JPH0683673B2 - ２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ２′,3′−ジデオキシアデノシン（９−β−Ｄ−
（２′,3′−ジデオキシリボフラノシル）アデニン）、
２′,3′−ジデオキシイノシン（９−β−Ｄ−（２′,
3′−ジデオキシリボフラノシル）ヒポキサンチン）、
２′,3′−ジデオキシグアノシン（９−β−Ｄ−
（２′,3′−ジデオキシリボフラノシル）グアニン）又
は２′,3′−ジデオキシチミジン（９−β−Ｄ−
（２′,3′−ジデオキシリボフラノシル）チミン）等の
２′,3′−ジデオキシヌクレオシドは強い抗ウイルス作
用を有しており、医薬特に最近世界的に問題となってい
るエイズ（AIDS）の治療薬としての利用が期待されてい
る。

本発明は微生物を利用した２′,3′−ジデオキシヌクレ
オシド、特に、２′,3′−ジデオキシアデノシン、
２′,3′−ジデオキシイノシン、２′,3′−ジデオキシ
グアノシン及び２′,3′−ジデオキシチミジンの製造方
法に関するものである。

（従来の技術） 従来の２′,3′−ジデオキシヌクレオシドの製造方法と
してはChem.Pharm.Bull.22,128（1974）に知られている
ようにヌクレオシド類の２′位あるいは３′位の脱酸素
反応が行われているが、反応に先立ち保護基を導入しな
ければならないこと、２′位、３′位は立体障害が大き
く反応が起きにくいこと、ヌクレオシドが過激な条件下
では不安定な為過激な反応条件や反応剤を用いることが
できない等の理由により報告例は極めて少なく、また工
業的に満足する方法はいまだ確立されていない。また微
生物を利用する製造方法に関しては全く知られていな
い。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の化学的方法はいずれも反応工程が長く、また収率
が低いため、高収率で効率よく２′,3′−ジデオキシヌ
クレオシドを製造する方法の開発が望まれている。

（問題を解決するための手段） 本発明者はこのような目的を達成するべく鋭意検討の結
果、化学合成法で安定、安価に供給される２′,3′−ジ
デオキシウリジン又は２′,3′−ジデオキシリボース−
１−リン酸を基質に用いることにより、２′,3′−ジデ
オキシヌクレオシドを酵素的に効率よく生産できること
を見い出し、この知見に基ずいて本発明を完成するに至
った。

本発明を簡単に記すと以下の通りである。

即ち本発明は2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸
と塩基に微生物を作用させて２′,3′−ジデオキシヌク
レオシドを製造する方法及び２′,3′−ジデオキシウ
リジンと無機リン酸若しくはその塩と塩基に微生物を作
用させて直接２′,3′−ジデオキシヌクレオシドを製造
する方法である。

本発明を更により正確に記すと、2,3−ジデオキシリ
ボース−１−リン酸とアデニン、ヒポキサンチン、グア
ニン又はチミンに微生物を作用させて２′,3′−ジデオ
キシアデノシン、２′,3′−ジデオキシイノシン、
２′,3′−ジデオキシグアノシン又は２′,3′−ジデオ
キシチミジンを生成せしめる方法、２′,3′−ジデオ
キシウリジンと無機リン酸若しくはその塩とアデニン、
ヒポキサンチン、グアニン又はチミンに微生物を作用さ
せて直接２′,3′−ジデオキシアデノシン、２′,3′−
ジデオキシイノシン、２′,3′−ジデオキシグアノシン
又は２′,3′−ジデオキシチミジンを生成せしめる方法
である。

もちろん、本発明には、２′,3′−ジデオキシウリジン
と無機リン酸又はその塩に微生物を作用させて目的とす
る２′,3′−ジデオキシヌクレオシドの前駆物質である
2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸を生成せしめる
方法も含む。

本発明に使用される微生物は２′,3′−ジデオキシウリ
ジンとリン酸を2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸
に変換する酵素と2,3−ジデオキシリボース−１−リン
酸とアデニン、ヒポキサンチン、グアニン又はチミンを
２′,3′−ジデオキシアデノシン、２′,3′−ジデオキ
シイノシン、２′,3′−ジデオキシグアノシン又は
２′,3′−ジデオキシチミジンに変換する酵素の両方の
活性を有しているので、これらの方法には同一の微生物
を用いることができる。

これらの方法に使用される微生物はエシェリヒア属、フ
ラボバクテリウム属、セラチア属、エンテロバクター
属、エルビニア属、シトロバクター属、コリネバクテリ
ウム属、ハフニア属、クルイヘラ属、サルモネラ属、又
はキサントモナス属に属し、このような微生物の例とし
て エシェリヒア コリ ATCC10798 （Escherichia coli） フラボバクテリウム レナヌム FERM BP−1862 （Flavobacterium rhenanum） セラチア ルベファシエンス FERM BP−1863 （Serratia rubefaciens） エンテロバクター エアロゲネス ATCC 13048 （Enterobacter aerogenes） エルビニア カロトボラ FERM BP−1538 （Erwinia carotovora） シトロバクター フロインディ ATCC 8090 （Citrobacter freundii） コリネバクテリウム ビタルメン ATCC 10234 （Corynebacterium vitarumen） ハフニア アルベイ ATCC 9760 （Hafnia alvei） クルイヘラ シトロフィラ FERM Ｐ−3149 （Kluyvera citrophila） サルモネラ ショットムエレリ ATCC 8759 （Salmonella schottmuelleri） キサントモナス シトリ FERM BP−1861 （Xanthomonas citri） を挙げることができる。

これらの微生物を用いて目的とする２′,3′−ジデオキ
シヌクレオシド又はその中間体である2,3−ジデオキシ
リボース−１−リン酸を生成せしめる方法は、微生物の
培養中に基質を添加する培養法を用いても良いし、また
培養した菌体あるいはこの処理物を基質に作用させる酵
素法を用いても良い。

培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、P,S,Fe,Mn
等の無機イオン、更に必要ならばビタミン等の微量栄養
素または蛋白分解物、酵母エキスのような有機窒素源を
含有する通常の培地を基本にして、例えば2,3−ジデオ
キシリボース−１−リン酸を生成する場合にはこの基本
培地に２′,3′−ジデオキシウリジンとリン酸またはそ
の塩を添加すればよい。

また、2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸から、例
えば２′,3′−ジデオキシアデノシン、２′,3′−ジデ
オキシイノシン、２′,3′−ジデオキシグアノシン又は
２′,3′−ジデオキシチミジンを生産する場合には、上
記基本培地に2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸と
アデニン、ヒポキサンチン、グアニン又はチミンを適宜
添加すればよい。

更に、２′,3′−ジデオキシウリジンから２′,3′−ジ
デオキシアデノシン、２′,3′−ジデオキシイノシン、
２′,3′−ジデオキシグアノシン又は２′,3′−ジデオ
キシチミジンを直接生産する場合には、上記基本培地に
２′,3′−ジデオキシウリジンとリン酸若しくはその塩
とアデニン、ヒポキサンチン、グアニン又はチミンを添
加した培地を用いて培養すればよい。

上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない。

酵素法を用いる場合の酵素源としては、炭素源、窒素
源、Ｐ、Ｓ、Fe、Mn等の無機イオン、更に必要ならばビ
タミン等の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスの
ような有機窒素源を含有する通常の培地で培養した培養
液、洗浄菌体が使用できる他に、菌体処理物も使用でき
る。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体の磨
砕物、菌体の超音波処理物、界面活性剤あるいはトルエ
ン等の処理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、菌体よ
り抽出した後、塩析等により分離した菌体の蛋白区分、
本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精製物、更に本菌
体および菌体処理物の固定化物等いずれもが使用でき
る。

基質として使用する２′,3′−ジデオキシウリジンある
いは2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸の濃度は１
−1000mM程度が適当であり、リン酸またはその塩の濃度
は中間体の2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸生成
の場合には２′,3′−ジデオキシウリジンと等モルある
いは等モル以上加えるのがよく、１−10倍モル程度、更
に２′,3′−ジデオキシヌクレオシド生成の場合には反
応系でリン酸がリサイクルできるので2,3−ジデオキシ
リボース−１−リン酸生成の場合より少なくでき、0.01
−10倍モル程度が適当である。無機リン酸の塩は反応の
進行を大きく阻害しないものであればいずれを用いても
良く、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の無機塩、さらに
はトリメチルアンモニウム塩等の有機塩が用いられる。

２′,3′−ジデオキシウリジンから２′,3′−ジデオキ
シアデノシン、２′,3′−ジデオキシイノシン、２′,
3′−ジデオキシグアノシン又は２′,3′−ジデオキシ
チミジンを直接生産する場合でも、2,3−ジデオキシリ
ボース−１−リン酸から目的とする２′,3′−ジデオキ
シアデノシン、２′,3′−ジデオキシイノシン、２′,
3′−ジデオキシダアノシン又は２′,3′−ジデオキシ
チミジンを生産する場合も、塩基であるアデニン、ヒポ
キサンチン、グアニン又はチミンの添加量は２′,3′−
ジデオキシウリジン又は2,3−ジデオキシリボース−１
−リン酸と等モルあるいはそれ以上が適当で、通常１−
10倍モル程度が適当である。

直接生産させる場合において、基質の２′,3′−ジデオ
キシウリジンが反応液に残っても良い場合には、これら
アデニン、ヒポキサンチン、グアニン又はチミンの添加
量は２′,3′−ジデオキシウリジンの等モル以下でも良
い。

尚、2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸は市販の製
品を用いてもよいし、また化学合成法により製造したも
のを用いてもよく、更に、本発明で開示されたように、
２′,3′−ジデオキシウリジンより微生物の作用で生産
後、採取されたものを用いてもよい。

さて、これらを含む水溶液に前記菌体、またはその処理
物を加え、pHを４−10の範囲に調整した後、20−70℃、
望ましくは40−70℃で静置あるいは撹はんしながら10分
−10日間保持すると反応が進行し、反応液中に目的とす
る２′,3′−ジデオキシアデノシン等の２′,3′−ジデ
オキシヌクレオシド又は中間体の2,3−ジデオキシリボ
ース−１−リン酸が著量蓄積される。

反応液より２′,3′−ジデオキシアデノシン等の２′,
3′−ジデオキシヌクレオシド又は中間体の2,3−ジデオ
キシリボース−１−リン酸を採取する方法は、水等の溶
媒に対する溶解度差を利用したり、イオン変換樹脂や吸
着樹脂を用いる方法で行うことができる。またこれら生
成物の定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法
で行なえばよい。

以下、実施例に従って、本発明を更に詳細に説明する。

実施例 １ 酵母エキス0.5g/dl、ペプトン1.0g/dl、肉エキス1.0g/d
lおよびNaCl0.5g/dlを含む培地（pH7.0）50mlを500ml容
肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン
寒天培地にて30℃、16時間前培養した第１表に示す微生
物を１白金耳ずつ接種し、30℃にて16時間振とう培養し
た。得られた培養液より菌体を遠心分離により分離した
後、0.05Mリン酸バッファー（pH7.0）で洗浄し、更に遠
心分離することにより洗浄菌体を調整した。

上記洗浄菌体を20mMの2,3−ジデオキシリボース−１−
リン酸と20mMアデニン、あるいは20mMの2,3−ジデオキ
シリボース−１−リン酸と20mMのヒポキサンチンあるい
は20mMの2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸と20mM
のグアニンを含む0.05Mトリスバッファー（pH7.2）10ml
に５％になるように添加し、60℃、24時間反応させた。

各反応液中に生成した２′,3′−ジデオキシアデノシ
ン、２′,3′−ジデオキシイノシンおよび２′,3′−ジ
デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて測定した。

実施例 ２ 実施例１と同様に培養、調整した、第２表に示す微生物
の洗浄菌体を20mMの２′,3′−ジデオキシウリジンを含
む100mMのリン酸バッファー（pH7.0）10mlに５％になる
ように添加し、60℃、24時間反応させた。各反応液中に
生成した2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸の濃度
を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。結果
を第２表に示す。

実施例 ３ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調整した第
３表に示す微生物の洗浄菌体を20mMの２′,3′−ジデオ
キシウリジンと20mMのアデニン、あるいは20mMの２′,
3′−ジデオキシウリジンと20mMのヒポキサンチンある
いは20mMの２′,3′−ジデオキシウリジンと20mMのグア
ニンを含む100mMのリン酸バッファー（pH7.0）10mlに５
％になるように添加し、60℃、24時間反応させた。各反
応液中に生成した２′,3′−ジデオキシヌクレオシドを
実施例１と同様の方法で測定し、その結果を第３表に示
した。

実施例 ４ 実施例１と同様の培地を用いて実施例１と同様の方法で
37℃、16時間培養したエシェリヒアコリATCC 10798の培
養液に、予め殺菌した200mMの２′,3′−ジデオキシウ
リジンと200mMのヒポキサンチンを含む500mMのリン酸バ
ッファー5mlを添加し更に10時間培養を続けた。この培
養液中に生成した２′,3′−ジデオキシイノシンを実施
例１の方法と同様に定量した結果、36mg/dlのジデオキ
シイノシンが生成していた。

実施例 ５ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調整したエ
シェリヒアコリATCC−10798の洗浄菌体を100mMの２′,
3′−ジデオキシウリジンと100mMのアデニンを含む10mM
のリン酸バッファー（pH7.0）10mlに２％になる様に添
加し、第４表に示す温度で24時間反応させた。各反応液
中に生成した２′,3′−ジデオキシヌクレオシドを実施
例１と同様の方法で測定し、その結果を第４表に示し
た。

実施例 ６ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調製したエ
シェリヒア コリATCC 10798の洗浄菌体を50mMの２′,
3′−ジデオキシウリジンと50mMのチミンを含む25mMの
リン酸バッファー（pH7.0）5mlに２％になる様に添加
し、50℃の温度で24時間反応させた。反応中に生成した
２′,3′−ジデオキシチミジンを実施例１と同様の方法
で測定した結果、122mg/dl生成していたことが確認でき
た。

（効 果） 本発明の方法は従来の化学合成法に比較して、反応が簡
単でしかも目的とする２′,3′−ジデオキシアデノシ
ン、２′,3′−ジデオキシイノシンおよび２′,3′−ジ
デオキシグアノシンを高収率で製造できる優れた方法で
ある。

また、このようにして製造された２′,3′−ジデオキシ
アデノシン、２′,3′−ジデオキシイノシンおよび
２′,3′−ジデオキシグアノシンは強力な抗ウイルス作
用を有する為に、抗ウイルス剤、特に最近世界的に問題
になっているエイズウイルスにより惹起されるエイズ
（AIDS）の治療薬として期待できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:64） (72)発明者 入江 康夫 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 安田 直彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味の 素株式会社中央研究所内 審査官 谷口 博

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、
   セラチア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シト
   ロバクター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、ク
   ルイヘラ属、サルモネラ属又はキサントモナス属に属
   し、2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸及び塩基か
   ら２′,3′−ジデオキシヌクレオシドを生成する能力を
   有する微生物を水性溶媒中で2,3−ジデオキシリボース
   −１−リン酸及び塩基に作用せしめることを特徴とする
   ２′,3′−ジデオキシヌクレオシドの製造方法。
2. 【請求項２】塩基がアデニンで２′,3′−ジデオキシヌ
   クレオシドが２′,3′−ジデオキシアデノシンであるこ
   とを特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
3. 【請求項３】塩基がヒポキサンチンで２′,3′−ジデオ
   キシヌクレオシドが２′,3′−ジデオキシイノシンであ
   ることを特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
4. 【請求項４】塩基がグアニンで２′,3′−ジデオキシヌ
   クレオシドが２′,3′−ジデオキシグアノシンであるこ
   とを特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
5. 【請求項５】塩基がチミンで、２′,3′−ジデオキシヌ
   クレオシドが２′,3′−ジデオキシチミジンであること
   を特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
6. 【請求項６】2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸が
   エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチア属、
   エンテロバクター属、エルビニア属、シトロバクター
   属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘラ
   属、サルモネラ属、又はキサントモナス属に属し、 （イ） ２′,3′−ジデオキシウリジン 及び （ロ） 無機リン酸又はその塩とから2,3−ジデオキシ
   リボース−１−リン酸を生成する能力を有する微生物を
   水性溶媒中で （イ） ２′,3′−ジデオキシウリジン 及び （ロ） 無機リン酸又はその塩に作用せしめることによ
   り生産されたものである請求項（１）記載の製造方法。
7. 【請求項７】エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、
   セラチア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シト
   ロバクター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、ク
   ルイヘラ属、サルモネラ属、又はキサントモナス属に属
   し、 （イ） ２′,3′−ジデオキシウリジン、（ロ） 無機
   リン酸又はその塩、及び（ハ） 塩基、とから ２′,3′−ジデオキシヌクレオシドを生成する能力を有
   する微生物を水性溶媒中で （イ） ２′,3′−ジデオキシウリジン、（ロ） 無機
   リン酸又はその塩、及び（ハ） 塩基に作用せしめるこ
   とを特徴とする２′,3′−ジデオキシヌクレオシドの製
   造方法。
8. 【請求項８】塩基がアデニンで２′,3′−ジデオキシヌ
   クレオシドが２′,3′−ジデオキシアデノシンであるこ
   とを特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
9. 【請求項９】塩基がヒポキサンチンで２′,3′−ジデオ
   キシヌクレオシドが２′,3′−ジデオキシイノシンであ
   ることを特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
10. 【請求項１０】塩基がグアニンで２′,3′−ジデオキシ
    ヌクレオシドが２′,3′−ジデオキシグアノシンである
    ことを特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
11. 【請求項１１】塩基がチミンで２′,3′−ジデオキシヌ
    クレオシドが２′,3′−ジデオキシチミジンであること
    を特徴とする請求項（７）記載の製造方法。