JPS6210157B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はプリンアラビノシド類の製造法に関
する。 プリンアラビノシド類にはアデニンアラビノシ
ド、グアニンアラビノシド等のように抗ウイルス
作用あるいは制癌作用等があるものが多く、医薬
としての用途がある。プリンアラビノシドの製造
方法として、いくつかの報告があるが、いずれも
満足できる結果が得られていない。 本発明者らはこのようなプリンアラビノシドの
より簡易な製造法を開発すべく研究した結果、プ
ロテウス（Proteus）属に属する微生物よりＤ−
アラビノフラノース−１−リン酸及び一般式に
示すピリミジン塩基のアラビノシド誘導体及びア
ラビノチド誘導体より選ばれるアラビノフラノー
ス供与体と、アデニン、アデノシン、デオキシア
デノシン、アデニル酸、デオキシアデニル酸、ヒ
ポキサンチン、イノシン、デオキシイノシン、イ
ノシン酸、デオキシイノシン酸、グアニン、グア
ノシン、デオキシグアノシン、グアニル酸、デオ
キシグアニル酸、キサンチン、キサントシン、プ
リン、プリンリボシド、６−メルカプトプリン、
６−メルカプトプリンリボシド、２・６−ジアミ
ノプリン、２・６−ジアミノプリンリボシド、６
−メルカプトグアニン、２−クロルヒポキサンチ
ン、６−クロロプリン、６−メトキシプリン、６
−メチルチオプリン、２−アミノプリン、２・６
−ジクロロプリン、２−チオメチルヒポキサンチ
ン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、６−カ
ルボキシプリン、８−クロロアデニン、２−クロ
ロ−６−メトキシプリン、又は８−ブロモアデニ
ンより選ばれるプリン源とより、該プリン塩基の
９−β−Ｄ−アラビノフラノシル誘導体（以下プ
リンアラビノシドと記す）を生成する能力を有す
る微生物を見い出した。 本発明のピリミジン塩基のアラビノチドとは、
アラビノシドの2′−、3′−または5′−のモノ、
ジ、またはトリ燐酸エステルをいう。 本発明の微生物としては具体的には以下のもの
がある。 プロテウス・レトゲリ AJ 2769（FERM−Ｐ
4796）（Proteus rettgeri） プロテウス・ブルガリス AJ 2764（FERM−
Ｐ 4795）（Proteus vulgaris） これらの微生物を、プリン源誘導体とアラビノ
フラノース供与体とに作用せしめる方法は、水性
媒体中にてこれらの微生物菌体またはその処理物
と上記の原料を接触せしめればよい。 これらの微生物の菌体を得る方法は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび更に必要ならばビタミン
等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用い
て培養すればよい。培養方法についても特別な方
法を要せず、従来知られている方法が適宜採用さ
れる。 菌体としては、上記の方法で得られた培養液そ
のまま、あるいは洗滌菌体が使用できる。菌体処
理物としてはアセトン乾燥菌体、菌体の摩砕物、
菌体の超音波処理物、界面活性剤またはトルエン
等に接触せしめた菌体、リゾチーム等の酵素に接
触せしめた菌体、塩析等により分離した菌体の蛋
白区分、本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精
製物更に上記菌体または菌体処理物の固定化物等
いずれもが使用できる。 これらの微生物の菌体またはその処理物をプリ
ン源とアラビノフラノース供与体に作用せしめる
には水性媒体液中にこれらを溶解またはけん濁
し、好ましくは温度10ないし70℃に、PH４ないし
10に暫時保てばよい。この間必要ならば溶液また
はけん濁液を適宜撹拌する。水性媒体としては、
水が好適であるが、水に極性溶媒あるいは非極性
溶媒を混ぜたものも適宜使用される。又必要に応
じリン酸イオンが添加される。 かくして反応液中にはプリンアラビノシドが著
量生成蓄積される。 反応液よりプリンアラビノシドを採取する方法
は水等の溶媒に対する溶解度差を利用したりイオ
ン交換樹脂を用いる等の方法で行うことができ
る。 実施例 １ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、肉
エキス0.5ｇ／dl、NaCl 0.5ｇ／dlを含み、PH7.2
に調節した液体培地の５mlを大型試験管に入れ殺
菌した。この培地にプロテウス・ブルガリス
AJ2764を１白金耳ずつ接種し、30℃にて36時間
振盪培養した。得られた培養液より菌体を遠心分
離して集め、生理食塩水にて洗滌後0.05M燐酸緩
衝液（PH7.5）にけん濁した（50mg−湿量／ml）。
上記の菌体けん濁液0.5mlを、ウラシルアラビノ
シド２ｇ／dl、第１表に示すプリン源0.2ｇ／
dl、KH₂PO₄1.0ｇ／dlを含みPH7.5に調節した反
応液0.5mlに加えた。これを60℃に15時間保ち、
その間、時々撹拌し、ついで100℃にて５分間加
熱した。 各反応液中に生成蓄積したプリンアラビノシド
は高速液体クロマトグラフイ（日立製作所(株)635
型を使用）により各種プリンアラビノシド標品の
保持時間と一致した。また高速液体クロマトグラ
フイにより定量した反応液中の蓄積量は第１表に
示すとおりであつた。プロテウス・レトゲリ
AJ2769を用いた場合にも同様の結果が得られ
た。

【表】 実施例 ２ 実施例１の方法で得られたプロテウス・レトゲ
リ AJ2769の菌体けん濁液0.5mlを第２表に示す
各種アラビノフラノース供与体2.0ｇ／dl、ヒポ
キサンチン0.2ｇ／dl、KH₂PO₄1.0ｇ／dlを含み
PH7.5に調節した反応液0.5mlに加えた。これを60
℃に15時間保ち、その間、時々撹拌し、ついで
100℃にて５分間加熱した。 各反応液中生成・蓄積した９−β−Ｄ−アラビ
ノフラノシルヒポキサンチン（ヒポキサンチンア
ラビノシド）は、高速液体クロマトグラフイーに
より定性、定量した。その結果を第２表に示す。

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した液体培地の100mlを500ml容肩
付フラスコに入れ殺菌した。これに、プロテウ
ス・ブルガリス AJ2764を接種し、30℃に保ち
つつ36時間振盪した。得られた培養液より、菌体
を遠心分離して集め生理食塩水にて洗浄後、
0.05M燐酸緩衝液（PH7.2）にけん濁した（50mg
湿重／ml）。 上記の菌体けん濁液0.5mlを第３表に示すアラ
ビノフラノース供与体２ｇ／dl、第３表に示すプ
リン源0.3ｇ／dl、及びKH₂PR₄0.1ｇ／dlを含
み、PH7.2に調節した反応液0.5mlに加えた。これ
を60℃に24時間保ち、その間、時々撹拌し、つい
で100℃にて５分間加熱した。各反応液中に生成
したプリンアラビノシド類は高速液体クロマトグ
ラフイー（日立製作所(株)635型を使用）により分
析したところ、アデニンアラビノシドと同定され
た。また、高速液体クロマトグラフイーにより定
量した反応液中のアデニンアラビノシド量を第３
表に示した。 プロテウス・レトゲリ AJ2769を用いた場合
にも同様の結果が得られた。

【表】

【表】 実施例 ４ プロテウス・レトゲリAJ2769を実施例１に示
した方法で培養し、培養液より菌体を遠心分離に
より集めた。 菌体５ｇ（湿重）／dl、アデニン100mg／dlウ
ラシルアラビノシド1000mg／dl、KH₂PO₄50mg／
dlを含みPH7.5に調節した反応液100mlを60℃に15
時間保つた。反応液より菌体を除き20ml迄濃縮
し、これを冷却して一夜静置した。得られた結晶
を水から再結し、25mgの結晶を得た。このものの
NMRスペクトル、赤外線吸収スペクトルおよび
紫外線吸収スペクトルは９−β−Ｄ−アラビノフ
ラノシルアデニン（アデーニンアラビノシド）標
品のそれと一致し、アデニンアラビノシドと同定
された。 実施例 ５ プロテウス・ブルガリスAJ2764の菌体を実施
例２の方法で得、これを100ｇ（湿重）／dlの濃
度になるように0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）にけ
ん濁し、これを超音波にさらして菌体を破壊し
た。遠心分離により沈澱物を除き、上清を粗酵素
液とした。 粗酵素液10ml／dl、ウラシルアラビノシド−
5′−モノ燐酸２ｇ／dl、第４表のプリン源100
mg／dl、KH₂PO₄ 30mg／dlを含みPH7.5に調節し
た反応液100mlを60℃に15時間保つた。 反応液より遠心分離により沈澱物を除き、上清
を高速液体クロマトグラフイーにかけ、定性定量
分析した。

【表】

【表】 実施例 ６ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、肉
エキス0.5ｇ／dl、NaCl 0.5ｇ／dlを含み、PH7.2
に調節した液体培地100mlを500ml容肩付フラスコ
（20本）に入れ殺菌した。これにプロテウス・ブ
ルガリス AJ2764を接種し、30℃に保ちつつ36
時間振盪した。培養液より菌体を遠心分離して集
めその50ｇ（湿重）を２−メチルヒポキサンチン
1.5ｇ、ウラシルアラビノシド10ｇ、KH₂PO₄3.4
ｇを含みPH7.0に調節した反応液１中に添加し
た。これを60℃に48時間保つた。反応液を100℃
に５分間加熱したのち遠心分離して菌体を除き、
上清をカチオン交換樹脂（「アンバーライトCG−
120」）に通し、次いで0.1N酢酸アンモニウム
（PH6.8）にて洗浄し、次いで0.1Nアンモニアにて
溶出した。 溶出区分を濃縮し、冷所に置き一夜放置し結晶
を析出させた（収量80mg）。 得られた結晶のNMRスペクトル、UV吸収スペ
クトル、元素分析値より生成物は９−β−Ｄ−ア
ラビノフラノシル−２−メチルヒポキサンチンと
同定した。 この化合物の性質は以下の通りである。 元素分析値 計算値 Ｃ：46.8 Ｈ：5.0 Ｎ：19.8 実測値 Ｃ：46.3 Ｈ：5.2 Ｎ：19.4 NMRスペクトルは第１図に示す通り。 紫外線吸収スペクトルは第２図に示す通り。 実施例 ７ 実施例４と同様にして得たプロテウス・レトゲ
リ AJ2769菌体50ｇ（湿重）を２−メチルアデ
ニン1.5ｇ、ウラシルアラビノシド10ｇ、
KH₂PO₄3.4ｇを含み、PH7.0に調節した反応液１
中に添加した。これを60℃に48時間保つた。反
応液より遠心分離して菌体を除き、上清を500ml
まで濃縮した。濃縮液を冷所に一夜放置した（収
量128mg）。析出した結晶のNMRスペクトル、UV
吸収スペクトル、元素分析値より９−β−Ｄ−ア
ラビノフラノシル−２メチルアデニンであると同
定した。 この化合物の性質は以下の通りである。 元素分析値 計算値 Ｃ：39.68 Ｈ：3.66 Ｎ：18.51 実測値 Ｃ：39.55 Ｈ：3.48 Ｎ：18.26 NMRスペクトル（第３図に示す通り） 紫外線吸収スペクトル（第４図に示す通り） 実施例 ８ 1.0ml当り、実施例５に示す粗酵素0.5ml、ウラ
シルアラビノシド50mg、KH₂PO₄2mg、下記プリ
ン源２mgを含む反応液1.0ml（PH7.5）を60℃に１
時間静置し、ついで100℃に５分間加熱した。反
応液より沈澱を除き、これをペーパークロマトグ
ラフイに展開した。ウラシルアラビノシドおよび
反応液に添加したプリン誘導体以外の紫外部吸収
を有するスポツトを切抜き、0.1HClにて抽出液
に塩酸を加えて６規定とし、10分間煮沸した。こ
の液にはオルシノール反応によりアラビノースが
検出された。 このことからプリンアラビノシドが反応液中に
生成されたことが推測される。 ６−クロロプリン ６−メルカプトプリン ６−メトキシプリン ６−メチルチオプリン アミノプリン ２・６−ジクロロプリン ２−チオメチルヒポキサンチン ２−アミノ−６−メルカプトプリン ６−カルボキシプリン ８−クロロアデニン ２−クロロ−６−メトキシプリン ８−ブロモアデニン

【図面の簡単な説明】

第１図は、９−β−Ｄ−２−メチルヒポキサン
チンアラビノシドのNMRスペクトルである。第
２図は、９−β−Ｄ−２−メチルヒポキサンチン
アラビノシドのUVスペクトルである。第３図
は、９−β−Ｄ−２−メチルアデニンアラビノシ
ドのNMRスペクトルである。第４図は、９−β
−Ｄ−２−メチルアデニンアラビノシドのUVス
ペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｄ−アラビノフラノース−１−リン酸及び一
   般式に示すピリミジン塩基のアラビノシド誘導
   体及びアラビノチド誘導体より選ばれるアラビノ
   フラノース供与体と、アデニン、アデノシン、デ
   オキシアデノシン、アデニル酸、デオキシアデニ
   ル酸、ヒポキサンチン、イノシン、デオキシイノ
   シン、イノシン酸、デオキシイノシン酸、グアニ
   ン、グアノシン、デオキシグアノシン、グアニル
   酸、デオキシグアニル酸、キサンチン、キサント
   シン、プリン、プリンリボシド、６−メルカプト
   プリン、６−メルカプトプリンリボシド、２・６
   −ジアミノプリン、２・６−ジアミノプリンリボ
   シド、６−メルカプトグアニン、２−クロルヒポ
   キサンチン、６−クロロプリン、６−メトキシプ
   リン、６−メチルチオプリン、２−アミノプリ
   ン、２・６−ジクロロプリン、２−チオメチルヒ
   ポキサンチン、２−アミノ−６−メルカプトプリ
   ン、６−カルボキシプリン、８−クロロアデニ
   ン、２−クロロ−６−メトキシプリン、又は８−
   ブロモアデニンより選ばれるプリン源とより、該
   プリン塩基の９−β−Ｄ−アラビノフラノシル誘
   導体を生成する能力を有するプロテウス属の微生
   物の作用により、該アラビノフラノース供与体と
   該プリン源とより水性媒体中にて該プリン塩基の
   ９−β−Ｄ−アラビノフラノシル誘導体を生成せ
   しめることを特徴とするプリンアラビノシド類の
   製造法。 一般式 但し、ＸはＯ、Ｓ又はNHを、ＹはOH、NH₂、
   SH、又はSR（Ｒは低級アルキル基）を、Ｚは
   Ｈ、ハロゲン、NO₂、CH₃又はCH₂OHを示す。