JPS6215200B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は２−および／または６−置換−プリ
ンアラビノシド（以下プリンアラビノシド類と総
称する）の製造法に関する。 プリンアラビノシド類はアデニンアラビノシ
ド、グアニンアラビノシドのように抗ウイルス作
用及び制癌作用があるものが多く、医薬としての
用途がある。プリンアラビノシド類の製造方法と
して、いくつかの報告があるが、いずれも満足で
きる収率が得られていない。 本発明者らはプリンアラビノシド類のより簡易
な製造法を開発すべく研究した結果、シユードモ
ナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属、アクロモバクター
（Achromobacter）属、サルモネラ
（Salmonella）属、シトロバクター
（Citrobacter）属、エツシエリヒア
（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）
属、エンテロバクター（Entero−bacter）属、エ
ーロモナス（Aeromonas）属、セラチア
（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、キサ
ントモナス（Xanthomonas）属、またはハフニ
ア（Hafnia）属の微生物のうちより、２−およ
び／または６−置換プリンのデオキシリボシド又
はデオキシリボチド（以下プリン化合物と総称す
る。）とシトシンアラビノシド、シトシンアラビ
ノチド、ウラシルアラビノシド及びウラシルアラ
ビノチドからなるアラビノース供与体とよりプリ
ンアラビノシド類を生成する能力を有する微生物
を見い出した。この発明はこの知見に基づいて更
に研究の結果完成されたものである。 本発明の２−および／または６−置換プリンと
は、プリンの２−および／または６−位が塩素、
フツ素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、モ
ノまたはジアルキルアミノ基、メチル、エチル、
プロピル等の低級アルキル基、低級アルコキシ
基、アリール基、アラルキル基、チオール基、ア
ルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アルキル
スルフエニル基、カルボキシル基、アルコキシカ
ルボニル基、ニトロ基等により置換されたもので
ある。 本発明の微生物としては具体的には以下のもの
がある。 シユードモナス・スツゼエリ FERM−P4170 （Pseudomonas stutzeri） フラボバクテリウム・レーナヌム CCM298 （Flavobacterium rhenanum） フラボバクテリウム・アシドフイクム
ATCC8366 （Flavobacterium acidoficum） フラボバクテリウム・プロテウス ATCC12841 （Flavobacterium proteus） アクロモバクター・ラクチウム CCM69 （Achromobacter lactium） サルモネラ・チフイムラム FERM−P3753 （Salmonella typhimurum） クレブシエラ・ニユーモニア ATCC9621 （Klebsiella pneumoniae） エルヴイニア・アミロバラ CCM1017 （Erwinia amylovara） エルヴイニア・ヘルビコラ ATCC14537 （Erwinia herbicola） ハフニア・アルベイ IFO3731 （Hafnia alvei） （バクテリウム・カダベリス （Bacterium cadaveris）） キサントモナス・シトリー FERM−P3396 （Xanthomonas citri） シトロバクター・フロインデイー ATCC8090 （Citrobacter freundii） シトロバクター・フロインデイー ATCC6750 エツシエリヒア・コリ ATCC9637 （Escherichia coli） エツシエリヒア・オーレツセンス ATCC12814 （Escherichia auresciens） エンテロバクター・エーロゲネス ATCC13048 （Enterobacter aerogenes） セラチア・リクイフアシエンス ATCC14460 （Serratia liquefaciens） エーロモナス・サルモニシダ ATCC14174 （Aeromonas salmonicida） エーロモナス・パンクタータ ATCC11163 （Aeromonas punctata） セラチア・マルセツセンス IFO3046 （Serratia marcescens） エルヴイニア・カロトボーラ CCM872 （Erwinia carotovora） これらの微生物をプリンデオキシリボンド又は
プリンデオキシリボチドと、ピリミジンアラビノ
シド又はピリミジンアラビノチドとに作用せしめ
る方法は、水性反応液中にてこれらの微生物菌体
またはその処理物と上記の原料を接触せしめれば
よい。 これらの微生物の菌体を得る方法は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび更に必要ならばビタミン
等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用い
て培養すればよい。培養方法についても特別な方
法を要せず、従来知られている方法が適宜採用さ
れる。 菌体としては、上記の方法で得られた培養液そ
のまま、あるいは洗滌菌体が使用できる。菌体処
理物としてはアセトン乾燥菌体、菌体の摩砕物、
菌体の超音波処理物、界面活性剤またはトルエン
等に接触せしめた菌体、リゾチーム等の酵素に接
触せしめた菌体、塩析等により分離した菌体の蛋
白区分、本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精
製物更に上記菌体または菌体処理物の固定化物等
いずれもが使用できる。 これらの微生物の菌体またはその処理物をプリ
ン化合物とアラビノース供給体とに作用せしめる
には水性反応液中にこれらを溶解またはけん濁
し、好ましくは温度10乃至70℃に、PH４乃至10に
暫時保てばよい。この間必要ならば溶液またはけ
ん濁液を適宜撹拌する。 かくして反応液中にはプリンアラビノシド類が
著量生成蓄積される。 反応液よりプリンアラビノシド類を採取する方
法は水等の溶媒に対する溶解度差を利用したり、
ノニオン交換樹脂を用いる等の方法で行うことが
できる。 実施例 １ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、肉
エキス0.5ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／dlを含み、PH7.2
に調節した液体培地の５mlを大型試験管に入れ殺
菌した。この培地に第１表に示す微生物を１白金
耳づつ接種し、30℃にて36時間振盪培養した。得
られた培養液より菌体を遠心分離して集め、生理
食塩水にて洗滌後0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に
けん濁した（50mg−湿量／ml）。 上記の菌体けん濁液0.5mlを、ウラシルアラビ
ノシド0.5ｇ／dl、デオキシイノシン0.4ｇ／dl、
KH₂PO₄1.0ｇ／dlを含みPH7.5に調節した反応液
0.5mlに加えた。これを60℃に15時間保ち、その
間時々撹拌し、ついで100℃に５分間加熱した。 各反応液中に生成蓄積したプリンアラビノシド
は高速液体クロマトグラフイ（日立製作所(株)635
型を使用）によりヒポキサンチンアラビノシド標
品の保持時間と一致し、ヒポキサンチンアラビノ
シドと同定された。また高速液体クロマトグラフ
イにより定量した反応液中の蓄積量は第１表に示
すとおりであつた。

【表】

【表】 実施例 ２ クレブシーラ・ニユーモニエATCC9621を実施
例１と同様の方法で培養し、培養液より菌体を遠
心分離にて集めた。 菌体５ｇ（湿重）／dl、デオキシアデノシン
200mg／dl、ウラシルアラビノシド800mg／dl、
KH₂PO₄50ft／dlを含み、PH7.2に調節した反応液
100mlを60℃、48時間保つた。反応後100℃、５分
間処理し、遠心分離にて除菌した。上清を約50ml
にまで濃縮し０℃氷冷して一夜放置した。生成し
た沈澱を集め、水より再結晶化して85mgのアデニ
ンアラビノシドを得た。本化合物のNMRスペク
トル、UVスペクトル、IRスペクトルは、標品ア
デニンアラビノシドのそれと一致した。 実施例 ３ 大豆タンパク加水分解物50ｇ、酵母エキス２ｇ
を含み、PH７に調整した培地１に、クレブシー
ラ・ニユーモニエATCC9621を接種し、30℃にて
24時間培養し、菌体15ｇ（湿重）を得た。この菌
体を25ｍＭのリン酸バツフアー（PH7.2）50mlに
けん濁し、超音波細胞破砕機にて20分間処理し、
遠心分離することにより上清を得、粗酵素液とし
た。 シトシンアラビノシド730mg、dGMP・2Na・
7H₂O 530mg 25ｍＭのリン酸バツフアー（PH
7.2）50mlに溶解し、上記粗酵素液50mlを加え
て、60℃に24時間保つた。反応後100℃５分間の
熱処理を行い、遠心分離にて蛋白を除き、その上
清を「ダウエツクス１×４」（アンモニア型）に
チヤージし、PH7.5のギ酸アンモニウム（0.1M）
にて洗浄後、PH4.0のギ酸アンモニウム（0.1M）
にて溶出した。溶出液を濃縮し「セフアデツクス
Ｇ−10」にチヤージし、水にて展開した。グアニ
ンアラビノシド相当区分を集め、濃縮し冷却する
ことによつて結晶を得、水より再結して36mgの結
晶を得た。 dAMPについても同様の反応を行い、アデニン
アラビノシド75mgを得た。 実施例 ４ 実施例３と同様にして得た菌体５ｇ（湿重）を
ウラシルアラビノシド750mg、６−メルカプトプ
リンデオキシリボシド200mg、KH₂PO₄340mgを含
有する反応液100ml（PH7.0）にけん濁し、60℃に
て48時間保つた。反応後100℃に５分間保ち、つ
いで遠心分離にて菌体を除いた。上清を「ダウエ
ツクス」１×４（OH型）にチヤージし、PH7.5の
酢酸アンモニウムにて洗浄し、PH4.0にて溶出す
る区分を集めて濃縮した。濃縮液約20mlを「セフ
アデツクス」Ｇ−10にチヤージし、水にて展開し
た。最初に溶出された区分を濃縮乾固した。乾固
物を熱水に溶解し冷却することによつて沈澱物32
mgを得た。本化合物は、NMRスペクトル、UVス
ペクトル、IRスペクトルより、６−メルカプト
プリンアラビノシド標品と一致することを確認し
た。 チオグアニンデオキシリボシドについても同様
の反応を行い、チオグアニンアラビノシド13mgを
得た。 実施例 ５ クレゴシーラ・ニユーモニエATCC9621の菌体
を実施例１の方法で得、これを100ｇ（湿重）／
dlの濃度になるように0.05M燐酸緩衝液（PH
7.5）にけん濁し、これを超音波にさらして菌体
を破壊した。遠心分離により沈澱物を除き、上清
を粗酵素液とした。 粗酵素液10ml／dl、シトシンアラビノシド−
5′−モノリン酸500mg／dl、デオキシイノシン265
mg／dl、KH₂PO₄30mg／dlを含みPH7.5に調節した
反応液100mlを60℃に15時間保つた。反応液より
遠心分離により沈澱物を除き、上清をカチオン交
換樹脂（「クロモビーズ」Ｃ−２）に通し、つい
で0.3Nギ酸により溶出し、溶出液をアニオン交
換樹脂（「ダウエツクス」１×４）にチヤージ
し、PH９乃至３のギ酸アンモニウムにて濃度勾配
溶出を行つた。溶出区分よりヒポキサンチンアラ
ビノシド8.5mgの結晶を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式で示すプリン化合物と、シトシンア
   ラビノシド、シトシンアラビノチド、ウラシルア
   ラビノシド及びウラシルアラビノチドのいずれか
   １または２以上からなるアラビノース供与体とよ
   り、一般式で示すプリンアラビノシドを生成す
   る能力を有するシユードモナス
   （Pseudomonas）属、フラボバクテリウム
   （Flavobacterium）属、アクロモバクター
   （Achromobacter）属、サルモネラ
   （Salmonella）属、シトロバクター
   （Citrobacter）属、エツシエリヒア
   （Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）
   属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エー
   ロモナス（Aeromonas）属、セラチア属
   （Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、キサ
   ントモナス属（Xanthomonas）属、またはハフ
   ニア（Hafnia）属の微生物の作用により、一般式
   で示すプリン化合物と、前記アラビノース供与
   体とを反応せしめて一般式で示すプリンアラビ
   ノシドを生成せしめることを特徴とするプリンア
   ラビノシド類の製造方法。 一般式 （Ｘは水素原子又はアミノ基であり、Ｙは水酸
   基、アミノ基又はメルカプト基であり、Ｚはデオ
   キシリボシル基又はホスホデオキシルボシル基で
   ある。） 一般式 （Ｘ及びＹは一般式に同じ）