DE69530910T4

DE69530910T4 - Medizinische zusammensetzungen enthaltend ein sialinsäurederivat

Info

Publication number: DE69530910T4
Application number: DE69530910T
Authority: DE
Inventors: Mamoru Yokkaichi-shi KOKETSU; Masakazu Yokkaichi-shi NISHIZONO; Teruhiko Yokkaichi-shi NITODA; Yuko Yokkaichi-shi ENOKI; Hiroshi Yokkaichi-shi KAWANAMI; Raj Lekh Yokkaichi-shi JUNEJA
Original assignee: Taiyo Kagaku KK
Current assignee: Taiyo Kagaku KK
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2015-07-15
Also published as: EP0727216A1; CA2171614C; WO1996002255A1; DE69530910T2; EP0727216A4; CA2171614A1; DE69530910D1; JP3930559B2; EP0727216B1; US5834423A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Sialinesäurederivate enthält und Verfahren zur Herstellung von Sialinsäurederivaten aus Vogel-Eidotter.
Hintergrund
Es wurden große Anstrengungen unternommen, um therapeutische/prophylaktische Mittel für virale Erkrankungen zu entwickeln, jedoch wurden bisher keine wirksamen antiviralen Mittel gegen bestimmte Viren bereitgestellt. Influenza, die durch das Influenzavirus bewirkt wird, stellt insbesondere eine Plage für die Menschen auf der ganzen Welt dar, da sie im globalen Maßstab einmal im Verlauf mehrerer Jahre auftritt, was zu einer großen Anzahl von Opfern führt. Es ist jedoch sehr schwierig, ein wirksames Arzneimittel gegen das Influenzavirus zu entwickeln, da sein Antigen eine hohe Variabilität zeigt.
Rotavirus, ein Virus, das ernstliche Diarrhoe-Erkrankungen bei Menschen und Tieren erzeugt, ist stark infektiös für Kinder während der Laktationsperiode, wobei durch ein niedriges Niveau an medizinischer Technologie und Ausrüstung in Entwicklungsländern zahlreiche Todesfälle auftreten. Es bewirkt auch große Schäden in der Viehwirtschaft. Dennoch gibt es keine wirksamen prophylaktischen/therapeutischen Methoden für Erkrankungen, die mit dem Rotavirus einhergehen.
Das Herpesvirus bewirkt Erkrankungen verschiedener Symptome, einschließlich chronischem Herpes, bei Mensch und Tier, es gibt jedoch keine etablierten radikalen Methoden zur Verhinderung oder Behandlung derartiger Erkrankungen, was teilweise auf latenten Infektionen beruht.
Das Virus der Newcastle-Erkrankung erzeugt die Newcastle-Erkrankung, eine tödliche infektiöse Erkrankung von Vögeln, was einer großen Anzahl von Geflügelfarmen beträchtlichen Schaden zufügt. Zwar wurden prophylaktische Maßnahmen durch Impfung vorgenommen, eine vollständige Prophylaxe kann jedoch nicht erzielt werden, Außerdem ist die Newcastle-Erkrankung rasch übertragbar und stellt eine konstante Infektionsbedrohung mit fremden Viren in der Geflügelwirtschaft dar.
Diarrhoe-Erkrankungen können grob in zwei Typen aufgeteilt werden: infektiöse Diarrhoe bewirkt durch Viren, Bakterien und nicht-infektiöse Diarrhoe bewirkt durch Stress. Es ist jedoch schwierig den Grund jeder Diarrhoe-Erkrankung zu bestimmen. Es wird angenommen, dass infektiöse Diarrhoe bei Kleinkindern hauptsächlich durch Rotavirus bedingt wird und es wird gesagt, dass Rotavirus-Diarrhoe mehr als eine Million Sterbefälle bei Kleinkindern jährlich in Entwicklungsländern bedingt. Wie vorstehend erwähnt, gibt es jedoch Diarrhoe-Erkrankungen, die durch andere Viren oder durch Bakterien oder Stress ausgelöst werden und das Auftreten der meisten Diarrhoe-Erkrankungen stellt ein komplexes Zusammenwirkungen derartiger verschiedener Gründe dar. Um daher Diarrhoe wirksam zu behandeln, besteht ein Bedürfnis nach einem Mittel, das sich auf die verschiedenen Gründe auswirkt. Bei Vieh und auch Geflügel sind Diarrhoe-Erkrankungen während der Aufzugsperiode verantwortlich für eine hohe Morbidität und Letalität und bewirken große Schäden in der Vieh- und Geflügelwirtschaft. Die meisten dieser Diarrhoe-Erkrankungen scheinen durch verschiedene Gründe bedingt zu werden. Es gibt jedoch keine wirksamen prophylaktischen/therapeutischen Methoden gegen Diarrhoe-Erkrankungen die durch verschiedene Faktoren ausgelöst werden.
Sialyloligosaccharide treten in der Natur als Oligosaccharidketten in Glycoproteinmolekülen auf, Oligosaccharidketten in Gangliosiden und Olidogsaccharidpeptiden oder Oligosaccharidketten, die aus Glycoproteinen oder Gangliosiden freigesetzt werden.
Als Sialyloligosaccharide, die in Vogel-Eidotter gefunden wurden, sind solche bekannt, die an das Phosvitinmolekül gebunden sind [Shainkin, R., und Perlmann, G. E. (1971), Arch. Biochem. Biophys. 145, 693–700].
In den letzten Jahren haben zahlreiche Untersuchungen die biologische Bedeutung von Sialyloligosacchariden beleuchtet. Sialyloligosaccharide, die an Glycoproteine gebunden sind, sind in verschiedener Hinsicht in Proteinmoleküle involviert, einschließlich der Retention der tertiären Struktur, der erhöhten Resistenz gegen Proteasen, der Halbwertszeit in Blut, der intermolekularen Wechselwirkung und der erhöhten Löslichkeit. Sie wirken sich auch auf die intrazelluläre Rekognition, Zellunterscheidung als eine wichtige Komponente von Glangliosiden aus, die eine Rolle als ein Rezeptor für verschiedene Cytotoxine, Neurotransmitter, Hormone, Interferone, Viren, spielen. Sialyloligosaccharide spielen eine wichtige Rolle im Anfangszustand von Entzündungen, (Sialyl Lewis-X-Antigen-Beteiligung), Ulkus, bewirkt durch Heliocobacter pylori und die Infektion durch das Influenza-Virus. Bezüglich der biologischen Funktionen von Sialinsäurederivaten beim Influenzavirus werden die Hämagglutination und Antihusteneffekt (japanische offengelegte Patentanmeldung 61/68418) und die Verwendung als antiinfektiöses Mittel (offengelegte japanische Patentanmeldung 63/284133) beschrieben.
Es ist bekannt, dass die Milch der menschlichen Brust Sialinsäure in einer Konzentration vom 1,5 bis 7,0-fachen der Kuhmilch enthält und es wurden verschiedene Wirkungen in Betracht gezogen, die eine gesteigerte Immunität von Kleinkindern, die Entwicklung der Zerebralfunktion und die Promotion einer geeigneten enterobakteriellen Proliferation umfassen. Auf der Basis dieser Erkenntnisse wurden Untersuchungen vorgenommen, um Sialyloligosaccharide zu Pharmazeutika und funktionellen Nahrungsmitteln zu fügen.
Eine Methode zur Reinigung von Sialyloligosacchariden aus von Lipiden befreiten Vogel-Eidottern im industriellen Maßstab ist bekannt. Diese Methode ist dadurch charakterisiert, dass von Lipiden befreiter Vogel-Eidotter als solcher oder in Form eines wässrigen Extrakts enzymatisch digeriert wird und verarbeitet wird unter Verwendung einer Ultrafiltrations- oder umgekehrten Osmose-Membran (offengelegtes japanischen Patent 6/245784). Enzyme, die bei der vorstehenden Methode verwendet werden, umfassen Proteasen und PNGase (Peptid-N-Glycanase): die ersteren wirken zur Freisetzung von Glycopeptides aus Glycoproteinen und die letzteren wirken zur Freisetzung von Zuckerketten vom N-glycosid-Typ aus Glycoproteinen oder Glycopeptiden. Jedoch sind die Sialyloligosaccharid-Peptide oder Sialyloligosaccharide, die unter Verwendung dieser Enzyme erhalten werden, Gemische vom Monosialyl- und Disialyltyp. Außerdem können Sialyloligosaccharid-Peptide immunogen sein, da sie ein Peptid aufweisen, das aus 5 oder 6 Aminosäuren an dessen Reduktionsende besteht. Darüber hinaus werden die meisten Arten von PNGase von pathogenen Bakterien hergeleitet. Aus diesem Grunde ist die Anwendung derartiger Enzyme auf Nahrungsmittel schwierig. Die PNGase findet sich in Mandelsamen, jedoch sind auch Enzyme, wie Proteasen, β-D-Galactosidase, β-D-Glucosidase und α-D-Mannosidase in Mandelkernen vorhanden, wodurch es schwierig wird, die PNGase im großem Maßstab zu reinigen. Außerdem ist die Anwendbarkeit von PNGase begrenzt, da sie nicht geeignet ist Zuckerketten, die an riesige dichtgefaltete Proteinmoleküle, wie Phosvitin, gebunden sind, freizusetzen.
Hasegawa et al., Jpyn. J. med. Sci. Biol., 47, 73–85 (1994) beschreiben, dass menschliches Lactoferrin und Rinder-Lactoferrin die Infektion von Gewebekulturzellen mit menschlichem Cytomegalovirus und menschlichem Herpes-Simplex-Virus-1 inhibieren. Die antivirale Aktivität war an den Proteinrest, nicht jedoch an das Eisenmolekül der Sialinsäure gebunden.
Die EP-A-0 584 558 beschreiben eine Zusammensetzung zur Inhibierung von Infektionen durch, und unterdrückt des Wachstums von HIV, wobei die Zusammensetzung ein Eisen-bindendes Protein, beispielsweise Lactoferrin, Transferrin oder Ovotransferrin, umfasst.
Endo et al., Biochemistry, 28, 8380–8388 (1989) beschreiben, dass Prionproteine des Menschen und von Nagetieren zwei Konsensus-Stellen für die Asparagin-gebundene Glycosylatierung nahe ihrer C-Termini enthalten. Die Asparagin-gebundenen Oligosaccharide der Scrapie-Isoform von Hamster-Nagetierprotein wurde freigesetzt, fraktioniert und einer Gylcosidase-Digestion mit verschiedenen Enzymen einschließlich der α-Frucosidase I der Mandel unterzogen. Die Oligosaccharide enthalten ein Gemisch von Zuckerketten vom bi-, tri- und tetraantinären Komplextyp mit Manα1→6(GlcNAcβ1→4) (Manα1→3)Manβ1→4GlcNAcβ1→4-(Fucα1→6)GlcNAc als ihren Kern.
Spil et al. Biochemie, 70, 1459–1469 (1988) geben eine vergleichende Studie der Glycan-Primärstrukturen von verschiedenen Transferrinen (Sero-Lacto- und Ovotransferrine) von verschiedenen Spezies im Hinblick darauf, festzustellen, ob Glycane Marker für die Evolution sind. A priori konnte keine Beziehung zwischen der Primärstruktur und der Funktion von Transferringlycanen festgestellt werden.
Beschreibung der Erfindung
Dem entsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit zu stellen, die ein Sialinsäurederivat als einen aktiven Bestandteil enthält. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur kostengünstigen und zweckmäßigen Herstellung eines Sialinsäurederivats im industriellen Maßstab.
Im Rahmen von intensiven Untersuchungen haben die vorliegenden Erfinder gefunden, dass ein Sialinsäurederivat mit einer speziellen Struktur überraschenderweise eine ausgezeichnete antivirale Wirkung, Antidiarrhoe-Wirkung, Antiulkus-Wirkung, entzündungswidrige bzw. antiinflammatorische Wirkung und antiallergische Wirkung hat und eine ausgezeichnete Aktivität zur Förderung der Proliferation von Bifidobakterien, einem enterischen Bakterium, hat. Die Erfinder haben auch gefunden, dass bei Verwendung von Vogel-Eidotter als Substrat eine Sialyloligosacchardkette sehr leicht freigesetzt werden kann, was zu einer leichten und wirksamen Herstellung des gewünschten Produkts führt, allein durch Zusatz eines Mandel- oder Aprikosenkerns als solchem anstelle von gereinigter PNGase. Die Erfinder haben weitere hierauf basierende Untersuchungen vorgenommen und die vorliegende Erfindung entwickelt.
Im folgenden wird das Wesen der Erfindung angegeben:

(a) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch den Gehalt eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Form (1) oder (2) als einen aktiven Bestandteil
worin R¹ einen Zuckerrest oder einen Glycopeptidrest darstellt; X¹ und X², die gleich oder verscheiden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- or GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, hat
worin R² und R³ gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten, n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; und X³ der Rest eines Sialinsäurederivats oder der Rest eines Sialyloligosaccharidederivats ist, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (3):
worin X⁴ und X⁵, die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- or GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X⁴ und X⁵ die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-; und Y einen Zuckerrest darstellt;
(b) die pharmazeutische Zusammsetzung, die vorstehend unter (a) beschrieben wird, zur Verwendung als antivirales Mittel;
(c) die vorstehend unter (a) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Heilmittel für Diarrhoe;
(d) die vorstehend unter (a) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Antiulkusmittel;
(e) die vorstehend unter (a) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als entzündungshemmendes bzw. antiinflammatorisches Mittel;
(f) die vorstehend unter (a) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als antiallergisches Mittel;
(g) die vorstehend unter (a) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als die Proliferation von Bifidobacteria förderndes Mittel.
(h) Ein Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (4), das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Mandel zur einem Vogel-Eidotter gefügt wird:
worin R⁴ einen Zuckerrest darstellt, X¹ und X² die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-. Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-;
(i) das vorstehend unter (h) beschriebene Verfahren, bei dem die Mandel von Lipiden befreit ist;
(j) ein Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die folgende allgemeine Form (4), das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Aprikosenkern zu einem Vogel-Eidotter gefügt wird:
worin R⁴ einen Zuckerrest darstellt; X¹ und X² die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-;
(k) Das vorstehend unter (j) beschriebene Verfahren, worin der Aprikosenkern von Lipiden befreit ist;
(l) Ein Sialinsäurederivat, dargestellt durch die vorstehende allgemeine Formel (1) oder (2) zur Verwendung bei der Therapie; und
(m) die Verwendung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die vorstehende allgemeine Formel (1) oder (2) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, Diarrhoe, Ulkus, Entzündungen, Allergien oder zur Förderung der Proliferation von Bifidobacteria.

Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Inhibierung einer Rotavirus-Infektion des Menschen durch ein Sialinsäurederivat (Sialylphospholipid).
2 zeigt die prophylaktische Wirkung eines Sialinsäurederivats (Sialylphospholipid) auf durch Rotavirus bedingte Diarrhoe.
3 zeigt die therapeutische Wirkung eines Sialinsäurederivats (Sialylphospholipid) auf durch Rotavirus bedingte Diarrhoe.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält als einen aktiven Bestandteil ein Sialinsäurederivat, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (1) oder (2).
Durch die allgemeine Formel (1) dargestelle Verbindungen
In der allgemeinen Formel (1) bedeutet R¹ einen Zuckerrest oder einen Glycopeptidrest. Derartige Zuckerreste umfassen, ohne eine Beschränkung darzustellen, -GlcNAc(β1,4)GlcNAc, -GlcNAc und -Gal(β1,4)Glc. Derartige Glcopeptide umfassen, ohne eine Einschränkung darzustellen, -GlcNAc(β1,4)GlcNAcAsn, -GlcNAcAsn, IleLysValAlaAsp(-GlcNAc)LysThr und LysValAlaAsp(-GlcNAc)LysThr.
X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, bedeuten NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-. Mindestens eines von X¹ und X² bedeutet NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-.
Verbindungen dargestellt durch die allgemeine Formel (2)
In der allgemeinen Formel (2) sind R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 12 bis 24 Kohlenstoffatomen. Die geradkettige, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen umfasst, ohne eine Begrenzung darzustellen, Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl, Stearoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Arachidonoyl-, Eicosapentaenoyl und Docosahexaenoylgruppen, wobei bevorzugt Lauoyl-, Myristoyl-, Palmitoyl- und Stearoylgruppen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit sind.
In der vorliegenden Beschreibung stellt -(CH₂)n- in der allgemeinen Formel (2) einen Abstandhalter dar. Die Ziffer n in dem Abstandhalter bedeutet eine ganze Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise 4 bis 16, bevorzugter 6 bis 12 und am bevorzugtesten 8 bis 10. Bevorzugt hat n die Bedeutung von 1 oder mehr, wegen der Verhinderung der Membran-Imprägnierung des Sialinsäurederivat-Rests oder Sialyloligosaccharidderivat-Rests, dargestellt durch X³ und n hat die Bedeutung von 20 oder weniger, wegen der Flexibilität.
X³ stellt den Rest eines Sialinsäurederivats oder den Rest eines Sialyloligosaccharidderivats dar, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (3):
worin X⁴ und X⁵, die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X⁴ und X⁵ die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-; und Y stellt einen Zuckerrest dar.
Der hier erwähnte Rest eines Sialinsäurederivats unterlegt keiner Beschränkung, Beispiele sind jedoch solche, die sich von den folgenden Verbindungen ableiten:
3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose, Sialyl Lewis X, N-Acetylneuraminsäure, O-Acetylneuraminsäure, N-Glycolylneuraminsäure, O-Glycolylneuraminsäure und 3-Deoxynonulosinsäure und Alkylester, O-Acylate, O-Alkylate, Deoxide, Thioglycoside und Lactone davon. Von diesen Verbindungen sind 3'-Sialyllactose, 6'-Sialyllactose und N-Acetylneuraminsäure und Alkylester, O-Acylate, O-Alkylate und Deoxide davon bevorzugt, wobei besonders bevorzugt N-Acetylneuraminesäure ist.
In der allgemeinen Formel (3) stellt Y einen Zuckerrest dar, Derartige Zuckerreste umfassen, ohne eine Beschränkung darzustellen, -GlcNAc(β1,4)GlcNAc-, -GlcNAy- und -Gal(β1,4)Glc-.
Dementsprechend sind Beispiele für den durch die allgemeine Formel (3) dargestellten Rest eines Sialyloligosaccharidderivats folgende:
Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung von Sialinsäurederivaten, dargestellt durch die allgemeine Formel (1) oder (2) beschrieben.
Ein Sialinsäurederivat, dargestellt durch die allgemeine Formel (1) kann beispielsweise erhalten werden durch Digirieren eines Glycoproteins mit einer Zuckerkettenstrucktur der allgemeinen Formel (1) mit Pronase oder PNGase in üblicher Verfahrensweise oder nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines Vogel-Eidotters.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats unter Verwendung eines Vogel-Eidotters genauer beschrieben.
Zwar unterlegt der Vogel-Eidotter, der erfindungsgemäß verwendet wird, hinsichtlich seines Ursprungs keiner Begrenzung, solange es sich um den Dotter eines Vogeleis handelt, jedoch sind die Dotter von Geflügel, einschließlich Hennen, Wachtel, Enten und Wildenten, bevorzugt. Bei Verwendung als Ausgangsmaterial kann der Dotter in flüssiger Form oder Pulverform vorliegen. Der Rückstand (von Lipiden befreiter Dotter) der aus der Delipidierung eines Vogel-Eidotters durch Extraktion mit organischem Lösungsmittel (z. B. Methanol, Ethanol, Diethylether) resultiert, kann als Ausgangsmaterial verwendet werden.
Die Mandel- und Aprikosenkerne, die erfindungsgemäß verwendet werden, unterliegen keiner Begrenzung, solange sie verwendet werden, ohne Behandlung zur Enzymreinigung oder solange die Behandlung, falls eine vorgenommen worden wird, kein Erhitzen oder andere Verfahrensweisen einbezieht, die das darin enthaltene Enzym inaktivieren. Sie können in der Form von einem Pulver oder einer Paste vorliegen. Erfindungsgemäß sind von Lipiden befreite Mandelkerne und von Lipide befreite Aprikosenkerne bevorzugt. Von Lipiden befreite Mandelkerne und von Lipiden befreite Aprikosenkerne werden nicht zu gereinigten Enzymen verarbeitet, werden aber beispielweise erhalten durch Entfetten von rohen Mandel- und rohen Aprikosenkernen durch Extraktion mit organischem Lösungsmittel (z. B. Aceton und Diethylether). Die Entfettungsbehandlung sollte den Lipidgehalt auf nicht mehr als 25%, vorzugsweise nicht mehr als 5% verringern. Erfindungsgemäß können Pulver und Pasten von derartigen von Lipiden befreiten Mandelkernen und von Lipiden befreiten Aprikosenkernen bevorzugt verwendet werden. Es sei festgestellt, dass die Verwendung eines gereinigten Enzyms, wie bei üblichen Verfahren, zu einem Gemisch von nahezu gleichen Anteilen des Monosialyl- und Disialyltyps führt, wohingegen die vorliegende Erfindung überraschenderweise ein Gemisch von sehr geringen Mengen des Monosialyltyps und einer großen Menge des Disialyltyps liefert, was den großen Vorteil einer leichten Trennung der beiden Typen mit sich bringt.
Ein Beispiel für ein Verfahren für die vorstehend beschriebene Verfahrensweise gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Vogel-Eidotters und Mandeln etc. wird nachstehend beschrieben.
Um Vogel-Eidotter von Lipiden zu befreien wird Wasser oder eine Salzlösung (eine Lösung eines Kaliumsalzes oder eines Natriumsalzes oder eines Salzes, das geeignet ist, über den Bereich vom pH 5 bis 10 zu puffern) zugesetzt, worauf bei 4 bis 80°C, vorzugsweise 4 bis 40°C während 10 Minuten bis 3 Tagen gerührt wird, worauf das Gemisch zur Abtrennung des unlöslichen Proteins filtriert wird. Zu dem so erhaltenen Extraktionsfiltrat werden 0,5 bis 20 g von Lipiden befreitem Mandelpulver oder von Lipiden befreitem Aprikosenkernpulver pro Liter des Filtrats gefügt, worauf beim pH 5,0 bis 5,5 und bei 30 bis 45°C während 8 bis 24 Stunden gerührt wird. Nach dem Filtrieren wird diese Lösung an einem Anionenaustauscherharz adsorbiert; nach dem Waschen mit Wasser wird eine Gradienten-Elusion durchgeführt unter Verwendung von 0 bis 0,3 M NaCl-Lösung. Das so erhaltene Eluat wird entsalzt und konzentriert unter Verwendung einer Membran zur umgekehrten Osmose (RO-Membran) worauf lyophilsiert wird unter Bildung eines Sialinsäurederivats.
Das hier verwendete Anionaustauscherharz ist beispielsweise DOWEX (hergestellt von der Dow Chemical), SEPABEADS (hergestellts von der Mitsubishi Chemical) und AMBERLITE (hergestellt von Rohm & Haas). Zwar unterliegen dieser Produkte hinsichtlich des Typs keiner Begrenzung, jedoch sind solche vom stark alkalischen Typ bevorzugt.
Das so erhaltene Sialinsäurederivat wird dargestellt durch die allgemeine Formel (4) und ist identisch mit dem, das dargestellt wird durch die allgemeine Formel (1), mit der Ausnahme, dass R⁴ kein Glycopeptiderest sondern ein Zuckerrest ist:
worin R⁴ einen Zuckerrest darstellt; X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAcβ1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-. Mindestens eines von X¹ und X² hat die Bedeutung von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-.
Die Verfahrensweise ist industriell sehr vorteilhaft, da sie eine kostengünstigere und zweckmäßigere Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die allgemeine Formel (4) ermöglicht, als übliche Verfahrensweisen und da das erhaltene Sialinsäurederivat für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung und die Ausgangsmaterialien dafür verwendet werden kann.
Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats der allgemeinen Formel (2) beschrieben. Das Sialinsäurederivat kann hergestellt werden durch Kombinieren einer chemischen Synthesereaktion und einer enzymatischen Synthesereaktion unter Verwendung von Phospholipase D (im folgenden als PLD bezeichnet) unter Verwendung einer Zuckerkomponente, eines Phospholipids und eines Abstandhaltermaterials als Ausgangsmaterialien.
Die hier erwähnte Zuckerkomponente ist eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen der Reste des Sialinsäurederivats oder der Reste eines Sialyloligosaccharidderivats, wie vorstehend aufgeführt und dargestellt durch X³, aufweist.
Das Phospholipid kann jegliches Phospholipid sein, sofern es ein Wasserstoffatom oder die vorstehend beschriebene Acylgruppe aufweist, d. h. die vorstehend in der Beschreibung von R² und R³ erwähnte Acylgruppe. Speziell umfassen derartige Phospholipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit und Phosphatidylglycerin, wovon alle die beschriebene Acylgruppe aufweisen. Diese Phospholipide können allein oder in Kombination von zwei oder mehreren Arten verwendet werden. Hinsichtlich seines Ursprungs kann das Phospholipid von einer Pflanze, wie Sojabohne, oder von einem Tier, wie einem Hühnerei, stammen. Das Phospholipid kann auch chemisch oder enzymatisch aus diesen Quellen hergestellt werden.
Die bevorzugten Abstandhaltermaterialien sind Alkyldiole mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Solche Alkyldiole umfassen
1,2 Ethandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,6-Hexandiol, 1,7-Heptandiol, 1,8 Octandiol, 1,9-Nonandiol, 1,10-Decandiol, 1,11-Undecandiol und 1,12-Dodecandiol.
Das für die Erfindung verwendete PLD kann von einem Tier, einer Pflanze oder einem Mikroorganismus stammen. Beispiele für mikrobielles PLD umfassen solche, die sich ableiten von den Stämmen Streptomyces, Nocardiopsis und Actinomadura. PLD wird in einer wässrigen Lösung oder einer geeigneten Pufferlösung oder immobilisiert an einem Träger verwendet. Beispiele für Puffer umfassen Acetatpuffer, Phosphatpuffer und Tris-chlorwasserstoffsäure-Puffer. Beispiele für Trägerharze umfassen Octyl-Sepharose (hergestellt von der Pharmacia) und Butyl-Toyopearl (hergestellt von Tosoh). Bakterielle Zellen mit PLD können ebenfalls verwendet werden. In diesem Falle werden intakte Zellen in der Form des trockenen Produkts oder immobilisiert at einem Träger eingesetzt.
Nachstehend werden spezielle Verfahrensweisen zur Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die allgemeine Formel (2) beschrieben.
Bei der ersten Methode wird eine mit einem Abstandshalter gebundene Zuckerkomponente mit dem Rest der polaren Gruppe eines Phospholipids durch Transphosphatidylierung unter Verwendung von PLD ausgetauscht.
Zuerst wird die Zuckerkomponente durch Einwirkung von Methanol unter sauren Bedingungen methyliert; das resultierende methylierte Produkt wird mit Chlorwasserstoff in Acetylchlorid behandelt, um sämtliche Hydroxylgruppen zu acetylieren und ein Peracetyl-2-chlorderivat zu ergeben, worin das Wasserstoffatom in der 2-Stellung des Zuckerrests an dem reduzierenden Ende der Zuckerkomponente durch ein Chloratom ersetzt wurde. Anschließend wird mit einem Monoester eines Alkyldiols in Anwesenheit eines Molekularsiebs und von Ag₂CO₃ behandelt unter Bildung eines Peracetyl-2-O-Alkylderivats. Dieses Alkylderivat wird unter alkalischen Bedingungen deacetyliert unter Bildung eines O-Alkylats der Zuckerkomponente. Dieses Alkylat wird in einem Puffer mit geeignetem pH-Wert (4,0 bis 8,0) gelöst, worauf ein Calziumsalz zugesetzt wird. Zu dieser Lösung werden PLD oder PLD-enthaltende Bakterienzellen gefügt und ein Phospholipid, das vorher in einem organischen Lösungsmittel gelöst wurde, wird zugesetzt und es wird eine Enzymreaktion während mehrerer Stunden durchgeführt, wobei das Gemisch gerührt wird.
Man erhält ein Produkt, resultierend aus der Transphosphatidylierung zwischen dem Rest der polaren Gruppe des Phospholipids und dem O-Alkylat der Zuckerkomponente, das anschließen durch Behandeln mit Alkalimetallhydroxid demethyliert wird, worauf es gereinigt wird unter Bildung des gewünschten Sialinsäurederivats.
Die Bedingungen zur Enzymreaktion unter Verwendung von PLD bei dieser Methode sind beispielsweise folgende: der pH-Wert des Reaktionsgemischs ist normalerweise 4,0 bis 8,0, vorzugsweise 5,6 bis 7,0. Bevorzugt wird das Gemisch auf ein pH-Niveau im Bereich von ± 0,5 vom optimalen pH des verwendeten PLD eingestellt. Wenn der pH-Wert aus diesem Bereich fällt, wird die Reaktionsgeschwindigkeit verringert. Auch beträgt die Menge an verwendetem PLD normalerweise 10 bis 100 Einheiten, vorzugsweise 20 bis 50 Einheiten pro Gramm Phospholipid. Die Menge an zugesetztem PLD ist vorzugsweise nicht weniger als 10 Einheiten wegen des zufriedenstellenden Fortschreitens der Reaktion und nicht mehr als 100 Einheiten wegen der Wirksamkeit der Reaktion. Die Reaktionstemperatur beträgt nomalerweise 15 bis 50°C, vorzugsweise 25 bis 30°C. Die Reaktionszeit beträgt normalerweise 0,5 bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 bis 6 Stunden und vorzugsweise nicht weniger als 0,5 Stunden wegen des zufriedenstellenden Fortschreitens der Reaktion und nicht länger als 12 Stunden wegen der Reaktionswirksamkeit und der Verhinderung von Nebenreaktionen.
Um die Enzymaktivität von PLD zu verbessern, ist es darüber hinaus bevorzugter ein Calziumsalz zusetzen, jedoch können Salze anderer Ionen zugefügt werden. Derartige Salze umfassen Halogenide, Carbonate, Phosphate und Acetate von typischen zweiwertigen Elementionen, wie Calciumionen und Bariumionen, und solche von Übergangsmetallelement-Ionen, wie Mangan, Lanthan und Cer. Die Menge des zugesetzten Salzes beträgt normalerweise 10 mM bis 1 M, vorzugsweise 10 mM bis 0,5 M, basierend auf der Menge des Reaktionsgemischs, Die Menge ist vorzugsweise nicht weniger als 10 mM zur Erzielung des erwünschten Effekts und nicht mehr als 1 M wegen der Reaktionswirksamkeit.
Bei dem Reaktionssystem kann es sich um ein wässriges System handeln, jedoch kann es sich um ein zweiphasiges System von Wasser und organischem Lösungsmittel oder ein organisches Lösungsmittel handeln, wobei bevorzugt ein zweiphasiges System aus Wasser und organischem Lösungsmittel ist, da die meisten Zuckerkomponenten in Wasser löslich sind, wohingegen Phospholipide in einem organischen Lösungsmittel löslich sind.
Organische Lösungsmittel, die verwendet werden können, um Phospholipide zu lösen, umfassen eine oder mehrere Arten ausgewählt aus der Gruppe von Alkylestern und Alkylethern von Carbonsäuren, aliphatische Kohlenwasserstoffe, alicyclische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe und halogenierte Kohlenwasserstoffe, jeweils mit einem Schmelzpunkt von 40°C oder darunter.
Beispiele für Alkylester von Carbonsäuren umfassen Ester, gebildet zwischen linearen oder verzweigten Fettsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und linearen oder verzweigten Alkoholen mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen, Beispiele sind Methylacetat, Ethylacetat, Methylvalerat, Methylpropionat, Methylbutyrat und Methylcaproat, wobei Methylacetat bevorzugt ist. Alkylether umfassen geradkettige oder verzweigte Alkylether mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, Beispiele sind Dimethylether, Diethylether, Ethylmethylether und Isopropylether, wobei Dietheylether bevorzugt ist. Aliphatische Kohlenwasserstoffe umfassen geradkettige oder verzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei bevorzugt Hexan, Heptan und Petrolether sind. Alicyclische Wasserstoffe umfassen alicyclische Kohlenwasserstoffe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen mit oder ohne Substituenten, wobei Cyclohexan, Methylcyclohexan und Cyclooctan bevorzugt sind. Aromatische Kohlenwasserstoffe umfassen Kohlenwasserstoffe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen mit oder ohne einen Substituenten, wobei Benzol, Toluol und Xylol bevorzugt sind. Halogenierte Kohlenwasserstoffe umfassen Chloride, Bromide und Iodide von geradkettigen oder verzweigten Alkanen mit 8 oder weniger Kohlenstoffatomen, wobei bevorzugt chlorhaltige Verbindungen sind, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid.
Das Alkalimetallhydroxid, das zu Demethylierungsreaktion verwendet wird, ist beispielsweise Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid. Die Demethylierungsreaktion wird normalerweise unter Eiskühlung durchgeführt, die Reaktionszeit beträgt etwa 30 Minuten bis 1 Tag. Man unterzieht das Reaktionsprodukt einer üblichen Reinigungsmethode, wie Extrahieren, Chromatographie oder Umkristallisieren, und erhält das gewünschte Sialinsäurederivat.
Bei der zweiten Verfahrensweise wird eine Abstandhalter-Verbindung zu einem Phosopholipid durch Transphosphatidylieren mit PLD gefügt, worauf eine Glycosylbindung an eine Zuckerkomponente folgt.
Speziell werden das Phospholipid und ein Alkyldiol in einem organischen Lösungsmittel vermischt; zu diesen Gemisch wird ein Puffer mit geeignetem pH-Wert gefügt um das Calziumsalz aufzulösen. Zu dieser Lösung werden PLD oder PLD enthaltende Bakterienzellen gefügt, gefolgt von einer Enzymreaktion während mehrerer Stunden, wobei die Lösung gerührt wird. Ein Zwischenprodukt, aus dem Transphosphatidylieren zwischen dem Rest der polaren Gruppe und dem Phospholipid und dem Alkyldiol wird auf diese Weise erhalten. Dieses Zwischenprodukt und der Benzylester des Peracetyl-2-chlorderivats der Zuckerkomponente, hergestellt nach der vorstehend beschriebenem Methode, werden in Anwesenheit eines Aktivators bei einer niedrigen Temperatur von unter 0°C glykolisiert unter Bildung eines acetylierten Produkts des gewünschten Sialinsäurederivats. Dieses acetylierte Produkt wird anschließend durch Behandeln mit einem Alkalimetallhydroxid deacetyliert, worauf eine Debenzylierung durch Hydrieren in Anwesenheit eines Katalysators folgt, wobei man das gewünschte Sialinsäurederivat erhält.
Der für die Glykosylierungsreaktion verwendete Aktivator ist beispielsweise Trimethylsilyltriflavat und Silbertriflavat, wobei Silbertriflavat bevorzugt ist. Die Menge des zugesetzten Aktivators beträgt normalerweise 0,1 bis 10 Äquivalente, vorzugsweise 0,1 bis 5 Äquivalente. Die Menge ist vorzugsweise nicht weniger als 0,1 Äquivalente wegen des zufriedenstellenden Fortschreitens der Reaktion und nicht mehr als 10 Äquivalente wegen der Wirksamkeit der Reaktion.
Die Struktur der Zuckerkette des Sialinsäurederivats, das erfindungsgemäß verwendet wird, kann nach jeglicher üblichen Methode unter Verwendung von HPLC oder NMR identifiziert werden.
Das so erhaltenes Sialinsäurederivat kann hergestellt werden als Flüssigkeit, Tablette, Granulat oder andere Dosierungsformen unter Verwendung geeigneter Lösungsmitteln oder Basismaterialien zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise als antivirales Mittel, Diarrhoe-Heilmittel, Antiulkusmittel, entzündungshemmendes bzw. antiinflammatorisches Mittel, antiallergisches Mittel und Förderer für die Proliferation von Bifidobacteria verwendet. Bei der Verwendung als Antivirusmittel unterlegt die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung keinerlei Beschränkung bezüglich des angestrebten Virus, sie wird jedoch vorzugsweise für Influenzavirus, Rotavirus, Virus der Newcastle-Erkrankung, Herpesvirus, verwendet. Bei Verwendung als Heilmittel für Diarrhoe wird die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung vorzugsweise für sowohl nicht-infektiöse Diarrhoe-Erkrankungen als auch für infektiöse Diarrhoe-Erkrankungen, wie die durch Rotavirus oder Salmonellen bedingten, verwendet. Bei Verwendung als Antiulkusmittel wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise für Ulcera verwendet, die durch Helicobacter pylori entstehen. Bei Verwendung als antiinflammatorisches Mittel wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise für Rheumatismus und Asthma eingesetzt. Bei Verwendung als antiallergisches Mittel wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise für allergische Rhinitis, Pollenosis usw. verwendet.
In den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Sialinsäurederivat-Komponenten, die durch die allgemeine Formel (1) oder (2) dargestellt werden, allein oder als Gemisch von 2 oder mehreren Komponenten verwendet werden.
Die Dosis der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung variiert mit dem Alter, Geschlecht, Körpergewicht des Patienten, den Symptomen und anderen Faktoren, jedoch beträgt die als Antivirusmittel verwendete Dosis 1,0 bis 300 μg pro kg Körpergewicht. Zur Verwendung zur Heilung von Diarrhoe liegt die Dosis bei 0,5 bis 10 mg per kg Körpergewicht. Zur Verwendung als Antiulkusmittel ist die Dosis 1,0 bis 2000 μg pro kg Körpergewicht. Zur Verwendung als antiinflammatorisches Mittel beträgt die Dosis 1,0 bis 100 μg pro kg Körpergewicht. Zur Verwendung als antiallergisches Mittel ist die Dosis 1,0 bis 300 μg pro kg Körpergewicht. Zur Verwendung als Promotor für die Proliferation von Bifidobacteria ist die Dosis 100 bis 1000 mg per kg Körpergewicht.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Herstellungsbeispiele. Arbeitsbeispiele und Testbeispiele beschrieben, die jedoch keine Beschränkung darstellen sollen.
Herstellungsbeispiel 1: Herstellung von N-Acetylneuraminylphospholipid
Drei Gramm N-Acetylneuraminsäure wurden in 300 ml Methanol gelöst. Drei Gramm „Dowex-50" (H⁺-Form) (hergestellt von der Dow Chemical) wurden zu dem vorstehenden Gemisch gefügt und das erhaltene Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung von „Dowex-50" filtriert. Die als Filtrat erhaltene methanolische Lösung wurde auf ein Volumen von 15 ml konzentriert und auf –20°C gekühlt. Zu diesem Konzentrat wurden 6 ml Diethylether bei der vorstehenden Temperatur gefügt, wobei man 2,47 g eines methylierten Produkts von N-Acetylneuraminsäure durch Umkristallisieren erhielt.
Zu dem so erhaltenen methylierten Produkt wurden 25 g Acetylchlorid und 3 g Essigsäureanhydrid bei –20°C gefügt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß mit trockenem gasförmigen Chlorwasserstoff gesättigt und die erhaltene Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde das Gemisch vollständig mit Benzol und Toluol entwässert. Dieses Produkt wurde dann aus einem Gemisch, das gleiche Mengen von Dichlormethan, Diethylether und Hexan enthielt, umkristallisiert unter Bildung von 3 g acetyliertem Produkt.
Dieses acetylierte Produkt wurde in 60 ml Dichlormethan mit einem Gehalt von 6 g Molekularsieben 4A, 5 g Ag₂CO₃ und 3 g 1,8-Octandiolmonomethylester bei –20°C gefügt und das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, um eine Glycosylierungsreaktion durchzuführen. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs durch Celite wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde dann durch Chromatographie an einer Siliciumdioxidgelsäule gereinigt (CH₂Cl₂ : MeOH = 98 : 2) unter Bildung von 1,9 g eines glycosylierten Produkts (Rf = 0,63 Kieselgel/CH₂Cl₂ : MeOH = 15 : 1).
Unter Eiskühlung wurden 1,9 g des glycosylierten Produkts in 30 ml vollständig entwässertem Methanol gelöst. Unter Eiskühlung wurden 300 mg Kalium zu dem vollständig entwässerten Methanol zur Bildung von Kaliummethoxid gefügt, das dann zu einer methanolischen Lösung des vorstehend hergestellten glycosylierten Produkts gefügt wurde. Nach der Reaktion unter Rühren bei 0°C während 3 Stunden wurde „Dowex-50" (H⁺-Form) zu dem Reaktionsgemisch bei –20°C gefügt. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs zur Entfernung des „Dowex-50" wurde Methanol aus dem Filtrat destilliert und das destillierte Filtrat wurde durch Chromotographie an einer Siliciumdioxidgelsäule gereinigt (CHCl₃ : MeOH = 5 : 1) unter Bildung von 0,9 g eines deacetylierten Produkts (Rf = 0,25 Kieselgel/CHCl₃ : MeOH = 5 : 1).
Das deacetylierte Produkt wurde zusammen mit 3 g Dipalmitoylphosphatidylcholin bei 30°C während 6 Stunden in einem gemischten Lösungsmittel aus 120 Diethylether und 24 ml Wasser in Anwesenheit von 6 ml 0,4 M Calziumacetat und 100 Einheiten „PLD" (hergestellt von der Asahi Chemical) zur Erzielung eines Rohprodukts gerührt. Das Rohprodukt wurde anschließend durch Chromatographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (CHCl₃ : MeOH = 9 : 1) unter Bildung von 0,3 g eines Zwischenprodukts.
0,3 g des erhaltenen Zwischenprodukts wurden in einem gemischten Lösungsmittel aus 10 ml THF und 5 ml H₂O gelöst. Unter Eiskühlung wurden 0,3 ml 1 N-NaOH-Lösung zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde gerührt. Nach dem Neutralisieren des Gemischs (auf pH 8) durch Zugabe vom „Dowex-50" (H⁺-Form) wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des „Dowex-50" filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Säulenchromatographie (ODS/H₂O, MeOH) unter Bildung von 9,6 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen N-Acetylneuraminsäurerest darstellt, R² und R³ jeweils Palmitoylgruppen sind und n die Bedeutung von 8 hat.
Wurde dieses Sialylphospholipid einer TLC-Analyse unterzogen, so zeigte es einen einzigen Spot und reagierte positiv sowohl auf Ditmmer-Reagenz als auch auf das Resorcin-Reagenz. Eine Instrumentalanalyse ergab folgende Werte: 1H-NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ0,896 (6H, t J = 6,9 Hz), δ1,327 (56H, m), δ1,525 (4H, m), δ1,616 (4H, m), δ1,729 (1H, t, J = 12,4 Hz), δ1,997 (3H, s), δ2,310 (2H, t, J = 7,4 Hz), δ2,326 (2H, t, J = 7,4 Hz), δ2,674 (1H, dd, J = 13,2, 4,7 Hz), δ3,997 (2H, t, J = 6,0 Hz), δ4,141 (1H, dd, J = 12,1, 7,1 Hz), δ4,436 (1H, dd, J = 12,1, 3,3 Hz), δ5,247 (1H, m). Molekulargewicht 1067. Dieses Sialinsäurederivat wird nachfolgend als „Sialylphospholipid 1" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 2: Herstellung von N-Acetylneuaminylphospholipid
4,39 g 1,8-Octandiol wurden in 200 ml Chloroform gelöst und 7,90 g von hydriertem Sojabohnen-Phosphatidylcholin (hergestellt von der Taiyo Kagaku) wurden zu dem vorstehenden Gemisch gefügt, 30 ml einer Essigsäurepufferlösung (pH 5,6) und 3 ml einer 0,4 M wässrigen Lösung von Calziumacetat wurden zu dem vorstehenden Gemisch gefügt, Darüber hinaus wurden 300 Einheiten PLD, gelöst in der gleichen Pufferlösung, allmählich zu dem vorstehenden Gemisch gefügt und anschließend wurde das erhaltene Gemisch 50 Stunden bei 30 bis 35°C gerührt, so dass die Komponenten miteinander reagieren konnten. Nach vollständiger Reaktion wurden die organischen Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert und das destillierte Produkt wurde durch Chromotographie an einer Säule von Siliciumdioxidgel (AcOEt : CHCl₃ = 3 : 1) gereinigt unter Bildung von 5, 65 g Phosphatidyloctanol.
2,34 g eines Benzylesters des Peracetyl-2-chlorderivats von N-Acetylneuraminsäure, hergestellt nach der im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Methode, und 3,33 g Phosphatidyloctanol wurden in 200 ml Choroform gelöst. Anschließend wurden 1,14 g Dinatriumhydrogenphosphat und 2,34 g Molekularsieb 4A zu dem vorstehenden Gemisch gefügt. Nach dem Kühlen des Gemischs auf –50°C bis –40°C wurde eine Mischung von 1,03 g Silbertrifluormethansulfonat, gelöst in 15 ml Toluol, zu dem Gemisch getropft. Anschließend wurde allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, so dass die Komponenten miteinander reagieren konnten. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs durch Celite, wurden die unlöslichen Anteile entfernt, wobei man ein Filtrat erhielt. Anschließend wurden die organischen Lösungsmittel aus dem Filtrat abdestilliert. Der Rückstand wurde dann durch Säulenchromotographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (CH₂Cl₂ : MeOH = 20 : 1–1 : 1) unter Bildung von 900 mg eines methylierten Produkts von acetylierten Sialylphospholipidderivaten.
234 mg des acetylierten Produkts von Sialylphospholipid wurden in 70 ml Methanol gelöst, Unter Eiskühlung wurde eine 30%-Methanollösung von Kaliummethoxid (MeOK 42 mg/MeOH 100 mg) allmählich zu dem Gemisch getropft. Nach beendeter Reaktion wurde das Gemisch neutralisiert (auf pH 8) durch Zusatz von „Dowex-50" (H⁺-Form) und anschließend wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des „Dowex-50" filtriert. Die organischen Lösungsmittel wurden aus dem Filtrat abdestilliert und anschließend wurde das destillierte Filtrat durch Säulenchromographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (CHCl₃ : MeOH = 2 : 1) unter Bildung von 111 mg eines methylierten Produkts von Sialylphospholipid. 100 mg des methylierten Produkts von Sialylphospholipid wurden ein einem gemischten Lösungsmittel aus 30 ml Ethanol und 10 ml Chloroform gelöst. 20 mg 10%-Palladium auf Aktivkohle wurden zu dem vorstehenden Gemisch gefügt und die erhaltene Mischung wurde ausreichend durch Ultraschalldispersion vermischt. Drei Tropfen 0,01 N-Chlorwasserstoffsäure wurden zu dem Gemisch getropft und die Wasserstoffadditionsreaktion wurde 24 Stunden unter Rühren unter Normaldruck durchgeführt. Nach beendeter Reaktion wurde der Druck zur Entfernung von Wasserstoff und Ersatz durch Stickstoff verringert. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch Celite filtriert, die Palladium-Aktivkohle wurde entfernt und man erhielt ein Filtrat. Anschließend wurden die organischen Lösungsmittel aus dem Filtrat abdestilliert und das destillierte Filtrat wurde durch präparative TLC gereinigt (CHCl₃ : MeOH : H₂O = 70 : 30 : 5) unter Bildung von 43,2 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen N-Acetylneuraminsäurerest darstellt, R² und R³ jeweils Acylgruppen von hydriertem Sojabohnen-Phosphatidylcholin sind und n die Bedeutung von 8 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachfolgend als „Sialylphospholipid 2" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 3: Herstellung von 1-Methoxyxarbonyl-N-Acetylneuraminylphospholipid
3 g N-Acetylneuraminsäure wurden in 300 ml Methanol gelöst. 3 g „Dowex-50" (H⁺-Form) wurden zu dem Gemisch gefügt und das erhaltene Gemisch wurde dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des „Dowex-50" filtriert. Die methanolische Filtratlösung wurde auf ein Volumen von 15 ml konzentriert. Zu diesem Konzentrat wurden 6 ml Diethylether bei –20°C gefügt unter Bildung von 2,47 g eines methylierten Produkts von N-Acetylneuraminsäure durch Umkristallisieren.
Zu dem so erhaltenen methylierten Produkt wurden 25 g Acetylchlorid und 3 g Essigsäureanhydrid bei –20°C gefügt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß mit trockenem gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und das erhaltene Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde das Reaktionsgemisch vollständig mit Benzol und Toluol entwässert. Dieses Produkt wurde dann aus einem Gemisch aus gleichen Mengen von Dichlormethan, Diethylether und Hexan umkristallisiert unter Bildung von 3 g eines acetylierten Produkts.
Dieses acetylierte Produkt wurde in 60 ml Dichlormethan, enthaltend 6 g Molekularsieb 4A, 5 g Ag₂CO₃ und 3 g 1,8-Octandiolmonomethylester bei –20°C gelöst und das erhalte Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, um eine Glycosylierungsreaktion durchzuführen. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs durch Celite wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde dann durch Säulenchromotographie an Siliciumdioxidgel (CH₂Cl₂ : MeOH = 98 : 2) gereinigt unter Bildung von 1,9 g eines glycosylierten Produkts (Rf = 0,63 Kieselsäuregel/CH₂Cl₂ : MeOH = 15 : 1)
Unter Eiskühlung wurden 1,9 g des glycosylierten Produkts in 30 ml eines völlig entwässerten Methanols gelöst. Unter Eiskühlung wurden 300 mg Kalium zu dem vollständig entwässerten Methanol gefügt, um Kaliummethoxid herzustellen, das anschließend zu einer methanolischen Lösung des vorstehend erhaltenen glycosylierten Produkts gefügt wurde. Nach dem Durchführen der Reaktion unter Rühren des Gemischs bei 0°C während 3 Stunden wurde „Dowex-50" (H⁺-Form) zu dem Reaktionsgemisch bei –20°C gefügt. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemischs zur Entfernung des „Dowex-50" wurde Methanol aus Bern Filtrat abdestilliert und das destillierte Filtrat wurde durch Säulenchromatographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (CHCl₃ : MeOH = 5 : 1) unter Bildung von 0,9 g eines deacetylierten Produkts (Rf = 0,25 Kieselgel/CHCl₃ : MeOH = 5 : 1).
Das deacetylierte Produkt wurde mit 3 g Dipalmitoylphosphatidylcholin bei 30°C während 6 Stunden in einem gemischten Lösungsmittel, das 120 ml Diethylether und 24 ml Wasser enthielt, in Anwesenheit von 6 ml 0,4 M Calziumacetat und 100 Einheiten PLD unter Bildung eines Rohprodukts umgesetzt. Das Rohprodukt wurde dann durch Chromatographie and Kieselgel (CHCl₃ : MeOH = 9 : 1) bereinigt unter Bildung von 0,3 g des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen 1- Methoxycarbonyl-N-acetylneuraminsäurerest darstellt, R² und R³ jeweils Palmitoylgruppen sind und n die Bedeutung von 8 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 3" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 4. Herstellung von 9-O-Acetylneuraminylphospholipid
400 mg 1,3-Propandiol, 790 mg Distearoylphosphatidylcholin (hergestellt von Funakoshi) und 420 mg 9-O-Acetylneuraminsäure hergestellt in üblicher Weise wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in der gleichen Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 4,5 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen 9-O-Acetylneruaminsäurerest, R² und R³ jeweils Stearoylgruppen und n 3 bedeuten. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 4" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 5: Herstellung von 4-O-Acetylneuraminylphospholipid
420 mg 1,4 Butandiol, 765 mg Dimyristoylphosphatidylcholin (hergestellt von Funakoshi) und 420 mg 4-O-Acetylneuraminsäure, hergestellt in üblicher Weise, wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in der gleichen Weise wie in Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 4,7 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formen (2), worin X³ einen 3-O-Acetylneuraminsäurerest bedeutet, R² und R³ jeweils Myristoylgruppen sind und n die Bedeutung von 4 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 5" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 6: Herstellung von 3'-Sialyllactosylphospholipid
240 mg 1,6 Hexandiol, 400 mg Stearoyllysophosphatidylcholin (hergestellt von Funakoshi) und 200 mg 3'-Sialyllactose wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in gleicher Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 2,2 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen 3'-Sialyllactoserest bedeutet, R² eine Stearoylgruppe ist, R³ ein Wasserstoffatom ist, und n die Bedeutung von 6 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 6" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 7. Herstellung von 6'-Sialyllactosylphospholipid
280 mg 1,10-Decandiol, 400 mg Dilinolenoylphosphatidylcholin (hergestellt von Funakoshi) und 200 mg 6'-Sialyllactose wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in gleicher Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 2,1 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen 6'-Sialyllactoserest bedeutet, R² und R³ jeweils Linolenoylgruppen sind und n die Bedeutung von 10 hat. Dieses Sialinsäurederivats wird nachstehend als „Sialylphospholipid 7" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 8: Herstellung von N-Acetylneuraminylphospholipid
230 mg 1,8-Octandiol, 250 mg Diarachidonoyllecithin (hergestellt von Funakoshi), und 200 mg N-Acetylneuraminsäure wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in gleicher Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 2,5 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen N-Acetylneuraminsäurerest bedeutet, R² und R³ jeweils Arachidonoylgruppen sind und n die Bedeutung von 8 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 8" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 9: Herstellung von N-Acetylneuraminylphospholipid
440 mg 1,8-Octandiol, 790 mg 1-Palmitoyl-2-stearoyllecithin (hergestellt von Funakoshi) und 400 mg N-Acetylneuraminsäure wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in gleicher Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 4,5 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ ein N-Acetylneuraminsäurerest ist, R² eine Palmitoylgruppe ist, R³ eine Stearoylgruppe ist und n die Bedeutung von 8 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 9" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 10: Herstellung von N-Acetylneuraminylphospholipid
440 mg 1,8 Octandiol, 790 mg 1-Stearoyl-2-palmitoyllecithin (hergestellt von Funakoshi) und 400 mg N-Acetylneuraminsäure wurden als Ausgangsmaterialien verwendet. Diese Ausgangsmaterialien wurden in gleicher Weise wie im Herstellungsbeispiel 2 behandelt unter Bildung von 4,3 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. ein Sialylphospholipid der allgemeinen Formel (2), worin X³ einen N-Acetylneuraminsäurerest bedeutet, R² eine Stearoylgruppe ist, R³ eine Palmitoylgruppe ist und n die Bedeutung von 8 hat. Dieses Sialinsäurederivat wird nachstehend als „Sialylphospholipid 10" bezeichnet.
Beispiel 1. Herstellung von Monosialyloliqosacchariden
40 kg eines von Lipiden befreiten Hennen-Eidotters (Pulver) wurden in 200 Liter Wasser suspendiert und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren des vorstehenden Gemischs wurde das Gemisch 2 Tage bei 4°C inkubiert, um geringe Mengen an unlöslichen Substanzen auszufällen und eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde auf ein Volumen von 20 Liter konzentriert unter Verwendung einer Membran zur Umkehrosmose („NTR-7410", hergestellt von Nitto Denko). Nachdem der pH-Wert des erhaltenen Konzentrats auf 5,0 eingestellt wurde, wurden 40 g von Lipiden befreites Mandelpulver zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde einen Tag bei 37°C gerührt. Anschließend wurde das erhaltene Gemisch filtriert und das Filtrat wurde an 100 Liter eines Anionenaustauscherharzes („Dowex 1 × 8", hergestellt von der Dow Chemical) adsorbiert. Das adsorbierte Harz wurde mit 200 Liter Wasser gewaschen und anschließend einer Gradienten-Elution unterworfen unter Verwendung einer 0 bis 0,15 M wässrigen Lösung von AcONa. Eine Fraktion von 0 bis 0,06 M wurde konzentriert, entsalzt und anschließend getrocknet, unter Bildung von 1,4 g Monosialyloligosacchariden. Die Reinheit des Produkts wurde durch HPLC gemessen und erwies sich als 93%.
Beispiel 2: Herstellung von Disialyloligosacchariden
100 kg eines von Lipiden befreiten Hennen-Eidotters (Pulver) wurden in 500 Liter Wasser suspendiert und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren des vorstehenden Gemischs wurde das Gemisch 2 Tage bei 4°C inkubiert, um geringe Mengen an unlöslichen Substanzen auszufällen und eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde auf ein Volumen von 50 Litern konzentriert unter Verwendung einer Membran zur Umkehrosmose, wie in Beispiel 1 beschrieben. Anschließend wurde der pH-Wert des erhaltenen Konzentrats auf 5,0 eingestellt und 700 g von Lipiden befreitem Mandelpulver wurden zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde einen Tag bei 37°C gerührt. Nach dem Filtrieren des erhaltenen Gemischs wurde das Filtrat an 250 Liter des gleichen Anionenaustauscherharzes wie im Beispiel 1 adsorbiert. Anschließend wurde das adsorbierte Harz mit 500 Liter Wasser gewaschen und einer Gradienten-Elution unter Verwendung einer 0 bis 0,3 M NaCl-Lösung unterzogen. Eine Eluens-Fraktion von 0,05 bis 0,1 M NaCl wurde konzentriert, entsalzt und anschließend getrocknet unter Bildung von 29,5 g Disialyloligosacchariden. Die Reinheit des erhaltenen Produkts wurde durch HPLC gemessen und erwies sich als 95%.
Beispiel 3: Herstellung von Disialyloligosacchariden
Es wurde wie im Beispiel 2 gearbeitet unter Bildung eines Konzentrats mit einem Volumen von 50 Liter. Der pH-Wert des erhaltenen Konzentrats wurde auf 5,0 eingestellt und 700 g von Lipiden befreitem Aprikosenkern-Pulver wurden zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde einen Tag bei 37°C gerührt. Nach dem Filtrieren des erhaltenen Gemischs wurde das Filtrat an 250 Liter des gleichen Anionenaustauscherharzes wie im Beispiel 1 adsorbiert. Das absorbierte Harz wurde mit 500 Liter Wasser gewaschen und einer Gradienten-Elution unterworfen unter Verwendung einer 0 bis 0,3 M Lösung von NaCl. Eine Eluens-Fraktion von 0,05 bis 0,1 M NaCl wurde konzentriert, entsalzt und anschließend getrocknet unter Bildung von 27,2 g Disialyloligosacchariden. Die Reinheit des erhaltenen Produkts wurde durch HPLC gemessen und erwies sich als 92%.
Testbeispiel 1: Bestätigung des Struktur der Oligosaccharidkette
Die Struktur der Zuckerkette jedes in den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Oligosaccharides wurde bestätigt. Speziell wurde das erhaltene Oligosaccharid mit ABEE derivatisiert nach der in der Literatur beschriebenen Methode (Journal of Food Science, 58 743–747 (1993)) und die Struktur wurde durch Bio-Gel-P-4-Chromatographie, HPLC, NMR und eine Analyse der Zuckerzusammensetzung bestätigt. Die Tabelle 1 zeigt die durch die NMR-Analyse erhaltenen Ergebnisse.
Tabelle 1
Anmerkungen
Die HPLC-Analysen zeigten, dass die Oligosaccharide von Beispiel 1 MS1 und MS2 gemäß Tabelle 1 als Hauptkomponenten enthielten und die Oligosaccharide der Beispiele 2 und 3 DS gemäß Tabelle 1 als Hauptkomponente enthielten. Durch Vergleich der Daten in der Tabelle 1 mit bekannten in der Literatur veröffentlichten Daten (Journal of Food Science 58, 743–747 (1993)) zeigte es sich, dass die Struktur der Zuckerketten der in den Beispielen erhaltenen Oligosaccharide folgende war:
Erhalten in Beispiel 1
Erhalten in den Beispielen 2 und 3
Es ist bekannt, dass die Hauptkomponenten der Sialyloligosaccharide in Hennen-Eidotter MS1, MS2 und DS, wie vorstehend erwähnt, sind (Journal of Food Science 58, 743–747 (1993). Daher ist es trotz der Anwesenheit von Gylcosidase möglich, ein gewünschtes Oligosaccharid leicht ohne Schädigung der Zuckerstruktur nach der erfindungsgemäßen Methode zu erhalten. Im folgenden wird das Gemisch von MS1 und MS2, dass im Beispiel 1 erhalten wurde, als „MS" bezeichnet.
Herstellungsbeispiel 11: Herstellung von Disialyloligosaccharid-Phospholipid
4,5 g 1,8-Octandiol wurden in 200 ml Chloroform gelöst und 6,8 g Dipalmitoylphosphatidylcholin wurden zu dem Gemisch gefügt. 30 ml einer Essigsäure-Pufferlösung (pH 5,6) und 3 ml 0,4 M wässrige Calziumacetatlösung wurden zu dem Gemisch gefügt. Darüber hinaus wurden 370 Einheiten von PLD, gelöst in 0,6 ml der gleichen Pufferlösung (pH 5,6) allmählich zu dem Gemisch gefügt und anschließend wurde das erhaltene Gemisch 50 Stunden bei 30 bis 35°C gerührt, so dass die Komponenten miteinander reagieren konnten. Nach beendeter Reaktion wurden die organischen Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch entfernt und das destilierte Produkt wurde durch Säulenchromotographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (AcOEt : CHCl₃ = 3 : 1) unter Bildung von 5,5 g Phosphatidyloctanol.
18 g Disialyloligosaccharid, erhalten im Beispiel 2, wurden in 1 Liter Methanol gelöst. 10 g „Dowex-50" (H⁺-Form) wurden zu dem Gemisch gefügt und das erhaltene Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch filtriert zur Entfernung des „Dowex-50". Die als Filtrat erhaltene Methanollösung wurde auf ein Volumen von 30 ml konzentriert. Zu diesem Konzentrat wurden 10 ml Diethylether bei –20°C gefügt unter Bildung von 15,3 g eines methylierten Produkts von Disialyloligosaccharid durch Umkristallisieren.
Zu dem so erhaltenen methylierten Produkt wurden 25 g Acetylchlorid und 3 g Essigsäureanhydrid bei –20°C gefügt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß mit trockenem gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und das erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde das Gemisch vollständig mit Benzol und Toluol entwässert. Dieses Produkt wurde dann aus einem Gemisch aus äquivalenten Mengen von Dichlormethan, Diethylether und Hexan umkristallisiert unter Bildung von 16,2 g eines acetylierten Produkts.
Dieses acetylierte Produkt wurde bei –20°C in 100 ml Dichlormethan, enthaltend 15 g Molekularsieb 4A, 10 g Ag₂CO₃ und 5 g Phosphatidyloctanol, wie vorstehend erhalten, gelöst, und das erhaltene Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um eine Glycolisierungsreaktion durchzuführen. Anschließend wurde das Gemisch durch Celite filtriert und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde dann durch Säulenchromotographie an Siliciumdioxidgel gereinigt (CH₂Cl₂ : MeOH = 9 : 1) unter Bildung von 1,08 g eines methylierten Produkts von acetylierten Disialyloligosaccharid-Phospholipid-Derivaten.
500 mg des vorstehend erhaltenen methylierten Produkts wurden in 100 ml Methanol gelöst. Unter Eiskühlung wurde eine 30% methanolische Lösung von Kaliummethoxid (MeOK 42 mg/MeOH 100 mg) allmählich zugetropft. Nach beendeter Reaktion wurde das Gemisch durch Zusatz von „Dowex-50" (H⁺-Form) netralisiert und anschließend wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung des „Dowex-50" filtriert. Anschließend wurden die organischen Lösungsmittel in dem erhaltenen Filtrat abdestilliert. Das destillierte Filtrat wurde dann durch Säulenchromatographie and Siliciumdioxidgel (CHCl₃ : MeOH = 2 : 1) gereinigt unter Bildung von 235 mg eines methylierten Produkts von Disialyloligosaccharid-Phospholipid.
200 mg des vorstehend erhaltenen methylierten Produkts wurden in einem gemischten Lösungsmittel aus 20 ml THF und 10 ml H₂O gelöst. Unter Eiskühlung wurden 0,6 ml 1 N-NaOH-Lösung zu dem vorstehenden Gemisch gefügt und das erhaltene Gemisch wurde eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von „Dowex-50" (H⁺-Form) neutralisiert und anschließend wurde das Harz mit H₂O gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden zusammen konzentriert und das konzentrierte Gemisch wurde durch Säulenchromatographie (ODS/H₂O, MeOH) gereinigt unter Bildung von 20,1 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. Disialyloligosaccharid-Phospholipid (DSPL3). Dieses Disialyloligosaccharid-Phospholipid wurde einer TLC-Analyse unterzogen und zeigte einen einzigen Fleck und reagierte positiv sowohl mit dem Ditmmer-Reagenz als auch mit Resocin-Reagenz.
Durch Änderung der Ausgangsmaterialien für die Phospholipide und die Abstandhalter wurde Sialinsäurederivate mit verschiedenen Acylgruppen erhalten. Distearoylphophatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,3-Propandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Erzielung von DSPL1. Dimyristoylphosphatidylcholin wurde als Phospholipid und 1,4-Butandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von DSPL2.
Diarachidoylphosphatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,8-Octandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von DSPL4. Dilinolenoylphosphatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,10-Decandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von DSPL5. Jede der Strukturen der Sialinsäurederivate ist nachstehend aufgeführt.
Herstestellungsbeispiel 12: Herstellung von Monosialyloliagsaccharid-Phospholipid
Es wurde gearbeitet wie in Beispiel 11, jedoch unter Verwendung der Monosialyloligosaccharide (MS) die im Beispiel 1 erhalten wurden, Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin und 1,8-Octandiol unter Bildung von 20,1 mg des gewünschten Sialinsäurederivats, d. h. Monosialyloligosaccharid-Phospholipid (MSPL3).
Durch Veränderung der Ausgangsmaterialen für die Phospholipide und die Abstandhalter, wurden Sialinsäurederivate mit unterschiedlichen Acylgruppen und Abstandhaltern erzielt. Distearoylphophatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,3-Propandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von MSPL1.
Dimyristoylphosphatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,4-Butandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von MSPL2. Diarachidyolphosphatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,8-Octandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von MSPL4. Dilinolenoylpholsphatidylcholin wurde als Phospholipid verwendet und 1,10-Decandiol wurde als Abstandhalter verwendet unter Bildung von MSPL5. Jede der Strukturen der Sialinsäurederivate wird nachstehend aufgeführt.
Herstellungsbeispiel 13: Herstellung von Sialyloligosaccharidpeptiden
50 kg eines von Lipididen befreiten Hühner-Eidotters (Pulver) wurde in 250 Liter Wasser suspendiert und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren des Gemischs wurde das Gemisch zwei Tage bei 4°C inkubiert, um geringe Mengen an unlöslichen Substanzen auszufällen, wobei eine überstehende Flüssigkeit erzielt wurde. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde auf ein Volumen von 50 Liter konzentriert unter Verwendung einer Membrane zur Umkehrosmose (RO-Membran). Das Konzentrat wurde an 250 Liter eines Anionaustauscherharzes („MSA-1", hergestellt von der Dow Chemical) adsorbiert. Anschließend wurde das adsorbierte Harz mit 500 Liter Wasser gewaschen und unter Verwendung von 50 mM NaCl-Lösung eluiert. Jede der mit Wasser gewaschenen Fraktionen und der 50 mM NaCl-Eluensfraktion wurde konzentriert, entsalzt und anschließend getrocknet, unter Bildung von jeweils 5,6 g Monosialyloligosaccharidpeptiden (MS-Peptiden) und 13,8 g Disialyloligosaccharidpeptiden (DS-Peptiden). Die Reinheit der erhaltenen Produkte wurde durch HPLC bestimmt und erwies sich als 88% bzw. 91%.
Testbeispiel 2: Inhibitorische Wirkung von Sialinsäurederivaten auf die durch das Influenza-Virus induzierte Hämagglutination
0,25 mL PBS, enthaltend jeweils die Proben der Tabelle 2 in variierenden Konzentrationen, wie in Tabelle 2 angegeben, wurden mit 0,25 mL Flüssigkeit, die das Influenza A₂. Virus (4HA-Einheiten) enthielt, vermischt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C gerührt. Anschließend wurde das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Hämagglutinationsfähigkeit von Hennen-Erythrocyten wurde bestimmt. Unter Verwendung der Testprobe, die von den Tieren stammte, die PBS ohne einen Gehalt von Sialinsäurederivat als Kontrolle erhielten, wurde die Hämagglutinations-Inhibierungsrate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde gefunden, dass Sialinsäurederivate, insbesondere die an Phospholipid gebundenen, eine inhibitorische Wirkung auf die durch Influenza induzierte Hämagglutination haben. Es wurde auch gefunden, dass die inhibierende Wirkung jedes Sialinsäurederivats beträchtlich höher war als die von N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 3: Inhibitorische Wirkung von Sialinsäurederivaten auf Infektion mit Rotavirus
100 μl von Eagle's Minimum Essential Medium (hergestellt von Nissui, im folgenden als EMEM bezeichnet), die jede der Proben der Tabelle 3 in variierenden Konzentrationen, wie in Tabelle 3 gezeigt, oder jedes der Sialinsäurederivate, (Sialylphospholipide) erhalten in den Herstellungsbeispielen 2, 4, 6 und 8 und N-Acetylneuraminsäure in Konzentrationen von 100 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,1 mg/mL und 0,01 mg/mL enthielten, wurden mit 100 μl EMEM, welches das menschliche Rotavirus (MO-Zelllinie) enthielt, vermischt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wurde zu MA 104-Zellen (Affennierenzellen) gefügt, die zum Zusammenfluss in jeder Vertiefung einer Titrationsplatte mit 96 Vertiefungen gezogen wurden. Die Platte wurde 1 Stunde by 37°C inkubiert und anschließend wurde der flüssige Anteil entfernt. Anschließend wurde EMEM zugefügt und es wurde weitere 17 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde nach dem Fixieren mit gekühltem Methanol die Rate der Rotavirusinfektion bestimmt durch Färben der infizierten Zellen unter Anwendung einer indirekten Technik mit fluoresierendem Antikörper. Unter Verwendung der Kontrolle, die mit EMEM behandelt wurde, das kein Sialinsäurederivat enthielt, anstelle des EMEM, das die vorstehenden Sialinsäurederivate enthielt, wurde die Inhibierungsrate der Rotavirusinfektion bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 und Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Wie in der 1 und Tabelle 3 gezeigt, wurde gefunden, dass jedes der Sialinsäurederivate eine inhibierende Wirkung auf die Infektion mit Rotavirus zeigte und dass die inhibierende Wirkung beträchtlich größer war als die von N-Acetylneuaminsäure.
Testbeispiel 4: Inhibierende Wirkung von Sialinsäurederivaten auf die Proliferation von Rotavirus
Menschliches Rotavirus (MO-Zelllinie) wurde zu MA104-Zellen gefügt, die zum Zusammenfluss in einer Rollflasche gezogen wurden und unter Schütteln während 1 Stunde bei 37°C kultiviert wurden, wodurch die MA104-Zellen mit dem Rotavirus infiziert wurden. Anschließend wurden die infizierten Zellen mit EMEM gewaschen, und EMEM, das jede der Proben in variierender Konzentration, wie in Tabelle 4 angegeben, enthielt, wurde zu der Rollflasche gefügt, die anschließend einer Schüttelkultur bei 37°C während 3 Tagen unterzogen wurden. Die überstehende Flüssigkeit der Kultur, der Infektionstiter des Rotavirus wurde durch eine indirekte Technik mit fluoresierendem Antikörper bestimmt. Man erhielt die Inhibierungsrate der Proliferation des Rotavirus im Vergleich mit der Kontrolle für die EMEM verwendet wurde, die keine Sialinsäurederivate enthielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde gefunden, dass jedes der dargestellten Sialinsäurederivate eine inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Rotavirus hatte und dass die inhibierende Wirkung beträchtlich größer war als die von N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 5: Antivirale Wirkung von Sialinsäurederivaten auf das Virus der Newcastle Disease
0,25 mL PBS, enthaltend jeweils die Proben in variierenden Konzentrationen, die in Tabelle 5 angegeben sind, wurden mit 0,25 mL einer Flüssigkeit, die das Newcastle-Disease-Virus (4HA-Einheiten) enthielt, vermischt und das Gemisch wurde bei 37°C während 30 Minuten geschüttelt. Nach einer Stunde Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Inhibierungsrate für die Hämagglutination mit Hennen-Erythrocyten bestimmt im Vergleich mit der Kontrolle bei der PBS, das keine Sialinsäurederivate enthielt, verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5
Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde gefunden, dass die Sialinsäurederivate eine inhibitorische Wirkung auf die durch das Virus der Newcastle-Disease induzierte Hämagglutination ausübte und dass die inhibitorische Wirkung beträchtlich größer war als die von N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 6: Antivirale Wirkung von Sialinsäurederivaten auf das Herpes-Virus
0,25 mL EMEM, enthaltend jeweils die in Tabelle 6 aufgeführten Proben in variierendem Konzentrationen, wurden mit 0,25 mL EMEM vermischt, das das Herpes-Simplex-Virus I enthielt und es wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wurde zu einer Kultur von Hela-Zellen gefügt, die zum Zusammenfluss in einer Miniflasche gezüchtet worden waren und es wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Dekantieren der Lösung wurde EMEM zu dem Rest gefügt und es wurde weitere 72 Stunden inkubiert. Es wurde durch Zusatz von 10% Formalin fixiert und anschließend wurde die Probe mit Kristallviolett gefärbt, um die Anzahl der Plaques zu zählen. Man erhielt die Inhibierungsrate der Plaque-Bildung im Vergleich mit der Kontrolle bei der EMEM, die keine Sialinsäurederivate enthielt, verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde gefunden, dass die Sialinsäurederivate, insbesondere die an Phospholipide gebundenen, eine antivirale Wirkung auf das Herpes-Virus hatten und dass jedes der Sialinsäurederivate eine beträchtlich höhere inhibierende Wirkung auf die Plaquebildung hatte als N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 7: Inhibierende Wirkung von Sialinsäurederivaten auf die Adhäsion von Helicobacter pylori
PBS, enthaltend jede der Proben in verschiedenen Konzentrationen, wie in Tabelle 4 angegeben, wurde mit einer Suspension vermischt, die Helicobacter pylori in PBS (2 × 10⁵ CFU/mL) enthielt, und das Gemisch wurde bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde es zu einer Platte mit 24 Vertiefungen, die mit Mucin (von Schweinen) überzogen war, gefügt, und die Platte wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde der flüssige Anteil entfernt, der Rückstand wurde mit PBS gewaschen und die Anzahl der Zellen in dem Rest wurde nach der Indophenol-Methode bestimmt, die die Aktivität von Urease, die durch die Bakterien als Sekret abgespalten wird, als Indikator, ausnutzt. Die Inhibierungsrate der Bakterien-Adhäsion wurde bestimmt im Vergleich mit der Kontrolle, die PBS ohne Sialinsäurederivate enthielt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7
Wie aus der Tabelle 7 ersichtlich, wurde gefunden, dass die Sialsäurederivate, insbesondere die an Phospholipide gebundenen, eine inhibitorische Wirkung auf die Adhäsion von Helicobacter pylori zeigten und das jedes der Sialinsäurederivate eine beträchtlich größere inhibitorische Wirkung auf die Adhäsion hatte als N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 8: Entzündungshemmende Wirkung von Sialinsäure-Derivaten (Wirkung auf das durch Carragheen-induzierte Knieödem)
Männlichen Wister-Ratten (Alter 8 Wochen) wurden intravenös 2 mL Evans Blue/Salzlösungs-Gemisch (10 mg/mL) injiziert und anschließend wurden in die Gelenkhöhlung des rechten Knies 0,1 mL 2% Carragheen/Salzlösung injiziert. 15 Minuten vor der Injektion des Carragheens wurden 100 μL, 10 μL und 1 μL jeder der in der Tabelle 8 angegebenen Proben, gelöst in 100 μL Salzlösung oder nur 100 μL Salzlösung als Kontrolle in die Gelenkhöhlung injiziert. Vier Stunden später wurden die Ratten getötet, enthäutet, um das Kniegelenk freizulegen und es wurde die Infiltration von Evans Blue untersucht. Anschließend wurden 0,15 mL Salzlösung in die Gelenkhöhlung injiziert und das Gelenk wurde geöffnet, um 5 mL der in dem Gelenk enthaltenen Flüssigkeit zu sammeln. Die Anzahl der Zellen, die in der Flüssigkeit enthalten waren, wurde gezählt und es wurde die Inhibierungsrate unter Verwendung der Anzahl der Zellen in der Kontrolle als 100% nach folgender Gleichung berechnet:
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8
Wie in der Tabelle 8 gezeigt, wurde gefunden, dass die Sialinsäure-Derivate einen entzündungshemmenden Effekt hatten und dass jedes der Sialinsäure-Derivate eine beträchtlich höhere anti-inhibitorische Wirkung als N-Acetylneuraminsäure hatten.
Testbeispiel 9: Anti-allergische Wirkung von Sialinsäure-Derivaten (Effekt auf die PCA-Reaktion (passive kutane anaphylaktische))
Männlichen Hartlay-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 bis 400 g wurden intrakutan 0,1 mL einer 16 × 10³-Verdünnung oder 8 × 10⁴-Verdünnung eines Antiserums injiziert (Kaninchen Ig G mit einem Antikörpertiter von nicht weniger als 1/36000). Vier Stunden später wurde eine PCA-Reaktion durch intravenöse Injektion einer Antigenlösung provoziert, die 10 mg/kg eines Antigens (Ovalbumin) in 2 mL 1% Evans Blue enthielt. Anschließend wurden die Meerschweinchen getötet und enthäutet, um die Fläche der Pigmentinfiltration zu messen. Die Menge des Pigments in dem blaugefärbten Hautanteil wurde spektrometrisch (620 nm) nach der Methode von Katayama (Microbiol. Immunol., 22 89(1978)) gemessen, wobei man die Konzentration des extrahierten Pigments erhielt. Dreißig Minuten vor der Auslösung der PCA-Reaktion, d. h. 3,5 Stunden nach der Sensibilisierung mit dem Antiserum, wurde jedes Sialinsäure-Derivat oder Salzlösung in Meerschweinchen in den nachstehenden Gruppen intravenös injiziert und die Wirkung der Sialinsäure-Derivate auf die PCA-Reaktion wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Prozent, basierend auf den Messungen in der Gruppe V, ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9
Wie in der Tabelle 9 gezeigt, wurde gefunden, dass die Sialinsäure-Derivate eine anti-allergische Wirkung hatten und dass jedes der Sialinsäure-Derivate eine wesentlich größere anti-allergische Wirkung hatte als N-Acetylneuraminsäure
Die Arten und die Dosierungen der in jeder Gruppe verwendeten Proben sind im folgenden aufgeführt:
Gruppe I: MS wurde in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht, 5 mg/kg Körpergewicht und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht;
Gruppe II: DS wurde in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht, 5 mg/kg Körpergewicht und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht;
Gruppe III: MSPL3 wurde in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht, 5 mg/kg Körpergewicht und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht;
Gruppe IV: DSPL3 wurde in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht, 5 mg/kg Körpergewicht und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht;
Gruppe V: 1 mL/kg Körpergewicht Salzlösung wurde verabreicht und
Gruppe VI: N-Acetylneuraminsäure wurde in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht, 5 mg/kg Körpergewicht und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht.
Testbeispiel 10: Fördernde Wirkung auf die Proliferation von Bifidobacteria
Zu dem nachstehenden Medium wurden 500 mg/mL jeder der in der Tabelle 10 aufgeführten Proben gefügt, worin jeweils 5 Bakterienzellen, d. h. B. adolescentis, B. breve, B. infantis, B. longum, und E. coli inokuliert waren und es wurde bei 37°C unter anaeroben Bedingungen während 5 Tagen kultiviert. Der Proliferationsgrad der Bakterien wurde durch Messung der Trübheit bei 600 nm bewertet. Zur Berechnung der Trübheit wurde die Proliferationsrate jeder Kultur, gezogen in dem Medium, das 500 mg/mL Glukose anstelle der Proben enthielt, als 100% angenommen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 dargestellt.
Tabelle 10
Das Medium war wie folgt zusammengesetzt:
Wie in der Tabelle 10 gezeigt, wurde gefunden, dass sich die Sialinsäure-Derivate fördernd auf die Proliferation von Bifidobacteria auswirkten. Jedes der Sialinsäure-Derivate wies eine beträchtlich höhere fördernde Wirkung für die Proliferation auf als N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 11: Prophylaktische Wirkung von Sialinsäure-Derivaten auf durch Rotavirus bedingte Diarrhoe
Jeder der in den Herstellungsbeispielen 2, 4, 6 und 8 hergestellten Sialinsäure-Derivate (Sialylphospholipide) wurde mit Salzlösung auf eine Konzentration von 1,0 mg/mL verdünnt und 15 μL davon wurden jeweils an ddY-Mäuse im Alter von 5 Tagen verabreicht. Eine Stunde nach der Verabreichung der Lösungen der Sialinsäure-Derivate wurde jede Maus oral mit 50 mL einer verdünnten Rotavirus-EMEM-Lösung, mit einer ausreichenden Konzentration an Rotavirus, um eine Infektion der Maus zu bewirken, infiziert. Anschließend wurde die Diarrhoe während 5 Tagen beobachtet. Die Ergebnisse sind in der 2 dargestellt. Die Anzeichen einer Diarrhoe waren bei der Gruppe, die mit Sialinsäure-Derivaten behandelt war, beträchtlich geringer als in der Gruppe an die keine Verabreichung erfolgte, was eine ausgezeichnete prophylaktische Wirkung der Sialinsäure-Derivate auf durch Rotavirus bedingte Diarrhö anzeigt.
Testbeispiel 12: Therapeutische Wirkung von Sialinsäure-Derivaten auf durch Rotavirus erzeugte Diarrhoe
ddY-Mäuse im Alter von 5 Tagen wurden oral mit 50 μL einer verdünnten Rotavirus-EMEM-Lösung, die eine zur Infektion der Maus ausreichende Konzentration an Rotavirus aufwies, infiziert. Anschließend wurde jede der in den Herstellungsbeispielen 2, 4, 6 und 8 hergestellten Sialinsäure-Derivate (Sialylphospholipide) mit Salzlösung verdünnt auf eine Konzentration von 1,0 mg/mL und 50 μL davon wurden oral an jede Maus während 3 Tagen verabreicht. Anschließend wurde das Auftreten von Diarrhoe während 5 Tagen beobachtet und die Sterblichkeit wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der 3 dargestellt. Die durch die Diarrhö bedingte Sterblichkeit war beträchtlich geringer und die Erholung der Mäuse erfolgte rascher bei der Gruppe, die mit Sialinsäure-Derivaten behandelt war, als bei der Gruppe, an die keine Verabreichung erfolgt war. Somit wiesen die Sialinsäure-Derivate eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf durch Rotavirus-bedingte Diarrhoe auf.
Testbeispiel 13: Therapeutische Wirkung von Sialinsäure-Derivaten auf durch Salmonella Bakterien bewirkte Diarrhoe
Einhundertundzwanzig mit Salmonella dublin infizierte Kälber wurden in 12 Gruppen von jeweils 10 Tieren aufgeteilt. 11 Gruppen der Tiere wurden jeden Tag eine Milchformulierung verabreicht, die eines der Sialinsäure-Derivate (Sialylphospholipide), hergestellt in den Herstellungsbeispielen 1 bis 10 oder N-Acetylneuraminsäure in einer Menge von 100 mg/Tag enthielt und die verbliebene eine Gruppe erhielt die gleiche Milch-Zusammensetzung, die jedoch keine Sialinsäure-Derivate enthielt auf gleichem Fütterungswege. Die Tiere wurden 5 Wochen mit diesem Nahrungsmittel versehen, wobei während dieser Zeit eine Bewertung der Ausscheidungen als Index für die Diarrhoe und die Anzahl der Zellen von Salmonella dublin in den Ausscheidungen bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 11 und 12 zusammengestellt.
Tabelle 11 Bewertung der Ausscheidungen
Mittel für 10 Tiere, normalen Ausscheidungen wurde eine Bewertung von 0 erteilt, weichen Ausscheidungen 1, schlammigen Ausscheidungen 2 und wässrigen Ausscheidungen 3.
Tabelle 12 Anzahl der Zellen von Salmonella dublin in den Ausscheidungen
Mittel für 10 Tiere. Die Anzahl der Zellen pro 1 g Ausscheidung wurde in logarithmischem Maßstab angegeben.
Wie aus den Tabellen 11 und 12 hervorgeht, sind die Bewertung der Ausscheidungen und der Zellanzahl von Salmonella dublin in den Ausscheidungen geringer in den Gruppen, die eine Milchformulierung mit einem Sialinsäure-Derivat erhielten als bei der Gruppe, die die Milchformulierung ohne Sialinsäure-Derivat erhielt. Hieraus ergibt sich, dass die Sialinsäure-Derivate eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf die durch Salmonella dublin erzeugte Diarrhoe aufweisen. Jedes der Sialinsäure-Derivate zeigte eine beträchtlich höhere therapeutische Wirkung als N-Acetylneuraminsäure.
Testbeispiel 14: Therapeutische Wirkung von Sialinsäure-Derivaten auf nicht-infektiöse Diarrhoe
Sechzig Kälber wurden in 6 Gruppen von jeweils 10 Tieren aufgeteilt, Bei 5 der 6 Gruppen wurde jedem Tier täglich eine Milchformulierung verabreicht, die eines der Sialinsäure-Derivate (Sialylphospholipide), hergestellt in den Herstellungsbeispielen 2, 4, 6 und 8 oder N-Acetylneuraminsäure enthielten, in einer Menge von 100 mg/Tag, und die verbliebene 1 Gruppe erhielt auf gleichem Wege die gleiche Menge an Milchformulierung, die jedoch keine Sialinsäure-Derivate enthielt. Die Tiere wurden 5 Wochen bei dieser Ernährung gehalten, wobei die Bewertung der Ausscheidungen als Index für nicht-infektiöse Diarrhoe und der Zellgehalt der intestinalen Bakterienflora bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 13 bis 17 aufgeführt. Für die Gruppe, die N-Acetylneuraminsäure erhielt, ist lediglich die Bewertung der Ausscheidungen in den Tabellen angegeben.
Tabelle 13 Bewertung der Ausscheidungen
Mittel für 10 Tiere, normalen Ausscheidungen wurde eine Bewertung von 0 erteilt, weichen Ausscheidungen 1, schlammigen Ausscheidungen 2 und wässrigen Ausscheidungen 3.
Tabelle 14 Intestinale Bakterienflora
Mittel für 10 Tiere. Anzahl der Zellen pro 1 g Ausscheidung wurde im logarithmischen Maßstab angegeben.
Tabelle 15 Intestinale Bakterien-Flora
Mittel für 10 Tiere. Anzahl der Zellen pro 1 g Ausscheidung wurde im logarithmischen Maßstab angegeben.
Tabelle 16 Intestinale Bakterien-Flora
Mittel für 10 Tiere. Anzahl der Zellen pro 1 g Ausscheidung wurde im logarithmischen Maßstab angegeben.
Tabelle 17 Intestinale Bakterien-Flora
Mittel für 10 Tiere. Anzahl der Zellen pro 1 g Ausscheidung wurde im logarithmischen Maßstab angegeben.
Wie in den Tabelle 13 bis 17 gezeigt, ergab die Gruppe, die die Milchformulierung erhielt die eines der Sialinsäurederivate enthielt, eine niedrigere Ausscheidungsbewertung, eine geringere Anzahl von Zellen von Clostridium perfringens und Escherichia coli und eine höhere Anzahl an Zellen von Bifidobacteria und Lactobacilli als die Gruppe, die die Milchformulierung ohne Sialinsäurederivate erhielt. Hieraus ist ersichtlich, dass die Sialinsäurederivate eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf nicht-infektiose Diarrhoe haben. Aus den Ergebnissen für die Bewertung der Ausscheidungen ist ersichtlich, dass jedes der Sialinsäurederivate eine beträchtlich höhere therapeutische Wirkung aufwies als n-Acetylneuraminsäure.
Industrielle Verwertbarkeit
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann als Antivirusmittel, als Antidiarrhoemittel, als Antiuklusmittel, als entzündungswidriges Mittel als antiallergisches Mittel und als ein Mittel zur Förderung der Proliferation von Bifidobacferia verwendet werden. Die Herstellungsweise der Erfindung ermöglicht die Herstellung von Sialinsäurederivaten in wirtschaftlicher Weise und leicht in industriellem Maßstab.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch den Gehalt eines Sialinsäurederivates, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (1) oder (2) als einen aktiven Bestandteil
worin R¹ einen Zuckerrest oder einen Glycopeptidrest darstellt; und X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines vom X¹ und X² die Bedeutung von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)Glc NAc(β1,2)- hat,
worin R² and R³, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten; n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; und X³ der Rest eines Sialinsäurederivats oder der Rest eines Sialyloligosaccharidderivats ist, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (3):
worin X⁴ und X⁵, die gleich oder verschieden sein können die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, daß mindestens eines von X⁴ und X⁵ die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)Glc NAc(β1,2)-; und Y einen Zuckerrest darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als antivirales Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Heilmittel für Diarrhoe.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antiulkusmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als antiinflammatorisches Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als antiallergisches Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung als die Proliferation von Bifidobacteria förderndes Mittel.
Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (4), dadurch gekennzeichnet, dass eine Mandel zu einem Vogel-Eidotter gefügt wird:
worin R⁴ einen Zuckerrest darstellt; X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestes eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α 2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Mandel von Lipiden befreit ist.
Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (4), dadurch gekennzeichnet, dass ein Aprikosenkern zu einem Vogel-Eidotter gefügt wird:
worin R⁴ einen Zuckerrest darstellt; X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α 2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Aprikosenkern von Lipiden befreit ist.
Sialinsäurederivat, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (1) oder (2):
worin R¹ einen Zuckerrest oder einen Glycopeptidrest darstellt; und X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-,
worin R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten; n eine ganze Zahle von 1 bis 20 ist; und X³ den Rest eines Sialinsäurederivats oder den Rest eines Sialyloligosaccharidderivats, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (3) bedeutet:
worin X⁴ und X⁵, die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X⁴ und X⁵ die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-; und Y einen Zuckerrest darstellt, zur Verwendung in der Therapie.
Sialinsäurederivat nach Anspruch 12 zur Verwendung in der Therapie als antivirales Mittel, als Heilmittel für Diarrhoe, als Antiulkusmittel, als antiinflammatorisches Mittel, als antiallergisches Mittel oder als die Proliferation von Bifidobacferia förderndes Mittel.
Verwendung eines Sialinsäurederivats, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (1) oder (2):
worin R¹ einen Zuckerrest oder einen Glycopeptidrest darstellt; und X¹ und X², die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X¹ und X² die Bedeutung hat von NeuAc(α 2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-,
worin R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Acylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten; n eine ganze Zahl von 1 bis 20; und X³ den Rest eines Sialinsäurederivats oder den Rest eines Sialyloligosaccharidderivats, dargestellt durch die nachstehende allgemeine Formel (3) bedeutet:
worin X⁴ und X⁵, die gleich oder verschieden sein können, die Bedeutung haben von NeuAc(α 2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-, Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)- oder GlcNAc(β1,2)-, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X⁴ und X⁵ die Bedeutung hat von NeuAc(α2,6)Gal(β1,4)GlcNAc(β1,2)-; und Y einen Zuckerrest darstellt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von einer viralen Infektion, Diarrhoe, Ulkus, Entzündung, Allergie oder zur Förderung der Proliferation von Bifidobacteria.