ES2241487B2 - Procedimiento para la sintesis de nucleosidos mediante la utilizacion de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. - Google Patents

Procedimiento para la sintesis de nucleosidos mediante la utilizacion de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes.

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Abstract

Procedimiento para la síntesis de nucleósidos mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. La presente invención se refiere a la síntesis de nucleósidos purínicos, nucleósidos pirimidínicos derivados de 5''-fluoruracilo y 5''-clorouracilo o triazoles, por intercambio de bases, mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes. La reacción ocurre partiendo de nucleósidos de uracilo, en un solo paso, a menor temperatura que la utilizada hasta ahora, no observándose reacciones secundarias de degradación del nucleósido formado. Los microorganismos seleccionados son Bacillus psychrosaccharolyticus; Bacillus subtilis ssp. niger; Photobacterium leiognathi; Photobacterium phosphoreum; Psychrobacter immobilis.

Description

Procedimiento para la síntesis de nucleósidos mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes.
Sector de la técnica
La presente invención, según se expresa en esta memoria descriptiva, se refiere a la utilización de microorganismos psicrotrofos en la síntesis de nucleósidos por intercambio de bases. El proceso es válido para la obtención de nucleósidos naturales, o no naturales, con buenos rendimientos y enantioselectividades. Estos compuestos tienen interés como medicamentos genéricos de actividad antiretroviral, antitumoral o para la terapia antisentido. Derivados de estos nucleósidos obtenidos mediante modificaciones simples se pueden utilizar en la inhibición de la difusión facilitada de nucleósidos naturales para el tratamiento de ciertas leucemias, agonistas de receptores A_{1}, A_{2A}, A_{2B}, A_{3}, antiinflamatorios, enfermedad de Huntington, taquicardias, etc. Su aplicación es en el campo de la Industria Farmacéutica y en la Industria Veterinaria.
Estado de la técnica
Los análogos de nucleósidos naturales presentan muchas aplicaciones en terapéutica. Entre ellas, las más contrastadas son el tratamiento de enfermedades de origen viral (Dimoglo A.S.; Gorbachov M.Y.; Lesnik T.I.; Saragoglu M.; Yildirich I.- Current Medicinal Chemistry 1977, 4, 23-34) y el tratamiento de diversas neoplasias (Sanders P.P.; Kutan R.; Lay M.M.; Robins R.K.- Mol. Pharmacol. 1983, 23, 534-538).
A partir de 1985 - cuando se descubre que el AZT (3'-azido-3'-desoxitimina) inhibe la replicación de los virus HIV-1 y HIV-2 in vitro - han sido innumerables las moléculas análogas diseñadas para combatir el SIDA, donde los 2',3'-didesoxinucleósidos constituyen la principal arma terapéutica contra este tipo de virus. Sin embargo, los efectos tóxicos colaterales: discrasias sanguíneas, pancreatitis, neuropatías periféricas, así como la aparición de resistencias a estos fármacos (AZT, ddl y ddC) siguen siendo los mayores inconvenientes de este tipo de tratamientos. Esto se está intentado solventar con el diseño de nuevos agentes potenciales anti-HIV de estructura nucleosídica.
La importancia económica y social de este tipo de fármacos es bien patente. Para ello solo hay que recordar las enfermedades contra las cuales se utilizan – cáncer, SIDA, herpes, etc. – y los elevados precios de estos fármacos. Su principal consumo está ligado a la Farmacia Hospitalaria y a los centros de atención de enfermos de SIDA por lo cual su montante real en ventas no se refleja en su justa medida en las tablas de fármacos más vendidos en las Oficinas de Farmacia. Otros ejemplos de este tipo de fármacos, muy empleados en estos centros son la Zidovudina (ZDV(Retrovir)), Nelfinavir (Virazep, AG1343), Aziclovir (Zovirax), (Ruiz Camps I. Inhibidores de transcriptasa inversa, El farmacéutico de Hospitales. Informe 8 nº 89 1999) etc.
En estos casos la actividad terapéutica se encuentra relacionada con la alteración del proceso de síntesis de ADN o de ARN.
No obstante, existen otras dianas farmacológicas frente a las que son activos los nucleósidos de síntesis. Entre ellas citaremos:
1)
Inhibición de la difusión facilitada de nucleósidos naturales. Esta metodología se utiliza en el tratamiento de ciertas leucemias humanas. Buolamwimi J.K.- Current Medicinal Chem. 1997, 4, 35-66). Las estructuras son del tipo:
\vskip1.000000\baselineskip
1
que pueden obtenerse fácilmente a partir de adenosina.
2)
Agonistas de receptores A_{1}, A_{2A}, A_{2B}, A_{3} de adenosina, de estructura general (Muller C.E.-Current Medicinal Chem. 2000, 7,1269-1288):
2
Estos compuestos son inhibidores de adenosina kinasa o inhibidores alostéricos de los receptores de adenosina. Por ello tienen aplicación en el tratamiento de la taquicardia supraventricular, enfermedad de Huntington, etc.
3)
Nucleósidos activos en el tratamiento de los procesos inflamatorios. Estos nucleósidos tienen como estructura general:
3
que también puede obtenerse fácilmente a partir de adenosina. Estos nucleósidos se obtienen oxidando los ribonudeósidos convencionales con monooxigenasas (Mahamoudian M.-Biocatalysis & Biotransformations 2000, 18, 105-118).
4)
Formación de triples hélices de ADN que permiten obtener nucleósidos antisentido con una extensa secuencia de reconocimiento (Fox K.R.-Current Medicinal Chem. 2000, 7, 17-37; Ganesh K.N.; Rajeev K.G.; Pallan P.S.; Rana V.S.; Barawkar D.A.; Kumar V.A.-Nucleoside & Nucleotides 1997, 16, 12-71; Bijapur J.; Keppler M.D.; Bergquist S.; Brown T.; Fox K.R.-Nucleic Acids Research 1999, 27, 1802-1807; Mercola D; Cohen J.S. Cancer Gene Therapy 1995, 2, 47-53).
5)
Estos compuestos poseen estructuras del tipo:
4
Ejemplos significativos lo constituyen el aciclovir y la tiazofurina:
5
Todo ello justifica por qué en los últimos años, se han realizado innumerables esfuerzos para lograr la síntesis a gran escala de nudeósidos con actividad biológica. Éstas se pueden dividir en dos grandes grupos:
A.- Síntesis químicas
B.- Síntesis quimio-enzimáticas
A.- Síntesis químicas
La síntesis químicas escalables y generalizables a todo tipo de nucleósido, parten del azúcar o de un análogo funcionalizado en C-1 con un grupo saliente que reacciona con el heterociclo previamente formado. Aunque se han desarrollado muchos métodos de síntesis, en especial en el caso de los derivados purínicos, la compleja estructura de estas moléculas, su inestabilidad, y su polifuncionalidad hacen que se requiera un elevado número de pasos de síntesis para su preparación, incluidos los de protección y desprotección de grupos funcionales reactivos. Además, es difícil el control de la configuración anomérica y la formación regioespecífica de la unión glicosídica C-N cuando existen varios posibles grupos nucleofílicos en las bases (Paf S. and Nair V.; Biotechnol. Letters, 1997, 19, 349; Wong C.H., Halcomb R.L., Ichikawa Y. and Kajimoto T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34, 511).
Por ello, las síntesis químicas conducen a una mezcla de compuestos isómeros, donde la separación del producto buscado puede ser tediosa y complicada obteniéndose rendimientos de bajos a moderados en producto final lo cual reduce la rentabilidad económica del proceso.
B.- Síntesis quimio-enzimática
La síntesis de nucleósidos catalizada por enzimas puede ser una alternativa a las llevadas a cabo por métodos químicos ya que no se requieren grupos protectores y usualmente transcurren con alta regio - y estereoespecificidad (Wong C.H. Whitesides G.M-., Enzymes in organic synthetic chemistry, Elsevier Science Ltd., Oxford, Cap.1 (1994); Hanrahan J.R., Hutchinson D.W.; J. Biotechnol.1992, 23, 193.) lo cual simplifica los procesos de separación del producto final de los productos secundarios de reacción. La alta eficiencia catalítica de las enzimas y su moderada especificidad por substrato en procesos in vitro permiten que las reacciones se lleven a cabo sobre análogos de substratos naturales, utilizando tanto disolventes orgánicos hidrófilos como hidrofóbicos.
La aplicación de las enzimas libres a la síntesis de nucleósidos ha sido revisada en dos recientes trabajos de Ferrero y Gotor (Ferrero M.; Gotor V.-Monatsh Chem 2000, 131, 585-616; Idem.- Chemical Rev. 2000, 100, 4319-4347). Entre ellas hay que citar las enzimas que catalizan la formación de uniones glicosídicas por transferencia del azúcar de una base donadora a una base aceptora (glicosiltransferasas y nucleósidofosforilasas).
B.I.- 2'-Desoxiribosiltransferasas
Estas enzimas son específicas de 2'-desoxiribosa y son abundantes en especies del género Lactobacillus como L. leichmanii (Carson D. A. y Wasson D.B.- Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 155, 829-839; Stoecker J.D., Poirot A.F., Smith R.M., Parks R.E., Ealick S.E., Takabayashi K., Erion M.D., Biochemistry 1997, 36 11749) y L. helveticus. (Krenitsky T., Koszalka G,. Tuttle J., J. Biochemistry. 1981, 20, 3615-3618). Hay dos subclases de enzimas según sea su mecanismo de acción.
6
Donde B1 y B2 son dos bases distintas.
Tipo I
Catalizan la transferencia de bases solamente entre purinas
dRib-Pur(1) + Pur(2) \Leftrightarrow d Rib-Pur(2) + Pur(1)
Tipo II
Catalizan la transformación entre purinas y/o pirimidinas
i) dRib-Pur(1) + Pur(2) \Leftrightarrow d Rib-Pur(2) + Pur(1)
ii) dRib-Pur + Pyr \Leftrightarrow d Rib-Pyr + Pur
iii) dRib-Pyr(1) + Pyr(2) \Leftrightarrow d Rib-Pyr + Pyr(2)
d Rib = 2'-desoxi-D-ribosa
Pur- = base púrica
Pyr = base pirimidínica
B.II.-Nucleósidofosforilasas
Estas enzimas catalizan la fosforólisis reversible de ribo o desoxiribonucleósidos con la formación de ribosa o 2'-desoxiribosa-1-fosfato, y la base correspondiente. Se conocen purín (EC 2.4.2.1) y pirimidín (EC 2.4.2.2, EC2.4.2.3 y EC 2.4.2.4) nucleósidofosforilasas (Burns Ch L., Clair M.H., Frick L.Y.; Spector Th., Averett D.R., English L.M., Holmes T.H., Krenitsky T., Koszalka G.W., J. Med. Chem. 1993, 36, 378-384; Shirae H., Yokozeki K., Uchiyama M., Kubota, K. Agric. Biol. Chem.1988, 52, 1777-1783; Lewkowicz E.S.; Martínez N.; Rogert M.C.; Porro S.; Iribarren A.M.- Biotcehnol.Lett. 2000, 23, 1277-1280), que pueden ser de origen bacteriano o de tejidos de mamíferos.
Las nucleósido fosforilasas de mamíferos no aceptan adenosina pero sí inosina, uridina y guanosina como sustrato (Hanrahan J.R., Hutchinson D.W.; J. Biotechnol. 1992, 23, 193-198). Por el contrario, las enzimas bacterianas aceptan a los tres nucleósidos purínicos (Shirae H., Yokozeki K., Uchiyama M., Kubota, K. Agric. Biol. Chem. 1988, 52, 1777-1783) o a nucleósidos pirimidínicos como uridina Shirae, H., Yokozeki, K. y Kubota, K. Agric. Biol. Chem. 1988, 52, 1499-1505). Esto, unido al rápido crecimiento de las bacterias productoras de estas enzimas y a la sencillez que presenta su fermentación, hace que sean estas últimas enzimas las más utilizadas. Como microorganismos productores de estas enzimas tenemos: Brevibacterium acetylicum ATCC 954 (Nori, N., Watanabe, M., Sungawa, K., Uehara, K. y Mikami, Y. J.Bacteriol. 1991, 17, 121-131), Erwinia carotovora AJ 2992 (Feng L., Yoshiharu 1., Kimura A. Applied Environm. Microbiol. 1990, 56, 3830-3834), Bacillus stearothermophilus JTS 859 (Wielgus-Kutrowska B., Kyulikowska E., Wierzchowski J., Bzowska A., Shugar D., Eur. J. Biochem. 1997, 243, 408.), E. coli BL21(Rogert M.C., Trelles A. J., Porro S., Lewkowicz E. S., Iribarren A.M. Biocatalysis and Biotransformations. 2002, 20, 347-351), Enterobacter gergoviae CECT 875 (Trelles A. J.; Fernández M.; Lewkowicz E.S.; Iribarren A.M.; Sinisterra J.V.-Tetrahedron Asymmetry 2003, 44, 2605-2609) etc., que se han empleado en la síntesis de diversos nucleósidos con actividad antiviral. En este grupo también hay que citar la nucleósido fosforilasa de Klebsiella sp(Utagawa T., Morisawa H., Yoshinaga F., Yamazaki A., Mitsugi K., Hirose Y., Agric. Blol. Chem., 1985, 49, 1053) que acepta como substratos tanto a nucleósidos pirimidínicos como purínicos cuando la célula ha sido cultivada en un medio donde la adenosina era la única fuente de carbono y nitrógeno.
Nucleósidofosforilasas
7
Donde B^{1}: pirimidina E_{1}: pirimidín nucleósído fosforilasa
B^{2}: purina E_{2}: purín nucleósido fosforilasa
o bien B^{1}: purina E_{1}: purín nucleósido fosforilasa
B^{2}: pirimidina E_{2}: pirimidín nucleósido fosforilasa
X = H, OH
En la Bibliografía existen trabajos científicos en los que se emplean diversos microorganismos en estos procesos. Entre ellos se destacan E. coli y Bacillus stearothermophilus. en forma de pastas húmedas de células (Utagawa, T. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999, 6, 215-222; Erion, M.D., Takabayashi, K., Smith, H.B., Kessi, J., Wagner, S., Hönger, S., Shamen, S. L., Ealick, S. E. Biochemistry 1997, 6, 11725-11734; Erion, M.D., Stoeckler, J.D., Guida, W.C., Walter, R.L. Ealick, S.E.- Biochemistry. 1997, 36, 11735-11748).
Entre las principales limitaciones del empleo de microorganismos mesófilos en esta síntesis destaca la descomposición de los nucleósidos 6-aminupurínicos por la adenosin deaminasa (Rogert M.C., Trelles J.A., Porro S., Lewkowicz E.S., Iribarren A.M. Bíocatalysis and Biotransformations. 2002, 20, 347-351). Esta reacción secundaria puede ser reducida, pero no eliminada, trabajando a T < 60ºC (Utagawa, T. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999, 6, 215-222: Yokozeki K.; Tsuji T., J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 2000, 10, 207-213). Otra limitación es la fuerte dependencia de la estructura del azúcar que limita su aplicación para obtener con un mismo microorganismo diversos nucleósidos con distintos anillos de azúcar.
Los microorganismos empleados en esta invención han sido microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes lo que nos ha permitido bajar la temperatura de reacción. Ninguno de estos microorganismos se ha descrito previamente como productor de este tipo de enzimas. Las enzimas de estos microorganismos pueden trabajar a menores temperaturas que las de los organismos mesófilos convencionales. Los microorganismos son activos desde 15ºC a 30ºC (Feller G.; Gerday C.- Cell Mol, Life Science 1997, 53, 830-841). Se han descrito solo algunas enzimas hidrolíticas obtenidas a partir de estos microorganismos, fundamentalmente bacterias antárticas. Entre estas podemos citar la: \alpha-amilasa de Alteromonas haloplanctis (Feller G.; Zekhnini Z.; Lummotte-Brasseur J.; Gerday C. Eur. J. Biochem. 1977, 244, 186-191), la subtilisina de Bacillus TA 39 (Feller G.; Payan F.; Theys F., Quian M.; Haser R. And Gerday C. Alteromonas haloplanctics A23 Eur.J. Biochem. 1994, 222, 441-447) o la (\beta-lactamasa de Psychrobacter immobilis (Feller G.; Zekhnini Z.; Lummotte-Brasseur J.; Gerday C. Eur. J. Biochem. 1977, 244, 186-191). Estas enzimas presentan un elevado valor de Km por lo que son poco específicas de substrato.
Explicación de la invención
Procedimiento para la síntesis de nucleósidos mediante la utilización de microorganismos psicrotrofos o psicrotolerantes.
En la presente invención se describe por primera vez el empleo de una serie de microorganismos en la síntesis de nucleósidos por intercambio de bases. La reacción permite la obtención en un solo paso de nucleósidos derivados de 6-mercapto purina, purinas, 2,6-diaminopurina u otros derivados de purina funcionalizadas en 2 y 6, a partir de nucleósidos como uridina, timidina, 2'-deoxiuridina y 2',3'-dideoxiuridina. Asimismo se han obtenido nucleósidos pirimidínicos derivados de 5-fluoruracilo, 5-clorouracilo, timina, etc. y con otras estructuras como triazoles como es el caso de la ribavirina.
La principal ventaja consiste en que la reacción ocurre a temperaturas menores de 60ºC, que es la usada tradicionalmente, por lo que no hay formación de hipoxantina o derivados a partir de nucleósidos de 6-aminopurina lo que constituye la principal reacción parásita que disminuye el rendimiento de la reacción.
Los microorganismos empleados en esta invención son: Aeromonas salmonicida ssp achromogenes (CECT 895); Bacillus psychrosaccharolyticus (CECT 4074); Bacillus subtilis ssp. niger (CECT 4071); Photobacterium damselae (CECT 626); Photobacterium leiognathi (CECT 4191); Photobacterium phosphoreum (CECT 4192); Psychrobacter immobilis (CECT 4492); Vibrio alginolyticus (CECT 436) y Vibrio mediterranei (CECT 415). Las cepas se encuentran depositadas en al Colección Española de Cultivos Tipo (CECT, Universidad de Valencia (Burjassot), Valencia. España).
El medio de fermentación empleado para el cultivo de estos microorganismos fue el siguiente: extracto de carne, extracto de levadura y NaCl en agua desionizada; el pH se ajustó a 7.
Los cultivos pueden crecer en cualquier recipiente apropiado, que podría ser típicamente en un medio sólido de placas Petri o en medios líquidos en matraces de vidrio tipo erlenmeyer. Los cultivos se pueden realizar en un intervalo de temperaturas de 15 a 40ºC, ventajosamente de 15 a 30ºC y típicamente de 25 a 30ºC. Los cultivos líquidos se llevaron a cabo con agitación orbital a 100-350 r.p.m. y típicamente a 200-250 r.p.m.
Las reacciones catalizadas por estos microorganismos se llevaron a cabo con las células recogidas después de haber alcanzado su periodo estacionario de crecimiento. El medio se centrifugó y se separaron las células que se lavaron con un tampón adecuado y se volvieron a recentrifugar. Las células limpias se mezclan con tampón adecuado y los reactivos correspondientes, en distintas relaciones molares. El seguimiento de la reacción se puede hacer mediante diversas técnicas como cromatografía de capa fina (TLC) o cromatografía de alta presión (HPLC).
La estereoquímica de los productos de reacción se puede determinar por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) o Dispersión óptica rotatoria (DOR).
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener nucleósidos naturales o no a partir de otros nucleósidos más baratos empleando células enteras de microorganismos que se describen aquí por primera vez con este fin.
Descripción detallada de la invención
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención pero no son limitativos de su alcance, el cual viene definido exclusivamente por la nota reivindicativa.
Ejemplo 1 Síntesis de 2'-deoxiadenosina a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Bacillus psychrosaccharolyticus CECT 4074 1.a- Cultivo de microorganismos productores de enzimas 1.a.1- Medios de cultivo
Medio de cultivo sólido: Los microorganismos se crecieron en placas Petri, un medio compuesto por 1% (plv) extracto de carne, 0.5% (plv) extracto de levadura y 0.5% (plv) NaCI y agar bacteriológico 2% (p/v), en agua desionizada ajustando el pH a 7 con KOH.
Medio de cultivo líquido: Los microorganismos se crecieron hasta saturación en erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50 ml de un medio de cultivo compuesto por 1% (plv) extracto de carne, 0.5% (plv) extracto de levadura y 0.5% (plv) NaCl en agua desionizada ajustando el pH a 7 con KOH.
1.a.2- Cultivo de los microorganismos en medio sólido
Los microorganismos se cultivaron inicialmente en medio sólido. Cuando el cultivo estuvo bien crecido, se raspó la superficie del medio sólido para proporcionar suficientes células como inóculo de los matraces en el paso siguiente.
1.b- Preparación del inóculo mediante el cultivo de los microorganismos en medio líquido
Los microorganismos se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml, que contenían 50 ml de medio de cultivo. La incubación se realizó a 28ºC en una bandeja con agitación orbital a una velocidad de 200 r.p.m. Los caldos de cultivo fueron recogidos a 24 hrs.
1.c- Reacciones de síntesis de nucleósidos
Las reacciones se llevaron acabo a temperaturas entre 50 y 70ºC en matraces de vidrio con agitación orbital constante de 200 r.p.m. El tiempo de reacción varió entre 30 min 21 hrs, según la síntesis a realizar. El caldo de cultivo se centrifugó a 4.000 r.p.m. y a 4ºC durante 15 min. El líquido sobrenadante se desechó y la pasta de células se lavó con tampón fosfato 30 mM (pH=7) y se recentrifugó en las mismas condiciones que antes. El lavado se repitió otra vez más.
El análisis del transcurso de la reacción se llevó a cabo por TLC (Cl_{3}CH/metanol 80:20 (v/v)) o por HPLC.
La pasta de células se mezcló con 10 ml de tampón fosfato 10 mM (pH=7). La reacción se lleva acabo a 57ºC, empleando células de Bacillus psychrosaccharolyticus. Las concentraciones de 2'-deoxiuridina y de adenina fueron iguales a 0,5 mM. El volumen de reacción se ajustó a 50 ml. Transcurrida una hora, se separa los microorganismos del medio de reacción centrifugando a 10.000 r.p.m. durante 20 min. a 4ºC. La reacción se siguió por HPLC.
El análisis por HPLC se llevó a cabo usando una columna INTERSIL ODS2 5 \mum (15 cm x 0.46 cm) (Tecnokroma S.A. España). La longitud de onda fue de 260 nm y la temperatura de la columna fue de 35ºC. La fase móvil fue HAcO/NaAcO (pH=5.8)/MeOH (95/5 v/v); Flujo 0.87 ml/min, Presión de 1,800 \pm 15 psi. Los tiempos de retención (min) fueron: 2'deoxiuridina= 5.56; Adenina = 6.42; Hipoxantina =3.65; 2'-deoxyadenosine = 28.5.
La conversión obtenida fue de un 71% con una productividad de 32 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 2 Síntesis de 2'-deoxiadenosina a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Psychrobacter immobilis CECT 4492
La síntesis se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando células de Psychrobacter immobilis.
La conversión obtenida fue de un 66% con una productividad de 23 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 3 Síntesis de 2'-deoxiadenosina a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Bacillus subtilis ssp niqer CECT 4071
La síntesis se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando ahora una concentración de 2'-deoxiuridina de 15 mM y de adenina de 5 mM.
La conversión obtenida fue de un 28% con una productividad de 0.18 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} células)
Ejemplo 4 Síntesis de adenosina a partir de uridina empleando células de Photobacterium phosphoreum CECT 4192
La síntesis se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, pero empleando células de Photobacterium phosphoreum. Las concentraciones de uridina fueron de 5 mM y la de adenina 0,5 mM.
La conversión obtenida fue de un 47% con una productividad de 46 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 5 Síntesis de adenosina a partir de uridina empleando células de Photobacterium leiognathi CECT 4191
La síntesis se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 4, pero empleando células de Photobacterium leiognathi.
La conversión obtenida fue de un 66% con una productividad de 47 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 6 Síntesis de 2'-deoxiadenosina a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Photobacterium leioanathi CECT 4191
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Photobacterium leiognathi.
La conversión obtenida fue de un 70% con una productividad de 32 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 7 Síntesis de 2',3'-dideoxiadenosina a partir de 2',3'-dideoxiuridina empleando células de Bacíllus subtilis ssp níger CECT 4071
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacíllus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 68% al cabo de 3 hrs de reacción, con una productividad de 28 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 8 Síntesis de 2'.3'-dideoxiribunucleosido de purina a partir de 2',3'-dideoxiuridina empleando células de Bacillus subtilis ssp níger CECT 4071
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 38% al cabo de 21 hrs de reacción, con una productividad de 1.2 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 9 Síntesis del ribonucleósido del 3-carboxamido-1,2,4-triazol a partir de uridina empleando células de Bacillus subtilis ssp níger CECT 4071
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 45% al cabo de 3 hrs de reacción, con una productividad de 12 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 10 Síntesis del ribonucleósido de 6-mercaptopurina a partir de uridina empleando células de Bacillus subtilis ssp níger CECT 4071
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 36% al cabo de 3 hrs de reacción, con una productividad de 7 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 11 Síntesis del 2'-deoxiribonucleósido de 6-mercaptopurina a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Bacillus subtilis ssp níger CECT 4071
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus subtilis ssp níger.
La conversión obtenida fue de un 18% al cabo de 3 hrs de reacción, con una productividad de 5 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 12 Síntesis de 2'-deoxiribonucleósido de 5'-fluoruracilo a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Bacillus psychrosaccharolyticus CECT 4074
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus psychrosaccharolyticus.
La conversión obtenida fue de un 5% al cabo de 1 hr de reacción, con una productividad de 3,2 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).
Ejemplo 13 Síntesis de Z-deoxiribonucleósido de 5'-clorouracilo a partir de 2'-deoxiuridina empleando células de Bacillus psychrosaccharolyticus CECT 4074
La síntesis se realizó en las condiciones descritas para el ejemplo 1, pero empleando las células de Bacillus psychrosaccharolyticus.
La conversión obtenida fue de un 10% al cabo de 3 hrs de reacción, con una productividad de 7 x 10^{-5} mM/(hr x 10^{6} cel).

Claims (16)

1. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos en un único paso por intercambio de bases que comprende:
a)
un nucleósido de uracilo como producto de partida
b)
un microorganismo psicrotolerante o psicrotrofo productor de nucleósido fosforilasas o 2'-desoxirribosiltransferasas como agente catalizador
c)
una temperatura de reacción entre 45 y 60ºC con una escasa formación de hipoxantina como producto secundario de la reacción por descomposición de nucleósidos de 6-aminopurina.
2. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de reacción es de 57ºC.
3. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se emplean las células enteras de los microorganismos utilizados.
4. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Bacillus psychrosaccharolyticus.
5. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Psychrobacter immobilis.
6. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
7. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de uridina y se obtiene adenosina utilizando cepas de Photobacterium phosphoreum.
8. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de uridina y se obtiene adenosina utilizando cepas de Photobacterium leiognathi.
9. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiadenosina utilizando cepas de Photobacterium leiognathi.
10. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2',3'-dideoxiuridina y se obtiene 2',3'-dideoxiadenosina utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
11. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2',3'-dideoxiuridina y se obtiene 2',3'-dideoxiribonucleósido de purina utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
12. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de uridina y se obtiene ribonucleósido de 3-carboxamido-1,2,4-triazol utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
13. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de uridina y se obtiene ribonucleósido de 6-mercaptopurina utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
14. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiribonucleósido de 6-mercaptopurina utilizando cepas de Bacillus subtilis ssp niger.
15. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiribonucleósido de 5'-fluoruracilo utilizando cepas de Bacillus psychrosaccharolyticus.
16. Procedimiento para la síntesis de nucleósidos, según reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se parte de 2'-deoxiuridina y se obtiene 2'-deoxiribonucleósido de 5'-clorouracilo utilizando cepas de Bacillus psychrosaccharolyticus.
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