JP2003310293A - ヌクレオシド化合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 シトシン誘導体とペントース−１−リン酸誘
導体またはその塩から、ヌクレオシドホスホリラーゼま
たは該酵素活性を有する菌体、酵素、培養液などを触媒
として用い、シチジンヌクレオシド誘導体を製造する方
法を提供する。 【解決手段】２０℃における水に対する溶解度が２．５
重量％以下の有機溶媒を反応液に加えて反応する事によ
り酵素反応の基質あるいは生成物の分解活性を特異的に
失活させることを特徴とするシチジンヌクレオシド誘導
体の製造方法。 【効果】 高収率で高品質のシチジンヌクレオシド誘導
体を製造でき、シチジンヌクレオシド誘導体の製造に際
しほとんど副生物を生成しない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬品等の合成原料
として有用なシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法に
関する。さらに詳しくは、２０℃における水に対する溶
解度が２．５重量％以下の有機溶媒（以下、単に有機溶
媒と呼ぶことがある）を加え、シチジンヌクレオシド誘
導体を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存
在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分
解する酵素の総称であり、リボヌクレオシドを例にする
と次式で表される反応を触媒する。 リボヌクレオシド ＋ リン酸（塩） → 核酸塩基
＋ リボース１−リン酸 プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホ
リラーゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、
哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在す
る。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各
種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例え
ば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チ
ミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平
０１−１０４１９０号公報）、２´−デオキシアデノシ
ン（特開平１１−１３７２９０号公報）または２´−デ
オキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）
を製造する方法が知られている。この様にヌクレオシド
ホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、
穏和な条件で立体特異的に製造することが可能であり、
多くのヌクレオシド誘導体の合成が検討されている。

【０００３】特公平７−８９９４８号ではデオキシリボ
ース−１−リン酸とシトシンから菌体反応によりデオキ
シシチジンを製造する方法が示されているが、該公報の
方法は菌体反応でありヌクレオシドホスホリラーゼによ
り生成しているとは必ずしも言えない。例えば、菌体内
に蓄積したデオキシシチジンが反応中に菌体内より溶出
したものであったり、菌体内のヌクレオシドデオキシリ
ボシルトランスファラーゼにより、基質として添加した
シトシンが菌体内のデオキシヌクレオシドの塩基に転移
した結果、デオキシシチジンが検出された可能性も考え
られる。本発明者らはそれらの点を検証するため、該公
報の実施例で寄託されている７株について実施例と同じ
方法で試験を行った。その結果、何れの菌株を用いても
デオキシシチジンは全く検出されなかった。

【０００４】特開平３−１２７８６号公報ではプリン塩
基とピリミジン塩基の両方に作用する新規なヌクレオシ
ドホスホリラーゼが報告されており、ピリミジン塩基と
してデオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシチ
ミジンに作用すると記載されてはいるが、その基質特異
性を何ら実施例で開示していない。また、該公報は取り
下げられているのでその活性を確認することはできない
が、該公報と同じ発明者らは、該公報と同一名の菌株よ
りヌクレオシドホスホリラーゼを精製し、その特徴をAp
plied and Environmental Microbiology,Vol.56,PP3830
-3834,(1990)で報告しており、該酵素はシトシン、シチ
ジン及びデオキシシチジンに対する活性はないと記載さ
れている。

【０００５】上記以外ではプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼあるいはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
の何れにおいても核酸塩基としてシトシンまたはシトシ
ン誘導体が基質となることは報告されておらず、例え
ば、Method.Enzymology,Vol.51,PP437〜442(1978)では
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonera typhimuriu
m）のピリミジンホスホリラーゼの一種であるチミジン
ホスホリラーゼにはデオキシシチジンに対する反応性は
認められないと記載されている。また、J.Biol.Chem.,V
ol.248,No.6,PP2040〜2043(1973)ではサルモネラ・チフ
ィムリウム（Salmonera typhimurium）のプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼにはピリミジンヌクレオシドへの
活性は認められないと記載され、ウリジン、シチジン、
デオキシウリジン、デオキシシチジンが例示されてい
る。

【０００６】これらの報告を総合的に勘案すると、従来
の技術水準では、シチジンヌクレオシド誘導体を酵素的
に合成する事はできなかったと考えるのが妥当である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ヌクレオシドホスホリ
ラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条
件で立体特異的にヌクレオシド誘導体を製造することが
可能であり、種々のヌクレオシド化合物の合成研究が盛
んに行われているが、これまでシトシン誘導体とペント
ース−１−リン酸誘導体またはその塩を基質としてシチ
ジンヌクレオシド誘導体を合成することが可能なヌクレ
オシドホスホリラーゼは報告されていなかった。

【０００８】また、仮にヌクレオシドホスホリラーゼに
よりシチジンヌクレオシド誘導体を合成することが可能
であったとしても、一般に微生物にはシトシンデアミナ
ーゼおよびシチジンデアミナーゼ活性が存在するため、
シトシン誘導体およびシチジンヌクレオシド誘導体のア
ミノ基が脱離したウラシル誘導体、ウリジン誘導体が合
成されてしまい、効率的にシチジンヌクレオシド誘導体
を蓄積することは困難である。

【０００９】また、ヌクレオシドホスホリラーゼは元
来、シチジンを合成する酵素ではない為、たとえ反応が
進行したとしても、合成活性、反応選択性共に低く、効
率良くシチジンヌクレオシド誘導体を蓄積する事は困難
である。更に、ヌクレオシド誘導体はアンチセンス医薬
品や診断薬の原料として使われており、微量の副生物の
混入も問題である。特にウラシル誘導体、ウリジン誘導
体などシチジンヌクレオシド誘導体と類似の骨格を有す
る不純物の混入は０．１％であっても、大きな問題とな
る。

【００１０】この様な事から、本発明の目的は、シチジ
ンヌクレオシド誘導体の合成において、ヌクレオシドホ
スホリラーゼの活性を維持したままシトシンデアミナー
ゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を選択的に失活さ
せるると共に、反応速度を上げる事で、反応選択性を向
上させ、高収率、かつ高品質のシチジンヌクレオシド誘
導体を製造する方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決するために鋭意検討した結果、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ活性を有する酵素、菌体、培養液ま
たはそれらの混合物に、シチジンヌクレオシド誘導体を
合成する活性が有る事を見出した。しかしながら、本酵
素をそのまま用いると、シトシンデアミナーゼおよびシ
チジンデアミナーゼ活性により、シトシン誘導体および
シチジンヌクレオシド誘導体のアミノ基が脱離したウラ
シル誘導体、ウリジン誘導体が合成されてしまい、効率
的にシチジンヌクレオシド誘導体を蓄積することは困難
であった。また、酵素液中には非常に高価なペントース
１−リン酸を分解する酵素も存在し、高収率でシチジン
ヌクレオシド誘導体を合成する事が困難であった。

【００１２】そこで、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ活性を維持しつつ、これら分解酵素を選択的に失活す
る目的で、２０℃における水に対する溶解度が２．５重
量％以下の有機溶媒を反応系に添加する事で、効率的に
分解酵素のみを失活させる事が可能である事を見出し
た。この際、加えられる有機溶媒が水に溶け易い溶媒で
は、酵素が有機溶媒により変質する為、ヌクレオシドホ
スホリラーゼの活性を低下させる原因となり、好ましく
はない。更に、この方法においては、有機溶媒が無い場
合と比較し、反応速度が飛躍的に向上する為、ペントー
ス１−リン酸の分解率を低下する事が可能である事を見
出した。

【００１３】上述の方法により、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼの活性を維持したまま、基質と生成物の分解活性
の両方を特異的に失活させるだけで無く、反応速度も向
上させる事で、シトシン誘導体とペントース−１−リン
酸誘導体またはその塩から副生物をほとんど生成せずに
シチジンヌクレオシド誘導体を製造できることを見出
し、本発明を完成させるに至った。

【００１４】本発明によれば、従来達成できなかったヌ
クレオシドホスホリラーゼによるシチジンヌクレオシド
誘導体の効率的な合成方法を提供することができる。即
ち本発明は以下の通りである。 （１）シトシン誘導体とペントース１−リン酸誘導体ま
たはその塩から、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有
する微生物の培養物或いはその処理物の存在下、シチジ
ンヌクレオシド誘導体を製造する方法において、２０℃
における水に対する溶解度が２．５重量％以下の有機溶
媒反応液に加えて反応する事を特徴とする、シチジンヌ
クレオシド誘導体の製造方法。 （２）シトシン誘導体が一般式（１）［化４］

【００１５】

【化４】

【００１６】（ここでＥは窒素原子または炭素原子、Ｆ
は水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子を示す。）
で示される化合物であり、ペントース１−リン酸誘導体
が一般式（２）［化５］

【００１７】

【化５】

【００１８】（ここでＲ１はヒドロキシメチル基または
カルボキシル基を示し、Ｘはハロゲン原子またはアルコ
キシ基を示し、ａ、ｂは各々独立して０から３の整数を
示す。）で示される化合物であり、シチジンヌクレオシ
ド誘導体が一般式（３）［化６］

【００１９】

【化６】

【００２０】（ここでＲ１、Ｅ、Ｆ、Ｘ、ａ、ｂは前記
と同義である。）で示される化合物である（１）記載の
シチジンヌクレオシド誘導体の製造方法。 （３）加えられる有機溶媒が飽和炭化水素または不飽和
炭化水素である（１）または（２）記載のシチジンヌク
レオシド誘導体の製造方法。 （４）加えられる有機溶媒がペンタン、ヘキサン、ヘプ
タン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シ
クロヘプタン、シクロオクタン、トルエン、エチルベン
ゼンである（１）〜（３）の何れか一項に記載のシチジ
ンヌクレオシド誘導体を製造する方法。 （５）シトシン誘導体がシトシンであり、ペントース１
−リン酸誘導体またはその塩が、２−デオキシリボース
１−リン酸２アンモニウム塩または２−デオキシリボー
ス１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩であり、
シチジンヌクレオシド誘導体が２'−デオキシシチジン
である、（１）〜（４）の何れか一項に記載のシチジン
ヌクレオシド誘導体の製造方法。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明におけるヌクレオシドホス
ホリラーゼ活性を有する微生物とは、シトシン誘導体を
基質としてシチジンヌクレオシド誘導体を生成する活性
を有すれば動物、植物、微生物の何れの起源であっても
構わない。このようなヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を有する微生物の具体例としては、エシェリシア・コリ
（Escherichia coli）等のエシェリシア（Escherichi
a）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼとして知られている酵素を好適な例として
挙げることができる。

【００２２】本発明におけるヌクレオシドホスホリラー
ゼ活性を有する微生物とは、一般的なヌクレオシドホス
ホリラーゼ活性を有し、且つ、シトシンまたはシトシン
誘導体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成
するヌクレオシドホスホリラーゼを発現していれば、特
に限定されない。このようなヌクレオシドホスホリラー
ゼを生産する微生物の具体例としては、エシェリシア・
コリ（Escherichia coli）等のエシェリシア（Escheric
hia）属に含まれる微生物を好適な例として挙げること
ができる。

【００２３】近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩
により、上述の微生物株のプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析す
ることにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得
し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された
組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入
し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出するこ
とが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる
技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラー
ゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本
発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生
物に包含されるものとする。

【００２４】ここでいう発現に必要な制御領域とは、プ
ロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含
む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列
等を示している。プロモーター配列の具体例としては、
大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモー
ター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラム
ダファージ由来のＰLプロモーター及びＰRプロモーター
や、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇ
ｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）
・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミ
ラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、
ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配
列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌
由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や
枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限
定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲ
ＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続し
たコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを
利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインター
ミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用で
きる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順
序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする
遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。

【００２５】ここでいうプラスミドの具体例としては、
大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中
での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベク
ターとして利用することができる。また、２種類以上の
宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐ
ＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクター
として利用することができる。ここでいう任意の宿主に
は、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が
代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定される
のものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチル
ス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。

【００２６】本発明におけるヌクレオシドホスホリラー
ゼ活性を有する微生物の培養物或いはその処理物として
は、該酵素活性を有する微生物の培養により得られた菌
体、及び菌体処理物またはそれらの固定化物などが使用
できる。市販の酵素もその範疇に包含される。培養物の
処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超
音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、
自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより
調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫
安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーによ
り精製を重ねたものを用いても良い。

【００２７】本発明におけるシチジンヌクレオシド誘導
体とは、ペントース−１−リン酸誘導体またはその塩
と、核酸塩基としてシトシン誘導体がＮ−グリコシド結
合で結合した化合物のことである。その代表例を挙げる
と、例えばシチジン、２'−デオキシシチジン、３'−デ
オキシシチジン、２'，３'−ジデオキシシチジン、アザ
シチジン、メチルシチジン、２'−デオキシアザシチジ
ン、２'−デオキシメチルシチジン、５−フルオロシチ
ジン、５−フルオロデオキシシチジンなどを挙げられる
が、これらに限定されるものではない。本発明における
シトシン誘導体とは、例えば、シトシン、アザシトシ
ン、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシンなどを
挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。

【００２８】本発明におけるペントース−１−リン酸誘
導体とは、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロ
キシケトンおよびその誘導体の１位にリン酸がエステル
結合したもののことである。これらの代表例を挙げる
と、例えばリボース１−リン酸、２−デオキシリボース
１−リン酸、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸、
アラビノース１−リン酸などが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。ここでいうポリヒドロキシア
ルデヒドまたはポリヒドロキシケトンとは、天然物由来
のものとしては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソーズ、Ｄ−リボースの
ようなアルドペントース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシ
ルロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース、Ｄ
−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボ
ースのようなデオキシ糖類を挙げることができるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００２９】本発明におけるペントース１リン酸誘導体
の塩または一般式（２）の塩とは、リン酸とイオン結合
可能なものであれば特に限定はないが、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネ
シウム塩、バリウム塩等の無機塩基による塩や、アンモ
ニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウ
ム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニ
ウム塩、シクロヘキシルアンモニウム塩、ジシクロヘキ
シルアンモニウム塩等の有機塩基等が挙げられ、リン酸
の価数に応じ、同種または異なる１または２個のイオン
と塩を形成する事が出来る。

【００３０】これらの代表例を挙げると、例えばリボー
ス１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩、リボー
ス１−リン酸２ナトリウム塩、リボース１−リン酸２ア
ンモニウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２シク
ロヘキシルアンモニウム塩、２−デオキシリボース１−
リン酸２アンモニウム塩、２−デオキシリボース１−リ
ン酸２カルシウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸
２バリウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２リチ
ウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２アン
モニウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２
シクロヘキシルアンモニウム塩、２，３−ジデオキシリ
ボース１−リン酸２カルシウム塩、２，３−ジデオキシ
リボース１−リン酸２ナトリウム塩、アラビノース１−
リン酸２アンモニウム塩、アラビノース１−リン酸２シ
クロヘキシルアンモニウム塩、アラビノース１−リン酸
２カルシウム塩などが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。

【００３１】Ｆで表される低級アルキル基とは、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチ
ル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基や、トリフルオロメ
チル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロ
ピル基、トリクロロメチル基等のパーハロゲン化アルキ
ル基が挙げられる。Ｆ、Ｘで表されるハロゲン原子とは
フッ素原子、クロル原子、臭素原子、よう素原子を示
す。Ｘで表されるアルコキシ基とは、メトキシ基、エト
キシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、メトキ
シメチルオキシ基、２−メトシキエトキシ基、２−エト
シキエトシキ基、トリフルオロエトキシ基等が挙げられ
る。

【００３２】本発明に係る２０℃における水に対する溶
解度が２．５重量％以下の有機溶媒とは、シトシンデア
ミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活さ
せることが可能であり、かつ水に対する溶解度（２０
℃）が２．５重量％以下であれば特に限定されないが、
具体的には１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタ
ノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−
１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノー
ル、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタ
ノール、１−ノナノール等のアルコール類、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec−ブチル、
酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸シクロヘキシ
ル、酢酸ベンジル等のエステル類、ペンタン、ヘキサ
ン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルブタン、
２，３−ジメチルブタン、シクロヘキサン、メチルシク
ロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン、シ
クロオクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカ
ン、石油エーテル、石油ベンジン、リグロイン、工業ガ
ソリン、灯油、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチル
ベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、メシチレン、ナ
フタレン等の炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジ
クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、クレゾー
ル、キシレノール等のフェノール類、メチルイソブチル
ケトン、２−ヘキサノン等のケトン類、ジプロピルエー
テル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、
ジベンジルエーテル等のエーテル類が挙げられ、好まし
くはペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロ
ペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオ
クタン、トルエン、エチルベンゼン等の炭化水素類であ
る。

【００３３】原料であるペントース−１−リン酸誘導体
またはその塩は、試薬として購入するか、またはヌクレ
オシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシド化合物
の加リン酸分解反応を行って製造する方法（J.Biol.Che
m.Vol.184、437、1950）や、アノマー選択的な化学合成法
等（ＷＯ０１５８９２０）によっても調製することがで
きる。

【００３４】ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する
微生物の培養物或いはその処理物としては、酵素液、菌
体、培養液等であり特に限定はないが、通常、水溶液と
して供給される。その場合、メタノール、エタノール、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒
を加えた液でも良い。その際溶媒をヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を有する微生物の培養物或いはその処理物
に対して添加し、必要に応じて一定時間適当なヌクレオ
シドホスホリラーゼ活性が大幅に減少しない温度で保持
した後、溶媒処理された酵素液として別途調製した後反
応に使用してもよい。

【００３５】ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する
微生物の培養物或いはその処理物は、ヌクレオシドホス
ホリラーゼの活性を維持する目的で、ペントース１−リ
ン酸誘導体またはその塩を添加する事も可能である。ペ
ントース−１−リン酸誘導体またはその塩を添加する場
合は、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持できれ
ば特に限定はないが、通常、０．１ｍＭ／Ｌ以上、好ま
しくは０．５ｍＭ〜１００ｍＭ／Ｌである。

【００３６】また、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を
有する微生物の培養物或いはその処理物は、熱等による
前処理を行なう事も出来る。前処理は、ヌクレオシドホ
スホリラーゼの活性を維持できれば特に限定はないが、
２０〜７０℃の範囲で、１０分間〜２４時間前処理でき
る。

【００３７】本発明におけるシチジンヌクレオシド誘導
体は、シトシン誘導体とペントース−１−リン酸誘導体
またはその塩を基質として、２０℃における水に対する
溶解度が２．５重量％以下の有機溶媒を加え、前記ヌク
レオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の培養物或
いはその処理物を触媒として反応させる事により合成す
る事が出来る。加えられる有機溶媒の量はシトシンデア
ミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的
に失活させることが可能であれば特に限定はないが、シ
トシン誘導体に対し０．１〜５０重量倍、好ましくは
０．１〜１０重量倍である。反応に用いられるペントー
ス−１−リン酸誘導体またはその塩はシトシン誘導体に
対し０．７当量以上用いれば良く、好ましくは０．８〜
３当量である。ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有す
る微生物の培養物或いはその処理物の使用量は反応に支
障がなければ特に限定はないが、シトシン誘導体に対
し、０．１重量倍以上用いれば良い。反応は適切なｐ
Ｈ、温度、反応時間などの条件を選べば良いが、通常、
ｐＨ４〜１０好ましくはｐＨ７〜１０、温度は１０〜８
０℃好ましくは１０〜６０℃、反応時間は１〜４８時間
好ましくは５時間〜３０時間の範囲で行うことができ
る。反応に使用するペントース−１−リン酸誘導体とシ
トシン誘導体の濃度は０．５〜２０％好ましくは２〜１
０％で行なう事が出来る。

【００３８】反応には、生成するリン酸を反応系から除
去する目的で、マグネシウム、カルシウム、バリウム、
コバルト、リチウム等のイオンを共存させる事も可能で
ある。具体的には、水酸化リチウム、炭酸リチウム、水
酸化マグネシウム、塩基性炭酸マグネシウム、炭酸カル
シウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化コ
バルト等を添加する事が出来る。この様なリン酸の除去
剤を加える時は、それぞれペントース１−リン酸に対
し、１〜５倍モル使用すれば良い。

【００３９】反応には、ｐＨを制御する目的で、塩酸、
硫酸、硝酸、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸などの酸類、水
酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウ
ム、水酸化リチウム、炭酸リチウム、アンモニアなどの
塩基類を用いる事も可能である。

【００４０】この様にして製造したシチジンヌクレオシ
ド誘導体は、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理や、イオ
ン交換樹脂、活性炭、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーなどの吸脱着処理などの常法を適用する事により単
離する事が出来る。

【００４１】

【実施例】以下に実施例で本発明を説明するが、本発明
はこれら実施例によって何等制限されるものではない。 ［分析法］生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液
体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下
による。 カラム；ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ＡＭ−３１２（６．０×
１５０ｍｍ） カラム温度；４０℃ ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ． 検出；ＵＶ２５４ｎｍ 溶離液；１０ｍＭリン酸２水素カリウム水溶液（３００
０ｍｌ）をリン酸でｐＨ３．８に調整し、 アセト
ニトリル（６０ｍｌ）を加え、混合、脱気する。 内標準物質：３，５−ジヒドロキシ安息香酸

【００４２】参考例１ ヌクレオシドホスホリラーゼ活
性を有する菌体の作製 大腸菌染色体ＤＮＡを次のようにして調製した。エシェ
リヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一
夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶
菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常
の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させ
た。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収
した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。

【００４３】ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア
・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（GenBank ac
cession No. AE000508（コード領域は塩基番号11531-12
250）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サ
イエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これ
らのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、
それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配
列を有する。

【００４４】制限酵素ＨｉｎｄIIIで完全に消化した前
記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各
３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変
性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、
伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３
０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。

【００４５】上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８
（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消
化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて
連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシ
ェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株
を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａ
ｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐
性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。こう
して得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ ＭＴ
−１０９０５と名づけた。

【００４６】エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５株
をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７
℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで
１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸
濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得
られた菌体を−２０℃にて凍結保存した。

【００４７】参考例２ 反応用酵素液の調製 参考例１で作成した菌体（３．５ｇ）を解凍し、１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．６ｇ）、２−
デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（２０ｍ
ｇ）、純水（４．８ｇ）、を混合し酵素液Ａを調製し
た。

【００４８】参考例３ 参考例１で作成した菌体（３．５ｇ）を解凍し、１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．６ｇ）、２−
デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（２０ｍ
ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４．８ｇ、以下
ＤＭＦと略す）を混合し、５０℃で３時間攪拌処理し、
酵素液Ｂを調製した。

【００４９】実施例３ シトシン６．９６ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）、２´−デオ
キシリボース１−リン酸２アンモニウム塩１８．７ｇ
（７５．４ｍｍｏｌ）、水酸化マグネシウム７．５８ｇ
（１３２ｍｍｏｌ）、参考例１で調製した凍結菌体
（２．０ｇ）を水（９６．４ｇ）、シクロヘキサン４．
８ｇの混合液に加え、酢酸にて反応液のｐＨを８．８に
コントロールしながら４５℃で１８ｈｒ反応した。反応
終了後、ＨＰＬＣで分析した所、目的物である、２'−
デオキシシチジンを１０．０３ｇ（７０．５モル％／シ
トシン）得た。この時、副生物であるウラシルは０・７
３ｇ（１０．４モル％／シトシン）、２'−デオキシウ
リジンは１．８０ｇ（１２．６モル％／シトシン）であ
った。

【００５０】実施例４〜８、比較例１ 酵素液として実施例４，５では参考例２で調製された酵
素液Ａを使用し、実施例６，７，８では参考例３で調製
された酵素液Ｂを使用した以外は実施例３と同様の条件
で、菌体処理に用いる有機溶媒、反応時に添加する有機
溶媒を変えて２'−デオキシシチジンの合成を行なった
際の反応液中の各成分の分析結果を表−１に示す。

【００５１】表−１の結果からもわかるように、反応中
に有機溶媒を添加することで副生するウラシル、デオキ
シシチジンの生成を低減できることがわかる。また、菌
体処理による酵素液の調製時に有機溶媒を添加すると、
その酵素液を用いた２’−デオキシシチジンの合成反応
では、より副生するウラシル、デオキシシチジンの生成
を低減できることがわかる。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【発明の効果】本発明は上記の実施例、比較例、参考例
からも明らかなように、ヌクレオシドホスホリラーゼ活
性を有する酵素、菌体、培養液を触媒としたシチジンヌ
クレオシド化合物の製造において、有機溶媒を加えて反
応する事により、分解反応及び副生成物を抑制し、高収
率で且つ高品質のシチジンヌクレオシド化合物を簡便に
製造する事が可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松葉 泰子 福岡県大牟田市浅牟田町30 三井化学株式 会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AF34 CA02 CA19 CB21 CC09 CC24 CD09 CD12 CD15 CD30 DA01 DA13 4C057 AA17 LL19

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シトシン誘導体とペントース１−リン酸誘
   導体またはその塩から、ヌクレオシドホスホリラーゼ活
   性を有する微生物の培養物或いはその処理物の存在下、
   シチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法において、
   ２０℃における水に対する溶解度が２．５重量％以下の
   有機溶媒を反応液に加えて反応する事を特徴とする、シ
   チジンヌクレオシド誘導体の製造方法。
2. 【請求項２】シトシン誘導体が一般式（１）［化１］ 【化１】 （ここでＥは窒素原子または炭素原子、Ｆは水素原子、
   低級アルキル基、ハロゲン原子を示す。）で示される化
   合物であり、ペントース１−リン酸誘導体が一般式
   （２）［化２］ 【化２】 （ここでＲ１はヒドロキシメチル基またはカルボキシル
   基を示し、Ｘはハロゲン原子またはアルコキシ基を示
   し、ａ、ｂは各々独立して０から３の整数を示す。）で
   示される化合物であり、シチジンヌクレオシド誘導体が
   一般式（３）［化３］ 【化３】 （ここでＲ１、Ｅ、Ｆ、Ｘ、ａ、ｂは前記と同義であ
   る。）で示される化合物である請求項１記載のシチジン
   ヌクレオシド誘導体の製造方法。
3. 【請求項３】加えられる有機溶媒が飽和炭化水素または
   不飽和炭化水素である請求項１または２記載のシチジン
   ヌクレオシド誘導体の製造方法。
4. 【請求項４】 加えられる有機溶媒がペンタン、ヘキサ
   ン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキ
   サン、シクロヘプタン、シクロオクタン、トルエン、エ
   チルベンゼンである請求項１〜３の何れか一項に記載の
   シチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法。
5. 【請求項５】 シトシン誘導体がシトシンであり、ペン
   トース１−リン酸誘導体またはその塩が、２−デオキシ
   リボース１−リン酸２アンモニウム塩または２−デオキ
   シリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩
   であり、シチジンヌクレオシド誘導体が２'−デオキシ
   シチジンである、請求項１〜４の何れか一項に記載のシ
   チジンヌクレオシド誘導体の製造方法。