JP3660230B2 - 天然型抗腫瘍性又は抗ウイルス性物質およびその用途 - Google Patents
天然型抗腫瘍性又は抗ウイルス性物質およびその用途 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬の分野で有用であり、腫瘍細胞・ウイルスの増殖を阻害し、抗腫瘍効果・抗ウイルス効果を発揮する天然由来の新規化合物、その製造法、その用途及びその産生細胞に関する。
更に詳細には、本発明は、ヒト胎盤脱落膜由来の細胞株、代表的にはＴＴＫ−１細胞からさらにクローニングされたＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性のヒト型ナチュラルサップレッサー（ＮＳ）細胞「ＣＤ５７+ ＨＬＡ−ＤＲbrightＮＳｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＴＴＫ−１）」（以下、「ＮＳ細胞」と略記する。）の培養生産物、その製造方法、その用途及び当該ＮＳ細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
癌化学療法の分野では、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）及びアドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）等の多くの微生物代謝産物を臨床的に応用することが試みられ、またこれらは実際に臨床において使用されている。
しかしながら、種々の腫瘍に対してその効果は必ずしも充分ではなく、また、臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細胞の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応用性は複雑化している［第４７回日本癌学会総会記事、１２頁〜１５頁（１９８８年）参照］。
一方、胎仔に対する母系の免疫反応は、一次的には脱落膜組織で制御されており、ＮＫ細胞マーカーを有する大顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）に属する大群の細胞集団が初期妊娠のヒトを含む哺乳動物の脱落膜層に集積していることが明らかにされている（森等、イミュノモルキュラー メカニズムズ イン マンマリアンインプランティション、エンドクリン、J.41（サプリメント）：S17 ［Mori, T et. al, Immunomolecular mechanisms in mammalian implantation. Endocrine. J.41 (Suppl): S17. ］）。
このＬＧＬに属するＮＳ細胞は、マウスにおいてはＷＧＡレクチンに対するレセプターを有し、ヒトにおいてはＣＤ５７の糖鎖マーカーを有するため、免疫Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージーとは、異なる細胞群であることが知られている。
その機能はＭＨＣ−非拘束性にマイトジェンによるリンパ球の分裂反応や混合リンパ球反応等のリンパ球分裂反応を強力に抑制することから、更にＮＳ細胞は癌細胞の分裂を抑制する機能を有していると報告されている（Ｔｉｌｄｅｎ等、ジャーナル オブ イムノロジー １３０巻、１１７１頁）。
しかしながら、ＮＳ細胞の免疫抑制作用、癌細胞増殖抑制作用を司る原因物質については、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白や分子量１万以下のリピッド様物質が指摘されているが（クラーク等、ジャーナル オブ イムノロジー、１４４巻、３００８頁（Clark et. al., J. Immunol ）及び（モルタリ等、ジャーナル オブ イムノロジー、１４４巻、３０３７頁（Mortari et. al., J. Immunol ）、現在のところ正確な構造と機能は全く不明で、その解明が望まれてきた。
本発明の化合物と化学構造が近似する既存の抗腫瘍・抗ウイルス効果を有する化合物としては、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）（米国特許第２８０２００５号及び同２８８５３９６号）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）（米国特許第４０７１６８０号）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）（英国特許第１１６８３９１号）、ジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ；ＡＺＴ）（ドイツ国特許第３６０８６０６号）、ジダノシン（Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ；ｄｄＩ）（欧州特許公開第２０６４９７号公報）等が挙げられる。
しかしながら、これらの核酸系抗癌剤、抗ウイルス剤は、効果が見込まれる腫瘍細胞・ウイルスの種類が限られているのみならず、ヒトの正常細胞にも作用するため、細胞毒性が高くその副作用が社会問題化している。
【０００３】
発明の開示
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、既存の抗腫瘍剤及び抗ウイルス剤が充分に効果を発揮できない種類の癌及びウイルスを含めて有効性を有する物質をヒト細胞代謝産物中に探索し、種々の耐性癌に対して制癌作用及び抗ウイルス作用を有し、ヒト正常細胞を傷害しない副作用が低減された物質を提供することにある。
【０００４】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、ＮＳ細胞株がＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＢｅＷｏ，ＧＣＩＹヒトがん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導し、がん細胞の分裂反応を抑制し、更に、この細胞株が分泌するアポトーシスによるがん細胞死を誘導する核酸系物質（ＡＩＦと命名）を見出し、分離、精製し、構造決定を行った。そして、これらの物質が全く新しい発想による副作用の少ない天然型の制癌剤、抗ウイルス剤およびその他の医薬品として応用開発が可能であると考えられた。
本発明者らは、式（１）の化合物を産生する能力を有するヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞を培養し、その培養液（上清および細胞、特に上清）から式（１）の化合物を採取し、要すれば医薬上許容される塩とすることにより、式（１）
【化３】
で表わされる基、Ｒ２は、水素原子、水酸基又はメトキシ基を示す。）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を得、式（１）の化合物又はその医薬上許容される塩が、ヒト癌細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導し、癌細胞の増殖反応を抑制し、抗腫瘍効果又は抗ウイルス効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、上記式（１）（式中のＲ１およびＲ２は、上記と同じ定義である。）で表される抗腫瘍性若しくは抗ウイルス性物質又はその医薬上許容される塩、その製造法、上記式（１）の抗腫瘍性もしくは抗ウィルス性物質またはその医薬として許容される塩を有効成分とする医薬、上記化合物の医薬製造および治療への使用、並びにＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本明細書で言及する各種の用語及び定義について説明する。
式（１）の化合物は、ＮＳ細胞株の培養上清中のアポトーシス インデューシング ファクター（ＡＩＦ）を物理・化学的方法による分離・精製により得られ、次式（１）
【化４】
で表わされる基、Ｒ２は、水素原子、水酸基又はメトキシ基を示す。）で表される化合物で示されるが、これらは逆相高速液体クロマトグラフィーによる活性分画に因んで、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６と命名される。
ここで、「Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６」とは、具体的には、それぞれ２′−デオキシウリジン、リボチミジン、２′−Ｏ−メチルウリジン、チミジン、２′−Ｏ−メチルイノシン及び２′−Ｏ−メチルグアノシンを意味する。
即ち、式（１）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ
【化５】
【０００６】
以下に、本発明の代表的化合物の理化学的性状を示す。
ａ）Ｐ１の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ５
ｍｐ：１６５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２２９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２），ｍａｘ，２５８．５ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図１にＰ１のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６４［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：２０分
【０００７】
ｂ）Ｐ２の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ６
ｍｐ：１８３〜１８５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２５９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６７ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図２にＰ２のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６６［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：２９分
【０００８】
ｃ）Ｐ３の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ６
ｍｐ：１５９℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２５９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６３ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図３にＰ３のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．７２［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：４０分
【０００９】
ｄ）Ｐ４の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ５
ｍｐ：１８５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２４３［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６７ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図４にＰ４のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６９［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：５０分
【００１０】
ｅ）Ｐ５の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１１Ｈ１４Ｎ４Ｏ５
ｍｐ：２１０〜２１２℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２８３［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２８３ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図５にＰ５のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６７［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：６４分
【００１１】
ｆ）Ｐ６の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ５
ｍｐ：２１８〜２２０℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２９８［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ１１，ｐＨ１）ｍａｘ，ｐＨ１１で２５８ｎｍ、ｐＨ１で２５６ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図６にＰ６のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．５９［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：８３分
【００１２】
以下に、本発明の細胞株の細胞学的性質を示す。
１）細胞の形態：大顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）
２）細胞の由来：妊娠７週齢のヒト胎盤より分離した脱落膜組織細胞
３）継代培養：永久増殖可能
４）生長因子要求性：ヒト正常子宮内皮細胞生長因子やヘパリンを含まない培地で増殖可能である。
５）細胞の維持・増殖条件・増殖依存性：本細胞株は一般に３６〜３８℃、好ましくは３７℃の温度条件下及びｐＨ６．５〜７．５好ましくは７．０の条件下で良好に維持増殖する。
６）細胞増殖能：本細胞の２×１０5 個細胞／ｍｌを上記培養条件下で培養すると、３日後には少なくとも５×１０5 個細胞／ｍｌの密度に達する。
７）機能：エストロゲン及びプロゲステロンレセプターを有さず、プロラクチンを分泌しないことより脱落膜間質細胞ではない。核酸系機能物質を産生し、ＭＬＲやマイトゲン刺激によるリンパ球分裂反応を抑制する。
８）コロニーの形式：ペトリ皿上ではコロニーを形成するが、軟寒天中では形成しない。
９）凍結保存：−７０℃〜−１９６℃できわめて長期間保存可能である。
１０）染色体の性状：メタセントリック
１１）染色体分析による確認：ヒト組織由来の細胞
１２）染色体数：９９〜１００、１０７〜１０８
１３）細胞表面マーカー：ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性であることより免疫系細胞である
１４）維持・増殖用培地：１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０培養液又はチミジンを除去した無血清培地において良好に維持増殖する。
【００１３】
本発明の細胞株を得るには、例えば、次のような方法を採用すればよい。
即ち、ヒト胎盤脱落膜細胞を取得するには、例えば、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）第５２巻、２７４５頁−２７５６頁（１９７３年）に記載の方法に従って行なえばよい。その概要は、ヒト子宮内膜又は胎盤脱落膜（ヒト子宮内組織であればいずれの組織でもよいが、例えば、胎盤脱落膜部位は入手が容易で好適である。）をできるだけ無菌的に採取し、洗浄後、トリプシン処理により細胞を結合組織より分離して集めることによって得られる。
本発明で使用される細胞は、ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト胎盤脱落膜由来の細胞であって、式（１）の化合物を産生する能力を有するものであれば何れの細胞でもよいが、好ましくはＮＳ細胞又はそのクローン株若しくはサブクローン株が挙げられる。本細胞株（ＮＳ）は、常法により選択クローニング株化することにより得ることができる。
例えば、ＮＳ細胞を常法によりクローニングする際に、式（１）の化合物産生量をチェックすることにより、式（１）の化合物の産生能の高いクローン株を得ることができる。具体的には、予め１×１０5 個のＴＴＫ−１細胞を限界希釈法により、０〜１個細胞／ウェルになるように、３７℃、５％炭酸ガス存在下培養を重ね、式（１）の化合物の産生能の高い細胞クローンを選択した。
なお、本発明の細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号）に寄託されており、その生命研受託番号はＦ ＥＲＭ ＢＰ６３５０(原寄託日：平成9年5月19日)（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１６２３３号より移管(移管日：平成10年5月13日))である。
また、図１３に本発明のＮＳ細胞株（ＴＴＫ−１）の位相差顕微鏡写真（４００倍）を示す。ＮＳ細胞株は自らラミニンを分泌し培養基質に接着しＬＧＬ細胞株の形態を示した。
【００１４】
次に、本発明化合物の製造法を説明する。
ヒト胎盤脱落膜由来の細胞、代表的にはＮＳ細胞を栄養源含有培地に接種して好気的にＣＯ２インキュベーター内で培養させることにより、その培養液（上清および細胞、好ましくは上清）から本発明の式（１）の化合物を採取し、要すれば薬学的に許容しうる塩とすることにより製造することができる。
上記のように得られたヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞は、一般に動物細胞の培養に用いられる培地に必要に応じて血清を加えたもの、具体的には２０％牛胎児血清を含む通常の細胞培養用培地で培養することができる。
該細胞培養用培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＭＥＭ培地（アール、アルファ、ダルベッコ、Ｈｉｇｈ−ＧＥＭ）、ハム培地（Ｆ−１０、Ｆ−１２）、イスコフ培地、１１９培地、Ｌ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、ＮＣＴＣ１３５培地、ウイリアムスＥ培地、ウェイマウス培地等の該細胞の培養可能な培地であれば、いずれの培地でもよいが、特にＲＰＭＩ−１６４０が好ましい。
培養方法は、一般の細胞株代謝産物の生産方法と同様に行うことができ、固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振盪培養、通気培養等のいずれの培養方法を実施してもよいが、特に振盪培養又は深部通気攪拌培養等が好ましい。該細胞を培養するに当り、上記培地に数％、好ましくは５％程度の炭酸ガスを含有させることが好ましい。
かかる培地のｐＨは、６〜８であり、特に中性付近が好都合である。培養は、３０〜４０℃で可能であり、特に、３７℃付近が好ましい。培養時間は使用する培地、ｐＨ、温度条件等により一概にはいえないが、通常、４〜５日の培養により、該細胞は継代することができる。
培養液から目的とする式（１）の化合物を採取するには、微生物の生産する代謝物の培養物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用される。
生成した式（１）の化合物は、公知の単離・精製法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を単独又は組合せて行うことにより精製することができる。
培養濾液より通常の分離手段、また逆相高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども抽出精製に適宜利用可能である。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーを適宜組合せることにより高度に精製することができる。
【００１５】
後述するように（「本発明の有用性の確認」の項）、本発明化合物は、ヒトをはじめとする哺乳動物の腫瘍及びウイルス性疾患の治療剤等の医薬として期待される。
なお、本発明化合物は、生体内でリン酸化されて薬理作用を示す可能性があるが、かかるリン酸化合物も本発明の範囲内に含まれるのは言うまでもない。
本発明化合物の治療効果が期待される好適な腫瘍としては、例えば、ヒトの血液癌のみならず、一般の胃、大腸癌等の消化器系癌、肺癌等の呼吸器系癌、卵巣癌、絨毛癌等の生殖系癌などの上皮性癌が挙げられる。
本発明化合物の治療効果が期待される好適なウイルスとしては、例えば、ヒトのレトロウイルス系のＨＴＬＶ、ＨＩＶ等が挙げられる。
本発明の式（１）の化合物は、抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として使用される場合には、その医薬上許容される塩としても使用することができる。
式（１）で表される本発明の化合物の無毒性塩としては、例えば塩酸、硝酸、硫酸若しくはリン酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸若しくは酒石酸等の有機酸との塩、メタンスルホン酸若しくはｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩又はアスパラギン酸、グルタミン酸若しくはリジン等のアミノ酸との塩が挙げられる。
本発明の化合物の医薬上許容しうる塩の製造法は、有機合成化学分野で通常用いられる方法を適宜組み合わせて行うことができる。具体的には、本発明化合物の遊離型の溶液を酸性溶液で中和滴定すること等が挙げられる。
【００１６】
本発明化合物を抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として使用する際の投与形態としては各種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の経口剤、例えば溶液、懸濁液等の殺菌した液状の非経口剤等が挙げられる。本発明の製剤は、本発明化合物（１種または複数種）を有効成分として含み、必要に応じて担体、希釈剤もしくは賦形剤など通常の種々の添加物を含むことができる（医薬組成物）。
固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできるが、適当な添加物を使用して製造することもできる。
該添加物としては、例えば乳糖、ブドウ糖等の糖類、例えばトウモロコシ、小麦、米等の澱粉類、例えばステアリン酸等の脂肪酸、例えばメタケイ酸ナトリウム、アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム等の無機塩、例えばポリビニルピロリドン、ポリアルキレングリコール等の合成高分子、例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、例えばステアリルアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール類、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の合成セルロース誘導体、その他、水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴム等通常用いられる添加物等が挙げられる。
これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末等の固形製剤は、一般的には０．１〜１００重量％、好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含むことができる。液状製剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、ピーナツ油、ゴマ油等の植物由来の油等液状製剤において通常用いられる適当な添加物を使用し、懸濁液、シロップ剤、注射剤等の形態として製造することができる。
特に、非経口的に筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射で投与する場合の適当な溶剤としては、例えば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉内注射用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈内注射用液体（例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム等の水溶液）、電解質溶液（例えば点滴静注、静脈内注射用）等又はこれらの混合溶液が挙げられる。
また、これらの注射剤は予め溶解したものの他、粉末のまま又は適当な添加物を加えたものを用時溶解する形態もとることができる。これらの注射液は、通常０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の有効成分を含むことができる。経口投与の懸濁剤又はシロップ剤等の液剤は、０．５〜１０重量％の有効成分を含むことができる。
本発明の製剤は、有効成分として本発明化合物の１種または複数種を含むことができ、有効成分の好ましい例は、本発明の代表的化合物Ｐ１〜Ｐ６の１種、より好ましくは２〜６種の組合せである。
本発明の化合物の実際に好ましい投与量は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種類、適用頻度及び治療すべき疾患部位及び患者の病状によって適宜増減することができる。
例えば、一日当りの成人一人当りの投与量は、経口投与の場合、１０ないし５００ｍｇであり、非経口投与、好ましくは静脈内注射の場合、１日当り１０ないし１００ｍｇである。なお、投与回数は、投与方法及び症状により異なるが、単回又は２ないし５回に分けて投与することができる。
【００１７】
本発明の有用性の確認
〔概要〕
ヒトの胎盤脱落膜組織に由来したＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）細胞株はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ，ＢｅＷｏ等ヒトガン細胞のアポトーシスを誘導し、それらの細胞の増殖を抑制する。アポトーシス誘導物質（ＡＩＦ）はＮＳ細胞株培養上清中に産生、放出される。そこで、ＮＳ細胞の産生するＡＩＦを物理、化学的方法を持って、分離、精製した。ＡＩＦの活性測定は細胞への３Ｈチミジンの取り込み能とＤＮＡ断片化法で行った。先ず、ＮＳ細胞株の培養上清中のＡＩＦの分離はＣ１８カラムに吸着させて溶出した。この粗抽出物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に展開し、活性分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製、純化した。ＨＰＬＣで得られた六つのピークに由来するコンポーネント（Ｐ１−Ｐ６）はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ，ＢｅＷｏガン細胞の細胞死と増殖抑制を誘導したがヒト胎児肺由来の正常ＷＩ−３８細胞は全く傷害しなかった。この六つのＡＩＦの物理、化学的性質は核酸またはその誘導体であることが示唆され、実際、ＦＡＢ−ＭＳ，ＮＭＲで構造解析をしたところＰ１は２′−デオキシウリジン、Ｐ２はリボチミジン、Ｐ３は２′−Ｏ−メチルウリジン、Ｐ４はチミジン、Ｐ５は２′−Ｏ−メチルイノシン、Ｐ６は２′−Ｏ−メチルグアノシンであった。これらの６種類のＡＩＦをヒトがん組織を移植したマウスに投与した動物実験においても著明な腫瘍退縮効果をみとめた。
【００１８】
〔確認試験〕
ＨＰＬＣで最終的に分離、生成したＡＩＦを標的がん細胞に添加して試験管内のアポトーシス誘導能を検討する（試験管内実験）と共に、がん細胞を接種したＳＣＩＤマウスでのＡＩＦによる治療効果を検討した（動物実験）。
［Ｉ］試験管内実験
次に、本発明の有用性を示すために、まず本発明に係る代表例のＮＳ細胞株と代表的な各種ヒト由来の癌細胞を標的細胞として使用して、直接又は間接の共培養による相互作用を測定した。使用した細胞は下記の通りである。
（１）ＮＳ細胞株（ＴＴＫ−１）（ヒト胎盤脱落膜由来細胞株）
妊娠７週齢のヒト胎盤脱落膜組織細胞の培養から株化した細胞でありＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性の骨髄リンパ系組織由来の自然免疫抑制細胞である。
（２）Ｍｏｌｔ４（ヒトＴ細胞性白血病細胞株）
（３）Ｋ５６２（ヒト赤芽球性白血病細胞株）
（４）Ｕ９３７（ヒト組織球性白血病細胞株）
（５）ＧＣＩＹ（ヒト胃がん細胞株）
（６）ＢｅＷｏ（ヒト絨毛がん細胞株）
（７）ＷＩ−３８（ヒト胎児肺組織由来正常細胞株）
以上の細胞は、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０培養液又はチミジンを除去した無血清培地で５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養を継代したものである。
【００１９】
試験例１：ＮＳ細胞株とＭｏｌｔ４／Ｋ５６２／Ｕ９３７／ＧＣＩＹ／ＢｅＷｏ／ＷＩ−３８標的細胞の直接共培養試験（直接反応）
直接共培養試験：
ＮＳ、Ｍｏｌｔ４（ヒトＴ細胞性白血病細胞株）、Ｋ５６２（ヒト赤芽球性白血病細胞株）、Ｕ９３７（ヒト組織球性白血病細胞株）、ＧＣＩＹ（ヒト胃がん細胞株）、ＢｅＷｏ（ヒト絨毛がん細胞株）及びＷＩ−３８（ヒト胎児肺組織由来正常細胞株）を使用し、２４ウエルのプレートに培養液２ｍｌずつＮＳ（１０4 、１０5 、１０6 ）とＭｏｌｔ４／Ｕ９３７／ＧＣＩＹ／ＢｅＷｏ／ＷＩ−３８細胞（１０6 ）とを２４時間から４８時間直接共培養した。
ＮＳ細胞株と標的細胞間の直接相互作用（共培養）の結果、２４時間後に細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。
その結果、図１４Ａに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ １０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４ではＮＳ １０6 ／ウエルのみ、レーン５ではＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。Ｍレーンは ＤＮＡのサイズを示すマーカーである。
図１４Ｂに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数がそれぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＫ５６２ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４はＫ５６２ １０6 ／ウエルのみ、レーン５ではＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｃに示すように、レーン１、２、３はＫ５６２細胞及びＭｏｌｔ４細胞それぞれ１０6 、１０5 、１０4 ／ウエル間の共培養で、レーン４はＭｏｌｔ４１０6 ／ウエルのみ、レーン５はＫ５６２ １０6 ／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
図１４Ｄに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数がそれぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウェルとＢｅＷｏ １０6 ／ウェル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン４ではＮＳ １０6 ／ウェルのみ、レーン５はＢｅＷｏ １０6 ／ウェルのみ、レーン６はＢｅＷｏ １０6 ／ウェルとＧＣＩＹ １０6 ／ウェル間の共培養、レーン７はＧＣＩＹ １０6 ／ウェルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化はみとめられなかった。
図１４Ｅに示すように、レーン１、２、３、４はＮＳ細胞数それぞれ１０3 、１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＵ９３７ １０6 ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン７はＭｏｌｔ４ １０6 ウエルとＵ９３７ １０6 ／ウエル間の共培養で、レーン８はＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエルのみ、レーン６はＵ９３７ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
図１４Ｆに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＧＣＩＹ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４はＧＣＩＹ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｇに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＷＩ−３８ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞は接種したＮＳ細胞数の増加にもかかわらずＤＮＡ断片化が認められなかった。レーン４はＷＩ−３８ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
即ち、ＮＳ細胞とＭｏｌｔ４，Ｋ５６２，Ｂｅｗｏ、Ｕ９３７，ＧＣＩＹ細胞間の相互作用（共培養）の結果、２４時間後に標的細胞のＤＮＡ断片化が認められた。また、標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。
一方、ＤＮＡ断片化はＫ５６２とＭｏｌｔ４細胞間共培養、あるいはＭｏｌｔ４とＵ９３７細胞間、またＢｅｗｏとＧＣＩＹ細胞間共培養ではいずれも惹起されなかった。また、ＮＳ細胞とＷＩ−３８正常細胞間の共培養でもＤＮＡ断片化は認められなかった。これは、ＮＳ細胞株はヒト正常細胞を傷害しないことを示している。つまり、ＮＳ細胞株はヒトがん細胞の特異的なアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらしたといえる。
【００２０】
試験例２：ＮＳ細胞と標的Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチャンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）
間接共培養試験：
ウエル中に底部がフィルター状（０．４５μｍ径）になった細胞間反応用のカルチャーチャンバーをはめ込み内部にＭｏｌｔ４／Ｋ５６２（１０4 ）細胞を分注する。
３日間５％ＣＯ2 、３７℃の条件下で培養を行った後、標的細胞を採取し、 3Ｈチミジンの取り込み放射能法、トリパンブルー取り込み染色法、ＤＮＡ断片化法を行い、細胞間相互作用の結果を測定した。
この系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチャンバー内の標的がん細胞数の減少が認められた（図１５）。
この実験結果は、チャンバーのミリポアー膜を通して低分子の可溶性の標的がん細胞死をもたらす物質がＮＳ細胞株より産生されていることを示すものである。
【００２１】
試験例３：薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗抽出したＡＩＦによる標的細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制及びＤＮＡ断片化確認試験
ＮＳ細胞株培養上清５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラム（ボンドエリユート）にかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルとメタノールで分離、溶出し、窒素ガスによって溶媒を揮撥させ濃縮乾燥した。カラムに停留した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の増殖を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導した。
更にこの分画をＴＬＣで展開した。すなわち、Ｃ１８カラムで分離した物質をクロロホルム：メタノール（１：１）液中に溶かしてから薄層にスポットして、クロロホルム：メタノール：蒸留水（６０：４０：８）によって展開させる。展開後、培地中に含まれるフェノールレッド試薬のバンド（Ｒｆ＝０．５）より下の分画部（Ｒｆ＜０．５，ＴＬＣ−Ａ）、上の分画部（Ｒｆ＞０．５，ＴＬＣ−Ｂ）とに分け、ゲルを掻き取ってクロロホルム／メタノールによって、それぞれを抽出回収し、窒素ガスで乾燥させた。フェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（Ｕ）にＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の増殖を抑制し（図１６Ａ〜Ｂ）、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を認めた（図１７Ａ〜Ｂ）。
対照として、用いた新鮮培地、あるいは標的細胞のＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清中には標的細胞の増殖を抑制したり、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の産生は認められなかった。そして、ＮＳ細胞株培養上清中にヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導できる物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッドよりすみやかに移動する分画中（フェノールレッドＲｆ＝０．５）にＡＩＦが存在していることを確認した。
【００２２】
試験例４：ＨＰＬＣで最終分離精製したＡＩＦの標的細胞Ｍｏｌｔ４の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制試験
ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（ＴＯＳＯＨ）を用いて活性を有するＴＬＣのＢ分画物をアセトニリトル、０．１％トリフルオロ酢酸０から５％までの濃度で３６０分間で流速０．５ｍｌ／分でＯＤ２１４ｎｍでの吸光度で測定しながら分離、精製する。
得られた主要な６つのピーク（１−６）（図１８Ａ、ＨＰＬＣチャート）からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、各ピークの１／１０に濃度を薄めた混合試料（０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示した（図１９）。
図１９のカラムＭに示したように、これは各ピーク（ＡＩＦ）の相乗効果を示すものである。
【００２３】
試験例５：Ｍｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導できるＡＩＦの限界量
図２０Ａ、図２０Ｂに示すように、ＨＰＬＣより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料（Ａ：７μｇ／ｍｌ、Ｂ：７×３-2μｇ／ｍｌ）を４８時間 Ｍｏｌｔ４細胞５×１０5 に作用させ、標的細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。７μｇ／ｍｌおよび７×３-2μｇ／ｍｌの濃度でＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化が認められたが、図２０Ｃに示すように、７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した。
【００２４】
試験例６：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞ＢｅＷｏのＤＮＡ断片化試験
図２１Ａに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＢｅＷｏ細胞に４８時間反応させＢｅＷｏ細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＢｅＷｏ細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２１Ａ）。
【００２５】
試験例７：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞Ｕ９３７のＤＮＡ断片化試験
図２１Ｂに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＵ９３７細胞に４８時間反応後Ｕ９３７細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＵ９３７細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２１Ｂ）。
【００２６】
試験例８：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞ＧＣＩＹのＤＮＡ断片化試験
図２１Ｃに示すように、各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＧＣＩＹ細胞に４８時間反応後ＧＣＩＹ細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＧＣＩＹ細胞のＤＮＡ断片化を誘導した。
【００２７】
試験例９：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦのヒト正常細胞ＷＩ−３８のＤＮＡ断片化試験
またヒト正常細胞ＷＩ−３８を標的とするとき各ピーク（１−６）由来の試料の３倍量（６３μｇ／ｍｌ）を作用させても細胞増殖の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった（図２１Ｄ）。これは図１４Ｇに示したように、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞との直接作用でも正常細胞の傷害をもたらさなかった結果と対応する。
【００２８】
このシリーズの実験結果は重大な意味を有している。つまり本発明者らの分離、精製してきたＡＩＦはがん細胞特異的にアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらし、正常細胞はほとんど傷害しないこと、つまりがん患者に投与した場合に副作用を示さない、理想的な抗癌剤として開発できることを示唆している。
また、従来の免疫抑制剤がリンパ球の分裂阻害的薬理作用でもってその効果を示すことにより、本発明化合物を免疫抑制剤として開発することも可能である。ＨＰＬＣでの最終分離対照としてＭｏｌｔ４細胞の培養上清や新鮮培地をＮＳ細胞株培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＮＳ細胞株培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャート上では存在しなかった（図１８Ｂ、Ｃ）。
一方、ＮＳ細胞株そのものを破壊し、抽出した試料のＨＰＬＣチャートではＮＳ細胞株培養上清と同じパターンを示した。このことは、ＮＳ細胞自体も培養上清中と同じ活性ピーク（１−６）を含有することを示す。
【００２９】
以上の試験管内実験結果をまとめると、下記のように示すことができる。
（１）「ＮＳ細胞株は標的がん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導する」
ＮＳ細胞とＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，ＢｅＷｏ，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ細胞間の直接の相互作用（共培養）の結果、２４時間後に標的細胞のＤＮＡ断片化が認められた（図１４Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅ．Ｆ）。
標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、ＤＮＡ断片化はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４細胞間共培養（図１４Ｃ）、あるいはＭｌｏｔ４とＵ９３７あるいはＧＣＩＹとＢｅＷｏ細胞間共培養ではいずれも惹起されなかった。また、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞間の共培養ではＤＮＡ断片化が認められなかった（図１４Ｇ）。これは、ＮＳ細胞はヒト正常細胞を傷害しないことを示している。つまり、ＮＳ細胞のみがヒトがん細胞の特異的なアポトーシスを誘導する能力を有している所見が認められた。
【００３０】
（２）「ＮＳ細胞株はＡＩＦを培養上清中へ放出する」
ＮＳ細胞と標的Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチエンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）の系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチエンバー内の標的がん細胞数の減少も認められた（図１５）。更に、チエンバー内の標的がん細胞のＤＮＡ断片化が認められた。この実験結果はチエンバーのミリポアー膜を通して低分子の可溶性の標的がん細胞死をもたらす物質がＮＳ細胞株より産生されていることを示すものである。
【００３１】
（３）「薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗精製したＡＩＦは標的細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導する」
ＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導した。
さらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（ＲＦ値＞０．５、ＴＬＣ−Ｂ）にＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し（図１６Ａ，Ｂ）、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を認めた（図１７Ａ，Ｂ）。
対照として、用いた新鮮無血清培地（ＳＦＭ）、あるいは標的細胞のＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清中には標的細胞の増殖を抑制したり、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の産生は認められなかった。
そして、ＮＳ細胞培養上清中にヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導できる物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッド（Ｒｆ＝０．５）よりすみやかに移動する分画中（Ｒｆ＞０．５）にＡＩＦが存在していることを確認した。
【００３２】
（４）「ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦは標的細胞のＤＮＡの断片化を誘導する」 ＮＳ細胞培養上清の５００ｍｌからＴＬＣで粗精製したトータルの活性分画（ＴＬＣ−Ｂ）をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＭｃｏｌｕｍｎ（東ソー）によって、逆相ＨＰＬＣで分離、抽出した。
主要な６つのピーク（１−６）が得られた（図１８Ａ．ＨＰＬＣチャート）。３Ｈ−チミジンの取り込み能で測定したところ、各ピーク１−６からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した（図１９）。つまり、Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、各ピークからの試料を１／１０に希釈した混合試料（各０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示た。図１９のカラムＭに示したように、これは各ピーク（ＡＩＦ）の相乗効果を示すものである。
【００３３】
（５）「標的細胞のＤＮＡ断片化能を誘導出来るＡＩＦの限界量」
各活性ピーク（１−６）のＭｏｌｔ４細胞分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２０Ａ）。
ＨＰＬＣより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料７×３-2μｇ／ｍｌを４８時間Ｍｏｌｔ４細胞に作用させると、標的細胞のＤＮＡ断片化が認められたが（図２０Ｂ）、７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した（図２０Ｃ）。
【００３４】
（６）標的細胞として、ＢｅＷｏ，Ｕ９３７，ＧＣＩＹを使用すると、いずれのピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）及び１／１０に希釈した混合試料（各２．１μｇ／ｍｌ）も標的細胞の断片化を誘導した（図２１Ａ，Ｂ，Ｃ）。 またヒト正常細胞ＷＩ−３８を標的とするとき各ピーク（１−６）由来の試料を標的がん細胞に作用させた３倍量（６３μｇ／ｍｌ）を反応させても細胞分裂の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった（図２１Ｄ）。これは図１４Ｇに示したように、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞との直接作用でも正常細胞の傷害をもたらさなかった結果と対応する。この実験結果は重大な意味を有している。つまり本発明者らの分離、精製してきたＡＩＦはがん細胞特異的にアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらし、正常細胞はほとんど傷害しないこと、つまりがん患者に投与した場合に副作用を示さない、理想的な抗癌剤として開発できることを示唆している。また、Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清や新鮮培地をＮＳ細胞培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＴＴＫ−１培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャート上では見い出せなかった（図１８Ｂ．Ｃ）。
一方、ＮＳ細胞そのものを破壊し、抽出した試料のＨＰＬＣチャートではＮＳ細胞培養上清と同じパターンを示した。
以上の結果をまとめると、ＡＩＦはＮＳ細胞株からのみ産生され、培養培地中に放出される物質であると結論できる。
【００３５】
（７）ＡＩＦの物理化学的特性の検討と構造決定
ＨＰＬＣで最終的に分離、精製したＡＩＦ中のアミノ酸や六炭糖の有無はオルシノル硫酸反応やニンヒドリン反応で定性的に検討した。さらにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、核酸系物質であることが判明した。分子量は質量分析計（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）で推定した。プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）法により最終構造を決定した。
ＨＰＬＣにより分離したＡＩＦの各活性ピーク（１−６）は耐熱性で、ニンヒドリン、オルシノル反応陰性であり、非蛋白性、非六炭糖性のものであることが示唆された。
さらにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、核酸系物質であることが判明した（図７〜１２左上パネル）
構造解析の方向が確定したので、ＮＳ細胞の大量培養（約３００Ｌ）を行い、最終的にＨＰＬＣで分離精製した各ピーク（１−６）より分取して試料を調整した。質量分析（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）と核磁気共鳴（ＮＭＲ）法により最終構造を決定した。ＡＩＦの活性ピーク１〜６は、Ｐ１；２′−デオキシウリジン、Ｐ２；リボチミジン、Ｐ３；２′−Ｏ−メチルウリジン、Ｐ４；チミジン、Ｐ５；２′−Ｏ−メチルグアノシン、Ｐ６；２′−Ｏ−メチルグアノシンであった（図右上パネル）。
なおそれぞれのＡＩＦの活性ピーク（１−６）の分子量（＋Ｈ）は質量分析図（図７〜１２下パネル）の矢印の下に示してある。
【００３６】
［II］動物実験
試験管内実験でＡＩＦの効果が確認された血液がん細胞の代表としてＭｏｌｔ４および上皮性がん細胞の代表としてＧＣＩＹを使用した。
（１）ＳＣＩＤマウス各２０匹に約１０８個のヒト胃癌細胞（ＧＣＩＹ）を接種し、腫瘍の径が０．５ｃｍ（０．２５ｃｍ2 ）に到達した際（約２週後）に各４組群に分け、ＡＩＦによる担癌マウスでの治療実験をとり行った。一群は各担癌マウス５匹より構成される。
試験例１．
担癌マウス各５匹に前記ＴＬＣで分画し、６種類のヌクレオシド（ＡＩＦ）を含む試料（ＴＬＣ−Ｂ分画）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解して毎回総量１ｍｇ（２′−デオキシウリジン９０μｇ、リボチミジン１１０μｇ、２′−Ｏ−メチルウリジン１３５μｇ、チミジン３２２μｇ、２′−Ｏ−メチルイノシン２２６μｇ、２′−Ｏ−メチルグアノシン１１６μｇに相当）を０．５ｍｌのＰＢＳに溶解して経静脈（尾部静脈）より合計１８回（総量１８ｍｇ）投与した。
対照としてはＴＬＣで分画した際に得られたＴＬＣ上でフェノールレッドより下の分画−つまり６種類のヌクレオシドを含まない試料（ＴＬＣ−Ａ分画）を使用し、やはり経静脈（尾部静脈）より合計１８回投与した。腫瘍のサイズは長径×短径の積（面積）で計測した。図２２には１週、２週、３週目の各５匹の腫瘍の平均サイズを示している。グラフに示すように明らかにＡＩＦ投与群と対照群の両者の差異が認められ、ＡＩＦ投与群は対照群に比べて有意に強い腫瘍抑制効果を示した（ｔ検定でＰ＜０．０１）。
試験例２．
担癌マウス各５匹に試験例１と同様にＴＬＣ−Ａ、Ｂ分画をそれぞれ１ｍｇを０．３ｍｌのＰＢＳに溶解して腫瘍内に直接３回（０．１ｍｌ／回）に分けて、３日間投与したところ、ＴＬＣ−Ｂ分画の６種類のヌクレオシド（ＡＩＦ）を含む試料（構成量は実験１と同じ）では腫瘍の完全退縮をもたらした。対照としてのＡＩＦを含まないＴＬＣ−Ａ分画では腫瘍の退縮はまったく誘導できなかった（代表的例として対照担がんマウスと治療マウス各一匹及び腫瘍を切除したＡＩＦ投与群３例と対照群３例を図２３Ａ、Ｂに示す）。このＡＩＦによる腫瘍の退縮の機序は図２３Ｃに示すようにＡＩＦはＤＮＡの断片化、つまりアポトーシスによる腫瘍死を誘導した。
【００３７】
（２）ＳＣＩＤマウス各１０匹に約１０８個のヒトＴ細胞白血病細胞（Ｍｏｌｔ４）を接種し、腫瘍の径が０．３ｃｍ（０．０９ｃｍ2 ）に達した際（約２週後）各二群に分け、ＡＩＦによる担癌マウスでの治療実験をとり行った。
担癌マウス５匹に３種類のＡＩＦヌクレオシド（２′−デオキシウリジン、リボチミジン、チミジン、各４００μｇ、三者合計１．２ｍｇ）を０．５ｍｌのＰＢＳに溶解して、経静脈と直接腫瘍内投与を交互にくりかえし合計１８回（総量２１．６ｍｇ）投与した。腫瘍のサイズは長径×短径の積（面積）で計測し、３週間追跡した。５匹のうち３匹の腫瘍は完全に退縮し、残り２匹の腫瘍も極めて小さなサイズに抑制した。図２４のグラフは１週、２週、３週目の各５匹の腫瘍の平均サイズを示している。一方、対照群のグラフに示しているようにＰＢＳ投与対照群では腫瘍の増大がもたらされ、両者の間には完全な有意差が認められた（ｔ検定でｐ＜０．００１）。
【００３８】
〔III〕考察
胎仔に対する母系の免疫反応は、一次的には脱落膜組織で制御されている。
ＮＫ細胞マーカーを有するＬＧＬ細胞と考えられる大群の細胞集団が初期妊娠のヒトを含む哺乳類の脱落膜層に集積していることが本発明者らの研究で明らかにされている。そして、おそらくこれらのＮＫ細胞集団は胚盤胞の着床の局面で重要な役割を担っている。つまり、妊娠時のたえず増殖し発生途上にある胎児胎盤の形成をＮＫ細胞は制御している。いいかえれば天然のがん免疫反応が妊娠の場で遂行されている。
本発明者らの有するＮＳ細胞株はヒト妊娠３カ月の脱落膜層より本発明者らがクローニングし樹立したＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性のヒトナチュラルサプレッサー細胞である。この細胞株は脱落膜間質細胞の特長であるエストロゲンやプロゲステロンレセプターをもたず、プロラクチンも分泌しないことから、むしろ、骨髄やリンパ系組織から遊走してきた細胞系譜と考えられる。
ＮＳ細胞の具体的機能としては抗体産生、ＭＬＲやマイトゲン刺激によるリンパ球分裂反応の抑制だけでなく、最近では腫瘍細胞の増殖抑制作用も報告されてきた（Sugiura,K.,M.Inaba.,H.Ogata.,R.Yasumuzu.,E.E.Sardina.,K.Inaba.,
S.Kuma.,R.A.Good.,and S.Ikehara.1990.Inhibition of tumor cell proliferation by natural suppressor cells present in murine bone marrow.Cancer.Res.50:2582 ）。このＮＳ細胞の基本的には細胞分裂制御を介在するエフェクター物質としては、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白（Clark,D.A.,K.C.Flanders.,D.Banwatt.,W.Millar-Book.,J.Manuel.,J.Stedronska-Clark.,and B.Rowley.1990.Murine pregnancy decidua produces a unique immunosuppressive molecule related to transforming growth factor beta-2.J.Immunol.144:3008）や、分子量１万以下のリピッド様物質（Mortari,F.,and S.K.Singhal.1988.Production of human bone marrow - derived suppressor factor.Effect on antibody synthesis and lectin-activated cell proliferation.J.Immunol.141:3037 ）が指摘されてきたがその実体については不明であった。またＮＳ細胞による免疫抑制作用機序として、本発明者らの以前の研究（〔Tatsumi,K,T.Mori.,E.Mori.,H.Kanzaki.,and T.Mori.1987.Immunoregulatory factor released form a cell line derived from human decidual tissue.Am.J.Reprod.Immunol.Microbiol.13:87 ）でも 指摘してきたように、ＮＳ細胞株の上清中の蛋白性物質がＩＬ−２を介するＴ細胞分裂反応を抑制する。
本発明において、驚くべきことに、このＮＳ細胞株はヒト血液がん細胞であるＫ５６２／Ｍｏｌｔ４／Ｕ９３７だけでなく、悪性度の極めて高いヒト胃がん細胞ＧＣＩＹやヒト絨毛がん細胞ＢｅＷｏもアポトーシス（ＤＮＡ断片化）作用によってがん細胞死を誘導し、その増殖を抑制することが明らかとなった。
そして、さらにこの細胞株の培養上清中より、がん細胞のアポトーシスを誘導する物質（ＡＩＦ）の分離、精製、構造決定を行った。その過程はまず、ＮＳ細胞株培養上清の凍結乾燥試料をＣ１８−カラムに疎水性結合した物質をアセトニトリルで溶出した。溶出した活性因子をさらにＴＬＣで粗精製した。活性画分はフェノールレッドより大きなＲｆ値を示し、Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し、ＤＮＡ断片化を招来した。そして最終的にはＣ１８逆相カラムでＨＰＬＣにより活性分子を６つの主要ピークとして分離、精製した。これら６つのピークより得られた試料はいずれも標的がん細胞の増殖を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導したことにより、当初の目的物つまりＡＩＦであることが確認出来た。またこの６種類のＡＩＦは混合してカクテルとして使用した場合（現在がん化学療法で行われている多剤併用この場合天然の多剤併用）に、最も有効に作用することを見い出している。さらに、この６種のＡＩＦの物理化学的性質はオルシノール反応やニンヒドリン反応陰性であることから、非蛋白性であり、六炭糖を含まない物質であった。そして５００ダルトンカットの透析膜を通過し、質量分析計からの測定より、その分子量は１００〜５００にあたると推定された。
さらに図７〜１２左上に示すようにＨＰＬＣで分画した各活性ピークはＵＶスペクトラムで最大吸収値２４５ｎｍから２６５ｎｍを示した。すなわち、ＡＩＦは核酸またはその誘導体関連の物質であることが強く示唆された。
大量のＮＳ細胞培養上清から最終的にＡＩＦを分離、精製して構造解析に耐え得る試料を調整し、ＦＡＢ−ＭＳで分子量をプロトンＮＭＲで最終的にそれらの構造を決定した（図１〜１２）。６種類のＡＩＦは塩基またはリボースの一部がデオキシ化されたりメチル化されたユニークな構造を有するヌクレオシド系に属するものであった。
本発明のようにヒトＮＳ細胞が一連の核酸系物質を分泌し、ヒトのあらゆるがん細胞のアポトーシスを誘導することが見出されたのは本発明者らが知る限り世界でも最初である。
現在、臨床的に使用されている核酸系抗癌剤、抗ウイルス剤（たとえば５− ＦＵ、フトラフール（ＦＴ）、フルツロン、ＡＺＴ、ＤＤＩ、Ａｒａ−ｃ）が細胞毒性が高くその効果もさることながら、人体に投与した場合に副作用が強く社会問題化している。
本発明者らが見出したＡＩＦは試験管内おひ動物実験の所見ではあるが（これらの実験系は、ヒト用の抗癌剤、抗ウイルス剤の評価を目的としてこの分野で確立された従来の試験管内および動物実験系である（たとえば図２２，２３，２４参照））、ヒト正常細胞はまったく傷害せず、つまり将来人体に投与した場合副作用の軽減化をはかりながら、がん細胞特異的なアポトーシス（ＤＮＡ断片化）の誘導という自然の薬理作用機序でもってがん細胞死をもたらす天然型の理想的な制癌剤を開発できる基盤を開拓したのである。
【００３９】
〔IV〕図の補足説明
図１４：ＮＳ細胞株は標的がん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導するが正常細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導しないことを示す。
ＮＳ細胞と標的細胞間の直接の相互作用（共培養）の結果、２４時間後細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
図１４Ａに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＭｏｌｔ４ １０６／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン５はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン４はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｂに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＫ５６２ １０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン４はＫ５６２の１０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｃに示すように、レーン１，２，３はＫ５６２細胞及びＭｏｌｔ４細胞それぞれ１０６，１０５，１０４／ウエル間共培養で、レーン４はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン５はＫ５６２ １０６／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｄに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＢｅＷｏ １０６／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン４ではＮＳ１０６／ウエルのみ、レーン５はＢｅＷｏ １０６／ウエルのみ、レーン６はＢｅＷｏ １０６／ウエルとＧＣＩＹ１０６／ウエル間の共培養、レーン７はＧＣＩＹ１０６／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｅに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０３，１０４，１０５，１０６／ウエルとＵ９３７ １０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン７はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルとＵ９３７ １０６／ウエル間共培養で、レーン８はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン６はＵ９３７ １０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｆに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＧＣＩＹ１０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン４はＧＣＩＹ１０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみのは場合はＤＮＡ断片化をおこさなった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｇに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＷＩ−３８ １０６／ウエル間共培養で標的細胞は接種したＮＳ細胞数が増加してもＤＮＡ断片化が認められなかった。レーン４は ＷＩ−３８ １０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１５：ＮＳ細胞株はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞と間接共培養において標的細胞の増殖を抑制することを示す。
図１５に示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞とＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチエンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）の系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチエンバー内の標的がん細胞数の減少が認められた。図１６〜１７：薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗精製したＡＩＦは標的細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導することを示す。
ＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清（ＴＴＫ−１ Ｓｕｐ）約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。
図１６Ａに示すようにさらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（Ｕ）は無血清培地（ＳＦＭ）、対照群（Ｃ）およびＴＬＣ上の位置より下部に存在する分画（Ｌ）と比べ、Ｋ５６２細胞の分裂を抑制することが認められた。
一方、図１６Ｂに示すようにさらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部（Ｕ）に存在する分画にＴＬＣ上の位置より下部（Ｌ）に存在する分画と比べ、有意にＭｏｌｔ４細胞の分裂を抑制することが認められた。
対照群（Ｃ）および用いた新鮮無血清培地（ＳＦＭ）は標的細胞の増殖を抑制することは認められなかった。
図１７Ａ，Ｂに示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）の位置より上部（Ｕ，レーン１，３）に存在する分画と下部（Ｌ，レーン２，４）に存在する分画とに分けて抽出し、Ｋ５６２細胞（Ａ）／Ｍｏｌｔ４細胞（Ｂ）のＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を調べた。
これらの抽出物をＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞と反応させ、２４時間（レーン１，２）、４８時間（レーン３，４）後に細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。この図に示すようにＮＳ細胞培養上清中にはヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導する物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッドよりすみやかに移動する分画（Ｒｆ＞０．５）中にＡＩＦが存在していることを確認した。
図１８：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦのＨＰＬＣチャート
図１８Ａに示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）培養上清の５００ｍｌからＴＬＣで粗精製したトータルの活性分画をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＭｃｏｌｕｍｎ（東ソー）によって、逆相ＨＰＬＣで分離、抽出した。主要な６つのピーク（１−６）が得られた。
図１８Ｂ，Ｃに示すようにＭｏｌｔ４細胞の培養上清（Ｂ）や新鮮培地（Ｃ）をＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＮＳ細胞培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャートでは見い出せなかった。
図１９，２０：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦは標的がん細胞Ｍｏｌｔ４の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡの断片化を誘導すること、および断片化を誘導できるＡＩＦの限界量を示す。
図１９に示すようにＨＰＬＣにより分離した主要な６つのピーク（１−６）からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した。つまり、Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、１／１０に希釈した各ピークの混合試料（各０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示した。図１９のカラムＭに示すように、これは各ピークの相乗効果を示すものである。
図２０Ａに示すように各ピーク（１−６）より調整した試料をＭｏｌｔ４細胞に４８時間反応後Ｍｏｌｔ４細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。各活性ピーク（１−６）のＭｏｌｔ４細胞分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料（７μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した試料（０．７μｇ／ｍｌ）の混合物はいずれもＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２０Ａ、レーン１〜７）。
図２０Ｂ、Ｃに示すようにＨＰＬＣにより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料（Ｂ；７×３-2μｇ／ｍｌ，Ｃ；７×３-5μｇ／ｍｌ）を４８時間Ｍｏｌｔ４細胞に作用させ、細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。図２０Ｂに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（７×３-2μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した試料（０．７×３-2μｇ／ｍｌ）の混合物によりＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化が認められたが（レーン、１−７）、図２０Ｃに示すように単独で７×３-5μｇ／ｍｌ、また１／１０に希釈した混合物で０．７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した（レーン、１−７）。
図２１：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦはヒトがん細胞ＢｅＷｏ／Ｕ９３７／ ＧＣＩＹのＤＮＡの断片化を誘導するが、ヒト正常細胞ＷＩ−３８のＤＮＡの断片化を誘導しないことを示す。
図２１Ａ、Ｂ、Ｃに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した混合物（２．１μｇ／ｍｌ）をＢｅＷｏ（Ａ）／Ｕ９３７（Ｂ）／ＧＣＩＹ（Ｃ）細胞に４８時間反応後の各標的細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。各活性ピーク（１−６）の標的細胞の分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料及び各ピーク（１−６）由来の１／１０希釈した試料の混合物はいずれも標的細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（レーン１−７）。
図２１Ｄに示すように、各ピーク（１−６）由来の試料を標的がん細胞に対する３倍量（６３μｇ／ｍｌ）をヒト正常細胞ＷＩ−３８に４８時間反応後のＷＩ−３８細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのＡＩＦも正常細胞の分裂の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった。
図７〜１２：ＨＰＬＣにより分離した各活性ピーク１−６（ＡＩＦ）の物理化学特性と構造決定
ＮＳ細胞株の大量の培養（約３００Ｌ）を行い、最終的にＨＰＬＣで分離精製した各ピーク（１−６）より分取した試料を調整した。
図７〜１２各Ｐ１−Ｐ６の左上パネルに示すようにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、ＡＩＦは核酸系物質であることが判明した。
ＵＶスペクトラム解析により構造解析の方向が確定したので、質量分析（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）法により分子量を決定した（下パネル矢印）。さらに核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によりＡＩＦの最終構造を図７−１２（右上）のように決定した。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（培地、培養液を説明する。）
３日間５％ＣＯ2 、３７℃の条件下で培養を行った後、ＮＳ細胞培養上清（５００ｍｌ）を凍結乾燥し、Ｃ１８カラムに通して分離を行った。活性物質はカラムに結合するので、アセトニトリル、メタノールによってカラムより分離、溶出し、窒素ガスによって溶媒を気撥させ、溶質を濃縮乾燥させた。
Ｃ１８カラムで分離した物質をクロロホルム：メタノール（１：１）液中に溶かしてから薄層（ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）にスポットして、クロロホルム：メタノール：蒸留水（６０：４０：８）によって展開させる。展開後、フェノールレッド試薬のバンドより下の分画部（Ｌ）、上の分画部（ｕ）と分け、ゲルを掻き取ってクロロホルム／メタノールによって、それぞれの分画をクロロホルム：メタノール（１：１）液で抽出回収し、窒素ガスで乾燥させた。
ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（ＴＯＳＯＨ）を用いて活性能を有するＴＬＣのｕ分画物をアセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で０から５％までの直線濃度勾配で３６０分間、流速０．５ｍｌ／分でＯＤ２１４ｎｍでの吸光度で測定しながら分離、精製し、主要な６つのピーク（１−６）が得られた（図１８Ａ、ＨＰＬＣチャート）。
目的物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６をそれぞれ０．０１４ｍｇ、０．０１７ｍｇ、０．０２１ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０３５ｍｇ、及び０．０１８ｍｇ得た。
【００４１】
以下に本発明の化合物の製剤化例を示すが、本発明の化合物の製剤化は、本製剤化例に限定されるものではない。
製剤化例１
本物質（Ｐ１）１０（部）（以下、重量割合を示す）
重炭酸化マグネシウム１５
乳糖７５
を均一に混合して３５０μｍ以下の粉末状又は細粒状の散剤とする。この散剤をカプセル容器に入れてカプセル剤とした。
【００４２】
製剤化例２
本物質（Ｐ２）４５（部）
澱粉１５
乳糖１６
結晶性セルロース２１
ポリビニルアルコール ３
蒸留水３０
を均一に混合した後、破砕造粒して乾燥し、次いで篩別して１７７〜１４１０μｍの大きさの顆粒剤とした。
【００４３】
製剤化例３
製剤化例２と同様の方法で顆粒剤を作った後、この顆粒剤９６部に対してステアリン酸カルシウム４部を加えて圧縮成形し、直径１０ｍｍの錠剤を作製した。
【００４４】
製剤化例４
製剤化例２の方法で得られた顆粒剤の９０部に対して結晶性セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３部を加えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、これにシロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁液を加えて糖衣状を作製した。
【００４５】
製剤化例５
本物質（Ｐ３）０．６（部）
非イオン系界面活性剤２．４
生理的食塩水９７
を加温混合してからアンプルに入れ、滅菌を行って注射剤を作製した。
【００４６】
産業上の利用可能性
本発明の式（１）の化合物又はその医薬上許容される塩は、ヒト正常細胞を全く傷害せず、人体に投与した場合には副作用の軽減化を図りながら、癌細胞を特異的にアポトーシスによる癌細胞死をもたらすという自然の作用機序でもってヒトの癌疾患及びウイルス疾患を治療することが期待され、医薬の分野で抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物Ｐ１のＮＭＲチャートである。
【図２】化合物Ｐ２のＮＭＲチャートである。
【図３】化合物Ｐ３のＮＭＲチャートである。
【図４】化合物Ｐ４のＮＭＲチャートである。
【図５】化合物Ｐ５のＮＭＲチャートである。
【図６】化合物Ｐ６のＮＭＲチャートである。
【図７】ＡＩＦ（Ｐ１）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図８】ＡＩＦ（Ｐ２）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図９】ＡＩＦ（Ｐ３）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１０】ＡＩＦ（Ｐ４）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１１】ＡＩＦ（Ｐ５）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１２】ＡＩＦ（Ｐ６）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１３】本発明のＮＳ細胞株の位相差顕微鏡写真である。
【図１４】（Ａ〜Ｇ）はＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図１５】ＮＳ細胞と標的細胞との間接共培養の結果を示すグラフである。
【図１６】（Ａ，Ｂ）はＡＩＦによる標的細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制の結果を示すグラフである。
【図１７】（Ａ，Ｂ）はＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図１８】（Ａ〜Ｃ）はＡＩＦのＨＰＬＣチャートである。
【図１９】3Ｈ−チミジンの取り込み抑制の結果を示すグラフである。
【図２０】ＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真（Ａ〜Ｃ）である。
【図２１】（Ａ〜Ｄ）はＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図２２】ＡＩＦのヒト胃癌細胞に対する抑制効果を示すグラフである。
【図２３】ＡＩＦによるヒト胃癌組織退縮の効果（Ａ〜Ｂ）およびＤＮＡ断片化試験の結果（Ｃ）を示す写真である。
【図２４】ＡＩＦのヒトＴ細胞白血病細胞に対する抑制効果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬の分野で有用であり、腫瘍細胞・ウイルスの増殖を阻害し、抗腫瘍効果・抗ウイルス効果を発揮する天然由来の新規化合物、その製造法、その用途及びその産生細胞に関する。
更に詳細には、本発明は、ヒト胎盤脱落膜由来の細胞株、代表的にはＴＴＫ−１細胞からさらにクローニングされたＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性のヒト型ナチュラルサップレッサー（ＮＳ）細胞「ＣＤ５７+ ＨＬＡ−ＤＲbrightＮＳｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＴＴＫ−１）」（以下、「ＮＳ細胞」と略記する。）の培養生産物、その製造方法、その用途及び当該ＮＳ細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
癌化学療法の分野では、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）及びアドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）等の多くの微生物代謝産物を臨床的に応用することが試みられ、またこれらは実際に臨床において使用されている。
しかしながら、種々の腫瘍に対してその効果は必ずしも充分ではなく、また、臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細胞の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応用性は複雑化している［第４７回日本癌学会総会記事、１２頁〜１５頁（１９８８年）参照］。
一方、胎仔に対する母系の免疫反応は、一次的には脱落膜組織で制御されており、ＮＫ細胞マーカーを有する大顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）に属する大群の細胞集団が初期妊娠のヒトを含む哺乳動物の脱落膜層に集積していることが明らかにされている（森等、イミュノモルキュラー メカニズムズ イン マンマリアンインプランティション、エンドクリン、J.41（サプリメント）：S17 ［Mori, T et. al, Immunomolecular mechanisms in mammalian implantation. Endocrine. J.41 (Suppl): S17. ］）。
このＬＧＬに属するＮＳ細胞は、マウスにおいてはＷＧＡレクチンに対するレセプターを有し、ヒトにおいてはＣＤ５７の糖鎖マーカーを有するため、免疫Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージーとは、異なる細胞群であることが知られている。
その機能はＭＨＣ−非拘束性にマイトジェンによるリンパ球の分裂反応や混合リンパ球反応等のリンパ球分裂反応を強力に抑制することから、更にＮＳ細胞は癌細胞の分裂を抑制する機能を有していると報告されている（Ｔｉｌｄｅｎ等、ジャーナル オブ イムノロジー １３０巻、１１７１頁）。
しかしながら、ＮＳ細胞の免疫抑制作用、癌細胞増殖抑制作用を司る原因物質については、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白や分子量１万以下のリピッド様物質が指摘されているが（クラーク等、ジャーナル オブ イムノロジー、１４４巻、３００８頁（Clark et. al., J. Immunol ）及び（モルタリ等、ジャーナル オブ イムノロジー、１４４巻、３０３７頁（Mortari et. al., J. Immunol ）、現在のところ正確な構造と機能は全く不明で、その解明が望まれてきた。
本発明の化合物と化学構造が近似する既存の抗腫瘍・抗ウイルス効果を有する化合物としては、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）（米国特許第２８０２００５号及び同２８８５３９６号）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）（米国特許第４０７１６８０号）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）（英国特許第１１６８３９１号）、ジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ；ＡＺＴ）（ドイツ国特許第３６０８６０６号）、ジダノシン（Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ；ｄｄＩ）（欧州特許公開第２０６４９７号公報）等が挙げられる。
しかしながら、これらの核酸系抗癌剤、抗ウイルス剤は、効果が見込まれる腫瘍細胞・ウイルスの種類が限られているのみならず、ヒトの正常細胞にも作用するため、細胞毒性が高くその副作用が社会問題化している。
【０００３】
発明の開示
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、既存の抗腫瘍剤及び抗ウイルス剤が充分に効果を発揮できない種類の癌及びウイルスを含めて有効性を有する物質をヒト細胞代謝産物中に探索し、種々の耐性癌に対して制癌作用及び抗ウイルス作用を有し、ヒト正常細胞を傷害しない副作用が低減された物質を提供することにある。
【０００４】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、ＮＳ細胞株がＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＢｅＷｏ，ＧＣＩＹヒトがん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導し、がん細胞の分裂反応を抑制し、更に、この細胞株が分泌するアポトーシスによるがん細胞死を誘導する核酸系物質（ＡＩＦと命名）を見出し、分離、精製し、構造決定を行った。そして、これらの物質が全く新しい発想による副作用の少ない天然型の制癌剤、抗ウイルス剤およびその他の医薬品として応用開発が可能であると考えられた。
本発明者らは、式（１）の化合物を産生する能力を有するヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞を培養し、その培養液（上清および細胞、特に上清）から式（１）の化合物を採取し、要すれば医薬上許容される塩とすることにより、式（１）
【化３】
即ち、本発明は、上記式（１）（式中のＲ１およびＲ２は、上記と同じ定義である。）で表される抗腫瘍性若しくは抗ウイルス性物質又はその医薬上許容される塩、その製造法、上記式（１）の抗腫瘍性もしくは抗ウィルス性物質またはその医薬として許容される塩を有効成分とする医薬、上記化合物の医薬製造および治療への使用、並びにＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本明細書で言及する各種の用語及び定義について説明する。
式（１）の化合物は、ＮＳ細胞株の培養上清中のアポトーシス インデューシング ファクター（ＡＩＦ）を物理・化学的方法による分離・精製により得られ、次式（１）
【化４】
ここで、「Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６」とは、具体的には、それぞれ２′−デオキシウリジン、リボチミジン、２′−Ｏ−メチルウリジン、チミジン、２′−Ｏ−メチルイノシン及び２′−Ｏ−メチルグアノシンを意味する。
即ち、式（１）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ
【化５】
以下に、本発明の代表的化合物の理化学的性状を示す。
ａ）Ｐ１の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ５
ｍｐ：１６５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２２９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２），ｍａｘ，２５８．５ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図１にＰ１のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６４［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：２０分
【０００７】
ｂ）Ｐ２の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ６
ｍｐ：１８３〜１８５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２５９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６７ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図２にＰ２のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６６［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：２９分
【０００８】
ｃ）Ｐ３の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ６
ｍｐ：１５９℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２５９［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６３ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図３にＰ３のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．７２［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：４０分
【０００９】
ｄ）Ｐ４の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ５
ｍｐ：１８５℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２４３［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２６７ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図４にＰ４のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６９［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：５０分
【００１０】
ｅ）Ｐ５の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１１Ｈ１４Ｎ４Ｏ５
ｍｐ：２１０〜２１２℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２８３［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ７），ｍａｘ，２８３ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図５にＰ５のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．６７［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：６４分
【００１１】
ｆ）Ｐ６の理化学的性状
性状：無色結晶
分子式：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ５
ｍｐ：２１８〜２２０℃
マススペクトル：高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ ２９８［Ｍ＋１］
ＵＶスペクトル：λ［Ｈ２Ｏ（ｐＨ１１，ｐＨ１）ｍａｘ，ｐＨ１１で２５８ｎｍ、ｐＨ１で２５６ｎｍ］
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ｄ−クロロホルム，δｐｐｍ）：図６にＰ６のＮＭＲチャートを示す。
溶解性：メタノール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶け、水に溶ける。
酸性、中性、塩基性物質の区別：塩基性物質
薄層クロマトグラフィー（メルク社製、キーゼルゲル６０Ｆ２５４）
Ｒｆ値：０．５９［展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水（６０：４０：８）］
高速液体クロマトグラフィー
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０TM ４．６×１５０ｍｍ（トーソー社製）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水中に、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを濃度勾配５％／３６０分で増加させた系
流速：０．５ｍｌ／分
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
保持時間：８３分
【００１２】
以下に、本発明の細胞株の細胞学的性質を示す。
１）細胞の形態：大顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）
２）細胞の由来：妊娠７週齢のヒト胎盤より分離した脱落膜組織細胞
３）継代培養：永久増殖可能
４）生長因子要求性：ヒト正常子宮内皮細胞生長因子やヘパリンを含まない培地で増殖可能である。
５）細胞の維持・増殖条件・増殖依存性：本細胞株は一般に３６〜３８℃、好ましくは３７℃の温度条件下及びｐＨ６．５〜７．５好ましくは７．０の条件下で良好に維持増殖する。
６）細胞増殖能：本細胞の２×１０5 個細胞／ｍｌを上記培養条件下で培養すると、３日後には少なくとも５×１０5 個細胞／ｍｌの密度に達する。
７）機能：エストロゲン及びプロゲステロンレセプターを有さず、プロラクチンを分泌しないことより脱落膜間質細胞ではない。核酸系機能物質を産生し、ＭＬＲやマイトゲン刺激によるリンパ球分裂反応を抑制する。
８）コロニーの形式：ペトリ皿上ではコロニーを形成するが、軟寒天中では形成しない。
９）凍結保存：−７０℃〜−１９６℃できわめて長期間保存可能である。
１０）染色体の性状：メタセントリック
１１）染色体分析による確認：ヒト組織由来の細胞
１２）染色体数：９９〜１００、１０７〜１０８
１３）細胞表面マーカー：ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性であることより免疫系細胞である
１４）維持・増殖用培地：１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０培養液又はチミジンを除去した無血清培地において良好に維持増殖する。
【００１３】
本発明の細胞株を得るには、例えば、次のような方法を採用すればよい。
即ち、ヒト胎盤脱落膜細胞を取得するには、例えば、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）第５２巻、２７４５頁−２７５６頁（１９７３年）に記載の方法に従って行なえばよい。その概要は、ヒト子宮内膜又は胎盤脱落膜（ヒト子宮内組織であればいずれの組織でもよいが、例えば、胎盤脱落膜部位は入手が容易で好適である。）をできるだけ無菌的に採取し、洗浄後、トリプシン処理により細胞を結合組織より分離して集めることによって得られる。
本発明で使用される細胞は、ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト胎盤脱落膜由来の細胞であって、式（１）の化合物を産生する能力を有するものであれば何れの細胞でもよいが、好ましくはＮＳ細胞又はそのクローン株若しくはサブクローン株が挙げられる。本細胞株（ＮＳ）は、常法により選択クローニング株化することにより得ることができる。
例えば、ＮＳ細胞を常法によりクローニングする際に、式（１）の化合物産生量をチェックすることにより、式（１）の化合物の産生能の高いクローン株を得ることができる。具体的には、予め１×１０5 個のＴＴＫ−１細胞を限界希釈法により、０〜１個細胞／ウェルになるように、３７℃、５％炭酸ガス存在下培養を重ね、式（１）の化合物の産生能の高い細胞クローンを選択した。
なお、本発明の細胞株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号）に寄託されており、その生命研受託番号はＦ ＥＲＭ ＢＰ６３５０(原寄託日：平成9年5月19日)（国内寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１６２３３号より移管(移管日：平成10年5月13日))である。
また、図１３に本発明のＮＳ細胞株（ＴＴＫ−１）の位相差顕微鏡写真（４００倍）を示す。ＮＳ細胞株は自らラミニンを分泌し培養基質に接着しＬＧＬ細胞株の形態を示した。
【００１４】
次に、本発明化合物の製造法を説明する。
ヒト胎盤脱落膜由来の細胞、代表的にはＮＳ細胞を栄養源含有培地に接種して好気的にＣＯ２インキュベーター内で培養させることにより、その培養液（上清および細胞、好ましくは上清）から本発明の式（１）の化合物を採取し、要すれば薬学的に許容しうる塩とすることにより製造することができる。
上記のように得られたヒト胎盤脱落膜由来のＮＳ細胞は、一般に動物細胞の培養に用いられる培地に必要に応じて血清を加えたもの、具体的には２０％牛胎児血清を含む通常の細胞培養用培地で培養することができる。
該細胞培養用培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＭＥＭ培地（アール、アルファ、ダルベッコ、Ｈｉｇｈ−ＧＥＭ）、ハム培地（Ｆ−１０、Ｆ−１２）、イスコフ培地、１１９培地、Ｌ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、ＮＣＴＣ１３５培地、ウイリアムスＥ培地、ウェイマウス培地等の該細胞の培養可能な培地であれば、いずれの培地でもよいが、特にＲＰＭＩ−１６４０が好ましい。
培養方法は、一般の細胞株代謝産物の生産方法と同様に行うことができ、固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振盪培養、通気培養等のいずれの培養方法を実施してもよいが、特に振盪培養又は深部通気攪拌培養等が好ましい。該細胞を培養するに当り、上記培地に数％、好ましくは５％程度の炭酸ガスを含有させることが好ましい。
かかる培地のｐＨは、６〜８であり、特に中性付近が好都合である。培養は、３０〜４０℃で可能であり、特に、３７℃付近が好ましい。培養時間は使用する培地、ｐＨ、温度条件等により一概にはいえないが、通常、４〜５日の培養により、該細胞は継代することができる。
培養液から目的とする式（１）の化合物を採取するには、微生物の生産する代謝物の培養物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用される。
生成した式（１）の化合物は、公知の単離・精製法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を単独又は組合せて行うことにより精製することができる。
培養濾液より通常の分離手段、また逆相高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども抽出精製に適宜利用可能である。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーを適宜組合せることにより高度に精製することができる。
【００１５】
後述するように（「本発明の有用性の確認」の項）、本発明化合物は、ヒトをはじめとする哺乳動物の腫瘍及びウイルス性疾患の治療剤等の医薬として期待される。
なお、本発明化合物は、生体内でリン酸化されて薬理作用を示す可能性があるが、かかるリン酸化合物も本発明の範囲内に含まれるのは言うまでもない。
本発明化合物の治療効果が期待される好適な腫瘍としては、例えば、ヒトの血液癌のみならず、一般の胃、大腸癌等の消化器系癌、肺癌等の呼吸器系癌、卵巣癌、絨毛癌等の生殖系癌などの上皮性癌が挙げられる。
本発明化合物の治療効果が期待される好適なウイルスとしては、例えば、ヒトのレトロウイルス系のＨＴＬＶ、ＨＩＶ等が挙げられる。
本発明の式（１）の化合物は、抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として使用される場合には、その医薬上許容される塩としても使用することができる。
式（１）で表される本発明の化合物の無毒性塩としては、例えば塩酸、硝酸、硫酸若しくはリン酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸若しくは酒石酸等の有機酸との塩、メタンスルホン酸若しくはｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩又はアスパラギン酸、グルタミン酸若しくはリジン等のアミノ酸との塩が挙げられる。
本発明の化合物の医薬上許容しうる塩の製造法は、有機合成化学分野で通常用いられる方法を適宜組み合わせて行うことができる。具体的には、本発明化合物の遊離型の溶液を酸性溶液で中和滴定すること等が挙げられる。
【００１６】
本発明化合物を抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として使用する際の投与形態としては各種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の経口剤、例えば溶液、懸濁液等の殺菌した液状の非経口剤等が挙げられる。本発明の製剤は、本発明化合物（１種または複数種）を有効成分として含み、必要に応じて担体、希釈剤もしくは賦形剤など通常の種々の添加物を含むことができる（医薬組成物）。
固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできるが、適当な添加物を使用して製造することもできる。
該添加物としては、例えば乳糖、ブドウ糖等の糖類、例えばトウモロコシ、小麦、米等の澱粉類、例えばステアリン酸等の脂肪酸、例えばメタケイ酸ナトリウム、アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム等の無機塩、例えばポリビニルピロリドン、ポリアルキレングリコール等の合成高分子、例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、例えばステアリルアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール類、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の合成セルロース誘導体、その他、水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴム等通常用いられる添加物等が挙げられる。
これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末等の固形製剤は、一般的には０．１〜１００重量％、好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含むことができる。液状製剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、ピーナツ油、ゴマ油等の植物由来の油等液状製剤において通常用いられる適当な添加物を使用し、懸濁液、シロップ剤、注射剤等の形態として製造することができる。
特に、非経口的に筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射で投与する場合の適当な溶剤としては、例えば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉内注射用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈内注射用液体（例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム等の水溶液）、電解質溶液（例えば点滴静注、静脈内注射用）等又はこれらの混合溶液が挙げられる。
また、これらの注射剤は予め溶解したものの他、粉末のまま又は適当な添加物を加えたものを用時溶解する形態もとることができる。これらの注射液は、通常０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の有効成分を含むことができる。経口投与の懸濁剤又はシロップ剤等の液剤は、０．５〜１０重量％の有効成分を含むことができる。
本発明の製剤は、有効成分として本発明化合物の１種または複数種を含むことができ、有効成分の好ましい例は、本発明の代表的化合物Ｐ１〜Ｐ６の１種、より好ましくは２〜６種の組合せである。
本発明の化合物の実際に好ましい投与量は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種類、適用頻度及び治療すべき疾患部位及び患者の病状によって適宜増減することができる。
例えば、一日当りの成人一人当りの投与量は、経口投与の場合、１０ないし５００ｍｇであり、非経口投与、好ましくは静脈内注射の場合、１日当り１０ないし１００ｍｇである。なお、投与回数は、投与方法及び症状により異なるが、単回又は２ないし５回に分けて投与することができる。
【００１７】
本発明の有用性の確認
〔概要〕
ヒトの胎盤脱落膜組織に由来したＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）細胞株はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ，ＢｅＷｏ等ヒトガン細胞のアポトーシスを誘導し、それらの細胞の増殖を抑制する。アポトーシス誘導物質（ＡＩＦ）はＮＳ細胞株培養上清中に産生、放出される。そこで、ＮＳ細胞の産生するＡＩＦを物理、化学的方法を持って、分離、精製した。ＡＩＦの活性測定は細胞への３Ｈチミジンの取り込み能とＤＮＡ断片化法で行った。先ず、ＮＳ細胞株の培養上清中のＡＩＦの分離はＣ１８カラムに吸着させて溶出した。この粗抽出物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に展開し、活性分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製、純化した。ＨＰＬＣで得られた六つのピークに由来するコンポーネント（Ｐ１−Ｐ６）はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ，ＢｅＷｏガン細胞の細胞死と増殖抑制を誘導したがヒト胎児肺由来の正常ＷＩ−３８細胞は全く傷害しなかった。この六つのＡＩＦの物理、化学的性質は核酸またはその誘導体であることが示唆され、実際、ＦＡＢ−ＭＳ，ＮＭＲで構造解析をしたところＰ１は２′−デオキシウリジン、Ｐ２はリボチミジン、Ｐ３は２′−Ｏ−メチルウリジン、Ｐ４はチミジン、Ｐ５は２′−Ｏ−メチルイノシン、Ｐ６は２′−Ｏ−メチルグアノシンであった。これらの６種類のＡＩＦをヒトがん組織を移植したマウスに投与した動物実験においても著明な腫瘍退縮効果をみとめた。
【００１８】
〔確認試験〕
ＨＰＬＣで最終的に分離、生成したＡＩＦを標的がん細胞に添加して試験管内のアポトーシス誘導能を検討する（試験管内実験）と共に、がん細胞を接種したＳＣＩＤマウスでのＡＩＦによる治療効果を検討した（動物実験）。
［Ｉ］試験管内実験
次に、本発明の有用性を示すために、まず本発明に係る代表例のＮＳ細胞株と代表的な各種ヒト由来の癌細胞を標的細胞として使用して、直接又は間接の共培養による相互作用を測定した。使用した細胞は下記の通りである。
（１）ＮＳ細胞株（ＴＴＫ−１）（ヒト胎盤脱落膜由来細胞株）
妊娠７週齢のヒト胎盤脱落膜組織細胞の培養から株化した細胞でありＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性の骨髄リンパ系組織由来の自然免疫抑制細胞である。
（２）Ｍｏｌｔ４（ヒトＴ細胞性白血病細胞株）
（３）Ｋ５６２（ヒト赤芽球性白血病細胞株）
（４）Ｕ９３７（ヒト組織球性白血病細胞株）
（５）ＧＣＩＹ（ヒト胃がん細胞株）
（６）ＢｅＷｏ（ヒト絨毛がん細胞株）
（７）ＷＩ−３８（ヒト胎児肺組織由来正常細胞株）
以上の細胞は、１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ−１６４０培養液又はチミジンを除去した無血清培地で５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養を継代したものである。
【００１９】
試験例１：ＮＳ細胞株とＭｏｌｔ４／Ｋ５６２／Ｕ９３７／ＧＣＩＹ／ＢｅＷｏ／ＷＩ−３８標的細胞の直接共培養試験（直接反応）
直接共培養試験：
ＮＳ、Ｍｏｌｔ４（ヒトＴ細胞性白血病細胞株）、Ｋ５６２（ヒト赤芽球性白血病細胞株）、Ｕ９３７（ヒト組織球性白血病細胞株）、ＧＣＩＹ（ヒト胃がん細胞株）、ＢｅＷｏ（ヒト絨毛がん細胞株）及びＷＩ−３８（ヒト胎児肺組織由来正常細胞株）を使用し、２４ウエルのプレートに培養液２ｍｌずつＮＳ（１０4 、１０5 、１０6 ）とＭｏｌｔ４／Ｕ９３７／ＧＣＩＹ／ＢｅＷｏ／ＷＩ−３８細胞（１０6 ）とを２４時間から４８時間直接共培養した。
ＮＳ細胞株と標的細胞間の直接相互作用（共培養）の結果、２４時間後に細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。
その結果、図１４Ａに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ １０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４ではＮＳ １０6 ／ウエルのみ、レーン５ではＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。Ｍレーンは ＤＮＡのサイズを示すマーカーである。
図１４Ｂに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数がそれぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＫ５６２ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４はＫ５６２ １０6 ／ウエルのみ、レーン５ではＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｃに示すように、レーン１、２、３はＫ５６２細胞及びＭｏｌｔ４細胞それぞれ１０6 、１０5 、１０4 ／ウエル間の共培養で、レーン４はＭｏｌｔ４１０6 ／ウエルのみ、レーン５はＫ５６２ １０6 ／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
図１４Ｄに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数がそれぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウェルとＢｅＷｏ １０6 ／ウェル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン４ではＮＳ １０6 ／ウェルのみ、レーン５はＢｅＷｏ １０6 ／ウェルのみ、レーン６はＢｅＷｏ １０6 ／ウェルとＧＣＩＹ １０6 ／ウェル間の共培養、レーン７はＧＣＩＹ １０6 ／ウェルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化はみとめられなかった。
図１４Ｅに示すように、レーン１、２、３、４はＮＳ細胞数それぞれ１０3 、１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＵ９３７ １０6 ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン７はＭｏｌｔ４ １０6 ウエルとＵ９３７ １０6 ／ウエル間の共培養で、レーン８はＭｏｌｔ４ １０6 ／ウエルのみ、レーン６はＵ９３７ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
図１４Ｆに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＧＣＩＹ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。
一方、レーン４はＧＣＩＹ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｇに示すように、レーン１、２、３はＮＳ細胞数それぞれ１０4 、１０5 、１０6 ／ウエルとＷＩ−３８ １０6 ／ウエル間の共培養で標的細胞は接種したＮＳ細胞数の増加にもかかわらずＤＮＡ断片化が認められなかった。レーン４はＷＩ−３８ １０6 ／ウエルのみ、レーン５はＮＳ １０6 ／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化は惹起されなかった。
即ち、ＮＳ細胞とＭｏｌｔ４，Ｋ５６２，Ｂｅｗｏ、Ｕ９３７，ＧＣＩＹ細胞間の相互作用（共培養）の結果、２４時間後に標的細胞のＤＮＡ断片化が認められた。また、標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。
一方、ＤＮＡ断片化はＫ５６２とＭｏｌｔ４細胞間共培養、あるいはＭｏｌｔ４とＵ９３７細胞間、またＢｅｗｏとＧＣＩＹ細胞間共培養ではいずれも惹起されなかった。また、ＮＳ細胞とＷＩ−３８正常細胞間の共培養でもＤＮＡ断片化は認められなかった。これは、ＮＳ細胞株はヒト正常細胞を傷害しないことを示している。つまり、ＮＳ細胞株はヒトがん細胞の特異的なアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらしたといえる。
【００２０】
試験例２：ＮＳ細胞と標的Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチャンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）
間接共培養試験：
ウエル中に底部がフィルター状（０．４５μｍ径）になった細胞間反応用のカルチャーチャンバーをはめ込み内部にＭｏｌｔ４／Ｋ５６２（１０4 ）細胞を分注する。
３日間５％ＣＯ2 、３７℃の条件下で培養を行った後、標的細胞を採取し、 3Ｈチミジンの取り込み放射能法、トリパンブルー取り込み染色法、ＤＮＡ断片化法を行い、細胞間相互作用の結果を測定した。
この系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチャンバー内の標的がん細胞数の減少が認められた（図１５）。
この実験結果は、チャンバーのミリポアー膜を通して低分子の可溶性の標的がん細胞死をもたらす物質がＮＳ細胞株より産生されていることを示すものである。
【００２１】
試験例３：薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗抽出したＡＩＦによる標的細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制及びＤＮＡ断片化確認試験
ＮＳ細胞株培養上清５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラム（ボンドエリユート）にかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルとメタノールで分離、溶出し、窒素ガスによって溶媒を揮撥させ濃縮乾燥した。カラムに停留した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の増殖を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導した。
更にこの分画をＴＬＣで展開した。すなわち、Ｃ１８カラムで分離した物質をクロロホルム：メタノール（１：１）液中に溶かしてから薄層にスポットして、クロロホルム：メタノール：蒸留水（６０：４０：８）によって展開させる。展開後、培地中に含まれるフェノールレッド試薬のバンド（Ｒｆ＝０．５）より下の分画部（Ｒｆ＜０．５，ＴＬＣ−Ａ）、上の分画部（Ｒｆ＞０．５，ＴＬＣ−Ｂ）とに分け、ゲルを掻き取ってクロロホルム／メタノールによって、それぞれを抽出回収し、窒素ガスで乾燥させた。フェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（Ｕ）にＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の増殖を抑制し（図１６Ａ〜Ｂ）、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を認めた（図１７Ａ〜Ｂ）。
対照として、用いた新鮮培地、あるいは標的細胞のＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清中には標的細胞の増殖を抑制したり、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の産生は認められなかった。そして、ＮＳ細胞株培養上清中にヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導できる物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッドよりすみやかに移動する分画中（フェノールレッドＲｆ＝０．５）にＡＩＦが存在していることを確認した。
【００２２】
試験例４：ＨＰＬＣで最終分離精製したＡＩＦの標的細胞Ｍｏｌｔ４の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制試験
ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（ＴＯＳＯＨ）を用いて活性を有するＴＬＣのＢ分画物をアセトニリトル、０．１％トリフルオロ酢酸０から５％までの濃度で３６０分間で流速０．５ｍｌ／分でＯＤ２１４ｎｍでの吸光度で測定しながら分離、精製する。
得られた主要な６つのピーク（１−６）（図１８Ａ、ＨＰＬＣチャート）からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、各ピークの１／１０に濃度を薄めた混合試料（０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示した（図１９）。
図１９のカラムＭに示したように、これは各ピーク（ＡＩＦ）の相乗効果を示すものである。
【００２３】
試験例５：Ｍｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導できるＡＩＦの限界量
図２０Ａ、図２０Ｂに示すように、ＨＰＬＣより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料（Ａ：７μｇ／ｍｌ、Ｂ：７×３-2μｇ／ｍｌ）を４８時間 Ｍｏｌｔ４細胞５×１０5 に作用させ、標的細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。７μｇ／ｍｌおよび７×３-2μｇ／ｍｌの濃度でＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化が認められたが、図２０Ｃに示すように、７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した。
【００２４】
試験例６：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞ＢｅＷｏのＤＮＡ断片化試験
図２１Ａに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＢｅＷｏ細胞に４８時間反応させＢｅＷｏ細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＢｅＷｏ細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２１Ａ）。
【００２５】
試験例７：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞Ｕ９３７のＤＮＡ断片化試験
図２１Ｂに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＵ９３７細胞に４８時間反応後Ｕ９３７細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＵ９３７細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２１Ｂ）。
【００２６】
試験例８：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦの標的細胞ＧＣＩＹのＤＮＡ断片化試験
図２１Ｃに示すように、各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）をＧＣＩＹ細胞に４８時間反応後ＧＣＩＹ細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのピークもＧＣＩＹ細胞のＤＮＡ断片化を誘導した。
【００２７】
試験例９：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦのヒト正常細胞ＷＩ−３８のＤＮＡ断片化試験
またヒト正常細胞ＷＩ−３８を標的とするとき各ピーク（１−６）由来の試料の３倍量（６３μｇ／ｍｌ）を作用させても細胞増殖の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった（図２１Ｄ）。これは図１４Ｇに示したように、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞との直接作用でも正常細胞の傷害をもたらさなかった結果と対応する。
【００２８】
このシリーズの実験結果は重大な意味を有している。つまり本発明者らの分離、精製してきたＡＩＦはがん細胞特異的にアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらし、正常細胞はほとんど傷害しないこと、つまりがん患者に投与した場合に副作用を示さない、理想的な抗癌剤として開発できることを示唆している。
また、従来の免疫抑制剤がリンパ球の分裂阻害的薬理作用でもってその効果を示すことにより、本発明化合物を免疫抑制剤として開発することも可能である。ＨＰＬＣでの最終分離対照としてＭｏｌｔ４細胞の培養上清や新鮮培地をＮＳ細胞株培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＮＳ細胞株培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャート上では存在しなかった（図１８Ｂ、Ｃ）。
一方、ＮＳ細胞株そのものを破壊し、抽出した試料のＨＰＬＣチャートではＮＳ細胞株培養上清と同じパターンを示した。このことは、ＮＳ細胞自体も培養上清中と同じ活性ピーク（１−６）を含有することを示す。
【００２９】
以上の試験管内実験結果をまとめると、下記のように示すことができる。
（１）「ＮＳ細胞株は標的がん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導する」
ＮＳ細胞とＫ５６２，Ｍｏｌｔ４，ＢｅＷｏ，Ｕ９３７，ＧＣＩＹ細胞間の直接の相互作用（共培養）の結果、２４時間後に標的細胞のＤＮＡ断片化が認められた（図１４Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅ．Ｆ）。
標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、ＤＮＡ断片化はＫ５６２，Ｍｏｌｔ４細胞間共培養（図１４Ｃ）、あるいはＭｌｏｔ４とＵ９３７あるいはＧＣＩＹとＢｅＷｏ細胞間共培養ではいずれも惹起されなかった。また、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞間の共培養ではＤＮＡ断片化が認められなかった（図１４Ｇ）。これは、ＮＳ細胞はヒト正常細胞を傷害しないことを示している。つまり、ＮＳ細胞のみがヒトがん細胞の特異的なアポトーシスを誘導する能力を有している所見が認められた。
【００３０】
（２）「ＮＳ細胞株はＡＩＦを培養上清中へ放出する」
ＮＳ細胞と標的Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチエンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）の系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチエンバー内の標的がん細胞数の減少も認められた（図１５）。更に、チエンバー内の標的がん細胞のＤＮＡ断片化が認められた。この実験結果はチエンバーのミリポアー膜を通して低分子の可溶性の標的がん細胞死をもたらす物質がＮＳ細胞株より産生されていることを示すものである。
【００３１】
（３）「薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗精製したＡＩＦは標的細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導する」
ＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導した。
さらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（ＲＦ値＞０．５、ＴＬＣ−Ｂ）にＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し（図１６Ａ，Ｂ）、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を認めた（図１７Ａ，Ｂ）。
対照として、用いた新鮮無血清培地（ＳＦＭ）、あるいは標的細胞のＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清中には標的細胞の増殖を抑制したり、ＤＮＡ断片化を誘導する物質の産生は認められなかった。
そして、ＮＳ細胞培養上清中にヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導できる物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッド（Ｒｆ＝０．５）よりすみやかに移動する分画中（Ｒｆ＞０．５）にＡＩＦが存在していることを確認した。
【００３２】
（４）「ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦは標的細胞のＤＮＡの断片化を誘導する」 ＮＳ細胞培養上清の５００ｍｌからＴＬＣで粗精製したトータルの活性分画（ＴＬＣ−Ｂ）をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＭｃｏｌｕｍｎ（東ソー）によって、逆相ＨＰＬＣで分離、抽出した。
主要な６つのピーク（１−６）が得られた（図１８Ａ．ＨＰＬＣチャート）。３Ｈ−チミジンの取り込み能で測定したところ、各ピーク１−６からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した（図１９）。つまり、Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、各ピークからの試料を１／１０に希釈した混合試料（各０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示た。図１９のカラムＭに示したように、これは各ピーク（ＡＩＦ）の相乗効果を示すものである。
【００３３】
（５）「標的細胞のＤＮＡ断片化能を誘導出来るＡＩＦの限界量」
各活性ピーク（１−６）のＭｏｌｔ４細胞分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２０Ａ）。
ＨＰＬＣより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料７×３-2μｇ／ｍｌを４８時間Ｍｏｌｔ４細胞に作用させると、標的細胞のＤＮＡ断片化が認められたが（図２０Ｂ）、７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した（図２０Ｃ）。
【００３４】
（６）標的細胞として、ＢｅＷｏ，Ｕ９３７，ＧＣＩＹを使用すると、いずれのピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）及び１／１０に希釈した混合試料（各２．１μｇ／ｍｌ）も標的細胞の断片化を誘導した（図２１Ａ，Ｂ，Ｃ）。 またヒト正常細胞ＷＩ−３８を標的とするとき各ピーク（１−６）由来の試料を標的がん細胞に作用させた３倍量（６３μｇ／ｍｌ）を反応させても細胞分裂の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった（図２１Ｄ）。これは図１４Ｇに示したように、ＮＳ細胞とＷＩ−３８細胞との直接作用でも正常細胞の傷害をもたらさなかった結果と対応する。この実験結果は重大な意味を有している。つまり本発明者らの分離、精製してきたＡＩＦはがん細胞特異的にアポトーシス（ＤＮＡ断片化）による細胞死をもたらし、正常細胞はほとんど傷害しないこと、つまりがん患者に投与した場合に副作用を示さない、理想的な抗癌剤として開発できることを示唆している。また、Ｍｏｌｔ４細胞の培養上清や新鮮培地をＮＳ細胞培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＴＴＫ−１培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャート上では見い出せなかった（図１８Ｂ．Ｃ）。
一方、ＮＳ細胞そのものを破壊し、抽出した試料のＨＰＬＣチャートではＮＳ細胞培養上清と同じパターンを示した。
以上の結果をまとめると、ＡＩＦはＮＳ細胞株からのみ産生され、培養培地中に放出される物質であると結論できる。
【００３５】
（７）ＡＩＦの物理化学的特性の検討と構造決定
ＨＰＬＣで最終的に分離、精製したＡＩＦ中のアミノ酸や六炭糖の有無はオルシノル硫酸反応やニンヒドリン反応で定性的に検討した。さらにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、核酸系物質であることが判明した。分子量は質量分析計（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）で推定した。プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）法により最終構造を決定した。
ＨＰＬＣにより分離したＡＩＦの各活性ピーク（１−６）は耐熱性で、ニンヒドリン、オルシノル反応陰性であり、非蛋白性、非六炭糖性のものであることが示唆された。
さらにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、核酸系物質であることが判明した（図７〜１２左上パネル）
構造解析の方向が確定したので、ＮＳ細胞の大量培養（約３００Ｌ）を行い、最終的にＨＰＬＣで分離精製した各ピーク（１−６）より分取して試料を調整した。質量分析（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）と核磁気共鳴（ＮＭＲ）法により最終構造を決定した。ＡＩＦの活性ピーク１〜６は、Ｐ１；２′−デオキシウリジン、Ｐ２；リボチミジン、Ｐ３；２′−Ｏ−メチルウリジン、Ｐ４；チミジン、Ｐ５；２′−Ｏ−メチルグアノシン、Ｐ６；２′−Ｏ−メチルグアノシンであった（図右上パネル）。
なおそれぞれのＡＩＦの活性ピーク（１−６）の分子量（＋Ｈ）は質量分析図（図７〜１２下パネル）の矢印の下に示してある。
【００３６】
［II］動物実験
試験管内実験でＡＩＦの効果が確認された血液がん細胞の代表としてＭｏｌｔ４および上皮性がん細胞の代表としてＧＣＩＹを使用した。
（１）ＳＣＩＤマウス各２０匹に約１０８個のヒト胃癌細胞（ＧＣＩＹ）を接種し、腫瘍の径が０．５ｃｍ（０．２５ｃｍ2 ）に到達した際（約２週後）に各４組群に分け、ＡＩＦによる担癌マウスでの治療実験をとり行った。一群は各担癌マウス５匹より構成される。
試験例１．
担癌マウス各５匹に前記ＴＬＣで分画し、６種類のヌクレオシド（ＡＩＦ）を含む試料（ＴＬＣ−Ｂ分画）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解して毎回総量１ｍｇ（２′−デオキシウリジン９０μｇ、リボチミジン１１０μｇ、２′−Ｏ−メチルウリジン１３５μｇ、チミジン３２２μｇ、２′−Ｏ−メチルイノシン２２６μｇ、２′−Ｏ−メチルグアノシン１１６μｇに相当）を０．５ｍｌのＰＢＳに溶解して経静脈（尾部静脈）より合計１８回（総量１８ｍｇ）投与した。
対照としてはＴＬＣで分画した際に得られたＴＬＣ上でフェノールレッドより下の分画−つまり６種類のヌクレオシドを含まない試料（ＴＬＣ−Ａ分画）を使用し、やはり経静脈（尾部静脈）より合計１８回投与した。腫瘍のサイズは長径×短径の積（面積）で計測した。図２２には１週、２週、３週目の各５匹の腫瘍の平均サイズを示している。グラフに示すように明らかにＡＩＦ投与群と対照群の両者の差異が認められ、ＡＩＦ投与群は対照群に比べて有意に強い腫瘍抑制効果を示した（ｔ検定でＰ＜０．０１）。
試験例２．
担癌マウス各５匹に試験例１と同様にＴＬＣ−Ａ、Ｂ分画をそれぞれ１ｍｇを０．３ｍｌのＰＢＳに溶解して腫瘍内に直接３回（０．１ｍｌ／回）に分けて、３日間投与したところ、ＴＬＣ−Ｂ分画の６種類のヌクレオシド（ＡＩＦ）を含む試料（構成量は実験１と同じ）では腫瘍の完全退縮をもたらした。対照としてのＡＩＦを含まないＴＬＣ−Ａ分画では腫瘍の退縮はまったく誘導できなかった（代表的例として対照担がんマウスと治療マウス各一匹及び腫瘍を切除したＡＩＦ投与群３例と対照群３例を図２３Ａ、Ｂに示す）。このＡＩＦによる腫瘍の退縮の機序は図２３Ｃに示すようにＡＩＦはＤＮＡの断片化、つまりアポトーシスによる腫瘍死を誘導した。
【００３７】
（２）ＳＣＩＤマウス各１０匹に約１０８個のヒトＴ細胞白血病細胞（Ｍｏｌｔ４）を接種し、腫瘍の径が０．３ｃｍ（０．０９ｃｍ2 ）に達した際（約２週後）各二群に分け、ＡＩＦによる担癌マウスでの治療実験をとり行った。
担癌マウス５匹に３種類のＡＩＦヌクレオシド（２′−デオキシウリジン、リボチミジン、チミジン、各４００μｇ、三者合計１．２ｍｇ）を０．５ｍｌのＰＢＳに溶解して、経静脈と直接腫瘍内投与を交互にくりかえし合計１８回（総量２１．６ｍｇ）投与した。腫瘍のサイズは長径×短径の積（面積）で計測し、３週間追跡した。５匹のうち３匹の腫瘍は完全に退縮し、残り２匹の腫瘍も極めて小さなサイズに抑制した。図２４のグラフは１週、２週、３週目の各５匹の腫瘍の平均サイズを示している。一方、対照群のグラフに示しているようにＰＢＳ投与対照群では腫瘍の増大がもたらされ、両者の間には完全な有意差が認められた（ｔ検定でｐ＜０．００１）。
【００３８】
〔III〕考察
胎仔に対する母系の免疫反応は、一次的には脱落膜組織で制御されている。
ＮＫ細胞マーカーを有するＬＧＬ細胞と考えられる大群の細胞集団が初期妊娠のヒトを含む哺乳類の脱落膜層に集積していることが本発明者らの研究で明らかにされている。そして、おそらくこれらのＮＫ細胞集団は胚盤胞の着床の局面で重要な役割を担っている。つまり、妊娠時のたえず増殖し発生途上にある胎児胎盤の形成をＮＫ細胞は制御している。いいかえれば天然のがん免疫反応が妊娠の場で遂行されている。
本発明者らの有するＮＳ細胞株はヒト妊娠３カ月の脱落膜層より本発明者らがクローニングし樹立したＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性のヒトナチュラルサプレッサー細胞である。この細胞株は脱落膜間質細胞の特長であるエストロゲンやプロゲステロンレセプターをもたず、プロラクチンも分泌しないことから、むしろ、骨髄やリンパ系組織から遊走してきた細胞系譜と考えられる。
ＮＳ細胞の具体的機能としては抗体産生、ＭＬＲやマイトゲン刺激によるリンパ球分裂反応の抑制だけでなく、最近では腫瘍細胞の増殖抑制作用も報告されてきた（Sugiura,K.,M.Inaba.,H.Ogata.,R.Yasumuzu.,E.E.Sardina.,K.Inaba.,
S.Kuma.,R.A.Good.,and S.Ikehara.1990.Inhibition of tumor cell proliferation by natural suppressor cells present in murine bone marrow.Cancer.Res.50:2582 ）。このＮＳ細胞の基本的には細胞分裂制御を介在するエフェクター物質としては、ＴＧＦ−βファミリーの蛋白（Clark,D.A.,K.C.Flanders.,D.Banwatt.,W.Millar-Book.,J.Manuel.,J.Stedronska-Clark.,and B.Rowley.1990.Murine pregnancy decidua produces a unique immunosuppressive molecule related to transforming growth factor beta-2.J.Immunol.144:3008）や、分子量１万以下のリピッド様物質（Mortari,F.,and S.K.Singhal.1988.Production of human bone marrow - derived suppressor factor.Effect on antibody synthesis and lectin-activated cell proliferation.J.Immunol.141:3037 ）が指摘されてきたがその実体については不明であった。またＮＳ細胞による免疫抑制作用機序として、本発明者らの以前の研究（〔Tatsumi,K,T.Mori.,E.Mori.,H.Kanzaki.,and T.Mori.1987.Immunoregulatory factor released form a cell line derived from human decidual tissue.Am.J.Reprod.Immunol.Microbiol.13:87 ）でも 指摘してきたように、ＮＳ細胞株の上清中の蛋白性物質がＩＬ−２を介するＴ細胞分裂反応を抑制する。
本発明において、驚くべきことに、このＮＳ細胞株はヒト血液がん細胞であるＫ５６２／Ｍｏｌｔ４／Ｕ９３７だけでなく、悪性度の極めて高いヒト胃がん細胞ＧＣＩＹやヒト絨毛がん細胞ＢｅＷｏもアポトーシス（ＤＮＡ断片化）作用によってがん細胞死を誘導し、その増殖を抑制することが明らかとなった。
そして、さらにこの細胞株の培養上清中より、がん細胞のアポトーシスを誘導する物質（ＡＩＦ）の分離、精製、構造決定を行った。その過程はまず、ＮＳ細胞株培養上清の凍結乾燥試料をＣ１８−カラムに疎水性結合した物質をアセトニトリルで溶出した。溶出した活性因子をさらにＴＬＣで粗精製した。活性画分はフェノールレッドより大きなＲｆ値を示し、Ｋ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制し、ＤＮＡ断片化を招来した。そして最終的にはＣ１８逆相カラムでＨＰＬＣにより活性分子を６つの主要ピークとして分離、精製した。これら６つのピークより得られた試料はいずれも標的がん細胞の増殖を抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導したことにより、当初の目的物つまりＡＩＦであることが確認出来た。またこの６種類のＡＩＦは混合してカクテルとして使用した場合（現在がん化学療法で行われている多剤併用この場合天然の多剤併用）に、最も有効に作用することを見い出している。さらに、この６種のＡＩＦの物理化学的性質はオルシノール反応やニンヒドリン反応陰性であることから、非蛋白性であり、六炭糖を含まない物質であった。そして５００ダルトンカットの透析膜を通過し、質量分析計からの測定より、その分子量は１００〜５００にあたると推定された。
さらに図７〜１２左上に示すようにＨＰＬＣで分画した各活性ピークはＵＶスペクトラムで最大吸収値２４５ｎｍから２６５ｎｍを示した。すなわち、ＡＩＦは核酸またはその誘導体関連の物質であることが強く示唆された。
大量のＮＳ細胞培養上清から最終的にＡＩＦを分離、精製して構造解析に耐え得る試料を調整し、ＦＡＢ−ＭＳで分子量をプロトンＮＭＲで最終的にそれらの構造を決定した（図１〜１２）。６種類のＡＩＦは塩基またはリボースの一部がデオキシ化されたりメチル化されたユニークな構造を有するヌクレオシド系に属するものであった。
本発明のようにヒトＮＳ細胞が一連の核酸系物質を分泌し、ヒトのあらゆるがん細胞のアポトーシスを誘導することが見出されたのは本発明者らが知る限り世界でも最初である。
現在、臨床的に使用されている核酸系抗癌剤、抗ウイルス剤（たとえば５− ＦＵ、フトラフール（ＦＴ）、フルツロン、ＡＺＴ、ＤＤＩ、Ａｒａ−ｃ）が細胞毒性が高くその効果もさることながら、人体に投与した場合に副作用が強く社会問題化している。
本発明者らが見出したＡＩＦは試験管内おひ動物実験の所見ではあるが（これらの実験系は、ヒト用の抗癌剤、抗ウイルス剤の評価を目的としてこの分野で確立された従来の試験管内および動物実験系である（たとえば図２２，２３，２４参照））、ヒト正常細胞はまったく傷害せず、つまり将来人体に投与した場合副作用の軽減化をはかりながら、がん細胞特異的なアポトーシス（ＤＮＡ断片化）の誘導という自然の薬理作用機序でもってがん細胞死をもたらす天然型の理想的な制癌剤を開発できる基盤を開拓したのである。
【００３９】
〔IV〕図の補足説明
図１４：ＮＳ細胞株は標的がん細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導するが正常細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導しないことを示す。
ＮＳ細胞と標的細胞間の直接の相互作用（共培養）の結果、２４時間後細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
図１４Ａに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＭｏｌｔ４ １０６／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン５はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン４はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｂに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＫ５６２ １０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン４はＫ５６２の１０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｃに示すように、レーン１，２，３はＫ５６２細胞及びＭｏｌｔ４細胞それぞれ１０６，１０５，１０４／ウエル間共培養で、レーン４はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン５はＫ５６２ １０６／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｄに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＢｅＷｏ １０６／ウエル間の共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存し上昇した。一方、レーン４ではＮＳ１０６／ウエルのみ、レーン５はＢｅＷｏ １０６／ウエルのみ、レーン６はＢｅＷｏ １０６／ウエルとＧＣＩＹ１０６／ウエル間の共培養、レーン７はＧＣＩＹ１０６／ウエルのみの場合はいずれもＤＮＡ断片化は認められなかった。
図１４Ｅに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０３，１０４，１０５，１０６／ウエルとＵ９３７ １０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン７はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルとＵ９３７ １０６／ウエル間共培養で、レーン８はＭｏｌｔ４ １０６／ウエルのみ、レーン６はＵ９３７ １０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｆに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＧＣＩＹ１０６／ウエル間共培養で標的細胞におけるＤＮＡ断片化の程度は接種したＮＳ細胞数の増加に依存していた。一方、レーン４はＧＣＩＹ１０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみのは場合はＤＮＡ断片化をおこさなった。Ｍはマーカーである。
図１４Ｇに示すように、レーン１，２，３はＮＳ細胞数それぞれ１０４，１０５，１０６／ウエルとＷＩ−３８ １０６／ウエル間共培養で標的細胞は接種したＮＳ細胞数が増加してもＤＮＡ断片化が認められなかった。レーン４は ＷＩ−３８ １０６／ウエルのみ、レーン５はＮＳ１０６／ウエルのみの場合はＤＮＡ断片化をおこさなかった。Ｍはマーカーである。
図１５：ＮＳ細胞株はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞と間接共培養において標的細胞の増殖を抑制することを示す。
図１５に示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞とＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞をチエンバー内へ入れた間接相互作用（間接共培養）の系では接種したＮＳ細胞数の増加に伴って７２時間後にはチエンバー内の標的がん細胞数の減少が認められた。図１６〜１７：薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で粗精製したＡＩＦは標的細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡ断片化を誘導することを示す。
ＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清（ＴＴＫ−１ Ｓｕｐ）約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画はＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。
図１６Ａに示すようにさらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部に存在する分画（Ｕ）は無血清培地（ＳＦＭ）、対照群（Ｃ）およびＴＬＣ上の位置より下部に存在する分画（Ｌ）と比べ、Ｋ５６２細胞の分裂を抑制することが認められた。
一方、図１６Ｂに示すようにさらにこの分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）のＴＬＣ上の位置より上部（Ｕ）に存在する分画にＴＬＣ上の位置より下部（Ｌ）に存在する分画と比べ、有意にＭｏｌｔ４細胞の分裂を抑制することが認められた。
対照群（Ｃ）および用いた新鮮無血清培地（ＳＦＭ）は標的細胞の増殖を抑制することは認められなかった。
図１７Ａ，Ｂに示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養上清約５０ｍｌから凍結乾燥した試料をＣ１８カラムにかけ、カラムに停留したものをアセトニトリルで溶出し濃縮した分画をＴＬＣにかけ、培地中に存在するフェノールレッド（Ｒｆ値０．５）の位置より上部（Ｕ，レーン１，３）に存在する分画と下部（Ｌ，レーン２，４）に存在する分画とに分けて抽出し、Ｋ５６２細胞（Ａ）／Ｍｏｌｔ４細胞（Ｂ）のＤＮＡ断片化を誘導する物質の存在を調べた。
これらの抽出物をＫ５６２／Ｍｏｌｔ４細胞と反応させ、２４時間（レーン１，２）、４８時間（レーン３，４）後に細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。この図に示すようにＮＳ細胞培養上清中にはヒトがん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導する物質（ＡＩＦ）が産生され、ＴＬＣ上でフェノールレッドよりすみやかに移動する分画（Ｒｆ＞０．５）中にＡＩＦが存在していることを確認した。
図１８：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦのＨＰＬＣチャート
図１８Ａに示すようにＮＳ（ＴＴＫ−１）培養上清の５００ｍｌからＴＬＣで粗精製したトータルの活性分画をＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＭｃｏｌｕｍｎ（東ソー）によって、逆相ＨＰＬＣで分離、抽出した。主要な６つのピーク（１−６）が得られた。
図１８Ｂ，Ｃに示すようにＭｏｌｔ４細胞の培養上清（Ｂ）や新鮮培地（Ｃ）をＮＳ（ＴＴＫ−１）細胞培養培地とまったく同様の処理を施し、最終的にＨＰＬＣにかけてみたところ、ＮＳ細胞培養培地より得られたような活性ピーク（１−６）はそのＨＰＬＣチャートでは見い出せなかった。
図１９，２０：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦは標的がん細胞Ｍｏｌｔ４の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制し、ＤＮＡの断片化を誘導すること、および断片化を誘導できるＡＩＦの限界量を示す。
図１９に示すようにＨＰＬＣにより分離した主要な６つのピーク（１−６）からの試料（７μｇ／ｍｌ）はいずれもＭｏｌｔ４細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みを抑制した。つまり、Ｍｏｌｔ４細胞の分裂を抑制した。特にピーク１とピーク４からの試料が強い活性を示し、１／１０に希釈した各ピークの混合試料（各０．７μｇ／ｍｌ）も強い活性を示した。図１９のカラムＭに示すように、これは各ピークの相乗効果を示すものである。
図２０Ａに示すように各ピーク（１−６）より調整した試料をＭｏｌｔ４細胞に４８時間反応後Ｍｏｌｔ４細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。各活性ピーク（１−６）のＭｏｌｔ４細胞分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料（７μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した試料（０．７μｇ／ｍｌ）の混合物はいずれもＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（図２０Ａ、レーン１〜７）。
図２０Ｂ、Ｃに示すようにＨＰＬＣにより分離した各活性ピーク（１−６）由来の試料（Ｂ；７×３-2μｇ／ｍｌ，Ｃ；７×３-5μｇ／ｍｌ）を４８時間Ｍｏｌｔ４細胞に作用させ、細胞ＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。図２０Ｂに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（７×３-2μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した試料（０．７×３-2μｇ／ｍｌ）の混合物によりＭｏｌｔ４細胞のＤＮＡ断片化が認められたが（レーン、１−７）、図２０Ｃに示すように単独で７×３-5μｇ／ｍｌ、また１／１０に希釈した混合物で０．７×３-5μｇ／ｍｌの低濃度ではもはやその作用は消失した（レーン、１−７）。
図２１：ＨＰＬＣで最終分離したＡＩＦはヒトがん細胞ＢｅＷｏ／Ｕ９３７／ ＧＣＩＹのＤＮＡの断片化を誘導するが、ヒト正常細胞ＷＩ−３８のＤＮＡの断片化を誘導しないことを示す。
図２１Ａ、Ｂ、Ｃに示すように各ピーク（１−６）由来の試料（２１μｇ／ｍｌ）と各ピーク（１−６）由来の１／１０に希釈した混合物（２．１μｇ／ｍｌ）をＢｅＷｏ（Ａ）／Ｕ９３７（Ｂ）／ＧＣＩＹ（Ｃ）細胞に４８時間反応後の各標的細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル電気泳動を行った。各活性ピーク（１−６）の標的細胞の分裂抑制効果に対応して、各ピーク（１−６）由来の試料及び各ピーク（１−６）由来の１／１０希釈した試料の混合物はいずれも標的細胞のＤＮＡ断片化を誘導した（レーン１−７）。
図２１Ｄに示すように、各ピーク（１−６）由来の試料を標的がん細胞に対する３倍量（６３μｇ／ｍｌ）をヒト正常細胞ＷＩ−３８に４８時間反応後のＷＩ−３８細胞のＤＮＡを抽出し、２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。いずれのＡＩＦも正常細胞の分裂の抑制やＤＮＡ断片化をきたさなかった。
図７〜１２：ＨＰＬＣにより分離した各活性ピーク１−６（ＡＩＦ）の物理化学特性と構造決定
ＮＳ細胞株の大量の培養（約３００Ｌ）を行い、最終的にＨＰＬＣで分離精製した各ピーク（１−６）より分取した試料を調整した。
図７〜１２各Ｐ１−Ｐ６の左上パネルに示すようにＵＶスペクトラム解析より、最大吸収値が２６０ｎｍ前後に認められることから、ＡＩＦは核酸系物質であることが判明した。
ＵＶスペクトラム解析により構造解析の方向が確定したので、質量分析（ＦＡＢ−ＭＡＳＳ）法により分子量を決定した（下パネル矢印）。さらに核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によりＡＩＦの最終構造を図７−１２（右上）のように決定した。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（培地、培養液を説明する。）
３日間５％ＣＯ2 、３７℃の条件下で培養を行った後、ＮＳ細胞培養上清（５００ｍｌ）を凍結乾燥し、Ｃ１８カラムに通して分離を行った。活性物質はカラムに結合するので、アセトニトリル、メタノールによってカラムより分離、溶出し、窒素ガスによって溶媒を気撥させ、溶質を濃縮乾燥させた。
Ｃ１８カラムで分離した物質をクロロホルム：メタノール（１：１）液中に溶かしてから薄層（ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）にスポットして、クロロホルム：メタノール：蒸留水（６０：４０：８）によって展開させる。展開後、フェノールレッド試薬のバンドより下の分画部（Ｌ）、上の分画部（ｕ）と分け、ゲルを掻き取ってクロロホルム／メタノールによって、それぞれの分画をクロロホルム：メタノール（１：１）液で抽出回収し、窒素ガスで乾燥させた。
ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（ＴＯＳＯＨ）を用いて活性能を有するＴＬＣのｕ分画物をアセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸溶媒で０から５％までの直線濃度勾配で３６０分間、流速０．５ｍｌ／分でＯＤ２１４ｎｍでの吸光度で測定しながら分離、精製し、主要な６つのピーク（１−６）が得られた（図１８Ａ、ＨＰＬＣチャート）。
目的物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６をそれぞれ０．０１４ｍｇ、０．０１７ｍｇ、０．０２１ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０３５ｍｇ、及び０．０１８ｍｇ得た。
【００４１】
以下に本発明の化合物の製剤化例を示すが、本発明の化合物の製剤化は、本製剤化例に限定されるものではない。
製剤化例１
本物質（Ｐ１）１０（部）（以下、重量割合を示す）
重炭酸化マグネシウム１５
乳糖７５
を均一に混合して３５０μｍ以下の粉末状又は細粒状の散剤とする。この散剤をカプセル容器に入れてカプセル剤とした。
【００４２】
製剤化例２
本物質（Ｐ２）４５（部）
澱粉１５
乳糖１６
結晶性セルロース２１
ポリビニルアルコール ３
蒸留水３０
を均一に混合した後、破砕造粒して乾燥し、次いで篩別して１７７〜１４１０μｍの大きさの顆粒剤とした。
【００４３】
製剤化例３
製剤化例２と同様の方法で顆粒剤を作った後、この顆粒剤９６部に対してステアリン酸カルシウム４部を加えて圧縮成形し、直径１０ｍｍの錠剤を作製した。
【００４４】
製剤化例４
製剤化例２の方法で得られた顆粒剤の９０部に対して結晶性セルロース１０部及びステアリン酸カルシウム３部を加えて圧縮成形し、直径８ｍｍの錠剤とした後、これにシロップゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸濁液を加えて糖衣状を作製した。
【００４５】
製剤化例５
本物質（Ｐ３）０．６（部）
非イオン系界面活性剤２．４
生理的食塩水９７
を加温混合してからアンプルに入れ、滅菌を行って注射剤を作製した。
【００４６】
産業上の利用可能性
本発明の式（１）の化合物又はその医薬上許容される塩は、ヒト正常細胞を全く傷害せず、人体に投与した場合には副作用の軽減化を図りながら、癌細胞を特異的にアポトーシスによる癌細胞死をもたらすという自然の作用機序でもってヒトの癌疾患及びウイルス疾患を治療することが期待され、医薬の分野で抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物Ｐ１のＮＭＲチャートである。
【図２】化合物Ｐ２のＮＭＲチャートである。
【図３】化合物Ｐ３のＮＭＲチャートである。
【図４】化合物Ｐ４のＮＭＲチャートである。
【図５】化合物Ｐ５のＮＭＲチャートである。
【図６】化合物Ｐ６のＮＭＲチャートである。
【図７】ＡＩＦ（Ｐ１）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図８】ＡＩＦ（Ｐ２）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図９】ＡＩＦ（Ｐ３）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１０】ＡＩＦ（Ｐ４）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１１】ＡＩＦ（Ｐ５）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１２】ＡＩＦ（Ｐ６）のＵＶスペクトル、マススペクトルおよび構造式を示す。
【図１３】本発明のＮＳ細胞株の位相差顕微鏡写真である。
【図１４】（Ａ〜Ｇ）はＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図１５】ＮＳ細胞と標的細胞との間接共培養の結果を示すグラフである。
【図１６】（Ａ，Ｂ）はＡＩＦによる標的細胞の 3Ｈ−チミジンの取り込み抑制の結果を示すグラフである。
【図１７】（Ａ，Ｂ）はＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図１８】（Ａ〜Ｃ）はＡＩＦのＨＰＬＣチャートである。
【図１９】3Ｈ−チミジンの取り込み抑制の結果を示すグラフである。
【図２０】ＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真（Ａ〜Ｃ）である。
【図２１】（Ａ〜Ｄ）はＡＩＦによる標的細胞のＤＮＡ断片化試験の結果を示す写真である。
【図２２】ＡＩＦのヒト胃癌細胞に対する抑制効果を示すグラフである。
【図２３】ＡＩＦによるヒト胃癌組織退縮の効果（Ａ〜Ｂ）およびＤＮＡ断片化試験の結果（Ｃ）を示す写真である。
【図２４】ＡＩＦのヒトＴ細胞白血病細胞に対する抑制効果を示すグラフである。
Claims (5)
- 下式（１）の化合物を産生する能力を有するヒト胎盤脱落膜由来細胞を培養し、その培養液から式（１）の化合物を採取し、要すれば医薬上許容される塩とすることを特徴とする、抗腫瘍性若しくは抗ウイルス性物質又はその医薬上許容される塩の製造方法。
- ヒト胎盤脱落膜由来細胞が、ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ−ＤＲ強陽性のヒト型ナチュラルサップレツサー細胞である、請求項１記載の方法。
- ヒト型ナチュラルサップレッサー細胞が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３５０の細胞株に相当する細胞である、請求項２記載の方法。
- ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト型ナチュラルサップレッサー細胞であって、請求項１中に記載された式（１）の化合物を産生する能力を有する細胞。
- ＣＤ５７陽性、ＨＬＡ．ＤＲ強陽性のヒト型ナチュラルサップレッサー細胞であって、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３５０の細胞株に相当する、請求項４に記載の細胞。
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