CN1178671C - 蛋抗炎成分、分离方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由已经用一种或多种抗原(特别是细菌抗原)超免疫鸟的蛋获得的抗炎成分。本发明还涉及包含有效量所述抗炎成分的蛋或蛋产品。本发明也涉及分离所述抗炎成分的方法。本发明最后涉及用所述抗炎成分和/或包含有效量的所述抗炎成分的蛋或蛋产品治疗炎症的方法。

Description

蛋抗炎成分、分离方法和用途
                         发明背景
发明领域
本发明一般涉及天然食料中产生的抗炎成分。本发明具体涉及蛋抗炎成分、以大致高度纯化形式生产它的方法和它在治疗炎症中的用法。
《多兰氏医学词典》中定义的炎症为“组织损伤或破坏引起局部保护反应，该反应用来破坏、稀释或隔开所述损伤剂和所述损伤组织。其特征在于微脉管系统穿孔、血液成分渗漏到间质空间以及白细胞迁移到发炎组织中。在宏观水平上，这一般伴随着红斑、肿胀、痛觉过敏(触痛)和疼痛的熟悉的临床症状。
在所述复杂反应期间，局部释放化学介质，诸如组胺、5-羟基色胺、各种趋化组合物、缓激肽、白三烯和前列腺素。吞噬细胞迁移到该区域中，细胞溶酶体膜可能破裂，释放裂解酶。所有这些事件都可能引起所述炎症反应。
患有类风湿性关节炎病人的炎症涉及抗原与抗体补体的结合引起局部释放吸引白细胞的趋化和化学激活组合物。白细胞吞噬抗原-抗体与补体的复合体，也释放它们的溶酶体中含有许多酶。这些溶酶体酶然后引起软骨和其它组织的损伤，这加剧了炎症的程度。也可能涉及细胞介导的免疫反应。在该过程中，也释放前列腺素，它是细胞功能的关键胞内调节剂。
局部过敏坏死反应为抗原与该抗原的抗体复合的皮下部位形成免疫复合物引起的炎症反应。嗜中性白细胞特征性地粘附到皮下注射部位处形成的免疫球蛋白复合物的Fc部分，在此部位它们释放消化酶，引起可见的急性炎症。因此，该反应主要是嗜中性白细胞介导的，影响该反应发展的药剂通过对这些细胞的作用介导该反应。
药剂有几种可能的途径干扰嗜中性白细胞从所述血管迁移到炎症部位。一个可能的途径是抑制贴壁，即炎性细胞的可逆地附着或“粘附”到所述血管壁的内皮细胞衬里上。这种附着受粘附和整联蛋白分子的质量和数量的精确调节，这些分子用作白细胞的“velcro”和血管的衬里。在正常状态下，大约50％的嗜中性白细胞可逆地附着，但在急性炎症反应期间，附着变得强得多，为嗜中性白细胞迁移过程中的关键步骤。尽管前列腺素不可能参与趋化反应，但花生四烯酸的另一种代谢产物白三烯是非常有效的趋化物质。
所述炎症反应为特征为上述炎症的任何反应。医学领域的技术人员熟知所述炎症反应引起多种身体不适(即疼痛和功能丧失)，最终涉及不同疾病和损伤。因此，通常的医学实践是给与减轻所述炎症反应的身体不适的药剂。具有这些性质的药剂分类为抗炎的。抗炎药物用来治疗多种疾病，同样的药物通常用来治疗不同疾病。用抗炎药物的治疗不是治疗所述疾病，大多数通常用于治疗症状(即炎症)。
抗炎、镇痛和退热药是不同类的化合物，通常是化学上无关的，然后它们共有某些治疗作用和副作用。皮质类固醇代表最广泛使用的一类治疗炎症的化合物。蛋白水解酶代表另一类被认为具有抗炎作用的化合物。直接或间接引起肾上腺皮质产生和分泌类固醇的激素代表另一类抗炎化合物。
不幸的是，所述天然和合成皮质类固醇制剂引起多种严重的副作用，包括升高血压、盐和水潴留、肾损害和提高钾和钙的排泄。此外，皮质类固醇可以掩盖感染的症状并增加传染性微生物的播散。这些激素被认为在孕妇中使用是不安全的，长期的皮质类固醇治疗已经与胃机能亢进和/或消化性溃疡相关联。用皮质类固醇治疗亦会加重糖尿病，需要更高剂量的胰岛素，并且可能产生精神障碍。间接增加内源皮质类固醇产生的激素抗炎药具有引起不利副作用的同样潜力。
已经描述了多种非类固醇抗炎药(NSAID’s)。其中，最广泛使用的是水杨酸盐。乙酰水杨酸或阿斯匹林是开处方最多的镇痛-退热和抗炎药。在Physician’s Desk Reference中列出了类固醇和非类固醇抗炎药的实例。
所述NSAID’s是合成生化化合物，它在高剂量下由于多种不良副作用而有毒。例如，水杨酸盐引起严重酸碱平衡失调，特征为该类化合物中毒。水杨酸盐直接和间接刺激呼吸。毒性剂量的水杨酸盐引起中枢呼吸麻痹以及在血管舒缩抑制后的循环性虚脱。食入水杨酸盐可能导致上腹部痛苦、恶心和呕吐。水杨酸盐诱导的胃出血是众所周知的。水杨酸盐可以产生肝损伤并延长凝血时间。因此，在患有严重肝损害、血凝血酶原过少、维生素K缺乏或血友病的病人中应该避免阿斯匹林，因为水杨酸盐抑制血小板止血可能导致出血。水杨酸盐中毒是常见的，每年在美国有超过10,000个严重水杨酸盐中毒的病例，其中一些是致命的，许多发生在儿童中。参见Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics，第7版，1985。
因此，尽管目前可利用大量的抗炎药，但仍需要安全有效的、无副作用和不利反应的抗炎产品。
如果可以获得具有抗炎作用的天然食品，那么可能提供容易给药的、易于利用的安全的治疗组合物。
相关领域：
已经报道了具有多种治疗作用的牛乳。美国专利4,423,782公开了含有突变链球菌抗体、具有抑制龋齿作用的牛乳。通过用突变链球菌以两个阶段免疫奶牛获得所述牛乳。美国专利4,284,623公开了具有抗炎性质的牛乳。美国专利4,879,110公开了具有抗高血压性质的牛乳。美国专利3,128,230公开了通过给奶牛接种抗原混合物获得的含有α、β和γ组分的球蛋白的牛乳。美国专利3,376,198、加拿大专利587,849和英国专利1,211,876也已经描述了含有抗体的牛乳。美国专利4,897,265号和美国专利4,636,384(Reissue No.33,403)公开了通过喂动物含有抗体牛乳降低血脂浓度的方法，所述牛乳得自通过注射多价细菌抗原保持在超免疫状态的奶牛。
鸟纲的各个属(诸如鸡(Gallus domesticus)、火鸡和鸭)在血液和蛋中产生抗引起鸟类疾病的抗原的抗体以及抗其它抗原的抗体。例如，LeBacq-Verheyden等(Immunology：27：683(1974))和Leslie，G.A.等(J.Med.130：1337(1969))已经定量分析了所述鸡的免疫球蛋白。Polson，A.等(Immunological Communications 9：495-514(1980))对几种蛋白和蛋清的天然混合物免疫母鸡，并在所述蛋黄中检测到IgY抗体。Fertel，R.等(Biochemical and Biophysical Research Communications 102：1028-1033(1981))对前列腺素免疫母鸡，并在蛋黄中检测到抗体。Jensenius等(Journal of Immunological Methods 46：63-68(1981))提供了用于免疫诊断的蛋黄IgG的分离方法。Polson等(Immunological Communications9：475-493(1980))描述了从用多种植物病毒免疫的母鸡蛋黄中分离的抗体。
美国专利4,357,272公开了从得自超免疫母鸡的蛋黄分离抗体。通过重复注射得自植物病毒、人类IgG、破伤风抗毒素、蛇抗蛇毒和Serneba的抗原引起超免疫，美国专利4,550,019公开了从蛋黄中分离抗体，所述抗体是通过用分子量或颗粒重量至少为30,000的免疫原超免疫的母鸡产生的。用来超免疫所述鸡的抗原选自植物病毒、人类免疫球蛋白、破伤风毒素和蛇毒。
另外，养鸡场研究和对照感染实验显示抗体蛋黄冻干粉和免疫全蛋冻干粉对肠毒性大肠杆菌的保护作用(Wiedermann等，J.Vet.Med.B.38：283-291(1991))。口服由用热杀死的K-99带菌毛肠毒性大肠杆菌抗原接种疫苗的母鸡制备的蛋黄粉，保护新生小牛免于大肠杆菌诱导的腹泻(Ikemori等，Am.J.Vet.Res.53：2005-2008(1992))。
也已经表明，给予感染轮状病毒的小鼠抗轮状病毒IgY提供完全的保护(Ebina等，Microbiol.Immunol.34：617-629(1990))。此外，发现含有抗缓慢爱得华氏菌抗体的蛋黄有效地预防日本鳗的edwardsiellosis(Gutierrez等，J.Fish Diseases 16：113-122(1993))。
美国专利4,784,018公开了被动免疫哺乳动物的方法，包括胃肠外给与纯化抗体，所述抗体由已经对相应抗原免疫的鸟蛋获得的，其中所述哺乳动物有食用所述蛋的历史。美国专利4,748,018中公开的专利延伸了美国专利4,748,018中公开的概念，因为可以通过适当的途径，而不仅仅胃肠外给与所述蛋抗体。
颁发给DCV-Biologics的美国申请序号08/688,576公开了通过向受治疗者给与超免疫蛋和/或牛乳或其部分，预防、抵抗或减轻受治疗者慢性胃肠疾病或非类固醇抗炎药诱导胃肠损害。
在美国专利5,215,746中公开了对特定细菌抗原免疫鸡的蛋提供哺乳动物中抗动脉粥样硬化的作用。
从用突变链球菌免疫的鸡获得含突变链球菌抗体的蛋(Otake等，J.Dental Research 70：162-166(1991))，它抑制龋齿的发展。
然而，这些参考文献没有一个公开或提示蛋可以产生可以给与动物以预防或减轻炎症的成分和/或因子。没有一个公开或提示提供合理预计任何鸟类的处理可以在蛋中产生这一组合物和/或因子的方法。这些参考文献没有一个提示或公开产生所需治疗效果的蛋抗炎组分的特性。
                         发明概述
本发明基于本发明人的以下发现：在蛋和蛋产品中，特别是从超免疫鸟类获得的蛋产品中有抗炎活性，所述蛋和蛋产品给予受治疗者，特别是哺乳动物时，预防或减轻所述受治疗者的炎症。
特别是，本发明涉及从鸟蛋中获得的高度纯化的抗炎成分。在从蛋黄和蛋清分离的部分中都发现抗炎活性。
本发明也涉及用以下方法生产的高度纯化的抗炎成分，该方法包括通过给予鸟类一种或多种抗原、特别是细菌抗原超免疫所述鸟类，从该超免疫鸟类收集蛋，然后从中分离所述高度纯化的抗炎成分。
超免疫方法产生来自鸟蛋的超常水平的高度纯化的抗炎成分。令人惊讶地是，通过所述超免疫方法可以提高蛋黄和蛋清中的该抗炎成分的水平。
本发明也包括治疗受治疗者、特别是哺乳动物炎症的方法，该方法包括给予所述受治疗者大致纯的抗炎成分或包含所述大致纯的抗炎成分的组合物。该方面包括给予抗炎全蛋和/或其部分。
本发明还涉及使用含有所述抗炎成分的蛋和/或所述高度纯化的抗炎因子本身，以防止淋巴细胞和嗜中性白细胞附着在小静脉的内皮上或(分离已经附着在小静脉内皮细胞衬里上的淋巴细胞和嗜中性白细胞)和减少淋巴细胞和嗜中性白细胞的迁移，并由此减少过度的肿胀和流体的积累。这样，所述组合物用来减少与所述炎症反应相关的组织损害。
本发明最后包括在哺乳动物中表现出抗炎活性的大致纯的抗炎成分。
                     附图简述
图1为显示通过DEAE Sepharose离子交换色谱分离分子量低于30,000的蛋抗炎成分的色谱图。
图2图示用分子量低于30,000的蛋抗炎成分抑制胸膜白细胞迁移。
图3图示用来自用己烷-乙醇脱脂蛋黄的无内毒素抗炎成分抑制大鼠胸膜白细胞的迁移。
图4为从蛋黄制备分子量低于30,000的抗炎成分的流程图。
图5为从液体蛋清中制备分子量低于30,000的抗炎成分的流程图。
图6图示用来自用超临界CO2萃取脱脂S-100蛋黄的分子量低于30,000的无内毒素抗炎成分抑制大鼠胸膜白细胞。
图7为从蛋黄干粉中制备分子量低于30,000的抗炎成分的流程图。
图8为从粉状蛋黄中纯化分子量低于3,000的抗炎成分的流程图。
图9为从粉状蛋清中纯化分子量低于3,000的抗炎成分的流程图。
图10为通过DEAE Poros离子交换色谱分离分子量低于3,000的蛋抗炎成分的色谱图。
图11图示用来自蛋黄和蛋清的分子量低于3,000的高度纯化部分抑制白细胞的迁移。
图12图示用小于3,000MW的DEAE峰2和来自超免疫蛋黄小于10,000MW的超滤液抑制白细胞的迁移。
图13图示来自蛋的分子量低于3,000的高度纯化抗炎成分与抗炎药(NSAIDS)(消炎痛和阿斯匹林)的比较。
图14为HPLC分离来自超免疫蛋黄的分子量低于3,000的抗炎成分的色谱图。
图15为HPLC分离来自超免疫蛋黄DEAE部分的色谱图。
                     发明详述
定义：
术语“蛋产品”是指本文所述含有抗炎蛋或蛋部分的任何产品。
术语“抗炎蛋或蛋部分”是指含有本文公开的抗炎成分、特别是用本文公开的方法生产的抗炎成分的蛋或蛋部分。
术语“抗炎成分”是指对抗或抑制炎症过程的成分。
术语“大致纯的蛋抗炎成分”是指纯度至少为实施例3和典型材料和图所述纯度的抗炎成分。
术语“高度纯化的蛋抗炎成分”是指纯度至少为实施例4和典型材料和图所述纯度的抗炎成分。
术语“抗炎因子”是指对抗或抑制所述炎症过程的大致纯的因子，所述因子存在于纯度至少为实施例7所述纯度所述抗炎成分中。
术语“联合衍生抗原”是指通过联合合成在抗原中产生分子多样性的新方法。
术语“生物工程抗原”是指通过允许插入和翻译具有抗原性质的蛋白的基因克隆技术和基因重排获得的抗原。
术语“基因疫苗”是指一般通过重组技术生产的、可以引起免疫应答的核酸疫苗。
术语“超免疫蛋”是指从保持在超免疫状态的产蛋动物中获得的全蛋或得自它的产品。
术语“超常水平”是指超过未保持在超免疫状态的产蛋动物的蛋中发现水平的水平。
术语“餐桌上的蛋”是指非超免疫蛋。
术语“炎症”以其领域认同的意义，用作由组织损伤或破坏引起的局部保护性反应，该反应用来破坏、稀释或隔开损伤剂和受伤组织，特征为不适当的非控制形式的典型后果的疼痛、发热、发红、肿胀和功能丧失，组织学上涉及一系列复杂事件，包括小动脉、毛细管和小静脉扩张并伴随通透性和血液流动增强，包括血浆蛋白的流体的渗出和白细胞迁移到所述炎症病灶。
术语“治疗”是指预防、减轻或完全消除病症的症状和/或该疾病病原起源。例如，所述抗炎成分不仅通过抑制人类和哺乳动物炎症症状，而且通过用作预防剂对抗所述受体中预期出现的炎性因子治疗炎症。
术语“给予”是指给受治疗者提供物质的任何方法，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉注射、肌内注射或皮下注射)或直肠给药。
术语“受治疗者”是指可以炎症反应并会患有炎性疾病和损害的任何活动物，包括人类和其它动物。
本发明
在一个实施方案中，本发明包括得自鸟蛋的高度纯的抗炎成分、其分离和纯化以及将所述成分给予受治疗者用于治疗炎症。本发明还包括得自已经用一种或多种抗原、特别是细菌抗原或其合成等价物超免疫的鸟蛋的高度纯化的抗炎成分。所述高度纯化的抗炎成分以超常水平存在于超免疫蛋中，在受治疗者中提供抗炎活性。
尽管所述高度纯化的抗炎成分在任何餐桌上的蛋的蛋黄和蛋清的水溶性部分中发现，但从超免疫蛋中分离时，发现超常水平的所述抗炎成分有效地治疗受治疗者的炎症。
本发明也包括得自鸟蛋的大致纯的抗炎成分、其分离和纯化以及将所述成分给予受治疗者用于治疗炎症。本发明还包括得自已经用一种或多种抗原(特别是细菌抗原)或其合成等价物超免疫的鸟的蛋获得的大致纯化的抗炎成分。所述大致纯化的抗炎成分以超常水平存在于超免疫蛋中，在受治疗者中提供抗炎活性。
本发明的抗炎成分可以通过提供抗炎活性的任何方式给予。例如，可以通过胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内或经口给药。用于口服的固体剂量形式包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。
本发明还包括在所述抗炎成分中发现的大致纯的抗炎因子。所述因子可以通过上述用于所述抗炎成分的相同方法给予。
下面给出本发明的细节。
所述高度纯化的抗炎成分的特征：
所述高度纯的抗炎成分具有以下特征：
1)在受治疗者、特别是哺乳动物中具有抗炎活性；
2)在鸟蛋的蛋清和蛋黄中都存在；
3)从蛋黄中分离时，其抗炎活性高于从蛋清中分离的活性；
4)其分子量低于大约3000道尔顿；
5)不被降解蛋白的酶降解；
6)非蛋白的和非类固醇；
7)普通条件下带负电；
8)于100℃热稳定至少30分钟；
9)具有口服活性，并且不被消化酶降解；
10)抗酸和抗碱，甚至在用pH 4-9.0的条件处理后，也转化为活性形式。
由所述成分的分离和纯化得出3,000道尔顿的分子量，其中所述分离和纯化过程使用不允许大于3,000道尔顿的分子种类通过的超滤膜。所述成分测定为非蛋白性的和非类固醇的，因为它的尺寸小，并且不被降解蛋白的酶降解。此外，该成分具有口服活性，并且不被消化酶降解。该成分的小稳定形式(有别于大得多的蛋白质)有助于从其消化道吸收。
该成分抗酸和抗碱，甚至在用pH 9.0的条件处理后转化为活性形式。此外，该成分于100℃热稳定至少30分钟，在中性pH下带负电。
所述高度纯化的蛋抗炎成分可以从全蛋、蛋黄和蛋清中分离。从蛋黄中分离的抗炎成分表现出的抗炎活性高于从蛋清中纯化的抗炎成分。
超常水平的所述高度纯化的抗炎成分可以从鸟的超免疫全蛋、蛋黄和蛋清中分离。
所述大致纯化的抗炎成分的特征：
所述大致纯的抗炎成分在哺乳动物中表现出抗炎活性。在蛋黄和蛋清的水溶性部分的含有分子量低于30,000道尔顿的部分中发现所述大致纯化的抗炎成分。该成分带负电，90℃热稳定至少1小时，它从蛋中的洗脱图示于图1。此外，从蛋黄中分离的该成分在哺乳动物中的抗炎活性高于从蛋清中分离的因子。
用上述方法从鸡蛋制备的蛋抗炎成分的分子量低于30,000道尔顿。这由以下事实得出：从蛋黄和蛋清中分离该因子的第一步是采用不允许分子量大于30,000道尔顿的物质通过的膜进行超滤。通过将蛋30K超滤液上DEAE Sepharose离子交换柱测定，该成分在普通条件下带负电。用水不能从该柱洗脱该抗炎成分。将该洗脱介质变为NH4OAc溶液使得该蛋抗炎成分洗脱。当将该超滤液上DEAE Sepharose柱时，各种蛋白和盐构成未结合部分。
产蛋动物的超免疫：
本发明部分基于以下发现：当产蛋动物(诸如鸟)达到超免疫的特定状态时，该动物产的蛋将具有超常水平的高度有益的抗炎成分，因此提供较高的抗炎作用。
任何产蛋动物都可以产生超免疫蛋产品。最好是，该动物为鸟纲成员。在鸟纲中，最好是家禽，但该纲的其它成员诸如火鸡、鸭子和鹅是合适的超免疫蛋产品源。
当通过例如周期性加强给与抗原的方法使这类产蛋动物达到超免疫的特定状态时，所述动物将产含有超常水平抗炎成分的蛋，将所述成分给与受治疗者时，在治疗炎症方面将具有有益的性质。
单独的免疫敏感性诱导不足以引起蛋中超常水平的所述蛋抗炎成分，正如即使在对鸟类疾病免疫的正常免疫期间和正常暴露于环境因子期间所述鸟类已被各种抗原致敏，被称为“餐桌上的蛋”的正常鸟蛋也不含有这些超常水平。仅在特定的超免疫状态下，所述蛋才具有所需的超常水平。
通过给与初次免疫，然后周期性地用足够高剂量的特定抗原或抗原混合物加强，达到所述蛋将含有较高水平的该抗炎成分的这种特定超免疫状态。加强的优选剂量应该等于或大于产生该鸟初次免疫必需剂量的50％。因此，加强剂量阈值以下，在鸟蛋中不产生所述性质，即使该鸟处于正常称为免疫状态的状态。由于已经了解发展和保持超免疫状态的要求，为了保持该动物处于所述超免疫状态，本领域技术人员可根据所用产蛋动物的属和品系改变抗原的用量。
应该理解，如果所述抗炎成分的水平如上述增加，那么所述抗炎因子自然也会相应地增加。
用任何抗原或抗原组合物都可以产生超免疫组合物。通过多次暴露于多种抗原、多次暴露于单一抗原或单次暴露于免疫原文库，都可以达到超免疫。几乎可以使用任何抗原诱导所述超免疫状态，所述抗原包括(但不限于)细菌、病毒、原生动物、变应原、真菌或细胞物质。
除用天然产生的抗原免疫外，也可以用联合化学合成衍生的抗原完成免疫。基本策略是装配用于产生具有多样性分子群体的化学构件块的多种组合。最近已经开发出几种方法用于寡聚物文库(Fodor，S.等，Science 251：767(1991)；Houghton，R.等，Nature 354：82(1991))以及小的有机分子(Bunin，B.和Ellman，J.，J.Am.Chem.Soc.114：10997(1992))的固相和溶液相联合合成。多个肽和寡聚物的快速合成可以用作联合衍生抗原源。此外，另一种策略允许以联合方式将有机构件块加入主链分子中，以改进抗原性。
超免疫产蛋动物的另一种模式包括使用基因疫苗或生物工程抗原。特别是，任何DNA构建物(一般由启动子区和抗原编码序列组成)将触发抗体释放。基因疫苗由抗原编码载体、裸露DNA片段、质粒DNA、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白质缀合物、DNA-脂质体缀合物、DNA表达文库和传递的病毒和细菌DNA组成，以产生免疫应答。
特别是，现在有证据表明，DNA具有免疫调节性和免疫原性。传递抗原编码载体、裸露NDA片段、质粒DNA、DNA-RNA抗原和DNA表达文库可以有效地模拟活的和热杀死的细菌和病毒疫苗。DNA疫苗的一个益处是从产生游离抗原的各个细胞中产生和释放抗原，以诱导体液以及细胞毒性免疫应答。细胞毒性应答导致效力增强(Ada.G.L.，Lancet 335：523-526(1990))。另一优点是基因疫苗能够产生具有合适三维构象的外源蛋白。
遗传免疫是疫苗生产的新途径，具有活/减毒病原体的许多优点，但没有感染的风险。可以用由几种来源的DNA组成的表达文库作为产生超免疫状态的疫苗。
DNA传递的方法包括(但不限于)粒子轰击、直接注射、脂质体、气流注射(Fynan，E.F.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：11478-11482(1993))。编码已知或未知免疫原、启动子区(值得注意的是CMV花椰菜花叶病毒)和SV40细菌起点的核酸可以在细菌中复制，产生用于DNA注射的质粒DNA。尽管在鸡中几种胃肠外DNA给药途径是有效的，但优选的方法是肌内注射到胸肌。在产蛋鸟中，最好在鸡中进行疫苗试验。以1-2周间隔重复免疫，直至6个月。
最好是，DNA的用量一般大约为含50-300μgDNA的盐水，以用于直接注射。对于粒子轰击，最好是通过加入2.5M CaCl2共沉淀到金珠粒上的4-100μg DNA。可以用促进DNA包被粒子进入活动物中的方法重复进行皮内免疫。
以下是用来使产蛋动物达到较高免疫状态的优选步骤的详细描述，所述动物产下的超免疫蛋或蛋产品可以给与受治疗者：
1.选择一种或多种抗原。
2.通过初次免疫在所述产蛋动物中引起免疫应答。
3.给与合适剂量的抗原加强疫苗，以诱导和保持所述超免疫状态。
4.测试所述超免疫蛋的抗炎活性水平。
5.收集并加工所述蛋。
以下是该方法更详细的描述。
步骤1：可以使用任何抗原或抗原组合。所述抗原可以是细菌、病毒、原生动物、真菌、细胞、变应原或产蛋动物的免疫系统会应答的任何其它物质。该步骤中关键的一点是抗原必须能够不仅诱导所述产蛋鸟的免疫和超免疫状态，而且诱导在所述蛋中产生所述抗炎成分。一种优选的疫苗是称为系列100(S-100)疫苗的多价细菌抗原。
所述S-100疫苗中含有的细菌在实施例1的表1中列出。该疫苗先前已经在美国专利5,106,618和5,215,746中进行了描述，这两个专利都颁发给Stolle Reseasrch and Development Corporation。
步骤2：该疫苗可以用引起免疫应答的任何方法给与。最好是，通过肌内注射给与所述抗原完成免疫。鸟中优选注射的肌肉是胸肌。剂量最好为0.5-5毫克所述抗原疫苗。其它可以使用的给药方法包括静脉注射、腹膜内注射、直肠栓剂和口服。使用DNA技术进行超免疫过程时，需要的量小得多，一般为1-300微克。
可以通过多种免疫学领域技术人员已知的方法，确定该疫苗是否引起产蛋动物的免疫应答。这些方法的实例包括酶联免疫吸附检定(ELISA)、用于抗所述刺激抗原的抗体存在的试验和设计评价所述宿主的免疫细胞对该抗原应答的能力的试验。一般而言，用该疫苗免疫后蛋抗体的出现是免疫应答的指标。诱导免疫应答所需的抗原最小剂量取决于所用的疫苗接种方法，包括所用的抗原类型以及用作所述宿主的产蛋动物的类型。
步骤3.最好通过以固定时间间隔重复加强给与合适剂量，诱导和保持所述超免疫状态。所述时间间隔最好为6个月中的2周间隔。所述加强给药不导致免疫耐受是必要的。
也可以使用其它超免疫维持方法或方法的组合，诸如初次免疫为肌内注射，加强注射为静脉注射。其它方法包括同时给与微胶囊抗原和液体抗原，或初次免疫为肌内注射，而加强剂量通过微胶囊方式口服或胃肠外给与。初次免疫和超免疫的几种组合是本领域技术人员已知的。
步骤4.测试所述蛋的抗原活性水平是必要的。这可以用测试或者所述超免疫蛋或其来源的产品对炎症的作用的任何临床或临床前评价进行。化学诱导的大鼠炎症为抗炎药的标准检定。(参见实施例6a、b和c)。
步骤5.该步骤包括收集和加工含有所述抗炎成分的蛋。可以通过常规方法收集所述蛋。下面描述加工所述蛋以分离和纯化该抗炎成分。
分离和纯化：
可以用全蛋、蛋黄或蛋清完成所述蛋抗炎成分的分离和纯化。优选方法的实例如下：
1.从蛋中制备水溶性部分；
2.将该水溶性部分超滤；
3.通过反相高效液相色谱分离部分；以及
4.生物检定分离部分的抗炎活性。
以下是该方法更详细的说明：
步骤1：
可以从全蛋、蛋黄或蛋清中分离所述抗炎成分。在优选实施方案中，用该方法从蛋清中分离该成分。在特别优选的实施方案中，从蛋黄中分离该成分。用本领域技术人员熟知的方法从所述全蛋或蛋黄中除去所述脂质部分。例如，在喷雾干燥的蛋黄粉的情况下，可以用溶剂(丙烷、丁烷或己烷或用双溶剂)、超临界CO2、酶等等完成脱脂，而在液体蛋黄的情况下，可以通过Lee(美国专利5,367,054号)所述的辛酸分离方法(CAPS)完成脱脂。对于蛋清不必去脂，因此液体或粉状形式的蛋清都可以用常规方法和下面实施例列出的方法或者加热或直接溶解。然后，所述全蛋、蛋黄或蛋清最好加工为或者液体或粉状形式，并且进一步加工获得水溶性部分。(参见实施例)。
步骤2：
从全蛋、蛋黄或蛋清产生的水溶性部分用配有截留分子量为3,000的膜的超滤系统进行超滤。所述超滤方法将分子量大于3,000道尔顿的分子与分子量小于3000道尔顿的分子分离。一旦进行超滤，则将产生的含有分子量小于3,000道尔顿分子的超滤液冻干，称量和制备用于生物检定测试。在特定公开的实施方案中，优选的超滤为AmiconRA1000(3K MWCO)和DEAE离子交换色谱。然而应该理解，已知本文的资料和本领域技术人员可利用的知识，可以用同等的技术和材料来分离该成分。
步骤3：
可以通过例如反相高效液相色谱分离小于3,000道尔顿的超滤液的部分，以分离所述高度纯化的抗炎成分。作为可选择的或另一策略，所述超滤液中的该蛋抗炎成分可以用阴离子交换DEAE-Sepharose色谱进行进一步的表征。这类分离方法是本领域技术人员熟知的。
步骤4：
可以通过测定抗炎活性的任何生物检定测试该成分的抗炎活性。一些实例包括抑制白细胞的迁移、大鼠足趾肿胀试验、佐剂诱导的关节炎、胶原蛋白诱导关节炎和活体显微镜检查。也可以进行蛋抗炎成分与已知抗炎药(诸如阿斯匹林和消炎痛)的比较。最后，也可以用用于类风湿性关节炎、退化性关节疾病和损伤诱导的关节炎的临床试验测定抗炎活性。
通过生物检定测定该高度纯化的蛋抗炎成分的抗炎活性。优选的生物检定为Vinegar等(“角叉菜胶诱导的大鼠胸膜炎的一些定量特性”Proc.Soc.Exp.Bio.Med.143：711-714(1973))、Ammendola，G.等(“大鼠角叉菜胶胸膜炎中的白细胞迁移和溶酶体酶释放”Agents andActions 5：250-255(1979))、Vinegar，R.等(“急性角叉菜胶炎症的定量研究”，Fed.Proc.35：2447-2456(1976))中描述的胸膜白细胞迁移抑制检定(参见实施例7、7a、7b、7c和9、图3、5和6)。
一般如下进行所述白细胞迁移抑制检定：将含有该抗炎成分的样品给与用1％角叉菜胶溶液人工发炎的成年雌性大鼠，然后通过与对照大鼠相比处理大鼠胸膜渗出液中白细胞数的降低，测定(用自动图象分析技术)每种剂量的所述样品的抗炎作用。
另一方面，可以通过将角叉菜胶注射到大鼠后爪引起的肿胀测试所述大致纯的抗炎成分的抗炎作用(Winter，C.A.，Risley，G.A.，Nuss，A.W.，“角叉菜胶诱导的大鼠后爪肿胀作为抗炎药的检定”Proc.Soc.Biol.MEd.3：544(1967))。
可以使用多种其它试验(参见Wetnick，A.S.和Sabin，C.，“氯胺烟酸和Bethaurethasone在大鼠中对佐剂诱导的关节炎和实验性变应性脑脊髓炎的作用”Jap.J.Pharm.22：741(1972))。
给与受治疗者用于治疗：
本发明也涉及治疗受治疗者炎症的方法，包括给与所述受治疗者所述蛋、蛋产品和/或本发明的抗炎成分。
本发明的抗炎成分可以用提供抗炎活性的任何方法给与。例如，可以胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内或经口给药。
口服最好通过固体剂量形式完成，所述固体剂量形式包括胶囊剂、粉剂、丸剂和颗粒剂。在固体剂量形式中，所述抗炎成分与至少一种诸如蔗糖、乳糖或淀粉之类的惰性稀释剂混合。与正常做法一样，这类剂量形式也可以包含非惰性稀释剂的其它物质。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂量形式也可以包含缓冲剂、pH敏感聚合物或食品和制药工业中通常用作胶囊成分的任何其它缓慢释放的胶囊剂。片剂和丸剂还可以用肠溶包衣制备。
用于口服的液体剂量形式的所述抗炎成分包括含有通常用于制药领域的惰性稀释剂的药学上可接受的乳液、溶液、悬液、糖浆和酏剂。除惰性稀释剂外，组合物也可以包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂和甜味剂。
用于胃肠外给药的抗炎组合物制剂包括无菌水溶性和非水溶液、悬液或乳液。非水溶剂或溶媒的实例为丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油和诸如油酸乙酯的可注射有机酯。
活性成分的剂量可以改变：然而，必要的是所述活性成分的量应该使得获得合适剂量形式。应该认识到，选定的剂量形式取决于所需的治疗作用、给药途径和治疗时间。
最好是将含有所述抗炎成分的所述蛋本身加入食品中，形成所述蛋产品。一个制备待加入食品中的所述蛋的优选方法包括将所述蛋干燥为蛋粉。尽管已知用于干燥蛋的各种方法，但喷雾干燥是优选方法。最好使用不超过140°F(60℃)的温度。在所述干燥过程中监测样品的含水量，以获得具有任何所需稠度的成品。干燥的蛋粉可以用于饮料、蛋白添加剂和任何其它运动员相关营养产品。此外，所述蛋粉可以用于烘烤混合物、粉状长面包、糖果、饼干等。其它蛋加工的实例包括制作煎蛋卷、嫩煮或强煮所述蛋、烘烤所述蛋或如果需要，可以生吃所述蛋。
考虑到副作用的可能性，给药剂量和频率取决于所述病人的年龄和一般健康状况。给药也取决于用其它药物同时治疗和病人对给与药物的耐受性。
离子交换色谱后的制剂贮存的优选模式为冻干粉。在第一纯化步骤收集的滤液可以冷藏直至使用。用上述大鼠胸膜白细胞迁移试验测定由该纯化产生的所述抗炎成分的活性。
可以通过给与所述蛋、蛋产品和/或本发明抗炎成分治疗的炎性疾病实例包括急性和亚急性粘液囊炎、急性非特异性腱炎、全身性红斑狼疮、全身性皮肤肌炎、急性风湿性心炎、天疱疮、大疱性皮炎、疱疹样严重红斑、多形性剥落性皮炎、肝硬变、季节性常年性鼻炎、支气管性哮喘、异位性皮炎、血清病、角膜炎、眼虹膜炎、diffuse ureitis、声带炎、视神经炎、交感性眼炎、症状性结节病、吕弗勒综合症、铍中毒、溶血性贫血症、乳腺炎、乳交炎、接触性皮炎、过敏性结膜炎、牛皮癣性关节炎、关节强硬性脊椎炎、急性痛风性关节炎、带状疱疹性类风湿性关节炎、骨关节炎、任何其它退化性关节疾病和任何相关的自身免疫疾病。此外，所述分离和纯化的蛋产品可以用来治疗接触潜在炎性因子(诸如变应原)个体。
有效量：
关于给与受治疗者所述超免疫蛋或蛋产品，已经测定并在以下实施例中详细描述了，待给与受治疗者超免疫蛋或蛋产品的优选剂量范围为1-40克/公斤受治疗者体重。
关于所述高度纯化的抗炎成分本身，已经测定了从超免疫蛋全蛋、蛋黄和蛋清纯化和分离的所述高度纯化成分的优选剂量范围为1微克至400毫克抗炎成分。
抗炎因子：
一旦分离和纯化所述抗炎成分，则可以进一步纯化和检测活性部分的结构和活性，以测定更具体活性抗炎化合物的特征。特别是，使用高压液相色谱(HPLC)，已经鉴定出显示抗炎活性的单一的超纯峰。据信该单一的超纯峰代表具有基本化学结构的单一化合物。该化合物已经标记为所述蛋的“抗炎因子”。
现在已经一般描述了本发明，通过一些具体实施例进一步描述本发明，提供这些实施例仅仅为了说明，而不是为了限制，除非另外具体说明。
                     实施例
实施例1
S-100疫苗的制备
在美国专利5,215,746中公开的已知为“系列100”或“S-100”并含有表1所示细菌(得自美国典型培养物保藏中心)的多价疫苗用15ml培养基重建，并于37℃过夜培养。一旦获得良好的生长，则用大约一半的细菌悬浮液接种1升液体培养基，于37℃培养。其余的悬浮液转移到无菌乙二醇试管中，并于-20℃贮存直至6个月。
在该培养物中见到良好生长后，通过离心收获所述细菌。将所述细菌沉淀重悬浮于无菌盐水溶液中，将所述细菌悬浮液离心3次，以清洗所述细胞。第三次清洗后，将获得的沉淀重悬浮于少量双蒸水中。
通过将无培养基细菌悬浮液置于80℃水浴中的玻璃烧瓶中过夜，热杀死该细菌悬浮液。用少量热杀死细菌测试液体培养物的生活能力。用热杀死细菌接种液体培养基，于37℃培养5天，每天检查其生长，因为必须杀死所述细菌以用于所述疫苗。
将所述热杀死细菌冻干直至干燥。然后将干细菌与无菌盐水溶液混合至浓度为2.2×108细菌细胞/ml盐水(于660nm下的光密度为1.0)。
                     表1
                S-100疫苗中的抗原
名称 培养基 名称 培养基
溶血性葡萄球菌   BHI 铜绿假单孢菌 BHI
表皮葡萄球菌   BHI 肺炎杆菌 BHI
酿脓链球菌A型1   APT 鼠伤寒沙门氏菌 BHI
酿脓链球菌A型3   APT 流感嗜血菌 BHI
酿脓链球菌A型5   APT 缓症链球菌 APT
酿脓链球菌A型8   APT 普通变形菌 BHI
酿脓链球菌A型12   APT 志贺痢疾杆菌 BHI
酿脓链球菌A型14   APT 肺炎双球菌 APT
酿脓链球菌A型18   APT 痤疮丙酸杆菌 肉汤
酿脓链球菌A型22   APT 血链球菌 APT
产气气杆菌   BHI 唾液链球菌 APT
大肠杆菌   BHI 突变链球菌 BHI
肠炎沙门氏菌   BHI 无乳链球菌 APT
实施例2
超免疫蛋的抗炎作用
该实施例表明在包括超免疫蛋的饮食中，实施例1所述超免疫蛋对角叉菜胶诱导狗皮肤肿胀的抗炎作用。这些结果证实超免疫蛋减轻炎症。对炎症的作用与用非类固醇抗炎药10mg/kg(在该试验中ED50剂量)布洛芬的作用相当。
喂20只白鹰犬(四组，每组5只)市售羔羊和大米狗食的基本膳食(350克)。如表2说明的，2组5只狗(组1和组2)在大约100天的调节时间期间只接受基本膳食。另外，组2的狗在用角叉菜胶炎症攻击前，用非类固醇抗炎药布洛芬处理。在同一期间，其余2组(组3和组4)喂给所述基本膳食和超免疫蛋(HIE)。组3接受加入所述膳食中的3.5克超免疫蛋，而组4接受35克超免疫蛋。调节膳食处理结束时，所述狗皮内注射2％角叉菜胶攻击，引起炎症反应。
所述攻击过程如下。每天每组随机挑选一只狗进行攻击和测试。每天重复该步骤5天，直至测试所有组的所有狗。所述攻击步骤前15分钟时，给与组2的狗口服10mg/kg布洛芬。通过静脉注射麻醉所有的狗，在左侧面进行修剪(大约6×8英寸)。在修剪面上做2条线，每条线3个标记，标号为1-6。在标记1处皮内注射0.1ml盐水作为阴性对照。标记2-6给与0.1ml皮内注射2％的角叉菜胶溶液。在该研究期间由同一个人进行注射。先前确定皮内注射该浓度的角叉菜胶在100％所述动物中引起可测量的肿胀，该肿胀可以用10mg/kg布洛芬减轻。在最后一次注射角叉菜胶后，用测微计测量每处肿胀并记录数值。让所述麻醉动物苏醒，6小时后重复测量并记录。测量每组的炎症反应平均大小。
                                  表2
  组     处理 每组动物的数量 平均炎症反应 与对照的平均差异   显著性P值
  1对照   基本膳食     5     4.41     -   -
  2药物   布洛芬(10mg/kg)+基本膳食     5     2.25     2.2   P＜0.01
  3测试   HIE蛋3.5克+基本膳食     5     2.8     1.6   P＜0.05
  4测试   HIE蛋35克+基本膳食     5     2.38     2.0   P＜0.05
这些结果表明，喂给超免疫蛋(3.5克加上基本膳食和35克加上基本膳食)的动物中肿胀显著减小表明口服所述超免疫蛋对炎症的预防作用。此外，这些结果表明，所述超免疫蛋的抗炎活性与用抗炎药布洛芬见到的作用相当。在处理组和对照组之间观察到显著性P＜0.05水平下的差异。
实施例3
             从超免疫鸟蛋中分离＜30,000道尔顿蛋抗炎成分
步骤1：从蛋中制备水溶性滤液
加工液体蛋黄、液体蛋清和蛋黄粉以获得所述水溶性部分。用在这些实施例中描述的Lee(美国专利5,367,054号)公开的辛酸相分离法(CAPS)将液体蛋黄脱脂。将液体蛋清加热这些实施例中描述的特定时间长度。蛋黄粉按这些实施例中所述用双溶剂、超临界CO2或酶脱脂。
步骤2：所述水溶性部分的超滤
在备有卷膜式30K MWCO超滤膜的Amicon DC10L超滤系统中浓缩所述水溶性部分。超滤柱的膜表面积为10ft2，入口的操作压接近40psi，而出口压为33psi(穿膜压为7psi)，循环流速为10.4L/min，通量流速为2.3L/min。
步骤3：离子交换色谱
来自所述水溶性部分DC10L超滤的滤液通过阴离子交换色谱进一步加工。在该步骤中，用DEAE Sepharose快速凝胶(Pharmacia)填装3×15cm玻璃柱，该柱用pH 7.0的无菌双蒸水平衡。
将通过0.2微米滤器预过滤的500ml所述滤液(＜30,000道尔顿)上该柱，该柱用pH 7.0的500ml无菌双蒸水清洗，流速为10ml/min。用250ml 0.15M NH4OAc洗脱预计含有蛋抗炎成分的结合部分。收集分部收集液并在LKB Uvicord 2138监测器中于280nm处监测，在相联的记录仪上打印光密度。无内毒素的大致纯的蛋抗炎成分的洗脱图示于图1。将所述蛋抗炎成分部分冻干，以用于进一步加工。
从液体蛋黄和液体蛋清中制备＜30,000道尔顿的蛋抗炎成分
用Lee(美国专利5,367,054号)公开的所述辛酸相分离法(CAPS)将2升超免疫蛋黄脱脂。简单地说，在含1％辛酸和0.06M氯化钠的0.02M乙酸盐pH 5.0的缓冲液中将S-100蛋黄稀释15倍。通过从絮凝物相过滤分离水相，用0.5M NaOH将其调至pH 7。将所述水相超滤，直至留下2L保留液。将所述超滤液上所述DEAE Sepharose柱，在DEAESepharose柱色谱后从2L蛋黄获得46.6g蛋黄抗炎成分(参见图4)。
1升超免疫蛋清用3L去离子水稀释。将该混合物加热至90℃1小时，冷却并离心。将上清液通过40微米滤纸过滤并超滤，直至获得大约64ml保留液。将500ml超滤液上DEAE Sepharose柱。在DEAESepharose柱色谱后，从1L蛋清中获得4.4g抗炎成分。(参见图5)。
         从蛋黄粉中制备＜30,000道尔顿的蛋抗炎成分
使用三种方法将蛋黄粉脱脂，然后从脱脂蛋黄粉中分离蛋抗炎成分(图7)。
步骤1：双溶剂萃取
将超免疫蛋黄粉与由无水乙醇和己烷组成的混合物混合，以从蛋黄中除去脂质，然后水分离所述蛋抗炎成分部分。简单地说，将400g超免疫蛋黄粉与2L双溶剂(25％无水乙醇-75％己烷或25％异丙醇-75％己烷)合并并混合。除去溶剂上清液，进行另外两次溶剂萃取，总共进行三次脂质萃取。最后一次萃取的混合物离心以协助最后的分离。将脱脂蛋黄材料干燥，与4,000ml去离子水混合，并用0.5M NaOH调至pH 7。然后在Amicon Dc10L超滤系统中将其浓缩至500ml。
所述超滤液中的所述蛋抗炎成分(＜30,000道尔顿)进一步通过DEAE Sepharose色谱分离，将所述蛋抗炎成分部分冻干，以用于进一步加工。DEAE色谱分离后，从所述超滤液中回收0.45g抗炎成分，测定其活性(图3)。
步骤2：超临界CO2提取
将超免疫蛋黄干粉置于超临界条件下，以从蛋黄除去脂质，然后水分离蛋抗炎成分部分。总之，将大约400g免疫蛋黄干粉置于Autoclave Engineers_SCE装置中，让其于32.2℃、～5400psi下经过静态CO2提取20小时。用4,000ml去离子水将部分脱脂蛋黄匀浆，并于10,000rpm离心30分钟。分离含水上清液，然后在Amicon DC10L超滤系统中浓缩至500ml。过滤液中的所述蛋抗炎成分(＜30,000道尔顿)进一步通过DEAE-Sepharose阴离子交换色谱分离。
将所述蛋抗炎成分部分冻干，以用于进一步加工，DEAE色谱分离后，从超滤液中获得1.86g蛋抗炎成分。图6显示通过超临界CO2提取、超滤和DEAE色谱后的大致纯的成分的生物检定活性。
步骤3：酶处理提取
超免疫蛋黄粉与由Newlase F乳酸盐缓冲液组成的混合物一起保温，以从蛋黄中分离脂质，然后水分离所述抗炎成分部分。简单地说，将300克S-100蛋黄干粉与6L 0.05M乳酸盐缓冲液pH 4.0和27gNewlase F(Sigma#P-5027)混合并匀浆。该混合物于50℃保温1小时，然后过滤底部水相。产生的水相用0.5M NaOH中和，然后在AmiconDC10L(30K MWCO)上浓缩，直至收集3L过滤液，将276ml过滤液上DEAE Sepharose柱。在DEAE色谱分离后，分析30,000MW过滤液的抗炎活性。
         除热原和分析＜30,000道尔顿的蛋抗炎成分
                 分离物的内毒素含量
除热原
将蛋抗炎成分分离物除热原，以消除模拟抗炎成分活性的内毒素。简单地说，将60mg蛋抗炎粉溶于15ml无菌生理盐水溶液中。通过在3K MWCO Centriplus浓缩器(Amicon)中超滤，将该混合物除热原。使用层流下的无菌技术，用PyroCLEAN(AlerCHECK，Inc.)将Centriplus浓缩器预先除热原。内毒素也可以用本领域技术人员可利用的标准方法除去，不必基于分子量的分离。
分析
为了证实，通过肿瘤坏死因子(TNF)酶联免疫吸附检定(ELISA)分析除热原的蛋抗炎成分的内毒素含量。简单地说，将一等份用生理盐水稀释的蛋抗炎成分加入在具有10％胎牛血清的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)培养基中生长的J774巨噬细胞的平板中。于37℃温育4小时后，将上清液加入包被单克隆抗TNF抗体的板中，用含2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭。所述板于室温下过夜温育后，加入生物素化抗体和抗生蛋白链菌素过氧化物酶。将3，3’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物加入所述板中以显色。于450nm下读出所述板孔内容物的吸收值。通过由标准曲线内推，测定所述蛋抗炎成分样品中的TNF含量。除热原后蛋抗炎成分分离物的TNF含量可忽略。(参见表3)。
                 表3
通过TNF检定测定的所述蛋抗炎成分部分的内毒素含量
部分 pg/ml
S100蛋黄抗炎成分 98.08a
S100蛋清抗炎成分 42.00a
非超免疫蛋黄抗炎成分 66.43a
非超免疫蛋清抗炎成分 52.90a
己烷：乙醇萃取的干蛋黄抗炎成分 92.70b
超临界CO2提取的蛋黄抗炎成分 ＜18b
a培养基只有46.5pg TNF/ml。
b培养基没有TNF。
＜30,000道尔顿无内毒素抗炎成分对白细胞迁移的作用
通过与对照大鼠相比，通过在大致纯蛋抗炎成分处理的大鼠的胸膜渗出液中白细胞数减少，测定每个剂量的大致纯的＜30,000道尔顿蛋抗炎成分的抗炎作用。(参见表4，图2)。图2和表4比较了所述大致纯的超免疫蛋黄和蛋清部分的作用与普通餐桌上的鸡蛋的作用。所有剂量的大致纯超免疫抗炎成分都导致迁移到胸膜渗出液中的白细胞数减少。在给与2mg来自蛋黄的所述大致纯成分的那些受治疗者中观察到最大的作用。
                       表4
在不同蛋抗炎成分剂量下白细胞迁移到胸膜渗出液中的抑制
    抑制％
蛋抗炎成分     蛋黄抗炎成分     蛋清抗炎成分
    剂量mg/大鼠     S100超免疫     非超免疫     S100超免疫   非超免疫
    0.5     45.64     18.49     22.0     8.22
    1.0     59.50     17.12     18.0     16.90
    2.0     67.20     18.72     54.4     28.31
    4.0     61.50     26.94     46.7     23.74
    8.0     61.00     29.68     54.9     37.44
蛋抗炎成分的特征
用上述方法制备的大致纯的蛋抗炎成分的分子量发现低于30,000道尔顿。这是由以下事实得出的：从蛋黄和蛋清中分离该成分的第一步骤为采用不允许分子量＞30,000道尔顿的物质通过的膜进行超滤。
该成分在普通条件下具有负电荷，该凝胶的pKa值为9.5。这是通过将蛋超滤液上DEAE Sepharose离子交换柱测定的。所述抗炎成分不能用水从该柱上洗脱。将所述洗脱介质变为NH4OAc溶液、或pH高于9.5的任何盐溶液或缓冲液，使得所述蛋抗炎成分洗脱。当将所述超滤液上DEAE柱时，各种蛋白和盐构成未结合部分(峰1，图1)。当用NH4OAc溶液(峰2)洗涤，然后用NaCl溶液(峰3)时记录峰。由峰2分离的部分在大鼠检定上表现出抗炎活性。第三个峰表现出可忽略的活性。蛋清抗炎成分于90℃热稳定1小时。
此外，可以从蛋黄和蛋清中分离所述蛋抗炎成分。来自蛋黄的蛋抗炎成分表现出的活性高于来自蛋清的蛋抗炎成分(图2，表4)。
实施例4
         从蛋中制备高度纯化的抗炎成分的优选方法
以下实施例描述从鸟蛋中以高度纯、最低分子量、非聚集形式获得抗炎成分的方法(示于大规模纯化)。将超免疫蛋和对照餐桌上的鸡蛋的全蛋压碎，将蛋清与蛋黄分离，将两者喷雾干燥。按实施例1所述方法获得超免疫蛋。单独加工蛋清粉，以获得用于超滤的水性部分。
进行所有的纯化步骤，以减小可能的细菌和热原污染。用无菌水制备溶液，将所有的玻璃器皿除热原。另外，将该溶液无菌过滤。
实施例4a
                 从蛋黄粉中制备蛋抗炎成分
溶剂萃取
将干燥蛋黄或者用丙烷或者用丁烷经过液体溶剂提取，从含有所述抗炎成分的含水蛋黄部分中分离脂质。简单地说，将500克蛋黄干粉置于柱中，在柱中加入4升液体丙烷溶剂。除去溶剂上清液和萃取的脂质。进行另外6次溶剂萃取，总共进行6次脂质萃取。
超滤
400克干脱脂蛋黄用4升无菌蒸馏水稀释，并用Virtis handishear匀浆。该蛋黄混合物或者以24 RPM离心，或者让其冷藏静置，直至不溶蛋黄颗粒沉淀。产生的含水部分用备有3,000MW截留分子卷膜的Amicon RA1000超滤系统超滤。该泵的速度保持在入口压为20psi，出口压为15psi。＜3,000分子量的过滤液用0.45μm无菌一次性Nalgene滤器除菌过滤，冻干或冷冻，以用于贮存、生物检定测试或进一步纯化。图8显示纯化过程的流程图。
来自蛋黄的低于3,000道尔顿的分子物质含有低分子量非聚集形式的抗炎成分。从400克原材料，抗炎成分的产量为约12克或总重量的3％。生物检定测试该3K部分的抗炎活性显示出高水平活性(实施例6a)。
实施例4b
             从蛋清粉中制备蛋抗炎活性
将按实施例1所述的超免疫蛋和对照餐桌上的蛋分离的4克蛋清用1升去离子水稀释。将该混合物匀浆，并通过40μm滤器过滤，通过3K MW CO超滤系统超滤(图9)。从400g蛋清粉中回收8.6g或2.15％的抗炎成分。该材料在抑制大鼠白细胞迁移到损伤诱导部位中表现出生物检定活性(实施例6a)。
该实施例表明从超免疫蛋和对照餐桌上的蛋的蛋清材料中制备活性抗炎成分。
实施例5
                     DEAE离子交换色谱
所述蛋抗炎成分也通过阴离子交换色谱进行进一步表征。该实施例证明所述抗炎成分在中性pH下带负电。
以实施例4a所述的同样方式获得来自蛋清和蛋黄材料的10K超滤，只是使用10,000MW膜代替3000MW膜。
DEAE-Poros 50柱(10/50毫米)用无菌双蒸无热原水(Sigma)pH 7.0平衡。将溶于100ml无菌无热原双蒸水中的10毫克超滤液(＜10,000MW)在BioCad 700(Perseptives Biosystems)上DEAE Poros柱。以10ml/min的流速将该材料上柱。用蒸馏水除去未结合到该柱的材料的流出物，并将其收集。用乙酸铵的线性梯度(0％-100％)洗脱结合到该柱的材料，并用280nm和254nm处的UV吸收监测部分，通过Avantec分部收集器收集10ml的部分。用NaCl(0.15M)除去结合到该柱的其余材料。该柱用蒸馏水洗涤，直至280nm和254nm的吸收回到基线。
图10显示典型的色谱图。箭头指出该活性抗炎成分(峰2)。用NH4OAc的典型洗脱图由箭头所指洗脱缓冲液的变化所证明。洗脱液用0.45μm无菌滤器除菌过滤，冻干至干燥并称量。所述各个峰的生物检定表明，含有所述活性的峰发现在峰2中(实施例6b)。通过DEAE离子交换色谱分离的部分证明所述抗炎成分带负电。
实施例6
                 抗炎活性检定
对餐桌上的蛋和超免疫蛋的蛋黄和蛋清的大致纯部分进行盲检分析抗炎活性。该试验检定测定抑制大鼠胸膜腔中白细胞从小静脉迁移到损伤诱导部位。
将2ml含1％角叉菜胶(一种刺激剂)的生理盐水注射到重120-150克的雌性大鼠(Charles River，MA)的胸膜腔中以诱导白细胞迁移至该胸膜腔。然后给所述大鼠腹膜内注射0.5ml剂量的选定浓度含每种测试部分的生理盐水。每个浓度注射2只大鼠。注射盐水用作对照。注射后4小时，用符合动物保护法案的方法杀死动物。取出胸膜渗出液并固定所述白细胞用于评价。将50微升渗出液加到相应标记的玻片上，加到cytospin上。完成cytospin循环后，用cytoprep固定剂(FisherScientific Co.Atlanta)喷雾所述玻片，并用苏木精染色。评价每个玻片的5个代表区，用Bioscan Optimas图象分析程序计数白细胞数。所有5个计数的平均用于每只大鼠的总平均白细胞计数。与对照盐水注射相比，计算每个样品浓度的抑制百分比。
实施例6a
     来自超免疫蛋和餐桌上的蛋清、蛋黄的抗炎活性比较
对按实施例4所述的来自餐桌上的蛋和超免疫蛋的喷雾干燥脱脂蛋黄和蛋清的纯化部分测试其抗炎活性。按实施例4和5所述进行超滤后，获得来自餐桌上的蛋清、超免疫蛋黄和超免疫蛋清的低于3,000MW的过滤液。每个样品用2只动物，或者腹膜内注射盐水、或者腹膜内注射1mg、5mg、10mg或20mg测试部分，并按实施例6所述进行评价。
图11表明，来自超免疫鸡的高度纯化的、低于3,000MW蛋黄部分证明在1mg/大鼠的剂量下65％的抑制白细胞迁移。这些超免疫蛋黄部分也证明活性(在1mg/大鼠的剂量下65％的抑制)高于由同样剂量的超免疫蛋清获得部分的活性(38％)。对照蛋清证明抗炎活性较低(在1mg/大鼠的剂量下25％的抑制)。非超免疫蛋部分也含有所述抗炎活性，因为所有母鸡都接种疫苗并由于环境中存在微生物和变应原而经过天然免疫。然而，令人惊讶地是，通过超免疫方法，在蛋黄和蛋清中所述抗炎成分的水平都提高。由于蛋中的组分一般划分为或者富含脂质的蛋黄或蛋清，令人惊讶的是在蛋黄和蛋清的低于3,000MW的部分中都发现所述抗炎活性。
该实施例表明，所述抗炎成分低于3,000道尔顿，在蛋黄和蛋清中发现，发现在超免疫蛋部分比对照餐桌上的蛋的有效量高得多。事实上，所述高度纯化的抗炎成分在超免疫蛋中发现的量有效地治疗炎症。
实施例6b
         所述带负电的DEAE部分对白细胞迁移的作用
按照所述抗炎生物检定步骤后，测试来自超免疫蛋黄的用乙酸铵洗脱的带负电的DEAE峰2和3K和10K超滤液的活性。在指定的剂量下测试每个样品。
图12表明，超免疫鸡蛋的所述带负电DEAE部分、3K和10K超滤液与盐水对照相比时，表现出高水平的抗炎活性。
实施例6c
                     与抗炎药的比较
将抗炎药消炎痛和阿斯匹林与所述蛋的3K超滤液比较体内对白细胞迁移的抑制。在该检定中，腹膜内注射给与1000μg、100μg、10μg、1μg的消炎痛、阿斯匹林和来自超免疫蛋的3K蛋抗炎成分。
图13表明，所述3K超滤液和阿斯匹林表现出相似水平的抗炎活性。消炎痛的白细胞迁移抑制水平似乎在较低剂量(1-100μg/大鼠)下较低。
该实施例表明，来自蛋的抗炎部分在白细胞迁移检测中与已知抗炎药的作用相当。
实施例7
         通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化抗炎部分
来自蛋黄大致纯的低于3K、10K的DEAE部分和来自蛋清的30K DEAE部分在Waters C8对称反相柱(3.9×250mm)上分离。在具有717加自动加样器和996光电二极管阵列检测器的Waters 2010型HPLC上，将10％-80％的甲醇和H2O的线性梯度用作流动相。冻干样品在100-200ml无菌双蒸水中稀释。该柱以2ml/min的流速洗脱，贮存在200nm-350nm的所有波长下的流出物二极管阵列数据。
图14显示3K过滤液分离的MAX色谱图。该色谱图显示产生高度纯化的蛋抗炎成分的分子量低于3K的2个主峰。图15说明来自10K过滤液成分的分离，该过滤液在DEAE离子交换柱上按实施例5概述进行分离。获得与用3K超滤液部分观察到的相似的2个峰。这些结果表明，低于3K和也表现出抗炎活性的DEAE(实施例7)的两个部分都可以用来获得高度纯化的带负电组分。
3K蛋黄部分的成分分析表明，存在在1-2分钟时洗脱的最初系列的峰和在10-20分钟时洗出的3个峰。该实施例表明，所述抗炎成分低于3,000MW，并可以用该方法分离为相对纯的峰。
制备型HPLC
为了在超滤后获得大量的所述抗炎因子，优选步骤是在制备型HPLC柱上分离所述高度纯化的低于3,000分子量的成分。因此，用Zorbax C8填充材料填充5.08×20cm柱，在每次运行期间纯化4克低于3,000MW的超滤液。使用具有0.05％TFA的80/20 H2O/甲醇作为流动相，流速为90ml/min，将所述渗透物分离为高度纯化的成分，将其收集并冻干。接着在分析型C8柱上重测试收集的峰。用所述方法，通过制备型HPLC获得大量的超纯峰，并分析生物检定活性、元素组成和化学结构。使用质谱、元素分析、红外光谱法和核磁共振(NMR)测定该因子的结构。
实施例8
             蛋抗炎成分的物理特性
该实施例说明对加热、酸碱变化、蛋白酶处理的稳定性。
4毫克低于3,000MW的超滤液在无菌水中稀释并于100℃经过30分钟。低于3K的超滤液样品在中和前经受酸HCl pH2.0、中性pH 7.4或碱NaOH pH 9.0 30分钟。3K部分也用1单位的链霉蛋白酶处理1小时。将所有的样品无菌过滤、冻干、称量并测试生物学活性。
处理过部分(高热、pH变化和链霉蛋白酶处理)与未处理对照和注射盐水动物的生物检定活性的比较显示出对这些处理的令人惊讶的稳定性。除尺寸小(低于3,000MW)外，对高热、pH变化和链霉蛋白酶处理的稳定性表明该抗炎成分不是蛋白质。
确定所述高度纯的抗炎成分具有以下特性。其分子量低于3,000道尔顿。该特性由该成分的分离纯化得出，其中所述分离纯化方法使用不允许大于3,000道尔顿的分子物质通过的超滤膜。确定该成分为非蛋白性的和非类固醇的，因为它的尺寸小，并且不被降解蛋白质的酶降解。此外，该成分具有口服活性，不被消化酶降解。该成分的小稳定形式(有别于大得多的蛋白质)有助于其消化道的吸收。
该成分抗酸碱，甚至在用pH 9.0的条件处理后也转化为活性形成。另外，该成分于100℃热稳定至少30分钟，在中性pH下具有负电荷。
所述蛋抗炎成分可以从全蛋、蛋黄和蛋清中分离。从蛋黄分离的抗炎成分显示出的抗炎活性高于从蛋清中纯化的抗炎成分。
可以从超免疫全蛋、超免疫蛋黄和超免疫蛋清中分离超常水平的抗炎成分。

Claims (23)

1.高度纯化形式的抗炎成分，其中所述成分的特征在于：
(1)存在于由产蛋动物产的蛋的蛋清和蛋黄中；
(2)于100℃热稳定至少30分钟；
(3)在中性pH下具有负电荷；
(4)在pH 4.0-pH 9.0的条件下抗酸和碱；
(5)具有口服活性；以及
(6)分子量低于3,000道尔顿；
所述分子量低于3,000道尔顿的部分是脱脂以及可溶于水的；
而来自产蛋动物蛋的抗炎成分的高度纯化方法包括：
(1)从所述全蛋、蛋黄或蛋清中分离水溶性部分；
(2)从所述水溶性部分分离低于3,000道尔顿的过滤液；
(3)分级分离所述低于3,000道尔顿的过滤液，以回收生物学活性部分。
2.来自产蛋动物蛋的抗炎成分的高度纯化方法，包括：
(1)从所述全蛋、蛋黄或蛋清中分离水溶性部分；
(2)从所述水溶性部分分离低于3,000道尔顿的过滤液；
(3)分级分离所述低于3,000道尔顿的过滤液，以回收生物学活性部分。
3.权利要求2的方法，其中所述分级分离步骤还包括所述低于3,000道尔顿过滤液的反相高压液相色谱。
4.权利要求2的方法，还包括将所述全蛋和所述蛋黄在步骤(1)之前脱脂。
5.权利要求2的方法，还包括将步骤(2)的所述低于3,000道尔顿的过渡液冻干。
6.权利要求2的方法，其中所述分离步骤还包括将所述水溶性部分通过截留分子量为3,000道尔顿的滤膜进行超滤。
7.权利要求2的方法，其中所述产蛋动物保持在超免疫状态。
8.权利要求7的方法，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗诱导所述超免疫状态。
9.权利要求8的方法，其中所述基因疫苗包含至少一种选自质粒DNA、病毒DNA、DNA表达文库、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白质缀合物、DNA脂质体缀合物、裸露DNA片段、以及它们的组合的抗原编码DNA构建物。
10.权利要求8的方法，其中所述抗原疫苗包含至少一种选自细菌、病毒、原生动物、真菌和细胞抗原的抗原。
11.由以下方法产生的高度纯化形式抗炎成分，该方法包括：
(1)从所述全蛋、蛋黄或蛋清中分离水溶性部分；
(2)从所述水溶性部分分离低于3,000道尔顿的过滤液；
(3)分级分离所述低于3,000道尔顿的过滤液，以回收生物学活性部分。
12.权利要求11的抗炎成分，其中所述产蛋动物处于超免疫状态。
13.权利要求11的抗炎成分，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗诱导所述超免疫状态。
14.权利要求13的抗炎成分，其中所述基因疫苗包含至少一种选自质粒DNA、病毒DNA、DNA表达文库、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白质缀合物、DNA脂质体缀合物、裸露DNA片段、以及它们的组合的抗原编码DNA构建物。
15.权利要求13的抗炎成分，其中所述抗原疫苗包含至少一种选自细菌、病毒、原生动物、真菌和细胞抗原和它们的组合物的抗原。
16.分子量低于3,000道尔顿的抗炎蛋或蛋部分，其通过超免疫产蛋动物；以及包含以下步骤的方法：
(1)从所述全蛋、蛋黄或蛋清中分离水溶性部分；
(2)从所述水溶性部分分离低于3,000道尔顿的过滤液；
(3)分级分离所述低于3,000道尔顿的过滤液，以回收生物学活性部分；而制备的。
17.权利要求16的抗炎蛋或蛋部分，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗超免疫所述产蛋动物。
18.权利要求17的抗炎蛋或蛋部分，其中所述基因疫苗包含至少一种选自质粒DNA、病毒DNA、细菌DNA、DNA表达文库、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白质缀合物、DNA脂质体缀合物、裸露DNA片段、以及它们的组合的抗原编码DNA构建物。
19.权利要求17的抗炎蛋或蛋部分，其中所述抗原疫苗包含至少一种选自细菌、病毒、原生动物、真菌和细胞抗原的抗原。
20.权利要求16的包含至少一种抗炎成分的抗炎蛋或蛋部分，所述抗炎成分以超常水平存在，所述水平是能有效地治疗受治疗者的炎症的水平。
21.权利要求20的抗炎蛋或蛋部分，其中所述抗炎成分的特征在于：
(1)存在于所述抗炎蛋的蛋清和蛋黄中；
(2)于100℃热稳定至少30分钟；
(3)在中性pH下具有负电荷；
(4)在pH 4.0-pH 9.0的条件下抗酸和碱；
(5)具有口服活性。
22.权利要求1或11的组合物于制备用于预防、对抗或减轻受治疗者炎症的药物中的用途。
23.权利要求1或11的组合物于制备用于抑制在受治疗者中白细胞迁移的药物中的用途。
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