DE3341760C2

DE3341760C2 -

Info

Publication number: DE3341760C2
Application number: DE3341760A
Authority: DE
Inventors: Haruo Funabashi Chiba Jp Ohnishi; Hiroshi Yokohama Kanagawa Jp Kosuzume; Yasuo Kawaguchi Saitama Jp Suzuki; Ei Tokio/Tokyo Jp Mochida
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-11-20
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1989-09-07
Also published as: SE8306384D0; GB2132481B; US4534966A; GB8330810D0; IT1174799B; SE8306384L; JPS5995221A; SE460825B; AU2155483A; GB2132481A; DE3341760A1; CH657050A5; NL8303980A; FR2536281B1; JPH0261925B2; AU552756B2; CA1204054A; FR2536281A1; IT8349367A0

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Human-Pepsin als Arzneimittel mit Phagocyten-Kontrollwirkung.

Eine der Funktionen die im lebenden Körper zur Aufrechterhaltung der Homöostase ablaufen, ist der Immunmechanismus. Es ist bekannt, daß Fremdstoffe, die von außen eindringen oder eine Substanz, die in vivo ein Fremdstoff geworden ist, in einigen Fällen den lebenden Körper nachteilig beeinflussen kann und daß ein Immunmechanismus eine Wirkung auf den Angriff und auf die Entwicklung von einigen Krankheiten, wie Infektionskrankheiten, Tumore, Autoimmunkrankheiten und dergleichen, bewirkt. Aus diesem Grund hat man in letzterer Zeit Versuche unternommen, diese Krankheiten dadurch zu behandeln, daß man den Immunmechanismus kontrolliert. Die üblichen immunomodulatorischen Mittel sind jedoch Arzneimittel, die hauptsächlich die Funktionen der Lymphocyten, welche für die humorale Immunität und die Zellularimmunität verantwortlich sind, kontrollieren und es liegen nur wenige Untersuchungen über Arzneimittel vor, durch welche direkt die phagocytolytischen Funktionen überwacht werden können.

Phagocyten fressen und verdauen nicht nur Fremdstoffe, die in den Lebendkörper eingedrungen sind, z. B. Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien, Eumyceten, etc. und solche Fremdstoffe, die im Lebendkörper erzeugt wurden, z. B. Tumore, sondern sie spielen auch eine wesentliche Rolle bei der Überwachung der Immunrespons, indem sie Informationen auf diesen Fremdstoffen zu den Lymphocyten übertragen. Deshalb erwartet man von Arzneimitteln, durch welche die phagocytolytischen Funktionen kontrolliert werden können, nicht nur eine Wirkung, wie sie von den die üblichen lymphocytolytischen Funktionen überwachenden Arzneimitteln zu erwarten ist, sondern auch eine Wirkung auf Infektionskrankheiten.

Da ein Arzneimittel, welche die Wirkung hat, phagocytolytische Funktionen zu überwachen, erwartungsgemäß ein Arzneimittel ist, welches man zur Behandlung von Infektionskrankheiten anwenden kann, welche durch Viren, Bakterien, Eumyceten usw., verursacht werden, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung Untersuchungen angestellt, um ein solches Arzneimittel zu entwickeln und sie haben festgestellt, daß Human-Pepsin und/oder humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym die Wirkung aufweist, die durch Phagocyten verursachte Immunität zu überwachen und Infektionskrankheiten, zu behandeln.

In der nicht vorveröffentlichten DE-OS 32 49 251 wird die Verwendung von Human-Pepsin zur Behandlung von allergischen Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumoren beschrieben. Außerdem offenbart EP-A-59 346 die Verwendung einer aus Urin gewonnenen, sauren Protease gegen allergische Störungen, Immunkomplex-Erkrankungen und Tumore.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Indikation für die Verwendung von Human-Pepsin und/oder humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym, vorzuschlagen. Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Human-Pepsin, welches ein Molekulargewicht von 32 000 bis 38 000, einen isoelektrischen Punkt von 1 bis 3 und eine maximale Absorption bei 274 nm aufweist, eine positve Ninhydrinreaktion ergibt und leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform ist, und/oder humanem Leukozyten-Pepsin ähnlichem Enzym, das ein Molekulargewicht von 35 000 bis 41 000, einen isoelektrischen Punkt von 2,5 bis 3,5 und eine maximale Absorption bei 278 nm aufweist, eine positive Ninhydrinreaktion ergibt und leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform ist, zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch phagozytische Funktionen kontrollierbar sind, insbesondere Infektionskrankheiten.

Das Human-Pepsin und das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym stellen aktive Bestandteile der erfindungsgemäß zur verwendenden Arzneimittel dar und bewirken eine Potentierung der durch die Phagocyten hervorgerufenen Wirkung und sie verstärken auch Aktivitäten der Phagocyten, z. B. die Immuninformationen an Lymphocyten und sie verstärken die Phagocytolyse von Heterocyten mittels Phagocyten, bewirken eine Verstärkung der bakteriziden Aktivität durch Neutrophile, bewirken die Inhibierung der Abscheidung von Cholesterin in den Arterien und bewirken eine Inhibierung von experimentell verursachter Gicht, die durch Einspritzen von Uraten in die Gelenkhöhlen verursacht wurde.

Human-Pepsin ist eines der aktiven Bestandteile gemäß der vorliegenden Erfindung und ist ein bekanntes Enzym (Etherington et al., Biochim. et. Biophi. Acta, 236, 92 1971). Es kann aus humanen Magenzellen, humanem Magensaft, humanem Urin etc., mittels geeigneter Methoden, wie sie üblicherweise zur Reinigung von Proteinen angewendet werden, gewonnen werden, z. B. durch Aussalzen, Adsorptionschromatografie unter Verwendung von anorganischen Adsorbentien, Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, Gelchromatografie mit einer molekularen Siebwirkung etc., gewonnen werden. Weiterhin kann man auch eine Massenproduktion durch Kultivierung von Zellen vornehmen, die durch Fusion von pepsinproduzierenden Zellen, wie humanen Magenzellen mit Krebszellen, erzeugt wurden oder durch Gentechnologien, z. B. indem man komplementäres DNA herstellt unter Verwendung von Messenger-RNA von Human-Pepsin als Matrize und unter Verwendung von Umkehrtranscriptase, worauf man dann dieses DNA in Escherichia coli etc., inkorporiert.

Das erfindungsgemäß verwendete Human-Pepsin kann man beispielsweise nach der Methode von Seÿffers et al, Amer. J. Physiol. 206, 1106 (1964) erhalten, indem man humanen Urin durch eine DEAE-Cellulosesäule, die mit einem 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,3) äquilibriert wurde, leitet, unter Absorption des Human-Pepsins, worauf man dann dieses mit dem gleichen Puffer, der außerdem noch 0,3 M Natriumchlorid enthält, eluiert, das Eluat konzentriert und schließlich das Konzentrat gelchromatografisch unter Verwendung von Sephadex G-100, welches mit 0,9% physiologischer Kochsalzlösung angequollen wurde, reinigt. Ein solches Humanpepsin hat ein Molekulargewicht von 32 000 bis 38 000 gemäß gelchromatografischer Analyse unter Verwendung von Sephadex G-100, hat einen isoelektrischen Punkt von 1 bis 3, gemessen durch amphoreinisoelektrische Elektrophorese und zeigt eine maximale Absorption von 274 nm. Es ergibt eine positive Ninhydrinreaktion und ist leicht in Wasser löslich und in Ether und Chloroform unlöslich.

Weiterhin ist humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym ein Enzym, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden wurde (Patentanmeldung PCT JP 82-00213) und das man erhält aus Human-Leukocyten oder Actynomycin D-behandelten promyelocytischen Leukemiezellen von HL-60-Stämmen etc., indem man geeignete Methoden kombiniert, wie sie üblicherweise zum Reinigen von Proteinen angewendet werden, z. B. Aussalzen, Adsorptionschromatografie unter Verwendung von anorganischen Adsorbentien, Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, Gelchromatografie mit einer Molekularsiebwirkung etc. Eine Massenproduktion ist möglich, indem man Zellen, die durch Fusion von pepsinähnlichem Enzym produzierenden Zellen, wie Human-Leukocyten, mit Krebszellen fusioniert oder durch gentechnologische Verfahren, z. B. indem man komplementäres DNA herstellt, unter Verwendung von Messenger-RNA des humanen Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzyms als Matrize und unter Verwendung von Umkehrtranscriptase, worauf man dann diese DNA in Escherichia coli etc., inkorporiert.

Man kann beispielsweise das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym erhalten, indem man die vorerwähnten kultivierten Zellen unter Verwendung einer überstehenden Lösung homogenisiert, die überstehende Lösung durch eine DEAE-Cellulosesäule, die mit einem 0,1 M Acetatpuffer äquilibriert wurde (pH 5,3) laufen läßt unter Adsorption des humanen Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzyms, worauf man dann dieses mit dem gleichen Puffer, der zusätzlich noch 0,5 M Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann konzentriert und schließlich wird das Konzentrat noch durch Gelchromatografie unter Verwendung von Sephadex G-100, angequollen mit 0,9% physiologischer Kochsalzlösung, gereinigt.

Dieses humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym hat ein Molekulargewicht von 35 000 bis 41 000 gemäß einer gelchromatografischen Analyse über Sephadex G-100, einen isoelektrischen Punkt von 2,5 bis 3,5, gemessen durch Amphorein isoelektrische Elektrophorese, und zeigt eine maximale Absorption bei 278 nm. Es ergibt eine positive Ninhydrinreaktion und ist leicht in Wasser löslich und unlöslich in Ether und Chloroform.

Weiterhin zeigt das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym eine hohe hydrolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin im sauren Bereich von pH 7 oder niedriger, wobei der optimale pH-Bereich bei 2,0 bis 3,5 liegt.

Die Wirksamkeit, Toxizität, die Anwendungsmethode und die Dosierung des humanen Pepsins oder des humanen Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzyms werden nachfolgend gezeigt.

Versuchsbeispiel 1 Einfluß der Phagocytose auf Human-Monocyten

Humane periphere Monocyten (10⁶ Zellen), die an einer Kulturoberfläche vorlagen, wurden hergestellt aus einer Suspension von periperen Leukocyten in Eagle's-Minimum-Essential-Medium, indem man die Zellen in einer Plastikschale bei 37°C während 1 Stunde kultivierte.

5 ml Eagle's-Minimum-Essential-Medium (Eagle-MEM), ergänzt mit 10 V/V-% fetalem Rinderserum und enthaltend Human-Pepsin oder humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym, wurde zu 10⁶ Zellen der humanen periperen Monocyten zugegeben, und dann kultivierte man bei 37°C. Nach 20 Stunden wurde das Medium verändert auf Eagle-MEM, ergänzt mit 10%igem fetalen Rinderserum und enthaltend Human-Pepsin oder humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und 2 × 10⁶ Zellen von wärmebehandelter Brothefe, und dann kultivierte man weitere 2 Stunden. Nach der Kultivierung wurde das Ausmaß der Phagocytose gemäß der folgenden Gleichung berechnet:

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Das Human-Pepsin und das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym beschleunigten die phagocytolytische Wirkung der Hefe durch humane Monocyten. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß Human-Pepsin und humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym die Phagocytolyse von Phagocyten verstärkt.

Versuchsbeispiel 2 Einfluß der Phagocytose auf Human-Monocyten

Humane periphere Monocyten (10⁶ Zellen), die sich an einer Kulturoberfläche befinden, wurden hergestellt aus einer Suspension der peripheren Leukocyten in Eagle-MEM, indem man die Zellen in einer Plastikschale bei 37°C während 1 Stunde kultivierte. 5 ml Eagle-MEM, das mit 10 V/V-% fetalem Rinderserum ergänzt war und eine gegebene Menge an Human-Pepsin oder humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym enthielt, wurde zu den humanen peripheren Monocyten gegeben und dann bei 37°C kultiviert. Nach 20 Stunden wurde das Medium ausgetauscht gegen ein gleiches Medium, welches 2 × 10⁸ rote Blutzellen von Schafen enthielt und dann wurde weitere 2 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Methanol fixiert und angefärbt (Giemsa-Färbung) um die phagocytolytische Wirkung, ähnlich wie in Versuchsbeispiel 1, zu berechnen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Human-Pepsin und humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym beschleunigten die Phagocytolyse der roten Blutzellen von Schafen durch Human-Monocyten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß Human-Pepsin und humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym die Phagocytolyse durch Phagocyten verstärken.

Versuchsbeispiel 3 Einfluß der Human-Monocytenaktivität auf den Transfer von Immuninformation zu den Lymphocyten

Eagle's MEM, ergänzt mit 10%igem fetalen Rinderserum, welches Human-Pepsin oder ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym enthielt, wurde zu 10⁶ Zellen/ml von humanen peripheren Monocyten gegeben und 20 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurde das Medium gegen ein Eagle's MEM, das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt war und das humanes Pepsin oder ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym sowie 2 × 10⁷ Zellen/ml von Schaferythrocyten enthielt, ausgetauscht, und die Kultivierung wurde 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Nach der Kultivierung wurde das Medium nochmals ausgetauscht gegen ein RPMI 1640-Medium, das mit 10% Humanserum ergänzt worden war und welches 3 × 10⁷ Zellen/ml an humanen periperen Lymphocyten enthielt, und dann wurde die Kultivierung 7 Tage durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden die Lymphocyten gesammelt, und die Anzahl der Plaques wurde nach der Methode von Dosch et al, J. Immunol., 118, 302 (1972) berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Das Human-Pepsin und das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym erhöhten die Produktion an Antikörpern gegenüber Schaferythrocyten, nämlich einem Fremdstoff gegenüber den Lymphocyten. Aus den Ergebnissen wird deutlich, daß Human-Pepsin und humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym die phagocytolytische Aktivität verstärken und Immuninformationen zu den Lymphocyten übertragen.

Versuchsbeispiel 4 Einfluß auf die Phagocytose von Mäuse-Makrophagen

5 ml Eagle's MEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und enthaltend Human-Pepsin, ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym oder Mäuse-Pepsin, wurde zu 10⁶ Zellen von intraperitonealen Mäuse-Phagocyten gegeben und 20 Stunden bei 37°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde das Medium gegen Eagle's MEM, ergänzt durch 10%iges fetales Rinderserum und enthaltend Human-Pepsin ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym oder Mäuse-Pepsin und 2 × 10⁸ Zellen von Schaferythrocyten oder Human-Erythrocyten ausgetauscht, und die Kultivierung wurde weitere 2 Stunden durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden die Phagocyten untersucht und das Ausmaß der Phagocytolyse wurde ähnlich wie in Versuchsbeispiel 1 berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Das Human-Pepsin und das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym erhöhte die Phagocytose von Schaferythrocyten durch die Mäuse-Phagocyten in gleicher Weise wie es das Mäuse-Pepsin tat. Im Falle der Mäuse-Phagocyten-Phagocytolyse von Human-Erythrocyten inhibierten, sowohl Human-Pepsin als auch humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym die Phagocytolyse während Mäuse-Pepsin sie erhöhte. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß Human-Pepsin und ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym wirksam sind, um die phagocytolytischen Funktionen zu kontrollieren und die Phagocytolyse von heterogenen Erythrocyten (Schaf) zu erhöhen, daß sie dagegen jedoch die Phagocytolyse von allogenen Erythrocyten (Human) inhibieren.

Versuchsbeispiel 5 Einfluß auf die bakterizide Aktivität von Neutrophilen

2,6 × 10⁵ Zellen von humanen peripheren Leukocyten, 3 × 10⁸ Polystyrollatex-Teilchen, 50 µl Nitroblau-Tetrazolium-Reagens und 150 µl Krebs-Henseleit-Puffer, enthaltend Human-Pepsin, ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym oder eine Mischung aus gleichgewichtigen Mengen von Human-Pepsin und einem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym, wurden 15 Minuten bei 37°C inkubiert, und dann wurde die Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 710 nm nach der Methode von Okamura et al, Chem. Pharm. Bull., 24, 2175 (1976) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Human-Pepsin, humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und die Mischung daraus verstärkten die bakterizide Aktivität gegenüber Neutrophilen. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß man eine Kontrollwirkung auf die phagocytolytische Funktion nicht nur im Falle von Human-Pepsin oder humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym bei alleiniger Verwendung dieser Enzyme beobachtet, sondern auch wenn diese in Kombination angewendet werden.

Versuchsbeispiel 6 Wirkung auf durch Pseudomonas aeruginosa verursachte Infektionskrankheiten

Gruppen von 10 ICR-Stamm-Mäusen mit einem Gewicht von jeweils etwa 18 g wurden intraperitoneal mit 10⁸ Zellen von P. aeruginosa, IFO 3445, suspendiert in 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, injiziert. Nach 1 Stunde wurde intravenös eine physiologische Kochsalzlösung, enthaltend humanes Serumalbumin, Human-Pepsin, ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym oder eine gleichgewichtige Mischung aus Human-Pepsin und humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym, alle 7 Tage injiziert und die Sterblichkeit der Tiere wurde beobachtet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Human-Pepsin, humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und die Mischung daraus inhibierten die Wirkung der Infektionskrankheiten.

Versuchsbeispiel 7 Heilwirkung bei lokalen pulmonaren Infektionen durch E. coli

Gruppen von 10 ICR-Stamm-Mäusen mit einem Gewicht von jeweils etwa 15 g wurden intranasa mit 10⁹ Zellen von E. coli (Stamm A4), suspendiert in 0,05 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, behandelt. 1 Stunde nach der Infizierung wurde eine Lösung mit einer gegebenen Menge von humanem Serumalbumin, Human-Pepsin, humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym oder einer Mischung aus Human-Pepsin und humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym in gleichen Mengen, gelöst in 0,1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, intravenös injiziert und die Injektionen wurden täglich während 7 Tagen fortgeführt. Die Überlebensrate der Tiere wurde beobachtet und die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Human-Pepsin, humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und die Mischung daraus zeigten eine Heilwirkung bei pulmonarer lokaler Infektion.

Versuchsbeispiel 8 Heilwirkung gegenüber E. coli-Infektion von Mäusen unter Immunsuppression

Gruppen von 10 ICR-Stamm-Mäusen mit einem Gewicht von jeweils etwa 20 g, wurde intraperitoneal 200 mg/kg Cyclophosphamid, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 20 mg/ml verabreicht. Nach 4 Tagen wurden 3 × 10⁷ Zellen von E. coli (Stamm A4), suspendiert in 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, intraperitoneal verabreicht. 1 Stunde nach der Identifizierung wurde eine Lösung einer gegebenen Menge aus humanem Serumalbumin, Human-Pepsin, humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym oder einer Mischung aus Human-Pepsin und humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym in gleichen Mengen, gelöst in 0,1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, intravenös verabreicht, und die Verabreichung wurde während 7 Tagen täglich durchgeführt. Die Überlebensrate der Tiere wurde festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8

Human-Pepsin, humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und die Mischung daraus zeigten eine Heilwirkung auf E. coli-Infektionen von Mäusen unter Immunsuppression.

Versuchsbeispiel 9 Heilwirkung bei Candida-Infektion

Gruppen von 10 ICR-Stamm-Mäusen mit einem Gewicht von jeweils 15 g, wurden intraperitoneal 6 × 10⁸ Zellen von C. albicans, suspendiert in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung, verabreicht. 1 Stunde nach der Infizierung wurde eine Lösung einer gegebenen Menge von Human-Serumalbumin, Human-Pepsin, humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym oder einer Mischung aus Human-Pepsin und humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym in gleichen Mengen, gelöst in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung, intravenös verabreicht, wobei die Verabreichung 7 Tage lang täglich vorgenommen wurde. Die Überlebensrate der Tiere wurde festgestellt und die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle 9

Human-Pepsin, humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym und die Mischung daraus zeigten eine Heilwirkung bei Candida-Infektion.

Die vorstehend untersuchten Infektionskrankheiten sind typisch für in den Körper eingedrungene oder dort erzeugte Fremdstoffe, z. B. Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien, Eumyceten etc.

Das Human-Pepsin, das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym und die Mischung daraus inhibierten eine Laufabnormalität aufgrund von Urat und zeigten eine Wirkung gegenüber Gicht.

Versuchsbeispiel 10 Akuter Toxizitätstest

Gruppen von jeweils 10 ddY-Stamm Mäusen (männlich) mit einem Gewicht von jeweils 20 bis 25 g erhielten intravenös oder intraperitoneal 2 g/kg Human-Pepsin, ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym oder eine gleichgewichtige Mischung daraus, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, und der Zustand wurde während 1 Woche beobachtet. Es wurde keine Abnormalität festgestellt.

Aus den vorhergehenden Ergebnissen wird ersichtlich, daß Human-Pepsin, ein humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym, welches die Hauptbestandteile in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind, sowohl in der Kontrolle von phagocytischen Funktionen wirksam und gleichzeitig auch geeignet sind, verschiedene Erkrankungen, die aufgrund der phagocytischen Funktionen verursacht werden, zu heilen, wobei die hierbei erforderlichen Dosierungen ausreichend sicher sind, wie aus dem akuten Toxizitätstest hervorgeht. Da diese Stoffe außerdem humane Proteine sind, nimmt man an, daß nur sehr geringe Nebenwirkungen aufgrund einer Antigenität, wie ein anaphylaktischer Schock usw., auftreten und deshalb kann man erwarten, daß man hier ein außerordentlich gutes Mittel für die klinische Anwendung hat. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen als injizierbare Lösungen für intravenöse, intraarterielle, subkutane oder intramuskuläre Verabreichungen oder für topische Verabreichungen formuliert und sie können auch in Form von oralen Zubereitungen, Inhaliermitteln, Rektalsuppositoren etc., vorliegen. Die therapeutische Dosis für Human-Pepsin oder das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym beträgt beim Erwachsenen 1 bis 1000 mg und vorzugsweise 5 bis 500 mg/Tag, wobei diese Dosis, je nach der Schwere der zu behandelnden Krankheit und der Art der Anwendung variiert werden kann. Weiterhin kann man auch das Human-Pepsin und das humane Leukocyten-Pepsin-ähnliche Enzym in jedem Verhältnis kombiniert verwenden. Human-Pepsin und humanes Leukocyten-Pepsin-ähnliches Enzym kann man zu pharmazeutischen Zubereitungen in üblicher Weise, zusammen mit gewünschten und üblichen pharmazeutischen Trägern oder Exzipientien formulieren.

Beispiele für feste Träger und Exzipientien, die hier vorteilhaft verwendet werden können, sind übliche Exzipientien, wie Lactose, Mannit, Maisstärke und Kartoffelstärke; Binder, wie kristalline Cellulose, Cellulosederivate, Gummiarabikum, Maisstärke und Gelatine; Zerfallsmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke und Calciumcarbohydroxymethylcellulose; und Schmiermittel, wie Talcum und Magnesiumstearat. Beispiele für flüssige Träger, die man vorteilhaft verwenden kann, sind destilliertes Wasser für Injektionen, physiologische Kochsalzlösung, Pflanzenöle für Injektionen und Glycole, wie Propylenglycol und Polyethylenglycol.

Bevorzugte Beispiele für Injektionen schließen gefriergetrocknete Zubereitungen ein, die man vor der Anwendung auflöst, sowie injizierbare flüssige Zubereitungen, sowie orale Zubereitungen, einschließlich Kapseln, Tabletten, Granulaten, Pulvern und oralen flüssigen Zubereitungen, sowie weiterhin inhalierbare Zubereitungen, einschließlich gefriergetrockneter Pulver, und Zubereitungen für eine rektale Verabreichung in Form von Rektalsuppositorien.

Beispiele der Erfindung folgen:

Beispiel 1

100 mg Human-Pepsin wurden in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und aseptisch durch ein Membranfilter filtriert. Das Filtrat wurde in einen sterilisierten Glasbehälter in einer Menge von 1,0 ml gegeben und gefriergetrocknet und dann verschlossen unter Erhalt einer gefriergetrockneten Pulverzubereitung.

Beispiel 2

100 g gefriergetrocknetes Human-Pepsin, 97 g Lactose und 3 g Magnesiumstearat wurden jeweils abgewogen und gleichmäßig miteinander vermischt. Die Mischung wurde in Nr. 2-Gelatinekapseln in einer Menge von 200 mg eingefüllt und erhielt einen enterischen Überzug, unter Erhalt von enterischen Kapseln.

Beispiel 3

100 mg eines humanen Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzyms wurden in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und aseptisch durch ein Membranfilter filtriert. Das Filtrat wurde in sterilisierte Glasbehälter in einer Menge von 1,0 ml jeweils eingefüllt und dann gefriergetrocknet, unter Erhalt einer gefriergetrockneten Pulverzubereitung.

Beispiel 4

Eiweißlecithin, Cholesterin und Diacethylphosphat wurden in einem Molverhältnis von 7 : 2 : 1 vermischt und dann wurden 100 mg davon in 12,5 ml Chloroform gelöst und ein dünner Film auf einer Flaschenwand gebildet. Dieser Film und 25 ml Phosphatpuffer, enthaltend 50 mg Human-Pepsin, und 50 mg eines humanen Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzyms wurden vermischt, unter Erhalt einer Dispersion. Diese wurde mit Ultraschall behandelt und mit 110 000 G zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sterilisiert. Man erhielt eine Zubereitung, bei der eine gleichgewichtige Mischung aus Human-Pepsin und humanem Leukocyten-Pepsin-ähnlichen Enzym mit einem Liposom vorlag.

Claims

Verwendung von Human-Pepsin, welches ein Molekulargewicht von 32 000 bis 38 000, einen isoelektrischen Punkt von 1 bis und eine maximale Absorption bei 274 nm aufweist, eine positive Ninhydrinreaktion ergibt und leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform ist, und/oder humanem Leukozyten-Pepsin ähnlichem Enzym, das ein Molekulargewicht von 35 000 bis 41 000, einen isoelektrischen Punkt von 2,5 bis 3,5 und eine maximale Absorption bei 278 nm aufweist, eine positive Ninhydrinreaktion ergibt und leicht löslich in Wasser und unlöslich in Ether und Chloroform ist, zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch phagozytische Funktionen kontrollierbar sind, insbesondere Infektionskrankheiten.