DE3634013A1 - Dipeptide und deren herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel

worin R₁ für Wasserstoff oder Methyl, R₂ für Wasserstoff oder Methyl und R₃ für Methyl, Ethyl oder CH₂OH stehen, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man eine Verbindung der Formel

worin R₁ obige Bedeutung besitzt, R₄, R₅ und R₆ für Schutzgruppen stehen und Ac die Acetylgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der Formel

worin R₂ und R₃ obige Bedeutung besitzen und R₇ für eine Schutzgruppe steht, umsetzt und anschließend die Schutzgruppen abspaltet.

Die Ausgangsprodukte der Formel II können nach folgendem Reaktionsschema erhalten werden:

Entsprechend diesem Reaktionsschema wird N-Acetylglucosamin zunächst glykosyliert und dann in die entsprechende 4,6-O-Benzylidenverbindung umgewandelt. Danach wird die freie Hydroxygruppe in Position 3 beispielsweise mit (S)-α-Chlorpropionsäure verethert, wobei 3-O-Lactyl-N-acetylglucosamin erhalten wird, das anschließend in seinen Benzylester überführt und durch saure Hydrolyse der Benzylidengruppe zum Diol umgesetzt wird. Zum Schutze der Hydroxygruppen werden nun selektiv Schutzgruppen eingeführt, die durch R₄, R₅, R₆ und R₇ symbolisiert sind. Beispielsweise bedeuten R₄, R₅ und R₆ die Benzyl- oder die Acetylgruppe, Ts steht für den Tosylrest und R₇ beispielsweise für die Benzylgruppe. Als nächster Schritt wird die Tosyloxygruppe mit Kaliumjodid in Dimethylformamid durch den Jodrest ersetzt. Mit Hilfe von Silberfluorid erhält man aus dem Jodderivat das exocyclische Olefin, das weiter mit Quecksilber-(II)-sulfat in verdünnt saurem Medium in das Cyclohexanonderivat überführt wird. Stereospezifische Reduktion führt zum 1,5-Diol. Nun werden die OH-Gruppen in den Positionen 1 und 5 wieder geschützt, beispielsweise durch Benzoylierung, und die Schutzgruppe R₇ abgespalten, wodurch Verbindungen der Formel II erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren der Kondensation von Verbindungen der Formel II mit Verbindungen der Formel III kann nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, und unter Zusatz von N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid bei Raumtemperatur. Auch die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt in konventioneller Weise.

Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:

1. Mikrobielle Septikämie in der neutropenischen Maus:

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1×200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s. c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i. p.) oder auch peroral verabreicht. Die Injekton erfolgt am Tag 4 durch i. v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginose Δ 12 : 1×10⁵, E. coli Δ 120 : 2×10⁶, Staph. aureus Δ 113 : 1×10⁶, Candida albicans Δ 124 : 1×10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Injektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:

• a) Durchschnittliche Überlebensdauer
• b) Überlebensrate

Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

2. Carbon Clearance Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i. p. oder s. c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

3. Herpesinfektion der Maus:

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkomponente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1×10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i. p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i. p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z. B. 1,3×10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus)infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:

• a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ)
• b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ)
• c) Durchschnittliche Überlebensdauer
• d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i. p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor)

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B₆D₂F₁ Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B₆D₂F₁ Mäusen gemessen [D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L. M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel I induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.

5. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintilationszähler gemessen wird [J. Gery et al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.

Weiteres besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie im folgenden B16F1 Melanomtest nachgewisen werden konnte:
B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆D₂F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung oder suspportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminiertes Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel I für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzinen, vorzugsweise für komplexe Vakzinen (inerte Viren, Bakterien) oder synthetische Vakzinen (z. B. Hepatitis- B-Oberlfächenantigenen). Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg,vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Die immunstimulierenden Eigenschaften der Verbindungen der Formel I können durch Einkapsulierung in Liposomen erhöht werden. Weiters zeigen die Verbindungen der Formel I mit γ-Interferonin humanen Blutmonozyten sowie mit bakteriellen LPS und dessen Partialstrukturen einen Synergismus.

Die Verbindungen der Formel I besitzen im allgemeinen die für Muramylpeptide bekannten Wirkungen, wobei jedoch bei bestimmten Wirkungen eine wesentlich verlängerte Wirkungsdauer zu beobachten ist.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, phamazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Injektionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindung der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutisches Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel, gegebenenfalls in Kombination mit einem Antibiotikum.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel 2-Acetamido-3-(D-2-propanoyl-L-alanyl-D-isoglutamin)-1,4,5- trihydroxycyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S) a) 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5-dibenzoxy-3-(D-2′-propanoyl-L-alanyl-D-iso-- glutaminbenzylester)cyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S)

Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 450 mg 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5- dibenzoxy-3-(D-1′-carboxyethoxy)cyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S) in 30 ml trockenem Dimethylformamid werden 128,8 mg N-Hydroxysuccinimid und 229 mg N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden gerührt und danach werden 400 mg Dipeptid L-Ala-D-iso-Gln-benzylester zugegeben. Es wird weitere 12 Stunden bei 20° gerührt. Der Dicyclohexylharnstoff wird abzentrifugiert und das Lösungsmittel im Hochvakuum abgezogen. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäure chromatographiert (Dichlormethan/Ethanol=10/1).
Fp: 115° (aus Methanol/Wasser)
Rf=0.38 (Dichlormethan/Ethanol=10/1)
[α] = +44,9° (c = 0.54 in Dichlormethan)

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 17.3 (CH₃-Ala); 19.2 (CH₃CH); 20.8 (OAc); 23.0 (NAc); 25.4 (CHCH₂-iso-Gln); 30.8 (CH₂CO-iso-Gln); 31.5 (C₆); 50.1 (CH-Alanin); 52.5 (CH-iso-Gln); 53.58 (C₂); 66.6 (CH₂Ph); 69.3 (C₅); 70.7 (C₁); 74.9 (C₃); 78.4 (C₄); 128.2-135.9 (Ph); 162.7 (COPh); 165.5 (COPh); 170.0 (COAc); 171.2 (CO₂CH₂Ph); 172,6 (CON); 173,2 (CON); 173,9 (CON).

b) 2-Acetamido-3-(D-2′-propanoyl-L-alanyl-D-isoglutamin)-1,4,5-trihydro-xy- cyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S)

Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 240 mg 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5- dibenzoxy-3-(D-2′-propanoyl-L-alanyl-D-isoglutaminbenzylester)cycloh-exan- (1S,2S,3R,4S,5S) in 12,5 ml Dioxan wird eine Lösung von 205 mg Pottasche in 12,5 ml Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden gerührt. Danach wird die Lösung mit Amberlite 1RN-77 neutralisiert und das Lösungsmittel abgedampft. Der weiße Rückstand wird in 10 ml 2 mM Essigsäure aufgenommen und chromatographiert (AG 1×2 in Acetatform). Als Eluierungsmittel werden eingesetzt: Essigsäure 2 mM, 50 ml; 0,10 M, 50 ml; 0,15 M, 50 ml; 0,20 M, 50 ml und 2 M, 100 ml. Aus der Lösung erhält man nach Lyophilisieren das Endprodukt.

[α] = +38,5° (c = 0.36 in Methanol)
Fp = 132-134°.

RMN¹³C (200 MHz, CD₃OD): 18 (CH₃-Ala); 19.7 (CH₃CH); 22.4 (NAc); 27.1 (CH₂CO-iso-Gln); 32.4 (CH₂COOH); 38 (C₆); 50.5 (CH-Ala); 53.4 (CH-iso-Gln); 57.7 (C₂); 67.5 (C₁); 69.8 (C₅); 77.7 (CH₃CH); 79.2 (C₄); 80.1 (C₃); 173.4,174.4,175,176.6,178.3 (CON, CO-Lactat, CO-Ala, CONH₂, COOH).

Das als Ausgangsprodukt benötigte 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5-dibenzoxy- 3-(D-1′-carboxyethoxy)cyclohexan-(1S,2S,3R,4S,5S) kann folgendermaßen erhalten werden:

a) Methyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonyl- ethyl)-2-desoxy-(α,β)-D-glucopyranosid

Man löst in einem Kolben, der mit einem Kalziumchloridrohr versehen ist, 31,4 g 3-O-Lactyl-N-acetylglucosamin in 250 ml Dimethylformamid und fügt 13,2 g Kaliumkarbonat zu. Dann werden bei 0° 14,2 ml Benzylbromid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Am nächsten Tag wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand zuerst mit Wasser und dann mit Hexan gewaschen.
Rf = 0.63 (α) und 0.73 (β) (Ethylacetat)
Fp = 204-205° (Dichlormethan/Hexan).

RMN¹H (80 MHz, CDCl₃): 1.40 (3 H, d, CH₃CH); 2.00 (3 H, s, NAc); 3.35 (3 H, s, OCH₃); 3,75 (5 H, m, H₂, H₃, H₄, H_6,6); 4,25 (1 H, m, H₃); 4.55 (1 H, q, CH₃CH); 5.15 (3 H, m, H₁, CH₂Ph); 5.50 (1 H, s, H₇); 7.40 (5 H, m, Ph).

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 18.8 (CHCH₃); 23.1 (NAc); 54.5 (C₂); 55.5 (OCH₃); 62.8 (C₅); 67.1 (CH₂Ph); 69.2 (C₆); 74.9 (C₃); 75.4 (CHCH₃); 83.6 (C₄); 98.7 (C₁); 101.5 (C₇); 137.4-126.0 (Ph); 170.9 (CO₂CH₂Ph); 174.9 (CH₃CON).

b) Methyl-2-acetamido-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)-2-desoxy-(α,β)- D-glucopyranosid

Man suspendiert 30 g Methyl-2-acetamido-4,6-O-benzylidin-3-O-(D-1′- benzyloxycarbonylethyl)-2-desoxy-(α,b)-D-glucopyranosid in 450 ml Wasser/Eisessig (½) und erhitzt diese Mischung für 1 Stunde bei 100° am Rückfluß. Dann wird die Mischung mit 200 ml Wasser verdünnt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgezogen. Der Rückstand wird aus Methanol/Wasser umkristallisiert.
Rf = 0.44 (α) und 0.53 (β) (Dichlormethan/Ethanol = 7/1)
Fp = 94° (Methanol/Wasser)

RMN¹H (80 MHz, CDCl₃): 1.40 (3 H, d, CH₃CH); 1.98 (3 H, s, NAc); 3.45 (3 H, s, OCH₃); 4,35 (1 H, 1, CH₃CH); 4.68 (1 H, s, H₁); 5,17 (2 H, s, PhCH₂); 7.35 (5 H, s, Ph).

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 19.1 (CHCH₃); 23.1 (NAc); 55.0 (C₂); 56.8 (OCH₃); 62.2 (C₆); 66.9 (CH₂Ph); 71.8 (C₅); 74.7 (C₄); 75.7 (CHCH₃); 80.5 (C₃); 102.9 (C₁); 172.1 (CO₂CH₂Ph); 175.0 (CON).

c) Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)-2- desoxy-6-O-tosyl-(α,β)-D-glucopyranosid

Bei 0° werden zu einer Lösung von 12,3 g Methyl-2-acetamido-3-O-(D-1′- benzyloxycarbonylethyl)-2-desoxy-(a,β)-D-glucopyranosid in 20 ml wasserfreiem Pyridin 15 g Tosylchlorid hinzugefügt. Man rührt das Reaktionsgemisch 24 Stunden und läßt die Temperatur allmählich auf 20° kommen. Danach werden bei 0° 8 ml Essigsäurecyanhydrid sowie eine katalytische Menge 4-Dimethylaminopyridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird weitere 18 Stunden bei Raumtempertaur gerührt und dann auf Eis gegossen.

Man extrahiert mit Ethylacetat, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat, filtriert und zieht das Lösungsmittel ab. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie über Kieselgel (Laufmittel : Ethylacetat/ Hexan = ³/₁) gereinigt.
Rf = 0.50 (a) und 0.73 (β) (Ethylacetat)
Fp = 104-105° (Ethylacetat/Hxan)

RMN¹H (200 MHz, CDCl₃): 1.40 (3 H, d, CH₃CH); 2.00 (3 H, s, NAc); 3.15 (3 H, s, OAc); 2,45 (3 H, s, CH₃Ph); 3.35 (3 H, s, OCH₃); 3.85 (3 H, m, H_6,6′, H₅); 4.10 (2 H, m, H₂, H₃); 4.35 (1 H, q, CH₃CH); 5.00 (1 H, T, H₄); 5.25 (3 H, m, CH₂Ph, H₁); 7.45 (5 H, s, Ph); 7.90 (4 H, m, Ph).

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 18.6 (CH₃CH); 20.6 (PhCH₃); 21.4 (OAc); 22.9 (NAc) 53.9 (C₂); 55.4 (OCH₃); 67.3 (CH₂Ph); 67.7 (C₅); 68.5 (C₆); 72.5 (C₃); 75.3 (CHCH₃); 75.5 (C₄); 97.5 (C₁); 145-127.7 (Ph); 169.3 (COAc); 171.0 (CO₂CH₂Ph); 174.3 (CON).

d) Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)-2- desoxy-6-iodo-(α,β)-D-glucopyranosid

Man löst in einem Kolben, der mit Rückflußkühler und Kalziumchloridrohr versehen ist, 12,4 g Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxy- carbonylethyl)-2-desoxy-6-O-tosyl-(α,b)-D-glucopyranosid in 50 ml wasserfreiem Dimethylformamid. Zu dieser Lösung gibt man 13 g Kaliumjodid. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde auf 100° erhitzt und danach in Eiswasser gegossen. Man erhält durch Zentrifugieren das kristalline Jodderivat.
Rf = 0.71 (α) (Ethylacetat)
Fp = 128° (Ethylacetat/Hexan)

RMN¹H (200 MHz, CDCl₃): 1.35 (3 H, d, CH₃CH); 2.00 (3 H, s, NAc); 3.15 (3 H, s, OAc); 3,20 (2 H, m, H₆H_6′); 3.50 (3 H, s, OCH₃); 3,75 (1 H, td, H₂); 3.90 (2 H, m, H₃, H₅); 4.35 (1 H, q, CH₃CH); 4.97 (1 H, t, H₄); 5.26 (3 H, q+m, CH₂Ph+H₁); 7.50 (5 H, s, Ph).
J_4,5=J_3,4=J_2,3=9 Hz; J_1,2=2,5 Hz.

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 3.9 (C₆); 18.9 (CH₃CH); 21.1 (OAc); 23.2 (NAc); 54.4 (C₂); 55.9 (OCH₃); 67.5 (CH₂Ph); 70.1 (C₅); 75.6 (C₄); 75.7 (CHCH₃); 76.2 (C₃); 97.9 (C₁); 135.2-128.4 (Ph); 169.8 (COAc); 171.0 (CO₂CH₂Ph); 174.5 (CONAc).

e) Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)-2- desoxy-5,6-eno-(α,β)-D-glucopyranosid

In einem Kolben, der mit einem Kalziumchloridrohr versehen ist, werden 12,4 g Methyl-2-acetamido-4-O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)- 2-desoxy-6-iodo-(α,β)-D-glucopyranosid in 150 ml waserfreiem Pyridin gelöst. Man fügt 7 g Silberfluorid bei und rührt das Reaktionsgemisch 15 Stunden bei 20°. Das Pyridin wird abgezogen und der schwärzliche Rückstand in Ethylacetat gelöst. Dann wird über Kieselgel filtriert. Man erhält die Titelverbindung als Öl. Rf = 0,72 (α) (Ethylacetat).

RMN¹H (200 MHz, CDCl₃): 1.4 (3 H, d, CH₃CH); 2.0 (3 H, s, NAc); 2.2 (3 H, s, OAc); 3.4 (3 H, s, OCH₃); 3.86 (1 H, dd, H₃); 4,06 (1 H, td, H₂); 4.46 (2 H, q, +s, CH₃CH+H₆); 4.73 (1 H, s, H_₆′); 5.26 (2 H, q, CH₂Ph); 5.33 (1 H, d, H₁); 5.46 (1 H, d, H₄); 7.5 (5 H, m, Ph).
J_1,2=3,5 Hz; J_2,3=10,5 Hz; J_3,4=9,5 Hz.

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 18.7 (CH₃CH); 20.9 (OAc); 23.2 (NAc); 56.1 (C₂); 56.3 (OCH₃); 67.1 (CH₂Ph); 71.9 (C₃); 75.3 (CH₃CH); 77.8 (C₄); 94.5 (C₆); 102.6 (C₁); 135.5-128.8 (Ph); 152.4 (C₅); 169.1 (COAc); 171.0 (CO₂CH₂Ph); 173.5 (CONH).

f) 4-Acetamido-2-acetoxy-3-(D-1′-benzyloxycarbonylethoxy)-5-hydroxycycl-o- hexanon-(2S,3R,4S,5S)

Man löst in einem Kolben mit Rückflußkühler 0,9 g Methyl-2-acetamido-4- O-acetyl-3-O-(D-1′-benzyloxycarbonylethyl)-2-desoxy-5,6-eno-(a,β)-D-xylo- hexopyranosid in 35 ml 5 mM Dioxan/Schwefelsäure (6/1). Man fügt 15 mg Quecksilber-II-sulfat zu und erhitzt das Reaktiosngemisch während 2 Stunden auf 80°. Danach wird die Lösung mit Amberlite IR 45 neutralisiert. Das Dioxan wird abgezogen und die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft und der Rückstand wird über Kieselgel chromatographiert.
Rf = 0.24 (Ethylacetat), Fp=168°.
[α] = +20,9° (c = 0.7 in Dichlormethan)

RMN¹H (200 MHz, CDCl₃): 1.40 (3 H, d, CH₃CH); 2.10 (3 H, s, NAc); 2.20 (3 H, s, OAc); 2,70 (3 H, m, H₆, H_6′, OH); 4.05 (2 H, m, H₂, H₄); 4.55 (1 H, q, CH₃CH); 4.80 (1 H, m, H₅); 5.35 (1 H, m, CH₂Ph, H₃); 7.45 (5 H, m, Ph).

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 18.7 (CHCH₃); 20.5 (OAc); 23.2 (NAc); 44.4 (C₆); 56.3 (C₄); 65.6 (C₅); 67.4 (CH₂Ph); 75.7 (CHCH₃); 76.3 (C₃); 81.3 (C₂); 128.2-128.7 (Ph); 169.3 (COAc); 171.8 (CO₂CH₂Ph); 174.8 (CONAc); 198.9 (C₁).

g) 2-Acetamido-4-acetoxy-3-(D-1′-benzyloxycarbonylethoxy)-1,5-dihydroxy-- cyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S)

Man löst in einem Kolben unter Inertgas 1 g 4-Acetamido-2-acetoxy-3-(D- 1′-benzyloxycarbonylethoxy)-5-dihydroxycyclohexanon-(2S,3R,4S,5S) in 25 ml wasserfeiem Tetrahydrofuran bei 0°, fügt dann 1,25 g Lithiumaluminium- tri-tert.butyloxyhydrid zu und rührt das Reaktionsgemisch 40 Minuten bei 0°. Danach wird die Lösung mit Essigsäure neutralisiert und bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel filtriert. Es bleibt ein weißer Feststoff zurück, der ohne weitere Reinigung verwendet wird. Rf = 0.49 (Dichlormethan/Ethanol=7/1).

h) 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5-dibenzoxy-3-(D-1′-benzyloxycarbonylethoxy)-- cyclohexan-(1S,2S,3R,4S,5S)

Zu einer Lösung von 1,8 g 2-Acetamido-4-acetoxy-3-(D-1′-benzyloxycarbonylethoxy)- 1,5-dihydroxycyclohexan-(1S,2S,3R,4R,5S) in 75 ml wasserfreiem Pyridin werden tropfenweise bei 0° 2,2 ml Benzoylchlorid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden bei 0° gerührt. Danach wird die Lösung in Eiswasser gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Ethylacetat/Hexan=3/1), wobei man die Titelverbindung als mikrokristallinen Schaum erhält.
Rf = 0.47 (Ethylacetat/Hexan=1/1), Fp = 69-71°,
[α] = +49,0 (c = 0.75 in Dichlormethan)

RMN¹H (400 MHz, CDCl₃): 1.27 (3 H, d, CH₃CH); 2.00 (7 H, s, OAc, NAc, H_6a; 2.58 (1 H, dt, H_6e); 4.05 (1 H, t, H₃); 4.12 (1 H, dd, H2); 1H, q, CH₃CH); 5.22 (2 H, q, CH₂Ph); 5.40 (1 H, td, H₅); 5.45 (1 H, q, H₄); 5.96 (1 H, m, H₁); 7.25-8.25 (15 H, m, Ph);.
J_1,2=3 Hz; J_2,3=J_3,4=J_4,5=J_5,6a=10,5 Hz; J_5,6e=4,5 Hz.

RMN¹³C (200 MHz, CDCl₃): 18.7 (CH₃CH); 20.8 (OAc); 23.0 (NAc); 31.8 (C₆); 54.5 (C₂); 67.5 (CH₂Ph); 68.9 (C₁); 70.0 (C₅); 75.6 (C₃); 75.7 (CHCH₃); 77.2 (C₄) 128.3-133.4 (Ph); 165.2 (COPh); 165.7 (COPh); 169.4 (CONAc); 171.2 (CO₂CH₂Ph); 174.9 (CON).

i) 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5-dibenzoxy-3-(D-1′-carboxyethoxy)cyclohexan-- (1S,2S,3R,4S,5S)

Zu einer Lösung von 600 mg 2-Acetamido-4-acetoxy-1,5-dibenzoxy-3-(D-1′- benzyloxycarbonylethoxy)cyclohexan-(1S,2S,3R,4S,5S) in 200 ml Ethanol gibt man 250 mg 10%iges Palladium auf Kohle. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden unter einem Druck von 2 bar hydriert. Danach wird die Lösung über Celite filtriert und hierauf unter vermindertem Druck eingedampft. Die Titelverbindung kann ohne weitere Reinigung verwendet werden.
Rf = 0.55 (Dichlormethan/Ethanol = 10/1).

Claims (2)

1. Neue Verbindungen der allgemeinen Formel worin R¹ für Wasserstoff oder Methyl, R² für Wasserstoff oder Methyl und R₃ für Methyl, Ethyl oder CH₂OH stehen.

2. Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der allgemeinen Formel worin R¹ für Wasserstoff oder Methyl, R² für Wasserstoff oder Methyl und R₃ für Methyl, Ethyl oder CH₂OH stehen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel worin R₁ obige Bedeutung besitzt und R₄, R₅ und R₆ für Schutzgruppen stehen, mit einer Verbindung der Formel worin R₂ und R₃ obige Bedeutung besitzen und R₇ für eine Schutzgruppe steht, umsetzt und anschließend die Schutzgruppen abspaltet.