JPH0223882A - ５−メチルウリジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ５−メチルウリジンはり？チミジンとも呼ばれ、チミジ
ンの類縁体である。すなわちチミジンの糖部分がデオキ
シリゴースであるのに対して５−メチルウリジンの糖部
分はすＭ−スである。本物質は容易に化学的に還元して
チミジンに変換しえる。

チミジンは医薬原料、特に最近世界的に問題になってい
るエイズ（ＡＩＤＳ）に対する最も効果のある治療薬と
して知られているアジドチミジンの原料であシ大量合成
法の確立が望まれている０本発明は化学合成法で容易に
チミジンに変換することのできる５−メチルウリジンを
微生物によって製造させる方法に関するものである。

（従来の技術） ５−メチルウリジンの製造法としてはリボースと５−メ
チルウラシルからの化学合成法が良く知られているが収
率が非常に悪い。またウリジンの５位を化学合成の手法
によってメチル化する方法もあるが、−度プロ毛化して
メチル基を導入する丸めに操作が複雑で実用的でない。

ビリミノンヌクレオシドを対応塩基化合物と対応すｚ−
ス化合物との酵素的反応によってつくることは、特開昭
５６−１０２７９４号公報ですでに知られているが、５
−メチルウリジンの合成に関して記載されてい低い。

（発明が解決しようとする課題） て良い５−メチルウリジンの製造方法の提供である。

（課題を解決するための手段） 本発明者はこのような目的を達成するべく鋭意検討の結
果、アデノシ／、グアノシン、イノシン、ウリノン、シ
チジン、キサントシン等のヌクレオシド又はリボース−
１−リン酸に、化学合成法で安価に供給される５−メチ
ルウラシルを微生物の存在下に作用させることによシ、
これらのヌクレオシド又はり？−スー１−リン酸が５−
メチルウリジンに変換されることを見いだし本発明を完
成するに至った０本発明を簡単に記すと以下の通シであ
る。

即ち本発明は（１）（イ）リボース−１−９７ｒｌｌＦ
ｉシ＜はその塩及び（ロ）５−メチルウラシルから５−
メチルウリジンを生成せしめる方法、並びに（２）（ｃ
４＞ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン
、シチジン、イノシン及びキサントシン）、（ｄＩ無無
機リン基若くはその塩及び（ハ）５−メチルウラシルか
ら５−メチルウリジンを生成せしめる方法である。また
ヌクレオシドのかわシにこれらに対応するヌクレオチド
（アデノシン−５′−モノリン酸、グアノシン−５′−
モノリン酸、イノシン−５′−モノリン酸、ウリジン−
５′−モノリン酸、シチジン−５／　−モノリン酸、キ
サントシン−５′−モノリン酸）を用いても構わない。

なぜならば、これらのヌクレオチドが反応中にヌクレオ
シドに変換されるため、基質として利用できるからであ
る。

本発明の更に有利な点は、上記ヌクレオシドどうしを混
合して用いても効率良く反応が進行するのでＲＮＡを加
水分解して得られるヌクレオチドの５′位を脱リン酸化
したヌクレオシド溶液に、本発明に使用される微生物（
単独で４複数の微生物を混合しても良い）の存在下、５
−メチルウラシルを作用させれば５−メチルウリシンに
変換することもできる点である。

本発ＦＪＡＫ使用される微生物はアクロモバクタ−属、
アシネトバクタ−属、エアロモナス属、アグロバクテリ
ウム属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、バチ
ルス属、ブレビバクテリウム属、セルロモナス属、シト
ロバクタ−属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属
、エンテロバクタ−属、エルビニア属、７２がバクテリ
ウム属、ハフニア属、ロドコッカス属、クレｆジュラ属
、クルイヘラ属、クルチア属、ミクロバクテリウム属、
ミクロコツカス属、ミコプラナ属、ノカルディア属、プ
ラノコツカス属、プロタミノバクター属、プロテウス属
、シュードモナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、サ
ルシナ属、セラチア属、スポロサルシナ属、ストレグト
マイセス属、ビブリオ属、Ｉ？サントモナス属、及びス
タフイａコクカス属に属し、例えば以下のようなもので
ある。

アクａモパクター　ラフティカム　　　　　　　ＦＥＢ
Ｍ　Ｐ−７４０１（Ａｃｈｒｗｎｏｂａａｔｅｒ　ｌａ
ｃｔｌｅｕｍ）アシネトバクタ−ルオフイ− （Ａｃｌｎｅｔｏｂａｅｔｅｒ　１ｗｏｆｆｌ）人ＴＣ
Ｃ９０３６ エアロモナス　サルモエシダ （Ａ＠ｒｏｍｏｔ＋ａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）ア
グロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｌｕｍ　ｔｕｍ＠ｆａｅｌ＠ｎｓ）アルカリ土類
ス　フェカリス （ＡＩａａｌｉｇ＠ｎ＊ｓ　ｆａ＠ｅｍｌ１ｍ）アース
ロバフタ−シンゾレクス （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｓｒ　ｓｌｍｐｌｅｘ　）ＡＴ
ＣＣ１４１７４ ＡＴＣＣ４４５２ ＦＥＢＭ　Ｐ−８４６０ ＦＥＲＭ　Ｐ−１００６１？ バチルス　サーキ為ランス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅｌｒｅｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ９
９６６ ブレビバクテリウム　アセチリカム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ龜ｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｅｕ
ｍ　）ＡＴＣＣ９５４ セルロモナス　フラビｒす （Ｃ＠１１ｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｌａｖ１ｇ＠ｎａ）Ａ
ＴＣＣ４８６ シトロバクタ−フロランブイ （Ｃ１ｔｒｏｂａａｔ＊ｒむｅｕｎｄｌｌ）ＩＦＯ１３
５３９ コリネバクテリウム　アクアチカム （Ｃｏｒｙｎ＊ｂａｅｔ＠ｒｉｕｍ　ａｑｕａＬｌｅｕ
ｍ）ＡＴＣＣ１４６６５ エシェリヒア　コリ （Ｅｍ＠ｈ＠ｒｉｅｈｌａ　ｃｏｌｌ　）ＦＥＲＭ　Ｐ
−９７３６ エンテロバクター　クロアカニ （Ｅｎｔ＠ｒｏｂａｅＬ＠ｒ　ｅｌｏａｃａｓ　）ＡＴ
ＣＣ７２５６ エルビニア （Ｅｒｗｉｎｉａ カロト？う ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ） ＦＥＲＭ　Ｐ−２７６６ フラボバクテリウム　レナナム （Ｆｌａｖｏｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　ｒｈ＊ｎａｎｕｍ）
ＦＥＢＭ　Ｐ−８４５９ ハフニア　アルベイ （Ｈａｆｎｌａ　ａｌｖｅｌ） ＡＴＣＣ９７６０ クレブジエラ　ニ為−モニエ （Ｋｌ＊ｂｓｌｓｌｌａ　ｐｎ＠ｕｍｏｎｉｍｓ）ＡＴ
ＣＣ８３０８ クルイヘラ　シトロバクタ （Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｅｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ＦＥＢＭ
　Ｐ−１００７０ クルチア　シフイー （Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｌ） ＡＴＣＣ６９００ ミクロバクテリウム　ラクチカム （Ｍｉｅｒｏｂａｃｔ＠ｒｌｕｍ　ｌａｅｔｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ８１８０ ミクロコツカス （Ｍｉｃｒｏｅｏｃｅｕｓ ルテウス ｌｕｔ＠ｕｓ　） ＦＥＲＭ　Ｐ−７３９９ ミコプラナ　デイモルファ （Ｍｙｅｏｐｌａｎａ　ｄｌｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４
２７９ ノカルディア　アステａイデス （Ｎｏｃａｒｄｌａ　ａｓｔ＠ｒｏｌｄｅｓ）ＡＴＣＣ
１９２４７ ｆ２ノコッカス　シトレウス （Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅ１ｔｒ＊ｕｓ）ＡＴＣ
Ｃ１５２３４ ｆａタミノバクター　アル？フラバス （ＰｒｏｔａｍｌｎｏｂａｃＬｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖ
ｕｓ）ＡＴＣｏ　　８４５８ プロテウス　ミラビリス （ＰｒｏＬ＠ｕａ　ｍｉｒａｂｉｌｉａ）ＦＥＢＭ　Ｐ
−９５９９ シュードモナス　ロゼオプバリア （Ｐｓ＊ｕｄｏｍｏｎａｉ　ｒｏｓ＠ｏｂｕｂａｌｉａ
）ＦＥＢＭ　Ｐ−９４７１ リゾビウム　メリロティ （Ｒｈｉｚｏｂｌｕｍ　ｍ５ｌｌｌｏｔｌ　）ＦＥＲＭ
　Ｐ−８１９７ ０ドコツカス　ロドクラウス （Ｒｈｏｄｏｅｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｅｈｒｏｕｓ）
ＡＴＣＣ２１２９１ サルモネラ　シ、ットムエレリ （Ｓｍ１ｍａｎ＠１１ａ　ｓｃｈｏｔｔｍｕ＊ｌｌ＠ｒ
ｌ）ＡＴＣＣ８７５９ サルシナ　ルテア （Ｓａｒｅｌｎａ　ｌｕｋ＠ａ） ＦＥＲＭ　Ｐ−７４００ セ？？ア　ルベファシエンス （８＊ｒｒａｔｉａ　　ｒｕｂ＊ｆａｃｉ＊ｎｓ）ＦＥ
ＢＭ　Ｐ−９１３４ スｙｌｌａサルシナ　ウレアエ （８ｐｏｒｅｓａｒｅｉｎａ　ｕｒ＠ａ＠）ＡＴＣＣ７
０５０ スタフィローツカス　シトレウス （８ｔａｐｈｙｒｏｅｓｎｃｕｓ　　ｃ口ｒｅｔｔｓ）
ＩＦＯ３３３２ ストレプトマイセス　タナシェンシス （Ｓｔｒ＠ｐｔｏｍｙ＠＋ｓｓ　ｔａｍａｓｈｌ＊ｎ５
ｌｓ）ＡＴＣＣ１５２３Ｂ ヒフリオ　メチ為二コピー　　　　　　　　ムＴＣＣ７
７０８（Ｖｌｂｒｉｏ　ｍ＠Ｊｓｅｈｎ１ｋｏｖｉｌ　
）キサントモナスシトリ　　　　　　　ＦＥＲＭ　Ｐ−
８４６２（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｅｌＬｒｉ）等が
ある。

これらの微生物を用いて５−メチルウリジンを生成せし
める方法は、微生物の培養中に基質を添加する培養法を
用いても良いし、また培養した菌体あるいはこの処理物
を基質に作用させる酵素法を用いても良い。

培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、ＰｌＳ、Ｆ
ｅ、Ｍｎ等の無機イオン、さらに必要ならばビタミン等
の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスのような有
機窒素源を含有する通常の培地を基本に用いれば良い。

即ち、すメース−１−リン酸から５−メチルウリジンを
生産する場合には、上記基本培地にυダースー１−リン
酸と５−メチルウラシルを適宜添加すればよい。

更に、５−メチルウリジンをヌクレオシドよシ直接生産
する場合には、上記基本培地に各種ヌクレオシド及びリ
ン酸若しくはその塩及び５−メチルウ２シルを添加して
培養すればよい。

上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない、
酵素法を用いる場合の酵素源としては、炭素源、窒素源
、ＰＳＳ、Ｆ・、Ｍｎ等の無機イオン、更に必要ならば
ビタミン等の微量栄養素を含有する培地または蛋白分解
物、若しくは酵母エキスのような有機窒素源を含有する
通常の培地で培養した培養液、さらにこれよシ得た洗浄
菌体が使用できる他に、菌体処理物も使用できる。菌体
処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体の磨砕物、菌
体の超音波処理物、界面活性剤あるいはトルエン等の処
理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、菌体より抽出し
た後、塩析等によシ分離した菌体の蛋白区分の精製物、
更に本菌体および菌体処理物の固定化物等いずれもが使
用できる。培養法を用いる場合でも、酵素法を用いる場
合でも基質として使用するりが−スー１−リン酸、及び
ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、イノシン、ウ
リジン、シチジン、キサントシン）の濃度は１−１００
０ｍＭ程度が適当であシ、リン酸またはその塩の濃度は
上記基質の０．０１−１０倍モル程度が適当である。無
機リン酸の塩は反応の進行を大きく阻害しないものであ
ればいずれを用いてもよく、例えばナトリウム塩、カリ
ウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩等の無機塩、さらにはトリメチルアンモニウム塩等の
有機塩が用いられる。ヌクレオシドから５−メチルウリ
ジンを直接生産する場合でも、リボース−１−リン酸か
ら５−メチルウリジンを生産する場合でも、５−メチル
ウラシルの添加量は上記基質と等モルあるいはそれ以上
が適当で、通常１−１０倍モル程度が適当である。又、
ヌクレオシドよシ直接生産させる場合において、基質の
アデノシン、グアノシン、イノシン、ウリジン、シチジ
ン、キサントシンが反応液中に残ってもよい場合には、
５−メチルウラシルの添加量はこれらの基質の等モル以
下でもよい。

さてこれらを含む水溶液に前記菌体、またはその処理物
を加え、−を４−１０の範囲に調製した後、２０−７０
℃、望ましくは５Ｏ−７０ｔｌ：で靜置あるいは攪拌し
ながら１０分−１０日間保持すると反応が進行し、反応
液中に目的とする５−メチルウリシンが蓄積される。

反応液より５−メチルウリジンを採取する方法は、水等
の溶媒にたいする溶解度を利用した＃）１イオン交換樹
脂や吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。また５
−メチルウリジンの定量は高速液体クロマトグラフィー
を用いる方法で行えばよい。

以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ 酵母エキスｏ、　ｓ　：ｙ７ｔｉｔ、ポリ（ブト７１．
０１１／ｄｉ　。

陶工Φス１．　ＯＩ／ｄｉＳＮａＣｔＯ，５１１／ｄｉ
を含む培地（−７，０）５０ｍＪを５００プ容肩付きフ
ラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン寒天培
地にて３０℃、１６時間前培養した第１表に示す微生物
を１白金耳ずつ接種し、３０℃にて１６時間捏上り培養
した。得られた培養液よシ菌体を遠心分離により分離し
た後、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）で洗
浄し、更に遠心分離することによシ洗浄菌体を調製した
。

上記洗浄菌体を２０　ｍＭのリボース−１−リン酸と２
０ｍＭの５−メチルウリジンを含む０．０５Ｍ）リスバ
ッファー（ｐＨ７，２）１０１１１７に５１７ｄｉにな
るように添加し、６０℃、２４時間反応させた。各反応
液中に生成した５−メチルウリジンの濃度を高速液体ク
ロマトグラフィーをもちいて測定しその結果を第１表に
示し九。

風下余白 実施例２ 実施例１と同様に培養調製した第２表に示す微生物の洗
浄菌体を５０ｍＭのグアノシンと５０ｍＭの５−メチル
ウラシルを含む１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７
，０）１０扉ｌに５ｂ賃になるように添加し、６０℃、
２４時間反応させた。各反応液中に生成した５−メチル
ウリジンを実施例１と同様の方法で測定し、その結果を
第２表に示した。

夙下余白 実施例３ ５−メチルウリジンの高生産株であるフラゴパクテリウ
ムレナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｒｈｅｎ
ａｎｕｍＦＥＲＭ　Ｐ　−８４ｓ　９　）　ｆｉについ
て実施例１同様に培養調製し、その洗浄画体を第３表に
示す５０ｍＭのヌクレオシドと５０ｍＭの５−メチルウ
ラシルを含む１００ｍＭのリン酸バッファー　（ｐ）ｌ
　７．０　）　１０　ｍｌに５１１７ｄｌになるように
添加し、６０℃、２４時間反応させた。各反応液中に生
成した５−メチルウリジンを実施例１と同様の方法で測
定し、その結果を第３表に示した。

双下余白 実施例４ 実施例１と同様の培地を用いて、実施例１と同様の方法
で、３７℃、１６時間培養したフラ？バクテリウム　レ
ナナム（Ｆｌａｖｏｂａｅｔ＠ｒｉｕｍ　ｒｈｅｎａｎ
ｕｍＦＥＲＭ　Ｐ−８４５９）の培養液に予め殺菌した
１１００ｒｎのグアノシンと１００ｍＭの５−メチルウ
ラシルを含む１００ｍＭのリン酸バッファ　−（ＰＨ７
，０）　１００ｍを添加し、更に２４時間培養を続けた
。この培養液中に生成した５−メチルウリジンを実施例
１の方法と同様に定量した結果、３３■／ｄ７！の５−
メチルウリジンが生成していた。

（効果） 本発明の方法は従来の化学合成法に比較して、反応が簡
単で、しかも高収率で目的とする５−メチルウリジンを
製造できる優れた方法である。また、このようにして製
造された５−メチルウリジンは最近世界的に問題となっ
ているエイズ（ＡＩＤＳ）の治療薬として有用なアジド
チミジン（ＡＺＴ）の原料となる。

特許出厘大　味の素株式会社 手続補正書 （１）明繕書第１６頁４行目、 「５−メチルウリ ジン」 を「５−メチルウラシル」 と訂正する。

昭和６３年７１月１５日 １、事件の裏下 昭和６３年特許願第１７３０１９号 ２、発明の名称 ５−メチルウリジンの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　東京都中央区京橋−丁目５＠８号名称　　　
　　（００６）味　　の　　素　　株　　式　　会　　
社代表者　　取締役社長　　歌　１）勝　弘／：＼４Ｊ
Ｉ正指令の日付　　　自発　　　　　　　　　　　　又
５、補正により増加する発明の数　　　なし６、補正の
対策　　　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補正の内
容　　　別紙の通り 手続補正書 平成元年２月１７日 特−１１〒長官殿 １．１１牛の表示 昭和６：３年特：ＩＩ−頓第１７３０１９号２、餓明の
名称 ５−メチルウリジンの製造方法 ：（、ン＋ｂｉＥをする各 １’；Ｉ’ｔとの関係 １１所

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクロモバクター属、アシネトバクター属、エア
   ロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属
   、アースロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリウ
   ム属、セルロモナス属、シトロバクター属、コリネバク
   テリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エ
   ルビニア属、フラボバクテリウム属、ハフニア属、ロド
   コッカス属、クレブジエラ属、クルイヘラ属、クルチア
   属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプ
   ラナ属、ノカルディア属、プラノコッカス属、プロタミ
   ノバクター属、プロテウス属、シュードモナス属、リゾ
   ビウム属、サルモネラ属、サルシナ属、セラチア属、ス
   ポロサルシナ属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、
   キサントモナス属、及びスタフィロコッカス属に属し、 （イ）リボース−１−リン酸若しくはその塩及び（ロ）
   ５−メチルウラシル から５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物
   を水性媒体中で （イ）リボース−１−リン酸若しくはその塩及び（ロ）
   ５−メチルウラシルに作用せしめることを特徴とする５
   −メチルウリジンの製造方法。
2. （２）アクロモバクター属、アシネトバクター属、エア
   ロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属
   、アースロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリウ
   ム属、セルロモナス属、シトロバクター属、コリネバク
   テリウム属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エ
   ルビニア属、フラボバクテリウム属、ハフニア属、ロド
   コッカス属、クレブジエラ属、クルイヘラ属、クルチア
   属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプ
   ラナ属、ノカルディア属、プラノコッカス属、プロタミ
   ノバクター属、プロテウス属、シュードモナス属、リゾ
   ビウム属、サルモネラ属、サルシナ属、セラチア属、ス
   ポロサルシナ属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、
   キサントモナス属、及びスタフィロコッカス属に属し、 （イ）ヌクレオシド、 （ロ）無機リン酸若しくはその塩及び （ハ）５−メチルウラシル から５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物
   を水性媒体中で （イ）ヌクレオシド、 （ロ）無機リン酸若しくはその塩及び （ハ）５−メチルウラシル に作用せしめることを特徴とする５−メチルウリジンの
   製造方法。
3. （３）ヌクレオシドがアデノシン、グアノシン、イノシ
   ン、ウリジン、シチジン又はキサントシンであることを
   特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の製造方法。