JPH07504884A - ガングリオシド類似体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ２９　動物を請求項１〜５のいずれかの化合物又は請求項１３による抗−イディ オタイプ抗体で免疫化して抗原と反応しつる抗体を産生ずる細胞を得、動物又は 細胞から抗体を分離することからなる抗体の製法。

３０、動物を、請求項１〜５のいずれかの化合物又は請求項１３による抗−イデ ィオタイプ抗体で免疫化して、抗原と反応しつる抗体を産生ずる細胞を得、その 細胞を融合細胞を不死化する細胞系の細胞と融合し、モノクロナール抗体を産生 して得られるハイブリドーマ抗体を選択してクローン化又はモノクロナール抗体 を産生ずる未融合細胞系を不死化し、次いで、培地中の細胞を生育してモノクロ ナール抗体を得、この抗体を生育培地から採取することからなる請求項１による モノクロナール抗体を作る請求項２９記載の方法。

３１、免疫化される動物が、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、豚 、馬又は二十日ネズミから選択された哺乳動物である請求項２９又は３０記載の 方法。

３２、抗体を産生ずる細胞が膵臓又はリンパ細胞である請求項２９〜３１のいず れかによる方法。

３３、ハイブリドーマ細胞が、生体外又はマウスのような動物の体内て育成され る請求項３０〜３２のいずれかによる方法。

明細書 ガングリオシド類似体 本発明の分野 この発明は、ガングリオシドの類似体、該化合物の製造方法、免疫応答を誘導す るための該化合物の用途、及びバクテリア及びウィルスの付着阻害剤としての用 途、ならびに該化合物に対する抗体の生成における。該化合物に対する抗体、な らびに治療又は診断における該抗体の用途に関する。

本発明の背景 ガングリオシド、つまり、シアリン酸含有グリコスフィンゴリビッドは、哺乳動 物の細胞表面の成分として公知である。さらに、ガングリオシドは対応するラク トンとの平衡で生じることが見出されている。このように、ＧＭ、−及びＣＤ、 −ガングリオシド［ＮｅｕＡｃ　ａ　（２−３）Ｇａ　ｌβ（＋−４）Ｇｌｃβ ０−セラミド及びＮｅｕＡｃａ　（２−８）ＮｅｕＡｃａ（２−３）Ｇａｌβ（ １−４）Ｇｌｃβ０−セラミド１は、シアリン酸由来のカルボニル基が、Ｎｅｕ Ａｃ及びＧａｌ残基のそれぞれ異なる水酸基とともに、ラクトンの形成に加わる ところでラクトンを形成することが証明されている。さらに、そのようなラクト ンは、生体内、例えば、脳組織及び腫瘍細胞の細胞膜に存在し、まさに単離工程 の人工物でないことが示されている（Ｇｒｏｓｓ、Ｓ、　Ｋ、：　Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ、　Ｍ、　Ａ、；　ＭｃＣＩｕｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅ ｍ、　＋９８０．３４．１３５１−１３６１）。ＧＭ、−ラクトンは、ＧＭ、− ガングリオシドの開放型（ｏｐｅｎ　ｆｏｒｍ）よりもより免疫遺伝的であるこ とが示されている（Ｎｏｒｅｓ、　Ｇ、Ａ：　Ｄｏｈｉ、　Ｔ、：　Ｔａｎｉｇ ｕｃｈｉ、　Ｍ。

；　Ｈａｋｏｏ＋ｏｒｉ、　Ｓ、−１，Ｊ、Ｉａ＋ｌｌ１ｕｎ、１９８７．　１ ３９．３１７１−３１７６）。

ＧＭｓ−ラクトンは、柔軟であるその粗構造に比較して、認識部位又は膜抗体と して機能する能力が高められうることを意味する椅子型配座のラクトン環を有す る高剛性構造であることも示唆されている（Ｙｕ、　Ｒ，Ｋ、；　Ｋｏｅｒｎｅ ｒ、　Ｔ、　Ａ、　Ｗ、；Ａｎｄｏ、　Ｓ、：Ｙｏｈｅ、　Ｈ，Ｃ，；　Ｐｒｅ ｓｔｅｇａａｒｄ、　Ｊ、　Ｈ，Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９８５．９８．１ ３６７−１３７３）　（図１参照）。さらに、ＧＭｓ−ガングリオシドのラクト ン（ＧＭ、−ラクトン）は、実験マウス黒腫の細胞における腫瘍関連抗原となる ことが示唆されている（上記文献Ｎｏｒｅｓ、　Ｇ、ら）。０Ｍ２−ガングリオ シド及び対応するラクトンでの比較免疫化において、同じ著者が、ラクトンはよ り強力な免疫原であることを示しており、この化合物は、少数の細胞膜成分であ るにもかかわらず実質的な免疫原であること示唆している。さらに、種々の細胞 とリポソームを有するモノクローナル抗−黒腫抗体（Ｍ２５９０）の活性は、細 胞膜又はリポソームにおけるＧＭｓ−ガングリオシドの濃度の型、全てか無か、 閾値に依存することを示した。また、抗原は、ＧＭｓ−ラクトンと相互反応する ことが見出された。

ガングリオシドラクトンは、中性のｐＨで不安定で、一方、酸性下で、ＧＭ、− ガングリオシドとＧＭｚ−ラクトンとの間の平衡において、ラクトンに育利に働 く。しかし、ＧＭ、−ガングリオシドはそれ自体酸性であり、酸含有糖脂質であ るので、ガングリオシドは、その濃度が細胞膜又はリポソームにおいて十分高い とき、それ自身のラクトン化を誘導しつる。これは、上述した閾値効果を説明す るのに有効であり、他のサツカライド含有シアリン酸と同様の関連を有しうる。

このように、ガングリオシドラクトンは開放型ガングリオシドよりも非常に免疫 原的であることを示しているが、中性に近いｐＨ値でのラクトンの低平衡濃度が 、ラクトンをむしろ無力の免疫原とするであろう、このように、ガングリオシド のラクトン型に類似し、ガングリオシドラクトンと少なくとも部分的な相互作用 をし得る抗体（及び他の免疫系の存在）を生じることができる不安定でない免疫 原的化合物を有することが望ましいことは明らかである。

本発明の要旨 １つの観点において、本発明は、空間的に広がりがあり、密接にガングリオシド に類似し、従って、対応するガングリオシドと相互反応し、さらにガングリオシ ドに指向し、よってガングリオシドが存在するところの存在物に対する免疫応答 を順次引出す抗体の生成を誘導しうるガングリオシド類似体に関する。

従って、本発明は、一般式■のガングリオシドラクタム類似体誘導体に関する。

〔式中、Ａは、式■のシアリン酸残基 （上記残基は、２位の点線を介して結合され、Ｚｌは−ＯＨ又は基−ＮＨＸ’　 、Ｙ”は−ＣＨｓ又は−ＣＨ，ＯＨ）、Ｘｌ及びＹ’は互いに結合を形成し、Ｙ ′は−ＯＨ又は基○Ｒ２ｏ、又はＸｌ及びＹ２は互いに結合を形成し、Ｙｌは− ＯＨ又は−ＮＨＡｃ、Ｙ２は−ＯＨ又は基ＯＲ″、Ｒ１はＨ又は式■のシアリン 酸基 （上記残基は、２位の点線を介して結合し、Ｚ２は−ＯＨ又は基−ＮＨＸ”　、 Ｙ”は上記と同義） Ｘ！及びＹｌ６は互いに結合を形成し、Ｙ”は−０Ｈ１又はＸ！及びｙ　ｔ　ａ は互いに結合を形成し、Ｙｌ６は−ＯＨ，但し、Ｒ１がＨのとき、Ｚｌは−ＮＨ Ｘ’　、Ｒ’が上記式■のシアリン酸残基のとき、Ｚｌ及びＺｌの少なくとも１ つは−ＯＨとは異なる、Ｒ１６がＨ、キャリアＣＡ、又は基−（糖）１、糖は、 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ′−キシロース、Ｄ− リポース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−フコース、２−アセタミド−２−デオキシ− Ｄ−グルコース、２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グル クロン酸、Ｄ−ガラクトユロニン酸、Ｄ−マンヌユロニン酸、２−デオキシ−２ −フタルイミド−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−フタルイミド−Ｄ−ガラ クトース及びシアリン酸からなる群から選ばれたモノサッカライド単位、ｎは１ −１０の整数、そこで還元　末端糖単位がへミアセタール又はキャリアＣＡにグ リコシド的に結合されている、Ｒ２０が式Ｉ′の基 −グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リポ ース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−フコース、２−アセタミトー２−デオキシ−Ｄ− グルコース、２−アセタミビー２−デオキシーＤ−ガラクトース、Ｄ−グルクロ ン酸、Ｄ−がラクトロン酸、Ｄ−マンヌユロン酸、２−チオキシ−２−ブタリミ ドーＤ−グルコース、２−デオキシ−２−フタリミド−Ｄ−ガラクトース及びシ アリン酸からなる群から選ばれたモノサッカライド単位、 Ｒ１はＨ又は上述の式■のシアリン酸残基（Ｚｌ　、　Ｒ１、Ｙ２Ｏ、Ｙ”、Ｙ ”及びＺ２は上記と同義、Ｘｌ及びＹ’は互いに結合を形成し、Ｙｔ′は−ＯＨ １又Ｘ′及びＹ”は互いに結合を形成し、Ｙ’は−ＯＨ又は−ＮＨＡｃである） 〕。

このように、本発明の化合物は、対応するガングリオシドラクトンのラクタム類 似体であり、そのようなラクタムは中性のｐＨで非常に安定であり、良好なラク トン代用物を与える。このように、ＧＭ、〜ラクトンの場合、対応ＧＭｓ−ラク タムは、ラクタムが、潜在的に対応ガングリオシドラクトンと相互に作用し、さ らに順次ガングリオシドラクトンに指向し、よってガングリオシドラクトンが存 在する存在物に指向する免疫応答を引き出す抗体の生成を誘導しうろことを意味 するラクトンに比較して非常に類似した全形を存していることが（以下に議論す るように）分かった。

本発明の詳細な説明 上記記載から明らかなように、基（糖）、及び基〔糖Ｉ）。

は、それぞれｎ及びｐ単糖類単位からなる群であり、それぞれは、これらのリス トから選択される。式Ｉにおける環に最も近似している糖単位がグリコシド的に 結合されている（α又はβ）ことが式Ｉから明らかである。さらに、式Ｉ゛の環 に最も近似している糖単位、つまり、環の６位に結合している単位は、グリコシ ド的に結合されている（α及びβ）。全基（糖）、及び基〔糖１〕、は直鎖又は 分岐していもよく、つまり、全群における集合した単位は直鎖又は分岐鎖を形成 してもよい。一般に、各単位（還元末端単位と独立に）は、配糖体の結合（α及 びβ）を介して、次の単位に結合する。配糖体の結合は、次の単位において利用 できる位置、例えば、通常の単糖類単位又はそれらの単一の誘導体の２位、３位 、４位又は６位、又はシアリン酸の８位のいずれと結合してもよい。

さらに、上述のように、基（糖）、における還元末端単糖類単位は、ヘミアセタ ール、つまり未置換である、又はキャリアＣＡに対してグリコンド的な結合（α 及びβ）をしていてもよい。同様に、つまりＲｔｏがそのようなキャリアの場合 、式■における環はキャリアＣＡに対してグリコシド的に結合していてもよい。

キャリアＣＡは、天然に、又は合成の糖抱合体、配糖体（可溶又は不溶）、糖脂 質又は糖蛋白において見出されているアグリコン基のいずれでもよい（例えば、 Ｇ、　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎら、Ｊ、　Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、　［９９０，５５，３９３２で議論され、具体的に示されている）。

このように、そのようなアグリコンは脂質基、つまり、炭水化物分子と共に糖脂 質を形成する脂肪親和性基でもよい。そのような脂質基の具体例としては、脂肪 酸のアシル基、例えば、Ｃｌ−２゜のアルカン酸又はアルケン酸のような炭素数 １〜２５の飽和又は不飽和で分岐又は末分技炭水化物鎖を存する脂肪酸のアシル 基、ベンゾイル、フェニル又はベンジル基のようなアリール含有基、又はコレス テロール又はラノステロール基のようなステロイド基である。脂質基の他の例は 、スフィンゴリビッド及びグリコグリセロリピッド基である。末端糖単位とカン ブリングした結果生ずるグリコスフィンゴリピッド又はグリコグリセロリピッド は、以下の一般構造を有する。

グリコスフィンゴリビッド グリコグリセロリピッド 末ｉ糖単位に結合されつる他の脂質基は、ここに参考として導入される米国特許 第４．８６８．２８９号に述べられたアグリコン基の一つである。そのようなア グリコン基は、好ましくＣＨｔ　ＣＨ−ＣＨｔ　−Ｓ　（０）−−Ｒ４Ｒ＊（ｑ は０．１又は２の整数、Ｒ１は飽和又は不飽和、分枝又は未分技の炭素数１〜２ ５のアルキル鎖、Ｒ６はＨ又はＣＨＯｌＮｏ、　、ＮＨ，、ＯＨ，ＳＨ，Ｃ０Ｏ Ｈ，Ｃ０ＮＨ，等の官能基である。しかし官能基、特にＣ０ＯＨ又はＣＯ’Ｎ　 Ｈ，は、さらに以下に示したような大きな、又は巨大分子構造に結合してもよい ）のイオウ含有アグリコンである。

キャリアＣＡは、さらに、具体的には蛋白質、多糖類、プラスチックポリマー及 び無機物質の残基のような、有機又は無機、重合体又はさもなければ巨大分子構 造のいづれかの大きな又は巨大分子構造であってもよい。蛋白質残基は、好まし くは、例えばアミノ基、水酸基又はメルカプト基等の蛋白質の核性基を介して結 合される。蛋白質自体は、広範に多様な蛋白質、特に、グロブリン等の生物学的 に共存できる蛋白質、オバルブミン、生型血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血 清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミン、フィブリン、ポリリシン、”キーホー ル”透明ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風前等のいずれでもよい。多糖類は、広 範に多様な多糖類のいずれでもよく、セルロース、スターチ又はグリコーゲン等 の通常の多糖類の水酸基を介して結合されていてもよく、キトサン又はアミノ化 セファ０−ス等のアミノ糖類のアミノ基を介して結合されていてもよく、チオ変 性化多糖類のメルカプト基を介して結合されていてもよい。プラスチックポリマ ーの例は、アミノ化又はチオール化ラテックス、チオール化、アミノ化又はヒド ロキシル化ポリスチレン及びポリビニルアルコールである。無機物質の例は、酸 化アルミニウム、又はシリカゲル、−ゼオライト、珪藻土等の酸化シリコン又は ガラスが、例えばビーズの形態で存在するチオール化又はアミノ化ガラス等の種 々のガラス又はシリカゲル型の表面である。

キャリアＣＡの特定の例は、それらが、還元末端糖単位に付加されたものとして 以下に示す。

ビス−スルフィドグリコリピッド ビスースルホングリコリピッド 本発明の好ましい化合物は、Ｙ′及びＹ３の最大一つが基−Ｑ　Ｒｔ　６である ものである。

これらの化合物のうち、特に好ましい化合物は、Ｙ３が−ＯＨで、もし存在する ならばＲ”における各糖単位、ならびにもし存在するならば式Ｉ′における環構 造及び各糖単位が、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、２−アセタミド−２− デオキシ−Ｄ−ガラクトース及びＬ−フコース単位である。このような化合物に おいて、特に好ましくは、一般式■の環が、ガラクト型を有することである。ま た、Ｒ’がＨであることがさらに好ましい。

式■及び■の２つのシアリン酸残基のそれぞれに、式Ｉ及び式■のそれぞれの環 の位置で、シアリン酸における酸基にラクタムを形成するための２つの可能な方 法がある。また、本発明の化合物は、式１′におけるＲ８の定義によって、可能 なラクタム化部位の当然の数で４種までのシアリン酸残基を含有できる。さらに 、可能なラクタム化部位の少なくとも１つは、ラクタム機能に関与することが必 要である。これは、種々の炭水化物機能の性質に関して、各基本のガングリオシ ド構造にかなりの数の特異構造が可能となる〔式Ｉ及びＩ′における環、糖ｌの 性質及び（糖）、の性質と組成、ならびにラクタム構造に含有されていない、残 存する変わりやすい性質〕。この関係を示すため、以下の図に、２つのガングリ オシド、つまり、（Ａ）１つのシアリン酸単位を含むＧＭ、−ガングリオシドと （Ｂ）２つのシアリン酸単位を含むＣＤ、−ガングリオシドから形成され得る可 能なラクトンを示す。図において用いられている学において述べられているガン グリオシドの同定及び特徴のための標準学術用語からきている。

特異のラクタム構造の例を、以下に示すが、そこでは、各化合物はそれが由来す るガングリオシドに基づいて、かつラクタムブリッジが形成されている間の位置 を介して示されているラクタム機能から名付けられている。

ｆＭ（１２−ラクタム） 開（ふ４−ラクタム） ＧＤ３（ＩＩＬ　９−ラクタム） ＧＤ２（８，９−ラクタム） シアリルグロポテトラオース（３，２−ラクタム）６Ｌフ（ふ４−ラクタム） フォルスマン（■−コンノくイン（３，２−ラクタム）ＧＤｌａ（ａ　２−ジラ クタム） 一般に、ラクタム環の新規な形成はさておき、本発明の式Ｉの化合物は、上記に 引用したＧ、　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎらによ′ってのように文献に示されているオ リゴサツカライド・グリココンジュゲートの製造において使用される保護／脱保 護及び配糖体合成の確立した標準反応シーケンスと方法によって製造される。ラ クタム環形成は、通常オリゴサツカライド鎖の構造の完成後され、その後アグリ コンキャリアＣＡか誘導される。ラクタム環の一部である窒素は、合成経路にお ける単糖類レベルで保護された型において導入され、その後脱保護され、シアリ ン酸残基のカルボキシル分子と閉環のため活性化される。ラクタム環の形成のた めの他の及び選択の対象となる経路は、Ｇａ１ＮａｃのＮ−アセチル基をペブチ ターゼ酵素によって除去し、次いでＮｅｕＡｃ残基のカルボキシル基と生成する 遊離アミノ基との閉環をさせるＮｅｕＡｃα２−３　Ｇａ１Ｎａｃ残基のペプチ ダーセ誘因ラクタム化を採用することに基づいている。

より詳しくは、グリコジル化反応は、塩化メチレン、トルエン、アセトニトリル 、エーテル又はニトロメタンのような中性、極性もしくは非極性の有機溶媒中で 行うことができる。反応温度は、臨界的ではなく、−７８℃〜＋１５０°Ｃ１通 常０°Ｃ〜５０°Ｃ１例えば室温で行われ、しかし最高の収率は、温度調節で得 ることができる。反応時間は、０．１〜２００時間、通常１〜２４時間、例えば １６時間であろう。グリコジルドナーは、ハロゲン糖、糖１．２−オルジエステ ル類、１−〇−アシル糖又はチオグリコシド類であることができ、かつ促進剤は 、酸化銀、炭酸銀、トリフレート銀（トリフルオロメタンスルホン酸銀）　、Ｈ ｇＢｒｔ、Ｈｇ（ＣＮ）１、メチルヌルフェニルトリフレート、ジメチルチオメ チルスルホニウムトリフレートのような金属塩又は他の親電子試薬から選択でき る。反応条件に敏感な糖誘導体の基は保護される。

従って、水酸基は、アセチル又はベンゾイルのような了シル、ベンジル又はベン ジリデン基で保護できる。形成された生成物は抽出、結晶化又はクロマトグラフ ィーなどの当該分野で周知の方法で精製できる。保護基は、所望により、続いて 当該分野で周知の方法で（選択的に）除去され、任意に脱保護した位置を変換し 、さらに精製される。

ラクタムの窒素原子は、対応するアジドを経て導入でき、これは、原料モノサッ カライド構成ブロック中に存在する。アジドのアミンへの還元は、硼素化水素ナ トリウムに、任意に塩化ニッケルと硼酸を加えて処理するか、又は各種のチオー ルと硫化水素での処理によって行うことができる。還元はシアリン酸残基を導入 するグリコジル化工程の前か後に行うことができる。

しかし、現在では、還元を合成経路の遅い時点で行うのが好ましいと考えられ、 これによって、形成されるアミンの保護が避けられる。反応温度は、−７８°Ｃ 〜＋１５０°Ｃ１通常−２０°Ｃ〜＋５０゛Ｃの範囲、例えば０°Ｃである。反 応時間は０．１〜２００時間、通常０．１〜２４時間、例えば２０分である。

ラクタム環の閉環は、アミノシアリン酸メチルエステル−サツカライドをピリジ ンのような適切な溶媒で処理することによって行うことができる。現在知られて いる系では、触媒の追加（例えば酸又は塩基）は必要とみられないが、ある場合 には必要であろう。反応温度は一７８°Ｃ〜＋１５０“Ｃ１通常０°Ｃ〜５０℃ の範囲、例えば室温である。反応時間は０．　１〜２００時間、通常０．１〜２ ４時間、例えば１２時間である。

オリゴサツカライド・ラクタム、例えばキャリアグリコシドへの変換は、一般的 な方法、ことに上記のＧ、　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎらの報告に記載の方法で行うこ とができる。

他の観点によれば、この発明は、上記の式Ｉの化合物に指向する抗体に関する。

この抗体は、対応するガングリオシドラクトンと反応しうるのが好ましい。

抗体は、モノクロナール抗体が有利であり、これはポリクロナール抗体より特異 性が高い（すなわち、抗原とのより密接な幾何学的“フィソビをし、結果として より高い結合恒数となる）ものである傾向がよい。従って、正確な診断測定に育 用となる。

モノクロナール性を要求しない目的には、抗体はポリクロナール抗体であっても よい。これは、適当な動物（例えば、ウサギ、サル、ヒツジ、マウス、ヤギ、ラ ット、豚、馬又は二十日ネズミ）に、この発明の化合物を注射し、次いで、最初 の放血前６ケ月まで適当な間隔（例えば２週間〜１ケ月）で１以上の補助注射を することによって行うことができる。次いで、この確立した免疫管理を続ける一 方、動物は各補助免疫後約１週間飼育し、抗体は、常法、例えばＨａｒｂｏｅと ｒｎｇｉｌｄ、　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、　２　（補１）　、１９７３年 、１６１−１６４頁に記載のように、血清から単離される。

モノクロナール抗体は、また池の常法（例えばＫｏｈｌｅｎ、　Ｍｉｓｓｔｅｉ ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６巻（１９７５年）　、　４９５頁）により、ハイブ リドーマ細胞系の使用、あるいはクローン又はそのサブクローン、又は該モノク ロナール抗体をコードするハイブリドーマ細胞系から遺伝子情報を保持する細胞 によって産生ずることができる。

モノクロナール抗体は、モノクロナール抗体を産生ずる細胞と適当な細胞系の細 胞を融合し、モノクロナール抗体を産生する生成したハイブリドーマ細胞を選択 、クローン化することによって得ることができる。又は、モノクロナール抗体を 産生する未融合細胞系を不死化し、次いで適当な培地中で細胞を発育させて抗体 を産生じ、生育培地からモノクロナール抗体を採取することによりマノクロナー ル抗体を得ることができる。この発明の抗体を産生ずる細胞は、免疫動物からの ひ臓細胞又はリンパ細胞、例えば末梢リンパ球である。

この発明の抗体の産生にハイブリドーマ細胞が使用される際、生体外又は動物の 体内に生育できる。抗体産生細胞は、動物、例えば動物の腹水中で高濃度の抗体 を放出する腹水腫瘍を生成をするマウスに注入される。動物は、また通常の抗体 を産生ずるが、この量はモノクロナール抗体に対し小さな割合であり、標準隋製 法、例えば遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィー又はこれらの組合せを用 いて、腹水から精製できる。

モノクロナール抗体が産生しつる適当な方法の例は、免疫マウス（例えばＢａ１ ｂ／Ｃマウス）からのび臓細胞とミエローマとを常法（例えば、Ｒ，Ｄａｌｃｈ ａｕ、　Ｊ、Ｋｉｎｋｌｅｙ、　Ｊ、Ｗ、Ｆａｂｒｅ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　ｔｏ、　１９８０．７３７〜７４４、“ラットの白血球−′共通（Ｌ −〇）抗体に恐らく相同のヒト白血球−特異性膜糖蛋白に対するモノクロナール 抗体”に記載の方法）を用いて融合させるものである。得られた融合体は、この 発明の化合物を使用する結合アッセイのような常法でスクリーンされる。

ある目的には、抗体は、この発明の化合物のエピトープに対し、指向した結合部 位を含有し、同じ抗原の他のエピトープ、他の抗原のエピトープ又はある医薬の エピトープに対し、指向した他の結合部位をさらに含有するハイブリッド抗体で あるのか有利である。用語”結合部位“とは、抗体分子の各種領域での抗原認識 構造を意味するものとして理解される。ハイブリッド抗体は、サンプル中の抗体 を検出させ、かつ医薬又は池の生理的に活性な分子又は池の抗原を、試薬が最も 大きな効果を示す腫瘍部位に標的化させるのに特別な方法を可能とする。有利な 具体例では、ハイブリッド抗体が反応する他の抗原は、細胞毒Ｔ−細胞の分化抗 原である（Ｓｔａｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４．１９８５．６２８参照）。

ハイブリッド抗体が反応しつる医薬は、細胞毒性又は抗新生物性剤（Ｃｏｌｌｉ ｅｒ、　Ｒ，Ｊ、　Ｋａｐｌａｎ、　ＤＡ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　２５１．１９８４．４４参照、下記の説明参照）である。

ハイブリッド抗体は、２つの関連する抗体を産生ずる２つのモノクロナール細胞 系間のハイブリッドで産生ずるか、２つの抗体のフラグメントを化合的に結合さ せることにより産生できる。

この発明は、さらに、各種の目的（下記参照）のため、抗イデイオタイプ抗体、 すなわち、抗原に関しエピトープと反応性である抗体の部位に指向した抗体、す なわちこの発明の化合物である抗体に関する。抗イデイオタイプ抗体は、この発 明の化合物と反応性である抗体に対し指向する。抗イデイオタイプ抗体は、モノ クロナール又はポリクロナール抗体について記した同様の方法て作ることができ る。この発明は、上で定義した抗イデイオタイプ抗体に対する抗−抗イデイオタ イプ抗体にも関する。

この発明の化合物に対する抗体及び上記の抗−抗イデイオタイプ抗体は原則的に 、弐■の化合物又は上記の抗イデイオタイプ抗体の親和クロマトグラフィーによ る精製に使用できる。

さらに重要な観点によれば、この発明は、上記の式Ｉの化合物、上記のこの発明 の抗体、上記の抗イデイオタイプ抗体、又は上記の抗−抗イデイオタイプ抗体か らなる診断薬に関する。

この発明の化合物に指向した抗体ならびに上記で定義した抗−抗イデイオタイプ 抗体は、癌の生体外診断に使用できる。例えば、生体サンプルが抗体又は抗−抗 イデイオタイプ抗体と処理され、下記のように結合した抗体を検出できる。抗イ デイオタイプ抗体は、この発明の式Ｉの化合物自体と同様に、この発明の化合物 に対する抗体の体液中での存在を検出するのに使用でき、従って免疫応答の強さ 、又はさらに抗体処置が必要かどうかを評価するのに使用できる。

殆んどの目的に、結合抗体を検出するため標識を育する抗体を提供するのが好ま しい。二重抗体（サンドイッチ）アッセイで、少なくとも１つの抗体が公知方法 での標識びて提供される。

この明細書で標識として育用な物質は、酵素、蛍光物質、放射性同位元素、ビオ チンのようなリガンドから選択できる。

無傷抗体に基づいて実施する全ての方法又は応用に代えて抗体のフラグメント、 例えばＦ　（ａｂ’　）ｓ又はＦａｂフラグメントを用いて行うことができると 理解されるべきである（Ｂ、　Ｄｅｌａｌｏｙｅら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　［ｎｖ ｅｓｔ　８７．１９８６．３０１参照）。

この発明は、さらに、この発明による式■の化合物と生理学的に受容な賦形剤又 はアジュバントからなるワクチンに関する。

このようなワクチンの使用に関して、この発明の化合物は、Ｒ１０が前に定義し たキャリアＣＡ又は基（糖）、で還元末端糖単位が、キャリアＣＡにグリコサイ ド的に結合しているものが好ましい。キャリアＣＡは蛋白キャリアからなるか、 上記の脂質基であるのが好ましい。

一般的に、ワクチンは免疫系の関連部分を最適に刺激する、すなわち免疫剤をあ る期間、認識、取込み又は刺激に必要な池の相互作用又はプロセッシングに関し て最適である型で提供させるべきである。

キャリアＣＡが脂質基のとき、ワクチンの特に興味ある具体例は、式Ｉの化合物 が超高分子集合体の一部を形成するものである。用語“超高分子集合体″とは、 粒子の懸濁液、コロイド、エマルジョン又は溶液（粒子サイズによる）で、粒子 の表面に、この発明の化合物が、免疫系の存在を検出し、免疫応答を溶出させる ように周囲環境と相互作用できる仕方で位置することを意味する。粒子は、生体 分解性ポリサッカライド粒子、例えばデキストリン粒子、式（１）の化合物を液 状メンブレン中に含む界面活性剤層からなるメンブレンからなる“液体”粒子の ような、多数の特に生体分解性粒子の何れであってもよい。“液体″粒子の例は 、リポソーム、ミセル又は立体相粒子である。

さらに他の観点では、この発明は請求項１Ｏ〜１６の何れかによる抗体と医薬的 に受容な賦形剤とからなる、ガン関連抗体としてガングリオシドラクトンを有す るヒトのガン治療用医薬組成物に関する。

この発明の組成物に使用される賦形剤は、何れの医薬的に受容なビヒクルでもよ い。このビヒクルは、注射用組成物の製造に普通に用いられる何れのビヒクルで あってもよく、例えば、等張又は緩衝食塩水のような希釈剤、懸濁剤などがある 。組成物は、抗体の医薬性に有効量体に、ビヒクルを組成物中で抗体の所望濃度 が得られる量体で混合することにより作ることができる。

ある場合は、抗体をキャリアー、特に巨大分子キャリアに結合させるのが有利で ある。巨大分子キャリアとしては、この発明の化合物について上記した何れでも よい。巨大分子キャリヤーは、通常トキシンが疎水性の非共存相互作用で結合さ れるポリマー、例えばポリスチレンのようなプラスチック、抗原あるいは抗体が 共有結合されるポリマー、例えばポリサッカライド、あるいはポリペプチド、例 えばウシ血清アルブミン、オボアルブミン、キーホールリンベントヘモシアニン である。さらに、巨大分子キャリアは、抗体が結合する細胞審剤あるいは抗新生 物剤のような医薬から選ぶのが有利である。

巨大分子キャリアは、非毒性で非アレルギー性であるのが好ましい。抗体は、巨 大分子キャリアに多価的に結合でき、それにより組成物の免疫性を増大しつる。

径口投与用の組成物としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、パスタ、ゲル、混合 液又は懸濁液の型で、任意に放出遅延コーティング又は抗原（すなわち、この発 明の化合物）が胃を通過する際に保護するコーティングを有していてもよい。

顆粒、錠剤、カプセル剤のような固形製剤は、糖、フルビトール、マンニトール 、珪酸のような充填剤、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンの ようなセルロース誘導体、澱粉、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムのような崩 解剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウムのような滑 剤を含むことができる。パスタ、ゲルのような半固形製剤は、アルギネート、ゼ ラチン、カラギーナン、トラガントゴム、ペクチンのようなゲル化剤、流動パラ フィンのような鉱物油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、ナタネ油、ブドウ種子油 のような植物油ならびに澱粉、ゴム、ゼラチンなどの糊料から構成できる。混合 液、懸濁液のような液状製剤は、水、流動パラフィンのような鉱物油、トウモロ コシ油、ヒマワリ油、ナタネ油、ブドウ種子油のような植物油などの水性又は油 性ビヒクルから構成できる。この発明の抗体は、常法により液状ビヒクルに懸濁 できる。

放出遅延コーチングとしは、例えば腸溶コーティングで、シヱラック、セルロー スアセテートフタレートのようなセルロールアセテートエステル類、ヒドロキシ プロピルメチルセルロースフタレートのようなヒドロキシプロピルメチルセルロ ースエステル類、ポリビニルアセテートフタレートのようなポリビニルアセテー トエステル類、メタクリル酸と（メタ）アクリル酸エステル類のポリマーから選 択できる。

特に、注射用組成物は、この発明のワクチンに関して記載した、粒子懸濁液、コ ロイド、エマルジョン又は溶液の型を使用して製剤化できる。

また、組成物は、半割のような直腸投与用に適用できる。このような半割は、カ カオ脂や他のグリセライドのような通常の賦形剤を含むことができる。

さらに、この発明は、この発明の化合物又はこの発明の抗イデイオタイプ抗体を 、ヒトのガン腫の治療用医薬の製造への使用、又はこの発明の抗体又は抗−抗イ デイオタイプ抗体をヒトのガン腫の治療用医薬の製造への使用に関する。

ガン、特にガン腫、通常の細胞より高濃度にガングリオシドラクトンを含む細胞 、特に細胞膜の治療は、当業者に知られた各種の手法で行うことができる。この 発明の化合物に対する抗体（特に上記の理由のヒトモノクロナール抗体）は、ガ ン患者に注射でき、ガンに直接又は、各種のエフェクター機構、例えば補体仲介 細胞毒性又は抗体依存細胞仲介細胞毒性を介して戦わすことかできる。

他の具体例によれば、抗体は、ドラック標的アプローチ（ｄｒｕｇ　ｔａｒｇｅ ｔｉｎｇ　ａｐｐｒｏａｃｈ）に利用することができる。抗体は、上記のように 患者に注射する前に、医薬にカップリングさせ（従ってこれらをその活性の部位 に移送する）又は細胞毒Ｔ−細胞又は他の細胞毒細胞の抗原のような細胞毒エフ ェクター機構に対する池の抗体にカップリングさせて修飾することができる。

この発明の抗原化合物に対する１つの結合部位と他の抗原又は上記の医薬に対す る他の結合部位を含有するハイブリッド抗体も、問題の腫瘍にツーウェイアタッ クをするのに有利に用いると考えられる。

医薬の標的化は、原則として、医薬が既に抗原−抗体反応によりカップリングさ れているハイブリット抗体、又は医薬とカップリングしていないハイブリッド抗 体の何れかを用いて行うことができる。第１の場合に、抗体は投与により、抗体 を有する医薬を運んでガン細胞膜のガングリオシドラクトンをめ、そこで医薬の 効果を奏しつるであろう。第２の場合には、抗体の前又は後に医薬を別に投与す ることが必要で、抗体は、ガン細胞の表面での身体中又は血清中で医薬と反応す るであろう。

抗体とカップリングさせる医薬は、メルフアラン、クロラムブシル、ブスルファ ン、シスプラチン、チオテパのようなアルキル化剤の制ガン剤、メトトレキサー ト、プルラシル、アサチオプリンのような代謝拮抗物質、ビンクリスチン、ビン ブラスチンで代表される細胞分裂抑制剤、ドキソルビシン、タウノルブソン、プ レオマイシンのような抗生物質が代表的なものである。医薬は細菌又は他のトキ シンであってもよい゛。

この発明の化合物は、体内での抗ガン免疫応答を刺激するため免疫化に用いるこ とができる。このため、この発明は、この発明の式Ｉの化合物と生理的に受容な 賦形剤とからなるワクチンに関する。この発明の化合物をガン患者の、例えば白 血球と培養して、ガンに対するエフェクター細胞を作るため生体外で使用しても よい。

この発明の化合物又は医薬組成物は、それらを投与することからなる、特に細菌 又はウィルスの細胞への付着に関しての細胞−細胞又は細胞−ウィルス相互細胞 、ヒト又は動物における感染、ガンの転位を阻害する方法に使用できる。この方 法は、細胞表面におけるガングリオシドの機能の１つがレセプターとして機能す るという事実に基くもので、一方、例えば細菌又はウィルスと池方咄乳動物細胞 間の相互作用で、ガングリオシドは認識レセプターと機能し、このものは、細菌 又はウィルスの表面でエピトープと作用し、これらが細胞表面に付着するか、又 は実際に細胞を侵襲することをみかけることが知られている。

かくして、この発明の化合物は、細菌、ウィルス又は転移細胞でエピトープを“ 飽和する”のに役立つことができ、従って、エピトープの能力を低下させ、天然 レセプターと相互作用することができる。

さらに、この発明の化合物は、循環する抗腫瘍抗体又は免疫コンプレックスを除 去するため又は抗体製剤の精製のための体外装置に使用できる。そのため、この 発明は、抗体含有溶解と抗体と反応しうる式Ｉの化合物〔化合物は固形支持体（ 親和クロマトグラフィー法におけるシリカゲルやデキストランのような固定相） にカプリングされているか結合されている〕と接触させ、支持体から抗体を放出 させることからなるこの発明の抗体の精製法に関する。結合抗体を支持体から放 出するには、Ｍａｎｉａｔｌｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｕｒ、　１９８２）に記載の周知方法により行うことができ、その際、例えば９ Ｈ１塩基度やイオン強度の変更、抗原様化合物の溶液に置き換えし、透析などを 行うことができる。

本発明の化合物をワクチン中に使用する可能の自然のなりゆきとして、本発明は 、さらに、本発明による化合物を、その化合物に対する抗体の生成を誘因しつる 量で、投与することからなるガン関連抗原としてガングリオシドラクトンを有す る人ガンに対する免疫保護を処置又は高める方法に関する。

本発明の化合物に対する抗体は、さらに、抗−イディオタイプ又は抗−抗−イデ ィオタイプ免疫応答を刺激するために投与できる。本発明の化合物と反応する抗 体に対してもたらされる抗−イディオタイプ抗体（ノモクロナール又はポリクロ ナール、もしくはこれらのフラグメント）は、これらの抗原化合物に類似のエピ トープ（抗原決定基）を表現でき、そのため、抗ガン腫瘍免疫応答を誘出するた め、免疫化と類似の方法で使用できる。このような抗体は、ｔＩｃｌの抗体につ いて上記した体外装置にも使用できる。

抗−抗イデイオタイプ抗体は、第１の抗ｒｍ瘍抗体についての記載と同様に使用 できる。

この発明の診断方法の池の具体例は、この発明の抗体の手段で生体内で腫瘍（特 に限定されるものではないが、ガン腫）を探し出す方法に関する。この方法は、 この発明の抗体を検出できるように漂識化してその珍断有効量を投与し、結合抗 体の局在する部位を決定することからなる。抗体は、放射性同位元素、特にテク ネソウムのような生理学的に認容の同位元素で漂識化てき、続いて注射し、公知 の方法、例えば適当な構成のガンマ−線検出器て検出てきるＱｌａｃｈ、　Ｊ、 　Ｐ、　らＮａｔｕｒｅ　２４８．１９７４゜ｐ７０４）。

この発明を図で例証すると、 図１は、ＧＭ、−ラクトンメチルグリコシドのエネルギーを最小化した立体構造 の２次元透視図、図２は、実施例１で生成したＧＭｓ　−ラクタムのメチルグリ コンドについてエネルギーを最小化した３次元構造の２次元透視図、図３は、図 １と図２で示した２つの構造の重ね図、図４ａ−ｄは、ＧＭ、−ラクタム−ＢＳ Ａフンシュゲートに対し生じたあるノモクロナールの結合阻止曲線（下記実施例 ５参照）。

この発明はさらに次の実施例で例証される。実施例１〜４において用いられるか 又は製造される各種の原料、中間体と生成物１〜２９を以下に示す。

実施例１ ネオグリコプロティンＧＭ、−ラクタム−ＢＳ’Ａ（１８）の合成は、原料物質 ｌ、２及び１０を用いてなされた。中間体３〜９及びＩｆ−１７が単離され、特 徴付けられた。

Ａ）２−（トリメチルシリル）エチル　２．３．６−）リー〇−ベンジル−４− ０−（３，４，５４リ−０−アセチル−２〜アジド−２−デオキシ−α／β−Ｄ −ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコビラソシド（３αβ）化合物２　（Ｊ ａｎｓｓｏｎらＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　１９８ｇ、　５３．５６２９：４ ゜５ｇ、８．２’２モル）、＋　（２，９ｇ、７．３６モル）及び乾燥分子篩（ ４人、３ｇ）を乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、その混合物を窒素雰 囲気下、６０分間攪拌した。珪酸銀（ｖａｎ　Ｂｏｅｃｋｅｌ、　Ｃ，Ａ、　Ａ 、、　Ｂｅｅｔｘ、　Ｔ、　Ｒｅｃ、　Ｔｒａｖ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐａｙｓ−Ｂ ａｓ、　１９８７．１０６．５９６：　８　ｇ）を加え、その混合物を室温で１ ８時間、強力に攪拌した。残渣をクロマトグラフィーに付して（ＳｉＯ２；ヘプ タン／ＥｔＯＡｃ傾斜６：１−４：１）、３αβ（３，８７ｇ、６１％：α／β ＝８：９２）を得た。

”）！−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　６　５．１９　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　＝ 　３．コツ　Ｈｚ、Ｈ−４’β）。

４．６０　（ｄｄ、１．）！、Ｊ　−３，２７，１０，８Ｈ２，Ｆ！−］／β１ ．　４．４０　（ｄ、　ＬＨ，Ｊ　−７，６Ｈｚ、Ｈ−１β）、　４．コ９　（ ｄ、１）１．　ｊ　−８，１Ｈｚ、Ｈ−１’ρ）、２．０９．　２．０４゜１． ９９　（コＳ、　コＨｅａｃｈ、ＯＡｃβｌ、１．０５　（ｍ、２Ｈ，Ｏ！２Ｓ ｉｌ、０．０４　（ｓ、９Ｈ，’５１Ｍ５コ）・ １コＣ−）ｒＭＲ（ＣＤＣ１３）　６　１０１．３．　ＬＯコ、０．　１００． ７．　９７．６゜Ｂ）２−（トリメチルシリル）エチ／Ｌ、２．　３．　６−１ −ＩＪ−０−ベンジル−４−０−（２−アジド−２−デオキ゛シーα／β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（４αβ） 化合物３αβ（３，７ｇ、４．２８ミリモル）をメタノール性ナトリウムメトキ シド（０，２Ｍ、５０ｍ１）で、室温にて１時間処理した。その混合物をツユラ イト（［１ｕｏｌｉｔｅ；Ｈ’）樹脂で中和、濾過し、溶媒を除去して粗生成物 ４αβ（３，０６ｇ、９７％）を得、精製しないで次の工程で用いた。

Ｃ）２−　（１−リメチルシリル）エチル　２．３．６−）リー〇−ベンジル− ４−０−（２−アジド−２−デオキシ−３，４−及び−４，６−０−イソプロピ リデン−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（５α β及び６β）化合物４αβ（７５０ｍｇ、１．０１ミリモル）及び（±）−カン ファースルホン酸（１５ｍｇ）を、２．２−ジメトキシプロパン（２５ｍｌ）に 溶解し、その混合物を、室温で４８時間攪拌した。トリエチルアミン（２ｍｌ） を加え、その混合物を、トルエン（４Ｘ２０ｍｌ）で共濃縮してアミンの痕跡を 除去した。残渣は、メタノール／水（１０・１．４４ｍ１）に溶解し、その混合 物を３時間還流しく浴温度８５°ＣＬ次いでトルエン（３Ｘ３０ｍｌ）で共濃縮 した。残渣はクロマトグラフィーに付して（Ｓｉ○、：ヘブタン／ＥｔＯＡｃ傾 斜５：ｌ→Ｉ：２）、（溶出液の順序で） Ｍｓａ２Ｃ）、１．０４　（ｍ、２）！、ＣＭ２ＳＬｌ、ａ、ｏ４　（Ｓ、９Ｈ ，５ｉｘａコ）。

を得た。

Ｄ）２−　（トリメチルシリル）エチル　２，３．６−４リ−○−ベンジルー４ −０−（２−アジド−６−０−ベンジル−２−デオキシ−３，４−０−イソプロ ピリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（７β） 及び２−（トリメチルシリル）エチル２，３．６−トリー〇−ベンジル−４−０ −（２−アジド−４−０−ベンジル−２−デオキシ−４，６−０−イソプロピリ デン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（８β）混合 物５β６β（２，３５ｇ、３．０２ミリモル）をジメチルホルムアミド（４０ｍ ｌ）に溶解し、水素化ナトリウムを加え、室温で攪拌した。１時間後、臭化ベン ジル（０，６ｍｌ、５ミリモル）を加え、その混合物を一夜室温で攪拌した。メ タノール（５ｍｌ）を滴下し、ジクロロメタン（３００ｍｌ）を加え、その混合 物を水で洗浄しく５Ｘ２００ｍｌ）、乾燥して（Ｎａ、Ｓｏ、）　、ＩＪ縮した 。残渣をクロマトグラフィーに付して（Ｓｉｆｔ；ヘプタン／ＥｔＯＡｃ傾斜２ ０’：ｌ→１゜１）、（溶出液の順序で） フβ　（２，２４ｇ、８６１；　Ｒｆ　Ｏ，コｌ、５ｉ０２．　ｈ＊ｐｃａｎｅ ／ＥセＯＡｃ　コニｉ）　［α］Ｄ２５＋２Ｌ’　＋Ｈ１，４，ＣＤＣ１３）； ＩＨ−ＮＫＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１４１６４，４０（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−７，８Ｈ ｌ、　）（−１）、４．２９８８　（２２１ｍｑ、８４：　Ｒｆ　Ｏ，１５，５ ｉ０２．ｈａｐｔａｎｅ／ＥｔＯＡｃ　コニ１）；ＩＨ−ＮＭＲｄａｔａ　（Ｃ ＤＣ１３）　＆　４．４０　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ　−７，９Ｈｌ、　Ｈ（）、４． ２６（ｄ、　ＬＨ，Ｊ　−８，１Ｈｚ、　Ｈ（’）、　１１０　（ｄｄ、　１１ （、Ｊ　−１６，１０，２Ｈｚ。

Ｈ−３’）、Ｌ、４５．　１．３７　（２ｓ、ＩＨｅａｃｈ、Ｍｅ２Ｃ）、１． ０４　ｉｎｌ、ＣＨ２５Ｌ）−を？辱ｔこ。

Ｅ）２−　（、トリメチルシリル）エチル　２．３．６−トリー〇−ベンジル− ４−０−（２−アジド−６−〇−ベンジルー２−デオキシーβ−Ｄ−ガラクトピ ラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド（９β） 混合物７β（２，２０ｇ、２．５３ミリモル）を酢酸／水（５０ｍｌ、８５　： 　１５）に溶解し、その混合物を８５°Ｃで、９０分間攪拌し、次いで、トルエ ン（５Ｘ２０ｍｌ）で共濃縮した。残渣をクロマトグラフィーに付して（ＳｉＱ ｔ＋ヘプタン／ＥｔＯＡｃ傾斜４：　ｌ→２：Ｉ）、９β（１，９６ｇ、９４％ ）を得た。

１−）！−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣｌ２）　５　４．４０　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　 −７，６にｚ、）ｔ−１）、４−コ１（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−８，１Ｈｚ、Ｈ−１’ ）、２．７６　（ｄ、１）ｔ、、ｙ　−コ、７　Ｈｚ：　０ＨＩＩ２．５６　（ ｄ、　１１４．　Ｊ　−８，０Ｈｚ、　ＯＨＩ、　１．０４　（ｍ、　２Ｌ　Ｃ ’Ｈ２Ｓ１）、　０．０４　（５゜９Ｍ、ＳｉＭ！１１゜ Ｆ）２−（トリメチルシリル）エチル　０−（メチル　５−アセトアミド−４， ７，８，９−テトラ−０−アセチル−３，５−シーデオキシーＤ−グリセロ−α −Ｄ−ガラクトー２−ノヌルビラノシロネート）−（２→３）−０−（２−アジ ド−２−デオキソ−６−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→ ４）−２，３，６−トリー〇−ベンジルーβ−Ｄ−グルコビラノット（１１） 化合物９β（１，９８ｇ、２．３９ミリモル）及び０−エチル−３−（メチル（ ５−アセトアミド−４，フ、８．９−テトラ−０−アセチル−３，５−ジ−デオ キシ−α−Ｄ−グリセロＤ−ガラクトー２−ノヌロピラノンル）オネート）　（ Ｍａｒｒａ、　Ａ。

５ｉｎａｙ、　Ｐ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１９８９．１８７．３ ５：　１０；　１　、　７１　ｇ。

２８７ミリモル）を新鮮な蒸留乾燥アセトニトリル／ジクロロメタン（７０ｍｌ 、３．２）に溶解し、分子篩（３人、４ｇ。

加熱により活性化する）を加える。その混合物を窒素雰囲気下、室温で９０分間 攪拌する。トリフレート銀（トリフルオロメタンスルホン酸銀）（０，７３８ｇ 、２．８７ミリモル）を加え、その混合物を一７８゛Ｃに冷却し、２０分間攪拌 した。１．　２−ジクロロエタン（０，７７ｍ１．）中の臭化メチルスルフェニ ル（Ｄａｓｇｕｐｔａ、　Ｆ、、　Ｇａｒｅｇｇ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｃａｒｂｏｈ ｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１９８８．１７７゜ｃ１３：０．３６５ｇ、２．８７ミリ モル）を、反応混合物に加え（シリンジ）、攪拌を一７８°Ｃで２時間持続した 。ジイソプロピルアミン（１ｍｌ）を加え、その混合物を−“７８°Ｃで１時間 攪拌し、次イテ、ジクロロメタン（３００ｍｌ、−２０°Ｃ）とともにセライト を通して濾過した。その混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し 、乾燥（Ｎａｔ　５ｏ４）、濃縮した。残渣をクロマトグラフィーに付して（Ｓ ｉｎｓ：）ルエン／ＥｔＯＨ傾斜４５：ｌ→２５・１）、不純物＋１を得た。異 なった溶媒を用いた第２のクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）に付し、以下の化合 物を得た。

ｉ）へキサン／ＥｔＯＡｃ　（１：　ｌ）で、９β（０，８１ｇ。

４１％）、 １１）トルエン／ＥｔＯＡｃ（５：４→１：１４１：２）で、２’　−３’−β −リンクされたトリサツカライド（０，１５ｇ。

５％）、 １ｉｉ））ルｚン／ＥｔＯＡｃ　（１：　３）　で、化合物１１（１゜６３ｇ、 ５２％）、 １ｖ）ＥｔＯＡｃで、１０の２．３−脱離生成物（０，５９ｇ。

）； ４．４０　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−７，コ　Ｈｚ、Ｈ−１）、４．１７　（ｄｄ、Ｌ Ｈ，Ｊ　−３，２，１０，０１コＣ−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　６　Ｃ ７０，９，１７０，６，１７０，２，’　１フ０．１．　Ｃ７０，０゜１６Ｂ、 ４．　エコ９．コ、ｌ］ａ、７．　ＬコＢ、５．　１３１ｍ、１．　Ｌ２Ｌ］、 Ｌ２１１．２．　１２ＬＬ。

１２フ、６．　１２７．５．　Ｃ２７，４６，Ｃ２７，４，１２７，Ｌ、１０コ ６工、１００．６．　９７．５゜Ｂコ、Ｌ　１１２．１．　フロ、９．　７５． ２．　ハ、９．　７４Ｊ、７コ、コ、７：１．２．　７２．５．　７２．２゜６ ９．０．　６８．７．　６Ｂ、４．　６ａ、３．　６７４．　６７、Ｌ、６６． ９．　６２．７．　６２．４．　５コ、ＩＬ４９、コ、　コア、０．　２３．２ ．　２１．２．　２０．９．　２０．７．　２０．６．　１Ｂ、５．　−１．４ ゜Ｇ）ＴＭＳＥ　ｔ　０Ｍ３−ラクタム（１２）化合物１１　（４００ｍｇ、０ ．３０６ミリモル）、塩化二・メチル（ＮｉＣＩ＊／６Ｈ＊　０．１．３７ｇ、 ５．７５モル）及びホウ酸（６４８ｍｇ、１１．ｉミリモル）を、エタノール（ ３０ｍｌ）に溶解した。その混合物を攪拌し、０°Ｃに冷却した。エタノール（ ２０ｍｌ）中の水素化ホウ素ナトリウム（３０８ｍｇ、８．１４ミリモル）の溶 液を１０分間で滴下した。

１０分後、その混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した 。その混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、乾燥（Ｎａｔ　 ＳＯ４）　、濃縮した。残渣をメタノール性ナトリウムメトキシド（０，０５Ｍ 、５ｍ１）で、−夜室温にて処理し、次いで、酢酸で中和し、トルエンで共濃縮 した。残渣をピリジン（５ｍｌ）とともに室温で一夜攪拌し、トルエンで共濃縮 した。残渣を、シリカ（ＣＨＣｌ　ｓ　／Ｍｅ　０ＨＩＯ：１）を通して濾過し 、ろ液を濃縮した。残渣を酢酸（１０ｍｌ）で、室温にて一夜還元した（Ｈ＊　 、Ｐｄ／Ｃ，１０％、１気圧）。その混合物をセライトを通して濾過し、ろ液を 濃縮した。残渣をクロマトグラフィーに付しくＳｉＯ，；Ｃ１）、１２　（１１ ８ｍｇ、５４％）；（（Ｚ）Ｄ”　２２゜ＬＨ−ＮＭＲｄａｔａ　（０２０）　 ６４．６９　（ｄ、　ＩＭ、　Ｊ　＝　８．０　Ｈｚ、　Ｈ−１’）、　４．４ ７（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−１１，１Ｈｚ、Ｉ（−１）、４．３２　（ｍ、ＬＨ，Ｈ− ４１１）、：１．２コ　（ｔ、ＬＨ。

Ｊ　＝　９．０　Ｈｚ、Ｈ−２１，２，５９（ｄｄ、ＬＭ、Ｊ　−５，３，１３ ，４Ｈｚ、Ｈ−３＋Ｔ６ｑ）。

２．０２　（ｓ、３Ｈ，ＮＨＡｃ）、１．６７　（ｄｄ、ＬＨ，ｊ　−ＬＬ、４ ．　１２．９　Ｈｚ。

Ｈ−３″ａｘ）、Ｌ、ＯＯ（ｍ、２Ｍ、ＣＨ２５ｉｌ、０．００　（Ｓ、９Ｈ， ＳｉＭａ３１；１コＣ−ＮＭＲ（０２０１６Ｌ１２．９．　Ｃ６９，６，１０２ ，コ、１００．７．　９８．８．　７ｇ、９゜７Ｌ８．　７７．０．　７４．９ ．　７４．８．　７コ、９．　７１２．　７Ｌ、０．　６９．コ、６Ｂ、６．　 ６７．５゜６６、コ、６４．１，６Ｌ、ａ、６Ｌ５，５２．６．　５Ｌ、６．　 ４０．１，２２．９．　１Ｂ、４．−Ｃ７゜Ｈ）ＴＭＳＥｔ　０Ｍ３−ラクタム −ＡＣ（＋３）化合物＋２（ｌ１３ｍｇ、０．１５８ミリモル）を無水酢酸／ピ リジン（１：ｌ、５ｍ１）で、室温にて２４時間処理し、次いてトルエンで共濃 縮した。残渣をクロマトグラフィーに付しく５ｉＯ＝；トルエン／エタノール、 ５：ｌ）、１３（１７１Ｍ−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　６　５．６１　 （ｂｄ、ＩＨ，Ｊ　−１０，５Ｈｌ、Ｈ−７′１）。

５．４６　（ｂｄｔ、　ＬＨ，Ｈ−４”ｌ、　４．４５　（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ　 −７，９，９，２Ｈｌ、　Ｈ−２＋。

４．５４　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ　−７，８Ｈｚ、　Ｈ−１１，４，４０（ｄ、　Ｉ Ｈ，Ｊ　−８，６Ｈｚ、　Ｈ−１’）、２．４０　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　＝　５． ６　ａｎｄ　エコ、４　Ｈｚ、Ｈ−３”ａｑ）、２．２０゜２．１Ｂ、２．０９ ．　２．０９．　２．０８．　２．０６．　２．Ｏａ、２．０３．　２．００． 　Ｌ、１１９　（９！Ｉ。

コＨｅａｃｈ、ＯＡｃ、１ｆＨＡｃ）、Ｃ７９（ｄｄ、１）！、Ｊ　−１１−４ ，１２，９Ｈｚ、Ｈ−■）クロロＧＭｓ−ラクタム−Ａｃ　（１４）化合物１３ 　（１６７ｍｇ、０．１５３ミリモノＬ；）及びジクロロメチルメチルエーテル （０，１０５ｍ１，１．１８ミリモル９を乾燥クロロホルム（４ｍｌ）に溶解し 、新鮮な溶融塩化亜鉛（＝２０ｍｇ）を加えた。その混合物を、室温にて一夜攪 拌し、クロロホルム（２５ｍｌ）を加え、その混合物を飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液及び水で洗浄、乾燥（Ｎａｇ　Ｓｏ、）ｔ、、濃縮して粗生成物１４を得 、精製しないで用いた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ　＊　）６６、　２０　（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝３゜９Ｈｚ、Ｈ −１） Ｊ）２−ブロモエチルＧＭ、−ラクタム−Ａｃ（１５）化合物１４　（１５６ｍ ｇ、０．１５４ミリモル）を、ジクロロメタン（２ｍｌ）中の２−ブロモエタノ ール（０，１ｍｌ。

１．４ミリモル）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（５２ｍｇ、０．２ｍｍｏ 　ｌ）及び分子篩（３人、０．１ｇ）の攪拌した混合物に、−２８°ＣＳ窒素雰 囲気下にて滴下した。４時間後、冷却浴を除去し、その混合物を一夜放置し、次 いで、セライトを通して濾過し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し 、乾燥（Ｎａｔ　ＳＯ４）　、濃縮した。残渣をクロマトグラフィーに付しく５ ｉＯｔ；）ルエン／エタノール、ｌＯＯ１２、α、β−混合物（１５：８５）と して、１５　（９０，ｍｇ、　５４％）　；　（α）　ｏ　”　−２７°　（ｃ 　１．２．ＣＤＣ１＊）を得た。

１Ｈ−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　６　４．９０　（ｄｄ、ＩＪｉ、Ｊ　 −８，０，９，４Ｎ２．　Ｈ−２１。

４．７８　（ｄ、ＬＭ、、、７−８．１　Ｈｚ、Ｈ−１１，３，４２（ｂｔ、２ Ｌ　ＱＣ■２ＣＨ２）、２−４０（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−５，６，エコ、２　＋（ ｚ、＋（−３”ｅｑ）、２．２０．　２．Ｌ５．　２．エコ、２．０７゜２．０ ６．　２．０５．　２．ｏｏ、Ｃ８９，（８ｓ、コＯＨ，ＯＡｃ、Ｎ１１Ａｃ） 。

Ｋ）スペーサーＧＭ、−ラクタム−Ａｃ（１６）化合物１５（９０ｍｇ、０．０ ８２ミリモル）、炭酸セシウム（３２ｍｇ、０．１０ミリモル）及びジメチルホ ルムアミド（４，５ｍ１）を室温で、窒素雰囲気下、１０分間攪拌した。

メチル３−メルカプトプロピオネート（３７μＬ０．３３ミリモル）を加え、混 合物を２．５時間攪拌し、ジクロロメタン（３０ｍｌ）を加え、その混合物を水 で洗浄し、乾燥（ＮａｇＳＱ、）、！縮した。残渣をクロマトグラフィーに付し く５ｉＯ１：トルエン／エタノール、傾斜１５：１→１０・１）、α。

β−混合物（〜１５：８５）として、１６（７７ｍｇ、８２％）、〔α〕。！！ 　２３°　（ｃ　１．１．ＣＤＣ１，）を得た。

２、Ｌ５．２．１１．２．０７．２．０６Ｆ３．２．０６．２．０４．２．００ ．１．９９．１．８９゜（１０ｇ、コＨａａｃｈ、ＯＡｃ、Ｎ’ＨＡｃｌ　Ｈ１ ３Ｃ−？ｉＫＲ（ＣＤＣｌ２）　６　Ｃ７２，Ｃ７１，４，１７Ｌ２．　１７０ ．８．　１７０．４．　１７０．コ。

Ｃ７０，ｌ、　１６９．９．　Ｃ６９，８，１６９，７，１６７，７，１００， ５，１００，２，９７４，７７，２゜７６．７．　７５．２．　７５．１．　７ コ、０．　７２．３．　７２．１．　７１７、７Ｌ４．　７０．４．　６９．７ ゜６９．４．　６７、コ、６５．１．　６２．１５．　６１．０．　Ｓｉ８．　 ５０．９．　４ｇ、７．　コア、コ、：１４．７゜Ｌ）スペーサー０Ｍ３−ラク タム（１７）化合物１６（４９ｍｇ、０．０４３ミリモル）゛を、メタノール性 ナトリウムメトキシド（０，０２Ｍ、２ｍ１）に溶解し、その混合物を室温にて ４時間攪拌し、次いでシュライｌ−Ｈ”樹脂で中和し、濾過及び濃縮した。残渣 をクロマトグラフィーに付しくＳ　ｉｏｔ；　ＣＨＣｌ、／ＭｅＯＨ／Ｈ，０１ ｌＯ：５：１）、α、β−混合物（、〜Ｉ：８）として、１７（２８ｍｇ、１− Ｈ−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　＆　４．９２　（ｄ、　Ｌ）Ｉ、　Ｊ　 −４，１Ｈｌ、　Ｈ−１ａ）、　４．６９（ｄ、　ＬＨ，Ｊ　ｍ　８．Ｉ　Ｎ２ ．　Ｈ−１１）、　４．４８　（ｄ、　１Ｍ、　Ｊ　−８，１Ｎ２．　！（−Ｉ Ｂ）。

４、：＋２　４ｒｎ、ＬＨ，Ｈ−４”ｌ、１７０　（ｓ、コＨ，ＣＯＯＭｅ）、 ｌコＯ（ｔ、ＩＨ，Ｊ　＝８．１　Ｈｌ、　Ｈ−２１，２，８５，２，８１（ｋ ｉｔ、　２Ｈｅａｃｈ、　ＣＨ２）、　２．７１　（ｋｉｔ、　２Ｈ。

ＣＩ（２）、２．５７　（ｄｄ、Ｌ）Ｌ、Ｊ　−５，４，１３，２Ｈｚ、Ｈ−： ｌ”ａｑ）、２．０２　（Ｓ、３Ｈ。

Ｎ）ｌＡｃ）、　１．６７　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ　−１０，３，Ｌ３．２　１（ｚ 、Ｈ−コ”ａｘ）；１３ｃｍドＭＲｄａｔａ　（ｏ２ｏ）　＆　Ｃ７５，９，Ｃ ６９，６，１０３，１，１００，７，９１１，８゜１Ｂ、７４．　７Ｂ、７１． 　フ７．０．　７５．０．　７４．６．　７コ、ａ、７１１．２．　７Ｌ、０． 　６９．９゜６１ｉ１．６．　６ｇ、２．　６４．１．　６Ｌ日、　６Ｌ、５． 　５コ、１．　５２．６．　５１．６．　４０．工、　コ５．０゜］Ｌ６．　２ ７＋１．、　２２．９．　Ｌコ＋Ｏ，Ｌ２．９゜Ｍ）０Ｍ３−ラクタム−ＢＳＡ −コンジュゲート（１８）化合物１７（２２ｍｇ、２８．９マイクロモル）及び 水和ヒドラジン（８５％、０．２５ｍ１）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、そ の混合物を一夜室温で攪拌し、濃縮した。残渣を水に溶解し、凍結乾燥した。得 られたヒドラジンをジメチルスルホキシド（０，５ｍ１）中に溶解し、ジメチル スルホキシド（５０μｍ）中の亜硝酸第３級ブチル（９μｍ、７５マイクロモル ）の溶液を添加し、続いて、ジオキサン中の塩酸（４Ｍ。

５３μｍ）を加えた。混合物を室温で３０分撹拌′し、ジメチルスルホキッド（ ５０μｍ）中のスルファニル酸（５ｍｇ、５５マイクロモル）の溶液を加えた。

１５分後、混合物に攪拌下で四ホウ素酸ナトリウムー炭酸水素カリウム緩衝液（ １ｍｌ、０゜０８ＭのＮ　ａ　２　Ｂ　＋　Ｏ？及び０．３５ＭのＫＨＣＯ，） 中の牛の血清アルブミン（２７ｍｇ、０．４１マイクロモル）の溶液を滴下によ り加えた。ｐＨを水酸化ナトリウム（ＩＭ）の添加によって８５〜９５に維持し た。混合物を４〜１５°Ｃで１時間及び室温で一夜攪拌し、次いで４ｄ用の蒸留 水で透析し、凍結乾燥し、１８（３３ｍｇ）を得た。結合の度合い（１８のモル 数／ＢＳＡのモル数）は硫黄燃焼分析により２１であった。

実施例２ ＴＭＳＥｔ　ＧＭ、−ラクタム（２２）の製造Ａ）化合物１９ エタノール（６０ｍｌ）中の化合物ＩＩ　（Ｉｇ、０．７６８ミリモル）を０° ＣまてのＮ１ＣＩｚ・６ＨｔＯ（３，４２ｇ。

１４、ミリモル）で冷却し、エタノール（６０ｍｌ）中のＨ。

ＢＣｈ　（１，７２ｇ、２７．　８ミリモル）を攪拌しながら１５分かけて滴下 した。攪拌と冷却を更に１５分続けた。反応混合物を乾燥状態まで濃縮し、ＣＨ ｔＣ１＊　（〜１５０ｒｎｌ）に溶解し、Ｎ　ａ　ＨＣＯｒの飽和溶液と水でそ れぞれ洗浄した。有機層を乾燥しくＮ　ａ　！Ｓ　Ｏ４）　、乾燥状態にまで蒸 留した。残渣をピリジン（２０ｍｌ）中に溶解し、８５°Ｃで４８時間攪拌した 。蒸留及びトルエン（ｌｏｍｌｘ３）と共沸蒸留し、続いて１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ Ｃ１３）　６’　５．６３　、（１，ＬＨ，）ｌ−４”）、５．：エコ　（ｄ、 ＬＨ，Ｊ　ｓ　１０．２Ｈｚ、　ＡｃＮＨｌ、　５．２７　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　 −２，２０，５，８６Ｈｌ、　Ｈ−７）　、５．１６　（ｍ。

ＬＨ，Ｈ−６”）、４．４８　（ｄ、ＩＨ，Ｊ　−８，０５Ｈｚ、Ｈ４）、４． ３７　（ｄ、ＩＨ，ｊ　−ａｊＱ　Ｋｚ、　Ｈ−Ｌ）、　２．６７　（ｄ、　Ｌ Ｈ，Ｊ　−２，２１（ｚ、　Ｏ）り、　２．４９　（ｄｄ、　ＬＨ。

Ｊ−５，６４，１１１Ｈｚ、Ｈ−３”ｅｑ）、２．１６，２．０コ、２．０２． Ｌ、９６，１８８（５ｓ、　４０Ａｃ　ａｎｄ　ＩＩ（Ａｃ）　、　ＬＪ５　（ ｄｄ、　１Ｍ、　Ｊ　＃　１．ＬＬ　１２．９１（ｚ。

Ｈ−コ”ａＸｌ、１２６　（Ｉｌｌ、２Ｈ，Ｃ７（２Ｓｌｌ、０．０５　（Ｓ、 ９Ｈ，ＳｉＭａ３１゜Ｂ）メチル−３，４，６−１−クー０−アセチル−２−デ オキシ−２−フタルイミド−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシドメチル−３ ，４，６−１−クー０−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド’−１−チ オ−β−Ｄ−ガラクトース（６８０ｍｇ、１．４２５ミリモル）、メチルチオト リメチルシラン（０，８ｍ１．５．６４ミリモル）及びＣＨ，Ｃ１，中のトリメ チルシリルトリフレートの混合物を室温で２日攪拌した。ジイソプロピルアミン （１ｍｌまで）を加え、ＣＨ＊Ｃ１＊（５０ｍｌまで）で希釈し、ＮａＨＣＯ， の飽和溶液と水でそれぞれ洗浄した。有機層を乾燥しくＮａ２ＳＯ２）　、乾燥 状態まで蒸留した。カラムクロマトグラフィー（トルエン−ＥｔＯＡする非晶質 の粉末として純粋な２ｏを得た（６３０ｍｇ、９５％）。

ＩＨ−ドＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　６　フ、８フーフ、７４　（ｍ、４１ ．　ａｒｏｍａｔｉｃｌ、ｓ、ａ）Ｈｚ、Ｈ−２＋、４．２５−４．１０　（町 　コＨ，Ｈ−６，Ｈ−５）、２．２０　（１，コＨ，５ＣＨ３）。

２．１９．　２−０５．　Ｌ、ａ５　（１ｇ、９８．　３０人Ｃ１゜Ｃ）化合物 ２１ ＣＨ＊ＣＩＩ−ＣＨ３ＣＮ　（２：　１，３ｍ１）中の化合物１９　（２００ｍ ｇ、０．１６１ミリモル）、化合物２０　（１５０ｍｇ、０．３２２ミリモル） 及び３人の分子篩（０，１ｇ）を窒素雰囲気下で１時間撹拌した。トリフレート 銀（０，０８４ｇ、０．３２７ミリモル）を添加し、窒素雰囲気下でフラッシュ させ、−７８℃に冷却した。メチルスルフェニルブロマイド（ｌ、２−ジクロロ エタ”、ｔｏ、０９ｍ１中、０．０４１ｇ。

０．３２２ミリモル）を４部に分けて注入した。温度を一２８°Ｃに上げて、混 合物を３時間攪拌した。ジイソプロピルアミン（０，２ｍ１）を加え、３０分攪 拌した。混合物をセライトを通して濾過し、ＣＨ，Ｃ１，（５０ｍｌ）で希釈し 、ＮａＨＣ・　０．の飽和溶液と水でそれぞれ洗浄した。有機層を乾燥しくＮａ ｔＳ０４）、乾燥状態まで蒸留した。カラムクロマトグラフィー（トルエン−Ｅ ｔＯＨ４０：１→３０：１）＋、：より［＜２３　ｏ　”−１８°　（ｃ　１． ０．７．ＣＨＣＩｓ）を育する粉末として２１を得た（１３７ｍｇ、５１％）。

１１ｆ−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３）　Ｊ　７．８−７．２　（！ＩＩ、　 ａｒｏｍａｔｉｃ）、　５．８１　（ｄ、　１ＨｔＪ　館８．４　Ｈｌ、Ｈ−１ ”’）、５．５３　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊｍ〕、２，１２．４　Ｍ！、Ｈ−３”＃） 。

５．４１　（ｍ、ＬＨ，！（−４”）、５．コロ　（ｂｄ、Ｊｍ２．７　８！、 ）ｉ−４”’）、５．３１　（ｍ。

２Ｍ、）ｉ−７″、ＩＩ”ｌ、５．１９　（ｄ、ＬＭ、、７−１０．３　Ｈｚ、 ＮＭ）、４．５６　（ｄｄ、ＬＨ。

Ｊ　ｗ　８．４．　１１．５　Ｈｚ、、Ｈ−２”勺、コ、０）　（ｄｄ、ＬＨ， Ｊ　＃　５．７．　９．１　Ｈｚ。

Ｈ−３″・ｑ）、２．１ａ−ｔ、＋ｎ　（７Ｓ、２４Ｈ，７０Ａｅ　ａｎｄ　Ｎ ＲＡ（：）、１．ｏｏ　（Ｉｌｌ、２Ｍ。

ＣＨ２５ｉ）、０．０２　（Ｌ　９Ｈ，、ＳｉＭｅｌ）。

Ｄ）ＴＭＳＥ　ｔ　ＧＭｔ−ラクタム（２２）氷酢酸（３ｍｌ）中の化合物２１ 　（９０ｍｇ、０．０５４ミリモル）及び１０％Ｐｄ−Ｃ（５０ｍｇ）を室温で 一夜水素下で攪拌し、セライトを通して濾過し、蒸留した。残渣を２０ｍ１　（ エタノール）で希釈し、蒸留及びエタノール（５ＸｌＯｍｌ）で共蒸留した後、 エタノール（３ｍｌ）に溶解し、ヒドラジン水和物（０，３ｍ１）を加え８５℃ で１時間２０分攪拌した。残渣をピリジン／Ａｃ＊Ｏ（１：ｌ、３ｍ１）中で１ 時間室温で攪拌し、次いで蒸留及びトルエン（５ｇ５ｍｌ）で共蒸留した。脱ア セチル化をメタノール性ＮａＯＭｅ　（０，０５Ｍ。

２ｍ１）を用いて２時間室温で行った。次いで混合物をジュライト上３樹脂を用 いて脱陽イオン化し、濾過し、蒸留した。残渣を、カラムクＣｌ？トゲラフイー 　（ＣＨＣＩｓ−ＭｅＯＨ−ＨｓＯ，１０：５：１）により［α］。′鵞−２９ ’（旦１．０゜（ｔ、ＬＨ，Ｊ　−８＋５　Ｈｌ、Ｈ−２）、２．６コ　（ｄｄ 、１１．　Ｊ　ｍ　５．９５．　１４．９　Ｈｌ。

Ｈ−３″！ｑ３．　２．１２　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−５，Ｌコ、１４．９　Ｈｌ 、Ｈ−３１１１１Ｘ）、２．０コ。

２．０２　＋２５！、６Ｍ、２ＮにＡｃｌ、ｏ、ｓ９　（ｍ、２Ｈ，ＣＨ２５ｉ ｌ、０．００　（ｊ　コＨ２Ｓ１Ｍ＊コ）。

実施例３ ＴＭＳＥｔ　ＧＭ、−ラクタム（２９）の製造Ａ）２−　（）リメチルシリル） エチル−３，４，６−）リー〇−アセチルー２−アンド−２−デオキシ−β−Ｄ −ガラクトピーアセチルー２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトビ　。

ラノンルブロマイド（６ｇ、１５．２ミリモル）、２−（トリメチルシリル）− エタノール（２，７ｇ、２２．８ミリモル）及び４人の粉末状分子篩（１４，６ ｇ）を窒素雰囲気下で１時間攪拌した。珪酸銀（３６９）を加えた。２０分攪拌 した後、反応混合物をセライトを通して濾過し、乾燥させるために濾過物を蒸留 した。残渣のカラムクロマトグラフィー（ヘプタン−ＥｔＯＡｃ　３　：　１） により［αコＤ”−１８°　（Ｃ１，Ｉ。

ＣＨＣｌ５）を育するシロップ状の２３を得た（５．．１１ｇ。

７８％）。

１Ｈ−ＮＨＲｄａｔａ　（ＣＤＣＬ：ｌ）　６　５．３２　（ｂｄ、１１４．　 Ｈ−４１，４：）７　（ｄｄ、ＬＨ，、ｒ　−］、コ、１０．９　Ｈｚ、Ｈ−３ ）、４．コツ　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−８，０Ｈｚ、Ｉ（−１１，４，２２−コ、９ ８　（ｍ、コＨ，Ｈ−６，０ＣＨ２）、コ＋１１５　（ｍ、ＬＨ，Ｈ−５）、３ ．フＯ−３，６１（Ｉｎ。

２Ｊ　Ｈ−２，０ＣＨ２）、２．１５−２．０４　（コｓ、９８．　コ０Ａｃｌ 、１．０６　（ｍ、２Ｍ。

ＣＨ２５１）、０．０４　（ｓ、　９１（、５ｉ３４１１））。

Ｂ）２−　（）リメチルシ・リル）エチル−２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ −ガラクトピラノシド（２４）化合物２３　（４，８８ｇ、１１．３ミリモル） を９０分、メタノール性ＮａＯＭｅ　（０，０４Ｍ、５０ｍ１）中で攪拌した。

混合物をアンバーライトＴＲ−１２０（Ｈ”）樹脂で脱陽イオン化し、濾過し、 ’　［ａ］　ｏ　”＋８．５°　（ｃｏ、８．ＭｅＯＨ）、融点１５８〜１６ビ ｃ（エーテル−ヘプタ：／）１７）２４（３゜２４ｇ、９４％）を得るために乾 燥状態まで蒸留した。

ＩＨ−ド！’ＯＬ　ｄａｔａ　（ＣＤ３０口）　６　４．２９−４．２６　（ｍ 、ＬＨ，Ｈ−１）、４．１０−４．０１　（ｍ。

ＬＨ，０ＣＨ２）、コ、９９　（ｄｄ、ｉ１４，１．Ｌ　２．６　Ｈｚ、Ｈ−４ １，３，７コ　（ｍ、２Ｍ。

ト２．コ）、　３．６５　（ｍ、ＬＨ，０Ｏｆ２）、３．４６　（ｍｅ　１ｕ、 Ｈ−５Ｌ　コ、４コ　（ｍ、２８゜８６）、Ｌ、ＯＯ（ｍ、２Ｈ，ＣＨ２５１１ ，０，０５（５，９Ｍ、５１Ｍｌ１１）。

Ｃ）２−　（１−リメチルシリル）エチル−２−アジド−２−デオ牛シー３，４ −イソプロピリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２５） ２．２−ジメトキシプロパン（１５ｍｌ）中の化合物２４（１，０ｇ、３．２７ ミリモル）を２４時間、触媒量（１０ｍｇ以下）のｐ−）ルエンスルホン酸の存 在中で攪拌した。トリエチルアミン（０，５ｍｌまで）を加え、ＥｔｓＮの痕跡 を除くために蒸留とトルエン（２ｘｉＯｍ＋Ｉ）との共沸蒸留した。

カラムクロマトグラフィー（ヘプタン−ＥｔＯＡｃ　２：１０．１％のＥｔりＮ を含む）により［α］。”＋４０．４゜”！４−）１’ＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ １３）　６　４．２４　（ｄ、ＬＨ，Ｊ　−８，５１Ｈｚ、）ｉ−１）、４．１ ０（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−２，０，５，４Ｈｚ、Ｈ−４１４，０４−３−８１（ｍ 、６Ｈ）、３．６２　（ｍ＋ＬＨ，０ＣＨ２ＣＨ２）、］−１８（ｔ、　ＬＨ， Ｈ−２）、２．０７　（ｄｄ、ＬＨ，ＯＨＩ、Ｃ５４゜Ｌ、：１４　（２ｓ、６ ）１．　ＣＭ！２１．　１．０５　（ｒａ、２Ｈ，ＣＨ２５ｉ）、０．０４　（ Ｓ、９Ｍ。

ＳＬＭＩり）。

Ｄ）２−０リメチルシリル）エチル−２−アジド−２−〇−ベンゾイルー２−デ オキシー３，４−イソプロピリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２６） ベンゾイルクロライド（０，４ｇ、３．２９ミリモル）をＯｏＣでピリジン（Ｉ Ｏｍｌ）中の２５　（０，８７ｇ、２．５３ミリモル）の溶液に加えた。混合物 をＣＨ，Ｃ１，（５０ｍｌ）で希釈し、Ｎ　ａ　ＨＣＯｓの飽和溶液と水でそれ ぞれ洗浄した。

有機層を乾燥させ（ＮａｘＣＯ−）　、蒸留した。残渣のカラムクロマトグラフ ィー（ヘプタン−ＥｔＯＡｃ）により［αコ。

り５＋６１　（旦０．９．ＣＨＣｌ３）の２６を得た（１．１２ｇ１９８％）。

１Ｈ−）ｆＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣ１３１６８，０６−７，５７（ｍ、　５Ｈ， ａｒａｍａｔｉｃｌ　、　４−２５　（ｄ。

ＬＨ，Ｊ　＝　Ｌ５　Ｈｚ、　Ｈ−１１，４，１７（ｄｄ、　Ｌ）Ｌ、　、、７ −２．２．５．コ）ｌｚ、　Ｈ−４）。

１．４２　（ｔ、ＬＨ，Ｈ−２）、１．５７．　Ｌ、コロ　（２ｇ、６Ｈ，ＣＭ ＠２）、Ｌ、０４　（ｍ、２Ｈ。

Ｃ）！２５１１．　−０．０１　（ｓ、　９Ｍ、ＳＬＭｅコｌ。

Ｅ）２−（トリメチルシリル）エチル−２−アジド−６−〇−ベンゾイルー２〜 デオキシーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（２８０％（７）酢酸水中の化合物２６ 　（１，０７ｇ、２．３７ミリモル）を９０″Ｃて２時間攪拌した。混合物を濃 縮し、［α］Ｉ。

”＋３７．８°　（ｃ　１．　ＣＨＣＩ　＋）　（’）２６を得ルタメニ（０８ ｇ、８３％）、残渣をクロマトグラフ処理したくヘプタン−ＥｔＯＡｃ　２　： 　ｌ）。

ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクトー２−ノヌルビアジドー２−デオ キソ−６−０−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２８） ＣＨ，ＣＩ、−ＣＨ，ＣＮ　（２＋　３．４０ｍ１）中の化合物１７　（０，５ ｇ、１．２２ミリモル）、化合物１０　（０，９ｇ。

１．５１ミリモル）及び粉末の分子篩（３人、１．５ｇ）を１時間室温でＮ、下 で攪拌した。トリフレート銀（０，４１ｇ。

１．６１ミリモル）を加え、混合物を一７８℃に冷却した。ｌ。

２−ジクロロエタン（０，３７ｍ１）中のメチルスルフェニルプロミド（０，１ ９ｇ、１．４７ミリモル）を３部に分けて加え、攪拌を３時間３０分、７８°Ｃ で続けた。ジイソプロピルアミン（０，２７ｍ１）を加え、３０分、７８℃で攪 拌した。通常の仕上げ（仕上げ工程は化合物！■の製造の欄を見よ）を行った後 に、残渣をアセチル化（ピリジン／Ａｃ＊Ｏｌ　：　ｌ。

２０ｍ１，２時間）された混合物を得るためにクロマトグラフ処理（ＭＴＢＥ− Ｅｔａ）（２０：　１）した。溶媒を除去し、［α］　ｏ　”−４５°　（ｃ　 １．　ＣＨＣＩｓ）の粉末の２８を得るために（６６１ｍｇ、５８％）、残渣を クロマトグラフ処理した　（ＥｔＯＡｃ−１ルエン　１　：　ｌ→８　・　１） 。

１）！−ＮＭＲｄａｔａ　（ＣＤＣＩＩｌ　６８．０２−７．４２　（ｍ、　５ Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ）、　５．６Ｌ　（ｍ。

Ｌ）Ｉ、Ｈ−８１）、５．２５　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−Ｌり、９．３　Ｈｚ、Ｈ −７’）、５．０６　（ｄ。

ＩＨ，Ｊ　−９，９６Ｈｚ、　Ｎ）ＬＡｃｌ、　４．９９　（ｍ、　２！（、Ｈ −４，Ｈ−４’）、　４．６２　（ｄｄ。

ＩＪｉ、Ｊ　＝　３．４．　ｉｏ、ｉ　Ｈｚ、Ｈ−３）、４．４１　（ｍ、ＩＭ 、＋（−６ａ）、４．３７　（ｄ。

ＬＨ，Ｊ　−ＬＩ　Ｈｚ、）（−１）、４．コｌ　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ　−２，５ ，１２，７Ｈｚ。

Ｈ−９’ａ）、４．２４　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−６，２，エエ、コ　Ｈｚ、Ｈ− ６ｂ）、４．１０　（ｄｄ。

３−Ｈ，Ｊ　−４，８，１２，７Ｈｚ、Ｈ−９’ｂｌ、コ、９９　（ｍ、コＨ１ ，３，８０（ｓ、コＨ。

ＯＣＲコ）、３．６２　（ｍ、２）ｆ）、２．６４　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−４， ６，１２，５Ｈｚ。

Ｈ−４’ｅｑ）、２．１３−２．０４　（５ｇ、１５　Ｈ，５０Ａｃｌ、１９４ 　（ｍ、ＬＨ，！（−３’ａｘｌ。

Ｌ、ＢＢ　（ｓ、　３１（、覗Ｃ１，１，０８（ｍ、　２Ｈ，ＣＨ２５ｉｌ、　 ０．００　（Ｊ　９Ｋ。

５１Ｍ５コ）。

Ｇ）ＴＭＳＥ　ｔ　ＧＭ、−ラクタム（２９）エタノール（１２ｍｌ）中のＮａ ＢＨ＋　（２０４ｍｇ、５゜４ミリモル）を滴下し、エタノール（５ｍｌ）中の 化合物２８（５０ｍｇ、０．０５３４ミリモル）、ＮｉＣ１１・６Ｈ！　０（４ ００ｍｇ、１．６８ミリモル）　、Ｈ，ＢＯｓ　（１２０ｍｇ、ｌ　Ｏミリモル ）の溶液を、０°Ｃ１４時間攪拌した。その混合物を、その後蒸発させ、残渣を ＣＨ，Ｃ１２（６９ｍｌ）で採取し、次いて炭酸水素ナトリウムの飽和溶液及び 水で、それぞれ洗浄した。残渣は、ＡｃＯＨで中和されたメタノール性ＮａＯＭ ｅ　（０，０５Ｍ、５ｍ１）中で、２時間攪拌し、蒸発させた。残渣をＳｉｎ、 （ＣＨ，ＣＬ　−ＭｅＯＨｌ　：　Ｉ／　（ＣＨ２Ｃ］　２　Ｍｅ　ＯＨ１：　 １）を通して濾過した。ろ液を蒸発させ、ピリジン（２ｍｌ）、）リエチルアミ ン（２ｍ　ｌ）及び４−ジメチルアミノビリジン（６ｍｇ）とともに、２日間、 室温で攪拌した。溶媒を蒸発により除去し、残渣をクロマトグラフィーに付して （ＣＨ，Ｃｌ、−ＭｅＯＨ６：　ｌ）　、白色粉末として２９　（１８ｍｇ、６ １％）を得た。（α）　ａ　”　１３゜４°　（ｃｌ、Ｈｓ○）。

１Ｈ−ＮＩＧｄａセａ　（Ｃ２０１＆　４．５７　（ｄ、ＬＨ，，７−８，２Ｈ ２，Ｈ−１］、４．コ２　（町ＬＨ，Ｈ−４’）、　４．０６　（＋！ｌ、　Ｌ Ｈ，０ＣＨ２ＣＨ２）、　４．０２　（ｂｄ、１’ｋｌ、　Ｈ−４１，１９６（ ｄｄ、Ｌ）Ｉ、Ｊ　−２，６，１０ニア　Ｈｚ、Ｈ−３）、　３．８７　（ｔ、 ＬＨ，Ｊ　−１０，コ　Ｈｌ。

Ｈ−５）、２．５５　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　−５，４，ｉｏ、２　Ｈｚ、Ｈ−３’ ＠Ｑ）Ｉ　２．Ｏｌ　（１，コＨ１ＮＨＡＣ）、１．６６　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ　 −１１５，１２，９Ｈｚ、Ｈ−３”×Ｌ　Ｌ、０２　（ｒａ。

２Ｈ，ＣＡ２５ｉｌ、ｏ、ｏｏ　（ｓ、９Ｍ、５１Ｍ１１３）。

実施例４ 配座研究 まず、研究を、０Ｍ３−ラクトン、つまり天然に存在するＧＭ、ガングリオシド のラクトンの立体配座構造で行った。驚くことに、ＣＭ！−ラクトンは、ラクト ン環がボート型配座（以下の図１参照）として存在する２つの構造によってよく 示され、上記に引用したＹｕらによって示唆された構造に反するものであったこ とを見出した。

ラクトン環のボート型配座の証拠は、２つの観察に基づ（もＭＲシグナルは、親 ＧＭ、−ガングリオシドに比較して〜０゜６ｐｐｍまでダウンフィールドにシフ トした。このような強力な脱遮蔽効果は、問題になっている水素原子と酸素原子 との間隔が近接している（Ｈ，、、Ｏ−間隔〈２．７人）しるしである（　Ｂｏ ｏｋ、に、：　Ｋｉｈｌｂｅｒｇ、　Ｊ、；　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｇ、　Ｃ ａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ。

１９９８、１７６２５３）。２つのボート型配座（図１）において、シアリン酸 残基のＨ−４とカルボニル酸素との間隔は、〜２．５人であり、一方、この間隔 は、いす型配座におけるよりもかなり長い（〜３．０人）。

ｉｉ）　ＣＭ！−ラクトンとの分子機構計算（Ｕ、　ＢｕｒｋｅｒｔとＮ、　Ｌ 。

ＡＩｌＡｌｌｌｎ　Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ 、Ｓｏｃ、ＵＳＡ、１９８２参照）は、ボート型配座かいす型配座よりもかなり 安定であることを示している。このように、後者が予測における原料配座として 用いられているときでさえ、ボート型配座が、エネルギー最小化後に得られる。

分子構造及びエネルギー最小化計算が、誘電率８０にセットしたＭａｃＭｉｍｉ ｃ／ＭＭ２（９１）ソフトウェア・パッケージ（インスター・ソフトウェア、イ ブオン・リサーチ・パーク、５７２２３７０　Ｌｕｎｄ。

スウェーデン）を用いてアップル・マツキントラシュ・パーソナル・コンピュー タにおいてなされた。

対応ラクタムの同様の計算（化合物１８として実施例１において製造された牛型 血清了ルブミンコンジュゲート）も、ボート型配座であった。さらに、メチルグ リコシドに対応する環元素の全てを用いたＧｋｈ−ラクトン及びＧＭｓ−ラクタ ムの低エネルギーボート型配座のスーパーインポジション及びＲＭＦ−フィッテ ィング（上記記載のソフトウェアによって）は、０゜０９７人と同じくらい低い ＲＭＳエラーと全形が非常に類似しているそれらを示した。この関係は、図１が 、ＧＭ、−ラクトンメチルグリコシドのエネルギー最小化構造を示し、図２が、 ＧＭｓ−ラクタムメチルグリコシドのエネルギー最小化構造を示している図面に 表されている。図３は、図１及び２の重ね図であり、明確に、一方において天然 であるが加水分解に不安定なガングリオシドラクトンと、他方において、２つの 化合物が潜在的に同じ生物学的活性を強力に発揮しうることを示す本発明による 合成の、加水分解に安定なガングリオシドラクタムとの構造の非常に近接した類 似性を示す。たとえば、牛の血清アルブミン（実施例１の化合物１８）にカップ リングしたＧＭ！−ラクタムは、ＧＭｓ−ラクトン抗原（上記に引用した１ｏｒ ｅｓら参照）のそれに類似した免疫応答を誘発し、抗体は、各抗原と相互作用す る。これらラクトンは、生体内における加水分解に対して安定であるべきであり 、従って抗原の高濃度を維持する。

実施例５ 免疫の研究 原料及び方法 モノクロナール抗体の確立 ケエラー（Ｋｏｈｌ、ｅｒ）の方法に従った（　［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、 　Ｋ　（１９８１）、　２８５−２９８頁）。ＧＭ、−ラクタム−ＢＳＡコンジ ュゲート（１８，５０μｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７゜２．５ ００μｌ’）中に溶解し、５００μｌのフロイントのコンブリードアツユバンド （ＦＣＡ、シグマ化学社製、アメリカ国、ミズーリー州、セントルイス所在）と 混合し、Ｂａｆｂ／ｃマウスの皮下（Ｓ、Ｃ，）に注射した。免疫処理を、さら にフロイントのインコンブリードアシュバンド（ＦＩＡ）を抗原として使用して 、１週間の間隔で３回（Ｓ、Ｃ，）繰り返した。２０日後、マウスに促進薬量（ ＰＢＳの１００μｌ中、１８を５０μｇ）の最終静脈注射（ｉ、ｖ、　）を行い 、７日後膵臓を摘出した。膵臓細胞を１４の比で５ｐ２１０骨髄腫単位で融合さ せ、ハイブリトーマをＥＬＩＳＡ（以下に示す）において、被覆されたＧＭ、− ラクタム−ＢＳＡ（１Ｂ、３μｇ／ｍｉ’）と共に反応性を調査した。１８の内 部に対応する合成グルコース−誘導ＢＳＡコンジュゲート（４０、上記１Ｂの製 造方法と類似の方法でグルコース５酢酸塩から製造される）とＢＳＡを陰性の対 照として使用した。陽性ウェルから細胞を引き延ばし、再クローン化したａ　３ ００以上のモノクロナールハイブリドーマが確立された。８つのハイブリドーマ を任意に選び、それらの特異性を調査した。

ハイブリドーマ細胞系を、５％ウソ胎児血清、１ｏｏＩＵ／ｒｎｌペニシリン及 び１．５０希釈のヒボキサンヂンーチミジン（Ｈ，Ｔ、　）が添加されたＲＰＭ ＩＩ６４０培地において保持した。全ての組織培養培地及び添加物は、Ｇｉｂｃ ｏ　Ｌｔｄ、、ベーズリー、スコツトランドからのものであった。

ネオグリコプロティン及び糖脂質への結合による特異性テスト（表１） ＧＭ、−ラクタム−ＢＳＡ　（１８）、　Ｇｊ７ｕ−ＢＡＳ　（４０）　、ＢＳ Ａ、ＧＭ、−ガングリオシド（４１；　Ｂｉｏｃａｒｂ、　Ｌｕｎｄ、　Ｓｗｅ ｄｅｎから得た）及び０Ｍ２−ガングリオシドラクトン（４２）　（Ｙｕ、　Ｒ ，Ｋ、、　Ｋｏｅｒｎｅｒ、　Ｔ、Ａ、Ｗ、、　Ａｎｄｏ、　Ｓ、、　Ｙｏｈｅ 、　Ｈ。

Ｃ１及びＰｒｅｓｔｅｇａａｒｄ、　Ｊ、Ｈ，（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　９８．１３６７−１３７３）を、Ｎｏｒｅｄら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　１３９　（１９８７）、　３１７１−３１７６）により述べられた方法を用い てマイクロタイタープレートに被覆した。

全ての化合物を３μｇ　／　ｍ　１の濃度で用いた。抗体（上澄み液の１００μ Ｉりを、被覆された各ウェルに加え、結合抗体の量を以下に述べるＥＬＩＳＡに おいて検出した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング ＥＬＩＳＡは、まずネオグリコプロティン１Ｂ及び４０、ＢＳＡ　（ｐＨ９，６ ，１００ｍｌの炭酸水素ナトリウム緩衝液中３μｇ　／　ｍ　ｉ’　）ならびに ガングリオシド４１及び４２をＥＬＩＳＡフィクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、　 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）に固定することによってなされた。プ レートは、２１°Ｃ１腐食雰囲気（ネオグリコプロティンプレート）中、又は換 気フード（ガングリオシド）で−夜装置され、３０分間、ＢＡＳ溶液（ＰＢＳ緩 衝液中１％、２００μｌ／ウエル）でブロックした。プレートを３Ｘ２００μｌ の洗浄緩衝液（ＰＢＡ−０，０５％トウウィーン２０）で洗浄した。ハイブリド ーマ上澄み液（１００μｌ）を各ウェルに加え、プレートを２時間、２ピＣにて インキュベートし、３×２００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。０゜１％ＢＳＡを 含存するＰＢＳ中のウサギ抗−マウスー１ｇ／アルカリホスホターゼーコンジュ ゲート（Ｄａｋｏ　Ａ／Ｓ、　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ。

Ｄｅｎｍａｒｋ）を各ウェルに加え、プレートを１時間、２ビＣにてインキュベ ートし、上記のように洗浄した。ホスホターゼ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフ ェート、５ｍｇ、タブレット、ＳＩｇｍａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、セントル イス、ミズーリー州、アメリカ）を１０ｍ／基質緩衝液（ｐＨ９，８，１０００ ｍｌの用量の水に溶解した０、９７ｍｌ１ジエタノールアミン及びＩ　０１ｍｇ ＭｇＣ１，・６ＨｔＯ）に溶解し、ウェル（２００μｌ／ウエル）に加えた。プ レートを３０分間、３７°Ｃでインキュベートし、光学密度（ＯＤ）をタイター チック・マルチスキャン・ホトメータ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ　Ｉ、ｔｄ、、　Ａ ｙｓｈｉｒｅ、スコツトランド）にて、４０５１ｍで測定した。免疫及び前免疫 のＢａ１ｂ／ｃマウスからの血清を、それぞれ陽性及び陰性コントロールとして 用いた。

阻害による特異性テスト（図４） 以下の２−（トリメチルシリル）エチルグリコシドを阻害試験において用いた　 ＧＭ、−ＴＭＳＥ　ｔ　（４３）　、ＧＭ、−ラクタム−ＴＭＳＥ　ｔ　（＋　 ２）、ＧＭ、−ラクタム−ＴＭＳＥｔ（２２）　、ＧＭ、−ラクタム−ＴＭＳＥ 　ｔ　（２９）、Ｇｂ、−ＴＭＳ　Ｅ　ｔ　（４４）　（Ｋｉｈｌｂｅｒｇ、Ｊ 、、）ｌｕｌｔｇｒｅｎ、　’Ｓ、Ｊ、、　Ｎｏｒｒｎｒｋ、　Ｓ、　及びＭａ ｇｎｕｓｓｏｔｉ、　Ｇ、　（１９８９）　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ 、　１１１．６３６４−６３６８）及び７２７口（ａｓｉａｌｏ）　−ＧＭ＊　 −ＴＭＳＥ　ｔ　（４５）ならびにアシアロ（ａｓｉａｌｏ）　−ＧＭ＋　−Ｔ ＭＳＥ　ｔ　（４６）（Ｒａ、ｙ、　Ａ、　Ｋ、及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｇ 、　（１９９２）　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、　４６、　４８７−４ ９１） ４５　７：／７０−ＧＭ、−ＴＭＳＥｔ４４　（＆−ＴＭＳＥｔ ４６　アシアロ−ＧＭ、　−ＴＭｓａｔ各配糖体を、０．　１％ＢＳＡとともに ＰＢＳ緩衝液に溶解し、連続的に、試験管中でＰＢＳ緩衝液の５倍用量で希釈し た。各サツカライド溶液の一部（１６０μりを・、抗体溶液の一部（上澄み液の １６０μりに加え、プレートを一夜、４°Ｃにてインキュベートし、ＥＬＩＳＡ （図４）においてテストした。

モノクロナール抗体のアイソタイプ ハイブリドーマの１ｇクラス及びサブクラステストを、市販のディップ−スティ ックキット（）ｌｏｌｌａｎｄ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ＡｊＬｅｉｄ ｅｎ、　Ｔｈｅ　Ｎｅ１ｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で行った。

結果及び考察 ＧＭ、−ラクタム−ＢＳＡ（１Ｂ）でのマウスの免疫、続いてハイブリドーマの 確立及び大きい数の抗原−特異クローン（＞　３００）を発見した。これらクロ ーンの大部分は、抗原のシアリル−ラクタム−ガラクトースプロティンを認識し た。Ｇｌｃ−ＢＳＡ構造（４０）又はＢＳＡを認識するクローンは、さらに処理 しなかった。一般のガングリオシドの低免疫性を考慮すると、その高い”非自己 “構造及び免疫性を示す、ＧＭ、−ラクタムへの高いＩｇＧ反応を示したことは 特に興味あるものである。

８つの任意に選択されたハイブリドーマがＩｇＧ、にクラス（表１）に属するこ とが見出された抗体を製造する。それらはすべて、マイクロタイタープレートに 被覆された抗原ＧＭｓ−ラクタム−ＢＳＡ　（１８）を認識するが、Ｂ　Ｓ　Ａ ＳＧｌｃ−Ｂ　Ｓ　Ａ（４０）又はＧＭｓ−ガングリオシドラクトン（４２）に 結合せず、よって、免疫のためにサツカライドアナピグ（１８）を用いること及 び天然の対応物を認識する抗体を得ることに反対する理由を満たす。

表１ 結合特異性及びＧｔｖｈ−ラクタム−ＢＳＡ（１８）との免疫によって得られた ８つの任意に選択したモノクロナール抗体イのサブクラス 抗体　１１　４２　４１　４０　８ＳＡ　サブクラスＰ２−０１０−８４−１４ ９（？２−１）＋＋＋ａ　−ｃ　−−−１９Ｇ２ｂ、ｇＰ２−ＥＬ２−Ｃ９−Ｆ ９　（Ｐ２−２）　中→　−−−−工ｑＧ２ｂ、ｇＰココ−ｌ２−Ｈ４−Ｆコ　 （Ｐコ）　÷＋＋−−−工９Ｇ２ｂ、ｇＰ５−ＦＬ２−Ｈ４−０４（シ５−２） ÷→　−−−−工ｑＧ１．にＰ５−Ｆ１２−Ｇ５−Ｈ６（２５−３）→　＋’ｓ 　−−−ＸｑＧｌ、ｇａ　＋＋＋：強力な結合、４０５μｍで、〉１．５とよむ ＥＬＩＳＡ光学密度、 ｂ　＋＋：緩和な結合、４０５μｍで、〜ｌとよむＥＬ　Ｉ　ＳＡ光学密度、 ｃ　−二結合なし ハイブリドーマＰ３．Ｐ５−１及びＰ５−３を、ブタペスト条約の規定に従って 、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒ ｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｎｉｍａｌＣｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅｓ）　、パブリック・ヘルス・ラボラトリ−・サービス（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈ ｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ）、センター°フォー・ア プライド・マイクロバイオロジー・アンド・リサーチ（ボートン・ダウン、イギ リス）　（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）に、それぞれ承認番号９２０６２５９１ ．９２０６２５９２及び９２０６２５９３で１９９２年６月２５日に寄託した。

上記に示した３種の寄託されたハイブリドーマによって生産される、抗体をもた らす抗原（１８）に対する抗体の結合を阻害する種々の化合物の能力を、阻害剤 の濃度の関数として試験した。図４Ａは、Ｉ　２　（０）、２２（ロ）、２９（ ・）及び４３．４４．４５及び４６（Ｘ）の濃度の関数として、抗体Ｐ３の阻害 曲線を示す。図４Ｂは、１２（○）、２９　（ロ）及び４３．２２．４４．４５ 及び４６（・）の濃度の関数として、抗体Ｐ５−１の阻害曲線を示す。図４Ｃは 、１２（０）、２９（ロ）及び４３．２２．４４．４５及び４６（・）の濃度の 関数として、抗体Ｐ５−３の阻害曲線を示す。図４Ｄは、溶解した形態における 抗原の、溶解した抗原の濃度の関数としてテストプレート上で免疫化された抗原 に対する抗体Ｐ３（○）、抗体Ｐ５−１　（ロ）及び抗体Ｐ５−３　（・）の結 合を阻害する能抗体Ｐ５−１及びＰ５−３の結合は、溶性１８及びラクタム１２ 及び２９によって阻害され、一方、グリコシド４２．２２．４４．４５及び４６ は、阻害剤として無力であった。０Ｍ２−ラクタム−ＴＭＳＥｔ　（２２）は不 活性であったという事実は、抗体が、ＧＭ、−ラクタム（２２）においてＧａ１ ＮＡｃ残基を立体的にじゃまするラクタム化（及びラクトン化）したＧＭ、−サ ツカライドのエピトープを認識することを示している。抗体ｐ３（ＧＭｓ−ガン グリオシドラクトン４２を認識しない）の被覆された１８への結合は、ラクタム １２．２２及び２９によって阻害された。明らかに、２２のＧａ１ＮＡｃ残基は 結合をじゃましない。よって、抗体Ｐ３及びＰ５−１／Ｐ５−３は異なったサツ カライド・エピトープを認識するようである。抗体Ｐ５−１及びＰ５−３は、Ｃ Ｍ　！−ガングリオシド（４１）の閉形でなく、ＧＭ！−ガングリオシドラクト ン（４２）を認識しく表１）、それらは潜在的に、ＣＭ、−ガングリオシドラク トン（４２）の選択的な免疫組織学的検出に有用である。

主な重要点は、これらの抗体が、天然ＧＭ、−ラクトンならびに合成ＧＭ、−ラ クトンのいずれをも認識するという事実であり、さらに、抗体に結合された場合 に、サツカライド・立体配座が非常に似ていることを確認する。従うて、安定な ガングリオシドラクトンは、腫瘍を示すガングリオシドに対する活性免疫におい て、一般に不安定なガングリオシドラクトンの置換に作動である。

阻害（％） ０．００１　０．１　１０　１０１０ ００１ｏ阻害剤濃度二纜の 阻害（％） ０．００１　０．１　１０　１１００ ０１ｏ　（阻害剤濃度、ｌｌめ 阻害（％） ０．００１　０．１　１０　１１００ ０１ｏ　（阻害剤濃度、ｎ■ 阻害（％） ０．０００１　０．０１　１　１１０ ０ｆｏ　（阻害剤濃度二μめ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年５月ｌＯ日陣

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉのガングリオシドラクタム類似誘導体▲数式、化学式、表等があり ます▼Ｉ 〔式中、Ａは、式ＩＩのシアリン酸残基▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ （上記残基は、２位の点線を介して結合され、Ｚ１は−ＯＨ又は基−ＮＨＸ１、 Ｙ３０は−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨ）、Ｘ１及びＹ１は互いに結合を形成し、Ｙ ２は−ＯＨ又は基ＯＲ２０、又はＸ１及びＹ２は互いに結合を形成し、Ｙ１は− ＯＨ又は−ＮＨＡｃ、Ｙ３は−ＯＨ又は基ＯＲ２０、Ｒ１はＨ又は式ＩＩＩのシ アリン酸基 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ（上記残基は、２位の点線を介して結 合し、Ｚ２は−ＯＨ又は基−ＮＨＸ２、Ｙ３０は上記と同義） Ｘ２及びＹ１０は互いに結合を形成し、Ｙ２０は−ＯＨ、又はＸ２及びＹ２０は 互いに結合を形成し、Ｙ１０は−ＯＨ、但し、Ｒ１がＨのとき、Ｚ１は−ＮＨＸ １、Ｒ１が上記式ＩＩＩのシアリン酸残基のとき、Ｚ１及びＺ２の少なくとも１ つは−ＯＨとは異なる、Ｒ１０はＨ、キャリアＣＡ、又は基−（糖）■、糖は、 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リ ボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−フコース、２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ −グルコース、２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルク ロン酸、Ｄ−ガラクトユロニン酸、Ｄ−マンヌュロニン酸、２−デオキシ−２− フタルイミド−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−フタルイミド−Ｄ−ガラク トース及びシアリン酸からなる群から選ばれたモノサッカライド単位、ｎは１〜 １０の整数、そこで還元末端糖単位がヘミアセタール又はキャリアＣＡにグリコ シド的に結合されている、Ｒ２０は式Ｉ′の基 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ′（式中、ｍは０又は１の整数、ｐは１〜 ５の整数、糖１は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ− キシロース、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−フコース、２−アセタミド −２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−アセタミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラク トース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクトユロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、２−デ オキシ−２−フタリミド−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−フタリミド−Ｄ −ガラクトース及びシアリン酸からなる群から選ばれたモノサッカライド単位、 Ｒ２はＨ又は上述の式ＩＩのシアリン酸残基（Ｚ１、Ｒ１、Ｙ１０、Ｙ２０、Ｙ ３０及びＺ２は上記と同義、Ｘ１及びＹ１は互いに結合を形成し、Ｙ２１は−Ｏ Ｈ、又Ｘ１及びＹ２１は互いに結合を形成し、Ｙ１は−ＯＨ又は−ＮＨＡｃであ る）〕。
2. ２．Ｙ２とＹ２の最大１つが基−ＯＲ２０である請求項１記載の化合物。
3. ３．Ｙ２が−ＯＨで、Ｒ１０が存在するとき、ならびに環構造における式Ｉ′の 糖１単位がＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、２−アセタミド−２−デオキシ −Ｄ−ガラクトース及びＬ−フコース単位から選択される請求項２記載の化合物 。
4. ４．−般式Ｉ中の環がガラクト構造を有する請求項３記載の化合物。
5. ５．Ｒ′がＨである請求項４記載の化合物。
6. ６．請求項１〜５のいずれかによる化合物に対し指向し、好ましくは対応するガ ングリオシドラクトンと反応しうるものである抗体。
7. ７．モノクロナール抗体である請求項６記載の抗体。
8. ８．ヒト源である請求項６記載の抗体。
9. ９．ポリクロナール抗体である請求項６記載の抗体。
10. １０．請求項１〜５のいずれかによる化合物のエピトープに対する結合部位を含 有し、さらに同じ化合物の他のエピトープ、他の抗原のエピトープ又は医薬のエ ピトープに対する他の結合部位を含有するハイブリッド抗体である請求項６記載 の抗体。
11. １１．他の抗原が細胞毒性Ｔ−細胞の分化抗原である請求項１０記載の抗体。
12. １２．医薬が細胞障害剤及び抗新生物剤から選択される請求項１０記載の抗体。
13. １３．請求項１〜５のいずれかによる化合物と反応性である抗体に指向している 抗−イディオタイプ抗体。
14. １４．請求項１３の抗−イディオタイプ抗体に指向している抗−抗イディオタイ プ抗体。
15. １５．請求項１〜５のいずれかによる化合物、請求項６〜１２のいずれかによる 抗体、請求項１３による抗−イディオタイプ抗体又は請求項１７による抗−抗イ ディオタイプ抗体からなる診断薬。
16. １６．請求項６〜１２のいずれかによる抗体又は請求項１４による抗−抗イディ オタイプ抗体が標識を有している請求項１５記載の診断薬。
17. １７．標識が酵素、蛍光物質、放射性同位元素及びビオチンのようなリガンドか ら選択される請求項１６記載の診断薬。
18. １８．請求項１〜５のいずれかによる式Ｉの化合物と生理学的に受容な賦形剤又 はアジュバントからなるワクチン。
19. １９．Ｒ１０がキャリアＣＡ又は請求項１に定義した基（糖）■で、還元末端糖 単位がキャリアＣＡにグリコシド的に結合している請求項１８記載のワクチン。
20. ２０．キャリＣＡが蛋白からなる請求項１９記載のワクチン。
21. ２１．キャリＣＡが脂質基からなる請求項１９記載のワクチン。
22. ２２．式Ｉの化合物がリボソーム、ミセル又は立体相のような超巨大分子凝集体 の一部を形成している請求項２０又は２１記載のワクン。
23. ２３．請求項１〜５のいずれかによる化合物又は請求項６〜１２のいずれかによ る抗体と医薬的に受容な賦形剤とからなるガン関連抗原としてガングリオシドラ クトンを有するヒトガンの治療用の医薬組成物。
24. ２４．請求項１〜５のいずれかによる化合物又は請求項２３による医薬組成物を 投与することからなるヒト又は動物における、細胞への細菌またはウィルス付着 に、特に関連しての細胞−細胞又は細胞−ウィルス相互作用、炎症又は腫瘍の転 移を阻害する方法。
25. ２５．抗体を含有する溶液と、その抗体を反応しうる式Ｉの化合物又は請求項１ ３による抗−イディオタイプ抗体（但し前記化合物又は抗イディオタイプ抗体は 固形支持体にカップリングされているか固体支持体とかなる）を接触させ、支持 体から抗体を放出させることからなる抗体の糖製法。
26. ２６．請求項１〜５のいずれかによる化合物を、その化合物に対する抗体の形成 を誘因しうる量で投与することからなるガン関連抗原としてガングリオシドラク トンを有するヒトガン２対する免疫保護を処置又は促進する方法。
27. ２７．検出しうる標識化された請求項６〜１２のいずれかによる抗体の診断有効 量を投与し、結合抗体の局在部位を測定することからなる生体内のガン腫瘍の部 位を探す方法。
28. ２８．請求項６による抗体、特にハイブリッド細胞を産生しうる細胞。
29. ２９．動物を請求項１〜５のいずれかの化合物又は請求項１３による抗−イディ オタイプ抗体で免疫化して抗原と反応しうる抗体を産生する細胞を得、動物又は 細胞から抗体を分離することからなる抗体の製法。
30. ３０．動物を、請求項１〜５のいずれかの化合物又は請求項１３による抗−イデ ィオタイプ抗体で免疫化して、抗原と反応しうる抗体を産生する細胞を得、その 細胞を融合細胞を不死化する細胞系の細胞と融合し、モノクロナール抗体を産生 して得られるハイブリドーマ抗体を選択してクローン化又はモノクロナール抗体 を産生する未融合細胞系を不死化し、次いで、培地中の細胞を生育してモノクロ ナール抗体を得、この抗体を生育培地から採取することからなる請求項１による モノクロナール抗体を作る請求項２９記載の方法。
31. ３１．免疫化される動物が、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、豚 、馬又は二十日ネズミから選択された哺乳動物である請求項２９又は３０記載の 方法。
32. ３２．抗体を産生する細胞が脾臓又はリンパ細胞である請求項２９〜３１のいず れかによる方法。
33. ３３．ハイプリドーマ細胞が、生体外又はマウスのような動物の体内で育成され る請求項３０〜３２のいずれかによる方法。