ES2241487B2 - Procedimiento para la sintesis de nucleosidos mediante la utilizacion de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. - Google Patents
Procedimiento para la sintesis de nucleosidos mediante la utilizacion de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes.Info
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Abstract
Procedimiento para la síntesis de nucleósidos mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. La presente invención se refiere a la síntesis de nucleósidos purínicos, nucleósidos pirimidínicos derivados de 5''-fluoruracilo y 5''-clorouracilo o triazoles, por intercambio de bases, mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. La reacción ocurre partiendo de nucleósidos de uracilo, en un solo paso, a menor temperatura que la utilizada hasta ahora, no observándose reacciones secundarias de degradación del nucleósido formado. Los microorganismos seleccionados son Bacillus psychrosaccharolyticus; Bacillus subtilis ssp. niger; Photobacterium leiognathi; Photobacterium phosphoreum; Psychrobacter immobilis.
Description
Procedimiento para la síntesis de nucleósidos
mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o
psicrotolerantes.
La presente invención, según se expresa en esta
memoria descriptiva, se refiere a la utilización de microorganismos
psicrotrofos en la síntesis de nucleósidos por intercambio de
bases. El proceso es válido para la obtención de nucleósidos
naturales, o no naturales, con buenos rendimientos y
enantioselectividades. Estos compuestos tienen interés como
medicamentos genéricos de actividad antiretroviral, antitumoral o
para la terapia antisentido. Derivados de estos nucleósidos
obtenidos mediante modificaciones simples se pueden utilizar en la
inhibición de la difusión facilitada de nucleósidos naturales para
el tratamiento de ciertas leucemias, agonistas de receptores
A_{1}, A_{2A}, A_{2B}, A_{3}, antiinflamatorios, enfermedad
de Huntington, taquicardias, etc. Su aplicación es en el campo de
la Industria Farmacéutica y en la Industria Veterinaria.
Los análogos de nucleósidos naturales presentan
muchas aplicaciones en terapéutica. Entre ellas, las más
contrastadas son el tratamiento de enfermedades de origen viral
(Dimoglo A.S.; Gorbachov M.Y.; Lesnik T.I.; Saragoglu M.; Yildirich
I.- Current Medicinal Chemistry 1977, 4,
23-34) y el tratamiento de diversas neoplasias
(Sanders P.P.; Kutan R.; Lay M.M.; Robins R.K.- Mol.
Pharmacol. 1983, 23, 534-538).
A partir de 1985 - cuando se descubre que el AZT
(3'-azido-3'-desoxitimina)
inhibe la replicación de los virus HIV-1 y
HIV-2 in vitro - han sido innumerables las
moléculas análogas diseñadas para combatir el SIDA, donde los
2',3'-didesoxinucleósidos constituyen la principal
arma terapéutica contra este tipo de virus. Sin embargo, los
efectos tóxicos colaterales: discrasias sanguíneas, pancreatitis,
neuropatías periféricas, así como la aparición de resistencias a
estos fármacos (AZT, ddl y ddC) siguen siendo los mayores
inconvenientes de este tipo de tratamientos. Esto se está intentado
solventar con el diseño de nuevos agentes potenciales
anti-HIV de estructura nucleosídica.
La importancia económica y social de este tipo de
fármacos es bien patente. Para ello solo hay que recordar las
enfermedades contra las cuales se utilizan – cáncer, SIDA, herpes,
etc. – y los elevados precios de estos fármacos. Su principal
consumo está ligado a la Farmacia Hospitalaria y a los centros de
atención de enfermos de SIDA por lo cual su montante real en ventas
no se refleja en su justa medida en las tablas de fármacos más
vendidos en las Oficinas de Farmacia. Otros ejemplos de este tipo de
fármacos, muy empleados en estos centros son la Zidovudina
(ZDV(Retrovir)), Nelfinavir (Virazep, AG1343), Aziclovir
(Zovirax), (Ruiz Camps I. Inhibidores de transcriptasa inversa,
El farmacéutico de Hospitales. Informe 8 nº 89 1999) etc.
En estos casos la actividad terapéutica se
encuentra relacionada con la alteración del proceso de síntesis de
ADN o de ARN.
No obstante, existen otras dianas farmacológicas
frente a las que son activos los nucleósidos de síntesis. Entre
ellas citaremos:
- 1)
- Inhibición de la difusión facilitada de nucleósidos naturales. Esta metodología se utiliza en el tratamiento de ciertas leucemias humanas. Buolamwimi J.K.- Current Medicinal Chem. 1997, 4, 35-66). Las estructuras son del tipo:
\vskip1.000000\baselineskip
que pueden obtenerse fácilmente a
partir de
adenosina.
- 2)
- Agonistas de receptores A_{1}, A_{2A}, A_{2B}, A_{3} de adenosina, de estructura general (Muller C.E.-Current Medicinal Chem. 2000, 7,1269-1288):
Estos compuestos son inhibidores de adenosina
kinasa o inhibidores alostéricos de los receptores de adenosina.
Por ello tienen aplicación en el tratamiento de la taquicardia
supraventricular, enfermedad de Huntington, etc.
- 3)
- Nucleósidos activos en el tratamiento de los procesos inflamatorios. Estos nucleósidos tienen como estructura general:
que también puede obtenerse
fácilmente a partir de adenosina. Estos nucleósidos se obtienen
oxidando los ribonudeósidos convencionales con monooxigenasas
(Mahamoudian M.-Biocatalysis & Biotransformations 2000, 18,
105-118).
- 4)
- Formación de triples hélices de ADN que permiten obtener nucleósidos antisentido con una extensa secuencia de reconocimiento (Fox K.R.-Current Medicinal Chem. 2000, 7, 17-37; Ganesh K.N.; Rajeev K.G.; Pallan P.S.; Rana V.S.; Barawkar D.A.; Kumar V.A.-Nucleoside & Nucleotides 1997, 16, 12-71; Bijapur J.; Keppler M.D.; Bergquist S.; Brown T.; Fox K.R.-Nucleic Acids Research 1999, 27, 1802-1807; Mercola D; Cohen J.S. Cancer Gene Therapy 1995, 2, 47-53).
- 5)
- Estos compuestos poseen estructuras del tipo:
Ejemplos significativos lo constituyen el
aciclovir y la tiazofurina:
Todo ello justifica por qué en los últimos años,
se han realizado innumerables esfuerzos para lograr la síntesis a
gran escala de nudeósidos con actividad biológica. Éstas se pueden
dividir en dos grandes grupos:
A.- Síntesis químicas
B.- Síntesis
quimio-enzimáticas
La síntesis químicas escalables y generalizables
a todo tipo de nucleósido, parten del azúcar o de un análogo
funcionalizado en C-1 con un grupo saliente que
reacciona con el heterociclo previamente formado. Aunque se han
desarrollado muchos métodos de síntesis, en especial en el caso de
los derivados purínicos, la compleja estructura de estas moléculas,
su inestabilidad, y su polifuncionalidad hacen que se requiera un
elevado número de pasos de síntesis para su preparación, incluidos
los de protección y desprotección de grupos funcionales reactivos.
Además, es difícil el control de la configuración anomérica y la
formación regioespecífica de la unión glicosídica
C-N cuando existen varios posibles grupos
nucleofílicos en las bases (Paf S. and Nair V.; Biotechnol.
Letters, 1997, 19, 349; Wong C.H., Halcomb R.L.,
Ichikawa Y. and Kajimoto T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
1995, 34, 511).
Por ello, las síntesis químicas conducen a una
mezcla de compuestos isómeros, donde la separación del producto
buscado puede ser tediosa y complicada obteniéndose rendimientos de
bajos a moderados en producto final lo cual reduce la rentabilidad
económica del proceso.
La síntesis de nucleósidos catalizada por enzimas
puede ser una alternativa a las llevadas a cabo por métodos
químicos ya que no se requieren grupos protectores y usualmente
transcurren con alta regio - y estereoespecificidad (Wong C.H.
Whitesides G.M-., Enzymes in organic synthetic chemistry,
Elsevier Science Ltd., Oxford, Cap.1 (1994); Hanrahan J.R.,
Hutchinson D.W.; J. Biotechnol.1992, 23, 193.) lo cual
simplifica los procesos de separación del producto final de los
productos secundarios de reacción. La alta eficiencia catalítica de
las enzimas y su moderada especificidad por substrato en procesos
in vitro permiten que las reacciones se lleven a cabo sobre
análogos de substratos naturales, utilizando tanto disolventes
orgánicos hidrófilos como hidrofóbicos.
La aplicación de las enzimas libres a la síntesis
de nucleósidos ha sido revisada en dos recientes trabajos de
Ferrero y Gotor (Ferrero M.; Gotor V.-Monatsh Chem 2000,
131, 585-616; Idem.- Chemical Rev.
2000, 100, 4319-4347). Entre ellas hay que
citar las enzimas que catalizan la formación de uniones
glicosídicas por transferencia del azúcar de una base donadora a una
base aceptora (glicosiltransferasas y nucleósidofosforilasas).
Estas enzimas son específicas de
2'-desoxiribosa y son abundantes en especies del
género Lactobacillus como L. leichmanii (Carson D. A.
y Wasson D.B.- Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 155,
829-839; Stoecker J.D., Poirot A.F., Smith R.M.,
Parks R.E., Ealick S.E., Takabayashi K., Erion M.D.,
Biochemistry 1997, 36 11749) y L. helveticus.
(Krenitsky T., Koszalka G,. Tuttle J., J. Biochemistry. 1981,
20, 3615-3618). Hay dos subclases de enzimas
según sea su mecanismo de acción.
Donde B1 y B2 son dos bases distintas.
Catalizan la transferencia de bases solamente
entre purinas
dRib-Pur(1) +
Pur(2) \Leftrightarrow d Rib-Pur(2)
+ Pur(1)
Catalizan la transformación entre purinas y/o
pirimidinas
i) dRib-Pur(1) +
Pur(2) \Leftrightarrow d Rib-Pur(2)
+ Pur(1)
ii) dRib-Pur + Pyr
\Leftrightarrow d Rib-Pyr + Pur
iii) dRib-Pyr(1) +
Pyr(2) \Leftrightarrow d Rib-Pyr +
Pyr(2)
d Rib =
2'-desoxi-D-ribosa
Pur- = base púrica
Pyr = base pirimidínica
Estas enzimas catalizan la fosforólisis
reversible de ribo o desoxiribonucleósidos con la formación de
ribosa o
2'-desoxiribosa-1-fosfato,
y la base correspondiente. Se conocen purín (EC 2.4.2.1) y
pirimidín (EC 2.4.2.2, EC2.4.2.3 y EC 2.4.2.4)
nucleósidofosforilasas (Burns Ch L., Clair M.H., Frick L.Y.; Spector
Th., Averett D.R., English L.M., Holmes T.H., Krenitsky T.,
Koszalka G.W., J. Med. Chem. 1993, 36,
378-384; Shirae H., Yokozeki K., Uchiyama M.,
Kubota, K. Agric. Biol. Chem.1988, 52,
1777-1783; Lewkowicz E.S.; Martínez N.; Rogert
M.C.; Porro S.; Iribarren A.M.- Biotcehnol.Lett. 2000,
23, 1277-1280), que pueden ser de origen
bacteriano o de tejidos de mamíferos.
Las nucleósido fosforilasas de mamíferos no
aceptan adenosina pero sí inosina, uridina y guanosina como
sustrato (Hanrahan J.R., Hutchinson D.W.; J. Biotechnol.
1992, 23, 193-198). Por el contrario, las
enzimas bacterianas aceptan a los tres nucleósidos purínicos
(Shirae H., Yokozeki K., Uchiyama M., Kubota, K. Agric. Biol.
Chem. 1988, 52, 1777-1783) o a
nucleósidos pirimidínicos como uridina Shirae, H., Yokozeki, K. y
Kubota, K. Agric. Biol. Chem. 1988, 52,
1499-1505). Esto, unido al rápido crecimiento de las
bacterias productoras de estas enzimas y a la sencillez que
presenta su fermentación, hace que sean estas últimas enzimas las
más utilizadas. Como microorganismos productores de estas enzimas
tenemos: Brevibacterium acetylicum ATCC 954 (Nori, N.,
Watanabe, M., Sungawa, K., Uehara, K. y Mikami, Y.
J.Bacteriol. 1991, 17, 121-131),
Erwinia carotovora AJ 2992 (Feng L., Yoshiharu 1., Kimura A.
Applied Environm. Microbiol. 1990, 56,
3830-3834), Bacillus stearothermophilus JTS
859 (Wielgus-Kutrowska B., Kyulikowska E.,
Wierzchowski J., Bzowska A., Shugar D., Eur. J. Biochem.
1997, 243, 408.), E. coli BL21(Rogert M.C.,
Trelles A. J., Porro S., Lewkowicz E. S., Iribarren A.M.
Biocatalysis and Biotransformations. 2002, 20,
347-351), Enterobacter gergoviae CECT 875
(Trelles A. J.; Fernández M.; Lewkowicz E.S.; Iribarren A.M.;
Sinisterra J.V.-Tetrahedron Asymmetry 2003, 44,
2605-2609) etc., que se han empleado en la síntesis
de diversos nucleósidos con actividad antiviral. En este grupo
también hay que citar la nucleósido fosforilasa de Klebsiella
sp(Utagawa T., Morisawa H., Yoshinaga F., Yamazaki A.,
Mitsugi K., Hirose Y., Agric. Blol. Chem., 1985, 49,
1053) que acepta como substratos tanto a nucleósidos pirimidínicos
como purínicos cuando la célula ha sido cultivada en un medio donde
la adenosina era la única fuente de carbono y nitrógeno.
| Donde | B^{1}: pirimidina | E_{1}: pirimidín nucleósído fosforilasa |
| B^{2}: purina | E_{2}: purín nucleósido fosforilasa | |
| o bien | B^{1}: purina | E_{1}: purín nucleósido fosforilasa |
| B^{2}: pirimidina | E_{2}: pirimidín nucleósido fosforilasa |
X = H, OH
En la Bibliografía existen trabajos científicos
en los que se emplean diversos microorganismos en estos procesos.
Entre ellos se destacan E. coli y Bacillus
stearothermophilus. en forma de pastas húmedas de células
(Utagawa, T. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.
1999, 6, 215-222; Erion, M.D., Takabayashi,
K., Smith, H.B., Kessi, J., Wagner, S., Hönger, S., Shamen, S. L.,
Ealick, S. E. Biochemistry 1997, 6,
11725-11734; Erion, M.D., Stoeckler, J.D., Guida,
W.C., Walter, R.L. Ealick, S.E.- Biochemistry. 1997,
36, 11735-11748).
Entre las principales limitaciones del empleo de
microorganismos mesófilos en esta síntesis destaca la
descomposición de los nucleósidos 6-aminupurínicos
por la adenosin deaminasa (Rogert M.C., Trelles J.A., Porro S.,
Lewkowicz E.S., Iribarren A.M. Bíocatalysis and
Biotransformations. 2002, 20, 347-351).
Esta reacción secundaria puede ser reducida, pero no eliminada,
trabajando a T < 60ºC (Utagawa, T. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic. 1999, 6,
215-222: Yokozeki K.; Tsuji T., J. Mol. Catal. B:
Enzymatic, 2000, 10, 207-213). Otra
limitación es la fuerte dependencia de la estructura del azúcar que
limita su aplicación para obtener con un mismo microorganismo
diversos nucleósidos con distintos anillos de azúcar.
Los microorganismos empleados en esta invención
han sido microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes lo que nos
ha permitido bajar la temperatura de reacción. Ninguno de estos
microorganismos se ha descrito previamente como productor de este
tipo de enzimas. Las enzimas de estos microorganismos pueden
trabajar a menores temperaturas que las de los organismos mesófilos
convencionales. Los microorganismos son activos desde 15ºC a 30ºC
(Feller G.; Gerday C.- Cell Mol, Life Science 1997,
53, 830-841). Se han descrito solo algunas
enzimas hidrolíticas obtenidas a partir de estos microorganismos,
fundamentalmente bacterias antárticas. Entre estas podemos citar
la: \alpha-amilasa de Alteromonas
haloplanctis (Feller G.; Zekhnini Z.;
Lummotte-Brasseur J.; Gerday C. Eur. J.
Biochem. 1977, 244, 186-191), la
subtilisina de Bacillus TA 39 (Feller G.; Payan F.; Theys F., Quian
M.; Haser R. And Gerday C. Alteromonas haloplanctics A23
Eur.J. Biochem. 1994, 222, 441-447) o
la (\beta-lactamasa de Psychrobacter
immobilis (Feller G.; Zekhnini Z.;
Lummotte-Brasseur J.; Gerday C. Eur. J.
Biochem. 1977, 244, 186-191). Estas
enzimas presentan un elevado valor de Km por lo que son poco
específicas de substrato.
Procedimiento para la síntesis de nucleósidos
mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o
psicrotolerantes.
En la presente invención se describe por primera
vez el empleo de una serie de microorganismos en la síntesis de
nucleósidos por intercambio de bases. La reacción permite la
obtención en un solo paso de nucleósidos derivados de
6-mercapto purina, purinas,
2,6-diaminopurina u otros derivados de purina
funcionalizadas en 2 y 6, a partir de nucleósidos como uridina,
timidina, 2'-deoxiuridina y
2',3'-dideoxiuridina. Asimismo se han obtenido
nucleósidos pirimidínicos derivados de
5-fluoruracilo, 5-clorouracilo,
timina, etc. y con otras estructuras como triazoles como es el caso
de la ribavirina.
La principal ventaja consiste en que la reacción
ocurre a temperaturas menores de 60ºC, que es la usada
tradicionalmente, por lo que no hay formación de hipoxantina o
derivados a partir de nucleósidos de 6-aminopurina
lo que constituye la principal reacción parásita que disminuye el
rendimiento de la reacción.
Los microorganismos empleados en esta invención
son: Aeromonas salmonicida ssp achromogenes (CECT 895);
Bacillus psychrosaccharolyticus (CECT 4074); Bacillus
subtilis ssp. niger (CECT 4071); Photobacterium damselae
(CECT 626); Photobacterium leiognathi (CECT 4191);
Photobacterium phosphoreum (CECT 4192); Psychrobacter
immobilis (CECT 4492); Vibrio alginolyticus (CECT 436) y
Vibrio mediterranei (CECT 415). Las cepas se encuentran
depositadas en al Colección Española de Cultivos Tipo (CECT,
Universidad de Valencia (Burjassot), Valencia. España).
El medio de fermentación empleado para el cultivo
de estos microorganismos fue el siguiente: extracto de carne,
extracto de levadura y NaCl en agua desionizada; el pH se ajustó a
7.
Los cultivos pueden crecer en cualquier
recipiente apropiado, que podría ser típicamente en un medio sólido
de placas Petri o en medios líquidos en matraces de vidrio tipo
erlenmeyer. Los cultivos se pueden realizar en un intervalo de
temperaturas de 15 a 40ºC, ventajosamente de 15 a 30ºC y
típicamente de 25 a 30ºC. Los cultivos líquidos se llevaron a cabo
con agitación orbital a 100-350 r.p.m. y típicamente
a 200-250 r.p.m.
Las reacciones catalizadas por estos
microorganismos se llevaron a cabo con las células recogidas
después de haber alcanzado su periodo estacionario de crecimiento.
El medio se centrifugó y se separaron las células que se lavaron
con un tampón adecuado y se volvieron a recentrifugar. Las células
limpias se mezclan con tampón adecuado y los reactivos
correspondientes, en distintas relaciones molares. El seguimiento de
la reacción se puede hacer mediante diversas técnicas como
cromatografía de capa fina (TLC) o cromatografía de alta presión
(HPLC).
La estereoquímica de los productos de reacción se
puede determinar por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) o
Dispersión óptica rotatoria (DOR).
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona un procedimiento para obtener nucleósidos naturales o
no a partir de otros nucleósidos más baratos empleando células
enteras de microorganismos que se describen aquí por primera vez
con este fin.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención pero no son limitativos de su alcance, el cual viene
definido exclusivamente por la nota reivindicativa.
Medio de cultivo sólido: Los
microorganismos se crecieron en placas Petri, un medio compuesto
por 1% (plv) extracto de carne, 0.5% (plv) extracto de levadura y
0.5% (plv) NaCI y agar bacteriológico 2% (p/v), en agua desionizada
ajustando el pH a 7 con KOH.
Medio de cultivo líquido: Los
microorganismos se crecieron hasta saturación en erlenmeyers de 250
ml conteniendo 50 ml de un medio de cultivo compuesto por 1% (plv)
extracto de carne, 0.5% (plv) extracto de levadura y 0.5% (plv)
NaCl en agua desionizada ajustando el pH a 7 con KOH.
Los microorganismos se cultivaron inicialmente en
medio sólido. Cuando el cultivo estuvo bien crecido, se raspó la
superficie del medio sólido para proporcionar suficientes células
como inóculo de los matraces en el paso siguiente.
Los microorganismos se cultivaron en matraces
Erlenmeyer de 250 ml, que contenían 50 ml de medio de cultivo. La
incubación se realizó a 28ºC en una bandeja con agitación orbital a
una velocidad de 200 r.p.m. Los caldos de cultivo fueron recogidos
a 24 hrs.
Las reacciones se llevaron acabo a temperaturas
entre 50 y 70ºC en matraces de vidrio con agitación orbital
constante de 200 r.p.m. El tiempo de reacción varió entre 30 min 21
hrs, según la síntesis a realizar. El caldo de cultivo se
centrifugó a 4.000 r.p.m. y a 4ºC durante 15 min. El líquido
sobrenadante se desechó y la pasta de células se lavó con tampón
fosfato 30 mM (pH=7) y se recentrifugó en las mismas condiciones
que antes. El lavado se repitió otra vez más.
El análisis del transcurso de la reacción se
llevó a cabo por TLC (Cl_{3}CH/metanol 80:20 (v/v)) o por
HPLC.
La pasta de células se mezcló con 10 ml de tampón
fosfato 10 mM (pH=7). La reacción se lleva acabo a 57ºC, empleando
células de Bacillus psychrosaccharolyticus. Las
concentraciones de 2'-deoxiuridina y de adenina
fueron iguales a 0,5 mM. El volumen de reacción se ajustó a 50 ml.
Transcurrida una hora, se separa los microorganismos del medio de
reacción centrifugando a 10.000 r.p.m. durante 20 min. a 4ºC. La
reacción se siguió por HPLC.
El análisis por HPLC se llevó a cabo usando una
columna INTERSIL ODS2 5 \mum (15 cm x 0.46 cm) (Tecnokroma S.A.
España). La longitud de onda fue de 260 nm y la temperatura de la
columna fue de 35ºC. La fase móvil fue HAcO/NaAcO (pH=5.8)/MeOH
(95/5 v/v); Flujo 0.87 ml/min, Presión de 1,800 \pm 15 psi. Los
tiempos de retención (min) fueron: 2'deoxiuridina= 5.56; Adenina =
6.42; Hipoxantina =3.65; 2'-deoxyadenosine =
28.5.
La conversión obtenida fue de un 71% con una
productividad de 32 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
La síntesis se llevó a cabo en las mismas
condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando células de
Psychrobacter immobilis.
La conversión obtenida fue de un 66% con una
productividad de 23 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
La síntesis se llevó a cabo en las mismas
condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando ahora una
concentración de 2'-deoxiuridina de 15 mM y de
adenina de 5 mM.
La conversión obtenida fue de un 28% con una
productividad de 0.18 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} células)
La síntesis se llevó a cabo en las mismas
condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando células de
Photobacterium phosphoreum. Las concentraciones de uridina
fueron de 5 mM y la de adenina 0,5 mM.
La conversión obtenida fue de un 47% con una
productividad de 46 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
La síntesis se llevó a cabo en las mismas
condiciones que en el ejemplo 4, pero empleando células de
Photobacterium leiognathi.
La conversión obtenida fue de un 66% con una
productividad de 47 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Photobacterium leiognathi.
La conversión obtenida fue de un 70% con una
productividad de 32 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacíllus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 68% al cabo de 3
hrs de reacción, con una productividad de 28 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 38% al cabo de
21 hrs de reacción, con una productividad de 1.2 x 10^{-5} mM/(hr
x 10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 45% al cabo de 3
hrs de reacción, con una productividad de 12 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 36% al cabo de 3
hrs de reacción, con una productividad de 7 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 18% al cabo de 3
hrs de reacción, con una productividad de 5 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus psychrosaccharolyticus.
La conversión obtenida fue de un 5% al cabo de 1
hr de reacción, con una productividad de 3,2 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
La síntesis se realizó en las condiciones
descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de
Bacillus psychrosaccharolyticus.
La conversión obtenida fue de un 10% al cabo de 3
hrs de reacción, con una productividad de 7 x 10^{-5} mM/(hr x
10^{6} cel).
Claims (16)
1. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos
en un único paso por intercambio de bases que comprende:
- a)
- un nucleósido de uracilo como producto de partida
- b)
- un microorganismo psicrotolerante o psicrotrofo productor de nucleósido fosforilasas o 2'-desoxirribosiltransferasas como agente catalizador
- c)
- una temperatura de reacción entre 45 y 60ºC con una escasa formación de hipoxantina como producto secundario de la reacción por descomposición de nucleósidos de 6-aminopurina.
2. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura
de reacción es de 57ºC.
3. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
emplean las células enteras de los microorganismos utilizados.
4. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Bacillus
psychrosaccharolyticus.
5. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiadenosina utilizando cepas de
Psychrobacter immobilis.
6. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte
de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Bacillus
subtilis ssp niger.
7. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte
de uridina y se obtiene adenosina utilizando cepas de
Photobacterium phosphoreum.
8. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte
de uridina y se obtiene adenosina utilizando cepas de
Photobacterium leiognathi.
9. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos,
según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte
de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiadenosina utilizando cepas de
Photobacterium leiognathi.
10. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de 2',3'-dideoxiuridina y se obtiene
2',3'-dideoxiadenosina utilizando cepas de
Bacillus subtilis ssp niger.
11. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de 2',3'-dideoxiuridina y se obtiene
2',3'-dideoxiribonucleósido de purina utilizando
cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
12. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de uridina y se obtiene ribonucleósido de
3-carboxamido-1,2,4-triazol
utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
13. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de uridina y se obtiene ribonucleósido de
6-mercaptopurina utilizando cepas de Bacillus
subtilis ssp niger.
14. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiribonucleósido de
6-mercaptopurina utilizando cepas de Bacillus
subtilis ssp niger.
15. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiribonucleósido de
5'-fluoruracilo utilizando cepas de Bacillus
psychrosaccharolyticus.
16. Procedimiento para la síntesis de
nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene
2'-deoxiribonucleósido de
5'-clorouracilo utilizando cepas de Bacillus
psychrosaccharolyticus.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200400817A ES2241487B2 (es) | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Procedimiento para la sintesis de nucleosidos mediante la utilizacion de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. |
| PCT/ES2005/000166 WO2005116232A1 (es) | 2004-04-02 | 2005-03-30 | Procedimiento para la síntesis de nucleósidos mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes |
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| US4458016A (en) * | 1981-03-09 | 1984-07-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Production of 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole |
| US4614719A (en) * | 1982-04-30 | 1986-09-30 | Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha | Process for producing ribavirin |
-
2004
- 2004-04-02 ES ES200400817A patent/ES2241487B2/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-30 WO PCT/ES2005/000166 patent/WO2005116232A1/es not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4458016A (en) * | 1981-03-09 | 1984-07-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Production of 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole |
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| CAVICCHIOLI, R. et al. Low-temperature extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 2002, Vol. 13 (3), páginas 253-261. * |
| LEWKOWICZ, E.S. et al. An improved microbial synthesis of purine nucleosides. Biotechnology Letters, 2000, Vol. 22, páginas 1277-1280. * |
| RAMANA, K.V. et al. Biotechnological application of psycrophiles and their habitat to low-temperature. Journal of Scientific and Industrial Research, 2000, Vol. 59, páginas 87-101. * |
| RUSSEL, N.J. Toward a molecular understanding of cold activity of enzimes from psycrophiles. Extremophiles, 2000, Vol. 4, páginas 83-90. * |
| TRELLES, J.A. et al. Purine nucleoside synthesis from uridine using immobilised Enterobacter gergoviae CECT 875 whole cells. Tetrahedron Letters, 2003, Vol. 44 (12), páginas 2605-2609. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2241487A1 (es) | 2005-10-16 |
| WO2005116232A1 (es) | 2005-12-08 |
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