DE60008300T2 - Oligosaccharide, Verfahren zur ihrer Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzung die sie enthalten - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein neues Oligosaccharid und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die es enthält.
  • Keratan-Sulfat ist ein Glycosaminoglycan, das als Grundstruktur N-Acetyllactosamin umfasst, bei dem die 6-Stellung des N-Acetylglucosaminrestes O-sulfatiert ist. Es ist berichtet worden, dass einige der Abbauprodukte von Keratan-Sulfat, z. B. Keratan-Sulfat-Oliogosaccharide, eine pharmakologische Wirkung besitzen (siehe z. B. die internationale Veröffentlichung Nr. WO96/16973).
  • Als eine von Keratan-Sulfat abgeleitete Disaccharidstruktur können die in 1 gezeigten erwartet werden. Jedoch war die Suche nach einem anderen Keratan-Sulfat-Oliogosaccharid mit einer pharmazeutischen Wirkung eineschränkt, weil es schwierig war, ein Keratan-Sulfat-Oliogosaccharid als ein Disaccharid mit einem Galactoserest an seinem reduzierenden Ende (GlcNAcβ1→3 Gal, wobei Gal Galactose darstellt, GlcN Glucosamin darstellt und Ac eine Acetylgruppe darstellt), und das wie Keratan-Sulfat eine Sulfatgruppe hat, zu erhalten. Zum Beispiel ist es schwierig, selbst durch Behandlung von Keratan-Sulfat mit bekanten Endo-β-Galactosidasen ein Disaccharid mit einem Galactoserest an seinem reduzierenden Ende (GlcNAcβ1→3 Gal) und einer verbliebenen Sulfatgruppe zu erhalten.
  • EP 0795560A offenbart Keratan-Sulfat-Oligonukleotide, die zwischen zwei und fünf Zuckereinheiten umfassen und sulfatiertes N-Acetylglucosamin am reduzierenden Ende besitzen und bei denen mindestens zwei Hydroxylgruppen sulfatiert sind.
  • EP 0926154 A offenbart ein Verfahren zur Herstellung von N-Acetyllactosamin-Oligosacchariden unter der Verwendung von Keratan-Sulfat.
  • Spijker et al. (Recl. Trav. Chim., Niederlande (1989), 108, S. 360–368) beschreiben die Synthese von fructosylierten Trisacchariden.
  • Kobayashi et al. (Tet. Lett. (1989), 30 (34), S. 4547–4530) offenbaren Verfahren zur Synthese von trisulfatierter Glycltetracose.
  • Jain et al. (Carbohydrate Res. (1995), 268, S. 279–285) offenbaren die Herstellung isomerisch sulfatierter Disaccharide.
  • Tai et al. (J. Biol. Chem. (1997), 272, S 28227–28231) offenbaren aus Menschenknorpeln isoliertes Keratan-Sulfat.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, einfach ein Keratan-Sulfat-Disaccharid mit einem Galactoserest an seinem reduzierenden Ende herzustellen.
  • Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ist es, ein neues Oligosaccharid mit pharmakologischer Wirkung zur Verfügung zu stellen und es als ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass ein Oligosaccharid mit einem Galactoserest an seinem reduzierenden Ende durch Ausbildung einer glycosidischen Bindung, wobei Hydroxylgruppen und eine Aninogruppe in Glucosamin und Hydroxylgruppen in Galactose auf eine bestimmte Weise geschützt werden, erhalten werden kann. Weiterhin fanden sie auch, dass Disaccharide, bei denen die Hydroxylgruppen in bestimmten Positionen sulfatiert waren, hervorragende pharmakologische Wirkungen haben. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieser Erkenntnisse erzielt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids zur Verfügung, das durch die folgende allgemeine Formel (3) dargestellt wird:
    Figure 00020001
    in der R10 und R11 jeder unabhängig -SO3M darstellen, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, Ac eine Acetylgruppe darstellt, R12 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest, und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    das Durchführen einer glycosidischen Verknüpfung zwischen einem von der folgenden allgemeinen Formel (1) dargestellten Monosaccharid
    Figure 00030001
    in dem R1 und R2 jeder unabhängig eine Aralkylgruppe darstellen, R3 eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe darstellt, R4 eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe darstellt und R5 eine Abgangsgruppe darstellt, und
    einem von der folgenden allgemeinen Formel (2) dargestellten Monosaccharid
    Figure 00030002
    in dem R6 und R8 jeder unabhängig eine Aralkylgruppe darstellen, R7 eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe darstellt, R9 Aralkylgruppe, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt, wobei an mindestens einem unter R3 und R7 ein Wasserstoffatom ersetzt wird und anschließend -SO3M gegen das Wasserstoffatom ausgetauscht wird (dieses Verfahren wird im Folgenden auch als „das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren" bezeichnet).
  • Beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ist es bevorzugt, dass mindestens einer unter R10 und R11 -SO3M darstellt, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, und das Verfahren umfasst, nach dem Schritt des Knüpfens der glycosidischen Bindung zwischen dem durch die oben erwähnte allgemeine Formel (1) dargestellten Monosaccharid und dem durch die oben erwähnte allgemeine Formel (2) dargestellten Monosaccharid ((Anmerkung des Übersetzers: hier fehlt etwas im Druckexemplar)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens werden die oben erwähnten allgemeinen Formeln (1)–(2) jeweils durch die folgenden Formeln (4)–(5) dargestellt:
    Figure 00040001
    in der Bn eine Benzylgruppe darstellt, R13 eine Acetylgruppe oder eine Lävulinoylgruppe darstellt und Pht eine Phthaloylgruppe darstellt und X ein Halogenatom darstellt;
    Figure 00040002
    in der Bn eine Benzylgruppe darstellt, R14 eine Benzylgruppe, einen 6-O-sulfatierten N-Acetylglucosaminrest, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Choiesterinrest, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, Z ein Halogenatom oder -NHCO- darstellt, und Piv eine Pivaloylgruppe darstellt; und
    ((Anmerkung des Übersetzers: Die allgemeine Formeln 6 wurde im Text des vorliegenden Druckexemplars zuvor nicht erwähnt))
    Figure 00040003
    in der Ac eine Acetylgruppe darstellt, und M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, R15 ein Wasserstoffatom, einen 6-O-sulfatierten N-Acetylglucosaminrest, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alylgyycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, Z ein Halogenatom oder -NHCO- darstellt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens werden die vorgenannten Formeln (1)–(3) jeweils von den folgenden Formeln (7)–(9) dargestellt:
    Figure 00050001
    in der Bn eine Benzylgruppe darstellt, Lev eine Lävulinoylgruppe darstellt und Phth eine Phthaloylgruppe darstellt, und X ein Halogenatom darstellt;
    Figure 00050002
    in der Bn, R14 und Z wie oben definiert sind, Ph eine Phenylgruppe darstellt und Me eine Methylgruppe darstellt; und
    Figure 00050003
    in der R15 und Z wie oben definiert sind, Ac eine Acetylgruppe darstellt und M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens werden die vorgenannten Formeln (1)–(3) jeweils von den folgenden Formeln (10)–(12) dargestellt:
    Figure 00060001
    in der Bn eine Benzylgruppe darstellt, Lev eine Lävulinoylgruppe darstellt und Phth eine Phthaloylgruppe darstellt, und X ein Halogenatom darstellt;
    Figure 00060002
    in der Bn, R14 und Z wie oben definiert sind, Ph eine Phenylgruppe darstellt und Me eine Methylgruppe darstellt; und
    Figure 00060003
    in der R15 und Z wie oben definiert sind, Ac eine Acetylgruppe darstellt und M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Oligosaccharid zur Verfügung, das durch die folgende allgemeine Formel (13) dargestellt wird:
    Figure 00060004
    in der R16 und R17 unabhängig voneinander -SO3M darstellen, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, Ac eine Acetylgruppe darstellt, R18 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanyfgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Oligosaccharids ist, R16 ein Wasserstoffatom und R17 ist -SO3M, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt.
  • Im erfindungsgemäßen Oligosaccharid ist R18 vorzugsweise ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, ein O-Alkylglycerolrest oder eine Cholestanylgruppe, und Z ist ein Sauerstoffatom.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Arzneimittel zur Verfügung, das als einen aktiven Bestandteil das erfindungsgemäße Oligosaccharid umfasst, das durch die folgende allgemeine Formel (13) dargestellt wird:
    Figure 00070001
    in der R16 und R17 unabhängig voneinander -SO3M: darstellen, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, Ac eine Acetylgruppe darstellt, R18 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt,
    oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz.
  • (Das Arzneimittel wird im folgenden als das „erfindungsgemäße Arzneimittel" bezeichnet).
  • Insbesondere das erfindungsgemäße Oligosaccharid, bei dem R16 -SO3M und R17 -SO3M sind, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon, ist nützlich als antiallergisches Agens, und das erfindungsgemäße Oligosaccharid, bei dem sowohl R16 -SO3M als auch R17 -SO3M sind, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon, ist nützlich als entzündungshemmendes Agens.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die das erfindungsgemäße Oligosaccharid, das für das Arzneimittel verwendbar ist, und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst. Insbesondere werden eine antiallergische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Oligosaccharid, das als antiallergisches Agens verwendbar ist, und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst, und eine entzündungshemmende Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Oligosaccharid, das als entzündungshemmendes Agens verwendbar ist, und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger umfasst, zur Verfügung gestellt. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Allergien zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirkenden Menge des erfindungsgemäßen als antiallergisches Agens wirkenden Oligosaccharidd an jemanden, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst, und ein Verfahren zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Entzündungen zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirkenden Menge des erfindungsgemäßen als entzündungshemmendes Agens wirkenden Oligosaccharids an jemanden, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Strukturen von Keratan-Sulfat-Disacchariden, die von der Struktur von Keratan-Sulfat erwartet werden.
  • 2 umreißt ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung eines Ausgangsstoffs zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 3 umreißt ebenfalls ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung eines Ausgangsstoffs zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 4 umreißt ein Beispiel des Verfahren zur Herstellung zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 5 umreißt ein Beispiel des Verfahren zur Herstellung zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 6 umreißt ein Beispiel des Verfahren zur Herstellung zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 7 umreißt ein Beispiel des Verfahren zur Herstellung zur Herstellung des erfindungsgemäßen Oligosaccharids.
  • 8 zeigt Strukturen von Keratan-Sulfat-Oligosacchariden.
  • 9 zeigt die Wirkung eines Keratan-Sulfat-Oligosaccharids auf die Erhöhung der Durchlässigkeit von Blutgefäßen.
  • 10 zeigt die Wirkung eines Keratan-Sulfat-Ologosaccharids auf die Erhöhung der Durchlässigkeit von Blutgefäßen.
  • 11 zeigt die Wirkung eines Keratan-Sulfat-Ologosaccharids auf die O2 – -Erzeugung durch Neutrophile.
  • 12 zeigt die Wirkung eines Keratan-Sulfat-Oligosaccharids auf die O2 –-Erzeugung durch Neutrophile.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • Gewöhnlich in der vorliegenden Spezifikation und den anhängenden Zeichnungen verwendete Abkürzungen werden als erstes mit ihren Bedeutungen, die in Klammern nach jeder Abkürzung angegeben werden, aufgelistet.
    • Ac (Acetylgruppe)
    • Bn (Benzylgruppe)
    • Pht (Phthaloylgruppe)
    • Piv (Pivaloylgruppe)
    • Lev (Lävulinoylgruppe)
    • Ph (Phenylgruppe)
    • Me (Methylgruppe)
    • All (Allylgruppe)
    • MP (p-Methoxiphenylgruppe)
    • M (Proton oder einwertiges Kation)
    • X (Halogenatom)
  • <1> Erfindungsgemäßes Herstellungsverfahren
  • Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist ein Verfahren zur Herstellung des durch die allgemeine Formel (3) dargestellten Oligosaccharids und umfasst zumindest den Schritt der Bildung einer glycosidischen Bindung zwischen dem durch die allgemeine Formel (1) repräsentiertem Monosaccharid und dem durch die allgemeine Formel (2) repräsentiertem Monosaccharid.
  • Die Substituenten in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (1)–(3) sind folgende:
    R1, R2, R6 und R8 stellen jeder unabhängig eine Aralkylgruppe dar. Beispiele für die Aralkylgruppe schließen Benzyl, p-Methoxibenzyl, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, p-Nitrobenzyl, o-Nitrobenzyl, p-Halobenzyl, p-Cyanobenzoyl, Diphenylmethyl, Triphenylmethyl (Trityl), α- oder β-Naphthylmethyl und α-Naphthyldiphenylmethylgruppen ein. R1, R2, R6 und R8 stellen bevorzugt jeweils eine Benzylgruppe dar.
    R3 und R7 stellen jeder unabhängig eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe dar Beispiele für die Acylgruppe schließen die Acetyl, Pivaloyl, Lävulinoyl, Benzoyl, Chloracetyl, Dichloracetyl, Triflouracetyl, Methoxiacetyl, Propionyl, n-Butyryl, (E)-2-Methylbutenoyl, Isobutyryl, Pentanoyl, o-(Dibrommethyl)benzoyl, o-(Methoxicarbonyl)benzoyl, p-Phenylbenzoyl, 2,4,6-Trimethylbenzoyl, p-Toluoyl, p-Anisoyl, p-Chlorbenzoyl, p-Nitrobenzoyl, und α-Naphthoylgruppen ein. Beispiele für die Silylgruppe schließen die Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Dimethylisopropylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, Methyl(di-t-butyl)silyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl, Triisopropylsilyl und Tetraisopropyldisiloxanylgruppe ein.
  • Bevorzugt stellen R3 und R7 jeder unabhängig eine Acylgruppe dar, oder R3 stellt eine Acylgruppe dar und R7 stellt eine Silylgruppe dar. Bevorzugte Beispiele der Acylgruppe sind eine Acetylgruppe, eine Pivaloylgruppe und eine Lävulinoylgruppe, und ein bevorzugtes Beispiel für die Silylgruppe ist eine t-Butyldiphenylsilylgruppe.
  • R4 stellt eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe dar, und Beispiele für Schutzgruppen schließen Phthaloyl-, Acetyl- und Allylcarbonylgruppen ein. Vorzugsweise ist es eine Phthaloylgruppe.
  • R5 stellt eine Abgangsgruppe dar. Der hier verwendete Ausdruck „Abgangsgruppe" bedeutet, eine Gruppe, die unter Bedingungen, unter denen die Bildung der glycosidischen Bindung zwischen dem durch die allgemeine Formel (1) dargestellten Monosaccharid und dem durch die allgemeine Formel (2) dargestellten Monosaccharid erfolgt, austritt. Beispiele für die Abgangsgruppe schließen Halogenatome (Fluoratom, Chloratom, Bromatom etc.), eine Imidogruppe, eine Methylthiogruppe und eine Phenylthiogruppe ein. Sie ist vorzugsweise ein Halogenatom, und besonders bevorzugt ein Fluoratom.
  • X in den Formel (4), (7) und (10) ist vorzugsweise eine Halogenatom unter den Abgangsgruppen. X ist besonders bevorzugt wie oben erwähnt ein Fluoratom.
  • R9 stellt eine Aralkylgruppe, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest dar. Der hier verwendete Rest stellt eine verbleibende Einheit dar, in der ein Atom oder eine Gruppe von Atomen, die an der Bindung einer Verbindung beteiligt sind, aus der Verbindung entfernt werden.
  • Beispiele und bevorzugte Vertreter der Aralkylgruppe sind wie oben beschrieben.
  • Der 6-O-sulfatierte N-Acetylglucosaminrest ist gewöhnlich ein Rest, in dem eine Hydroxylgruppe in 4-Stellung entfernt ist.
  • Beispiele für die Alkylgruppe sind solche mit einer Kohlenstoffzahl zwischen 1 und 23, vorzugsweise 8 und 14.
  • Der Glycerolrest ist gewöhnlich ein Rest, bei dem eine der Hydroxylgruppen entfernt ist.
  • Der O-Alkylglycerolrest ist nicht speziell beschränkt, aber im Allgemeinen ein Rest, bei dem eine der Hydroxylgruppen entfernt ist. Er ist vorzugsweise ein Di-O-Alkylglcerinrest, noch bevorzugter ein 2,3-Di-O-Alkylglcerinrest. Beispiele für das hier verwendete „Alkyl" sind solche mit einer Kohlenstoffzahl zwischen 1 und 23, vorzugsweise 8 und 14.
  • Der O-Acyglycerolrest ist nicht speziell beschränkt, aber im Allgemeinen ein Rest, bei dem eine der Hydroxylgruppen entfernt ist. Er ist vorzugsweise ein Di-O-Acylglcerinrest, noch bevorzugter ein 2,3- Di-O-Acylglcerinrest. Beispiele für das hier verwendete „Acyl" sind solche mit einer Kohlenstoffzahl zwischen 1 und 23, vorzugsweise 8 und 14.
  • Der Cholesterinrest ist gewöhnlich ein Rest, bei dem eine Hydroxylgruppe am C-3 des Cyclopentaphenantrenrings entfernt ist.
  • Der Ceramidrest ist gewöhnlich ein Rest, bei dem eine Hydroxylgruppe in 1-Stellung entfernt ist. Die N-Acylgruppe im Ceramid hat gewöhnlich eine Kohlenstoffzahl zwischen 1 und 28, vorzugsweise zwischen 14 und 23.
  • Beispiele für den Phospholipidrest schließen Glycerolphospholipidreste, (Phosphatidylchinolin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, etc.) und Spingophospholipidreste (Sphingomyelin etc) ein.
  • Der Biotinrest ist im Allgemeinen ein Rest, bei dem die Carboxylgruppe entfernt ist.
  • Der Peptidrest ist im Allgemeinen ein Rest, bei dem irgendeine der Amino- oder Carboxylgruppen entfernt ist.
  • Z stellt ein Sauerstoffatom oder -NHCO- dar. Irgendeines unter dem Stickstoff- oder Sauerstoffatom des -NHCO- kann auf der R9-Seite sein.
  • Wenn R9 eine Aralkylgruppe, eine Alkylgruppe, ein Glycerolrest, ein O-Alkylglycerolrest, ein O-Acylglycerolrest, ein Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, ein Ceramidrest oder ein Phospholipidrest ist, ist Z vorzugsweise ein Sauerstoffatom.
  • Wenn R9 ein Biotinrest oder ein Peptidrest ist, ist Z vorzugsweise -HNCO-.
  • R10 und R11 stellen unabhängig jeder -SO3M dar.
  • R12 stellt ein Wasserstoffatom, einen 6-O-sulfatierten N-Acetylglucosaminrest, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Blotinrest oder einen Peptidrest dar. Diese Gruppen und Reste sind wie in Bezug auf R9 beschrieben.
  • Wenn R12 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, ein Glycerolrest, ein O-Alkylglycerolrest, ein O-Acylglycerolrest, ein Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, ein Ceramidrest oder ein Phospholipidrest ist, ist Z vorzugsweise ein Sauerstoffatom.
  • Wenn R12 ein Biotinrest oder ein Peptidrest ist, ist Z vorzugsweise -HNCO-.
  • Die Bedingungen zur Bildung der glycosidischen Bindung können geeignet in Abhängigkeit von der zu verwendenden Abgangsgruppe ausgewählt werden. Z. B. können dann, wenn ein Fluoratom als Abgangsgruppe verwendet wird, als Reaktionsbedingungen eine Reaktionszeit zwischen 5 Minuten und 50 Stunden und eine Reaktionstemperatur zwischen –70 bis 60°C verwendet werden. Das Lösungsmittel ist nicht besonders eingeschränkt und 1,2-Dichlorethan und so weiter können verwendet werden.
  • Die Aralkylgruppe, die Acylgruppe oder die Silylgruppe und die Schutzgruppe für die Aminogruppe werden so ausgewählt, dass sie unter den Bedingungen, unter denen die Schutzgruppe abgespalten wird, nicht abgespalten werden. Diese Gruppen können die selben Gruppen sein.
  • Das Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (2) kann z. B. mittels des in 2 dargestellten Verfahrens hergestellt werden. Das heißt, die Synthese von Verbindung 2 bis Verbindung 9 kann durchgeführt werden, indem man von Galactose ausgeht (Verbindung 1), entsprechend des Synthesewegs, der von Ito et al. beschrieben wurde (Agric. Biol. Chem., 50, 3227, (1986)). Die Synthese von Verbindung 10 bis Verbindung 14 kann entsprechend eines Synthesewegs durchgeführt werden, der die Substitution einer Benzylgruppe durch eine Trichloraminogruppe (Verbindung 10), Deacylierung (Verbindung 11), Benzylierung (Verbindung 12), Deallylierung (Verbindung 13) und Pivaloylierung (Verbindung 14) umfasst. Die Bedingungen für diese Schritte können von Fachleuten auf dem Gebiet passend ausgewählt werden.
  • Das Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (1) kann z. B. mittels des in 3 dargestellten Verfahrens hergestellt werden. Das heißt, die Synthese von Verbindung 16 bis Verbindung 20 kann durchgeführt werden, indem man von Glucosamin ausgeht (Verbindung 15), entsprechend des Synthesewegs, der von Nakano et al. beschrieben wurde (Tetrahedron Lett., 31, 1597, (1990). Die Synthese von Verbindung 21 bis Verbindung 24 kann entsprechend eines Synthesewegs durchgeführt werden, der Decyclisierung der Benzylidengruppe zwischen der 4- und 6-Stellung (Verbindung 21), Acetylierung (Verbindung 22), Demethoxiphenylierung (Verbindung 23) und Fluorierung (Verbindung 24) umfasst. Die Bedingungen für diese Schritte können von Fachleuten auf dem passend Gebiet ausgewählt werden.
  • Nachdem die Bildung der glycosidischen Bindung zwischen dem Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (1) und dem Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (2) erreicht wurde, kann das Oligosaccharid mit der allgemeinen Formel (3) durch Eliminieren der Aralkylgrupe und der Acylgruppe oder der Silylgruppe und Substituieren der Acetylgruppe durch die Schutzgruppe für die Aminogruppe erhalten werden. Die Bildung der glycosidischen Bindung und die Eliminierung und Substitution durch solche Gruppen wie dien oben erwähnten, kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werde (z. B. Sythesis, 384 (1989)). Spezifische Beispiele solcher Reaktionen werden in den unten erwähnten Beispielen beschrieben.
  • Da in der allgemeinen Formel (3) beide, R10 und R11 nach der Bildung der glycosidischen Bindung zwischen dem Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (1) und dem Monosaccharid mit der allgemeinen Formel (2) -SO3M darstellen, kann die selektive Eliminierung von mindestens einem von R3 und R7 (eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe) durch Substitution durch ein Wasserstoffatom (wobei eine Hydroxylgruppe gebildet wird), und die Substitution des Wasserstoffatoms durch -SO3M (Sulfatierung) durchgeführt werden.
  • Die selektive Eliminierung (und die Substitution durch ein Wasserstoffatom) der Acylgruppe oder der Silylgruppe kann durchgeführt werden, indem eine geeignete Acylgruppe oder eine Silylgruppe für die Aralkylgruppe und die Schutzgruppe für die Aminogruppe ausgewählt werden. Beispiele für solche Kombinationen schließen ein: eine Kombination einer Benzylgruppe als die Aralkylgruppe, eine Phthaloylgruppe als die Schutzgruppe für die Aminogruppe, und eine Acetylgruppe oder eine Pivaloylgruppe als die Acylgruppe oder die Silylgruppe. Das Verfahren zur Sulfatierung ist nicht besonders eingeschränkt und bekannte Verfahren können verwendet werden. Spezifische Beispiele für solche Reaktionen werden in den unten erwähnten Beispielen beschrieben.
  • Spezifisch kann das Oligosaccharid mit der allgemeinen Formel (3) mittels des in 4 beschriebenen Verfahrens erhalten werden. Das heißt, es kann durch ein Verfahren erhalten werden, das das Eliminieren einer Acetylgruppe und einer Pivaloylgruppe (und Substitution durch ein Wasserstoffatom) und Substitution einer Acetylgruppe statt einer Phthaloylgruppe (Verbindung 26), Sulfatierung (Verbindung 27) und Debenzylierung (Verbindung 28) umfasst. Die Bedingungen für diese Schritte können von Fachleuten auf dem Gebiet passend ausgewählt werden.
  • Da R10 und R11 -SO3M darstellen, können die Acylgruppe und die Silylgruppe von R3 und R7 so gewählt werden, dass eine von ihnen selektiv eliminiert werden kann. So wird z. B. für R3 die Levulinoylgruppe ausgewählt (Monosaccharid der Formel (7) oder (10)) und als R7 wird eine t-Butyldiphenylsilylgruppe (Monosaccharid der Formel (8) oder (11)) ausgewählt. Durch selektive Eliminierung der Levulinoylgruppe (und Substitution durch ein Wasserstoffatom), Sulfatierung und Eliminierung von Schutzgruppen durch andere Hydroxylgruppen kann ein Oligosaccharid erhalten werden, bei dem nur die Hydroxylgruppe in 6-Stellung zum Glucosaminrest sulfatiert ist (Oligosaccharid der Formel (9)). Durch selektive Eliminierung der t-Butyldiphenylsilylgruppe (und Substitution durch ein Wasserstoffatom), Sulfatierung und Eliminierung von Schutzgruppen durch Hydroxylgruppen kann ein Oligosaccharid erhalten werden, bei dem nur die Hydroxylgruppe in 6-Stellung des Galactoserests sulfatiert ist (Oligosaccharid der Formel (12)).
  • Die selektive Eliminierung der Acylgruppe oder der Silylgruppe (und ihre Substitution durch ein Wasserstoffatom), die Sulfatierung der durch die Eliminierung der Acylgruppe oder der Silylgruppe gebildeten Hydroxylgruppe, Eliminierung der Aralkylgruppe und die Substitution durch die Acetylgruppe an Stelle der Schutzgruppe für die Aminogruppe kann mittels bekannter Verfahren durchgeführt werden.
  • Andere Beispiele des Verfahrens zur Herstellung des durch die allgemeine Formel (3) dargestellten Oligosaccharids durch die Bildung einer glycosidischen Bindung zwischen einem durch die allgemeine Formel (1) repräsentierten Monosaccharid und dem durch die allgemeine Formel (2) repräsentierten Monosaccharid und Ähnliche werden in den 5 bis 7 dargestellt.
  • 5 zeigt ein Beispiel, bei dem R9 in der allgemeinen Formel (2) ein O-Alkylglycerolrest (2,3-Di-O-tetradecyl-sn-glycerolrest) ist. 6 zeigt ein Beispiel, bei dem R9 in der allgemeinen Formel (2) eine Alkylgruppe (Octylgruppe) ist. 7 zeigt ein Beispiel, bei dem R9 in der allgemeinen Formel (2) eine Cholestanylgruppe ist. Diese können mittels Verfahren, die den oben beschriebenen Verfahren ähnlich sind, erhalten werden. Wenn Figur R9 die andere Gruppe oder der andere Rest ist, kann die Herstellung mittels eines ähnlichen Verfahrens erreicht werden.
  • Das erhaltene sulfatierte Oligosaccharid kann in Form des Salzes (das heißt, M kann in diesem Oligosaccharid ein einwertiges Kation sein) vorliegen, oder es kann nicht in Form eines Salzen vorliegen (das heißt, M kann in diesem Oligosaccharid ein Proton sein). Beispiele für das Salz schließen die im Abschnitt <3> Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, die unten beschrieben werden, ein. Jedoch ist es vorzugsweise ein Alkalimetallsalz, insbesondere bevorzugt ein Natriumsalz. Weiterhin kann das Monosaccharid in ionisiertem Zustand vorliegen.
  • Entsprechend des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kann das vorgenannte Oligosaccharid in hoher Ausbeute in weniger Schritten hergestellt werden.
  • <2> Erfindungsgemäßes Oligosaccharid
  • Das erfindungsgemäßes Oligosaccharid ist das Oligosaccharid, das durch die allgemeine Formel (13) dargestellt wird.
  • Die Substituenten in den durch die allgemeine Formel (13) dargestellten Verbindungen sind wie folgt:
    R16 und R17 stellen jeweils -SO3M dar.
    R18 stellt ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerolrest, einen O-Alkylglycerolrest, einen O-Acylglycerolrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest, dar. Er ist bevorzugt ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, ein O-Alkylglycerolrest oder eine Cholestanylgruppe. Diese Gruppen und Reste sind diejenigen, die in Bezug auf R9 beschrieben sind, wenn R18 in der allgemeinen Formel (13) ein Wasserstoffatom ist, kann die durch R18 gebildete Hydroxylgruppe in der β-Stellung oder in der α-Stellung sein. Wenn R18 die andere Gruppe oder der andere Rest ist, ist seine glycosidische Bindung vorzugsweise eine β-glycosidische Bindung.
  • Z stellt ein Sauerstoffatom oder-NHCO- dar. Wenn R18 ein Biotinrest oder ein Peptidrest ist, ist Z vorzugsweise -NHCO-. Wenn R18 die andere Gruppe oder der andere Rest ist, ist Z vorzugsweise ein Sauerstoffatom.
  • Das erfindungsgemäße Oligosaccharid kann in Form eines Salzes (das heißt, M kann in diesem Oligosaccharid ein einwertiges Kation sein) vorliegen, oder es kann nicht in Form eines Salzes vorliegen (das heißt, M kann in diesem Oligosaccharid ein Proton sein). Beispiele für das Salz schließen die im Abschnitt <3> Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, die unten beschrieben werden, ein. Jedoch ist es vorzugsweise ein Alkalimetallsalz, insbesondere bevorzugt ein Natriumsalz. Weiterhin kann das Monosaccharid in ionisiertem Zustand vorliegen.
  • Das erfindungsgemäße Oligosaccharid, dessen R18 ein Wasserstoffatom ist, kann mittels des vorgenannten erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens erhalten werden. Das erfindungsgemäße Oligosaccharid, dessen R18 von einem Wasserstoffatom verschieden ist, kann mittels Binden eines Monosaccharids mit einer Alkylgruppe, einem Glycerolrest, einem O-Alkylglycerolrest, einem O-Acylglycerolrest, einem Cholesterinrest, einer Cholestanylgruppe, einem Ceramidrest, einem Phospholipidrest, einemn Biotinrest oder einem Peptidrest an ein anderes Monosaccharid, wie in den 5 bis 7 gezeigt, erhalten werden, oder mittels Binden eines erfindungsgemäßen Oligosaccharids, dessen R18 ein Wasserstoffatom ist, mittels eines bekannten Glycosilierungsverfahrens an Glycerol, Cholesterin, Ceramid, Biotin oder ein Peptid.
  • Das erfindungsgemäße Oligosaccharid oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon, hat eine pharmakologische Wirkung und kann als Arzneimittel verwendet werden.
  • <3> Erfindungsgemäßes Arzneimittel
  • Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält das erfindungsgemäße Oligosaccharid oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon als einen aktiven Bestandteil.
  • Das pharmazeutisch verwendbare Salz bedeutet irgendein ein pharmazeutisch verwendbares Salz unter, z. B., Alkalimetallsalzen wie einem Natriumsalz, einem Kaliumsalz und einem Lithiumsalz, Salze anorganischer Basen wie einem Ammoniumsalz, Salze organischer Basen wie einem Diethanolaminsalz, einem Cyclohexylaminsalz und Salzen von Aminosäuren und so weiter. Aber es ist nicht darauf beschräkt.
  • Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann insbesondere als antiallergischer Wirkstoff verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße Arzneimittel als antiallergischer Wirkstoff verwendet wird, ist es bevorzugt, dass die Hydroxylgruppe der 6-Stellung des N-Acetylglucosaminrests eines erfindungsgemäßen Oligosaccharids sulfatiert ist (d. h. R16 in der allgemeinen Formel (13) ist -SO3M); und es ist noch mehr bevorzugt, dass beide der Hydroxylgruppen in der 6-Stellung des Galactoserests und in der 6-Stellung des N-Acetylglucosaminrests sulfatiert sind, (d. h. R16 und R17 in der allgemeinen Formel (13) sind – SO3M.
  • Der erfindungsgemäße antiallergische Wirkstoff ist für alle Krankheiten im Zusammenhang mit Allergien wirksam. Spezifischer kann er verwendet werden zum Zweck der Vorbeugung oder Behandlung von bronchialem Asthma, allergischer interstitialer Lungenentzündung, allergischer Rhinitis, allergischer Conjinctivitis, atopischer Dermatitis, und so weiter.
  • Das erfindungsgemäße, das erfindungsgemäße Oligosaccharid enthaltende, Arzneimittel, bei dem die Hydroxylgruppe in der 6-Stellung des Galactoserests und die Hydroxylgruppe in 6-Stellung des N-Acetylglucosaminrests sulfatiert sind, kann insbesondere als entzündungshemmender Wirkstoff verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße entzündungshemmende Wirkstoff ist für alle Krankheiten im Zusammenhang mit Entzündungen wirksam. Spezifischer kann er verwendet werden zum Zweck der Vorbeugung oder Behandlung von rheumatischer Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Spondylosis deformans, Osteoarthritis, Hexenschuss, zum Zurückdrängen von Entzündungen und Schwellungen nach Operationen oder äußeren Verletzungen, Entzündungen des Schultergelenks, Arthrose des Unterkiefers, Entzündungen im Bereich von Sehnen, Sehnenscheidenentzündung, Entzündung des Gelenkkopfes des Oberarms (Tennisarm), Muskelschmerzen, Keratoconjunktivitis und so weiter. Der erfindungsgemäße antiallergische Wirkstoff übt wegen der pharmakologischen Aktivität des aktiven Bestandteils entzündungshemmende Wirkung einschließlich analgesischer Wirkung, antiphlogistischer Wirkung, antipyretischer Wirkung usw. auf diese Erkrankungen aus.
  • Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann nicht nur zu Behandlungszwecken im wörtlichen Sinne des Ausdrucks verwendet werden, sondern auch zur Vorbeugung, Erhaltung des Zustands (Verhindern einer Verschlechterung), Linderung (Verbesserung von Symptomen), und so weiter, bei Krankheiten.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Dosierung abhängig von der Art und dem Fortschritt der zu behandelnden Krankheit, dem Verabreichungsweg usw. gewählt werden.
  • Das heißt, dass das Erfindungsgemäße Medikament mittels Injektion (intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intrakutane, intraperitoneale Injektionen, etc.), orale Verabreichung, transdermale Verabreichung, Inhalieren usw. verabreicht werden kann und es kann entsprechend dieser Verabreichungswege sinnvoll formuliert werden. Die Darreichungsform, die gewählt werden kann, ist nicht spezifisch eingeschränkt, und sie kann aus einem weiten Bereich einschließlich Injektionen (Lösung, Suspension, Emulsion, fest, um vor der Verwendung gelöst zu werden, etc.), Tabletten, Kapseln, Granulat, Pulver, Flüssigkeit, Liposominklusion, Salbe, Gel, Puder zur äußerlichen Verabreichung, Spray, Inhalierpuder usw.) ausgewählt werden. Zur Herstellung dieser Präparate können jedwelche Zutaten, die für Arzneimittel gewöhnlich verwendet werden, einschließlich konventioneller Grundlagen, Stabilisatoren, Bindemittel, Schmierstoffe, Emulgatoren, Regulatoren für den osmotischen Druck, pH-Regulatoren, Farbstoffe, Sprengmittel usw..
  • Die Menge des aktiven Bestandteils in der Formulierung des erfindungsgemäßen Arzneimittels, das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid, und die Dosis des erfindungsgemäßen Arzneimittels sollten individuell bestimmt werden, in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, Verwendungszweck, spezifischen Symptomen von Patienten, Körpergewicht von Patienten und ähnlichem, und sie sind nicht besonders eingeschränkt.
  • Bei allergischen Krankheiten induzieren Antigene das Freisetzen chemischer Überträger aus sensibilisierten Mastzellen mit IgE-Antikörpern, die sich im Atmungstrakt oder in der Lunge befinden. Die chemischen Überträger schließen Histamin, den eosinophilen chemotaktischen Faktor, SRS-A usw. ein. Sie verursachen Symptome wie Atemnot, Husten, Anfälle etc. bei Asthma, und offene Lungenentzündung, Ödeme, interstitielle Lungenentzündung, Vaskulitis etc. bei Lungenkrankheiten. Sie können in seltenen Fällen Granulome verursachen, und diese Erkrankung entwickelt sich häufig zu Lungenfibrose. Allergische Erkrankungen werden gewöhnlich mit Antihistaminika, Steroiden und antiallergischen Wirkstoffen (Inhibitoren der Freisetzung chemischer Überträger) behandelt. Jedoch ist im Zusammenhang mit Antihistaminika von Nebenwirkungen wie Kraftlosigkeit, Schwäche, Kopfschmerzen, Erbrechen, dumpfer Kopfschmerz, Appetitlosigkeit etc. berichtet worden. Bei Bronchialasthma unterdrücken Antihistaminika die Sekretion des Atmungstrakts aufgrund der Anticholin-Wirkung und macht Spucken und Abhusten schwierig und können daher außer bei leichten Fällen nicht verwendet werden. Weiterhin stellen sie eine Gegenanzeige für Patienten mit Glaukom und Problemen beim Harnlassen dar. Andererseits wird als Hauptwirkung von Steroiden ihre entzündungshemmende Wirkung betrachtet und normalerweise ist eine umfangreiche und kontinuierliche Verabreichung zur Behandlung allergischer Erkrankungen nötig. Weil Steroide kritische Nebenwirkungen haben, werden sie im Prinzip für Fälle verwendet, die mittels der gewöhnlichen Therapien nicht kontrollierbar sind. Weiterhin, weil antiallergische Wirkstoffe Leberschäden, blutende Blasenentzündung und Verletzungen der Verdauungsorgane verursachen können, machen sie eine regelmäßige Untersuchung nötig.
  • So wurden speziell auf den Gebiet allergischer Erkrankungen effektive Therapien mit weniger Nebenwirkungen verlangt, und das erfindungsgemäße Arzneimittel stellt solche Therapien zur Verfügung.
  • Beim erfindungsgemäßen Arzneimittel (einschließlich dem antiallergischen Wirkstoff und dem entzündungshemmenden Wirkstoff) sind R18 und Z bevorzugt wie oben beschrieben.
  • Wie oben beschrieben, entsprechend der vorliegenden Erfindung, kann das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid mit einem Galactoserest am reduzierenden Ende effizient hergestellt werden. Insbesondere kann ein Keratan-Sulfat-Oligosaccharid zur Verfügung gestellt werden, bei dem die Hydroxylgruppe(n) in 6-Stellungen) des Galactoserests und/oder des N-Acetylglucosaminrests sulfatiert ist bzw. sind. Die Keratan-Sulfat-Oligosaccharide, die einen Galactoserest, bei dem die Hydroxylgruppe in 6-Stellung sulfatiert ist, am reduzierenden Ende haben, und ähnliche haben eine hervorragende pharmakologische Wirkung und können eine sichere und effektive neue pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung stellen.
  • Beispiele Die vorliegende Erfindung wird spezifischer im Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben. Jedoch wird der Rahmen der vorliegenden Erfindung durch diese nicht beschränkt.
  • Beispiel 1: Synthese des Dinatriumsalzes von O-(2-Acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-6-O-sulfo-β-D-galactopyranose
  • Das Dinatriumsalz von O-(2-Acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-6-O-sulfo-β-D-galactopyranose wurde entsprechend dem in den 2 bis 4 dargestellten Schema synthetisiert. Verfahren, die zur Synthese in den folgenden Beispielen gewöhnlich verwendet wurden, wurden wie folgt durchgeführt. Silicagel-Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von Kieselgel (Merck) durchgeführt. Dünnschichtchromatographie wurde unter Verwendung von HPTLC-Fertigplatten-Kieselgel 60 F254 (Merck) durchgeführt. 1H-NMR-Spektren und 13C-NMR-Spektren wurden unter Verwendung eines JNM-EX-400 (hergestellt von JEOL Ltd.) gemessen. Als interner Standard wurde Tetramethylsilan zur Messung von Lösungen in CDCl3 und CD3OD verwendet, und t-Butanol für D2O.
  • (1) Synthese der Verbindungen 2 bis 14
  • Die Galactosesynthone wurden aus Galactose (Verbindung 1) entsprechend dem von Ito et al. beschriebenen Syntheseweg hergestellt. Die Synthese der Verbindungen 10–14 wurde folgendermaßen durchgeführt.
  • Die Ziffern hinter jedem Substanznamen stellen die Ziffern der Verbindungen in den 2 bis 4 dar.
  • (a) Benzyl-2,4-di-O-acetyl-β-D-glucopyranosid (10)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurden Benzylalkohol (18.4 mL, 178.8 mmol) und Verbindung 9 (2,4-Di-O-Acetyl-3,6-di-O-allyl-D-galactopyranosyltrichloracetimidat, 21,84 g, 44,67 mmol) in ein Reaktionsgefäß, das vorher getrocknetes Molekularsieb 4 Å (30,0 g) enthielt, gegeben und 15 min lang unter Eiskühlung gerührt. Nach der Zugaben von Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat (1,7 mL, 8,93 mmol) zum Reaktionsgemisch unter Eiskühlung wurde bei der selben Temperatur vier Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und durch Zugabe von Triethylamin unter Eiskühlung neutralisiert, und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 6 : 1), und es wurde Verbindung 10 erhalten (18.6 g, 96%).
    Rf: 0.51 (Toluol : Ethylacetat = 3 : 1)
    C23H30O8 MW: 434.47
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ: 2,037 (s, 3H, OAc), 2,146 (s, 3H, OAc), 4.445 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1), 5,461 (d, 1H, J = 2,9 Hz, N-4), 5,715–5,914 (m, 2H CH2 = CH × 2), 7,200–7,400 (m, 5H, Aromaten).
  • (b) Benzyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranosid (11)
  • Natriummethoxid (134 mg, 2,5 mmol) wurde zu einer Lösung von Verbindung 10 (134 mg, 2,5 mmol) in Methanol (30 mL) zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffgasatmosphäre 48 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäure neutralisiert und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1), und es wurde Verbindung 11 erhalten (6.8 g, 78%).
    Rf: 0.27 (Toluol : Ethylacetat = 2 : 1) C19H26O6 MW: 350.40
  • (c) Benzyl-3,6-di-O-ally-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (12)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre und Eiskühlung wurde Benzylbromid (11,4 mL, 95,5 mmol) zu einem Gemisch von 60% Natriumhydrid (3,8 g, 95,5 mmol), Verbindung 11 (6,7 g, 19,1 mmol) und Dimethylformamid (20 mL) gegeben, und das Gemisch wurde 18 Stunden lang gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Methanol unter Eiskühlung gegeben, und es wurde eine Stunde lang gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mit Diethylether verdünnt, nacheinander mit Wasser und gesättigter Sohle-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (n-Hexan : Ethylacetat = 10 : 1–9 : 1), und es wurde Verbindung 12 erhalten (9.1 g, 90%).
    Rf: 0.27 (Toluol : Ethylacetat = 10 : 1)
    C33H38O6 MW: 530.63
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ:
    3,424 (dd, 1H, J = 2,9, 9,8 Hz, H-3), 3,829 (dd, 1H, J = 7,8, 9,8 Hz, H-2), 3,861 (d, 1 H, J = 2,9 Hz, H-4), 4,453 (d, 1H, J = 7,8 Hz; H-1), 5,805–5,984 (m, 2H, CH2 = CH × 2), 7,200–7,450 (m, 15H, Aromaten).
  • (d) Benzyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (13)
  • Unter Wasserstoffgasatmosphäre wurde eine Lösung von Verbindung 12 (8,9 g, 16,7 mmol) in Tetrahydrofuran (80 mL) zu einer Lösung eines aktivierten Iridumkomplexes (Ir(CoD)(PMePh2)2PFs, 287 mg, 0.34 mmol) in Tetrahydrofuran (60 mL) bei Raumtemperatur gegeben und das Gemisch wurde sieben Stunden lang gerührt. Anschließend wurden Wasser (100 mL) und Iod (8.5 mL, 67.1 mmol) zum Reaktionsgemisch zugegeben und es wurde 15 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, nacheinander mit gesättigter Natriumthiosulfatlösung, gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der erhaltene Rückstand wurde umkristallisiert (Ethanol/Dichlormethan/Diethylether), und es wurde Verbindung 13 erhalten (7,4 mg, 97%).
    Rf: 0,34 (n-Hexan : Diethylacetat = 1 : 1)
    C27H30O6 MW: 450.51
  • (e) Benzyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (14)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurde Pivaloylchlorid (4,2 mL, 35,7 mmol) zu einer Lösung von Verbindung 13 (7,3 g, 16,2 mL) in Pyridin (50 mL) bei 0°C zugegeben und das Gemisch wurde 70 Minuten lang gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Methanol gegeben und das Gemisch wurde 40 Minuten lang gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 6 : 1), und es wurde Verbindung 14 erhalten (7.81 g, 90%).
    Rf: 0.45 (Toluol : Ethylacetat = 6 : 1)
    C32H38O7 MW: 534.62
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ: 1,202,(s, 9H, Opiv), 2,326 (bs, 1H, OH), 3,628–3,708 (m, 3H, H-2, H-3 und H-5), 3,786 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-4), 4,142 (dd, 1H, J = 6,4, 10,7 Hz, H-6), 4,352 (dd, 1H, J = 6,8, 11,2 Hz, H6), 4,448 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 6,650–7,150 (m, 15H, Aromaten).
  • (2) Synthese von Verbindung 16 bis Verbindung 24
  • Die Glucosaminsynthone 16 bis 20 wurden aus Glucosamin (Verbindung 15) entsprechend des von Nakano et al (Tetrahedron Letters, 31, 1597 (1990) beschriebenen Synthesewegs synthetisiert. Die Verbindungen 21 bis 24 wurden folgendermaßen synthetisiert.
  • (f) p-Methoxiphenyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-2-phthalimido-β-D-galactopyranosid (21)
  • In ein Reaktionsgefäß mit zuvor getrocknetem 4 A-Molekularsieb (60,0 g) wurde zu Trimethylaminboran (75,0 g, 1028 mmol) eine Lösung von Verbindung 20 (21 : 0 g, 35,4 mmol) in Dichlormethan (200 mL) gegeben und es wurde Diethylether (80 mL) zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang unter Stickstoffgasatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgefäß wurde auf 0°C gekühlt und wasserfreies Aluminiumchlorid (20,0 g, 150 mmol) wurde portionsweise über 1,5 Stunden zum Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch wurde bei 0°C 2,5 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und das Filtrat wurde mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit wässriger 1 N Sulfonsäurelösung, Wasser, gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Das Filtrat wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1), und es wurde Verbindung 21 erhalten (14,5 g, 69%).
    Rf: 0.40 (Toluol : Ethylacetat = 3 : 1)
    C35H33N1O8 MW: 595.62
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, + CDCl3, TMS) δ: 3,620–3,662 (m, 1H, H-5), 3,706 (s, 3H, OMe), 3,783–3,849 (m, 2H, H-4 und H-6), 3,939 (dd, 1H, J = 2,4, 12,2 Hz, H-6'), 4,351 (dd, 1H, J = 8,3, 10,7 Hz, H-2), 4,435 (dd, 1H, J08,3 Hz, 10,7 Hz, H-3), 5,693 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1), 6,650–7,900 (m, 15H, Aromaten).
  • (g)p-Methoxiphenyl-6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-2-phthalimido-β-D-galactopyranosid (22)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurden Essigsäureanhydrid (200 mL) und DMAP (katalytische Menge) zu einer Lösung von Verbindung 21 (10,5 g, 17,6 mmol) in Pyridin (200 mL) gegeben und das Gemisch wurde 20 Stunden lang gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Ethanol gegeben und es wurde 20 Minuten lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1), und es wurde Verbindung 22 erhalten (9,6 g, 85%).
    Rf: 0.51 (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1)
    C37H35N1O9 MW: 637,66
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ: 2,062 (s, 3H, OAc), 3,680 (s, 3H, OMe), 3,759–3,817 (m, 2H, H-4 und H-5), 4,296 (dd, 1H, J = 4,4, 12,2 Hz, H-6), 5,631 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1), 6,650–7,900 (m, 18H, Aromaten).
  • (h) 6-O-Acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-2-phthalimido-D-glucopyranose (23)
  • Verbindung 22 (9,0 g, 14,1 mmol) wurde in Acetonitril : Wasser (4 : 1, 400 mL) gelöst. Dazu wurde Ammoniumcer(IV)nitrat (20,1 g, 36,7 mmol) gegeben und das Gemisch 40 Minuten lang bei Raumtemperatur stark gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, nacheinander mit Wasser, wässriger gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 2,5 : 1), und es wurde Verbindung 23 erhalten (6,1 g, 81%).
    Rf: 0.23 (Toluol : Ethylacetat = 2 : 1)
    C30H29N1O8 MW: 531,54
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3 + D2O TMS) δ: 2,074 (s, 3H, OAc), 3,680 (t, 3H, J = 9,3 Hz, H-4), 3,739–3,772 (m, 1H, H-5), 4,100 (dd, 1H, J = 8,8, 10,8 Hz, H-2), 4,240 (dd, 1H, J = 3,9, 11,2 Hz, H-6), 5,386 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1 ), 6,650–7,900 (m, 14H, Aromaten).
  • (i) 6-O-Acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-2-phthalimido-β-D-glucopyranosylflourid (24)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurde Diethylaminoschwefeltriflourid (5,8 ml, 43,9 mmol) zu einer Lösung von Verbindung 23 (5,95 g, 11,2 mmol) in 1,2-Dichlorethan (50 mL) unter Eiskühlung gegeben und das Gemisch wurde zwei Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, nacheinander mit wässriger gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann wurde das Lösungsmittel unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1), und es wurde Verbindung 24 erhalten (5,9 g, 99%).
    Rf: 0.68 (Toluol : Ethylacetat = 2 : 1)
    C30H28N1O7F1 MW: 533,53
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ: 2,097 (s, 3H, OAc), 3,859 (dd, 1H, J = 8,3, 9,8 Hz, H-4), 3,800–3,840 (m, 1H, H-5), 5,810 (d, 0,5H, J = 7,8 Hz, H-1β), 5,943 (d, 0,5H, J = 7,8 Hz, H-1β), 6,800–7,800 (m, 14H, Aromaten).
  • (3) Synthese von Verbindung 28 aus Verbindung 14 und Verbindung 24
  • Die Verbindungen 25 bis 28 wurden folgendermaßen synthetisiert.
  • (j) Benzyl-O-(6-O-acetyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (25)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurde Silbertriflat (7,23 g, 28,2 mmol), Hafnocendichlorid (5,4 g, 14,1 mmol) und 1,2-Dichlorethan (20 mL) in ein Reaktionsgefäß mit zuvor getrocknetem 4 A Molekularsieb (20.0 g) gegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten lang unter Eiskühlung gerührt. Das Reaktionsgefäß wurde auf –23°C gekühlt und dann wurde eine Lösung von Verbindung 24 (5,8 g, 10,8 mmol) und Verbindung 14 (5,4 g, 10,0 mmol) in 1,2-Dichlorethan (45 mL) zum Gemisch zugegeben und es wurde bei –23°C 1,5 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt und unter Eiskühlung wurde Triethylamin zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethylacetat verdünnt, nacheinander mit wässriger gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann wurde das Lösungsmittel unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie gereinigt (Toluol : Ethylacetat = 9 : 1), und es wurde Verbindung 25 erhalten (9,3 g, 82%).
    Rf: 0.39 (Toluol : Ethylacetat = 8 : 1) C62N65N1O14 MW: 1048,15
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, TMS) δ: 1,173 (s, 9H, OPiv), 1,986 (s, 3H, OAc), 3,859 (bd, 1H, J = 2,5 Hz, H-4), 4,063 (dd, 1H, J = 5,9, 11,2 Hz), 5,454 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1), 6,800–7,800 (m, 24H, Aromaten).
  • (k) Benzyl-O-(2-acetamino-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (26)
  • Ethylenamin (170 mL) wurde zu einer Lösung von Verbindung 25 (8,0 g, 7,6 mmol) in 1-Butanol (200 mL) gegeben und das Gemisch wurde 46 Stunden lang bei 98°C gerührt. Das Lösungsmittel des Reaktionsgemisches wurde unter Unterdruck abgezogen. Toluol und Methanol wurden zum Rückstand gegeben und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde in Pyridin (200 mL) gelöst in DMAP (katalytische Menge) und Essigsäureanhydrid (150 mL) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel des Reaktionsgemisches wurde abgezogen und der Rückstand mit Toluol und Ethanol in ein Azeotrop überführt. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1) gereinigt, und es wurde ein Gemisch zweier Verbindungen (6,84 g) erhalten Zu einer Lösung dieses Gemisches in Methanol (100 mL) wurde Natriummethoxid (7,69 mg, 14,3 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 60 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoffgasatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Amberlist 15 neutralisiert und filtriert und das Filtrat wurde unter Unterdruck abgezogen. Der erhaltene Rückstand wurde umkristallisiert (Dichlormethan/Isopropylether) und Verbindung 26 wurde erhalten (6,0 9,94%).
    Rf: 0.33 (Toluol : Ethylacetat = 1 : 3)
    C49H55N1O11 MW: 833,94
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3, + CD3OD, TMS) δ: 1,557 (s, 3H, NAc), 4,438 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 4,784 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1), 7,200–7,450 (m, 20H, Aromaten).
    100 MHz 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD, TMS) δ: 22,92 (Me-CO), 61,44, 61,64 (C-6 × 2), 101,73 (C-1), 102,60 (C-1), 170,29 (Me-CO).
  • (1) Benzyl-O-(2-acetamino-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz (27)
  • Unter Stickstoffgasatmosphäre wurde ein Gemisch von Verbindung 26 (212,5 mg, 0,255 mmol) und Schwefeltrioxidtriethylaminkomplex (184,7 mg, 1,02 mmol) in Methylformamid (1,0 mL) gelöst und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 50°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde, so wie es anfiel, mit Sephadex LH-20 (Chloroform : Methanol = 1 : 1) gereinigt und die Saccharidfraktion wurde aufkonzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in Methanol (4 mL) gelöst. Dazu wurde Dowex 50 (Na+, 4 g) gegeben und das Gemisch wurde 12 Stunden lang gerührt, um das Gegenion gegen Natrium auszutauschen. Dann wurde der Rückstand mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Chloroform : Methanol = 1 : 1) gereinigt, und weiter mit Sephadex LH-20 (Chloroform : Methanol = 1 : 1), um das Siligagel zu entfernen. So wurde Verbindung 27 (252 mg, 95%) erhalten.
    Rf: 0.53 (Chloroform : Methanol = 3 : 1)
    C49H53N1O17S2Na2 MW: 1038,03
    400 MH2 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, TMS) δ: 1,621 (s, 3H, NAc), 7,200–7,450 (m, 20H, Aromaten).
    100 MH2 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD, TMS) δ: 22,14 (Me-CO), 66,25, 66,61 (C-6 × 2), 102,04 (C-1 × 2), 170,98 (Me-CO).
  • (m) O-(2-Acetamino-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosedinatriumsalz (28)
  • 20 Palladiumhydroxid/Kohlenstoff (268 mg) wurden zu einer Lösung von Verbindung 27 (236,8 mg, 0,228 mmol) in Methanol/Wasser (2 : 1. 6 mL) gegeben. Das Innere des Reaktionssystems wurde mit Wasserstoff gefüllt und das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und der Rückstand mit Wasser gewaschen. Dann wurden Filtrat und Waschlösung vereinigt und das Lösungsmittel unter Unterdruck abgezogen. Der erhaltene Rückstand wurde mit Sephadex G-25 (Wasser) gereinigt und Verbindung 28 (131 mg, 98%) wurde erhalten.
    Rf: 0.28 (1-Butanol : Ethanol : Wasser = 2 : 2 : 1)
    C14H23N1O17S2Na2 MW: 587,44
    400 MH2 1H-NMR (D2O, t-BuOH bei 50°C) δ: 2,029 (s, 3H, NAc), 4,580 (d, 0,55H, J = 8,3 Hz, H-1aβ), 4,727 d, 0,55H, J = 8,3 Hz, H-1bβ) 4,742 (d, 0,45H, J = 8,3 Hz, H-1aα), 5,232 (d, 0,45H, J = 3,4 Hz, H-1aα)
    100 MH2 13C-NMR (D2O, t-BuOH bei 50°C) δ: 25,04 (Me-CO), 69,81 (C-6b), 70,70 (C-6 aβ), 70,94 (C-6aα), 95,21 (C-1aα), 99,21 (C-1aβ), 105,39 (C-1b), 177,74 (Me-CO).
  • Beispiel 2: Herstellung von O-(2-Acetamino-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2-acetamino-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranose)trinatriumsalz (im Folgenden als G4L4-Natriumsalz bezeichnet)
  • NeuAc-Gal β1-4GlcNAc (6S) β1-3Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (wobei Gal einen Galactoserest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosaminrest darstellt, NeuAc einen N-Acetylneuraminsäurerest darstellt und 6S einen 6-O-Sulfatester darstellt und ~ eine α2,3- oder eine α2,6-Verknüpfung darstellt, s. WO96/16973, 1g) wurde in 10 mL 0,1 M schwefliger Säure gelöst und die Lösung wurde bei 50°C 22 Stunden lang inkubiert, um den N-Acetylneuraminsäure-Rest (Sialsäurerest) abzuspalten. Nach der Reaktion wurde die Lösung durch Zugabe einer geringen Menge 1 M NaOH auf pH 5 eingestellt, und es wurden1 mL 0,5 M Natriumacetatpuffer, pH 4,5 und 25 μL 20% Natriumazid zugegeben. Lactase (hergestellt von Keial Kasei, 5000 U) wurde zu dem Gemisch gegeben und es wurde bei 37°C 22 Stunden lang inkubiert, um die Galactosereste abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde fünf Mal mit destilliertem Wasser verdünnt und dann auf eine Muromac-Säule (Muromachi Kagaku Kogyo, 2,5 × 24 cm) aufgetragen, die mit 1 M NaCl äquilibiriert worden war. Die Säule wurde mit einem Salzkonzentrationsgradienten von 1 M NaCl (500 mL) bis 2,5 M NaCl (500 mL) beladen, und das Eluat wurde in 5-mL-Fraktionen gesammelt. Die eluierten Fraktionen wurden mittels Kapillarelektrophorese analysiert und die Eluatfraktionen von G4L4 wurden bestimmt. Die G4L4 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer auf etwa 10 mL aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Lösung wurde auf eine Cellufine GCL25s-Säule aufgetragen (Seikagaku Corporation, 3 × 60 cm), die mit destilliertem Wasser äquilibiriert war, und mit destilliertem Wasser eluiert. Die als 10-mL-Fraktionen gesammelten eluierten Fraktionen wurden mittels Kapillarelektrophorese analysiert und die Eluatfraktionen von G4L4 wurden bestimmt. Die G4L4 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer auf etwa 20 mL aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Lösung wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Molmassenschnitt bei 10 000 filtriert, um Endotoxine zu eliminieren, und gefriergetrocknet, so dass eine endgültige Probe erhalten wurde.
  • Die endgültige Probe zeigte einen einzigen Peak bei der Analyse mittels Kapillarelektrophorese. Ihr Gehalt an Hexose und Sulfat wurde zu 0,84 und 0,91, respektive, bestimmt, und relativ zum theoretischen Gehalt, der per Definition 1 ist.
  • Weiterhin zeigte die endgültige Probe bei der Analyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen bei einer Retentionszeit von 16,4 Minuten einen einzigen Peak.
    Säule: YMC-Pak Polyamin II (4,6 × 250 mm, hergestellt von YMC Co, Ltd.)
    Säulentemperatur: 35°C
    Eluat: 150 mM Natriumdihydrogenphosphat
    Durchflussrate: 1 mL/min
    Wellenlänge der Messung: 210 nm
    Probe: 10 mg/mL G4L4 (die endgültige Probe)
  • Die Ergebnisse der NMR-Untersuchung der endgültigen Probe sind im Folgenden dargestellt.
    400 MH2 1H-NMR (D2O, t-BuOH bei 22,9°C) δ: 2,024 (s, 3H, NAc), 2,030 (s, 3H, NAc), 4,526 (d, 1H, J1,2 = 7,8 Hz, H-1b), 4,699 (d, 1H, J1,2 = 8,8 Hz, H-1c), 4,729 (d, 0,4H, J1,2 = 7,8 Hz, H-1aβ), 5,211 (d, 0,6H, J1,2 = 2,5 Hz, H-1aα)
    100 MH2 13C-NMR (D2O, t-BuOH bei 26,0°C) δ: 24,74 (NHCOCH3), 25,05 (NHCOCH3), 69,62 (C-6a oder b oder c), 69,77 (C-6b oder c oder a), 70,57 (C-6c oder a oder b), 93,31 (C-1aα), 97,82 (C-1aβ), 105,80 (C-1b oder c), 105,91 (C-1c oder b).
  • Beispiel 3: Synthese von 2-Acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl)-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol-dinatriumsalz
  • 2-Acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl)-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol-dinatriumsalz wurde entsprechend dem in 5 dargestellten Schema synthetisiert. Die Ziffern hinter den Substanznamen stellen die Ziffern der Verbindungen in 5 dar.
  • (a) 2,4-Di-O-acetyl-3,5-di-O-allyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-snglycerol (3)
  • 2,3-Di-O-tetradecyl-sn-glycerol (500 mg; 1,03 mmol), Bis(cyclopentatdienyl)hafniumchlorid (782 mg, 2,68 mmol), Silbertriflat (1,06 g, 5,36 mmol) und 4 Å-Molekularsieb wurden in 1,2-Dichlorethan (3,0 mL) suspendiert, bei Raumtemperatur unter einem Strom von Argongas gerührt und auf –15°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung 1 (536 mg, 1,55 mmol) gegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 3 (716,7 mg, 85,8%) wurde erhalten.
    Rf: 0.58 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C47H85O10 MW: 810,179 1H-NMR (CDCl3) δ: 5,887 (m, 1H, allyl), 5,816 (m, 1H, allyl), 5,500 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4), 5,108 (dd, 1H, J = 8,3, 9,9 Hz, H-2), 4,474 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1), 2,165, 2,015 (2s, 6H, 2Ac), 0,912 (t, 6H, J = 6,3 Hz, 2 CH3)
  • (b) 3,6-Di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-snglycerol (5)
  • Verbindung 3 (430 mg, 0,531 mmol) wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1, 4 mL) gelöst. 1 N Natriumhydroxidlösung (0.8 mL) wurden zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 5 : 2) gereinigt, und Verbindung 4 (377,9 mg, 95,0%) wurde erhalten.
    Rf: 0.43 (Toluol : AcOEt = 2 : 1)
  • Dann wurde Verbindung 4 (778 mg, 1,072 mmol) in N,N-Dimethylformamid (3 mL) gelöst. Dazu wurde Natriumhydrid (308 mg, 6,99 mmol) gegeben und das Gemisch wurde bei –15 °C unter einem Argongasstrom gerührt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch Benzylbromid (0,84 mL, 6,99 mmol) zugegeben und es wurde 3 Stunden lang gerührt, wobei die Temperatur nach und nach auf Raumtemperatur angehoben wurde. Nach der Zugabe von Methanol zur Reaktion wurde neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Hexan : AcOEt = 12 : 1) gereinigt, und Verbindung 5 (864 mg, 89%) wurde erhalten.
    RfF: 0.67 (Hexan : AcOEt = 6 : 1)
    C57H93O8 MW: 906,354
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,845 (m, 1H, allyl), 5,771 (m, 1H, allyl), 4,859 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,8164 (d, 1H, J = 10,8 Hz, Bn), 4,665 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,572 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,272 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1 ), 3,773 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-4), 3,660 (dd, 1H, J = 7,8, 9,8 Hz, H-2), 0,801 (t, 6H, J = 6,4 Hz, 2 CH3).
  • (c) 2,4-Di-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol (6)
  • Iridiumkomplex (1,5-Cyclopentadien-bis(methyldiphenylphosphin)iridiumhexafluorophosphat, 112 mg, 0,096 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) suspendiert und durch Rühren im H2-Strom aktiviert. Zu dieser Lösung wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) gelöste Verbindung 5 (864 mg, 0,95 mmol) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argongasstrom gerührt. Dann wurden Iod (484 mg), Wasser (24,7 mL) und Tetrahydrofuran (15 mL) zugegeben und das Gemisch weitere zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumthiosulfatlösung, gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : EtOAc 5 : 2) gereinigt, und Verbindung 6 (686,6 mg, 87,1%) wurde erhalten.
    Rf: 0.32 (Toluol : AcOEt = 2 : 1)
    C51H85O8 MW: 826,225
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,991 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,834 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,658 (d, 2H, J = 11,2 Hz, 2 Bn), 4,385 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 3,778 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4), 0,881 (t, 6H, J = 6,8 Hz, 2 CH3).
  • (d) 2,4-Di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol (7)
  • Durch Zugabe von Pyridin (12 mL) wurde Verbindung 6 (687 mg, 0,831 mmol) gelöst. Pivaloylchlorid (130 μL, 1,08 mmol) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei –5°C gerührt. Weiteres Pivaloylchlorid (130 μL, 1,08 mmol) wurde dazu gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei –5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, dann durch Celit filtriert und nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 7 (716,6 mg, 94,7%) wurde erhalten.
    Rf: 0.57 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C56H93O9 MW: 910,342
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,991 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,855 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,650 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,646 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,365 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1 ), 4,302 (dd, 1H, J = 6,8, 11,8 Hz, H-6), 4,109 (dd, 1H, J = 6,4, 11,2 Hz, H-6'), 3,775 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4), 1,179 (s, 9H piv), 0,879 (t, 6H, J = 6,8 Hz, 2 CH3).
  • (e) 3-O-Acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecylsn-glycerol (8)
  • Durch Zugabe von Pyridin (12 mL) wurde Verbindung 7 (10,8 mg, 11,9 mmol) gelöst. Essigsäureanhydrid (0,5 mL) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde mit Toluol in ein Azeotrop überführt und der Rückstand wurde mit Sephadex LH-20 gereinigt (CHCl3 : MeOH = 1 : 2). Es wurde Verbindung 8 erhalten (11,3 mg, qu.).
    Rf: 0. 46 (Toluol : AcOEt = 8 : 1) C56H95O10 MW: 952,379
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,900 (dd, 1H, J = 3,4, 10,3 Hz, H-3), 4,882 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,634 (d, 2H, J = 12,2, Hz, 2Bn), 4,543 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,437 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 4,299 (dd, 1H, J = 6,8, 11,2 Hz, H-6), 4,087 (dd, 1H, J = 6,8, 11,2 Hz, H-6'), 3,850 (d, 1H, J = 2,9 Hz, H-4), 3,765 (dd, 1H, J = 7,8, 10,3 Hz, H-2), 1,926 (s, 3H, Ac), 1,188 (s, 9H piv), 0,881 (t, 6H, J = 6,8 Hz, 2 CH3).
  • (f) 3,4-Di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-levuloyl-2-phtalimido-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol (9)
  • Verbindung 7 (685 mg, 0,752 mmol), Cyclopentatdienylhafniumchlorid (571 mg, 1,96 mmol), Silbertriflat (771 mg, 3,91 mmol) und 4 A-Molekularsieb (2,5 g) wurden in 1,2-Dichlorethan (10 mL) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur im Argongasstrom gerührt und auf –15°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung (2) (563 mg, 0,98 mmol) gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemsich wurde durch Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert. Das Gemisch wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 9 : 1) gereinigt, und Verbindung 9 (1,01 g, 91,5%) wurde erhalten.
    Rf: 0.44 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C89H124O17N MW: 1479,949
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,461 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1 b), 4,941 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,874 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,789 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,648 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,536 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,460 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,414 (d, 2H, J = 11,7 Hz, 2Bn), 4,223 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 3,897 (d, 1H, J = 3,2 Hz, H-4a), 2,130 (s, 3H, CH3), 1,153 (s, 9H piv), 0,881 (t, 6H, J = 6,6 Hz, 2 CH3).
  • (g) 2-Acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-β-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glycerol (10)
  • Verbindung 9 (977 mg, 0,667 mmol) wurde in Ethanol (33,5 mL) suspendiert. Dazu wurde Nydrazinhydrat (3,35 mL), gegeben und das Gemisch wurde bei 110°C 18 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und die erhaltene Aminoverbindung wurde in Pyridin (6,0 mL) gelöst. Dazu wurde Essigsäureanhydrid (5,0 mL) gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1, 20,0 mL) gelöst. Es wurde Natriummethoxid (108 mg, 2,0 mmol) dazugegeben und das Gemisch wurde bei 60°C eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Siligagel-Säulenchromatographie (Toluol : Aceton : CHCl3 = 5 : 2 : 1) und dann weiter mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt, und Verbindung 10 (756 mg, 94,8%) wurde erhalten.
    Rf: 0.18 (Toluol : Aceton : CHCl3 = 6 : 2 : 1)
    C73H110O13N MW: 1209,666
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,823 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,354 (d, 1H, J = 6,8 Hz, H-1a), 1,497 (s, 3H, NHAc), 0,881 (t, 6H, J = 6,4 Hz, 2 CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 173,06 (Me-CO), 105,51, 104,01 (C-1 × 2), 62,80, 62,51 (C-6 × 2).
  • (h) 2-Acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glyceroldinatriumsalz (11)
  • Verbindung 10 (200 mg, 0,165 mmol) wurde in N,N-Dimethylformamid (1,5 mL) gelöst. (C2H5)3NSO3 (300 mg, 1,65 mmol) wurde dazugegeben und das Gemisch wurde 0,5 Stunden lang bei 50°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt. Das Lösungsmittel wurde zu einem gewissen Maße abgezogen und zum Rückstand wurden Wasser (2,0 mL) und Dowex-50 (Na+-Typ) zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang gerührt. Dann wurde das Gemisch durch Celit filtriert und das Filtrat abgezogen. Der Rückstand wurde mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt. So wurde Verbindung 11 (215 mg, 92,2 %) erhalten.
    Rf: 0.38 (CHCl3 : MeOH = 6 : 1)
    C73H108O19NS2Na2 MW: 1413,74
    1H-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 4,403 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 1,593 (s, 3H, NHAc), 0,889 (t, 6H, J = 6,4 Hz, 2 CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 172,93 (Me-CO), 105,24, 104,01 (C-1 × 2), 68,13, 68,00 (C-6 × 2).
  • (i) 2-Acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl-(1→1)-2,3-di-O-tetradecyl-sn-glyceroldinatriumsalz (12)
  • Verbindung 11 (200 mg, 0,141 mmol) wurde in einem Gemisch von Methanol und Wasser (3 : 1, 15 mL) gelöst und Palladiumhydroxid/Kohlenstoff (200 mg) wurde zugegeben. Das Innere des Reaktionssystems wurde mit Wasserstoffgas gefüllt und die katalytische Reduktion wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und das Filtrat abgezogen. Der Rückstand wurde mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, weiter mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 1 : 3 : 1) gereinigt und schließlich erneut mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, um Verbindung 12 zu erhalten (119,6 mg, 80,5%).
    RfF: 0.52 (CHCl3 : MeOH : H2O = 12 : 8 : 3)
    C45H84O19NS2Na2 MW/: 1053,24
    1H-NMR (DMSO3 + D2O) δ: 4,666 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,162 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1a), 4,067 (b. dd, 1H, H-6b), 4,006–3,924 (b. dd, 1H, H-6a), 1,882 (s, 3H, NHAc), 0,861 (t, 6H, J = 8,8 Hz, 2 CH3).
    13C-NMR (DMSO3 + D2O) δ: 171,32 (Me-CO), 103,49, 102,37 (C-1 × 2), 65,91, 65,85 (C-6 × 2).
  • Beispiel 4: Synthese von Octyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosid-dinatriumsalz
  • Octyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-galactopyranosid-dinatriumsalz wurde entsprechend dem in 6 dargestellten Schema synthetisiert. Die Ziffern hinter den Substanznamen stellen die Ziffern der Verbindungen in 6 dar.
  • (a) Octyl-2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranosid (13)
  • Octanol (300 mg, 2,30 mmol), Cyclopentatdienylhafniumdichlorid (1,75 g, 5,99 mmol), Silbertriflat (2,36 g, 12,0 mmol) und 4 Å-Molekularsieb (2,3 g) wurden in 1,2-Dichlorethan (5,0 mL) suspendiert, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur unter einem Strom von Argongas gerührt und auf –15°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung 1 (1,2 g, 3,47 mmol) gegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 13 (0,8 g, 76%) wurde erhalten.
    Rf: 0.46 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    0,34 (Hexan : AcOEt = 5 : 1)
    C24H40O8 MW: 456,572
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,855 (m, 1H, allyl), 5,784 (m, 1H, allyl), 5,472 (d, 1H, J = 3,4 Hz, N-4), 5,086 (dd, 1H, J = 7,8, 9,8 HZ, H-2), 4,394 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1), 2,125, 2,066 (2s, 6H, 2Ac), 0,879 (t, 3H, J = 6,8 Hz, CH3).
  • (b) Octyl-3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (15)
  • Verbindung 13 (0,8 g, 1,75 mmol) wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1, 5 mL) gelöst. 1N Natriumhydroxidlösung (1,0 mL) wurden zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 5 : 2) gereinigt, und Verbindung 14 (585 mg, 89,7%) wurde erhalten.
    Rf: 0.32 (Toluol : AcOEt = 2 : 1)
  • Dann wurde Verbindung 14 (585 mg, 1,57 mmol) in N,N-Dimethylformamid (3 mL) gelöst. Dazu wurde Natriumhydrid (451 mg, 10,2 mmol) gegeben und das Gemisch wurde bei –15 °C unter einem Argongasstrom gerührt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch Benzylbromid (1,22 mL, 10,2 mmol) zugegeben und es wurde 3 Stunden lang gerührt, wobei die Temperatur nach und nach auf Raumtemperatur angehoben wurde. Nach der Zugabe von Methanol zum Reaktionsgemisch wurde neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Hexan : AcOEt = 15 : 1) gereinigt, und Verbindung 15 (811 mg, 93,5%) wurde erhalten.
    Rf: 0.79 (Hexan : AcOEt = 6 : 1)
    C34H48O6 MW: 552,747
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,947 (m, 1H, allyl), 5,849 (m, 1H, allyl), 4,959 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,915 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,765 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,660 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,346 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-1), 0,887 (t, 3H, J = 6,4 Hz, CH3).
  • (c) Octyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranoid (16)
  • Iridiumkomplex (1,5-Cyclopentadien-bis(methyldiphenylphosphin)iridiumhexafluorophosphat, 172 mg, 0,15 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) suspendiert und durch Rühren im H2-Strom aktiviert. Zu dieser Lösung wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) gelöste Verbindung 15 (811 mg, 1,47 mmol) gegeben, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter einem Argongasstrom gerührt. Dann wurden Iod (754 mg), Wasser (38 mL) und Tetrahydrofuran (15 mL) zugegeben und das Gemisch eine weitere Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemsich wurde mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumthiosulfatlösung, gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : EtOAc = 5 : 2) gereinigt, und Verbindung 16 (589 mg, 82,1%) wurde erhalten.
    Rf: 0.35 (Toluol : AcOEt = 2 : 1)
    C28H40O6 MW: 472,618
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,000 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,843 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,674 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,662 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,360 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 3,776 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-4), 0,868 (t, 3H, J = 6,8 Hz, CH3).
  • (d) Octyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (17)
  • Durch Zugabe von Pyridin (17 mL) wurde Verbindung 16 (569 mg, 1,20 mmol) gelöst. Pivaloylchlorid (188 μL, 1,57 mmol) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei –5°C gerührt. Weiteres Pivaloylchlorid (188 μL, 1,57 mmol) wurde dazu gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei –5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, dann durch Celit filtriert und nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 17 (648 mg, 96,7%) wurde erhalten.
    Rf: 0.56 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C33H48O7 MW: 556,735
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,986 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,838 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,664 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,653 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,332 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 4,316 (dd, 1H, J = 6,8, 11,7 Hz, H-6), 4,113 (dd, 1H, J = 6,7, 11,0 Hz, H-6'), 3,772 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4), 1,180 (s, 9H piv), 0,867 (t, 3H, J = 6,8 Hz, CH3).
  • (e) Octyl-3-O-acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (18)
  • Durch Zugabe von Pyridin (1 mL) wurde Verbindung 17 (10 mg, 18,0 μmol) gelöst. Essigsäureanhydrid (0,5 mL) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde mit Toluol in ein Azeotrop überführt und der Rückstand wurde mit Sephadex LH-20 gereinigt (CHCl3 : MeOH = 1 : 2). Es wurde Verbindung 18 erhalten (11 mg, qu.).
    Rf: 0.58 (Toluol : AcOEt = 8 : 1)
    C35H50O8 MW: 598,772
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,903 (dd, 1H, J = 3,2, 10,0 Hz, H-3), 4,883 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,645 (d, 1H, J-11,7, Hz, Bn), 4,638 (d, 1H, J = 11,7, Hz, Bn), 4,545 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,405 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H- 1), 4,311 (dd, 1H, J = 6,8, 10,8 Hz, H-6), 4,087 (dd, 1H, J = 6,8, 10,7 Hz, H-6'), 3,847 (d, 1H, J = 2,9 Hz, H-4), 3,769 (dd, 1H, J = 7,8, 10,3 Hz, H-2), 1,937 (s, 3H, Ac), 1,188 (s, 9H piv), 0,870 (t, 3H, J = 6,8 Hz, CH3).
  • (f) Octyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-levuloyl-2-phtalimido-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (19)
  • Verbindung 17 (624 mg, 1,12 mmol), Cyclopentatdienylhafniumdichlorid (850 mg, 2,91 mmol), Silbertriflat (1,15 mg, 5,82 mmol) und 4 Å-Molekularsieb (3,2 g) wurden in 1,2-Dichlorethan (10 mL) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur im Argongasstrom gerührt und auf –15°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung (2) (838 mg, 1,46 mmol) gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemsich wurde durch Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert. Das Gemisch wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 19 (1,03 g, 82,9%) wurde erhalten.
    Rf: 0.47 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C66N79O15N MW: 1126,342
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,475 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,189 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 3,874 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4a), 2,133 (s, 3H, CH3), 1,153 (s, 9H piv), 0,826 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3).
  • (g) Octyl-2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzylβ-D-galactopyranosid (20)
  • Verbindung 19 (1,0 g, 0,899 mmol) wurde in Ethanol (45 mL) suspendiert. Dazu wurde Hydrazinhydrat (4,5 mL), gegeben und das Gemisch wurde bei 110°C 18 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und die erhaltene Aminoverbindung wurde in Pyridin (5,0 mL) gelöst. Zur Lösung wurde Essigsäureanhydrid (4,0 mL) gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt und das Lösungsmittel wurde abgezogen. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1, 20,0 mL) gelöst. Es wurde Natriummethoxid (146 mg, 2,7 mmol) dazugegeben und das Gemisch wurde bei 60°C eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : Aceton = 2,3 : 1) und dann weiter mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt, und Verbindung 20 (739 mg, 96%) wurde erhalten.
    Rf: 0.49 (Toluol : Aceton = 3 : 2)
    C50H55O11N MW: 856,06
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,840 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,329 (d, 1H, J = 6,8 Hz, H-1a), 1,515 (s, 3H, NHAc), 0,848 (t, 3H, J = 6,8 Hz, CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 173,17 (Me-CO), 105,32, 104,01 (C-1 × 2), 62,82, 62,55 (C-6 × 2).
  • (h) Octyl-2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz (21)
  • Verbindung 20 (150 mg, 0,175 mmol) wurde in N,N-Diformamid (1,5 mL) gelöst. (C2H5)3NSO3 (319 mg, 1,75 mmol) wurde dazugegeben und das Gemisch wurde 0,5 Stunden lang bei 50°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt. Das Lösungsmittel wurde zu einem gewissen Maße abgezogen und zum Rückstand wurden Wasser (2,0 mL) und Dowex-50 (Na+-Typ) zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang gerührt. Dann wurde das Gemisch durch Celit filtriert und das Filtrat abgezogen. Der Rückstand wurde mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt. So wurde Verbindung 21 (185 mg, 99,6 %) erhalten.
    Rf: 0.23 (CHCl3 : MeOH = 6 : 1)
    C50H63O17NS2Na2 MW: 1060,134
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,382 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1a), 1,634 (s, 3H, NHAc), 0,854 (t, 3H, J = 6,84 Hz, CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 173,03 (Me-CO), 105,10, 103,99 (C-1 × 2), 68,18 (C-6 × 2).
  • (i) Octyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz (22)
  • Verbindung 21 (170 mg, 0,160 mmol) wurde in einem Gemisch von Methanol und Wasser (3 : 1, 15 mL) gelöst und Palladiumhydroxid/Kohlenstoff (180 mg) wurde zugegeben. Das Innere des Reaktionssystem wurde mit Wasserstoffgas gefüllt und die katalytische Reduktion wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und das Filtrat abgezogen. Der Rückstand wurde mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, weiter mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 1 : 3 : 1) gereinigt und schließlich erneut mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, um Verbindung 22 zu erhalten (101,4 mg, 90,6%).
    Rf: 0.30 (CHCl3 : MeOH : H2O = 12 : 6 : 1)
    C22H39O17NS2Na2 MW: 699,636
    1H-NMR (DMSO3 + D2O) δ: 4,665 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,136 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 4,053 (dd, 1H, J = 2,0, 11,7 Hz H-6b), 3,956–3,851 (b. dd, 1H, H-6a), 1,869 (s, 3H, NHAc), 0,861 (t, H, J = 7,1 Hz, CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 171,19 (Me-CO), 102,98, 102,30 (C-1 × 2), 66,09, 65,87 (C-6 × 2).
  • Beispiel 5: Synthese von Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz und von Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-galactopyranosid.
  • Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz und Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl(1→3)-β-D-galactopyranosid wurden entsprechend dem in 7 dargestellten Schema synthetisiert. Die Ziffern hinter den Substanznamen stellen die Ziffern der Verbindungen in 7 dar.
  • (a) Cholestanyl-2,4-di-O-acetyl-3,6-di-O-allyl-β-D-galactopyranosid (23)
  • Cholestanol (700 mg, 1,80 mmol), Cyclopentatdienylhafniumdichlorid (1,37 g, 4,68 mmol), Silbertriflat (1,85 g, 9,37 mmol) und 4 Å-Molekularsieb (2,7 g) wurden in 1,2-Dichlorethan (7,0 mL) suspendiert, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur unter einem Strom von Argongas gerührt und auf –10°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung 1 (936 mg, 2,70 mmol) gegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 32 (970 mg, 75,3%) wurde erhalten.
    Rf: 0.57 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C43H70O8 MW: 715,018
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,880 (m, 1H, Allyl), 5,802 (m, 1H, Allyl), 5,480 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-4), 5,072 (dd, 1H, J = 8,3, 10,3 HZ, H-2), 4,510 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1), 2,150, 2,095 (2s, 6H, 2Ac), 0,922 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,890 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,885 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,800, 0,667 (2s, 6H, 2CH3).
  • (b) Cholestanyl-3,6-di-O-allyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (25)
  • Verbindung 23 (0,98 g, 1,37 mmol) wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1,10 mL) gelöst. 1N Natriumhydroxidlösung (1,0 mL) wurde zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Weiterhin wurde Natriummethoxid (74 mg, 1,37 mmol) zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 5 : 2) gereinigt, und Verbindung 24 (0,83 g, 96%) wurde erhalten.
    Rf: 0.32 (Toluol : AcOEt = 2 : 1)
  • Dann wurde Verbindung 24 (838 mg, 1,32 mmol) in N,N-Dimethylformamid (8 mL) gelöst. Dazu wurde Natriumhydrid (378 mg, 8,58 mmol) gegeben und das Gemisch wurde bei 0°C unter einem Argongasstrom gerührt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch Benzylbromid (1,02 mL, 8,58 mmol) zugegeben und es wurde 3 Stunden lang gerührt, wobei die Temperatur nach und nach auf Raumtemperatur angehoben wurde. Natriumhydrid (378 mg, 8,58 mmol) und Benzylbromid (1,02 mL, 8,58 mmol) wurden zusätzlich zum Reaktionsgemisch gegeben, und es wurde 18 Stunden lang gerührt Nach der Zugabe von Methanol zum Reaktionsgemisch wurde es neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Hexan : AcOEt = 13 : 1) gereinigt, und Verbindung 25 (0,94 g, 88,1%) wurde erhalten.
    Rf: 0.72 (Hexan : AcOEt = 6 : 1)
    C53H7806 MW: 811,193
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,935 (m, 1H, Allyl), 5,836 (m, 1H, Allyl), 4,931 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,903 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,739 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,639 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,438 (d, 1H, J = 7,8 H2, H-1), 3,829 (d, 1H, J = 2,9 Hz, H-4), 3,719 (dd, 1H, J = 7,8, 9,8 Hz, H-2), 3,397 (dd, 1H, J = 2,9, 9,8 Hz, H-3), 0,893 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,862 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,858 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,799, 0,641 (2s, 6H, 2 CH3).
  • (c) Cholestanyl-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (26)
  • Iridiumkomplex (1,5-Cyclopentadien-bis(methyldiphenylphosphin)iridiumhexafluorophosphat, 136 mg, 0,12 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) suspendiert und durch Rühren im H2-Strom aktiviert. Zu dieser Lösung wurde in Tetrahydrofuran (5 mL) gelöste Verbindung 25 (940 mg, 1,16 mmol) gegeben, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Argongasstrom gerührt. Dann wurden Iod (588 mg), Wasser (30 mL) und Tetrahydrofuran (15 mL) zugegeben und das Gemisch weitere 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemsich wurde mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit gesättigter Natriumthiosulfatlösung, gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : Aceton = 6 : 1) gereinigt, und Verbindung 26 (748 mg, 88,2%) wurde erhalten.
    Rf: 0.49 (Toluol : Aceton = 4 : 1)
    C47N70O6 MW: 731,064
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,006 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,823 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,678 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,650 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,476 (d, 1H, J = 6,8 Hz, N-1).
  • (d) Cholestanyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (27)
  • Verbindung 26 (647 mg, 0,885 mmol) wurde in Pyridin (13 mL) gelöst. Pivaloylchlorid (138 μL, 1,15 mmol) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde 0,5 Stunden lang bei –5°C gerührt. Weiteres Pivaloylchlorid (138 μL, 1,15 mmol) wurde dazu gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei –5 bis 0°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt, dann durch Celit filtriert und das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 27 (663 mg, 91,9%) wurde erhalten.
    Rf: 0.56 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    C52N78O7 MW: 815,181
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,993 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,821 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,667 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,642 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,450 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1), 4,293 (dd, 1H, J = 6,8, 11,2 Hz, H-6), 4,083 (dd, 1H, J = 6,3, 10,8 Hz, H-6'), 3,746 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-4), 1,176 (s, 9H piv).
  • (e) Cholestanyl-3-O-acetyl-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-ß-D-galactopyranosid (28)
  • Verbindung 27 (10 mg, 12,3 μmol) wurde in Pyridin (1 mL) gelöst. Essigsäureanhydrid (0,5 mL) wurde zur Lösung gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde mit Toluol in ein Azeotrop überführt und der Rückstand wurde mit Sephadex LH-20 gereinigt (CHCl3 : MeOH = 1 : 2). Es wurde Verbindung 28 erhalten (9 mg, 85,4%).
    Rf: 0.65 (Toluol : AcOEt = 8 : 1)
    C54H80O8 MW: 857,218
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,889 (dd, 1H, J = 2,7, 10,5 Hz, H-3), 4,885 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,647 (d, 1H, J = 11,7, Hz, Bn), 4,625 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,533 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,518 (d, 1H, J = 7 ,3 Hz, H-1), 4,289 (dd, 1H, J = 6,8, 11,2 Hz, H-6), 4,061 (dd, 1H, J = 6,3, 11,2 Hz, H-6'), 3,766 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-4), 3,753 (dd, 1H, J = 7,3, 10,3 Hz, H-2), 1,924 (s, 3H, Ac), 1,185 (s, 9H piv).
  • (f) Cholestanyl-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-levuloyl-2-phtalimido-β-D-glucopyranosyl(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosid (29)
  • Verbindung 27 (737 mg, 0,904 mmol), Cyclopentatdienylhafniumchlorid (686 mg, 2,35 mmol), Silbertriflat (927 mg, 4,70 mmol) und 4 Å-Molekularsieb (2,5 g) wurden in 1,2-Dichlorethan (10 mL) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur im Argongasstrom gerührt und auf –15°C gekühlt. Dazu wurde Verbindung (2) (676,5 mg, 1,18 mmol) gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemsich wurde durch Zugabe von Triethylamin neutralisiert, mit Ethylacetat verdünnt und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde nacheinander mit gesättigter wässriger Hydrogencarbonatlösung und gesättigter Sohlelösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : AcOEt = 10 : 1) gereinigt, und Verbindung 29 (982,1 mg, 79,3%) wurde erhalten.
    Rf: 0.58 (Toluol : AcOEt = 6 : 1)
    0,07 (Hexan : AcOEt = 6 : 1)
    C85H109O15N MW: 1384,788
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,475 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,453 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 3,852 (d, 1H, J = 2,9 Hz, H-4a), 2,133 (s, 3H, CH3), 1,146 (s, 9H piv).
  • (g) Cholestanyl-2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (30)
  • Verbindung 29 (668 mg, 0,488 mmol) wurde in Ethanol (24,5 mL) suspendiert. Dazu wurde Hydrazinhydrat (2,45 mL), gegeben und das Gemisch wurde bei 110°C 18 Stunden lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und die erhaltene Aminoverbindung wurde in Pyridin (5,0 mL) gelöst. Zur Lösung wurde Essigsäureanhydrid (4,0 mL) gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt und das Lösungsmittel wurde abgezogen. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol und Tetrahydrofuran (1 : 1, 10,0 mL) gelöst. Es wurde Natriummethoxid (78,8 mg, 1,46 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei 60°C eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Amberlist 15E (H+-Typ) neutralisiert und durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Toluol : Aceton = 3 : 1) gereinigt und dann weiter mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt, und Verbindung 30 (534 mg, 99,6%) wurde erhalten.
    Rf: 0.34 (Toluol : Aceton = 3 : 1)
    C69H95O11N MW: 1114,506
    1H-NMR (CDCl3) δ: 5,044 (d, 1H, J = 12,2 Hz, NH), 4,875 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,851 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1b), 4,809 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,740 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,696 (d, 1H, J = 11,7 Hz, Bn), 4,672 (d, 1H, J = 12,2 Hz, Bn), 4,642 (d, 1H, J = 10,7 Hz, Bn), 4,571 (d, 1H, J = 11,2 Hz, Bn), 4,562 (d, 1H, J = 12,2 Hz, Bn), 4,439 (d, 1H, J = 6,4 Hz, H-1a), 1,524 (s, 3H, NHAc), 0,892 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH3), 0,860 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,856 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,760, 0,635 (2s, 6H, 2CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 173,00 (Me-CO), 103,79, 103,06 (C-1 × 2), 62,77, 62,40 (C-6 × 2).
  • (h) Cholestanyl-2-acetamido-3,4-di-O-benzyl-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-2,4-di-O-benzyl-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz (31)
  • Verbindung 30 (150 mg, 0,136 mmol) wurde in N,N-Diformamid (1,5 mL) gelöst. (C2H5)3NSO3 (247 mg, 1,36 mmol) wurde dazugegeben und das Gemisch wurde 0,5 Stunden lang bei 50 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt mit Sephadex LH-20 (CHCl3 : MeOH = 2 : 3) gereinigt. Das Lösungsmittel des Eluats wurde zu einem gewissen Maße abgezogen und zum Rückstand wurden Wasser (2,0 mL) und Dowex-50 (Na+-Typ) zugegeben und das Gemisch wurde einen Tag lang gerührt und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde abgezogen und der Rückstand wurde mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt. So wurde Verbindung 31 (175 mg, 97,3%) erhalten.
    Rf: 0.22 (CHCl3 : MeOH = 8 : 1)
    C69H93O17NS2Na2 MW: 1318,58
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,523 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1a), 4,384 (dd, 1H, J = 2,0, 10,8 Hz, H-6b), 4,290 (dd, 1H, J = 4,4, 10,7 Hz, H-6a), 1,645 (s, 3H, NHAc), 0,910 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,837 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,868 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,730, 0,658 (2s, 6H, 2CH3).
    13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 102,97, 102,55 (C-1 × 2), 68,47, 67,22 (C-6 × 2).
  • (i) Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sulfo-β-D-galactopyranosiddinatriumsalz (32)
  • Verbindung 31 (170 mg, 0,129 mmol) wurde in einem Gemisch von Methanol und Wasser (3 : 1, 15 mL) gelöst und Palladiumhydroxid/Kohlenstoff (180 mg) wurde zugegeben. Das Innere des Reaktionssystem wurde mit Wasserstoffgas gefüllt und die katalytische Reduktion wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und das Filtrat abgezogen. Der Rückstand wurde mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, weiter mittels einer Dowex-50 (Na+-Typ)-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 1 : 3 : 1) gereinigt und schließlich erneut mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH : H2O = 5 : 10 : 3) gereinigt, um Verbindung 32 zu erhalten (109,4 mg, 88,6%).
    Rf: 0.47 (CHCl3 : MeOH : H2O = 12 : 8 : 1)
    C41H69O17NS2Na2 MW: 958,08
    1H-NMR (CDCl3) δ: 4,727 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1b), 4,310 (d, 1H, J = 7,8 Hz, H-1a), 4,093 (b. dd, 1H, H-6b), 3,956–3,851 (b. dd, 1H, H-6a), 1,926 (s, 3H, NHAc), 0,945 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,909 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH3), 0,905 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,827, 0,689 (2s, 6H, 2CH3).
    13C-NMR (DMSO3 + D2O) δ: 170,88 (Me-CO), 102,21, 100,73 (C-1 × 2), 65,85, 65,65 (C-6 × 2).
  • (j) Cholestanyl-2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-galactopyranosid (33)
  • Verbindung 30 (230 mg, 0,209 mmol) wurde in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Ethylacetat (4 : 1 : 1, 25 mL) gelöst und dazu wurde Palladiumhydroxid/Kohlenstoff (230 mg) gegeben. Das Innere des Reaktionsgefäßes wurde mit Wasserstoffgas gefüllt und die katalytische Reduktion bei Raumtemperatur 20 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und das Filtrat wurde abgezogen. Der Rückstand wurde mit einer Sephadex LH-20-Säule (CHCl3 : MeOH = 1 : 1) gereinigt, und es wurde Verbindung 33 erhalten (126,1 mg, 81,5%).
    Rf: 0.51 (CHCl3 : MeOH = 3 : 1)
    C41H71O11N MW: 754,008
    1H-NMR (C5D5N + D2O) δ: 5,383 (d, 1H, J = 8,3 Hz, H-1b), 4,825 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-1a), 2,059 (s, 3H, NHAc).
  • Beispiel 6: Sicherheitsprüfungen und Prüfung der pharniakologischen Wirkung
  • In diesem Beispiel wurden als Keratan-Sulfat-Oligosaccharid das Natriumsalz von L4, das Natriumsalz von Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid (L4L4), das aus zwei L4 besteht, die über eine β1-3-Verknüpfung miteinander verbunden sind, das Natriumsalz von K4 (Verbindung 28 in Beispiel 1), das Natriumsalz von K2 und das Natriumsalz von G4L4 (die Strukturen der Oligosaccharide, die durch diese Abkürzungen dargestellt werden: s. 8) verwendet. L4 und L4L4 wurden mittels des in der Internationalen Veröffentlichung WO96/16973 beschriebenen Verfahrens erhalten.
  • Das Natriumsalz von K2 wurde folgendermaßen erhalten:
    10 g aus Rinderknorpeln stammendes Keratan-Sulfat wurden in 120 mL 0,1 M Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst. Das Keratan-Sulfat wurde durch Zugabe von 1000 Einheiten von Pseudomonas sp. stammender Keratanase (von der Seikagaku Corporation hergestellt) zur Lösung und Inkubieren der Lösung bei 37 °C 50 Stunden lang, abgebaut. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war und das 1,3-fache Volumen Ethanol zur Lösung zugegeben worden war, wurde das Gemisch gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde die Lösung in Überstand und Niederschlag mittels Zentrifugieren (10000 U/min, 20 Minuten) getrennt und der Überstand wurde unter Unterdruck aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde gefriergetrocknet und man erhielt 9 g getrocknetes Material. Das erhaltene getrocknete Material wurde in einer geringen Menge destilliertem Wasser gelöst, Gelchromatographie unter Verwendung einer Cellufine GCL-90 m (von der CNISSO Corporation hergestellt, 4,5 cm × 125 cm) und 0,2 M Natriumchlorid-Lösung als Eluierungsmittel unterzogen, und es wurde eine K2 enthaltende Fraktion erhalten. Die erhaltene K2-Fraktion wurde unter Unterdruck aufkonzentriert, mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Cellufine GCL-25m (von der CHISSO Corporation hergestellt, 4,0 cm × 120 cm) und destilliertem Wasser als Eluierungsmittel entsalzen und gefriergetrocknet.
  • Diese gefriergetrocknete K2 enthaltende Fraktion wurde in einer geringen Menge destilliertem Wasser gelöst, auf Muromac 1 × 4 (200–400) (hergestellt von Muromachi Kagaku Co., Ltd, 2,0 cm × 32 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von Natriumchlorid zwischen 0 und 2 M eluiert, um eine weiter gereinigte K2-Fraktion zu erhalten. Die erhaltene K2-Fraktion wurde unter Unterdruck aufkonzentriert, mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Cellufine GCL-25m (von der CHISSO Corporation hergestellt, 4,0 cm × 120 cm) entsalzen und gefriergetrocknet, um 1,9 g getrocknetes K2 zu erhalten.
  • (1) Sicherheitsprüfung
  • 1. Toxizitätstest mittels einmaligem Verabreichen bei Mäusen
  • K4 oder G4L4 wurde normalen Mäusen intravenös in einer Dosis von 2000 mg/kg einmal verabreicht (jede Gruppe besteht aus 5 Mäusen), und die Mäuse wurden in Hinblick auf ihren Allgemeinzustand 14 Tage lang beobachtet.
  • Weder bei der männlichen noch bei der weiblichen Gruppe wurden Todesfälle beobachtet. Während bei jeder Maus direkt nach der Verabreichung von K4 oder G4L4 Lähmungserscheinungen beim Gehen beobachtet wurden, stellte sich bei allen Mäuse innerhalb von etwa 3 Minuten nach der Verabreichung wieder normales Befinden ein. Was das Körpergewicht betrifft, zeigten zwar männliche Mäuse am nächsten Tag nach der Verabreichung einen geringen Gewichtsverlust, aber alle Mäuse zeigten anschließend eine erfreuliche Zunahme des Körpergewichts. Bei den Autopsien wurden bei allen Mäusen keine Abnormalitäten auf Grund der Verabreichung von K4 oder G4L4 beobachtet. Aus den oberen Ergebnissen ergibt sich, dass als mindeste tödliche Dosis von K4 und G4L4 für eine einmalige intravenöse Verabreichung 2000 mg/kg oder darüber betrachtet wird. Daher übersteigt LD50 von K4 und G4L4 sowohl für männliche wie für weibliche Mäuse bei der einmaligen intravenösen Verabreichung 2000 mg/kg.
  • 2. Antigenizitätstest bei Meerschweinchen
  • Meerschweinchen wurden mittels dreimaliger subkutaner Verabreichung von K4 oder G4L4 alleine oder einer Emulsion von K4 mit einem Immunostimmulans, Freunds kompletten Adjuvans (FCA) sensibilisiert. K4 oder G4L4 wurden den Tieren 12 Tage nach der letzten Sensibilisierung intravenös verabreicht, um eine aktive systemische Anaphylaxie zu induzieren. Als positive Blindprobe wurde ein ähnlicher Test mit Ovalbumin (OVA) durchgeführt.
  • Die Ergebnisse des oben beschriebenen Tests sind in Tabelle 1 zusammen mit den Dosen der Testsubstanzen dargestellt. Bei den K4- oder G4L4-induzierten Meerschweinchen wurde keine anaphylatische Reaktion beobachtet. Die positive Kontrolle bei diesem Test, ovalbumin-induzierte Meerschweinchen, zeigten eine anaphylatische Reaktion. Wegen der obigen Ergebnisse wird von K4 und G4L4 nicht behauptet, dass sie aktive systemische Anaphylaxie bei Meerschweinchen verursachen.
  • Tabelle 1 Antigenizitätstest bei Meerschweinchen
    Figure 00510001
  • (2) Test auf pharmakologische Wirkung
  • 1. Untersuchung der Wirkung auf die von Calcium-Ionophoren induzierte Steigerung der Permeabilität von Blutgefäßen
  • Unter Betäubung mit Ether wurden Ratten am Rücken rasiert und 0,1 mL einer Lösung von Calcium-Ionophoren (A23187, Wako Pure Chemicals Industries, 10 μg/mL), gelöst in 2% DMSO, wurde jeder Ratte an einer Stelle intrakutan verabreicht. Als negative Blindprobe wueden jeder Ratte an einer Stelle 0,1 mL 2%ige DMSO-Lösung intrakutan verabreicht. Jede Testsubstanz war in der Calcium-lonophor-Lösung gelöst und 0,1 mL der Lösung wurde an verschiedenen Stellen intrakutan verabreicht. Unmittelbar danach wurde jeder Ratte 1 mL Evans Blau intravenös verabreicht, und jede Ratte wurde durch Verbluten lassen 30 Minuten später getötet. Die Haut wurde abgezogen und die Evans Blau durchlässige Stelle wurde mit einem Trepan ausgestanzt. Das ausgestanzte Stück wurde zur Messung der Menge freigesetzten Farbstoffs verwendet. Die Menge freigesetzten Farbstoffs wurde entsprechend des Verfahrens von Katayama et al. (Microbiol. Immunol., 22, 89–101 (1978)) gemessen. Das heißt, die erhaltende Haut wurde über Nacht mit 1 N KOH hydrolisiert, mit einer 0,6 N HP3O4-Lösung in Aceton (gemischt in einem Verhältnis von 5 : 13) neutralisiert und dann zentrifugiert. Die Menge freigesetzten Farbstoffs wurde auf der Grundlage der Absorption (620 nm) des Überstandes gemessen.
  • Die bei der Verwendung von L4, L4L4, K4 und K2 als Testsubstanzen erhaltenen Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Die bei der Verwendung von L4 und G4L4 als Testsubstanzen erhaltenen Ergebnisse sind in 10 dargestellt.
  • L4L4, K4 und K2 unterdrückten in Abhängigkeit von der Dosis den Anstieg der Permeabilität der Blutgefäße und sie zeigten bei Konzentrationen von 2,5 bis 10 mg/Stelle, 0,63 bis 5 mg/Stelle und 1,25 bis 5 mg/Stelle, respektive, einen signifikanten Unterdrückungseffekt. Der stärkste Unterdrückungseffekt wurde von K4 gezeigt; K2 zeigte einen schwächeren Effekt und L4L4 einen noch schwächeren Effekt. G4L4 zeigte ebenfalls einen signifikanten Unterdrückungseffekt auf den Anstieg der Permeabilität der Blutgefäße. Andererseits unterdrückte L4 kaum den Anstieg der Permeabilität der Blutgefäße in diesem Modell. Die Ergebnisse legen nahe, dass K4, K2, L4L4 und G4L4 antiallergische Wirkung durch Unterdrückung des Anstiegs der Permeabilität der Blutgefäße zeigen könnten. Insbesondere liegt nahe, dass von K4 eine hervorragende Aktivität gezeigt werden könnte.
  • Weil L4L4, K4, K2 und G4L4 den durch Calcium-Ionophor induzierten Anstieg der Permeabilität der Blutgefäße in diesem Test signifignikant unterdrückte, wurde vorgeschlagen, dass die K2-Struktur für die Ausübung dieser Aktivität wichtig ist, und die Aktivität wurde durch die K4-Struktur verstärkt. Weiterhin wurde vorgeschlagen, dass die L4-Struktur in diesem Modell nicht so wichtig ist, weil L4 diese Unterdrückungsaktivität nicht zeigte. Andererseits wurde von L4L4, das aus zwei L4-Strukturen besteht, die über eine β-(1-3)-Bindung miteinander verknüpft sind, erwartet, in diesem Modell Unterdrückungsaktivität zu zeigen, da es die K4-Struktur hat. Es wurde vorgeschlagen, dass L4L4, K4, K2 und G4L4 den Anstieg der Permeabilität der Blutgefäße unterdrückten, indem sie die Membranen stabilisieren und so das Einfließen von Ca2+ in Zellen inhibieren oder Entgranulierung inhibieren oder unterdrücken, dass Histamin usw. von Mastzellen ausgeschieden wird.
  • 2. Untersuchung des Effekts auf die O2 –-Bildung durch Neutrophile bei Meerschweinchen, induziert durch FMLP (N-Formyl-Met-Leu-Phe)-Stimulierung
  • Eine 0,2%ige wässrige Lösung von Glycogen in physiologischer Kochsalzlösung wurde autoklaviert und 20 mL der Lösung wurden einem weiblichen Hartley-Meerschweinchen intraperitoneal verabreicht. Das Tier wurde 16 Stunden später durch Verbluten lassen getötet, 20 mL physiologische Sohlelösung, die 10 U/mL Heparin enthielt, wurde in die Bauchhöhle injiziert und das peritoneale Exsudat wurde gesammelt. Das Exsudat wurde bei 100 U/min in einer Tischzentrifuge 10 Minuten lang zentrifugiert, und zum Niederschlag wurde gereinigtes Wasser zugegeben, um 30 Sekunden lang Hämolyse zu verursachen. Die Lösung wurde mit Hanks Gleichgewichts-Salzlösung in doppelter Konzentration wieder isotonisch eingestellt, und das Zentrifugieren wurde zweimal wiederholt, um Neutrophile zu erhalten. Die erhaltenen Meerschweinchen-Neutrophile wurden in Hanks Gleichgewichts-Salzlösung suspendiert und die Leukozytenzahl wurde mittels eines Blutzellen-Zählgerätes (Sysmex K-2000) gezählt. Eine mit Hanks Gleichgewichts-Salzlösung auf 2 × 106 Zellen/mL verdünnte Suspension wurde als Zellsuspension für das Experiment verwendet.
  • 1 mL der Zellsuspension und 10 μL einer Lösung der Testsubstanz mit einer bekannten Konzentration (in einer Blindprobe war kein Keratan-Oligosaccharid zugegeben), wurden vermischt, eine Stunde lang bei 37°C vorinkubiert und dazu wurden nacheinander 50 μL einer 1,6 mM Lösung Cytochrom C und 100 μL einer 0,1 mM FMLP-Lösung zugegeben und vermischt. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Kühlen mit Eis abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 3000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und die Absorption des Überstandes wurde bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Alle vorgenannten Tätigkeiten mit Ausnahme der Inkubation wurden unter Eiskühlung durchgeführt.
  • Die unter Verwendung von L4, L4L4, K4 und K2 als Testsubstanzen erhaltenen Ergebnisse sind in 11 dargestellt. Die unter Verwendung von L4 und G4L4 als Testsubstanzen erhaltenen Ergebnisse sind in 12 dargestellt.
  • L4L4, K4 und G4L4 unterdrückten die O2 –-Bildung durch Neutrophile induziert durch FMLP-Stimulierung in einer Konzentration von 0,01 bis 1 mg/mL erheblich. Sie zeigten relative Inhibierungsraten verglichen mit der Blindprobe von 50,6%, 44,7% und 57,1%, respektive, Bei einer Konzentration von 1 mg/mL. L4 und K2 zeigten im Wesentlichen keine O2 – -Bildung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass L4L4, K4 und G4L4 entzündungshemmende Wirkung zeigen, indem sie die Bildung aktiven Sauerstoffs durch Neutrophile unterdrücken.
  • In diesem Test zeigte K4 den Unterdrückungseffekt, aber L4 nicht, trotz der Tatsache, dass L4 und K4 die selbe Ladung, empirische Formel haben und aus den selben Sacchariden bestehen. Darüber hinaus zeigte L4L4 einen Unterdrückungseffekt, aber K4, das ein konstituierendes Saccharid von L4K4 ist, zeigte den Effekt nicht. Die Tatsache, dass L4L4, K4 und G4L4 die O2 –-Bildung durch Neutrophile bei Meerschweinchen, induziert durch FMLP (N-Formyl-Met-Leu-Phe)-Stimulierung signifikant unterdrückten, legt nahe, dass die K4-Struktur für die Ausübung dieser Aktivität wichtig ist. Weiterhin wurde vorgeschlagen, weil K2 den Unterdrückungseffekt nicht zeigte, dass L4L4, K4 und G4L4, die die K4-Struktur besitzen, die Aktivität ausüben könnten, indem sie das Reizübertragungssystem, das das GTP-bindende Protein und Phospholipase C induziert, inhibieren, oder direkt im Hinblick auf die FMLP-Rezeptoren im Wettbewerb stehen.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids, das durch die folgende allgemeine Formel (3) dargestellt ist:
    Figure 00550001
    wobei R10 und R11 jeder unabhängig -SO3M darstellen, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, Ac eine Acetylgruppe darstellt, R12 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerinrest, einen O-Alkylglycerinrest, einen O-Acylglycerinrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Ausführen der Ausbildung der glykosidischen Bindung zwischen einem Monosaccharid, das durch die folgende allgemeine Formel (1) dargestellt ist:
    Figure 00550002
    wobei R1 und R2 jeder unabhängig eine Aralkylgruppe darstellen, R3 eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe darstellt, R4 eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe darstellt und R5 eine abgehende Gruppe darstellt, und einem Monosaccharid, das durch die folgende allgemeine Formel (2) dargestellt ist:
    Figure 00560001
    wobei R6 und R8 jeder unabhängig eine Aralkylgruppe darstellen, R7 eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe darstellt, R9 eine Aralkylgruppe, eine Alkylgruppe, einen Glycerinrest, einen O-Alkylglycerinrest, einen O-Acylglycerinrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt, und Ersetzen jedes R3 und R7 durch ein Wasserstoffatom, und anschließend Ersetzen des Wasserstoffatoms durch -SO3M.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die allgemeinen Formeln (1) und (2) entsprechend durch die folgenden Formeln (4) bzw. (5) dargestellt sind:
    Figure 00560002
    wobei Bn eine Benzylgruppe darstellt, R13 eine Acetylgruppe oder eine Lävulinoylgruppe darstellt und Pht eine Phthaloylgruppe darstellt und X ein Halogenatom darstellt, und
    Figure 00560003
    wobei Bn eine Benzylgruppe darstellt, R14 eine Benzylgruppe, eine Alkylgruppe, einen Glycerinrest, einen O-Alkylglycerinrest, einen O-Acylglycerinrest, einen Choles terinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt, Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt und Piv eine Pivaloylgruppe darstellt.
  3. Oligosaccharid, das durch die folgende allgemeine Formel (13) dargestellt ist:
    Figure 00570001
    wobei R16 und R17 jeder unabhängig -SO3M darstellen, wobei M ein Proton oder ein einwertiges Kation darstellt, Ac eine Acetylgruppe darstellt, R18 ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, einen Glycerinrest, einen O-Alkylglycerinrest, einen O-Acylglycerinrest, einen Cholesterinrest, eine Cholestanylgruppe, einen Ceramidrest, einen Phospholipidrest, einen Biotinrest oder einen Peptidrest darstellt und Z ein Sauerstoffatom oder -NHCO- darstellt.
  4. Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Z ein Sauerstoffatom ist.
  5. Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Z ein Sauerstoffatom ist und R18 ein Wasserstoffatom ist.
  6. Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Z ein Sauerstoffatom ist und R18 eine Alkylgruppe ist.
  7. Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Z ein Sauerstoffatom ist und R18 ein O-Alkylglycerinrest ist.
  8. Oligosaccharid nach Anspruch 3, wobei Z ein Sauerstoffatom ist und R18 eine Cholestanylgruppe ist.
  9. Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 3 bis 8 oder ein pharmazeutisch verwertbares Salz davon zur Verwendung als ein Medikament.
  10. Verwendung eines Oligosaccharids nach einem der Ansprüche 3 bis 8 oder eines pharmazeutisch verwertbaren Salzes bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Allergien.
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