JPS6214279B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はプリンアラビノシド、および２−・
６−および／または８−置換プリンアラビノシド
（以下プリンアラビノシドと総称する）の製造法
に関する。 プリンアラビノシドはアデニンアラビノシドの
ように抗ウイルス作用及び制癌作用があるものが
多く、医薬としての用途がある。プリンアラビノ
シドの製造方法として、いくつかの報告がある
が、いずれも満足できる収率が得られていない。 本発明者らはプリンアラビノシドのより簡易な
製造法を開発すべく研究した結果、シユードモナ
ス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属、アクロモバクター
（Achromobacter）属、サルモネラ
（Salmonella）属、シトロバクター
（Citrobacter）属、エツシエリヒア
（Escherichia）属、エンテロバクター
（Enterobacter）属、エーロモナス
（Aeromonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）
属、セラチア（Serratia）属、エルビニア
（Erwinia）属、キサントモナス
（Xanthomonas）属、またはハラニア（Hafnia）
属の微生物のうちより、プリンまたは２−・６−
および／または８−置換プリン又はそのヌクレオ
シドもしくはヌクレオチド（以下プリン化合物と
総称する）とアラビノース−１−リン酸とよりプ
リンアラビノシドを生成する能力を有する微生物
を見い出した。この発明はこの知見に基いて更に
研究の結果完成されたものである。 本発明の２−・６−および／または８−置換プ
リンとは、プリンの２−・６−および／または８
−位が塩素、フツ素等のハロゲン原子、水酸基、
アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基、メチ
ル、エチル、プロピル等の低級アルキル基、低級
アルコキシ基、アリール基、アラルキル基、チオ
ール基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル
基、アルキルスルフエニル基、カルボキシル基、
アルコキシカルボニル基、ニトロ基等により置換
されたものである。 本発明の微生物としては具体的には以下のもの
がある。

【表】

【表】 これらの微生物をプリン化合物とアラビノース
−１−リン酸とに作用せしめる方法は、水性反応
液中にてこれらの微生物菌体またはその処理物と
上記の原料を接触せしめればよい。 これらの微生物の菌体を得る方法は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび更に必要ならばビタミン
等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用い
て培養すればよい。培養方法についても特別な方
法を要せず、従来知られている方法が適宜採用さ
れる。 菌体としては、上記の方法で得られた培養液そ
のまま、あるいは洗滌菌体が使用できる。菌体処
理物としてはアセトン乾燥菌体、菌体の摩砕物、
菌体の超音波処理物、界面活性剤またはトルエン
等に接触せしめた菌体、リゾチーム等の酵素に接
触せしめた菌体、塩析等により分離した菌体の蛋
白区分、本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精
製物更に上記菌体または菌体処理物の固定化物等
いずれもが使用できる。 これらの微生物の菌体またはその処理物をプリ
ン化合物とアラビノース−１−リン酸に作用せし
めるには、水性反応液中にこれらを溶解またはけ
ん濁し、好ましくは温度10ないし70℃に、PH４な
いし10に暫時保てばよい。この間必要ならば溶液
またはけん濁液を適宜撹拌する。 かくして反応液中にはプリンアラビノシドが著
量生成蓄積される。 反応液よりプリンアラビノシドを採取する方法
は水等の溶媒に対する溶解度差を利用したり、イ
オン交換樹脂を用いる等の方法で行うことができ
る。 実施例 １ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、肉
エキス0.5ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／dlを含み、PH7.2
に調節した液体培地の５mlを大型試験管に入れ殺
菌した。この培地に第一表に示す微生物を１白金
耳づつ接種し、30℃にて36時間振盪培養した。得
られた培養液より菌体を遠心分離して集め、生理
食塩水にて洗滌後0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に
けん濁した（50mg−湿量／ml）上記の菌体けん濁
液0.5mlを、アラビノース−１−リン酸（バリウ
ム塩）0.8ｇ／dl、ヒポキサンチン0.2ｇ／dl、
KH₂PO₄0.05ｇ／dlを含みPH7.5に調節した反応液
0.5mlに加えた。これを60℃に16時間保ち、その
間時々撹拌し、ついで100℃に５分間加熱した。 各反応液中に生成蓄積したプリンアラビノシド
は高速液体クロマトグラフイ（日立製作所(株)635
型を使用）によりヒポキサンチンアラビノシド標
品の保持時間と一致し、ヒポキサンチンアラビノ
シドと同定された。また高速液体クロマトグラフ
イにより定量した反応液中の蓄積量は第一表に示
すとおりであつた。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した液体培地の100mlを500ml容肩
付フラスコに入れ殺菌した。これにエーロモナ
ス・サルモニシダATCC14174を接種し、30℃に
保ちつつ36時間振盪した。 培養液より菌体を遠心分離して集め、その２ｇ
（湿重）をピポキサンチン100mg、アラビノース−
１−リン酸（バリウム塩）800mg、KH₂PO₄50mg
を含みPH7.5に調節した反応液100ml中に添加し
た。これを60℃に15時間保つた。 反応液より遠心分離して菌体を除き、上清を濃
縮し、濃縮液をアニオン交換樹脂（「ダウエツク
ス１×４」）に通し、ついで0.1N蟻酸アンモニウ
ム（PH4.5）にて溶出し、溶出液を「セフアテツ
クスＧ−10」に通した。ついで、水にて溶出し溶
出区分を集めた。溶出液（100ml）を濃縮し、メ
タノールを添加して冷所に置き結晶を析出させ
た。得られた結晶を水から再結し、83mgの結晶を
得た。 このものは、ヒポキサンチンアラビノシドの標
品とNMRスペクトル、赤外線吸収スペクトル、
紫外線吸収スペクトルが一致し、ヒポキサンチン
アラビノシドと同定した。 実施例 ３ クレブシエラ・ニユーモニアATCC9621を実施
例２に示した方法で培養し、培養液より菌体を遠
心分離により集めた。 菌体２ｇ（湿重）／dl、アデニン100mg／dl、
アラビノース−１−リン酸（バリウム塩）800
mg／dl、KH₂PO₄50mg／dlを含みPH7.5に調節した
反応液100mlを60℃に15時間保つた。反応液より
菌体を除き、20ml迄濃縮し、これを冷却して一夜
静置した。得られた結晶を水から再結し、125mg
の結晶を得た。このもののNMRスペクトル、赤
外線吸収スペクトルおよび紫外線吸収スペクトル
はアデニンアラビノシド標品のそれと一致し、ア
デニンアラビノシドと同定された。 実施例 ４ エンテロバクター・エーロゲネスATCC13048
の菌体２ｇ（湿重）／dl、アラビノース−１−リ
ン酸（バリウム塩）30ｍＭ、KH₂PO₄5ｍＭ、第
二表に示すプリン各10ｍＭを含み、PH7.5に調節
した反応液１mlを試験管に入れ、60℃に８時間保
つた。 各反応液より、分取用高速液体クロマトグラフ
イにより、新らしく生じた紫外部吸収を有する画
分を採取した。これを濃縮し、エタノールを加え
て結晶を析出せしめた。各結晶のNMRスペクト
ルよりこのものは、各原料のプリン塩基に対応す
るプリンアラビノシドであることを確認した。 生成物の分子吸光係数より、プリンよりの転換
率を計算した。結果を第二表に示す。

【表】 実施例 ５ クレブシエラ・ニユーモニアATCC9621の菌体
を実施例２の方法で得、これを100ｇ（湿重）／
dlの濃度になるように0.05M燐酸緩衝液（PH
7.5）にけん濁し、これを超音波にさらして菌体
を破壊した。遠心分離により沈澱物を除き、上清
を粗酵素液とした。 粗酵素液10ml／dl、アラビノース−１−リン酸
（バリウム塩）800mg／dl、イソシン200mg／dl、
KH₂PO₄30mg／dlを含みPH7.5に調節した反応液
100mlを60℃に15時間保つた。反応液より遠心分
離により沈澱物を除き、上清をアニオン交換樹脂
（「ダウエツクス」１×４）に通し、ついで0.3N
蟻酸により溶出し、溶出液を「セフアデツクスＧ
−10」にチヤージし、水にて濃度溶出を行つた。
溶出区分よりヒポキサンチンアラビノシド８mgの
結晶を得た。 実施例 ６ 1.0ml当り実施例５に示す粗酵素0.2ml、アラビ
ノース−１−リン酸（バリウム塩）20mg、
KH₂PO₄2mg、下記プリン２mgを含む反応液1.0ml
（PH7.5）を60℃に15時間静置し、ついで100℃に
５分間加熱した。反応液より沈澱を除き、これを
ペーパークロマトグラフイに展開した。ウラシル
アラビノシドおよび反応液に添加したプリン以外
の紫外部吸収を有するスポツトを切抜き、
0.1NHClにて抽出した。抽出液に塩酸を加えて６
規定とし、10分間煮沸した。この液にはオルシノ
ール−塩化第二鉄反応によりアラビノースが検出
された。このことからプリンアラビノシドが反応
液中に生成されたことが推測される。 ６−クロロプリン ６−メルカプトプリン ６−メトキシプリン ６−チオメチルプリン ２−クロロヒポキサンチン ２・６−ジクロロプリン ２−アミノプリン ２−アミノ−６−メルカプトプリン ２−チオメチル−ヒポキサンチン ６−ニトロプリン ６−カルボキシプリン ６−メトキシプリン ２−クロロ−６−メトキシプリン ８−クロロアデニン ８−ブロモアデニン 実施例 ７ アラビノース−１−リン酸（バリウム塩）800
mg、AMP・2Na・6H₂O450mgを25ｍＭのリン酸緩
衝液（PH7.5）50mlに溶解し、実施例５にて得た
粗酵素液50mlを添加し、60℃に24時間保持した。
反応後、100℃にて５分間加熱し、ついで遠心分
離にて蛋白を除き、その上清を４℃にて２日間冷
却した。生成した沈澱を集めて、水より再結し
108mgのアデニンアラビノシドの結晶を得た。 実施例 ８ アラビノース−１−リン酸（バリウム塩）800
mg、GMP・2Na・6H₂O450mgを25ｍＭのリン酸緩
衝液（PH7.2）50mlに溶解し、実施例５にて得た
粗酵素液50mlを添加し、60℃に24時間保持した。
反応後、100℃に５分間加熱し、遠心分離にて蛋
白を除き、その上清を「ダウエツクス１×４」
（アンモニア型にチヤージし、PH7.5のギ酸アンモ
ニウム（0.1M）にて洗滌後、PH4.0のギ酸アンモ
ニウム（0.1M）にて溶出した。溶出液を濃縮し
「セフアデツクスＧ−10」にチヤージし、水にて
展開した。グアニンアラビノシド相当区分を集
め、濃縮し、冷却することによつて結晶を得、水
から再結することによつて、53.6mgの結晶を得
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式で表わされるプリン化合物及びアラ
   ビノース−１−リン酸より、一般式で表わされ
   るプリンアラビノシドを生成する能力を有するシ
   ユードモナス（Pseudomonas）属、フラボバク
   テリウム（Flavobacterium）属、アクロモバク
   ター（Achromobacter）属、サルモネラ
   （Salmonella）属、シトロバクター
   （Citrobacter）属、エツシエリヒア
   （Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）
   属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エー
   ロモナス（Aeromonas）属、セラチア
   （Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、キサ
   ントモナス（Xanthomonas）属、またはハフニ
   ア（Hafnia）属の微生物の作用により、一般式
   で表わされるプリン化合物及びアラビノース−１
   −リン酸より一般式で表わされるプリンアラビ
   ノシドを生成せしめることを特徴とするプリンア
   ラビノシドの製造方法。 一般式 （Ｘは水素原子、水酸基、アミノ基、メトキシ
   基、ハロゲン原子又はチオメチル基であり、Ｙは
   水素原子、水酸基、アミノ基、メルカプト基、ハ
   ロゲン原子、メトキシ基又はカルボキシル基であ
   り、Ｚは水素原子であるが、Ｙがアミノ基である
   とき、ハロゲン原子であり、Ａは水素原子、リボ
   フラノシル基又は5′−ホスホリボフラノシル基で
   ある。） 一般式 （Ｘ、Ｙ及びＺは、一般式に同じ）