JPS62253393A - リボヌクレオシドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリボヌクレオシドの製造法に関する。

さらに詳しくは、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に加
えて夾雑活性としてヌクレオシダーゼ活性を有するヌク
レオシドホスホリラーゼ調製物を用いてＮ−グリコシド
結合を介して塩基部分とリボース部分とを結合させてリ
ボヌクレオシドを製造するに際し、あらかじめヌクレオ
シドホスホリラーゼ活性に加えて夾雑活性としてヌクレ
オシダーゼ活性を有する酵素源を光硬化性樹脂による包
括固定化に付すことによって夾雑するヌクレオシダーゼ
活性を抑制し、リボヌクレオシドを長期間、安定かつ効
率良く製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

塩基供与体とリボース化合物とを酵素的に反応させてリ
ボヌクレオシドを製造する方法としては。

例えば、各種のプリンリボヌクレオシドの製造法（特公
昭４３−２４４７５号、特公昭４３−２８９５４号、特
公昭４３−２８９５６号、特公昭４５−１１１１６号、
特公昭４８−１４９５７号など）、リバビリンまたはそ
の誘導体の製造法（特公昭５８−３６９６０号、特開昭
５７−１４６５９３号、特開昭５８−１９０３９６号、
特開昭５８−２１６６９６号、特開昭５９−１４３５９
９号など）ほかが知られている。これらの方法は、いず
れもヌクレオシドホスホリラーゼ活性を主体とする微生
物自体もしくはその誘導物からなる酵素活性物質を利用
する方法と考えられる。しかしながら、これらの方法に
おいては酵素活性物質中のヌクレオシダーゼ活性の夾雑
およびこれによる目的リボヌクレオシドの収率の低下と
いう問題点は認識されておらず、それに対する対策も考
慮されていない。

一方、一般に複数酵素含有物質中の不要な酵素活性を除
去もしくは抑制する方法としては、酵素の調製に使用す
る微生物に突然変異を起こさせ。

不要な酵素の生産を抑制する方法、酵素反応時に反応系
に不要な酵素に対するインヒビターを存在させる方法な
どがある。

光硬化性樹脂で固定化した酵素または微生物菌体などを
用いて各種の酵素反応を行わせることは公知である（例
えば、特公昭５５−４０号、特公昭５５−２０６７６号
、特公昭５７−４１９１８号、特公昭５８−３６７３号
、特公昭５８−３６７４号、特公昭５９−３１９６号、
特公昭５９−３２１１７号、特公昭６０−１３６７１号
、特開昭　５７−１１８７９７号など）。

特開昭５７−１１８７９７号には、ウラシルアラビノシ
ドとアデニンとからアデニンアラビノシドを生成する作
用を有する微生物菌体を光硬化性樹脂によって固定化し
、この固定化菌体と、５重量％以上のジメチルスルホキ
シドを含有する水性溶媒にピリミジンアラビノシドおよ
びアデニン等のアデニン供与体を溶解した溶液とを接触
せしめるアデニンアラビノシドの製造法が開示されてい
る。この発明の特徴は、原料および生成物の溶解性を向
上させるために反応溶液に特定量の有機溶媒を添加する
こと、ならびに添加した有機溶媒の存在下および至適反
応条件と考えられる高温条件（実施例の反応温度は６０
℃）で微生物菌体の酵素活性が低下することを防止する
ために光硬化性樹脂によって微生物菌体を固定化するこ
とにあると考えられる。すなわち、この発明の効果は、
反応溶液中に特定の有機溶媒を存在させることと、使用
する微生物菌体を光硬化性樹脂によって固定化すること
を組み合せることによってはじめて達成されるものと考
えられる。なお、使用されている微生物菌体がヌクレオ
シダーゼ活性を有するか否か、またヌクレオシダーゼ活
性を有するならばアデニンアラビノシドの収率に悪影響
を及ぼすか否かについては不明である。しかも一般にア
ラビノヌクレオシドはリボヌクレオシドよりもヌクレオ
チダーゼに対して抵抗性を有するとされている。

また、一般に有機溶媒の存在下と非存在下における酵素
の作用は異なると考えられるが、この発明は有機溶媒存
在下における光硬化性樹脂固定化微生物の酵素反応につ
いて開示するものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ヌクレオシドホスホリラーゼ活性物を用い、Ｎ−グリコ
シド結合を介して塩基部分とリボース部分とを結合させ
てリボヌクレオシドを製造する場合、酵素ＷＲ製物中に
ヌクレオシダーゼ活性が夾雑するときには基質および／
または目的物質が分解され、目的とするリボヌクレオシ
ドの生成率が低下するという大きな問題点がある。

ところが、このような問題点を解決するため、酵素活性
を除去もしくは抑制する一般的手法を適用することは困
難である。

すなわち、酵素源としての生物体に突然変異を起こさせ
て、そのヌクレオシダーゼ活性のみを低下させる方法は
、手間がかかるだけでなく、時にはヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性の低下をも同時に招くことがあり、国運な
方法である。特にリボース化合物としてリボヌクレオチ
ドを使用する場合、酵素調製物中にヌクレオシドホスホ
リラーゼとともにホスファターゼもしくはヌクレオチダ
ーゼも含まれていなければならず、このような酵素調製
物からヌクレオシダーゼ活性のみを上記の方法で除去す
ることはさらに困難である。

また、インヒビターを利用する方法については。

ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に影響を与えることな
くヌクレオシダーゼ活性を特異的に阻害するインヒビタ
ーは本発明者らが知る限りでは未だ見出されていないの
で、リボヌクレオシドの製造には適用できない。

以上のとおり、本発明が解決すべき課題は、微生物菌体
のようなヌクレオシドホスホリラーゼ。

ヌクレオシダーゼ等の複数の酵素を含有する酵素源を用
いてリボヌクレオシドを製造する際に、反応系において
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を低下させずにヌクレ
オシダーゼ活性のみを特異的に抑制してリボヌクレオシ
ドの収率を向上させることである。

〔問題点を解決するための手段〕

ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に加えて夾雑活性とし
てヌクレオシダーゼ活性を有するヌクレオシドホスホリ
ラーゼ調製物を用い、Ｎ−グリコシド結合を介して塩基
部分とリボース部分とを結合させてリボヌクレオシドを
製造する際に不要なヌクレオシダーゼ活性を特異的に抑
制する方法について鋭意検討した結果、光硬化性樹脂と
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に加えて夾雑活性とし
てヌクレオシダーゼ活性を有する酵素源とを混合し、活
性光線を照射して作成した光架橋重合物からなる固定化
ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物においてヌクレオシ
ダーゼ活性が特異的に抑制されることを見出し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、塩基供与体とリボース化合物とを
ヌクレオシドホスホリラーゼの作用下において反応させ
、塩基供与体の塩基部分とリボース化合物のリボース部
分との間でＮ−グリコシド結合を形成させてリボヌクレ
オシドを製造する方法において、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼ活性に加えて夾雑活性としてヌクレオシダーゼ活
性を有する酵素源と、プレポリマーの連ＩＲ構造の任意
の位置に光感応基を有する光硬化性樹脂との混合物に活
性光線を照射して得られる固定化ヌクレオシドホスホリ
ラーゼ調製物を使用し、ヌクレオシダーゼ活性を抑制す
ることを特徴とするリボヌクレオシドの製造法を提供す
るものである。

以下１本発明をより具体的に説明する。

本発明方法の目的物質である「リボヌクレオシド」とは
、芳香族複素環塩基とりボフラノシル基がＮ−グリコシ
ド結合を介して結合したものであって、ヌクレオシドホ
スホリラーゼの酵素反応によって対応する塩基供与体お
よびリボース供与体から生成されうる化合物を指体する
。

このようなリボヌクレオシドとしては、プリンリボフラ
ノシド、ピリミジンリボフラノシド、１゜２．４−トリ
アゾールリボフラノシド、イミダゾールリボフラノシド
、デアザプリンリボフラノシド、アザプリンリボフラノ
シド、アザピリミジンリボフラノシド、ピリジンリボフ
ラノシドなどが例示される。

さらに具体的には、プリンリボフラノシドとしては、プ
リン塩基の１位、２位、６位および８位の１または２以
上の位置に置換基（たとえば、アミノ基、置換アミノ基
、ヒドロキシル基、オキソ基、メルカプト基、アシル基
、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、ハロ
ゲノ基など）を有するもの、たとえばアデノシン、グア
ノシン、イノシン、キサントシン、６−メルカプトプリ
ンリボフラノシド、６−チオグアノシン、Ｎ６−アルキ
ルもしくはアシルアデノシン、２−アルコキシアデノシ
ン、２−チオアデノシン、２，６−ジアミツプリンリボ
フラノシドなどが例示される。

ピリミジンリボフラノシドの具体例としては、ピリミジ
ン塩基の２位、４位および５位の１または２以上の位置
に前記と同様の置換基を有するもの、たとえばシチジン
、ウリジン、リボチミジン、５−ハロゲノウリジン（５
−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、５−クロロ
ウリジン、５−プロモウリジン）、５−ハロゲノシチジ
ン（５−フルオロシチジン、５−クロロシチジン）、５
−トリハロゲノメチルウリジン（５−トリフルオロメチ
ルウリジン）、４−チオシチジン、４−チオウリジン、
Ｎ４−アシルシチジン、５−ハロゲノビニルウリジン（
５−ブロモビニルウリジン）などが挙げられる。

１．２．４−トリアゾールリボフラノシドの具体例とし
ては、１，２．４−トリアゾール塩基の３位の位置に置
換基を有するもの、たとえば１−β−Ｄ−リボフラノシ
ル−１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミド、
１−β−Ｄ−リボフラノシル−１．２．４−トリアゾー
ル−３−カルボン酸、１−β−Ｄ−リボフラノシル−１
，２゜４−トリアゾール−３−カルボン酸アルキルエス
テルなどが挙げられる。

イミダゾールリボンラノシドの具体例としては。

イミダゾール塩基の４位および５位に置換基を有するも
の、たとえば５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシル
イミダゾール−４−カルボキサミド、４−カルバモイル
−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾリウム−５−オ
レエートなどが挙げられる。

デアザプリンリボフラノシドの具体例としては。

１−デアザアデノシン、３−デアザアデノシン、３−デ
アザグアノシン、７−デアザアデノシン、前記のプリン
リボフラノシドと同様の置換基を有するデアザプリンリ
ボフラノシドなどが挙げられ。

アザプリンリボフラノシドの具体例としては８−アザア
デノシンなどが挙げられる。

アザピリミジンリボフラノシドの具体例としては５−ア
ザリボチミジン、５−アザシチジン、６−アザウリジン
などが挙げられ、ピリジンリボフラノシドの具体例とし
は３−デアザウリジン、１−β−Ｄ−リボフラノシルニ
コチン酸、１−β−Ｄ−リボフラノシルニコチン酸アミ
ドなどが挙げられる。

本発明において「ヌクレオシドホスホリラーゼ活性」と
は塩基供与体の塩基部分とリボース化合物のリボース部
分との間にＮ−グリコシド結合を形成させることのでき
る酵素活性をいう、すなわち、本発明においては上記反
応を触媒する酵素活性をヌクレオシドホスホリラーゼ活
性と称し、本来の意味におけるヌクレオシドホスホリラ
ーゼ活性だけでなく、ヌクレオシド−Ｎ−グリコジル・
トランスフェラーゼなどの転移酵素活性も包含するもの
とする。

また、「ヌクレオチダーゼ活性」とはリボヌクレオシド
のグリコシド結合を加水分解してリボースと塩基を与え
る酵素活性をいう。

「酵素源」には前記のように、さらにヌクレオチダーゼ
、ホスファターゼ、デアミナーゼなど、その他の酵素が
含まれることもある。

動植物の組織または微生物の菌体（胞子も含む）などに
由来する任意の起源の酵素源を本発明の酵素源として使
用することができる。工業的な生産性を考慮すると微生
物由来であることが好ましい。

ヌクレオシドホスホリラーゼは微生物に広く分布して存
在する。前述の公知のヌクレオシドホスホリラーゼによ
る各種リボヌクレオシド製造法において酵素源として使
用されている微生物の属の一例を挙げると次のとおりで
ある。

（１）　ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属（２）　コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｍ）属（３）　アースロバフタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属（４）　ミクロコツカス
（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（５）バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属（６）　フラボバクテリウム（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、＠（７）　ミクロバクテリ
ウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（８）　キサ
ントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属（９）　シュ
ウトモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ａｏｎａｓ）属（１０）　
　アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔａｒ）属
（１１）　　エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　）
属（１２）　　スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属（１３）セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
）属（１４）バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（
１５）　　プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属（１６）　
　セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属（１７
）　　エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
属（１８）　　ミコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属（
１９）　　ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（２０）　　エ
ルヴィニア（Ｅｒｖｉｎｉａ）属（２１）　　クレブシ
ェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属（２２）　　エアロモ
ナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属（２３）　　アルテロモ
ナス（Ａ１ｔｅｒｏ＋ａｏｎａｓ）属（２４）　　クル
チア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属（２５）　　プロタミノバク
タ−（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属（２６）　
　サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（２７）　　
シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属（２８）
　　スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属（
２９）　　アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
属（３０）　　アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａ
ｎｅｓ）属（３１）　　ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属（３２）　　ノカルディア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）属（３３）　　ストレプトヴエルチシ
リウム（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）
属 （３４）　　ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏ−ｓｐｏｒａｎｇｉｕａ＋）属 （３５）　　サーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏ−
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属 （３６）　　ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）属（３７）サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属（３８）　　ミコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏ
ｒｕｌａ）属（３９）　　キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属以上の属に属する微生物の具体的菌株の一例を次
に示す。

ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅ−ｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴ−６−７
微工研菌寄第６３０５号／ＡＴＣＣ３９３１１／ＫＡＩ
ＳＴ　８３０９２７−１０８１０ブレビバクテリウム・
アセチリカム　ＡＴＣＣ９５３同　　　上　　　　　　
　　　　　　　　　ＡＴＣＣ９５４同　　　上　　　　
　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ２１６６５ブレビバクテ
リウム・インペリアレ（Ｂｒａｖｉｂａｃｔｅ−ｒｉｕ
＋ｍ　ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）　　　　　　　　　　　Ａ
ＴＣ８３６５ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａ＋ｍｍｏｎｉａｇ
ｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１／ＫＦＣＣ１１７４０コリ
ネバクテリウム・エクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｅｑｕｉ）　　　　　　　　　　　　　　　ＩＡＭ
　　１０３８　／ＫＣＴＣ１２９ｇコリネバクテリウム
・ミシガネンス（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｉａｉｃｈｉｇａｎｅｎｓａ）　　　　　　　　　　
　ＡＴＣＣ７４２９アースロバフタ−・グロビホルミス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔａｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）
　　　　　　ＩＦＯ１２１３７／ＡＴＣＣ８０１０アー
スロバフタ−・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｃｉｔｒｅｕｓ）　　ＩＦＯ１２９５７／ＡＴＣＣ１１
６２４／ＫＣＴＣ１００１アースロバフタ−・シンプレ
ックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）　
　ＩＦＯ１２０６９／ＡＴＣＣ６９４６／にＦＣＣ３５
４００ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ４６９ｇ　／ＩＡＭ　１
０５６　／ＫＣＴＣ１０５６同　　　上　　　　　　　
　　　　　　　　ＩＡＭ　　１０３０同　　　上　　　
　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ３９８ミクロコツ
カス・ヴアリアンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｖａｒｉ
ａｎｓ）　　　　　　　　　ＩＦＯ３７６５／ＡＴＣＣ
３９９ミクロコツカス１０ゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）ＩＦＯ３７６８／ＡＴＣＣ１８６ バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＡＴＣＣ１４５９３／にＦＣＣ３５４２１／Ｋ
ＣＴＣ１０２３バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２１６３４／ＩＡＭ　　１０
２９バチルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐ
ｈａｅｒｉｃｕｓ）ＩＦＯ３３４１ バチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ
）ＡＴＣＣ８１８５／ＫＦＣＣ１１７１１フラボバクテ
リウム・アルボレセンス（Ｆｌａｖｏ−ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ａｒｂｏｒｅｓｅｅｎｓ）　　ＩＦＯ３７５０／
ＡＴＣＣ４３５８フラボバクテリウム・ルテセンス（Ｆ
ｌａｖｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｕｔｅｓｅｎｓ）　
　　ＩＦＯ３０８４／ＡＴＣＣ２５３１１同　　　上　
　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ３０８５フラボバ
クテリウム・ニステロアロマティクム（Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｓｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）
ＩＦＯ３７５１／ＡＴＣＣ８０９１ フラボバクテリウム・レナナム（Ｆｌａνｏｂａｃｔａ
ｒｉｕｍｒｈｅｎａｎｕｍ）　　　　　　　　　　　　
　　　ＣＣＭ　２９８ミクロバクテリウム・サーモスフ
アクタム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｓｒｍ
ｏｓｐｈａｃｔｕ＋ｉ）　　ＩＦＯ１２１６７＝プロコ
スリツクス・サーモスフアクタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉ
ｘ　ｔｈｅｒ＋＊ｏｓｐｈａｃｔａ）　　　　ＡＴＣＣ
１１５０９キサントモナス−オリゼー（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＩＦＯ３３１２ ＝キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ２１７５４キサントモナス・キャンペストリス（ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）　　
　　　　ＡＴＣＣ７３８１シュウトモナス・デスモリチ
力（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ）
　Ｊ　−４−２微工研菌寄第６３０７号／ＡＴＣＣ３９
３１０ シュウトモナス・シューリキリエンシス（Ｐｓｅｕｄｏ
−ｍｏｎａｓ　５ｃｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ）　
　　　　　　ＩＡＭ　１０５１シュウトモナス・オバリ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｖａｌｉｓ）ＩＡＭ　
１００２ シュウトモナス・ダクンハエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）　　　　　　　　　　　　　　ＩＡ
Ｍ　１０８９シュウトモナス・ディミヌタ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｒａｏｎａｓｄｉｍｉｎｕｔａ）　　　　　　　　　
　　　　ＡＴＣＣ１１５６８アクロモバクタ−・ユウリ
デイセ（Ａｃｈｒｏ■ｏｂａｃｔｅｒｅｕｒｙｄｉｃｅ
）　ＢＥ−３−３微工研菌寄第６３０４号／ＡＴＣＣ３
９３１２ アクロモバクタ−・パルバラス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｐａｒｖｕｌｕｓ）　　　　　　　ＩＦＯ１３１
８２／ＮＲＲＬ　Ｂ−２３９５アクロモバクタ−・ゼロ
シス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｅｒｏｓｉｓ）　
　　　　　　　　　　　　　ＩＦｏ　１２６６８アクロ
モバクタ−・ラフチウム（Ａｃｈｒｏ＋ｍｏｂａｃｔｅ
ｒｌａｃｔｉｕｍ）　　　　　　　　　　　　　　　　
ＣＣＭ　６９エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）ＩＦＯ３３０１／ＫＦＣＣ３２３９６ 同　　　上　　　　　　ＩＡＭ　　１２６８　　／ＡＴ
ＣＣ１１３０３同　　　上 ＩＦＯ１３５００／ＡＴＣＣ９６３７／ＫＣＴＣ１０３
９同　　　上　　　　　ＩＦＯ１３５４０／ＡＴＣＣ１
２８１４同　　　上　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ１５３８９同　　　上　　　　　　　　　　　　　Ａ
ＴＣＣ１０７９８スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ） ＩＡＭ　１０１１　／ＡＴＣＣ６５３８Ｐ　／ＫＦＣＣ
３５４９３／にＣＴＣ１０６９同　　　上　　　　　　
ＩＦＯ３０６０／ＫＦＣＣ３２３９５スタフィロコッカ
ス・エビデルミゾイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＩＦＯ３７６２／ＡＴＣＣ
１５５ セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ　　１１０５　　／ＡＴＣＣ２１
６３９同　　　上　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦ
Ｏ３０４６バタテリウム・カダベリス（Ｂａｃｔｓｒｉ
ｕ＋ｗ　ｃａｄａｖｅｒｉｓ）ＡＴＣＣ９７６ プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａ
ｒｉｓ）ＩＡＭ　１０２５ 同　　　上　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ３１
６７同　　　上　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
３０４５セルロモナス・フラビゲナ（Ｃａｌｌｕｌｏｍ
ｏｎａｓｆｌａｖｉｇｅｎａ）　　　ＩＦＯ３７５３／
ＡＴＣＣ４８７／ＫＣＴＣ１４４０同　　　上 ＩＦＯ３７４７／ＡＴＣＣ４９１／ＫＣＴＣ１４４１同
　　　上 ＩＦｏ　１２６８０　／ＡＴＣＣ４８６／ＫＣＴＣ１３
７０同　　　上　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ
８１８３エンテロバクタ−・エアロモナス（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔａｒａｅｒｏｇａｎｅｓ）　　　　　　　Ｉ
ＦＯ１２０１０／ＡＴＣＣ１５０３８同　　　上　　　
　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１３０４８エンテロバク
タ−・クロアセ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａ
ｃａｅ）　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ７２５
６同　　　上　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１
３０４７ミコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｂ
ｕｌｌａｔａ）ＩＦＯ１３２９０／ＡＴＣＣ４２７８ ミコプラナ・ジモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍ
ｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９ ビブリオ・アンギララム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌ
ｌａｒｕｍ）ＩＦＯ１３２６６／ＡＴＣＣ１９２６４ビ
ブリオ・メッチニコビー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｍｅｔｃｈｎ
ｉｋｏｖｉｉ）ＡＴＣＣ７７０８ エルヴィニア・力ロトボーラ（Ｅｒ％１ｉｎｉａ　ｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａ）ＩＦＯ１２３８０ 同　　　上 ＩＦｏ　３８３０　／ＡＴＣＣ１５３９０／ＫＦＣＣ１
１３１９エルヴィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ１４５３６ クレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐ
ｎｅｕｎ＋ｏｎｉａ）　　　　　　　　　　　　　ＡＴ
ＣＣ８３０８同　　　上　　　　　ＡＴＣＣ９６２１／
ＫＦＣＣ１１７８８エアロモナス・ハイドロフィラ・サ
ブスピーシーズ・アナエロゲネス（Ａｅｒｏｌｏｎａｓ
　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ　５ｕｂｓｐ。

ａｎａｅｒｏｇｅｎｅｓ）　　　　　　ＩＦＯ１３２８
２／ＡＴＣＣ１５４６７エアロモナス・パンクタタ（Ａ
ａｒｏｍｏｎａｓ　ｐｕｎｃｔａｔａ）ＡＴＣＣ１１１
６３ エアロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａ
ｌｍｏｎｉｃｉｄａ）　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ１４１７４アルテロモナス・プトレファシエンス（Ａ
ｌｔｅｒｏ−ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｒｅｆａｃｉａｎｓ）
　　　　　　　　ＡＴＣＣ８０７１同　　　上　　　　
　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ８０７２同　　　上　　
　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ８０７３クルチア・
シフイー（Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ）ＩＦＯ１２
０８３／ＡＴＣＣ６９００ 同　　　上　　　　　ＩＦＯ１２０８４／ＡＴＣＣ１０
５３８プロタミノバクタ−・アルボフラバス（Ｐｒｏｔ
ａｓ＋１ｎｏ−ｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）
ＩＦＯ３７０７／ＡＴＣＣ８４５ｇ　／ＫＣＴＣ１３０
３サルモネラ・スコットムエレリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａｓｃｈｏｔｔｏｍｕｅｌｌｅｒｉ）　　　　　　　　
　　ＡＴＣＣ８７５９サルモネラ・エンテリチジス（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）　　　　
　　　　　　　　　ＩＦＯ３３１３シトロバクタ−・フ
ロインディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ）　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ８０９０ス
ポロサルシナ０ウレアエ（Ｓｐｒｏｓａｒｃｉｎａ　ｕ
ｒｅａｓ）ＡＴＣＣ６４７３ アルカリゲネス・メタル力リゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓｍｅｔａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　　　　　　　
　　　ＡＴＣＣ１３２７０アクチノプラネス・ミゾウリ
エンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　　ｍ１ｓｓｏｕ
ｒｉｅｎｓｉｓ）　　　　　　　　ＩＦＯ１３２４３ミ
クロモノスポラ・プルプレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａρｕｒｐｕｒｅａ） ＩＦＯ１３１５０／ＡＴＣＣ１５８５３／ＫＦＣＣ３４
７１３（３，２−１） ノカルディア・エリトロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒ
ｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　　　　　　　　　　　　ＩＦ
Ｏ１２６８２ストレブトヴエルチシリウム・ロセオヴエ
ルチシラツム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｔｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ　ｒｏｓｅｏ−ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｉ＋）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ１２８１
７ストレプトスボランギウム・ロゼラム（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏ−ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　　ｒｏｓａｕｍ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ３７７６サーモアク
チノマイセス・ヴルガリス（Ｔｈａｒｍｏａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ　　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　　　　　　　　Ｉ
ＦＯ１３６０５ストレプトマイセス・オリヴアセウス（
Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）　
　　　　　　　　　ＩＦｏ　１２８０５ストレプトマイ
セス・フラデイエ（Ｓｔｒｅｐｔｏ■ｙｃｅｓｆｒａｄ
ｉａｅ）　　　　　　　　ＩＦＯ１２７７３／ＡＴＣＣ
１０７４５ストレプトマイセス・ファエオクロモゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２８９８／ＡＴＣＣ２３９４５
／ＫＣＴＣ１０７４ストレプトマイセス・オリヴオクロ
モゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｏｌｉｖｏｃ
ｈｒｏｍｏｇａｎｅｓ）　　　　　ＩＦＯ１３０６７サ
ツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　　　　　　　　　　　
　ＡＴＣＣ２６０１ミコトルラ・ジャポニカ（Ｍｙｃｏ
ｔｏｒｕｌａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）ＯＵＴ　　６２２６ キャンディダ・トロビカリア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉａ）ＡＴＣＣ１４０５６ 前記例示微生物は、本発明において目的とするリボヌク
レオシドの種類に応じて適宜に選択されるべきである。

前記例示微生物のうちブレビバクテリウム属に属する微
生物が本発明の酵素源として典型的な例である。特に１
本発明の効果は、ブレビバクテリウム属微生物、さらに
具体的にはブレビバクテリウム・アセチリカムに属する
微生物を酵素源として用いた場合にきわめて顕著に達成
することができる。

前記例示の菌体から突然変異によって誘導された変異株
も、本発明の目的とする酵素活性を有するものであれば
本発明の酵素源として使用できる。

さらに、これらの菌株から遺伝子工学的手法によって得
られた生物体で、本発明の目的とする酵素活性を有する
ものも本発明の酵素源として使用できる。

微生物に由来する酵素含有物質を本発明における酵素源
として使用する場合、このような微生物は常法により培
養され、本発明の目的とする酵素活性を有する微生物菌
体が得られる５ すなわち、培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭
素源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩
、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用
される。具体的には、培地成分として糖類（グルコース
、サッカロースなど）。

天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ｊｌ、米など
）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素源
としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、尿素など、無機塩としては亜
鉛、鉄、マグネシウム。

ナトリウム、カルシウム、カリウムなどの金属のりん酸
塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質としてはビ
タミンＢいビタミンＢ２、パントテン酸、ビオチンなど
が例示される。

培養は通常、液体培養法（振盪培養、通気撹拌培養、静
置培養、連続培養など）によって行われる。

培養条件は、微生物および培地の種類によって異なり、
特定することはできない。通常は、培養開始のｐＨを中
性付近に調整し、約２０〜４０℃の温度条件下で目的と
する酵素活性が十分に得られるまで培養する。

本発明において使用される酵素源としては、本発明の目
的とする酵素活性を有する生物体そのもの、またはこの
ような生物体に適宜な処理を施して得られる処理物が挙
げられる。

ここで生物体そのものとは、生物体を培養して得られた
培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈降分離、凝集
分離、洗浄など）によって分離された本発明の目的とす
る酵素活性を有する生物体で下記の処理を施さないもの
を意味する。生物体が微生物である場合は通常、培養液
から集菌された菌体である。

また、処理物は、上記の生物体を機械的破壊（ワーリン
グ・ブレンダーツフレンチ・プレス。

ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解。

乾燥（凍結乾燥、風乾、アセトン乾燥などによる）。

自己消化（トルエン、酢酸エチルなどの溶媒処理による
）、酵素処理（リゾチームなどの細胞壁溶解酵素による
）、超音波処理、浸透圧ショック法、化学的処理（塩類
溶液、酸性溶液、アルカリ性溶液、界面活性剤、キレー
ト剤などによる）などの一般的処理法に従って処理し、
生物体の破壊、細胞壁もしくは／および細胞膜の変性、
または酵素活性を有する両分の抽出によって、さらに、
必要に応じて酵素活性を有する抽出物を一般的な酵素精
製法（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、
各種クロマトグラフ処理、透析処理などによる）に従っ
て処理し１本発明の目的とする酵素活性を有する両分を
分画することによって得られる。

以上の方法によって得られた酵素源には、高いヌクレオ
シドホスホリラーゼ活性が存在しているが、本発明の目
的には障害となる酵素活性であるヌクレオシダーゼ活性
も存在する。本発明の主目的は、本発明の酵素源を特定
の方法で包括固定化することによって酵素反応時におけ
るヌクレオシダーゼ活性を抑制することにある。

上記特定の固定化方法とは、酵素源と、連鎖構造のプレ
ポリマーの任意の位置に光感応基を有する光硬化性樹脂
との混合物に活性光線を照射し、光反応によって光硬化
性樹脂内に三次元架橋反応を起こさせ、ゲル構造の中に
上記酵素源を包括固定化する方法である。

酵素源が微生物菌体もしくはその処理物である場合は均
一に分散された水性懸濁液として固定化に供される。こ
の懸濁液は有機溶媒または懸濁化剤を含有させることも
できる。

本発明による固定化に使用される光感応基を有する光硬
化性樹脂としては、プレポリマーの主鎖成分と光感応基
であるアクリロイル基、メタアクリロイル基、シンナモ
イル基などのエチレン性不飽和基からなるものが使用さ
れる。なお光感応基はプレポリマー鎖の末端に限らず、
任意の位置に存在することができる。

具体的には、前記光硬化性樹脂としては、ポリアルキレ
ングリコール類の水酸基部分にジイソシアナート類を介
し、前記エチレン性不飽和基を有する酸（例えば、アク
リル酸、メタアクリル酸など）のヒドロキシアルキルエ
ステルをウレタン結合によって結合せしめた不飽和ウレ
タン類が例示される。ここでジイソシアナート類として
は、イソホロンジイソリアナート、キシリレンジイソシ
アナート、トリレンジイソリアナート、ヘキサメチレン
ジイソリアナートなどが挙げられる。また。

ヒドロキシアルキル基としては２−ヒドロキシエチル基
および２−ヒドロキシプロピル基などが挙げられる。

不飽和ウレタン類の好適な例としては、ポリエチレング
リコール、ポリプロピレングリコールあるいはポリエチ
レングリコールとポリプロピレングリコールを任意の割
合で混合したプレポリマーを主鎖成分とし、両末端にア
クリロイル基の結合した光硬化性樹脂プレポリマー（以
下、記載順にｒＥＮＴＪ　、ｒＥＮＴＰＪおよびｒＥＮ
ＴＧＪと略称する。）が挙げられる。ＥＮＴ、ＥＮＴＰ
およびＥＮＴＧは、それぞれ２−ヒドロキシエチルアク
リレート、イソホロンジイソリアナートおよびポリエチ
レングリコール；２−ヒドロキシエチルアクリレート、
イソホロンジイソリアナートおよびポリプロピレングリ
コール；２−ヒドロキシエチルアクリレート、イソホロ
ンジイソリアナートおよびポリエチレングリコールとポ
リプロピレングリコールの混合物；から合成される（Ｅ
ＮＴおよびＥＮＴＰの構造については「酵素工学」。

１９８１年９月１８日、−東京化学同人発行。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ、、　６　、２０７（１９７９）、１ｂｉ
ｄ、且、３２５　（１９７９）、１ｂｉｄ。

８．１４３　（１９７９）参照）。

また、光硬化性不飽和樹脂の例として、骨格中の主鎖末
端もしくは側鎖に水酸基を有する樹脂の水酸基と反応さ
せて光感応基を導入する方法がある。反応方法としては
、エステル化、ウレタン化、アセタール化、エーテル化
等がある。光感応基としては、エチレン性不飽和結合を
持つ代表的なものとしてアクリロイル基、メタアクリロ
イル基、アクリロイルアミノ基、アリル基、ビニルエー
テル基、ビニルチオエーテル基、ビニルアミノ基等を挙
げることができる０以上の光感応基はそれぞれ単独で導
入してもよいし、あるいは２種もしくはそれ以上組合せ
て導入してもよい。

側鎖に水酸基を有する樹脂としては、光硬化後の強度が
大きく、固定化した酵素や菌体の溶離や脱離を少なくで
きるものが望ましく、それには、樹脂自体が繊維、プラ
スチックスとしても利用できる範囲の高分子量水溶性も
しくは水分散性樹脂が好ましい。かかる樹脂の例として
は、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロースなどを挙げることができる１分
子量範囲としては、数平均分子量２０，０００〜５００
．０００、取扱粘度、機械的強度を考慮すると、好まし
くは３０，０００〜２００，０００である。

これらポリビニルアルコール、水溶性セルロース類に不
飽和基を導入する方法として特に有利に使用しうるもの
としては、水酸基のアセタール化反応を利用してＮ−メ
チロールアクリルアミドを導入する方法が挙げられる。

例えば、数平均分子量５０，０００〜１００，０００（
７）ポリビニルアルコール（ｐｖＡ）（ケン化度８５〜
９０％）に水溶液中でＰＶＡ１ｋｇに対し、０．３〜５
モルのＮ−メチロールアクリルアミド（Ｎ−ＭＡＭ）を
酸性触媒（リン酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸など
）を用いてＮ−ＭＡＭのメチロール基とＰＶＡの水酸基
を反応させて不飽和ＰＶＡが合成される。

本発明で使用される光硬化性樹脂は、前記の不飽和ポリ
ウレタン類、不飽和ポリビニルアルコール類および不飽
和セルロース類に限定されず、これと同様の機能を有す
る光感応基を導入した不飽和ポリエステル類、不飽和ア
クリル樹脂、不飽和ポリアミド類、不飽和エポキシド類
など（例えば、特公昭５９−３１９６号公報参照）も同
様に本発明において使用できる。

光硬化性樹脂の選択は、使用する酵素源の種類および物
性、目的とする固定化酵素の形状、物性などに応じて実
験的に行えばよい。

次に酵素源を前記の光硬化性樹脂を用いて包括固定化す
る方法について詳細に説明する。

本発明の固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物は、
基本的には酵素源と、前記の光硬化性樹脂の一種または
二種以上の混合物とを混合した後、活性光線を照射し、
光反応によって架橋反応を起こさせることによって得ら
れる。

架橋反応に際し、光硬化性脂にあらかじめ光増感剤また
は光重合開始剤を混合し、この混合物に酵素源を混合す
ることが好ましい。

光増感剤または光重合開始剤は公知のものを使用するこ
とができ、特定のものには限定されない。

たとえば、ベンゾイン、アセトインなどのα−カルボニ
ルアルコール類、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾイ
ンエチルエーテル、ベンゾインプロピルエーテル、アニ
ツインエチルエーテル、ピバロインエチルエーテルなど
のアシロインエーテル類、α−メチルベンゾイン、α−
メトキシベンゾインなどのα−置換アシロイン類、ナフ
トール。

ヒドロキシアントラセンなどの多環芳香族化合物類、２
−シアノ−２−ブチルアゾホルムアミドなどのアゾアミ
ド化合物類、硝酸ウラニル、塩化第二鉄などの金属類な
どを好適に使用できる。

また、架橋反応に際し、前記の混合物に多糖類（アルギ
ン酸塩など）溶液、水、緩衝液または有機溶媒の一種ま
たは二種以上を添加し、前記混合物を希釈してもよい。

以上の混合物を必要に応じて適宜の形状に成形した後ま
たは成形しながら、活性光線の照射を行って架橋反応を
行わせ、固定化された酵素源、すなわち本発明の固定化
酵素調製物を得る。さらに、固定化後、切断、粉砕等の
手段によって固定化物を適宜の形状に成形してもよい。

なお、光照射前または光照射中に成形を行う方法として
は、前記混合物に目的に応じてアルギン酸塩、カラギー
ナンなどの多糖類を混合し、適当な形状の支持体の表面
にこの混合物を塗布、流延もしくは積層させるか、前記
混合物が浸透可能な支持体（たとえば繊維状支持体など
）に含浸せしめ、多糖類を併用した場合はその凝固剤（
塩化カルシウム、塩化カリウムなど）により凝固させる
方法、または多糖類を混合した前記混合物を凝固液中に
自由流下せしめる方法など任意の方法を採用しうる。こ
こでいう支持体の材質は前記の目的に反しない限り任意
に選択することができ、例えば、合成樹脂１合成繊維、
天然繊維、セラミック、金属などを使用することができ
る。酵素反応に供される固定化物は１以上の成形方法に
依存した任意の形状とすることができるが、具体的には
、膜状（シート、フィルムなど）１層状、粒状、柱状。

線状、繊維状、リング状などの任意の形状が例示される
。

架橋反応に使用する活性光線源は、波長が２２０〜７０
０ｎ＋ｗ、好ましくは２５０〜６００ｎｍの光線を発生
するものであればよい。例えば、低圧水銀ランプ（蛍光
ケミカルランプ、ブラックライト蛍光ランプなど）、高
圧水銀ランプ、蛍光灯、キセノンランプ、カーボンアー
クランプ、太陽光などを光源として使用しうる。架橋反
応に際し、活性光線の照射は９通常１〜１０分間行えば
よい、また。

照射は水溶液中、不活性ガス中、および／または低温条
件下で行うことができる。

かくして固定化された酵素調製物を充填層型、原型、流
動層型、懸濁槽型または撹拌槽型など、前記の固定化物
の形状に適した反応器中において後述の基質溶液と接触
させて酵素反応を行わせることができる。

本発明の酵素反応、すなわち、塩基供与体とリボース化
合物とをヌクレオシドホスホリラーゼ調製物の存在下に
おいて反応させることは公知である（特開昭５８−１９
０３９６号、特開昭５８−２１６６９６号、特開昭５９
−１４３５９９号など）。

本発明の酵素反応の基質は塩基供与体およびリボース化
合物である。

塩基供与体は、目的とするリボヌクレオシドに応じて選
択すればよく、ヌクレオシドホスホリラ−ゼの作用によ
ってリボース化合物のリボース部分とＮ−グリコシド結
合を形成しうる芳香族複素環塩基またはその誘導体であ
ればよい。芳香族複素環塩基の具体例は、例えば、プリ
ン誘導体、ピリミジン誘導体、トリアゾール誘導体、イ
ミダゾール誘導体、デアザプリン誘導体、アザプリン誘
導体、アザピリミジン誘導体またはピリジン誘導体など
である。また、塩基供与体としては、芳香族複素環塩基
そのものはもとより、リボース化合物のリボース部分に
芳香族複素環塩基を転移しうる誘導体、例えばリボフラ
ノシル基以外の糖部分を有するヌクレオシド、ヌクレオ
チドなどであってもよい。

具体的には、プリン塩基の１位、２位、６位または８位
の１または２以上の位置に置換基（例えば、アミノ基、
置換アミノ基、水酸基、オキソ基、メルカプト基、アシ
ル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、
ハロゲノ基など）を有するプリン誘導体、例えばアデニ
ン、グアニン。

ヒボキサンチン、キサンチン、６−メルカプトプリン、
６−チオグアニン、Ｎ′−アルキルもしくはアシルアデ
ニン、２−アルコキシアデニン、２−チオアデニン、２
，６−ジアミツプリンなど。

ピリミジンの２位、４位または５位の１または２以上の
位置に前記と同様の置換基を有するピリミジン誘導体、
例えば、シトシン、ウラシル、チミン、５−ハロゲノウ
ラシル（５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルな
ど）、５−ハロゲノシトシン（５−フルオロシトシンな
ど）、５−トリハロゲノメチルウラシル（５−トリフル
オロメチルウラシルなど）、４−チオシトシン、４−チ
オウラシル、Ｎ４−アシルシトシン、５−ハロゲノビニ
ルウラシルなど、１，２．４−トリアゾールの３位に置
換基を有する１、２．４−トリアゾール誘導体１例えば
１，２．４−トリアゾール−３−カルポキサミド、１，
２．４−トリアゾール−３−カルボン酸、１，２．４−
トリアゾール−３−カルボン酸アルキルエステルなど、
イミダゾールの４位および５位に置換基を有するイミダ
ゾール誘導体１例えば５−アミノ−４−イミダゾールカ
ルボキサミド、４−カルバモイル−イミダゾリウム−５
−オレエートなと、プリンの１位、３位もしくは７位に
おけるデアザプリン誘導体、例えば１−デアザアデニン
、３−デアザアデニン、３−デアザグアニン、７−デア
ザアデニン、７−デアザグアニンもしくはこれらに前記
プリン誘導体と同様の置換基を有する化合物など、８−
アザアデニンなどのアザプリン誘導体、５−アザチミン
。

５−７ザシトシン、６−アザウラシルなどのアザピリミ
ジン誘導体、３−デアザウラシル、ニコチン酸、ニコチ
ン酸アミドなどのピリジン誘導体などが例示される。

また、リボース化合物は、ヌクレオシドホスホリラーゼ
の作用によって塩基供与体の塩基部分とそのリボース部
分がＮ−グリコシド結合を形成しうるリボース誘導体で
あればよい。通常はリボヌクレオシド、リボヌクレオチ
ドまたはリボース−１−りん酸が使用される。

具体的には、リボヌクレオシドとしてはアデノシン、グ
アノシン、イノシン、キサントシン、ウリジン、シチジ
ンなど、リボヌクレオチドとしては上記リボヌクレオシ
ドの２′位、３′位または５′位におけるモノりん酸エ
ステル、ジりん酸エステルもしくはトリりん酸エステル
などが例示される。

以上の塩基供与体およびリボース化合物を含有する反応
液と、本発明の固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ調製
物とを接触させることによって使用した塩基供与体に対
応するリボヌクレオシドが酵素的に合成される。

反応液は塩基供与体およびリボース化合物の一種または
二種以上が水または緩衝液に溶解もしくは懸濁したもの
であればよく、必要に応じてりん酸供与体、有機溶媒な
どを含んでいてもよい、なお１本発明の酵素反応は基本
的にはヌクレオシドホスホリラーゼ作用によるものであ
るから反応液中のりん酸イオンの存在は必須であるが、
基質としてヌクレオチドを使用する場合には酵素源に含
まれるホスファターゼまたはヌクレオチダーゼの作用に
よってりん酸イオンが生成すること、または酵素源自体
にりん酸イオン供与体が含まれることもあるので、必ず
しも反応系外からりん酸イオン供与体を添加する必要は
ない。

りん酸イオン供与体としては１反応液中でりん酸イオン
に解離しうるもののいずれを用いてもよく、例えば遊離
型のりん酸またはりん酸塩（例えば、ナトリウム、カリ
ウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム
などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩など）が好
適に使用される。

また、りん酸イオン供与体としては、反応液中でりん酸
イオンを遊離しうる系、例えば各種りん酸エステル誘導
体とホスファターゼの組合せ、ヌクレオチドとヌクレオ
チダーゼの組合せなどを利用することもできる。

本発明の反応は通常、３５〜７０℃の範囲で効率よく進
行するが、特に４０〜６５℃程度の反応温度が好ましい
。反応温度が３５℃以下のときは反応速度が遅く、各種
の妨害酵素活性も高く、反応効率がよくない。また、７
０℃以上の反応温度ではヌクレオシドホスホリラーゼ活
性を低下させるおそれがある。

反応液の液性は通常ｐＨ４〜１０、好ましくはＰＨ６〜
８の範囲に保たれればよい。反応中にｐＨが変動すると
きは酸またはアルカリを用いて好ましいｐＨ範囲に補正
すればよい。

反応後、反応液と固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ調
製物とを分離し、目的とするリボヌクレオシドを分離精
製工程に供する。

生成したリボヌクレオシドは公知の方法またはこれを応
用した方法によって分離精製することができる。例えば
、イオン交換グロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種の
クロマトグラフィー。

向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法
、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する
方法などの一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜
に組合せて行えばよい。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明の実施の一例を具体的に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するも
のではない。

なお、実施例において目的とするリボヌクレオシドの分
析は高速液体クロマトグラフィーによって行った。

実施例　１ 酵母エキス１．５％を含む培地をＰＨ７，０に調整し、
１２０℃で１５分間殺菌した。この培地にブレビバクテ
リウム・アセチリカムＡＴ−６−７（微工研菌寄第６３
０５号）を植菌し、２８℃にて２４時間振盪培養を行っ
た。この培養液より菌体を集め、Ｏ，ＩＭ）−リス緩衝
液（ＰＨ７，０）で洗浄後、遠心分離して洗浄菌体を得
た。

この洗浄菌体２．Ｏｇを０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７
，０）１．０ｍＪ２に懸濁し、別に作成した光硬化性樹
脂（ＥＮＴ−２０００；関西ペイント■製）８．０ｇに
光重合開始剤としてベンゾインエチルエーテル０．０８
ｇを加えた樹脂液に上記懸濁液を添加し、十分混合した
後、透明フィルム上に流し込み、３６０ｎ１１前後の光
線をフィルム面の表裏に同時に３分間照射して光重合物
を得た。

この固定化物より菌体量として０．２ｇを含む部分を取
り、細断して４０ｍＭ１，２．４−トリアゾール−３−
カルボキサミド、６０ｒａＭ５’−ウリジル酸二ナトリ
ウムおよび８＋ａＭりん酸−カリウムを含む水溶液（基
質溶液）１０−に上記固定化物を投入し、４５℃で７２
時間撹拌しながらリバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノ
シル−１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミド
）の生成反応を行った。対照として前記と同一の洗浄菌
体０．２ｇをそのまま同量の前記基質溶液に投入して同
一条件で反応を行った。それぞれの結果を第１表に示す
。

なお、上記の反応において、化学量論的には生成される
リバビリンと副産物であるウラシルは等モルとなるはず
であるが、使用菌株はヌクレオシドホスホリラーゼ活性
とともにヌクレオチダーゼ活性を有するため、基質であ
る５′−ウリジル酸がリバビリンの生成に利用されずに
分解してウラシルが生成し１反応液中のウラシルとリバ
ビリンの生成モル比は１．０を越える。

以下の表において転換率（％）とは基質として使用した
１、２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドに対す
る生成したリバビリンのモル百分率を示し１モル比とは
生成したりバビリンに対する副生じたウラシルのモル比
（ウラシル／リバビリン（モル比））を示す。

第１表 以上のとおり、本発明の方法においては対照と比較して
「モル比」が低下することからヌクレオシダーゼ活性が
抑制されていることがわかる。また、対照においては反
応時間の経過とともに一度生成されたりバビリンも分解
されたが、本発明の方法においては、生成したりバビリ
ンは分解されずに安定に存在した。

実施例　２ 実施例１と同様にして作成した固定化菌体を内容量１１
５ｍＱのジャケット付カラムに充填し、実施例１と同一
組成の基質溶液を４０ｍΩ／時間の速度で流してリバビ
リン生成反応を行った。結果をリバビリンの転換率（％
）およびウラシル／リバビリンのモル比で表し、第２表
に示した。

第２表 以上のとおり、固定化菌体カラムでは３６０時間通液し
ても転換率の著しい低下はなく、「モル比」の変化もな
かった。

実施例　３ 実施例１と同様にして得た洗浄菌体０．５ｇを用いて実
施例１と同一の方法で作成した固定化菌体と、生菌体０
．５ｇとで回分繰り返し反応方式でリバビリンの生成反
応を行い、転換率の安定性を比較した。

反応は、実施例１と同じ基質溶液を同量用いて４５℃で
行い、２３時間反応ごとに反応液の分析。

酵素源の濾取および基質溶液の投入を行った。結果を第
３表に示す。

以上のとおり、生菌体では６回目以降転換率が急激に低
下していくのに対し、固定化菌体では１２回反応させて
も安定であった。

実施例　４ 実施例１と同様にして作成した固定化菌体（生菌体０．
１６ｇを固定化）を２０ｍＭヒポキサンチン、３０ｍＭ
ウリジンおよび３０ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶
液（ｐＨ７，０）１０−に投入し、５０℃で１８時間撹
拌し、イノシン生成反応を行った。ヒポキサンチンから
イノシンへの転換率は６６．３％であった。

一方、対照として上記と同量の生菌体を用いたほかは同
一条件で反応を行ったところイノシンへの転換率は５８
．５％であった。

実施例　５ 光硬化性樹脂をＥＮＴ−２０００からＥＮＴ−２００Ｏ
Ｎ　（主鎖成分がポリエチレングリコールでエチレン性
不飽和基がメタアクリロイル基である光硬化性樹脂；関
西ペイント■１りに代えた以外は実施例３と同一の方法
でリバビリンの生成反応を行った。結果を第４表に示す
。

第４表 以上のとおり、ＥＮＴ−２００ＯＮでも反応が安定に進
行していることが確認された。

実施例　６ 実施例１と同様にして得た洗浄菌体５．Ｏｇを０．１Ｍ
トＩＪス緩衝液（ｐ）１７．Ｏ）１．０−懸濁させ、３
％アルギン酸ナトリウム溶液２．０−を加えて均一な懸
濁液とした。

光硬化性樹脂（ＥＮＴＧ−３８００；ポリエチレングリ
コール：ポリプロピレングリコール混合比＝８：２；関
西ペイント＠１１）１ｏ、Ｏｇに光重合開始剤としてベ
ンゾインエチルエーテル０．１ｇを加えた樹脂液を上記
菌体懸濁液に添加し、十分混合した後、内径１．４５ｍ
１ｅの管を取り付けた注射器に入れ、０．１Ｍ塩化カル
シウム溶液（ｐＨ７，０）中に滴下し、粒状物を作成し
た。

この粒状物をシャーレにとり、３６０ｎｍ前後の光線を
上下から同時に５分間照射して光架橋重合体である粒状
固定化菌体を得た。

この粒状固定化菌体を菌体量として０．５ｇ含む量だけ
採取し、実施例３と同様の方法で回分繰り返し反応を行
った。結果を第５表に示す。

以上のとおり、ＥＮＴＧ−３８００でも、また粒状固定
化菌体でも反応が安定に進行していることが確認された
。

実施例　７ エルヴィニア・カロトボーラＩＦ○　１２３８０を酵母
エキス１．５％を含む液体培地（ＰＨ７，０）２０ｄに
植菌し、２８℃で２４時間振盪培養した。

実施例１と同様の方法でＥＮＴＧ−３８００を使用して
菌体の固定化物を作成し、２０ｍＭウラシル、３０ｍＭ
イノシン、３０ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶液（
ｐｉ（７，０）を用いて実施例３と同様にしてウリジン
生成反応を行フた。結果を第６表に示す。

第６表 実施例　８ クルチア・シフイーＩＦ０１２０８３を用いて実施例７
と同様にして菌体固定化物を作成し。

３２ｍＭ１，２．４−トリアゾール−３−カルボキサミ
ド、４８ｍＭ５’　−ウリジル酸二ナトリウム、６．４
ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶液を用いて実施例３
と同様にしてリバビリン生成反応を行った。結果を第７
表に示す。

実施例　９ ブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴＣＣ９５３を実
施例７と同様に培養して得られた菌体からＥ　ＮＴ−２
０００およびＥＮＴＧ−３８００を用いて実施例１と同
様の方法でそれぞれの菌体固定化物を作成し、実施例１
と同一の基質溶液１０−を用いて４５℃で２０時間リバ
ビリン生成反応を行った。その結果を第８表に示す。

第８表 参考例　１ 本発明による固定化菌体と生菌体とのヌクレオシダーゼ
活性を比較するために以下の実験を行った。

実施例１と同一の菌株の培養菌体を実施例１と同じ方法
で固定化し、生菌体０．５ｇに相当する固定化菌体を得
た。この固定化菌体を３０ｍＭのウリジン溶液（ｐＨ７
，０）１０−に投入し、４５℃で撹拌し、ウラシルの生
成率を経時的に測定した。また、上記と同一の生菌体０
．５ｇを上記と同一条件で反応させ、ウラシルの生成率
を経時的に測定した。結果を第９表に示す。

第９表 以上のとおり、固定化菌体を使用した場合はウリジンは
４８時間経過後でも全く分解されないのに対し、生菌体
を使用した場合はウリジンの分解が起り、経時的に増加
する。

参考例　２ ２％ブイヨン培地ＩＱに実施例１と同一の菌株を植菌し
、３０℃、２２時間振盪培養した後、遠心分離によって
生菌体を得た。

この生菌体にＡ液（ＩＮ−塩酸２４−、トリス３．４２
５ｇ、ＴＥＭＥＤ　（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’テトラメチ
レンジアミン）０．２３−を溶解して水で１００−に希
釈した水溶液）２０ｄ、Ｂ液〔アクリルアミド３０ｇ、
ＢＩＳ　（Ｎ、Ｎ−メチレン　ビス−アクリルアミド）
ｏ、８ｇを水に溶解して１００−とした水溶液〕２０−
およびＣ液［過硫酸アンモニウム０．３ｇを水に溶解さ
せて２００−とした水溶液］４０−を加えて放置し、菌
体を固定化した。固定化後ホモジナイザーで細片化し、
１８０ｍ１２の固定化菌体を得た。

この固定化菌体１０Ｉ１１１に２０　ｍ　Ｍ　１　、２
　、４−トリアゾール−３−カルボキサミド、２０ｄイ
ノシンおよび２５ｍＭりん酸−カリウムを含む基質溶液
２０ｍ１２　（ｐＨ７、０）を加え、６０℃、２４時間
反応し、反応液を分析したところ６２．８９％のリバビ
リンが生成していた。なお、生菌体を使用して同一条件
で反応を行ったところリバビリンの生成率は６５．４４
％であった。

〔発明の効果〕

ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物において、ヌクレオ
シドホスホリラーゼ活性と共存するヌクレオシダーゼ活
性は１例えば両者の熱安定性の差を利用して５５〜７０
℃程度の温度で反応させることによって抑制することが
できるが、その場合ヌクレオシドホスホリラーゼ活性の
熱失活速度も大きく、工業操作を考えた場合には得策と
はいえない０本発明は酵素源を光硬化性樹脂を用いて固
定化するという簡単な手段によって、ヌクレオシダーゼ
活性を抑制しつつ、より低い反応温度においても酵素反
応を行うことが可能となった。

さらに本発明によれば酵素源中のヌクレオシドホスホリ
ラーゼの熱安定性を増大させ、リボヌクレオシドの製造
において固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物の長
期間にわたる連続使用を可能とした。

本発明においては、他の従来の固定化法に伴う固定化処
理中のヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下がみられ
ない、ヌクレオシダーゼ活性の抑制によりリボヌクレオ
シドを高収率で製造することが可能となった。

これらの効果の総合により、本発明方法はヌクレオシド
ホスホリラーゼの作用によるリボヌクレオシドの製造法
として最良の方法である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）塩基供与体とリボース化合物とをヌクレオシドホス
   ホリラーゼの作用により反応させて塩基供与体の塩基部
   分とリボース化合物のリボース部分との間でＮ−グリコ
   シド結合を形成させてリボヌクレオシドを製造する方法
   であって、該ヌクレオシドホスホリラーゼがヌクレオシ
   ドホスホリラーゼ活性に加えて夾雑活性としてヌクレオ
   シダーゼ活性を有するヌクレオシドホスホリラーゼ調製
   物である方法において、該ヌクレオシドホスホリラーゼ
   調製物として、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に加え
   て夾雑活性としてヌクレオシダーゼ活性を有する酵素源
   とプレポリマーの連鎖構造の任意の位置に光感応基を有
   する光硬化性樹脂との混合物に活性光線を照射して得ら
   れる固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物を使用し
   、ヌクレオシドホスホリラーゼ調製物中に夾雑するヌク
   レオシダーゼ活性を抑制することを特徴とするリボヌク
   レオシドの製造法。 ２）リボヌクレオシドがプリンリボフラノシド、ピリミ
   ジンリボフラノシド、１，２，４−トリアゾールリボフ
   ラノシド、イミダゾールリボフラノシド、デアザプリン
   リボフラノシド、アザプリンリボフラノシド、アザピリ
   ミジンリボフラノシドおよびピリジンリボフラノシドか
   らなる群から選ばれるものである特許請求の範囲第１項
   記載の製造法。 ３）１，２，４−トリアゾールリボフラノシドが１−β
   −Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３
   −カルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，
   ２，４−トリアゾール−３−カルボン酸および１−β−
   Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−
   カルボン酸アルキルエステルからなる群から選ばれるも
   のである特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４）１，２，４−トリアゾールリボフラノシドが１−β
   −Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３
   −カルボキサミドである特許請求の範囲第３項記載の製
   造法。 ５）酵素源が微生物菌体である特許請求の範囲第１項記
   載の製造法。 ６）微生物が細菌、放線菌および酵母からなる、群から
   選ばれる特許請求の範囲第５項記載の製造法。 ７）細菌がブレビバクテリウム属、エルヴィニア属およ
   びクルチア属からなる群から選ばれる属に属する微生物
   である特許請求の範囲第６項記載の製造法。 ８）細菌の菌株がブレビバクテリウム・アセチリカムか
   ら選ばれる特許請求の範囲第６項記載の製造法。 ９）細菌菌株がブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴ
   −６−７（微工研菌寄第６３０５号、ＡＴＣＣ３９３１
   １）である特許請求の範囲第８項記載の製造法。 １０）光感応基を有する光硬化性樹脂がプレポリマーの
   主鎖成分とエチレン性不飽和基の光感応基からなる樹脂
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 １１）光感応基がアクリロイル基、メタアクリロイル基
   、アクリロイルアミノ基、アリル基、ビニルエーテル基
   、ビニルチオエーテル基、ビニルアミノ基からなる群か
   ら選ばれる特許請求の範囲第１０項記載の製造法。 １２）樹脂がポリアルキレングリコールの水酸基にジイ
   ソシアナート類を介してエチレン性不飽和基を有する酸
   のヒドロキシアルキルエステルをウレタン結合により結
   合させた不飽和ウレタン類である特許請求の範囲第１０
   項記載の製造法。 １３）ジイソシアナート類がイソホロンジイソリアナー
   ト、キシリレンジイソシアナート、トリレンジイソリア
   ナート、ヘキサメチレンジイソリアナートからなる群か
   ら選ばれる特許請求の範囲第１２項記載の製造法。 １４）不飽和ウレタンがポリエチレングリコール。 ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコ
   ールとポリプロピレングリコールを任意の割合で混合し
   たプレポリマーを主鎖成分とし、両末端にアクリロイル
   基を結合させた光硬化性樹脂である特許請求の範囲第１
   ２項記載の製造法。 １５）プレポリマーの主鎖成分がポリビニルアルコール
   、エチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロー
   スからなる群から選ばれる樹脂である特許請求の範囲第
   １０項記載の製造法。 １６）ヌクレオシドホスホリラーゼによる塩基供与体と
   リボース化合物との反応が３５〜７０℃の温度範囲で行
   われる特許請求の範囲第１項記載の製造法。 １７）反応が、ｐＨ４〜１０に維持された溶液中で行わ
   れる特許請求の範囲第１６項記載の製造法。 １８）ブレビバクテリウム・アセチリカムに属する微生
   物に由来する酵素源とプレポリマーの連鎖構造の任意の
   位置に光感応基を有する光硬化性樹脂との混合物に活性
   光線を照射して調製される固定化ヌクレオシドホスホリ
   ラーゼ調製物。