe hergestellt, worauf die Menge an PGI₂ in der überstehenden Flüssigkeit durch die Unterdrückungswirkung der Aggregation -von Plättchen als Index sowie unter Einsatz von ADP als Agglutinierungsmittel bestimmt wird, wobei eine wäßrige physiologische Lösung als Vergleichsprobe verwendet wird. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 15 hervor. Die Zugabe der. erfindungsgemäßen Substanz erhöht die Erzeugung von PGI₂ durch die Schnittstücke der Halsaorta.

Es wurden bereits verschiedene Untersuchungen im Hinblick auf die Ursache von Arteriosklerose durchgeführt, wobei die Agglutinierung von aggregierten Klumpen an der Wand der Gefäße als besondere Ursache hervorgehoben wird. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß die Verhinderung der Agglutinierung der Plättchen auf der Wand der Gefäße die Behandlung der Wahl ist. Es ist bekannt, daß PGI₂ eine stark in-

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hibierende Wirkung gegenüber der Agglutinierung von Plättchen besitzt. Aus den gewonnenen Erkenntnissen geht deutlich hervor, daß die erfindungsgemäßen Substanzen, welche die Produzierfähigkeit von PGI₂ auf der Aortawand erhöhen, eine Wirkung bezüglich der Behandlung und Verhinderung von Arteriosklerose ausüben.

Beispiel 23

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Erhöhung des Gehaltes an PGE₁ im lebenden Körper von Säugetieren

(1) Im Falle eines künstlich verursachten Fußödems

An drei Gruppen von männlichen Sprague-Dowley-Ratten von insgesamt 6 Gruppen werden die jeweiligen erfindungsgemäßen Substanzen, and zwar die Proben 4, 7 und 8, erzwungenermaßen auf oralem Wege in einer Menge von 1000 mg/kg verabreicht. An die anderen drei Gruppen der gleichen Rattenart wird zu diesem Zeitpunkt ".nichts verabreicht.

60 Minuten nach der Verabreichung werden 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Carrageenin (1 mg) und PGE₁ (0,1 μg) in die hintere Pfote der vier Rattengruppen einschließlich der drei Gruppen, an die die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, injiziert. In eine Gruppe der restlichen zwei Gruppen, an die nicht die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, werden 0,1 ml einer wäßrigen Lösung, die nur Carrageenin in einer Menge von 1 % enthält, injiziert, während in der anderen Gruppe, an die keine erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, eine wäßrige Lösung, die nur PGE₁ enthält, injiziert wird.

Das Volumen der gequollenen Füße der Gruppen der auf diese Weise behandelten Ratten wird nach der Wasserverdrängungsmethode gemessen. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XVII

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hervor, und zwar anhand der Zunahme des Fußvolumens im Vergleich zu dem Fußvolumen vor der Behandluna, ausgedrückt in %.

♦ (2) Im Falle einer Stimulierung der Haut

W Ί

An drei Gruppen männlicher Sprague-Dowley-Ratten von insgesamt 6 Gruppen werden die jeweiligen erfindungsgemäßen Substanzen (Proben 4, 7 und 8) unter Zwang auf oralem Wege in einer Menge von 1000 mg/kg verabreicht, während an die anderen drei Gruppen zu diesem Zeitpunkt nichts verabreicht wird- 60 Minuten nach der Verabreichung wird eine Mischung aus PGE₁ (2,5 χ 10~¹¹ Mol/Tier) und Histamin (2 χ 10~⁸ Mol/ Tier) intrakutan unter einer leichten fitheranästhesie in die rasierte Haut eines Bauchteils von vier Gruppen der Ratten einschließlich der drei Gruppen, an welche die erfindungsgemäße Substanz verfüttert worden ist, injiziert. In eine Gruppe der zwei Gruppen, die intakt geblieben sind, wird nur Histamin in einer Menge von 2x10 Mol/Tier und

-11 in die andere Gruppe nur PGE₁ in einer Menge von 2,5 χ 10

Mol/Tier injiziert.

Unmittelbar nach der vorstehend erwähnten Injektion wird Evans Blau als wäßrige Lösung in einer physiologischen Kochsalzlösung in eine seitliche Schwanzvene aller Versvchsratten in einer Menge von 2 ml/kg entsprechend 25 mg

•_f..;.-is Blau/kg injiziert. Alle Tiere werden 30 Minuten na ■ Λ-, der Injektion des Farbstoffs getötet und das Ausmaß des Farbstoffaustretens spektrophotometrisch nach der Methode von Harada et al. untersucht, wobei die Absorption bei 620 ran als Index verwendet wird.

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Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XVIII hervor.

Tabelle XVII

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf ein durch "Carrageenin erzeugtes Anschwellen

Rattengruppen, behandelt durch

Prozentsatz der Fußvolumenzunahme 60 min nach der Verabreichung von Carrageenin

Carrageenin

Carrageenin + PGE₁ Probe Nr. 4 + Carrageenin + PGE₁ Probe Nr. 7 + Carrageenin + PGE-Probe Nr. 8 + Carrageenin + PGE₁

37,0 9,3 66,2 32,5 28,2 29,7

Tabelle XVIII

Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen auf das Austreten von Farbstoff

Rattengruppen, behandelt durch

Absorption bei 620 nm

Histamin

Histamin +
Probe Nr. 4 + Histamin + PGE Probe Nr. 7 + Histamin + PGE Probe Nr. 8 + Histamin + PGE

0,192 0,066 0,259 0,155 0,152

0,162 ϊ

Die in der Tabelle XVII zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß die durch Carrageenin erzeugte und durch PGE₁ potenzierte Entzündung durch die Einwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen inhibiert wird.

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Die Ergebnisse der Tabelle XVIII zeigen, daß das Austreten von Farbstoff infolge von Histamin, potenziert durch PGE₁, gehemmt wird.

Beispiel 24

Diuretische Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz in Verbindung mit dem Gehalt an 6-Keto PGF₁₀. im Blut von Ratten

Gruppen weiblicher spontan hypertensiver Ratten (SHR), die 12 Stunden lang nicht gefüttert und 2 Stunden lang nicht mit Wasser getränkt wurden, werden durch erzwungene orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen (der Proben Nr. 4, 7 und 8) in Mengen von 1 und 5 g/kg, gelöst in 8 ml (pro 200 g Körpergewicht) einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung behandelt, wobei an eine Vergleichsgruppe nur die wäßrige physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 8 ml/200 g Körpergewicht verabreicht wird.

Die Menge an ausgeschiedenem Rattenurin wird jede Stunde , 1 Stunde nach der Verabreichung 6 χ gemessen, wobei die Prozentsätze des ürinvolumens zu dem Volumen der wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung, welche die erfindungsgemäße Substanz, die zuvor verabreicht worden ist (8 ml pro 200 g Körpergewicht) enthält, aus der Tabelle XIX hervorgehen.

i Anschließend werden 6 Stunden nach der Verabreichung alle

Tiere zum Sammeln des gesamten Blutes zur Gewinnung einer Plasmafraktion getötet. Der Ätherextrakt der Plasmafraktion wird durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt. Nach einer Umwandlung der auf diese Weise abgetrennten Substanzen zu Methyloxymesilylderivaten wird die Veränderung von 6-Keto PGF₁. durch Gaschromatographie und Massenspektrographie untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XIX

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hervor.

Wie aus der Tabelle XIX hervorgeht, ist die Menge an Urin
nach der Umwandlung auf den Standardsgewinnungswert größer im Falle der Ratten, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, als im Falle der Vergleichsratten, wobei eine Dosierung-Wirkung-Beziehung bezüglich der Urinmenge innerhalb der Ratten festzustellen ist, an welche
die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß durch die erfindungsgemäße Substanz eine diuretische Wirkung erzielt wird.

Ferner ist der Gehalt an 6-Keto PGF₁^ im Blut der Ratten, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, etwas höher als im Falle der Vergleichsgruppe, obwohl der Unterschied sehr gering ist. Wenn es auch natürlich ist, daß eine Erhöhung von 6-Keto PGF _1/γ , das ein Stoffwechselprodukt von PGI„ ist, eine Erhöhung des Gehaltes an PGI-bedeutet, da die diuretische Funktion als eine der physiologischen Funktionen von PGI2 erkannt worden ist, ist es
wahrscheinlich, daß die erfindungsgemäße Substanz ihre diuretische Wirkung durch Steuerung von PGI2 ausübt.

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Tabelle XIX

Menge an Urin und Gehalt an 6-Keto PGF im Blut

1OC

Gruppen	1) Urinvolumen (%) nach χ Stunden	2	9	3	4	5	6	Gehalt an 6-Keto PGF im Blut (ng/ml)	*	3.9
Vergleich	1		22	26	28	30	3.0	3.5
erfindungsaemäße Sub stanz	2
Probe Nr. 4		40						3.7
5 g/kg		40	• 50	52	78	91	3.5	3.2
1 g/kg	7		46	50	60	63	3.3
Probe Nr. 7	6	50
5 g/kg		38	66	80	92	100
1 g/kg	5		45	48	63	72
Probe Nr. 8	4	43		-
5 g/kg		39	60	70	77	93
l g/kg	5	47	50	65	68
5

Bemerkungen:

¹ * Die Prozentsätze der Volumina an angereichertem Urin zum Zeitpunkt der Bestimmung des Volumens an verabreichter wäßriger physiologischer Kochsalzlösung, welche die erfindungsgemäße Substanz enthält

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Beispiel 25

Wirkungen der erfindungsqemäßen Substanz auf die Schmerzschwelle eines durch wiederholte Injektion von PGE~ erzeugten Schmerzes

Eine Gruppe männlicher Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 230 bis 250 g wird täglich während 2 Wochen in ihre beiden Pfoten mit 2 μg PGE₂, gelöst in 0,1 ml einer wäßrigen sterilisierten 0,9 %igen Lösung von Natriumchlorid, gespritzt. Am 16. Tag wird eine erfindungsgemäße Substanz (Proben 4, 7 und 8) unter Zwang oral in einer Menge von 1000 mg/kg verabreicht.

Die "Schmerzschwelle" wird 1 Stunde nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz gemessen. Der Begriff "Schmerzschwelle" bedeutet den minimalen Druck, der auf die Pfote der R^tte angewendet wird, bis die Ratte Schmerz empfindet. Die Eigebnisse gehen aus der Fig. 16 hervor.

-Vie der Fig. 16 zu entnehmen ist, wird die Herabsetzung der "ijchmerzschwelle", verursacht durch die Injektion von PGE₂/ durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz praktisch auf 0 ermöglicht. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß die erfindungsgemäßen Substanzen eine analgetische Wirkung besitzen.

Beispiel 26

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Verhinderung des Auftretens von Streßgeschwüren des Magens von Ratten

An drei Gruppen männlicher Donryu-Ratten mit einem Körpergewicht von 220 bis 250 g wird nach 23,5 stündigem Fasten oral eine erfindungsgemäße Substanz (Proben 4, 7 und 8) in einer Menge von 1 g/kg, gelöst in 8 ml (pro 200 g Körperge·

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wicht) einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung, verabreicht.

Diese drei Gruppen von Ratten sowie eine andere Gruppe von Ratten, die in ähnlicher Weise während 23,5 Stunden nicht gefüttert worden ist, worauf nur eine wäßrige physiologisehe Kochsalzlösung verabreicht worden ist, werden in einen Streßkäfig eingebracht und in Wasser mit einer Temperatur von 23°C bis zur Brusttiefe eingetaucht, damit die Ratten einem Streß ausgesetzt werden.

7 Stunden nach dem Eintauchen werden die Ratten aus dem Wasser gezogen und sofort getötet, um das gesamte Blut zu sammeln. Außerdem werden ihre Mägen herausgeschnitten. Die Plasmafraktion, die aus dem Blut hergestellt wird, wird mit Äther extrahiert, worauf der Ätherextrakt durch- Dünnschichtchromatographie abgetrennt wird. Der abgetrennte Extrakt wird nach einer Umwandlung in die jeweiligen MethyloxymesiIyIderivate einer gaschromatographischen und massenspektrographischen Untersuchung zur Bestimmung des Gehalts an 6-Keto-PGF ../y unterzogen .

Eine wäßrige 1 %ige Lösung von Formaldehyd wird in die herausgeschnittenen Mägen injiziert. 10 Minuten nach der Injektion werden die Mägen zum öffnen der größeren Krümmungsseite aufgeschnitten, um die Mukosamembran des Magenkörpers zu untersuchen. Die längere Spanne einer jeden Erosion in der Mukosamembran einer Ratte, falls eine derartige Erosion überhaupt vorliegt, wird mikroskopisch gemessen und die Summe, gemessen in mm, als Geschwürkoeffizient der Ratte verwendet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XX hervor.

Wie der Tabelle XX zu entnehmen ist, vermögen die erfindungsgemäßen Substanzen das Auftreten eines Streßgeschwürs zu unterdrücken. Die Menge an 6-Keto PGF₁^ in dem Plasma ist größer im„Falle der Ratten, an welche die erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden ist, als im Falle der Vergleichsratten.

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Vergleich	100
erfindungsgemäße Substanz
Probe Nr. 4	62
Probe Nr. 7	58
Probe Nr. 8	55

Da die Erhöhung des Gehaltes an 6-Keto PGF₁Zy , einem Stoffwechselprodukt von PGI-r eine Erhöhung des Gehaltes an PGI₂ bedeutet und PGI~ als aktiv zur Unterdrückung der Sekretion von Magensaft und zur Unterdrückung der Bildung eines Geschwürs bekannt ist, nimmt man an, daß die erfindungsgemäßen Substanzen eine Antigeschwürfunktion durch Steuerung des Gehaltes an PGI~ ausüben.

Tabelle XX Streßgeschwür und Gehalt an 6-Keto ^PGF-i/y

Gruppe Geschwürkceffizient Menge an 6-Keto PGF₁₍y

(%) (ng/ml)

3,3

3,8 3,9 3,6

Bemerkungen: 1) Die Gesamtsumme der längeren Erosionsspannen auf der Mukosamembran des Magens der behandelten Rattengruppen, geteilt durch die Summe der Vergleichsgruppen, multipliziert mit 100

Beispiel 27

Wirkung einer erfindungsgemäßen Substanz auf eine Pyrexie, verursacht durch pyrogene Bakterien

Die Versuche werden unter Einsatz von Katzen mit einem Gewicht von 3 bis 3,5 kg durchgeführt. Bei einer aseptischen Operation unter intraperitoneal verabreichtem Natrrumpentobarbiton in einer Menge von 36 mg/kg wird eine Collison-Kanüle in den · Schnabelteil der dritten Ventrikel der Katze implantiert.

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Wenige Tage nach der Implantation der Kanüle, nachdem sich die Katze von der Operation erholt hat, werden Proben der zerebrospinalen Flüssigkeit ohne Anästhesie gesammelt, während die Katze in ihrem Käfig frei laufen gelassen wird, wobei ihre rektale Temperatur aufgezeichnet wird.

Die Proben der zerebrospinalen Flüssigkeit (es. f.) werden sofort nach dem Sammeln oder nach einem Lagern bei -2°C während 24 bis 48 Stunden untersucht, wobei die Untersuchung von PGE in den .Proben wie in Beispiel 9 unter Einsatz eines H-Prostaglandin-E-Radioimmunoassay Kits (hergestellt von der Clinical Assay Co., USA) durchgeführt wird. Die rektale Temperatur wird bei Zimmertemperatur (21 bis 23⁰C) mit-einem Thermistor-Proberohr, das ungefähr 10 cm in,das Rektum eingesetzt ist, gemessen.

Als Pyrogen wird ein somatisches o-Antigen von Shigella dysentriae verwendet. Nach einem Auflösen von 75 ng des Pyrogens in 0,15 ml einer pyrogenfreien künstlichen es.f. wird die Lösung in das dritte Ventrikel durch die implantierte Kanüle zur Induzierung von Fieber injiziert.

2 Stunden nach der Verabreichung wird die rektale Temperatur zur Bestätigung des Auftretens einer Pyrexie gemessen, worauf eine erfindungsgemaße Substanz (Proben 4, 7 und 8) zwangsweise oral in Form einer wäßrigen Lösung in destilliertem Wasser in einer Menge von 100 mg/kg verabreicht wird. An die Vergleichsgruppe wird nur destilliertes Wasser zu diesem Zeitpunkt verabreicht.

Die rektale Temperatur aller Tiere wird 1 Stunde nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz gemessen.

Die c.s.f. zur Bestimmung ihres Gehaltes an PGE wird 2 Stunden vor und nach der Injektion des Pyrogens und 1 Stunde nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz gemessen.

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Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle XXI hervor.

Tabelle XXI
Rektale Temperatur und Menge an PGE in der c . s . f. -Gruppe

rektale Tempera- Menge an PGE (ng/ tür (⁰C)" ml c.s.f.)

Vergleichsgruppe vor der Verabreichung von Pyrogen 39,0 2,5

2 Stunden nach der Verabreichung

von Pyrogen 41,0 12

1 Stunde nach der Verabreichung

von Wasser * 40,7 10

Gruppe, an welche die erfindungsgemäße
Substanz verabreicht worden ist

Probe Nr. 4

vor der Verabreichung von Pyrogen 39,0 2,6

2 h nach der Verabreichung von Pyrogen 41,3 11

1 h nach der Verabreichung von Pyrogen 39,9 5

Probe Nr. 7

vor der Verabreichung von Pyrogen 38,8 2,4

2 h nach der Verabreichung von Pyrogen 41,1 16

1 h nach der Verabreichung von Pyrogen 39,5 6

Probe Nr. 8

vor der Verabreichung von Pyrogen 39,1 2,5

2 h nach der Verabreichung von Pyrogen 41,5 13 1 h nach der Verabreichung von Pyrogen 40,0 8

Bemerkung: * destilliertes Wasser

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Wie aus der Tabelle XXI hervorgeht, wird die rektale Temperatur der Katzen, nachdem sie durch die Injektion des Pyrogens erhöht worden ist, herabgesetzt, wobei die gleiche Tendenz · der Veränderung des Gehaltes an PGE in der es.f. durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz festzustellen ist.

Daher nimmt man an, daß die erfindungsgemäße Substanz bei einer oralen Verabreichung an Säugetiere, die Symptome von Pyrexie infolge einer Beimpfung mit einem mikrobiellen Pyrogen aufweisen, eine antipyretische Aktivität entwickeln, die wahrscheinlich in Verbindung mit der Verminderung von PGE in der c.s.f. steht.

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Claims

MULLKR-IH)IiE · I)ElJl KL· · SCHÖN · HEItTIiL PATE NTANWA LTE DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALTVON 1927-1875) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS. REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIFiES AGRFES PRES L1OFFICE EUROP^EN DES BREVETS K 1515 H Aug. 1980 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha, 9-11 Horidome-cho 1-chome, Nihonbashi, Chuo-ku, Tokyo, Japan. Mittel zur Steuerung der Herstellung und des Stoffwechselsvon Prostaglandin in Säugetieren Patentansprüche

1. Mittel zur Steuerung der Erzeugung und des Stoffwechsels von Prostaglandin in Säugetieren, gekennzeichnet durch (a) eine Verbindung der allgemeinen Formel

COOR²

τ ι — NH-R-¹-

worin R für eine Restgruppe steht, die durch Entfernen von OH in der 1(CVf)- oder 1 (ß)-Stellung von Arabinose,

Xylose, Rhamnose, Glucose, Galactose, Mannose und Fruc-

tose gebildet worden ist, und R ein Wasserstoffatom_/

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Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein pharmazeutisch verträgliches Metall darstellt, und

(b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel dafür.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus Natrium-p-aminobenzoat-N-D-mannosid besteht.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus Natriuiti-p-aminobenzoat-N-D-xylosid besteht.

4. Mittel nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus Natrium-p-aminobenzoat-N-L-rhamnosid besteht

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