JPH0357760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は次式で示すリボフラノシルトリアゾー
ル誘導体を微生物の作用を利用して製造する方法
に関する。

【式】 （式中Ｒはヒドロキシル、アミノ、又はアル
コキシル基を示す。） 式中Ｒがアミノ基であるヴイラゾール（１−β
−Ｄ−Ribofuranosyl−１，２，４−triazale−
３−carboxamide）等のリボフラノシルトリア
ゾール誘導体は抗ウイルス作用を有し医薬として
利用できる化合物であり、従来、これを製造する
方法としては化学合成法の他に発酵法により製造
する方法も知られている（特公昭54−17830号公
報）。この発酵法による方法は、特定の微生物を
前駆物質であるトリアゾール誘導体を含む培地で
培養して培養液中にリボフラノシルトリアゾール
誘導体を生成せしめる方法であるが、本発明者等
は微生物の作用を利用してより効率的に製造する
方法を開発することを目的として鋭意研究を重ね
た結果、１，２，４−トリアゾール誘導体とリボ
ヌクレオシド類又はリボース−１−リン酸を含む
水溶液に特定の微生物を非増殖条件下で作用させ
ると目的とするリボフラノシルトリアゾール誘導
体が効率的に生合成されることを発見し本発明を
完成するに至つた。 以下、本発明について説明する。 本発明で使用する微生物は１，２，４−トリア
ゾール誘導体とリボヌクレオシド類又はリボース
−１−リン酸に作用してリボフラノシルトリアゾ
ール誘導体を生成せしめる能力を有する微生物が
使用され、更に詳細には、シユードモナス
（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属、サルモネラ
（Salmonella）属、シトロバクター
（Citrobacter）属、エシエリヒア（Escheriehia）
属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、アル
カリゲネス（Alcaligenes）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、エーロモナス
（Aeromonas）属、アースロバクター
（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia）
属、エルビニア（Erwinia）属、プロテウス
（Proteus）属、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、セルロモナス
（Cellulomonas）属、キサントモナス
（Xanthomonas）属、クレブシエラ
（Klebsiella）属、ミクロコツカス
（Micrococcus）属、バシルス（Bacillus）属又
はバクテリウム（Bacterium）属、キヤンジダ属
（Candida）、サツカロミセス（Saccharomyces）
属、スタヒロコツカス（Staphylococcur）属、
ビブリオ（Vibrio）属、マイコプラナ
（Mycoplana）属に属し、トリアゾール誘導体と
リボヌクレオシド類又はリボース−１−リン酸よ
りリボフラノシルトリアゾール誘導体を合成する
能力を有する微生物が非増殖条件下で使用され
る。更に具体的には次のような微生物を挙げるこ
とができる。即ち、

【表】

【表】 これら微生物の菌体を得る方法は、炭素源、窒
素源、無機イオン及び更に必要ならばビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて
培養液すればよい。培養方法についても特別な方
法を要せず、従来知られている方法が適宜採用さ
れる。 菌体としては、上記の方法で得られた培養液そ
のまま、或は洗滌菌体が使用できる他に、菌体処
理物も使用できる。菌体処理物としては、アセト
ン乾燥菌体、菌体の摩砕物、菌体の超音波処理
物、界面活性剤又はトルエン等に接触せしめた菌
体、リゾチーム等の酵素で処理した菌体、菌体よ
り抽出した後、塩析等により分離した菌体の蛋白
区分、本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精製
物、更に上記菌体または、菌体処理物の天然ある
いは合成ポリマー等による固定化物等いずれもが
使用できる。 本発明で使用するトリアゾール誘導体は式(2)に
示す１，２，４−トリアゾール誘導体が使用され
る。 式(2)

【式】 〔式中Ｒはヒドロキ シ、アミノ又はアルコキシル基を示す。〕 本発明で使用するリボヌクレオシド類としては
ウリジン、シチジン、イノシン、アデノシン、グ
アノシン等の天然リボシド等が用いられ、これら
に関連する化合物でヌクレオシドホスホリラーゼ
の作用でリボース−１−リン酸を生成するもので
あればすべて使用することができる。添加量は
0.1％以上、望ましくは0.5％であり、0.1％以下で
は反応が遅く、効率が低くて実用的ではない。 これら１，２，４−トリアゾール誘導体とリボ
ヌクレオシド類又はリボース−１−リン酸を含む
水溶液に前記微生物菌体又はその処理物を加え、
PHを４〜10の範囲に調整した後、50〜70℃で適宜
撹拌しながら、10分〜20時間保持すると反応が進
行し、該反応液中に目的とするリボフラノシルト
リアゾール誘導体が著量蓄積される。 反応液よりリボフラノシルトリアゾール誘導体
を採取する方法は、水等の溶媒に対する溶解度差
を利用したり、イオン交換樹脂を用いる等の方法
で行うことができる。 以下、実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、内
エキス1.0ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／dlを含み、PH7.2
に調節した液体培地の５mlを大型試験官に入れ殺
菌した。この培地に第１表に示す微生物を１白金
耳づつ接種し、30℃にて24時間振盪培養した。得
られた培養液より菌体を遠心分離して集め、生理
食塩水にて洗滌後0.05M燐酸緩衝液（PH7.0）に
懸濁した（50mg−湿量／ml）。 上記の菌体懸濁液0.5mlをウリジン2.0ｇ／dl、
１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミ
ド0.2ｇ／dl、KH₃PO₄0.8ｇ／dlを含みPH7.0に調
節した反応液0.5mlに加えた。これを60℃に10時
間保ち、その間時々撹拌し、次いで100℃にて５
分間加熱した。 各反応液中に生成蓄積したヴイラゾールは、高
速液体クロマトグラフイ（日立製作所(株)635型を
使用）により標品ヴイラゾールの保持時間と一致
し、ヴイラゾールの生成が確認された。同様にウ
リジンの代りにイノシン（0.5ｇ／dl）を用いて
反応を行い、ヴイラゾールの生成を確認し、つい
でまた高速液体クロマトグラフイにより定量した
反応液中の蓄積量は第１表に示すとおりであつ
た。

【表】 実施例 ２ 実施例１において、ウリジンの代りにリボース
−１−リン酸を用いて同様の反応を行つた。この
場合、菌体懸濁液（50mg湿重／ml）を超音波処理
（５分、氷冷中）を行い酵素源とした。生成した
ヴイラゾールは高速液体クロマトグラフイーによ
り、定性し、生成量を定量した。その結果を第２
表に示した。

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した液体培地の100mlを500ml容肩
付フラスコに入れ殺菌した。これにエルビニア・
ヘルビコラATCC14536を接種し30℃に保ちつつ、
36時間振盪した。遠心分離にて菌体を集め、５ｇ
（湿重）を10mlのリン酸バツフアー（PH7.0）に懸
濁し、15分間の超音波処理を行つた。遠心分離後
得られた上清10mlを１，２，４−トリアゾール−
３−カルボキシアミド100mg、ウリジン500mg、
KH₂PO₄350mgを含み、PH7.0に調節した反応液90
ml中に添加した。これを60℃に10時間保つた。反
応後、100℃、５分間処理した後、反応液より遠
心分離してタンパクを除き上清を濃縮し、濃縮液
をセフアデツクスＧ−10のカラムにチヤージレ、
水にて溶出した。溶出液を濃縮し冷所に置き結晶
を析出させた。得られた結晶を水から再結し135
mgの結晶を得た。 このものは、ヴイラゾールの標品とNMRスペ
クトル、赤外線吸収スペクトル、UVスペクトル
が一致し、ヴイラゾールと固定された。 実施例 ４ 実施例４に示した方法においてバチルス・ブレ
ビスATCC8185を培養して菌体を集め凍結乾燥し
た。 実施例３のウリジンの代りにイノシンを添加し
た。その結果15mgの結晶を得た。れはUVスペク
トル、NMRスペクトル、IRスペクトル、元素分
析値よりヴイラゾールと同定した。 実施例 ５ コリネバクテリウム・ミシガネンスATCC7429
を実施例３と同様の方法で培養し、遠心分離して
湿潤菌体を得た。この菌体500mgを１，２，４−
トリアゾール誘導体を20mgとリボース−１−リン
酸を10mg含む10mMトリス緩衝液（PH7.0）1.0ml
に加え60℃に10時間保持し、その間時々撹拌し
た。これを100℃で５分間加熱した後、反応液中
に生成された各リボフラノシルトリアゾール誘導
体を高速液体クロマトグラフイーにより同定し、
その蓄積量を求めた。その結果、式(2)中Ｒが、ヒ
ドロキル基アミノ基、又はメトキシ基である１，
２，４−トリアゾール誘導体を用いた時は、夫々
の誘導体リボースが転位結合した化合物、即ち、
１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリ
アゾール−３−カルボン酸、１−β−Ｄ−リボフ
ラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カル
ボキサミド（ヴイラゾール）、及び１−β−Ｄ−
リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３
−カルボキサメチルエステルが夫々0.2mg／ml、
6.5mg／ml、0.1mg／ml生成されていることが確認
された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の式〔２〕で表わされる１，２，４−ト
   リアゾール誘導体及び0.1％以上のリボヌクレオ
   シド類又はリボース−１−リン酸を含み実質的な
   量の炭素源を含まない水溶液に、シユードモナス
   属、フラボバクテリウム属、サルモネラ属、シト
   ロバクター属、エシエリヒア属、スポロサルシナ
   属、アルカリゲネス属、エンテロバクター属、エ
   ーロモナス属、アースロバクター属、ブレビバク
   テリウム属、セラチア属、エルビニア属、プロテ
   ウス属、コリネバクテリウム属、セルロモナス
   属、キサントモナス属、クレブシエラ属、ミクロ
   コツカス属、バチルス属、バクテリウム属、キヤ
   ンジダ属、サツカロミセス属、スタヒロコツカス
   属、クルチア属、ビブリオ属、マイコプラナ属に
   属し、式(2)で表される１，２，４−トリアゾール
   誘導体とリボヌクレオシド類又はリボース−１−
   リン酸から式(1)で表されるリボフラノシルトリア
   ゾール誘導体を生成する能力を有する微生物を非
   増殖条件下で55℃〜70℃で作用して該水溶液中に
   下記の式〔１〕で示すリボフラノシルトリアゾー
   ル誘導体を生成せしめることを特徴とするリボフ
   ラノシルトリアゾール誘導体の製造法。 式〔１〕 【式】〔式中Ｒはヒドロキシ、ア ミノ又はアルコキシル基を示す。〕 式〔２〕 【式】〔式中Ｒはヒドロキシ、アミ ノ又はアルコキシル基を示す。〕