DE60008319T2

DE60008319T2 - IL-12 Produktionsinhibitor

Info

Publication number: DE60008319T2
Application number: DE60008319T
Authority: DE
Inventors: Akira Iruma-shi Asari; Hitoshi Musashimurayama-shi Kurihara; Heping Xu; Satoshi Masashimurayama-shi Miyauchi; Toshikazu Minamisawa
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: EP1074260B1; EP1074260A1; US6436911B1; DE60008319D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Interleukin-12(IL-12)-Bildungs-Inhibitor und ein als einen aktiven Wirkstoff für den IL-12-Bildungs-Inhibitor verwendbares Keratan-Sulfat-Oligosaccharid-Derivat.
Das IL-12 ist ein aus einem 70 kDa Glycoprotein (p70) zusammengesetztes Cytokin, welches aus zwei verknüpften Polypeptid-Ketten von 35 kDa und 40 kDa zusammengesetzt ist, und es ist bekannt, dass es eine entscheidende Rolle in der Regulation der Immunfunktionen in lebenden Körpern spielt (Shimpei Kasakura Ed., „Cytokine", Second Edition, Revised New Edition, pp. 207–225, Nihon Igakukan, June 29, 1997).
Es ist auch bekannt, dass IL-12 die Differenzierung einer T-Helferzell-Typ-1-Subpopulation (Th1) unter den T-Zellen induziert und infolgedessen den mit der Th1-Aktivierung assoziierten Ablauf von pathologischen Zuständen bei Autoimmunerkrankungen beschleunigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Keratan-Sulfat-Oligosaccharid mit einem Acylester in einer Hydroxylgruppe und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung bereitzustellen, die aus der Gruppe besteht, die aus der Kontaktdermatitis, der autoimmunen Uveitis/Retinitis, der allergischen cerebrospinalen Meningitis, dem insulinabhängigen Diabetes Mellitus, dem Diabetes Mellitus, dem Morbus Hashimoto, der multiplen Sklerose, der rheumatoiden Arthritis, dem Sjögren's Syndrom, dem Morbus Crohn, der Colitis Ulcerosa, der Sarcoidose, der Psoriasis, der Lipopolysaccharid induzierten Lebernekrose, der rapid progressiven Glomerulonephritis und dem systemischen Lupus Erythematodes. Dieses funktioniert durch das Inhibieren der IL-12-Bildlung ausgewählt ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Wirkstoff von dem IL-12-Bildungs-Inhibitor bereitzustellen.
Die vorliegenden Erfinder stellten fest, dass Keratan-Sulfat-Oligosaccharide und Derivate davon eine Wirkung aufwiesen, um die IL-12-Bildlung zu inhibieren, und vollendeten so die vorliegende Erfindung.
Das in dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung verwendete Keratan-Sulfat-Oligosaccharid umfasst vorzugsweise mindestens eine sich wiederholende Einheit von einem der beiden Disaccharide der folgenden Formeln:
Gal(6S)-GlcNAc(6S) und Gal(6S)-GlcNAc,
wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, und – eine glycosidische Bindung darstellt.
Noch bevorzugter ist das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid aus jenen ausgewählt, die durch die Formeln (1) bis (3) dargestellt sind:
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (2)
Gal(6S)β1-4GlcNAc (3),
wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, β1-4 eine β-1,4-glycosidische Bindung darstellt und β1-3 eine β-1,3-glycosidische Bindung darstellt.
Das in dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung verwendete Keratan-Sulfat-Oligosaccharid-Derivat ist ein Acylester an der Hydroxylgruppe eines Keratan-Sulfat-Oligosaccharids und ist noch bevorzugter durch die Formel (4) dargestellt:
wobei X¹ bis X⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe darstellt, vorausgesetzt, dass mindestens eines der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe ist, Y ein Wasserstoffatom oder SO₃M ist, M unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges bis dreiwertiges Metall oder eine einwertige bis dreiwertige Base ist, die ionisiert sein kann, und die durch eine gewellte Linie dargestellte Bindung eine Bindung in einer α-Glycosid-Konfiguration oder einer β-Glycosid-Konfiguration darstellt.
In der Formel (4) stellt jedes der X¹ bis X⁵ bevorzugt eine Acylgruppe dar, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, und M ist ein Alkalimetall.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Keratan-Sulfat-Oligosaccharid-Derivat bereit, welches durch die obige Formel (4) dargestellt ist (im Weiteren auch als das Derivat der vorliegenden Erfindung bezeichnet).
Es ist in dem Derivat der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass jedes der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe darstellt, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, und M in der Formel (4) ein Alkalimetall ist.
Der IL-12-Bildungs-Inhibitor ist als ein Reagenz zur Untersuchung der Funktionen von IL-12 in der Regulation von Immunfunktionen in lebenden Körpern verwendbar. Es kann auch als ein Therapeutikum oder Prophylaktikum für Erkrankungen verwendet werden, dessen pathologische Zustände durch IL-12 beschleunigt werden. Der IL-12-Bildungs-Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist sehr sicher, da als sein Material aus der Natur stammende Substanzen verwendet werden.
KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Anzahl von weißen Blutzellen (WBZ) im Blut von MRL-Ipr-Ipr-Mäusen nach Verabreichung von L4.
2 zeigt den IL-12-Spiegel im Plasma von MRL-Ipr/Ipr-Mäusen nach Verabreichung von L4.
3 zeigt die Anzahl von WBZ im Blut von MRL-Ipr/Ipr-Mäusen nach Verabreichung von L4.
4 zeigt die Plasma-CRE und -BUN-Spiegel von MRL-Ipr/Ipr-Mäusen nach Verabreichung von L4.
5 zeigt den IL-12-Spiegel im Plasma von MRL-Ipr/Ipr-Mäusen nach Verabreichung von L4.
6 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus acht Wochen und 39 Wochen alten MRL-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
7 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus C57BL6/7-Mäusen in peritonealen Makrophagen.
8 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus MRL-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
9 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus MRL-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
10 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus C57BL6/7-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
11 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus MRL-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
12 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus MRL-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
13 zeigt den inhibitorischen Effekt von L4 auf die IL-12-p70-Bildung in aus menschlichen Patienten mit chronischem Gelenkrheumatismus isolierten Gelenkzellen.
14 zeigt den inhibitorischen Effekt von L3 auf die II-12-p70-Bildung in aus C3H/HeN-Mäusen isolierten peritonealen Makrophagen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das in dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung verwendete „Keratan-Sulfat-Oligosaccharid" sind Acylester einer Hydroxygruppe eines Keratan-Sulfat-Oligosaccharids, welche mindestens die Grundstruktur des Keratan-Sulfats (eine Struktur, in der ein Galaktose-Rest oder ein Galaktose-6-O-Sulfat-Rest und ein N-Acetylglucosamin-Rest oder ein N-Acetylglucosamin-6-O-Sulfat-Rest abwechselnd durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind) enthält. Das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid kann zum Beispiel ein durch Abbauen eines Keratan-Sulfats erhaltenes Produkt und ein durch Sulfatieren eines Oligosaccharids erhaltenes Produkt sein, welches eine oder mehrere verbundene Einheiten eines N-Acetyllactosamins umfasst.
Unter solchen Keratan-Sulfat-Oligosaccchariden wird ein durch Abbauen von Keratan-Sulfat erhaltenes Oligosaccharid (Oligosaccharid wird von dem Keratan-Sulfat abgeleitet) bevorzugt. Ein durch Abbauen von Keratan-Sulfat mit einem Keratan-Sulfat abbauenden Enzym des Endo-β-N-Acetylglucosaminidase-Typs erhaltenes Produkt wird mehr bevorzugt.
Dieses Keratan-Sulfat-Oligosaccharid kann einen Sialinsäure-Rest und/oder einen Fucoserest enthalten. Ein Sialinsäure-Rest ist üblicherweise durch eine α-2,3-oder eine α-2,6-glycosidische Bindung an den Galaktose-Rest gebunden, und ein Fucoserest ist durch eine α-1,3-glycosidische Bindung an einen N-Acetylglucosamin-Rest gebunden.
Das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid ist üblicherweise ein Oligosaccharid, das 2 bis 10 Saccharide enthält und einen N-Acetylglucosamin-Rest an dem reduzierenden Ende aufweist. Es spielt keine Rolle, ob die Hydroxylgruppe an der 6-Position des N-Acetylglucosamin-Rests sulfatiert ist oder nicht, aber die Hydroxylgruppe an der 6-Position des Galaktose-Rests ist vorzugsweise sulfatiert.
Noch bevorzugter enthält das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid mindestens eine sich wiederholende Einheit eines Disaccharids, das durch Gal(6S)-GlcNAc(6S) oder Gal(6S)-GlcNAc dargestellt ist, wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, und – eine glycosidische Bindung darstellt.
Das oben erwähnte Keratan-Sulfat-Oligosaccharid wird des Weiteren bevorzugt aus einem Oligosaccharid, das durch die Formel (1) (im Weiteren auch als L4L4 bezeichnet) dargestellt ist, einem Oligosaccharid, das durch die Formel (2) (im Weiteren auch als L4 bezeichnet) dargestellt ist, und einem Oligosaccharid, das durch die Formel (3) (im Weiteren auch als L3 bezeichnet) dargestellt ist, ausgewählt:
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (1)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (2)
Gal(6S)β1-4GlcNAc (3),
wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, β1-4 eine β-1,4-glycosidische Bindung darstellt und β1-3 eine β-1,3-glycosidische Bindung darstellt.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Keratan-Sulfat-Oligosaccharid schließt jene ein, die ionisiert oder protoniert sind. Sie schließen auch pharmazeutisch zulässige Salze des Keratan-Sulfat-Oligosaccharids ein.
In der vorliegenden Beschreibung ist mindestens ein Wasserstoffatom der Hydroxylgruppen in dem Keratan-Sulfat-Oligosaccharid (vorzugsweise 10% oder mehr aller Hydroxylgruppen) durch eine Acylgruppe, vorzugsweise durch eine O-Acylgruppe (teilweise oder komplett O-acylierte Derivate), ersetzt, und es schließt pharmazeutisch zulässige Salze davon ein.
Die pharmazeutisch zulässigen Salze schließen zum Beispiel pharmazeutisch zulässige Salze unter den Alkalimetallsalzen, wie zum Beispiel Natriumsalze, Kaliumsalze und Lithiumsalze, den Erdalkalimetallsalzen, wie zum Beispiel Kalziumsalze, den Salzen mit einer anorganischen Base, wie zum Beispiel Ammoniumsalze und den Salzen mit einer organischen Base, wie zum Beispiel Diethanolamin-Salze, Cyclohexylamin-Salze und Aminosäuresalze, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Acylgruppe in einem Keratan-Sulfat-Oligosaccharid, welche gegen ein Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe ersetzt wird, ist vorzugsweise eine Acylgruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, noch bevorzugter ist sie eine 1 bis 10 Koh lenstoffatome aufweisende aliphatische oder aromatische Acylgruppe, zumindest eine Alkanoyl-Gruppe oder eine Aroyl-Gruppe, welche ein Heteroatom enthalten können. Beispiele davon enthalten Gruppen, wie zum Beispiel Acetyl, Chloracetyl, Dichloracetyl, Trifluoracetyl, Methoxyacetyl, Propionyl, n-Butyryl, (E)-2-Methylbutenyl, Isobutyryl, Pentanyl, Benzyl, o-(Dibrommethyl)-Benzyl, o-(Methoxycarbonyl)-benzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl, p-Toluyl, p-Anisyl, p-Chlorbenzyl und p-Nitrobenyzl. Wenn das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid eine Vielzahl von Acylgruppen aufweist, können diese Acylgruppen dieselben oder unterschiedlich voneinander sein.
Wenn das Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe an der 1-Position an dem reduzierenden terminalen Saccharid des Keratan-Sulfat-Oligosaccharids gegen eine Acylgruppe ausgetauscht ist, kann die Konfiguration der O-Acyl-Gruppe in einer α-glycosidischen Konfiguration oder einer β-glycosidischer Konfiguration, jedoch vorzugsweise in einer α-glycosidischen Konfiguration, vorliegen.
Die acetylierten Keratan-Sulfat-Oligosaccharide weisen Vorteile auf, wie zum Beispiel eine verbesserte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und Lipiden, eine gesteigerte Permeabilität für biologische Membranen und eine gesteigerte Absorption im gastrointestinalen Trakt, wenn sie oral verabreicht werden.
In dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid-Derivat bevorzugt eines, das durch die obige Formel (4) dargestellt ist. In der Formel (4) ist M unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges bis dreiwertiges Metallatom oder eine einwertige bis dreiwertige Base, die ionisiert sein kann. Bei Vorliegen einer Ionisierung wird die Sulfonsäuregruppe zu einem Negativ-Ion. Noch bevorzugter stellen alle X¹ bis X⁵ eine Acetylgruppe dar. Ein durch die folgende Formel (5) dargestelltes Derivat ist besonders bevorzugt.
wobei Ac eine Acetylgruppe darstellt, Y ein Wasserstoffatom oder SO₃Na darstellt, und die durch eine gewellte Linie dargestellte Bindung eine Bindung in einer α-Glycosid-Konfiguration oder β-Glycosid-Konfiguration darstellt.
Das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid oder ein Derivat davon, welche in dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können eine Einzelsubstanz oder eine Substanzenmischung sein. Es kann zum Beispiel ein gereinigtes Produkt einer Substanz, die eine α-Glycosid-Konfiguration an der Bindung zeigt, die durch eine gewellte Linie in der obigen Formel (5) dargestellt ist, ein gereinigtes Produkt einer Substanz, die eine β-Glycosid-Konfiguration an dieser Bindung zeigt, oder eine Mischung aus diesen Substanzen sein.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Keratan-Sulfat-Oligosaccharid kann durch das Ermöglichen eines Keratan-Sulfat-Abbau-Enzyms des Endo-β-N-Acetylglucosaminidase-Typs, zum Beispiel der von Bacillus-Bakterien erhaltenen Keratanase (2) (japanische Patentoffenlegung (Kokai) No. 2-57182/1990) oder eines von Bacillus circulans KsT202-Stamm erhaltenen Keratan-Sulfat-Abbau-Enzyms (WO96/16166), um zum Beispiel auf eine Puffer-Lösung des Keratan-Sulfats, vorzugsweise auf hoch sulfatiertes Keratan-Sulfat, zu wirken, um das Keratan-Sulfat abzubauen, und dem folgenden Fraktionieren des erhaltenen Abbauprodukts, erhalten werden. Die erhaltenen Oligosaccharide können mittels gewöhnlicher Trennungs- und Reinigungs-Verfahren, wie zum Beispiel der Ethanolpräzipitation, der Gelfiltration und der Anionenaustauscherchromatographie, getrennt und gereinigt werden, um ein Ziel-Oligosaccharid zu erhalten. Beispiele dieser Präparationsverfahren sind in der internationalen Veröffentlichung WO96/16973 beschrieben. Das als Rohmaterial verwendete Keratan-Sulfat ist hauptsächlich aus sich wiederholenden Strukturen der Disaccharide der Galaktose oder des Galaktose-6-O-Sulfats und des N-Acetylglucosamins oder des N-Acetylglucoamin-6-O-Sulfats aufgebaut. Obwohl der Sulfatgehalt in Abhängigkeit von den Tierspezies, den Organen usw. variiert, können üblicherweise jene verwendet werden, die aus den Rohmaterialen des Knorpels, des Knochens, der Cornea usw. von Knorpelfischen, beispielsweise eines Hais, von Säugetieren, beispielsweise eines Wals und eines Rindes, präpariert werden.
Das als Rohmaterial verwendete Keratan-Sulfat ist nicht besonders eingeschränkt und jenes, das üblicherweise verfügbar ist, kann verwendet werden. Hoch sulfatiertes Keratan-Sulfat wird jedoch bevorzugt verwendet, wobei die Galaktose- Reste, die konstitutive Saccharide sind, sulfatiert sind, (hoch sulfatiertes Keratan-Sulfat, das 1,5 bis 2 Sulfatgruppen pro konstitutivem Disaccharid enthält, kann als ein Keratan-Polysulfat bezeichnet werden). Die Sulfatgruppe des Galaktose-Rests ist bevorzugt an der 6-Position lokalisiert. Ein solch hoch sulfatiertes Keratan-Sulfat kann auch zum Beispiel aus einem Proteoglycan eines Knorpelfisches, wie zum Beispiel einem Hai, erhalten werden. Auch jene, die kommerziell verfügbar sind, können verwendet werden.
Ein wie oben beschriebenes erhaltenes Keratan-Sulfat-Oligosaccharid, von dem der Sulfatgruppengehalt entsprechend einem bekannten Verfahren zum Desulfieren oder Sulfatieren von Zuckerketten eingestellt ist, kann als das in der vorliegenden Erfindung verwendete Keratan-Sulfat-Oligosaccharid verwendet werden.
Die Substitution einer Acylgruppe gegen ein Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe in dem Keratan-Sulfat-Oligosaccarid kann mittels gewöhnlicher Acylierungs-Verfahren durchgeführt werden, die für den Schutz der Hydroxylgruppen von Sacchariden angewandt werden. Die Acylgruppe kann zum Beispiel in einer konventionellen Weise in eine geeigneten Reaktionslösung (Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran, N,N-Dimethylformamid (DMF), Acetonitril, Chloroform, Dichlormethan, Methanol, Ethanol, Wasser, Mischungen davon usw.) eingeführt werden, indem einem Keratan-Sulfat-Oligosaccharid ermöglicht wird, mit einem reaktiven Derivat der einzuführenden Acylgruppe zu reagieren (ein Carboxylsäure-Anhydrid, das der Acylgruppe entspricht (zum Beispiel ein Säure-Anhydrid, wenn eine Acetylgruppe eingeführt wird, oder ein Propion-Anhydrid, wenn eine Propanylgruppe eingeführt wird) und ein Acylhalid, das der Acylgruppe oder dergleichen entspricht). Die Reaktion kann, wenn es erforderlich ist, in der Gegenwart eines Basenkatalysators, wie zum Beispiel Pyridin, durchgeführt werden.
Wenn es erforderlich ist, kann der Grad der Acylierung eingestellt werden. Diese Einstellung kann durch Ausführen einer partiellen Acylierung in dem oben genannten Acylierungs-Verfahren oder einem partiellen Entfernen der Acylgruppen von dem acylierten Keratan-Sulfat-Oligosaccharid erreicht werden.
Die Acylgruppen können durch eine Hydrolyse unter Verwendung von Methanolammonium, konzentriertem Salmiakgeist, Natriummethoxid, Natriumethoxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dergleichen entfernt werden. Das erhaltene De- Derivat kann mittels der Reversen-Phase-Hochleistungsflüssigkeit-Chromatographie oder dergleichen gereinigt werden.
Das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid oder ein Derivat davon, das ein Wirkstoff für den Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist, wird bevorzugt bis zu einem solchen Grad gereinigt, dass es als ein Arzneimittel verwendet werden kann, und keinerlei Substanzen enthält, die nicht als Inhalt in Arzneimitteln zugelassen sind.
Da der Inhibitor der vorliegenden Erfindung effektiv für das Inhibieren der IL-12-Bildung ist, sind Erkrankungen, bei denen er anwendbar ist, nicht eingeschränkt, solange die Inhibierung der IL-12-Bildung der Zweck der Verabreichung ist. Beispiele für Erkrankungen gegen die die Inhibierung der IL-12-Bildung der Zweck der Verabreichung ist. Beispiele für Erkrankungen, gegen die die Inhibierung der IL-12-Bildung effektiv ist, schließen Erkrankungen ein, die durch die Aktivierung von Th1 verursacht werden, bei denen das IL-12 das Fortschreiten der Erkrankungen beschleunigt. Solche Erkrankungen schließen speziell die Kontaktdermatitis, die autoimmune Uveitis/Retinitis, die allergische cerebrospinale Meningitis, den insulinabhängigen Diabetes Mellitus, den Diabetes Mellitus, den Morbus Hashimoto, die multiple Sklerose, die rheumatoide Arthritis, das Sjögren's Syndrom, den Morbus Crohn, die Colitis Ulcerosa, die Sarcoidose, die Psoriasis, die Lipopolysaccharid induzierte Lebernekrose, die rapid progressive Glomerulonephritis und den systemischen Lupus Erythematodes usw. ein. Folglich umfasst der Inhibitor der vorliegenden Erfindung auch ein Konzept eines Agens zur Behandlung dieser Erkrankungen.
Der Inhibitor der vorliegenden Erfindung kann nicht nur mit dem Ziel einer echten therapeutischen Behandlung, sondern auch mit einem Präventionsziel, einer Erhaltung (der Prävention vor Verschlechterung), einer Linderung (der Verbesserung der Zustände) von Erkrankungen usw. verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Dosierungsform angemessen in Abhängigkeit von der Art und dem Fortschritt der Erkrankungen und dem Verabreichungsweg usw. ausgewählt werden.
Der Inhibitor der vorliegenden Erfindung kann durch Injektion (intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan, intraperitoneal usw.) oder via nasalen, oralen oder perkutanen Weg oder durch Inhalation oder dergleichen verabreicht werden. Er kann gemäß diesen Verabreichungswegen angemessen ausgebildet sein. Die Dosierungsformen, die ausgewählt werden, sind nicht besonders eingeschränkt und können aus einem weiten Bereich ausgewählt werden, der zum Beispiel Injektionen (eine Lösung, eine Suspension, eine Emulsion, einen Feststoff, der vor Verwendung aufgelöst werden kann, usw.), Tabletten, Kapseln, Granulate, Pulver, Flüssigkeiten, Liposomen umkapselte Arzneimittel, Salben, Pflaster, Lotionen, Pasten, Klappen, Gelen, Zäpfchen, externe Pulver, Sprays, Inhalationspulver usw. einschließt. Zur Herstellung dieser Rezepturen können auch Ingredienzien, die für gewöhnliche Arzneimittel (pharmazeutisch zugelassene Träger) verwendet werden, wie zum Beispiel konventionelle Arzneistoffträger, Stabilisatoren, Bindemittel, Gleitmittel, Emulgatoren, osmotische Regulatoren; pH-Regulatoren, Färbemittel und sich auflösende Agenzien verwendet werden.
Die Rezepturmenge des als ein Wirkstoff in dem Inhibitor der vorliegenden Erfindung verwendeten Keratan-Sulfat-Oligosaccharids oder eines Derivats davon und dessen Dosis sind nicht besonders eingeschränkt, sollten aber individuell abhängig von dem Verabreichungsweg, der Verabreichungsform, dem Zweck der Verabreichung und den spezifischen Symptomen, dem Körpergewicht, dem Alter, dem Geschlecht des Patienten usw. bestimmt werden. Als eine klinische Dosis für das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid ist eine Einfachdosis von 50 bis 5000 mg pro Tag für einen Erwachsenen beispielhaft erläutert.
Die Sicherheit des Keratan-Sulfat-Oligosaccharids, das als ein Wirkstoff des Inhibitors der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in der internationalen Veröffentlichung WO 96/16973 offenbart. Die Sicherheit der Derivate davon kann aus den später beschriebenen Beispielen geschlossen werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird noch spezieller in Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt werden.
Beispiel 1: Synthese des acetylierten L4's
Das Dinatriumsalz des L4's (hergestellt durch das in der internationalen Veröffentlichung WO 96/16973 beschriebene Verfahren) wurde in deionisiertem Wasser aufgelöst, durch eine Kation-Austauscher-Harz-Säule (Dowex 50W-X4, H⁺-Form: Dow Chemical) gegeben, um es in eine freie Säureform zu bringen, und sofort mit Eis gekühlt. Das Produkt wurde kontinuierlich unter Eiskühlung gehalten und Tetra-n-Butylammonium-Hydroxid, das 10-fach mit deionisiertem Wasser verdünnt ist, wurde tropfenweise in einer Menge von 1.1 Äquivalenten für die L4-Sulfat-Gruppen dazu gegeben. Nach dem Rühren für etwa eine Stunde wurde die Lösung unter vermindertem Druck bei einer niedrigen Temperatur konzentriert und durch eine Sephadex-LH20-Säule (Pharmacia) gegeben, um grob gereinigt zu werden. Die erhaltene wässrige Lösung wurde lyophilisiert, um das L4-Di-(Tetra-n-Butylammonium)-Salz zu erhalten.
Das lyophilisierte L4-Di-(Tetra-n-Butylammonium)-Salz wurde in Pyridin in einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst und ein saures Anhydrid wurde tropfenweise in einer Menge von 1,5 Äquivalenten mit Hinblick auf die gesamten Hydroxylgruppen in dem L4 bei Raumtemperatur unter Rühren dazu gegeben. Nach dem Rühren für 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung bei einer niedrigen Temperatur unter vermindertem Druck überdestilliert und der Rest wurde mehrfach unter Verwendung eines Methanol/Diethylether-Lösungsmittel-Systems repräzipitiert, um ein rohes acetyliertes L4-Di-(Tetra-n-Butylammonium)-Salz zu erhalten. Dieses Salz wurde mittels Anion-Austauscher-Säulen-Chromatographie (LiChroprep NH₂: Merck) in ein Natriumsalz überführt, mittels Gel-Filtrations-Chromatographie (Cellulofine GCL-25: erhältlich von Seikagaku Corporation) gereinigt und dann lyophilisiert, um ein Penta-O-acetyliertes L4 (im Weiteren auch als AcL4 bezeichnet) zu erhalten, welches durch die Formel (5) als eine Mischung der Verbindungen in einer α-Glcyosid-Konfiguration und einer β-Glycosid-Konfiguration dargestellt ist. Die Verbindungen in der α-Glcyosid-Konfiguration und der β-Glycosid-Konfiguration wurden mittels einer Anion-Austauscher-Chromatographie (LiChroprep RP-18: Merck) getrennt, um die Verbindung in der α-Glcyosid-Konfiguration zu erhalten. Das ¹H-NMR-Spektrum und das ¹³C-NMR(DEPT)-Spektrum des AcL4's (in der α-Glycosid-Konfiguration) sind unten gezeigt.
¹H-NMR-Spektrum
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, TSP (δH = 0,00 ppm))
δ_H = 1,97 ppm (s, 3H, COCH₃), 2,02 (s, 3H, COCH₃),
2,17 (s, 3H, COCH₃), 2,18 (s, 3H, COCH₃), 2,217 (s, 3H, COCH₃), 2,220 (s, 3H, COCH₃), 4,07–4,17 (m, 4H, H-4A, H-5A, H-6B, H-6'B), 4,22–4,28 (m, 3H, H-5B, H- 6A, H-6'A), 4,40–4,44 (dd, 1H, H-2A), 4,91–4,93 (d, 1H, H-1B), 5,00–5,04 (dd, 1H, H-2B), 5,20–5,23 (dd, 1H, H-3B), 5,26–5,31 (dd, 1H, H-3A), 5,485–5,493 (d, 1H, H-4B), 6,09–6,10 (d, 1H, H-1A)
¹³C-NMR-(DEPT)-Spektrum
¹³C-NMR (100 MHz, D₂O, TSP (δ_C = 0,00 ppm))
δ_C = 22,86 ppm (2C, OCOCH₃), 23,04 (OCOCH₃), 23,08 (OCOCH₃), 23,43 (OCOCH₃), 24,47 (NHCOOH₃), 53,09 (C-2A), 67,98 (C-6B), 68,36 (C-6A), 70,61 (C-4B), 72,62 (C-2B), 73,34 (C-5B), 73,56 (2C, C-3A, C-5A), 74,27 (C-3B), 77,80 (C-4A), 93,38 (C-1A), 102,96 (C-1B)
„A" stellt einen N-Acetylglucosamin-Rest dar, und „B" stellt einen Galaktose-Rest dar.
Das Dinatriumsalz des L4's (5 g) wurde in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Amberlite-IR-120 (Sigma-Aldrich)-Säule (H⁺-Form) gegeben.
Der pH der vereinigten Lösung der sauren Fraktionen wurde durch Zugabe von Pyridin auf 6,5 eingestellt, dann evaporiert, um den Überschuss von Pyridin zu entfernen, und lyophilisiert, um das L4-Dipyridinium-Salz zu erhalten.
Das in den folgenden Beispielen verwendete L4 (Dinatriumsalz) und das L4L4 (Tetranatriumsalz) wurden durch das in der internationalen Veröffentlichung WO96/16973 beschriebene Verfahren präpariert. Das verwendete L3 (Mononatriumsalz) wurde mittels des folgenden Verfahrens präpariert.
5 g eines Dipyridiniumsalzes des L4's wurde es ermöglicht, in einem Lösungsgemisch aus Acetylchlorid und Methanol für die Desulfierung zu reagieren. Die Lösung wurde nach der Reaktion auf eine mit destilliertem Wasser äquilibrierte Muromac-Säule (Muromachi Kagaku Kogyo, 3 × 21 cm) aufgetragen. Ein NaCl-Konzentrations-Gradient von 0 M (1 L) bis 2,0 M (1 L) wurde auf die Säule aufgetragen, und das Eluens wurde als 16-ml-Fraktionen gesammelt. Der Hexosegehalt jeder Eluens-Fraktion wurde gemessen, um die eluierte Position des partiell desulfatierten L4's zu bestimmen.
Die Fraktionen, die das partiell desulfatierte L4 enthalten, wurden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und mittels einer mit destilliertem Wasser äquilibrierten Sephadex-G-10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) deionisiert. Die deionisierte Präparation wurde lyophilisiert, dann in 100 mM Citrat/Phosphat- Puffer gelöst, der 45 Einheiten der β-Galaktosidase (Seikagaku Corporation) enthält, und für 45 Stunden bei 37°C inkubiert, um das enthaltene Galβ1-4GlcNAc (6S) abzubauen.
Die Reaktionslösung wurde auf eine mit destilliertem Wasser äquilibrierte Muromac-Säule (3 × 32 cm) aufgetragen. Ein NaCl-Konzentrations-Gradient von 0 M (1 L) bis 1,5 M (1 L) wurde auf die Säule aufgetragen und das Eluens wurde als 19-ml-Fraktionen gesammelt. Der Hexosegehalt in jeder Eluens-Fraktion wurde gemessen, um die Position der L3-Elution zu bestimmen.
Die Fraktionen, die L3 enthalten, wurden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und durch die Verwendung einer Sephadex-G-10-Säule deionisiert. Was die deionisierte L3-Lösung betrifft, wurde der Salz-Austausch durchgeführt, um ein Natriumsalz durch Verwendung einer Dowex-59wx4-Säule (Dow Chemical) zu erhalten, und die Lösung wurde wieder auf eine Muromac-Säule (2,2 × 52 cm) aufgetragen. Ein NaCl-Konzentrations-Gradient von 0 M (1 L) bis 0,75 M (1 L) wurde auf die Säule aufgetragen und das Eluens wurde als 15-ml-Fraktionen gesammelt. Die Eluens-Fraktionen wurden mittels kapillarer Elektrophorese analysiert, um die Position der L3-Elution zu bestimmen.
Nachdem die Fraktionen, die das L3 enthalten, vereinigt wurden und NaCl unter Verwendung einer Elektrodialyse-Apparatur (Micro Acilyzer, Asahi-kasei) entfernt wurde, wurde die Lösung unter vermindertem Druck auf 5 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde in einer Menge von 400 μl (etwa 20 mg des L3's) mehrere Male auf eine mit 3 M NaCl äquilibrierte DAISO-Pak-Säule für die Hochleistungsflüssigkeit-Chromatographie (Daiso, 2 × 50 cm) aufgetragen und mit 3 M NaCl eluiert.
Die eluierten Fraktionen, die das L3 enthalten, wurden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert, durch eine mit destilliertem Wasser äquilibrierte Sephadex-G-10-Säule (2,2 × 114 cm) deionisiert und dann ein weiteres Mal unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Ultra-Filter-Membran (MW Ausschluss: 10.000) gefiltert, um Endotoxine zu entfernen, lyophilisiert und in den folgenden Beispielen verwendet.
Beispiel 2: Durch die Verabreichung von L4 verursachte Senkung im Plasma-IL-12
Die Plasma-IL-12-Spiegel wurden unter Verwendung von mit und ohne L4 behandelten MRL-Ipr/Ipr-Mäusen untersucht. Die Makrophagen der MRL-Ipr/Ipr-Mäuse sind dafür bekannt, dass sie ausgeprägt IL-12 produzieren und ihr Serum-IL-12-Spiegel hoch ist (J. Exp. Med., 183, pp. 1447–1459 (1996)).
Die MRL-Ipr/Ipr-Mäuse, die C57BL/6-Mäuse und die ICR-Mäuse als Normalkontrollen wurden von der japanischen Charles River Co., Ltd. eingekauft und vor der Einteilung in Gruppen vorläufig für einige Wochen gehalten. Das Blut wurde aus dem orbitalen Plexus venosus gesammelt, und sie wurden nach ihrem Plasma-Creatinin-Spiegel (CRE) als einen ersten Marker zugeordnet, so dass dort kein Unterschied in dem Durchschnittswert und der Standardabweichung für den Creatinin-Spiegel unter den Gruppen sein würde. Sie wurden auch so gruppiert, dass dort soweit wie möglich kein Unterschied in dem Plasma-Stickstoff-Spiegel (BUN), der Anzahl der weißen Blutzellen (WBZ), der Thrombozyten-Anzahl (PLT) und dem Gewicht zwischen den Gruppen sein würde.
Die Gruppen wurden wie folgt eingesetzt: Tabelle 1

DW: destilliertes Wasser,
p. o.: orale Verabreichung,
i. n.: intranasale (Nasenschleimhaut) Verabreichung

Die Testsubstanzen wurden ab dem auf die Gruppierung folgenden Tag verabreicht. Jede der Testsubstanzen wurde in destilliertem Wasser in einer vorbestimmten Konzentration gelöst, um eine Lösung zum Verabreichen zu präparieren. Die Lösung wurde intermittierend dreimal pro Woche über vier Wochen (insgesamt 12 Dosen) verabreicht.
Die orale Verabreichung wurde in einer konventionellen Weise unter Verwendung einer 1-ml sterilisierten Einwegspritze und einer sterilisierten oralen Sonde durchgeführt. Die intranasale Verabreichung wurde in einer konventionellen Weise unter Verwendung einer Mikropipette und einem sterilisierten Span durchgeführt.
Die Beobachtung und die Messung wurden wie unten beschrieben durchgeführt.
(1) Allgemeinbefinden
Das Allgemeinbefinden und der Tod der Mäuse wurden jeden Tag ein oder mehrmals pro Tag während des Beobachtungszeitraums von 29 Tagen von Beginn der Verabreichung bis zur Autopsie untersucht.
(2) Körpergewicht
Das Körpergewicht wurde zur Zeit der Gruppierung, an dem ersten Tag der Verabreichung und danach jede Woche gemessen.
(3) Hämatologischer Test
Das Blut wurde aus dem orbitalen Plexus venosus zu der Zeit der Gruppierung und an dem Tag vor der Autopsie gesammelt. Die Anzahl der weißen Blutzellen(WBZ) wurde unter Verwendung eines automatischen Zytometers für vielfache Testeinheiten (Sysmex K-2000: Toa Medical Electronics) gemessen.
(4) Autopsie
Die Autopsie wurde ausgeführt, wenn die Endbeobachtung abgeschlossen war. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Abnormalitäten in den Hauptorganen wurde untersucht. Es wurden auch die Gewichte der Leber, der Niere, der Milz, dem Mesenterium und dem zervikalen Lymphknoten gemessen. Die Autop sie wurde genauso für die Mäuse durchgeführt, die während des Tests gestorben waren.
(5) Blut-Zytokin
Das Blut wurde aus dem orbitalen Plexus venosus zu der Zeit der Gruppierung und an dem Tag vor der Autopsie gesammelt. Die IL-12-Konzentration in dem Blutplasma wurde unter Verwendung eines IL-12-p70-ELISA-Systems (Endogen Inc.) gemessen.
Der Durchschnittswert und die Standardabweichung wurden für die oben erhaltenen gemessenen Werte berechnet und die statistische Signifikanz wurde mittels eines multiplen Vergleichstests nach Williams analysiert.
Die Ergebnisse waren wie folgt.
(1) Allgemeinbefinden
Es wurde keine Änderung beobachtet.
(2) Körpergewicht
Es wurde in allen Gruppen eine günstige Umwandlung beobachtet.
(3) Hämatologischer Test
In den mit der L4-Niedrigdosis verabreichten Gruppen wurde eine signifikante Inhibition des Anstiegs in den WBZ beobachtet. 1 zeigt die Ergebnisse der Gruppen 1, 2, 3 und 4 an dem Tag vor der Autopsie. In der Figur gibt * an, dass dort eine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 war.
(4) Autopsie
Es wurde keine Abnormalität beobachtet. Es wurde auch kein signifikanter Unterschied für die Organgewichte beobachtet.
(5) Blut-Zytokin
In den L4-verabreichten Gruppen wurde eine signifikante Inhibition der Erhöhung in IL-12 beobachtet. 2 zeigt die Ergebnisse der Gruppen 1, 2, 3 und 5 am Tag vor der Autopsie. In der Figur zeigen * und ** an, dass dort eine statistische Signifikanz in den Höhen von p < 0,05 und p < 0,01 war. Die Gruppe 5 (C57BL/6-Mäuse) stellt den Wert für die Normal-Mäuse dar.
Diese Ergebnisse zeigten, dass L4 eine Wirkung hatte, die IL-12-Bildung zu inhibieren.
Beispiel 3: Die Wirkung der Verabreichung von acetyliertem L4
9 Wochen alte MRL-Ipr/Ipr-Mäuse, C57BL/6-Mäuse und ICR-Mäuse wurden von der japanischen Charles River Co., Ltd. eingekauft und vor der Einteilung in Gruppen vorläufig für sechs Wochen gehalten. Die Gruppen wurden wie folgt eingesetzt. Tabelle 2

DW: destilliertes Wasser,
AcL4: acetyliertes L4,
p. o.: orale Verabreichung,
i. n.: intranasale (Nasenschleimhaut) Verabreichung

Jede der Testsubstanzen wurde in destilliertem Wasser in einer vorbestimmten Konzentration gelöst, um eine Lösung zu präparieren, die verabreicht wird Die Lösung wurde intermittierend dreimal pro Woche für sechs Wochen (insgesamt 19 Dosen) verabreicht. Die Beobachtung wurde für 45 Tage vom Beginn der Verabreichung bis zu der Autopsie durchgeführt. Die anderen Bedingungen und Verfahren waren die gleichen wie jene in Beispiel 2.
Die Ergebnisse waren wie folgt.
(1) Allgemeinbefinden
Es wurde keine Veränderung beobachtet.
(2) Körpergewicht
Es wurde in allen Gruppen eine günstige Umwandlung beobachtet.
(3) Hämatologischer Test
In der mit dem L4 intranasal verabreichten Gruppe und den mit dem acetylierten L4 verabreichten Gruppen wurde eine signifikante Inhibition des Anstiegs in den WBZ beobachtet. 3 zeigt die Ergebnisse der Gruppen 1 bis 6 an dem Tag vor der Autopsie. In der Figur zeigt * an, dass dort eine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 war.
(4) Biochemischer Bluttest
Das Blut wurde von dem orbitalen Plexus venosus gesammelt und der Plasma-Creatinin-Spiegel (CRE) und der Plasma-Harnstoff-Stickstoff-Spiegel (BUN) wurden unter Verwendung eines automatischen Analysegerätes für die klinische Chemie (COBAS MIRA S: Nippon Roche) zu der Zeit der Gruppierung und an dem Tag vor der Autopsie gemessen.
In den mit dem acetylierten L4 verabreichten Gruppen und den mit dem L4 verabreichten Gruppen wurde als ein Ergebnis eine signifikante Senkung in dem CRE und dem BUN beobachtet. 4 zeigt die Ergebnisse der Gruppen 1 bis 6 an dem Tag vor der Autopsie. In der Figur zeigen * und ** an, dass dort eine statistische Signifikanz in den Höhen von p < 0,05 beziehungsweise von p < 0,01 war.
Diese Ergebnisse zeigten, dass das L4 und das acetylierte L4 als ein Therapeutikum und als ein prophylaktisches Agens für Nierenerkrankungen (zum Beispiel der Nephritis (der Glomerulonephritis usw.), der Nephropathie (Lupos Nephropathie usw.)) nützlich waren.
(5) Autopsie
Es wurde keine Abnormalität beobachtet. Es wurde auch kein signifikanter Unterschied in den Organgewichten beobachtet.
(6) Blut-Zytokin
In der mit dem L4 intranasal verabreichten Gruppe wurde eine signifikante Inhibition des Anstiegs in dem IL-12 beobachtet. 5 zeigt die Ergebnisse der Gruppen 1, 5 und 6 an dem Tag vor der Autopsie. In der Figur zeigt ** an, dass dort eine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,01 war.
Außerdem wurde es mit diesen Ergebnissen bestätigt, dass L4 eine Wirkung hatte, die IL-12-Bildung zu inhibieren.
Beispiel 4: Die durch die L4-Behandlung verursachte Senkung in der IL-12-p70-Bildung in den Makrophagen
Fünf bis sieben Milliliter einer eiskalten Hank's abgestimmten Salzlösung wurden in die Bauchhöhlen von 8 bis 39 Wochen alten MRL-Ipr/Ipr-Mäusen injiziert und fünf Minuten später extrahiert, um residente peritoneale Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden über Nacht in einem RPMI-Medium, das in einer 96-Loch-Platte mit flachem Boden enthalten ist, bei 37°C in der Gegenwart von 5% Co₂ kultiviert. Nach der Kultivierung wurden nicht-adhärente Zellen entfernt und die adhärenten Zellen wurden als peritoneale Makrophagen für das Experiment verwendet.
Die Zellen wurden für 24 Stunden mit einem Lipopolysaccharid (LPS, List Biological Laboratories, Inc.) behandelt, um die IL-12-Bildung zu stimulieren. Die Kon zentration des IL-12-p70's in dem Zellkulturüberstand wurde unter Verwendung eines IL-12-p70-ELISA-Systems (Endogen, Inc.) gemessen, um die IL-12-Bildung zu evaluieren. Für die gemessenen Werte wurden der Mittelwert und die Standardabweichung erhalten. Sofern nichts, anderes genannt ist, wurde die statistische Signifikanz durch den multiplen Vergleichstest nach Williams untersucht.
Das Experiment wird unten erklärt werden.
(1) Gleichzeitige Behandlung mit LPS und L4
Die Stimulation wurde 24 Stunden in dem Medium, das LPS (100 ng/ml) und verschiedene Konzentrationen von L4 enthält, durchgeführt und dann wurde die IL-12-Bildung evaluiert.
(2) Behandlung mit L4 nach vorheriger Stimulation mit LPS
Die Makrophagen wurden mit 100 mg/ml des LPS's für 0, 2 oder 6 Stunden behandelt und dann wurde das Medium durch ein frisches Medium, das 1000 ng/ml des L4's enthält, oder nur durch ein frisches Medium (L4(–)) ersetzt (das durch die Vorbehandlung gebildete IL-12 wurde konsequent entfernt). 24 Stunden nach dem Ersetzen des Mediums wurde die IL-12-Bildung evaluiert.
(3) Stimulation mit LPS nach der Vorbehandlung mit L4
Als erstes wurden die Makrophagen mit L4 in verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden behandelt und das Medium wurde durch ein Medium ersetzt, das 100 ng/ml des LPS enthält. 24 Stunden nach dem Ersetzen des Mediums wurde die IL-12-Bildung evaluiert.
Die Ergebnisse der gleichzeitigen Behandlung mit LPS und L4 sind in 6 gezeigt. In den Gruppen, die mit 100 ng/ml LPS stimuliert wurden, zeigte das L4 einen dosisabhängigen inhibitorischen Effekt auf die IL-12-Bildung. Es wurde sowohl für die acht Wochen alten Mäuse als auch für die 39 Wochen alten Mäuse das gleiche Ergebnis erhalten (6). Das gleiche Ergebnis wurde auch erhalten, wenn andere Arten von Mäusen (C57BL/6-Mäuse) verwendet wurden (7). In den 6 und 7 zeigen * und ** an, dass dort eine statistische Signifikanz in den Höhen von p < 0,05 beziehungsweise von p < 0,01 war.
Die erhaltenen Ergebnisse, wenn Makrophagen mit L4 nach der vorhergehenden Stimulation mit LPS behandelt wurden, sind in 8 gezeigt. In der Figur zeigt # an, dass die Detektion nicht möglich war. Das * zeigt an, dass dort eine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 nach dem Student's t-Test war. Die Inhibition der IL-12-Bildung durch das L4 wurde auch in den mit dem LPS für zwei und sechs Stunden vorbehandelten Makrophagen beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigten, dass L4 die IL-12-Bildung auch nach der Stimulation mit dem LPS inhibieren konnte.
Die erhaltenen Ergebnisse, wenn Makrophagen mit LPS nach der Vorbehandlung mit L4 stimuliert wurden, sind in 9 gezeigt. In der Figur zeigt * an, dass dort eine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 war. Es ist offensichtlich, dass die L4-Vorbehandlung die IL-12-Bildung inhibiert. Die IL-12-Bildung wurde fast komplett bei hohen Dosen (100 ng/ml oder mehr) inhibiert. Die gleichen Ergebnisse wurden auch erzielt, wenn andere gewöhnliche Mäuse (C57BLL/6-Mäuse) verwendet wurden (mit L4 für 36 Stunden vorbehandelt) (10). In 10 zeigt das * an, dass dort keine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 war.
Die IL-12-Bildung in den Makrophagen der MRL-Ipr/Ipr-Mäuse, die mit oder ohne 1000 ng/ml von L4 für 24 Stunden vorbehandelt wurden, dann mit 100 ng/ml von LPS für 24 Stunden behandelt wurden (L4-Vorbehandlung) und dann mit 100 ng/ml von LPS zusammen mit oder ohne 1000 ng/ml von L4 behandelt wurden (gleichzeitige Behandlung), wurde verglichen. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. In 11 zeigen * und ** an, dass dort keine statistische Signifikanz in einer Höhe von p < 0,05 beziehungsweise von p < 0,01 gemäß dem Student's t-Test war.
Es kann von den in 11 gezeigten Daten entnommen werden, dass die L4-Vorbehandlung die IL-12-Bildung verglichen mit der gleichzeitigen Behandlung noch effizienter inhibiert.
Das gleiche Ergebnis wurde erzielt, wenn L4L4 (Tetranatriumsalz) anstatt von L4 verwendet wurde. Die Ergebnisse der Stimulation mit 100 ng/ml des LPS's für 24 Stunden in der Gegenwart von L4L4 in verschiedenen Konzentrationen sind in 12 gezeigt.
Beispiel 5: Die durch die L4-Behandlung verursachte Senkung in der IL-12-p70-Bildung in Gelenkzellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis
Eine Zellsuspension wurde durch Suspendieren von Gelenkzellen, die von menschlichen Patienten mit rheumatoider Arthritis gesammelt wurden, in PRMI1640-Medium (Sigma), welches 500 ng/ml von LPS, 50 U/ml eines rekombinanten Maus-Interferon-γ- (IFN-γ) und 10% fetales Rinderserum enthält, in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml präpariert.
100 μl der oben genannten Zellsuspension wurden in eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden dispensiert und ferner wurden 100 μl der L4-Lösung, dessen Konzentration auf das zweifache der Endkonzentration in dem RPMI1640-Medium eingestellt wurde, dazu gegeben. Dann wurden die Zellen bei 37°C in der Gegenwart von 5% CO₂ für 24 Stunden kultiviert.
Anschließend wurde die Platte zentrifugiert, um den Kulturüberstand zu sammeln. Die IL-12-Konzentration in dem Überstand wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt.
Wie in 13 gezeigt, wurde dort eine Tendenz beobachtet, dass die Zugabe von L4 die IL-12-Bildung inhibierte. Die IL-12-Bildung in Gelenkzellen wurde durch 1000 ng/ml des L4's fast halbiert.
Beispiel 6: Die durch die L3-Behandlung verursachte Senkung in der IL-12-p40-Bildung in Makrophagen
Eiskaltes phosphatgepuffertes Salz (PBS) wurde in die Bauchhöhlen von C3H/HeN-Mäusen injiziert. Nachdem das Abdomen jeder Maus massiert wurde, wurde das PBS gesammelt und zentrifugiert, um die Makrophagen zu erhalten. Eine Zellsuspension wurde durch Suspendieren der erhaltenen Makrophagen in RMPI1640-Medium (Sigma), das 200 ng/ml des LPS's, 2 U/ml eines rekombinanten Maus-Interferon-γ's (IFN-γ) und 10% eines fetalen Rinderserums enthält, in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml präpariert.
100 μl der Zellsuspension wurden auf eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden dispensiert und ferner wurden 100 μl der L3-Lösung, dessen Konzentration auf das zweifache der Endkonzentration in dem RPMI1640-Medium eingestellt wurde, da zu gegeben. Dann wurden die Zellen bei 37°C in der Gegenwart von 5% CO₂ für 24 Stunden kultiviert.
Anschließend wurde die Platte zentrifugiert, um den Kulturüberstand zu sammeln. Die IL-12-Konzentration in dem Überstand wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt.
Wie es aus den in 14 gezeigten Resultaten ersichtlich ist, inhibierte L3 die IL-12-Bildung von Makrophagen in einer dosisabhängigen Weise.
Die Daten der Beispiele 2 bis 6 zeigen deutlich, dass das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid oder Derivate davon die IL-12-Bildung inhibieren können. Insbesondere ist es deutlich, dass die vorausgehende Verabreichung der Substanzen die anschließende IL-12-Bildung inhibieren kann (d. h., sie haben einen präventiven Effekt).

Claims

Verwendung eines Acylesters an einer Hydroxylgruppe eines Keratan-Sulfat-Oligosaccharids und eines pharmazeutisch verwendbaren Trägers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die aus der Kontaktdermatitis, der autoimmunen Uveitis/Retinitis, der allergischen cerebrospinalen Meningitis, dem insulinabhängigen Diabetes mellitus, dem Diabetes mellitus, dem Morbus Hashimoto, der Multiplen Sklerose, der rheumatoiden Arthritis, dem Sjögren's Syndrom, dem Morbus Crohn, der Colitis ulcerosa, der Sarcoidose, der Psoriasis, der Lipopolysaccharid induzierten Lebernekrose, der rapid progressiven Glomerulonephritis und dem systemischen Lupus Erythematodes ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid mindestens eine sich wiederholende Einheit von einem der beiden Disaccharide der folgenden Formeln umfasst: Gal(6S)-GlcNAc(6S) und Gal(6S)-GlcNAc, wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, und – eine glycosidische Bindung darstellt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Keratan-Sulfat-Oligosaccharid aus jenen ausgewählt ist, die durch die Formeln (1) bis (3) dargestellt sind: Gal(6S)β1-4GlNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (1) Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (2) Gal(6S)β1-4GlcNAc (3), wobei Gal einen Galaktose-Rest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosamin-Rest darstellt, 6S angibt, dass der 6-O-Sulfatester an einer Hydroxylgruppe an der 6-Position gebildet ist, β1-4 eine β-1,4-glycosidische Bindung darstellt und β1-3 eine β-1,3-glycosidische Bindung darstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Acylester durch die folgende Formel (4) dargestellt ist:
wobei X¹ bis X⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe darstellt, vorausgesetzt, dass mindestens eines der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe ist, Y ein Wasserstoffatom oder SO₃M ist, M unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges bis dreiwertiges Metall oder eine einwertige bis dreiwertige Base ist, die ionisiert sein kann, und die durch eine gewellte Linie dargestellte Bindung eine Bindung in einer α-Glycosid-Konfiguration oder einer β-Glycosid-Konfiguration darstellt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei jedes der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe darstellt, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, und M ein Alkalimetall ist.
Keratan-Sulfat-Oligosaccharid-Derivat, welches durch die folgende Formel (4) dargestellt ist:
wobei X¹ bis X⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe darstellt, vorausgesetzt, dass mindestens eines der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe ist, Y ein Wasserstoffatom oder SO₃M ist, M unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges bis dreiwertiges Metall oder eine einwertige bis dreiwertige Base ist, die ionisiert sein kann, und die durch eine gewellte Linie dargestellte Bindung eine Bindung in einer α-Glycosid-Konfiguration oder einer β-Glycosid-Konfiguration darstellt.
Derivat nach Anspruch 6, wobei jedes der X¹ bis X⁵ eine Acylgruppe darstellt, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, und M ein Alkalimetall ist.