JPS6025119B2 - リバビリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明はリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）の酵素的な
製造法に関するものである。

リバビリンの化学名は１−Ｂ−Ｄ−リボフラ／シルー１
，２，４−トリアゾール−３ーカルボキサミドであり、
バィラゾール（Ｖｉｒａｚｏｌｅ）とも称され、ＤＮＡ
およびＲＮＡウイルスに対して広範囲で強力な抗ウイル
ス作用を示す化合物として知られている（アナルズ・オ
ブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．）２８
４，２７２〜２９２（１９７７））。

従来技術従来知られているリバビリンの製造法としては
合成法、発酵法および酵素法がある。

合成法の代表的な方法としては、３−メトキシカルボニ
ル−１，２，４ートリアゾールと１−○−アセチルー２
，３，５ートリー○ーアシルー８一○ーリボフラノース
を反応させ（溶融法）、得られた１−（Ｚ，３′，５ー
トリー○−アシルー８−Ｄ−リボフラノシル）−３ーメ
トキシカルボニル−１，２，４ートリアゾールをアンモ
ニアで処理し、アミド化と脱保護を行う方法（特開昭４
８−４４６９号、袴関昭４９一８００７び号、特開昭４
９−８００７１号各公報参照）、前記と同様の方法にお
いてトリアゾールの３位の置換基としてアラルキルオキ
シ基を用いる方法（特関昭５５一１６０７９３号公報参
照）、３ーメトキシカルボニル一１，２，４−トリアゾ
ールをトリメチルシリル化し、２，３，５−トリー○−
ペンゾイルー８−Ｄーリポフラ／シドのハロゲン化合物
と反応させた（シリル化法）後、アンモニアで処理する
方法（椿開昭４８−４４６ｙ号、袴関昭４９一８６３７
２号各公報参照）などが知られている。

このような合成法は、いずれも反応前に原料化合物の活
性基を保護する必要があり、また反応に際してはリポー
スの活性化が必要であったり、高温に加熱する必要があ
る場合もあり、さらに、反応後に脱保護およびアミド化
が必要であるなど反応操作が煩雑であるなどの問題があ
ると思われる。また、縮合反応の位置選択性はいずれも
高くないようである。発酵法としては、ブレビバクテリ
ゥム属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属、
ミクロコッカス属またはバチルス属に属する微生物を培
養して増殖させる際に、使用生物の培養のために必要な
炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養物を含有する培
地に、培養開始または培養中、一時にまたは間歌的に１
，２，４−トリアゾールー３ーカルボキサミドを添加し
、培養開始後２〜８日間という長期間にわたって培養し
、培地中にリバピリンを生成蓄積させる方法が知られて
いる（持公昭５４−１７８３０号公報、日本農業化学会
議、５０（９），４２３〜４３０（１９７６）参照）。

この方法は、しかしながら、次のような欠点を有するも
のを思われる。すなわち、■リバビリンの製造は微生物
の増殖中に栄養塔地中で行われるので、まず微生物を増
殖させるために各種の栄養源を含有する培地を調製しな
ければならず、種菌を楯菌する前にこれらの培地を殺菌
しなければならないなど前処理が煩雑である。■リバビ
リンの蓄積を目的とする、微生物の増殖を伴う培養は、
通常２０〜４０℃の常温で行われるので、常に雑菌汚染
への配属が必要であるばかりでなく、このような条件下
ではリバビリン分解活性も存在しているので、生成した
りバビリンも分解され、目的物の収量が低下する。■培
養を２〜８日間という長期間にわたって行わなければな
らない。■各種のヌクレオシド、リバビリンのりん酸化
物、その他の代謝産物が富』生し、培養液からリバビリ
ンを回収するためには、原料化合物だけでなく、各種の
副生物とも分離しなければならず単離精製が煩雑である
。■微生物をリバビリンの製造の度に培養しなければな
らない。また、酵素的な製造法としては１，２，４−ト
リアゾールー３−カルボキサミドとりボース−１一りん
酸とを柵５〜９、温度０〜５０℃の条件下でヌクレオシ
ドホスホリラーゼの存在下において反応させる方法が知
られている（特関昭５０−２９７２０号公報参照）。

この方法も、■リボース供与体として用いられるリボー
スー１−りん酸が不安定である上に、入手が容易でない
、■酵素として精製酵素が用いられており、酵素の調製
が容易でないなどの欠点を有するものと思われる。発明
の概要 要旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌体処理物
を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に酵素反応によっ
てリバビリンを生成させることができることを初めて知
見し、この知見に基づいて本発明を完成した。

本発明は、下記の群から選んだ属り属して１，２，４−
トリアゾール−３−カルボキサミドとりボース供与体か
らのりバビリンを生成する反応を触媒する酵素系を含有
する微生物の酵素作用下に、１，２，４−トリアゾール
ー３ーカルボキサミドまたはその塩とりポース供与体と
を前記微生物の非増殖条件において水性媒体中で接触さ
せてリバビリンを生成させることを特徴とするりバビリ
ンの製造法を提供するものである。

‘１’プレビバクテリゥム属（ブレピバクテリウム・ア
セチリカムを除く。

）、｛２１コリネバクテリウム属、｛３１アースロバク
ター属、‘４１ミクロコッカス魔、‘５１バチルス属。
本発明で「微生物の酵素作用下に」ということは、この
微生物の培養物、菌体または菌体処理物の存在下という
ことを意味する。

本発明方法と、従釆の発酵法および酵素法とが最も相違
する点は、本発明においては微生物の培養物、菌体また
は菌体処理物を酵素剤とし、しかも微生物が増殖しない
、酵素反応に最適な条件下で反応基質である１，２，４
ートリアゾールー３−カルボキサミドまたはその塩とり
ポース供与体とを反応させる点である。

効果 本発明方法は、発酵法に比べて、■微生物の非増殖条件
、たとえば高温条件下で反応を行う場合には雑菌汚染が
ほとんどなく、リバビリンの分解反応が抑制されるので
リバビリンの収率低下がない、■酵素反応なので反応時
間が短かく、副生物の生成も少なく、リバビリンの単離
精製が容易である、■酵素源の反復使用も、連続使用も
可能である、■酵素源の保存が可能であり、酵素源の調
製および使用を任意な時期に行うことができるなどの利
点がある。

また、酵素法に比べて■酵素源の調製が容易である、■
リボース供与体をヌクレオシド、ヌクレオチドなどから
広く選択でき、リボース供与体の入手が容男であるなど
の利点がある。また、本発明方法の最適の酵素源を選択
すれば、従来のこれらの方法に比べてはるかに高収率に
リバビリンを製造することができる。発明の具体的説明 酵素源／使用微生物 本発明において用される微生物は、その培養物、菌体ま
たは菌体処理物が、１，２，４ートリアゾールー３ーカ
ルボキサミドとＩＪポース供与体との反応を触媒し、リ
バビリンを生成する酵素系を含有するものであり、具体
的にはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ鼠ｃｔｅｒｉｕ
ｍ；以下、「Ｂ．」と略すこともある。

）嵐（Ｂ．アセチリカムを除く）、コリネバクテリウム
（ＣｏひＭｂａｃにｒｊｕｍ：以下、「Ｃ．」と略すこ
ともある。）属、アースロバクター（山ｔｈｒｏ舷ｃｔ
ｅｒ；以下、「Ａ．」と略すこともある。）属、ミクロ
コツカス（Ｍｊｃｒの比ｃｕｓ：以下、「Ｍ．」と略す
こともある。）属またはバチルス（Ｂａｃｍ雌：以下、
「欧ｃ．」と略すこともある。）属に属し、前記の酵素
活性を有する微生物が拳げられる。本発明においてはこ
のような基本的性質を有するものである限り、特に使用
菌株の種類に限定されるものではない。本発明の目的と
するりバビリン製造のための酵素活性が強く、かつ当業
者が容易に入手できる菌株を以下に例示する。

ブレビバクテリウム・インベリアレ （Ｂ．ｉｍｐｅｄａｌｅ） ＡＴＣＣ
総６５コリネバクテリウム・エクイ（Ｃ．ｅｑｕｉ）ｌ
ＡＭ ＩＯ斑バチルス・ズブチルス（欧ｒ．ｓ肋ｔｉｌ
ｉｓ）ＡＴＣＣ１４５９３バチルス・セレウス（母ｒ．
ｃｅｒｅｕｓ）ｌＡＭ Ｉ０２９ミクロコツカス・ルテ
ウス（Ｍ．１山ｅ雌）ＡＴＣＣ ４６９８同上
山Ｍ Ｉ０５６ ミクロコツカス・ヴアリアンス（Ｍ．ｖａｒｉａｎｓ）
ＩＦ０３７６５（ＡＴＣＣ３９９） ミクロコツカス・ロゼウス（Ｍ．ｒｏｓｅｕｓ）ＩＦ０
３７６８（ＡＴＣＣ １８６） アースロバクタ−・シトレウス（Ａｃｉｔｒｅ順）ＩＦ
Ｏ １２９５７（ＡＴＣＣ Ｉ１６２４） アースロ／ゞクター・グロビホルミス （Ａｇｏｂ胸ｒｍｉｓ） ＩＦＯ１２１
３７（ＡＴＣＣ ８０１０）なお、上記菌株の寄託番号
において、ＡＨＣＣを付した番号はアメリカン・タイプ
カルチュアー・コレクション（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅＣｕｌｔ川ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）におけ
る寄託番号を、ＩＦＯを付した番号は財団法人 発酵研
究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｅｎｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ，０ｓａｋａ）における寄託番号を、ｌＡＭを付し
た番号は東京大学応用微生物研究所（ ｌｍｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｏｋｙｏ）におけ
る寄託番号を、それぞれ示すものである。

ＡＴＣＣ番号を付された菌株はＡｍｅｎｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｃａｔａ
ｌｏｇｕｅｏｆＳｔｒａｉ肥 １，ＦｉｎｅｅｎｔｈＥ
ｄｉｔｉｏｎ，１９８２に収載されている保存菌である
。またｍ○、およびｌＡＭ番号を付された菌株は日本微
生物保存株目録（ＪＦＣＣ Ｃａｔａｌｏ沙ｅ ｏｆＣ
ｕｌｔｍｅｓ）１９７９，ＴｈｉｒｄＥｄＭｏｎまたは
１船ｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｅｒｍｅｎねｔｏｉｎＣｂａ
ｋａ，ＬｉｓｔｏｆＣのｔｕｒｅｓ１９７８，Ｓｉ×比
Ｅｄｉｔｉｏｎに収載されている保存菌株である。こ
れらの保存菌株の属名または種名は分類基準の変更など
によって変えることもあるが、このような菌株であって
も前記例示の菌株と同一もしくは均等の菌学的性質を有
するものは、その属する属名にかかわらず前記例示の菌
株と同一とみなされる。また、前記の菌株から、紫外線
、Ｘ線、ソ線の照射などの物理的処理もしくはニトロソ
グアニジンなどによる薬剤処理など、一般的変異議導法
による誘導突然変異または自然の原因に起因する自然突
然変異によって誘導された変異株も、本発明の目的とす
るりバビリン製造に関与する変異株も、本発明の目的と
するりバビリン製造に関与する酵素活性を失なわない限
り、本発明に使用される。

さらに、以上のような本発明に好適に使用される菌株か
ら得られた本発明の目的とするりバビリン製造に関与す
る酵素系の遺伝子がブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、アースロバクター属、ミクロコッカス属ま
たはバチルス属以外の微生物に取り込まれてそのような
形質が発現するに至った場合、このような微生物の培養
物、培養菌体またはその処理物を本発明の目的に使用す
る方法は、本発明に包含される。

酵素源の調製／培養 本発明に使用する培養源を調整するために、これらの微
生物を培養するに際しては、使用される培地および培養
法は、これらの微生物が生育する限り、特に限定されな
い。

培地としてこれらの微生物が資化可能な炭素源および窒
素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、徴量発育促
進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。

具体的には、炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、マルトース、ガラクトース、リボース、サツカロー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糠類も
しくはその脂肪酸ェステルなどの誘導体、麦、雛、米な
どの天然炭化水素、グリセロール、マンニトー、メタノ
ール、エタノールなどのアルコール類、グルコン酸、ビ
ルビン酸、酢酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパ
ラフィン、ケロシンなどの炭化水素類、グリシン、グル
タミン酸、グルタミン、アラニン、アスパラギンなどの
アミノ酸類など、一般的な炭素源より使用する微生物の
資化性を考慮して一種または二種以上を適宜に選択して
使用すればよい。窒素源としては、肉エキス、ベプトン
、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミ
ルクカゼイン、カゼミノ酸、各種ァミ／酸、コーンステ
イープリカー、コットンシードミールないしその加水分
解物、フィッシュミールないしその加水分解物、その他
の物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物
、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナ
トリウムなどの硝酸塩、尿素など無機窒素化合物より使
用微生物の資化性を考慮し、一種または二種以上を適宜
に選択して使用する。さらに、無機塩として徴量のマグ
ネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カル
シウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭
酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種または二種以上を適宜
添加し、必要に応じて植物油、界面活性剤などの消泡剤
、ビタミンＢ，Ｂ２、ニコチン酸、バントテン酸、ビオ
チン、ｐーアミノ安息香酸などの徴量発育促進物質を添
加してもよい。また、栄養要求を同時に示す微生物を使
用する場合、当然その生育を満足させる物質を培地に添
加しなければならない。培養は、前記培地成分を含有す
る液体塔地中で振滋培養、通気櫨操培養、静直培養、連
続培養などの通常の培養法より使用微生物に適した培養
法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいが、通常は培養開始のｐＨを約６〜８に調
整し、約２５〜３５ｑ０の温度条件下で培養を行う。

培養期間は使用微生物の生育に十分な時間があればよく
、通常１〜３日間である。酵素源の態様本発明方法にお
いて使用される酵素源は、１，２，４−トリアゾール−
３ーカルボキサミドとりボース供与体とからリバビリン
を生成する反応を触媒する酵素系を含有するものである
。

本発明方法における酵素反応の主たる必須酵素はヌクレ
オシドホスホリラーゼであり、本発明に使用する酵素源
としては本酵素活性を有することが必頚である。

さらにリボース供与体として本酵素の直接の基質となら
ないものを使用する態様においては、リボース供与体か
ら基質に導く酵素系の活性を含有するものであることが
好ましい。以上のように微生物を培養した後、得られた
培養物、培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離など
の通常の方法によって集菌した生菌体、または生菌体に
適宜な処理を施して得られる菌体処理物を本発明におけ
る酵素源として使用できる。ここで、培養物とは培養後
の培地の培養菌体が禾分離の状態のものをいう。また、
菌体処理物とは、乾燥菌体、細胞膜および（または）壁
変性菌体、破砕菌体、菌体抽出物、本発明の目的とする
りバビリンの製造に関与する酵素活性を有する菌体抽出
物の蛋白質画分もしくはその精製物蛋白質画分もしくは
その精製物の固定化物などを指称する。菌体処理物を得
るための方法を以下に例示する。すなわち、■生菌体に
対し、たとえば凍結融解処理、凍結乾燥処理、通風乾燥
処理、アセトン乾燥処理、酸性ないしアルカリ性下にお
ける加温処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧差処理な
どの物理的処理手段、もしくはたとえば、リゾチーム、
細胞溶解酵素などの酸素処理、トルェン、キシレン、ブ
チルアルコール（ブタノール）などの溶媒もしくは界面
活性剤との接触処理などの化学的ないし生物化学的処理
を単独もしくは粗も合せて施すことにより、また、■菌
体抽出物に対し、たとえば塩析処理、等露点沈澱処理、
有機溶媒沈澱処理、各種クロマトグラフ処理、透析処理
などの酵素分離精製手段を単独もしくは組み合せて施す
ことにより、さらに、■生菌体、菌体抽出物もしくはそ
の精製物に包括処理、架橋処理、迫体への吸着処理など
の酵素固定化手段を施すことにより菌体処理物を得るこ
とができる。反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は１，２，４−トリ
アゾールー３−カルボキサミドおよびリボース供与体で
ある。

１，２，４−トリアゾールー３−力ルボキサミド‘ま遊
離型またはナトリウム塩などの塩のいずれも使用できる
。

リボース供与体としてはリポヌクレオシドもしくはＤー
リボースまたはこれらの各極りぼ酸ヱステルのいずれで
もよい。

すなわち、リポヌクレオシドはその塩基部分がプリン系
またはピリミジン系のいかなる塩基であってもよく、天
然物由釆であれ化学合成によるものであれ使用すること
ができる。また、リボヌクレオシドもしくはＤーリボー
スの糖部水産基は非置換のものであってもあるいは、２
位、３位もしくは５位水酸基のいずれか一個所、二個所
もしくは全てにモノりん酸ェステル残基、ジりん酸ェス
テル残基、トリりん酸ェステル残基を有するものであっ
てもよい。また、これらのりん酸ェステルは遊離型であ
ってもよく、またナトリウム、カリウム、カルシウム、
マグネシウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム
などの一般的なアルカリ塩であってもよい。リポース供
与体の具体例としてはイノシン、アデノシン、グアノシ
ン、キサントシン、ウリジン、シチジンなどのりボヌク
レオシド、５′−イノシン酸、５ーアデニル酸、５′−
グアニル酸、５′一千サンチル酸、５′ーウリジル酸、
５′ーシチジル酸、２（３）ーィノシン酸、？（３′）
ーアデニル酸、２（３′）ーグアニル酸、２（３）ーキ
サンチル酸、２（３′）−ウリジル酸、２′（３′）ー
シチジル酸などのりボヌクレオシド、Ｄーリボース、Ｄ
−リボース−１−りん酸などが例示される。反応基質溶
液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基本的には
前記の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性
液である。

水性液中には前記の反応基質のほかに、必要に応じてり
ん酸イオン供与体、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類、
補酵素類、酸、塩基、糟類などの酵素反応を促進する物
質、反応基質の溶解性を向上させる物質、酵素と反応基
質の接触を向上させる物質等を含有していてもよい。

水性媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩衝
液（りん酸緩衝液、ィミダゾール−塩酸緩衝液、ベロナ
ール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）を用いる
ことができる。

本発明の酵素反応は主にヌクレオシドホスホリラーゼの
作用に基づくものであり、それ故反応系にりん酸イオン
の存在が必要である。

酵素反応系のりん酸イオンが存在しない場合は、りん酸
イオン供与体の添加が必要である。りん酸イオン供与体
としては、水性媒体中でりん酸イオンに解離しうるもの
のいずれを用いてもよく、たとえば遊離型のりん酸その
もの、無機りん酸塩、たとえばナトリウム、カリウムな
どのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのア
ルカリ士類金属、アンモニウムとの塩が好適に使用され
る。

また、りん酸イオン供与体としては、酵素反応液中でり
ん酸イオンを遊離しうる系、たとえばリボース供与体の
ＩＪボヌクレオチドとホスフアターゼの縄も合せ、同じ
くヌクレオチドとヌクレオチターゼの組み合せなどを利
用することができる。このような系における反応に関与
する酵素は、本発明に使用される酵素源に混在するもの
であってもよく、別途添加された酵素、またはその酵素
活性を有する菌体もしくは菌体処理物等であってもよい
。以上のようなりん酸供与系は、酵素反応に際して系外
から添加されたものでも、酵素源がその成分として含有
しているものであってもよい。すなわち、酵素反応に利
用しうる形態である限り、上記の物質の単独もしくは二
種以上を絹合せた系を、または上記の物質を含有する微
生物菌体もしくはその菌体処理物を、本発明の酵素反応
に際して反応液に別途添加してもよく、あるいは収用微
生物が菌体成分として含有しているこれらの物質そもの
まま利用してもよい。有機溶媒としては、たとえばメタ
ノール、エタノール、プロ／ｆノール、ブタノール、ベ
ンタノール、ァセトソ、メチルエチルケトン、酢酸エチ
ル、トルエン、テトラヒドフラン、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホル
ムアミド、２ーメトキシエタノ−ル、２′−エトキシエ
タノール、１，２−ジメトキシェタンなどが例示される
。

接触方法 本発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを水性媒体
中で微生物の非増殖条件下において接触させることによ
り達成される。

接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択すればよ
いが、通常、酵素源を反応基質溶液に懸濁もしくは溶解
し、好ましくは加溢しながら凝梓もしくは振盤するバッ
チ方式、または酵素源を必要に応じて適当な担体、助剤
、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラム
に充填し、反応基質溶液を通液するカラム方式などが適
用される。

反応基質および酵素源の濃度もしくは添加量反応に際し
、反応液の基質濃度は特に制限されるものではなく、反
応温度における使用水性媒体に対する基質の飽和濃度以
下の基質濃度が通常孫用されるが、反応基質溶液に添加
された前記の有機溶媒、界面活性剤などにより基質濃度
を増大させることもできる。

また、反応鮫中に飽和濃度以上の基質を懸濁状態に存在
させ、反応の進行に従って各基質を溶解させることもで
きる。また、基質を反応中に逐次添加して、その濃度を
適当レベルに保つこともできる。基質を溶解させる場合
、基質濃度は１，２，４−トリアゾール−３−カルボキ
サミドまたはその塩については通常５〜２０仇ｈＭ程度
、好ましくは１０〜１０仇ｈＭ程度である。リボース供
与体については、これを別途添加する場合は通常５〜３
０血程度、好ましくは１０〜１５仇Ｍ程度である。酵素
源の使用量は微生物の種類、その使用形態、反応効率、
経済性などを考慮し、当業者が予備実験等によって容易
に決定できるものであるが、通常バッチ方式の場合、た
とえば生（湿）菌体であれば１０〜１５０のタノの‘基
質溶液程度、乾燥菌体であれば２〜３０の２／の【基質
溶液程度であればよＬ〈、カラム方式においてはバッチ
方式に準じて適当な量を設定することができる。

反応条件 本発明の反応の条件は、菌体等を非増殖条件下、すなわ
ち休止もしくは死滅菌体の状態で反応・に供すること以
外は特に限定されない。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物が増殖できない温度範囲（ただ
し、本発明の反応に関与する酵素が失活しない温度範囲
である。

）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかじめ前記の
とおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理すること
によって微生物を増殖できない状態にした後、反応に供
する方法、反応に際して、たとえばトルェンなどの使用
微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に添加する
方法などを単独にあるいは組み合せて採用すればよいが
、特に反応温度を操作する方法が最も効果的で簡便であ
る。本発明の反応りおいて反応温度は上記のとおり重要
な条件であり、本発明を特徴づけるものである。

反応は３７〜８０午０の範囲において進行するが、実用
性を考慮すれば４０〜７０ｏＣの範囲が好ましい。なお
、最適の温度条件は反応基質の種類によって異るが、当
業者であれば予備実験などにより、容易に決定すること
ができる。４０００以上の温度範囲で酵素反応を行うこ
とにより、使用微生物の生育は大部分抑制される。反応
基質溶液の潟性は、通常ｐＨ４〜ｌｕ好ましくはｐＨ６
〜８の範囲に保たれればよく、反応中に柵が変動すると
き‘ま、塩酸、硫酸、りん酸などの酸または水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモニアガ
スなどのアルカリを用いて好ましいｐＨ範囲に補正すれ
ばよい。反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確
認しながら決定すればよいが、通常バッチ方式では２〜
４虫時間程度、好ましくは２４〜３曲時間程度反応させ
ればよく、カラム方式ではバッチ方式に準じて適当な条
件を設定して反応させればよい。

分離精製反応後、必要に応じて菌体等を炉過、遠心分離
または凝集分離などの常法によって分離除去し、リバピ
リンの分離精製工程に供する。

リバビリンの分離精製は、公知の方法またはこれを応用
して行えばよく、たとえばイオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー
、ゲル炉適法など各種のクロマトグラフィー、同流分配
、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、
冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法など
の一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。

分析 本発明の実施例等においてリバビリンおよび１，２，４
−トリアゾール−３ーカルボキサミドの分析は高速液体
クロマトグラフィーによって行った。

以下に示す装置および条件で分析すると、リバビリンは
保持時間３．５０分付近に、１，２，４ートリアゾール
ー３ーカルボキサミドは保持時間２．６母分付近に港出
され、検量線よりそれぞれの量を算出できる。装 置：
島津高速液体クロマトグラフＬＣ−３Ａ型（■島津製作
所製）力ラム：マイクロ・ボンダパツク（ム ＢＯＮＤＡＰＡＫ） Ｃ，８，４．６帆×２５仇蚊（日本ウオーターズリミテ
ッド社製）溶出剤：２％アセトニトリルを含む２山ｈＭ
トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）流 速：１の【／分 測定波長：松則血 カラム操作温度：室温 実施例 以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明する。

実施例 １第１表に示す各菌株を粉末ブイヨン（極東製
薬工業■製）２％水溶液のブイヨン塔地各５０心に植菌
し、２がｏ、２蝿寿間振遼培養後、遠心分離によって桑
菌し、殺菌水を加えて菌体懸濁液各５のＺを得た。

２伽Ｍ１，２，４‐トリアゾール−３ーカルポキサミド
、２肌Ｍイノシンおよび２抗Ｍりん酸一カリウムを含む
水溶液（ｐＨ７．０）各５私に前記菌体懸濁液各５の‘
を加え、６び○、２４時間反応させた。

反応終了後、遠心分離によって除菌し、上燈液のＩＪバ
ピリン生成率を分析したところ、第１表に示すとおりで
あった。第１表 実施例 ２ コリネバクテリウム・エクイ仏ＭＩＯ聡を１．５％酵母
エキス塔地（ｐＨ７．０）９凧【に楢菌し、２８ｏｏで
１日振綾培養した。

培養液より遠心分離によって集菌した。２ＭＭ１，２，
４−トリアゾールー３ーカルボキサミド、２皿Ｍの第２
表に示す各種リボース供与体および２軌Ｍりん酸ーカリ
ゥムを含有する水溶液（ｐＨ７．０）各１の‘に上記菌
体を水１泌に懸濁した懸濁液１の‘を加え、４５ｑ０で
２４時間反応させた。

反応後、実施例１と同様にリバビリン生成率を測定した
ところ第２表に示す通りであった。

第２表実施例 ３ 使用微生物としてバチルス・ズブチリス ＡＴＣＣＩ４５９３を用い、リボース供与体として２位
ｈＭの第３表に示すヌクレオチドを使用するほかは実施
例２と同様に操作し、第３表の結果を得た。

第３表 実施例 ４ 使用微生物としてブレビバクテリウム・ィンベリアレ
ＡＴＣＣ８３６５を用い、リボース供与体として２肌Ｍ
の第４表に示すヌクレオチドを使用するほかは実施例２
と同様に操作し、第４表の結果を得た。

第４表 実施例 ５ 使用微生物としてアースロバクタ−・シトレウス ｍ０
１２９５７を用い、リポース供与体として２瓜ｈＭのＧ
ＭＰ・がａを用いるほかは実施例２と同様に操作し、リ
バビリン生成率を測定したところ、２２．５０％であっ
た。

実施例 ６ 実施例２と同一の菌体を用い、リボース供与体として第
５表に示す化合物を使用し、反応温度を６０ｑ０とする
ほかは実施例２と同じ方法で反応を行なった。

結果を第５表に示す。第５表 実施例 ７ 実施例４と同一の菌体を用い、リポース供与体として第
６表に示す化合物を使用し、反応温度を６０こＣとする
ほかは実施例４と同じ方法で反応を行った。

結果を第６表に示す。第６表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の群から選んだ属に属して１，２，４−トリア
   ゾール−３−カルボキサミドとリボース供与体とからリ
   バビリンを生成する反応を触媒する酵素系を含有する微
   生物の酵素作用下に、１，２，４−トリアゾール−３−
   カルボキサミドまたはその塩とリボース供与体とを前記
   微生物の非増殖条件下において水性媒体中で接触させて
   リバビリンを生成させることを特徴とする、リバビリン
   の製造法。 （１） ブレビバクテリウム属（ブレビバクテリウム・
   アセチリカムを除く）、（２） コリネバクテリウム属
   、 （３） アースロバクター属、 （４） ミクロコツカス属、 （５） バチルス属。 ２ 酵素反応を微生物の非増殖条件下において行う方法
   が、反応液を微生物の増殖できない温度条件に保持して
   反応を行う方法、微生物菌体をあらかじめ該微生物が休
   止もしくは死滅する方法によつて処理し、これを用いて
   反応を行う方法、および反応液に微生物の増殖を阻害す
   る物質を添加して反応を行う方法からなる群より選ばれ
   た一種の方法または二種以上を組み合せた方法である特
   許請求の範囲第１項記載のリバビリンの製造法。 ３ 微生物の非増殖条件が、３７〜７０℃の温度条件で
   ある特許請求の範囲第１または２項記載のリバビリンの
   製造法。