JP4058663B2 - リボース１−リン酸類及びヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ウイルス剤、アンチセンス医薬などの原料として使用されるヌクレオシド化合物の製造方法、及び該化合物の生化学的合成の重要な出発原料であるリボース１−リン酸類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシド化合物の工業的製造は、チミジン以外は化学合成の収率が極めて低いために、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の加水分解物からの抽出・単離が中心になっている。しかし、現在ＤＮＡの原料として使用されている鮭や鰊の白子は資源的に限られているうえに、集荷が難しく、低温保存の設備が必要である。また、白子の中にはＤＮＡの他にタンパク質、糖類が含まれており、まず、ＤＮＡをこれらから分離しなければならない。さらに、ＤＮＡの加水分解物中には４種の２’−デオキシヌクレオシド類（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン）が存在するので、分離工程が煩雑でコスト高になってしまう。
【０００３】
一方、ヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシドと核酸塩基を原料として、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により塩基交換反応を行わせ、希望するヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシドを得る方法が報告されている（Ｈｏｒｉ Ｎ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｙ．，＆ Ｍｉｋａｍｉ Ｙ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，１９７〜２０２（１９８９）、特開平１１−４６７９０号公報）。この方法の本質は、ヌクレオシドホスホリラーゼにより触媒される、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸による核酸塩基のリボシル化である。すなわち、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と任意の核酸塩基を原料にして、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により、対応するヌクレオシド化合物を調製することが可能である。リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基からヌクレオシド化合物を酵素的に合成する方法は最も単純で、合成後の精製も容易である。
【０００４】
しかし、リボース１−リン酸及び２−デオキシリボース１−リン酸は化学的に合成することが極めて困難な化合物であり、また化学的にやや不安定なばかりでなくホスファターゼにより分解されやすい。そのため、工業的にリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基を出発原料としてヌクレオシド化合物を合成することはできなかった。このような事情から、出発原料となるリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸の製造方法の確立、およびリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を出発原料としたヌクレオシド化合物の製造方法の確立が強く望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は第１にリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を効率よく製造する生化学的方法を提供することである。第２には、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基を原料としてヌクレオシド化合物を効率よく工業的に製造する生化学的方法を提供することである。
【０００６】
本発明を為すにあたり本発明者らは、以下に記載の点に着目し検討を重ねた。
【０００７】
リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を効率よく生成する酵素として、ホスホペントムターゼ（ＥＣ５．４．２．７（以下、式中でＰＰＭと略す））が知られていて、本酵素は式（１）又は式（２）で示される平衡反応を触媒する。
【０００８】
【化１】
【０００９】
従来の報告（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５２，１８４〜１９３（１９６１））では、式（２）の平衡は２−デオキシリボース５−リン酸生成側に著しく片寄っており、平衡状態における２−デオキシリボース５−リン酸と２−デオキシリボース１−リン酸の存在比率は９５：５であった。
【００１０】
しかし、式（１）及び式（２）において平衡時における両化合物の存在比率は、理論的にはリン酸基の切断時放出エネルギー（ポテンシャル・エネルギー、△’Ｇ）の比に相当すると考えられ、概算７０：３０程度と推定されるため、式（１）及び式（２）で示される反応でのリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸の存在比率は３０％が期待される。
【００１１】
また、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸が不安定な化合物であり、ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１ アルカリホスファターゼ、及びＥＣ３．１．３．２ 酸性ホスファターゼ）により容易に分解される化合物であることから、酵素源として用いる微生物はホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを著量含有し、かつホスファターゼを含有しないことが望ましい。この場合、ヌクレオシドホスホリラーゼはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）の両者を意味する。
【００１２】
更に、最終生産物のヌクレオシド化合物を分解するヌクレオシダーゼ（例えば、ＥＣ３．２．２．７ アデノシンヌクレオシダーゼ）を含有しない微生物が一層望ましい。
【００１３】
２−デオキシリボース５−リン酸はデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．４）により、容易にグリセルアルデヒド３-リン酸とアセトアルデヒドに分解される。したがって、２−デオキシリボース５−リン酸を基質とする場合は、該酵素を含有しない微生物であることが望ましい。
【００１４】
出発原料である核酸塩基は水に溶け難いが、一般に温度の上昇に連れて溶解度は増大するので、酵素は高温で使用できる耐熱性酵素であることが望ましい。例えば、アデニン１ｇを溶解するには、常温では２Ｌの水が必要であるが、沸騰水では４０ｍＬで十分である（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，９版、１９８３年刊、１３８頁）。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、
（１）自然界より分離したある微生物株が強いホスホペントムターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を示し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼ活性を実質的に示さないこと、
（２）該微生物株は生育適温が５０℃以上であり、含有するホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼは５０℃以上で使用可能な耐熱性酵素であること、
（３）２−デオキシリボース５−リン酸を原料とする場合、該微生物株の菌体又は該菌体由来酵素を作用させる際にアセトアルデヒドやプロピオンアルデヒドなどのアルデヒド類を共存させると、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制され、反応収率が著しく向上すること、
（４）該微生物株はバチルス属に属し、特に高い活性を示す１株はバチルス・コアギュランスと同定され、もう一株はバチルス・スピーシーズと同定されること、
（５）該バチルス株の菌体又は該菌体由来酵素により、リボース５−リン酸又は２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基から、対応するヌクレオシド化合物がほぼ理論収率に近い値で合成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の要旨は以下のようである。
【００１７】
（１）リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類に、耐熱性ホスホペントムターゼを含有し、かつホスファターゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、リボース１−リン酸及び２−デオキシリボース１−リン酸からなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するリボース１−リン酸類を得ることを特徴とするリボース１−リン酸類の製造方法。
（２）リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類と核酸塩基に、耐熱性ホスホペントムターゼと耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、ヌクレオシド及び２’-デオキシヌクレオシドからなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するヌクレオシド化合物を得ることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
（３）微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする上記（１）記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
（４）微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする上記（２）記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（５）前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である上記（１）または（３）に記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
（６）前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である上記（２）または（４）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（７）耐熱性ホスホペントムターゼおよび耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを産生する、バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）およびバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）からなる群より選択される微生物。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
＜原料＞
本発明で原料として使用するリボース５−リン酸又は２−デオキシリボース５−リン酸（以下、リボース５−リン酸類という）は市販されている（例えば、シグマ社製）。また、リボース５−リン酸類はリボース又は２−デオキシリボース（以下、リボース類という）をオキシ塩化リンなどのリン酸化剤で処理することにより調製することができる。
【００２０】
もう一つの原料である核酸塩基には天然型のチミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチンなどの他に、ヌクレオシドホスホリラーゼにより認識される人工の核酸塩基類縁化合物（例えば、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルチオプリン、１−デアザアデニン、３−デアザグアニン、ベンズイミダゾール、グリオキサール−グアニンなど）を使用することができる。
【００２１】
＜酵素反応によるリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸及びヌクレオシド化合物の合成＞
リボース５−リン酸類を加えた緩衝液に、耐熱性ホスホペントムターゼを生産する微生物の菌体又は該菌体由来酵素を添加して、該酵素の適温の範囲で撹拌すると、式（１）又は（２）に示す反応が生じ、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸（以下、リボース１−リン酸類という）が生成する。
【００２２】
【化２】
【００２３】
次に、この反応液に核酸塩基とヌクレオシドホスホリラーゼが存在するとリボシル化が行われヌクレオシド化合物が生成する。例えば、プリン塩基であるアデニンが存在するとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、式中でＰＵＮＰと略す）の作用により、式（３）又は式（４）に示す反応が生じアデノシン又はデオキシアデノシンが生成する。また、ピリミジン塩基であるチミンが存在するとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、式中でＰＹＮＰと略す）の作用により、式（５）又は式（６）に示す反応が生じ５−メチルウリジン又はチミジンが生成する。
【００２４】
【化３】
【００２５】
【化４】
【００２６】
したがって、例えば、合成原料として２−デオキシリボース５−リン酸とアデニン又はチミン、酵素としてホスホペントムターゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼが反応液中に共存する場合は、式（２）と式（４）、又は式（２）と式（６）の反応が連続して起こり、デオキシアデノシン又はチミジンが生成する。
【００２７】
本発明で好ましい微生物株として用いるバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４及びバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８はいずれもホスホペントムターゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含有しているので、連続反応により、原料の核酸塩基に対応したヌクレオシド化合物を合成することができる。
【００２８】
ところで、微生物は生物である以上、通常は生存のためにホスファターゼ、ヌクレオシダーゼ、デオキシリボースリン酸アルドラーゼなどの酵素を含有しており、これらはそれぞれリボース１−リン酸類及びリボース５−リン酸類のリン酸脱離（リボース又は２−デオキシリボースへの分解）、ヌクレオシド化合物の分解、２−デオキシリボース５−リン酸の分解（グリセルアルデヒド３-リン酸とアセトアルデヒドへの分解）を触媒する、本発明にとって望ましくない酵素である。このため、これらの酵素活性を持たない微生物が好ましい。
【００２９】
ホスファターゼの阻害剤としてエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）が有効であることはよく知られているが、一般にホスホペントムターゼはマンガンイオン（２価）を活性の必須要素とするためにＥＤＴＡは阻害的に働き添加することができない（Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐａｇｅ ５．４．２．７ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｎｔｏｍｕｔａｓｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，１９９０）。しかしながら、本発明で好ましい菌株として用いるバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４及びバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８はいずれもホスファターゼ活性が極めて微弱であって、実際上ＥＤＴＡの添加は必要ない。また、ヌクレオシダーゼの活性も実際上認められない。
【００３０】
一方、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（以下、式中でＤＥＲＡと略す）は微量存在するが、２−デオキシリボース５−リン酸を原料とする場合は、アルデヒド類の添加が、下記式（７）における平衡を２−デオキシリボース５−リン酸生成側（右側）にシフトさせ、２−デオキシリボース５−リン酸の分解の阻害剤として働くことを発見した。アルデヒド類としては、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリセルアルデヒドなどが挙げられる。中でも、アセトアルデヒドとプロピオンアルデヒドが好ましく、アセトアルデヒドが最も好ましい。
【００３１】
【化５】
【００３２】
なお、リボース５−リン酸を原料とする場合は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼが存在しても該酵素による分解反応はないが、アルデヒド類を添加した場合にあっても３５０ｍＭ以下の適当量であれば全体の酵素反応には一向に差し支えない。
【００３３】
本発明は、かかる微生物株の天然界からの分離と反応条件の発見によって完成されたものである。
【００３４】
＜反応条件及び生成物の分離・精製と定量＞
次に反応条件について記す。本発明において、原料のリボース５−リン酸類の初期濃度は５〜２００ｍＭであり、好ましくは５〜５０ｍＭである。原料の核酸塩基の初期濃度は５〜２００ｍＭであり、好ましくは５〜５０ｍＭである。核酸塩基の初期濃度は、リボース５−リン酸類の初期濃度以上とするのがよい。一般に、リボース５−リン酸類に対する核酸塩基のモル濃度は高い方が該リボース５−リン酸類に対するヌクレオシド化合物の収率は増大する。ただし、飽和濃度より高い濃度の核酸塩基を加える場合には、反応の進行を見ながら分割して加えてもよい。アルデヒド類の初期濃度は５〜６００ｍＭであり、好ましくは２００〜３５０ｍＭである。
【００３５】
反応液（緩衝液）のｐＨは６．０〜１１．０であり、好ましくは９．０〜１１．０である。緩衝液はトリス−塩酸緩衝液が好ましい。反応温度は、耐熱性酵素の適温の範囲４０〜６５℃で行えばよく、好ましくは５０〜６０℃である。反応時間は反応条件によって左右されるが、反応は通常２〜２４時間で終了する。
【００３６】
なお、反応液からのヌクレオシド化合物の採取は、限外ろ過、イオン交換分離、吸着クロマトグラフィーなどにより行うことができる。
【００３７】
反応生成物の定性・定量分析はＴＬＣにより、より精度の高い定量はＵＶ検出器及び／又は屈折計を装着したＨＰＬＣ等により行うことができる。
【００３８】
＜スクリーニングにおけるホスホペントムターゼ活性の測定方法＞
天然土壌からの微生物のスクリーニングにおいて、ホスホペントムターゼ活性は次のようにして求めた。
【００３９】
ホスホペントムターゼの反応基質であるリボース５−リン酸類において、リボース５−リン酸の場合はホスファターゼにより分解されやすく、２−デオキシリボース５−リン酸の場合は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼとホスファターゼにより分解されやすい。また、反応生成物のリボース１−リン酸類の定量は煩雑であった。このため、反応基質又は生成物の定量によりホスホペントムターゼ活性を測定することは困難であった。
【００４０】
そこで、スクリーニングでは、リボース５−リン酸類、ヒポキサンチン及びヌクレオシドホスホリラーゼを反応液に添加し、ホスホペントムターゼにより生成したリボース１−リン酸類を更にイノシン又はデオキシイノシンへ変換させ、これを定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。
【００４１】
＜酵素生産微生物及びその同定＞
本発明で使用する微生物は、いかなる起源のものでもかまわない。リボース１−リン酸類を製造する場合にあっては、耐熱性ホスホペントムターゼを含有し、かつホスファターゼを実質的に含有しない微生物であれば特に限定されず、またヌクレオシド化合物を製造する場合にあっては、耐熱性ホスホペントムターゼと耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼを実質的に含有しない微生物であれば特に限定されない。尚、本発明において「酵素を実質的に含有しない」とは、当該酵素を含有していないか、あるいは含有していても当該酵素が本発明の製造方法に影響を及ぼさない微弱な活性しか示さないことを意味する。この条件を満たす微生物として、好ましくはバチルス属に属する耐熱性微生物が挙げられる。更に具体的菌株として、好ましくはバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）及びバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）が挙げられる。これらの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに上記寄託番号により国際寄託されている。
【００４２】
これらの微生物は細菌用培地に生育するが、培地にリボースなどの糖又はイノシンなどのヌクレオシドを添加することが、ホスホペントムターゼ及びヌクレオシドホスホリラーゼの生産を高めるうえで効果的である。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素類又はペプトンなどの有機窒素類を用いることができる。また、培地にマンガン、マグネシウムを添加するのが望ましい。培養した菌体はそのまま本酵素反応で利用可能であるが、通常の方法（超音波又はミルによる破砕、遠心分離、硫安分離、膜分離など）により該微生物由来の酵素を得てこれを用いることもできる。
【００４３】
寄託菌株の菌学的性質を、バージェイス・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻（１９８４年）及びバージェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第９版（１９９４）に準じて検討した結果は、次のようである。なお、実験は主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。
【００４４】
バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）［以下、ＹＧＫ−６０５４と略す］。
【００４５】
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．７×２μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）細胞の多形性の有無：なし
（４）運動性：あり
（５）鞭毛の着生状態：周毛
（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端
（７）抗酸性：なし
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：不規則形、全縁波状、低くて平ら、やや光沢あり、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、半透明で培地全体に広がり生育は良好
（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全体液化（冷却時）
（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陽性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陽性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：陽性
（９）無機窒素源の利用：
・硝酸塩：陽性
・アンモニウム塩：陽性
（10）色素の産生：陰性
（11）ウレアーゼ：陰性
（12）オキシダーゼ：陽性
（13）カタラーゼ：陽性
（14）生育の範囲
・ｐＨ５〜６．８における生育：生育した
・ＮａＣｌ濃度：１〜２％で生育した、５％で生育せず
・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５℃）、３０℃で生育せず
（15）酸素に対する態度：通性嫌気性
（16）Ｏ−Ｆテスト
・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）
４．その他種の特徴を示すに必要なもの
（１）各種炭素源の利用
・ラクトース：−
・マルトース：＋
・Ｄ−キシロース：＋
・マンニトール：＋
・Ｄ-ラフィノース：−
・ソルビトール：−
・シュークロース：−
・イノシトール：−
・アドニトール：−
・ラムノース：−
・Ｌ−アラビノース：−
・Ｄ−マンノース：−
・リボース：＋
・ガラクトース：＋
・Ｄ−グルコース：＋
・Ｄ−フルクトース：＋
・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
・トレハロース：＋
（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性
（３）アルギニン脱炭酸：陰性
（４）リジン脱炭酸：陰性
（５）オルニチン脱炭酸：陰性
（６）エスクリン加水分解：陽性
（７）インドール産生：陰性
（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
（９）ゼラチン加水分解：陽性
５．化学分類学的性質
（１）ＧＣ含量：５０〜５２ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）と判明した。
【００４６】
バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）［以下、ＹＧＫ−６００８と略す］。
【００４７】
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．８×２〜３μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）細胞の多形性の有無：なし
（４）運動性：あり
（５）鞭毛の着生状態：周毛
（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端
（７）抗酸性：なし
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：楕円形、全縁なめらか、低凸状、やや光沢あり、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、不透明で画線跡にそって生育、生育は良好
（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全面液化（冷却時）
（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陽性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陽性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：陽性
（９）無機窒素源の利用：
・硝酸塩：陽性
・アンモニウム塩：陽性
（10）色素の産生：陰性
（11）ウレアーゼ：陰性
（12）オキシダーゼ：陽性
（13）カタラーゼ：陽性
（14）生育の範囲
・ｐＨ５〜６．８における生育：ｐＨ５〜５．７で生育せず、ｐＨ６．８で生育した
・ＮａＣｌ濃度：１％で生育した、２〜５％で生育せず
・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５℃）、３０℃で生育せず
（15）酸素に対する態度：通性嫌気性
（16）Ｏ−Ｆテスト
・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）
４．その他種の特徴を示すに必要なもの
（１）各種炭素源の利用
・ラクトース：−
・マルトース：＋
・Ｄ−キシロース：＋
・マンニトール：＋
・Ｄ−ラフィノース：−
・ソルビトール：−
・シュークロース：−
・イノシトール：−
・アドニトール：−
・ラムノース：−
・Ｌ−アラビノース：−
・Ｄ−マンノース：−
・リボース：＋
・ガラクトース：＋
・Ｄ−グルコース：＋
・Ｄ−フルクトース：＋
・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
・トレハロース：＋
（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性
（３）アルギニン脱炭酸：陰性
（４）リジン脱炭酸：陰性
（５）オルニチン脱炭酸：陰性
（６）エスクリン加水分解：陽性
（７）インドール産生：陰性
（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
（９）ゼラチン加水分解：陽性
５．化学分類学的性質
（１）ＧＣ含量：４８〜５０ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）と判明した。
【００４８】
【実施例】
以下、実験例及び実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
【００４９】
リボース５−リン酸類、リボース１−リン酸類、リボース類の同定はＴＬＣ分析により行った。分析条件は次のとおりである。
【００５０】
[方法]
ＴＬＣプレート：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ254（メルク社製）
展開液：ｎ−ブタノール/2-プロパノール/水＝３/１２/４（v/v/v）
検出：エタノール/ｐ-アニスアルデヒド/酢酸/硫酸＝９０/５/１/５（v/v/v/v）
発色：９０〜１００℃
また、核酸塩基とヌクレオシド化合物の定量はＨＰＬＣ分析により行った。分析条件は次のとおりである。
【００５１】
[方法]
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（ジーエルサイエンス製）φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
溶出液：８％メタノール／０．１Ｍ−ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ ２６０ｎｍ
なお、ヌクレオシド化合物の収率は、リボース−５−リン酸類に対するモル濃度パーセントで表した。
【００５２】
実験例１：土壌試料からの菌株の分離とリボース５−リン酸を基質とした１次スクリーニング
土壌懸濁液（土壌は、京都市、大阪府枚方市、愛媛県久万町内から採取）をイノシン、チミジン又はリボースを単一炭素源とした培地（培地１Ｌあたりにイノシン、チミジン又はリボースを２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、寒天２５ｇを含む、ｐＨ７．０）の上へ広げた。３０℃、６０℃又は７０℃で培養し、生育したコロニーを分離した。これら分離菌株を分離培地と同一の炭素源を加えた液体培地（培地１Ｌあたりにイノシン、チミジン又はリボースを２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む、ｐＨ７．０）に植菌し、培養した。
【００５３】
得られた菌体についてホスホペントムターゼ活性を以下のようにして測定した。被検微生物の培養液２ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ リボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０６ユニット［ｐＨ７．４、２５℃で１分間に１μｍｏｌのイノシンをヒポキサンチンとリボース１−リン酸へ変換する酵素量を１ユニットとする。］を含む反応液０．５ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて６時間振とう反応させた（ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及びグルコース１，６−二リン酸はホスホペントムターゼによる反応の活性化因子として報告されている（Ｈａｍｍｅｒ−Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７，３９７〜４０７（１９７０））ので加えた）。生成したイノシンをＨＰＬＣ分析により定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。培養温度と反応温度は分離温度と同一温度とした。その結果、３０℃及び６０℃で分離した菌株にホスホペントムターゼ活性が認められた。イノシンが収率２％以上で得られた、３０℃分離菌株１６株及び６０℃分離菌株３３株を選抜した（表１）。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実験例２：１次スクリーニング選抜菌株の培養、反応条件の検討
１次スクリーニング選抜菌株の至適培養、反応温度を検討した。６０℃で分離したホスホペントムターゼ活性菌株は、５０℃で培養及び反応を行うと多くの菌株でホスホペントムターゼ活性が高くなった。一方、３０℃で分離したホスホペントムターゼ活性菌株は、３０℃での培養及び反応が適していた。また、反応液のｐＨを検討したところ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いると活性が高くなった。
【００５６】
実験例３：リボース５−リン酸を基質とした２次スクリーニング
１次スクリーニングで選抜した菌株を、１次スクリーニングと同様の方法で培養した。培養液２ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ リボース５−リン酸、１０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０６ユニットを含む反応液０．５ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて６時間振とう反応させた。生成したイノシンをＨＰＬＣ分析により定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。培養温度と反応温度は、６０℃で分離した菌株については５０℃とし、３０℃で分離した菌株については３０℃とした。その結果、６０℃で分離した菌株に高いホスホペントムターゼ活性が認められた。イノシンが収率５％以上で得られた、６０℃分離菌株１３株を選抜した（表２）。
【００５７】
【表２】
【００５８】
実験例４：２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした３次スクリーニング２次スクリーニングで選抜した菌株を、１次スクリーニングと同様の方法で培養した。培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０１２ユニットを含む反応液０．１ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。生成したデオキシイノシンの収率は０〜６％であった。反応後、基質の２−デオキシリボース５−リン酸はほとんど残存しておらず、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによりグリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドに分解されたと考えられた。
【００５９】
そこで、上記の反応液に３３３ｍＭ アセトアルデヒドを加えて同様に反応を行ったところ、ほとんどの菌株でデオキシイノシンへの変換効率が大きく上昇した。なかでもＹＧＫ−６０５４及びＹＧＫ−６００８は収率それぞれ２６．５％及び１６．４％でデオキシイノシンを効率よく生成した。反応後、基質の２−デオキシリボース５−リン酸はほぼ未反応分残存しており、アセトアルデヒドを加えたことにより、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制されたと考えられた。ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８をホスホペントムターゼ高活性菌として選抜した。
【００６０】
実施例１：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸の分解活性
最終濃度で１６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液を調製した。また、上記反応液に最終濃度で０．１Ｍ アセトアルデヒドを添加した反応液を調製した。それぞれの反応液５０μＬを２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で２時間振とう反応させた。反応後、２−デオキシリボースの生成量及び２−デオキシリボース５−リン酸の残存量をＴＬＣ分析により測定した（表３）。両株とも、２−デオキシリボースの生成は微量であり、ホスファターゼ活性は微弱であった。
【００６１】
両株とも、２−デオキシリボース５−リン酸の減少量は、アセトアルデヒドを加えない反応液では大きかったが、アセトアルデヒドを加えた反応液では小さくなった。両株とも、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を持つが、アセトアルデヒドを添加することによりデオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制されたと考えられた。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例２：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素が利用可能な核酸基質最終濃度で５０ｍＭの表４に示す各種核酸塩基、１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．３Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で２時間振とう反応させた。生成した各種ヌクレオシド化合物をＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、ＹＧＫ−６０５４及びＹＧＫ−６００８の酵素系はヒポキサンチン以外にも、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、グリオキサール−グアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシルを基質として利用し、それぞれ２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシウリジン、チミジン、グリオキサール−グアニン−２’−デオキシリボシド、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、２’−デオキシ−５−ブロモウリジンを生成できることが分かった（表４）。
【００６４】
【表４】
【００６５】
実験例のスクリーニングとは異なり、市販のヌクレオシドホスホリラーゼは使用していない。それにもかかわらず、表４の結果が得られたことは、ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８が、それぞれ耐熱性ホスホペントムターゼとともに耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを生産していることを示している。また、両菌株の酵素系は天然核酸塩基のみならず、人工核酸塩基も基質として利用することが示された。
【００６６】
実施例３：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素生成に対する培養条件と培地組成の影響
１Ｌあたりに表５に示す糖又はヌクレオシド２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５ｍＬを試験管に入れ、滅菌した。これらにＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８を植菌し、５０℃で１晩培養した。培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、３３３ｍＭ アセトアルデヒド、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸を含む反応液０．１ｍＬを上記静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。
【００６７】
その結果、いずれの菌株も、糖又はヌクレオシドを添加しない培地で培養したとき、デオキシイノシンの生成が認められなかった。ＹＧＫ−６０５４の場合、イノシン又はチミジンを添加した培地、ＹＧＫ−６００８の場合、リボース又は２−デオキシリボースを添加した培地で培養したとき、特にデオキシイノシンの収率が高かった（表５）。
【００６８】
【表５】
【００６９】
実施例４：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素生成に対する培養温度の影響
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬをＬ字型試験管に入れて滅菌し、ＹＧＫ−６０５４を植菌した。同様に上記培地のイノシンをリボースで置き換えた培地にＹＧＫ−６００８を植菌した。これらを４２〜６３℃で振とう培養し、生育度（ＯＤ６６０）の経時変化をみた。その結果、上記２株は４２〜５９℃で生育し、生育速度から見た至適培養温度は５２〜５５℃であり、最大生育（ＯＤ６６０）は、ＹＧＫ−６０５４では５２℃で、ＹＧＫ−６００８では５５℃で得られた（図１及び図２）。
【００７０】
実施例５：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬをＬ字型試験管に入れて滅菌し、ＹＧＫ−６０５４を植菌した。同様に上記培地のイノシンをリボースで置き換えた培地にＹＧＫ−６００８を植菌した。これらを５２℃で振とう培養し、生育度（ＯＤ６６０）の経時変化を見た。
【００７１】
また、培養途中で培養液を一部採取し、培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、３３３ｍＭ アセトアルデヒド、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸を含む反応液０．１ｍＬを上記静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。
【００７２】
その結果両菌株とも、増殖期初期にあたる培養０〜５時間目の菌体（栄養細胞）では、デオキシイノシンの生成はほとんど認められなかった。増殖期後期から定常期にあたる培養７〜９時間目の菌体（菌体内に内性胞子を形成した胞子のう細胞）を用いると、デオキシイノシンの収率が最大となった。死滅期にあたる培養２３時間目の菌体（胞子）では、デオキシイノシンの収率は低かった（図３及び図４）。
【００７３】
実施例６：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響
最終濃度で０〜１Ｍのアセトアルデヒド又はプロピオンアルデヒド、１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）それぞれ８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で２時間振とう反応させた後、生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも０．２〜０．３Ｍのアセトアルデヒド又はプロピオンアルデヒドを加えることによりデオキシイノシンの収率が大きく増大した（図５及び図６）。
【００７４】
上記反応液の２−デオキシリボース５−リン酸をリボース５−リン酸に置き換えて反応を行い、生成したイノシンを定量したところ、両株とも０．１〜０．３Ｍのアセトアルデヒドを加えてもイノシンの収率に影響はなかった（図７）。
【００７５】
実施例７：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響
１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）、１６６ｍＭ ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１０）、１６６ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜１０．０）、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）について検討した。最終濃度で上記濃度の上記緩衝液、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．２Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で２時間振とう反応させた後、生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）を用いたときにデオキシイノシンの収率が高かった（図８及び図９）。
【００７６】
実施例８：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する反応温度の影響
最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．２Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて３０〜７０℃で２時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも、５０〜６０℃で反応を行ったときにデオキシイノシンの収率が高かった（図１０）。
【００７７】
実施例９：至適培養条件と至適反応条件下でのヌクレオシド化合物の合成
・ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬを５０ｍＬ三角フラスコへ入れ、滅菌した。これにＹＧＫ−６０５４を１白金耳植菌し、５２℃、１３０ｒｐｍで９時間往復振とうし、前培養液を得た。上記の培地１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコへ入れ滅菌し、前培養液５ｍＬを加えて５２℃、１００ｒｐｍで１８．５時間往復振とうした。培養液を遠心分離して静止菌体を得た。
【００７８】
０．８５％塩化ナトリウム溶液１００ｍＬに菌体を懸濁して再び遠心分離し、洗浄菌体を得た。湿菌体重は０．６６ｇで、胞子のう細胞の状態であった。最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．３Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４の静止菌体（上記の培養で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液１８０μＬを調製した。これを２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で振とうして反応を行った。生成したデオキシイノシンを経時的にＨＰＬＣで定量したところ、反応４時間目で１７．８ｍＭのデオキシイノシンが生成し、収率は３５．６％となった（図１１）。
【００７９】
また、最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ リボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、ＹＧＫ−６０５４の静止菌体（上記の培養で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液１８０μＬを調製し、上記と同様に反応を行い、生成したイノシンを定量したところ、反応４時間目で１１．７ｍＭのイノシンが生成し、収率は２３．３％となった（図１２）。
【００８０】
・ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成
１Ｌあたりにリボース２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬを５０ｍＬ三角フラスコへ入れ、滅菌した。これにＹＧＫ−６００８を１白金耳植菌し、５５℃、１３０ｒｐｍで９時間往復振とうし、前培養液を得た。上記の培地１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコへ入れ滅菌し、前培養液５ｍＬを加えて５５℃、１００ｒｐｍで１４．５時間往復振とうした。培養液を遠心分離して静止菌体を得た。０．８５％塩化ナトリウム溶液１００ｍＬに菌体を懸濁して再び遠心分離し、洗浄菌体を得た。湿菌体重は０．７２ｇで、胞子のう細胞の状態であった。
【００８１】
上記ＹＧＫ−６０５４での反応条件と同様にしてＹＧＫ−６００８を用いて反応を行つた。２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした場合は、反応４時間目で１６．７ｍＭのデオキシイノシンが生成し、収率は３３．３％となった（図１１）。また、リボース５−リン酸を基質とした場合は、反応４時間目で８．９５ｍＭのイノシンが生成し、収率は１７．９％となった（図１２）。
【００８２】
【発明の効果】
本発明によれば、リボース５−リン酸類である２−デオキシリボース５−リン酸又はリボース５−リン酸に耐熱性微生物の酵素を作用させることにより高収率で効率よく前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するリボース１−リン酸類、２−デオキシリボース１−リン酸又はリボース１−リン酸を製造することができる。また、リボース５−リン酸類である２−デオキシリボース５−リン酸又はリボース５−リン酸と核酸塩基から該微生物の酵素により高収率で効率よくヌクレオシド化合物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４の生育度に対する培養温度の影響を示すグラフ。
【図２】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８の生育度に対する培養温度の影響を示すグラフ。
【図３】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響を示すグラフ。
【図４】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響を示すグラフ。
【図５】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図６】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図７】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図８】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響を示すグラフ。
【図９】 バチルス・スピーシーズＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響を示すグラフ。
【図１０】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する反応温度の影響を示すグラフ。
【図１１】 至適培養条件及び至適反応条件下でのバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成の経時変化を示すグラフ。
【図１２】 至適培養条件及び至適反応条件下でのバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成の経時変化を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ウイルス剤、アンチセンス医薬などの原料として使用されるヌクレオシド化合物の製造方法、及び該化合物の生化学的合成の重要な出発原料であるリボース１−リン酸類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシド化合物の工業的製造は、チミジン以外は化学合成の収率が極めて低いために、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の加水分解物からの抽出・単離が中心になっている。しかし、現在ＤＮＡの原料として使用されている鮭や鰊の白子は資源的に限られているうえに、集荷が難しく、低温保存の設備が必要である。また、白子の中にはＤＮＡの他にタンパク質、糖類が含まれており、まず、ＤＮＡをこれらから分離しなければならない。さらに、ＤＮＡの加水分解物中には４種の２’−デオキシヌクレオシド類（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン）が存在するので、分離工程が煩雑でコスト高になってしまう。
【０００３】
一方、ヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシドと核酸塩基を原料として、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により塩基交換反応を行わせ、希望するヌクレオシド又は２’−デオキシヌクレオシドを得る方法が報告されている（Ｈｏｒｉ Ｎ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｙ．，＆ Ｍｉｋａｍｉ Ｙ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，１９７〜２０２（１９８９）、特開平１１−４６７９０号公報）。この方法の本質は、ヌクレオシドホスホリラーゼにより触媒される、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸による核酸塩基のリボシル化である。すなわち、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と任意の核酸塩基を原料にして、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により、対応するヌクレオシド化合物を調製することが可能である。リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基からヌクレオシド化合物を酵素的に合成する方法は最も単純で、合成後の精製も容易である。
【０００４】
しかし、リボース１−リン酸及び２−デオキシリボース１−リン酸は化学的に合成することが極めて困難な化合物であり、また化学的にやや不安定なばかりでなくホスファターゼにより分解されやすい。そのため、工業的にリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基を出発原料としてヌクレオシド化合物を合成することはできなかった。このような事情から、出発原料となるリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸の製造方法の確立、およびリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を出発原料としたヌクレオシド化合物の製造方法の確立が強く望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は第１にリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を効率よく製造する生化学的方法を提供することである。第２には、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基を原料としてヌクレオシド化合物を効率よく工業的に製造する生化学的方法を提供することである。
【０００６】
本発明を為すにあたり本発明者らは、以下に記載の点に着目し検討を重ねた。
【０００７】
リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸を効率よく生成する酵素として、ホスホペントムターゼ（ＥＣ５．４．２．７（以下、式中でＰＰＭと略す））が知られていて、本酵素は式（１）又は式（２）で示される平衡反応を触媒する。
【０００８】
【化１】
従来の報告（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５２，１８４〜１９３（１９６１））では、式（２）の平衡は２−デオキシリボース５−リン酸生成側に著しく片寄っており、平衡状態における２−デオキシリボース５−リン酸と２−デオキシリボース１−リン酸の存在比率は９５：５であった。
【００１０】
しかし、式（１）及び式（２）において平衡時における両化合物の存在比率は、理論的にはリン酸基の切断時放出エネルギー（ポテンシャル・エネルギー、△’Ｇ）の比に相当すると考えられ、概算７０：３０程度と推定されるため、式（１）及び式（２）で示される反応でのリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸の存在比率は３０％が期待される。
【００１１】
また、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸が不安定な化合物であり、ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１ アルカリホスファターゼ、及びＥＣ３．１．３．２ 酸性ホスファターゼ）により容易に分解される化合物であることから、酵素源として用いる微生物はホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを著量含有し、かつホスファターゼを含有しないことが望ましい。この場合、ヌクレオシドホスホリラーゼはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）の両者を意味する。
【００１２】
更に、最終生産物のヌクレオシド化合物を分解するヌクレオシダーゼ（例えば、ＥＣ３．２．２．７ アデノシンヌクレオシダーゼ）を含有しない微生物が一層望ましい。
【００１３】
２−デオキシリボース５−リン酸はデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．４）により、容易にグリセルアルデヒド３-リン酸とアセトアルデヒドに分解される。したがって、２−デオキシリボース５−リン酸を基質とする場合は、該酵素を含有しない微生物であることが望ましい。
【００１４】
出発原料である核酸塩基は水に溶け難いが、一般に温度の上昇に連れて溶解度は増大するので、酵素は高温で使用できる耐熱性酵素であることが望ましい。例えば、アデニン１ｇを溶解するには、常温では２Ｌの水が必要であるが、沸騰水では４０ｍＬで十分である（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，９版、１９８３年刊、１３８頁）。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、
（１）自然界より分離したある微生物株が強いホスホペントムターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を示し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼ活性を実質的に示さないこと、
（２）該微生物株は生育適温が５０℃以上であり、含有するホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼは５０℃以上で使用可能な耐熱性酵素であること、
（３）２−デオキシリボース５−リン酸を原料とする場合、該微生物株の菌体又は該菌体由来酵素を作用させる際にアセトアルデヒドやプロピオンアルデヒドなどのアルデヒド類を共存させると、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制され、反応収率が著しく向上すること、
（４）該微生物株はバチルス属に属し、特に高い活性を示す１株はバチルス・コアギュランスと同定され、もう一株はバチルス・スピーシーズと同定されること、
（５）該バチルス株の菌体又は該菌体由来酵素により、リボース５−リン酸又は２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基から、対応するヌクレオシド化合物がほぼ理論収率に近い値で合成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の要旨は以下のようである。
【００１７】
（１）リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類に、耐熱性ホスホペントムターゼを含有し、かつホスファターゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、リボース１−リン酸及び２−デオキシリボース１−リン酸からなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するリボース１−リン酸類を得ることを特徴とするリボース１−リン酸類の製造方法。
（２）リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類と核酸塩基に、耐熱性ホスホペントムターゼと耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、ヌクレオシド及び２’-デオキシヌクレオシドからなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するヌクレオシド化合物を得ることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
（３）微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする上記（１）記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
（４）微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする上記（２）記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（５）前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である上記（１）または（３）に記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
（６）前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である上記（２）または（４）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（７）耐熱性ホスホペントムターゼおよび耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを産生する、バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）およびバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）からなる群より選択される微生物。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
＜原料＞
本発明で原料として使用するリボース５−リン酸又は２−デオキシリボース５−リン酸（以下、リボース５−リン酸類という）は市販されている（例えば、シグマ社製）。また、リボース５−リン酸類はリボース又は２−デオキシリボース（以下、リボース類という）をオキシ塩化リンなどのリン酸化剤で処理することにより調製することができる。
【００２０】
もう一つの原料である核酸塩基には天然型のチミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチンなどの他に、ヌクレオシドホスホリラーゼにより認識される人工の核酸塩基類縁化合物（例えば、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルチオプリン、１−デアザアデニン、３−デアザグアニン、ベンズイミダゾール、グリオキサール−グアニンなど）を使用することができる。
【００２１】
＜酵素反応によるリボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸及びヌクレオシド化合物の合成＞
リボース５−リン酸類を加えた緩衝液に、耐熱性ホスホペントムターゼを生産する微生物の菌体又は該菌体由来酵素を添加して、該酵素の適温の範囲で撹拌すると、式（１）又は（２）に示す反応が生じ、リボース１−リン酸又は２−デオキシリボース１−リン酸（以下、リボース１−リン酸類という）が生成する。
【００２２】
【化２】
次に、この反応液に核酸塩基とヌクレオシドホスホリラーゼが存在するとリボシル化が行われヌクレオシド化合物が生成する。例えば、プリン塩基であるアデニンが存在するとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、式中でＰＵＮＰと略す）の作用により、式（３）又は式（４）に示す反応が生じアデノシン又はデオキシアデノシンが生成する。また、ピリミジン塩基であるチミンが存在するとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、式中でＰＹＮＰと略す）の作用により、式（５）又は式（６）に示す反応が生じ５−メチルウリジン又はチミジンが生成する。
【００２４】
【化３】
【化４】
したがって、例えば、合成原料として２−デオキシリボース５−リン酸とアデニン又はチミン、酵素としてホスホペントムターゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼが反応液中に共存する場合は、式（２）と式（４）、又は式（２）と式（６）の反応が連続して起こり、デオキシアデノシン又はチミジンが生成する。
【００２７】
本発明で好ましい微生物株として用いるバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４及びバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８はいずれもホスホペントムターゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含有しているので、連続反応により、原料の核酸塩基に対応したヌクレオシド化合物を合成することができる。
【００２８】
ところで、微生物は生物である以上、通常は生存のためにホスファターゼ、ヌクレオシダーゼ、デオキシリボースリン酸アルドラーゼなどの酵素を含有しており、これらはそれぞれリボース１−リン酸類及びリボース５−リン酸類のリン酸脱離（リボース又は２−デオキシリボースへの分解）、ヌクレオシド化合物の分解、２−デオキシリボース５−リン酸の分解（グリセルアルデヒド３-リン酸とアセトアルデヒドへの分解）を触媒する、本発明にとって望ましくない酵素である。このため、これらの酵素活性を持たない微生物が好ましい。
【００２９】
ホスファターゼの阻害剤としてエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）が有効であることはよく知られているが、一般にホスホペントムターゼはマンガンイオン（２価）を活性の必須要素とするためにＥＤＴＡは阻害的に働き添加することができない（Ｅｎｚｙｍｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐａｇｅ ５．４．２．７ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｎｔｏｍｕｔａｓｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，１９９０）。しかしながら、本発明で好ましい菌株として用いるバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４及びバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８はいずれもホスファターゼ活性が極めて微弱であって、実際上ＥＤＴＡの添加は必要ない。また、ヌクレオシダーゼの活性も実際上認められない。
【００３０】
一方、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（以下、式中でＤＥＲＡと略す）は微量存在するが、２−デオキシリボース５−リン酸を原料とする場合は、アルデヒド類の添加が、下記式（７）における平衡を２−デオキシリボース５−リン酸生成側（右側）にシフトさせ、２−デオキシリボース５−リン酸の分解の阻害剤として働くことを発見した。アルデヒド類としては、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリセルアルデヒドなどが挙げられる。中でも、アセトアルデヒドとプロピオンアルデヒドが好ましく、アセトアルデヒドが最も好ましい。
【００３１】
【化５】
なお、リボース５−リン酸を原料とする場合は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼが存在しても該酵素による分解反応はないが、アルデヒド類を添加した場合にあっても３５０ｍＭ以下の適当量であれば全体の酵素反応には一向に差し支えない。
【００３３】
本発明は、かかる微生物株の天然界からの分離と反応条件の発見によって完成されたものである。
【００３４】
＜反応条件及び生成物の分離・精製と定量＞
次に反応条件について記す。本発明において、原料のリボース５−リン酸類の初期濃度は５〜２００ｍＭであり、好ましくは５〜５０ｍＭである。原料の核酸塩基の初期濃度は５〜２００ｍＭであり、好ましくは５〜５０ｍＭである。核酸塩基の初期濃度は、リボース５−リン酸類の初期濃度以上とするのがよい。一般に、リボース５−リン酸類に対する核酸塩基のモル濃度は高い方が該リボース５−リン酸類に対するヌクレオシド化合物の収率は増大する。ただし、飽和濃度より高い濃度の核酸塩基を加える場合には、反応の進行を見ながら分割して加えてもよい。アルデヒド類の初期濃度は５〜６００ｍＭであり、好ましくは２００〜３５０ｍＭである。
【００３５】
反応液（緩衝液）のｐＨは６．０〜１１．０であり、好ましくは９．０〜１１．０である。緩衝液はトリス−塩酸緩衝液が好ましい。反応温度は、耐熱性酵素の適温の範囲４０〜６５℃で行えばよく、好ましくは５０〜６０℃である。反応時間は反応条件によって左右されるが、反応は通常２〜２４時間で終了する。
【００３６】
なお、反応液からのヌクレオシド化合物の採取は、限外ろ過、イオン交換分離、吸着クロマトグラフィーなどにより行うことができる。
【００３７】
反応生成物の定性・定量分析はＴＬＣにより、より精度の高い定量はＵＶ検出器及び／又は屈折計を装着したＨＰＬＣ等により行うことができる。
【００３８】
＜スクリーニングにおけるホスホペントムターゼ活性の測定方法＞
天然土壌からの微生物のスクリーニングにおいて、ホスホペントムターゼ活性は次のようにして求めた。
【００３９】
ホスホペントムターゼの反応基質であるリボース５−リン酸類において、リボース５−リン酸の場合はホスファターゼにより分解されやすく、２−デオキシリボース５−リン酸の場合は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼとホスファターゼにより分解されやすい。また、反応生成物のリボース１−リン酸類の定量は煩雑であった。このため、反応基質又は生成物の定量によりホスホペントムターゼ活性を測定することは困難であった。
【００４０】
そこで、スクリーニングでは、リボース５−リン酸類、ヒポキサンチン及びヌクレオシドホスホリラーゼを反応液に添加し、ホスホペントムターゼにより生成したリボース１−リン酸類を更にイノシン又はデオキシイノシンへ変換させ、これを定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。
【００４１】
＜酵素生産微生物及びその同定＞
本発明で使用する微生物は、いかなる起源のものでもかまわない。リボース１−リン酸類を製造する場合にあっては、耐熱性ホスホペントムターゼを含有し、かつホスファターゼを実質的に含有しない微生物であれば特に限定されず、またヌクレオシド化合物を製造する場合にあっては、耐熱性ホスホペントムターゼと耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼを実質的に含有しない微生物であれば特に限定されない。尚、本発明において「酵素を実質的に含有しない」とは、当該酵素を含有していないか、あるいは含有していても当該酵素が本発明の製造方法に影響を及ぼさない微弱な活性しか示さないことを意味する。この条件を満たす微生物として、好ましくはバチルス属に属する耐熱性微生物が挙げられる。更に具体的菌株として、好ましくはバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）及びバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）が挙げられる。これらの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに上記寄託番号により国際寄託されている。
【００４２】
これらの微生物は細菌用培地に生育するが、培地にリボースなどの糖又はイノシンなどのヌクレオシドを添加することが、ホスホペントムターゼ及びヌクレオシドホスホリラーゼの生産を高めるうえで効果的である。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素類又はペプトンなどの有機窒素類を用いることができる。また、培地にマンガン、マグネシウムを添加するのが望ましい。培養した菌体はそのまま本酵素反応で利用可能であるが、通常の方法（超音波又はミルによる破砕、遠心分離、硫安分離、膜分離など）により該微生物由来の酵素を得てこれを用いることもできる。
【００４３】
寄託菌株の菌学的性質を、バージェイス・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１巻（１９８４年）及びバージェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー第９版（１９９４）に準じて検討した結果は、次のようである。なお、実験は主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。
【００４４】
バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ） ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）［以下、ＹＧＫ−６０５４と略す］。
【００４５】
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．７×２μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）細胞の多形性の有無：なし
（４）運動性：あり
（５）鞭毛の着生状態：周毛
（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端
（７）抗酸性：なし
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：不規則形、全縁波状、低くて平ら、やや光沢あり、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、半透明で培地全体に広がり生育は良好
（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全体液化（冷却時）
（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陽性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陽性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：陽性
（９）無機窒素源の利用：
・硝酸塩：陽性
・アンモニウム塩：陽性
（10）色素の産生：陰性
（11）ウレアーゼ：陰性
（12）オキシダーゼ：陽性
（13）カタラーゼ：陽性
（14）生育の範囲
・ｐＨ５〜６．８における生育：生育した
・ＮａＣｌ濃度：１〜２％で生育した、５％で生育せず
・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５℃）、３０℃で生育せず
（15）酸素に対する態度：通性嫌気性
（16）Ｏ−Ｆテスト
・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）
４．その他種の特徴を示すに必要なもの
（１）各種炭素源の利用
・ラクトース：−
・マルトース：＋
・Ｄ−キシロース：＋
・マンニトール：＋
・Ｄ-ラフィノース：−
・ソルビトール：−
・シュークロース：−
・イノシトール：−
・アドニトール：−
・ラムノース：−
・Ｌ−アラビノース：−
・Ｄ−マンノース：−
・リボース：＋
・ガラクトース：＋
・Ｄ−グルコース：＋
・Ｄ−フルクトース：＋
・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
・トレハロース：＋
（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性
（３）アルギニン脱炭酸：陰性
（４）リジン脱炭酸：陰性
（５）オルニチン脱炭酸：陰性
（６）エスクリン加水分解：陽性
（７）インドール産生：陰性
（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
（９）ゼラチン加水分解：陽性
５．化学分類学的性質
（１）ＧＣ含量：５０〜５２ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）と判明した。
【００４６】
バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）［以下、ＹＧＫ−６００８と略す］。
【００４７】
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．８×２〜３μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）細胞の多形性の有無：なし
（４）運動性：あり
（５）鞭毛の着生状態：周毛
（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端
（７）抗酸性：なし
２．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：楕円形、全縁なめらか、低凸状、やや光沢あり、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、不透明で画線跡にそって生育、生育は良好
（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全面液化（冷却時）
（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８
３．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陽性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陽性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：陽性
（９）無機窒素源の利用：
・硝酸塩：陽性
・アンモニウム塩：陽性
（10）色素の産生：陰性
（11）ウレアーゼ：陰性
（12）オキシダーゼ：陽性
（13）カタラーゼ：陽性
（14）生育の範囲
・ｐＨ５〜６．８における生育：ｐＨ５〜５．７で生育せず、ｐＨ６．８で生育した
・ＮａＣｌ濃度：１％で生育した、２〜５％で生育せず
・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５℃）、３０℃で生育せず
（15）酸素に対する態度：通性嫌気性
（16）Ｏ−Ｆテスト
・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）
４．その他種の特徴を示すに必要なもの
（１）各種炭素源の利用
・ラクトース：−
・マルトース：＋
・Ｄ−キシロース：＋
・マンニトール：＋
・Ｄ−ラフィノース：−
・ソルビトール：−
・シュークロース：−
・イノシトール：−
・アドニトール：−
・ラムノース：−
・Ｌ−アラビノース：−
・Ｄ−マンノース：−
・リボース：＋
・ガラクトース：＋
・Ｄ−グルコース：＋
・Ｄ−フルクトース：＋
・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
・トレハロース：＋
（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性
（３）アルギニン脱炭酸：陰性
（４）リジン脱炭酸：陰性
（５）オルニチン脱炭酸：陰性
（６）エスクリン加水分解：陽性
（７）インドール産生：陰性
（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
（９）ゼラチン加水分解：陽性
５．化学分類学的性質
（１）ＧＣ含量：４８〜５０ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）と判明した。
【００４８】
【実施例】
以下、実験例及び実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
【００４９】
リボース５−リン酸類、リボース１−リン酸類、リボース類の同定はＴＬＣ分析により行った。分析条件は次のとおりである。
【００５０】
[方法]
ＴＬＣプレート：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ254（メルク社製）
展開液：ｎ−ブタノール/2-プロパノール/水＝３/１２/４（v/v/v）
検出：エタノール/ｐ-アニスアルデヒド/酢酸/硫酸＝９０/５/１/５（v/v/v/v）
発色：９０〜１００℃
また、核酸塩基とヌクレオシド化合物の定量はＨＰＬＣ分析により行った。分析条件は次のとおりである。
【００５１】
[方法]
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（ジーエルサイエンス製）φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
溶出液：８％メタノール／０．１Ｍ−ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ ２６０ｎｍ
なお、ヌクレオシド化合物の収率は、リボース−５−リン酸類に対するモル濃度パーセントで表した。
【００５２】
実験例１：土壌試料からの菌株の分離とリボース５−リン酸を基質とした１次スクリーニング
土壌懸濁液（土壌は、京都市、大阪府枚方市、愛媛県久万町内から採取）をイノシン、チミジン又はリボースを単一炭素源とした培地（培地１Ｌあたりにイノシン、チミジン又はリボースを２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、寒天２５ｇを含む、ｐＨ７．０）の上へ広げた。３０℃、６０℃又は７０℃で培養し、生育したコロニーを分離した。これら分離菌株を分離培地と同一の炭素源を加えた液体培地（培地１Ｌあたりにイノシン、チミジン又はリボースを２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む、ｐＨ７．０）に植菌し、培養した。
【００５３】
得られた菌体についてホスホペントムターゼ活性を以下のようにして測定した。被検微生物の培養液２ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ リボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０６ユニット［ｐＨ７．４、２５℃で１分間に１μｍｏｌのイノシンをヒポキサンチンとリボース１−リン酸へ変換する酵素量を１ユニットとする。］を含む反応液０．５ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて６時間振とう反応させた（ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及びグルコース１，６−二リン酸はホスホペントムターゼによる反応の活性化因子として報告されている（Ｈａｍｍｅｒ−Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７，３９７〜４０７（１９７０））ので加えた）。生成したイノシンをＨＰＬＣ分析により定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。培養温度と反応温度は分離温度と同一温度とした。その結果、３０℃及び６０℃で分離した菌株にホスホペントムターゼ活性が認められた。イノシンが収率２％以上で得られた、３０℃分離菌株１６株及び６０℃分離菌株３３株を選抜した（表１）。
【００５４】
【表１】
実験例２：１次スクリーニング選抜菌株の培養、反応条件の検討
１次スクリーニング選抜菌株の至適培養、反応温度を検討した。６０℃で分離したホスホペントムターゼ活性菌株は、５０℃で培養及び反応を行うと多くの菌株でホスホペントムターゼ活性が高くなった。一方、３０℃で分離したホスホペントムターゼ活性菌株は、３０℃での培養及び反応が適していた。また、反応液のｐＨを検討したところ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いると活性が高くなった。
【００５６】
実験例３：リボース５−リン酸を基質とした２次スクリーニング
１次スクリーニングで選抜した菌株を、１次スクリーニングと同様の方法で培養した。培養液２ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ リボース５−リン酸、１０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０６ユニットを含む反応液０．５ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて６時間振とう反応させた。生成したイノシンをＨＰＬＣ分析により定量してホスホペントムターゼ活性を評価した。培養温度と反応温度は、６０℃で分離した菌株については５０℃とし、３０℃で分離した菌株については３０℃とした。その結果、６０℃で分離した菌株に高いホスホペントムターゼ活性が認められた。イノシンが収率５％以上で得られた、６０℃分離菌株１３株を選抜した（表２）。
【００５７】
【表２】
実験例４：２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした３次スクリーニング２次スクリーニングで選抜した菌株を、１次スクリーニングと同様の方法で培養した。培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ（シグマ社製）０．０１２ユニットを含む反応液０．１ｍＬを上記の静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。生成したデオキシイノシンの収率は０〜６％であった。反応後、基質の２−デオキシリボース５−リン酸はほとんど残存しておらず、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによりグリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドに分解されたと考えられた。
【００５９】
そこで、上記の反応液に３３３ｍＭ アセトアルデヒドを加えて同様に反応を行ったところ、ほとんどの菌株でデオキシイノシンへの変換効率が大きく上昇した。なかでもＹＧＫ−６０５４及びＹＧＫ−６００８は収率それぞれ２６．５％及び１６．４％でデオキシイノシンを効率よく生成した。反応後、基質の２−デオキシリボース５−リン酸はほぼ未反応分残存しており、アセトアルデヒドを加えたことにより、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制されたと考えられた。ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８をホスホペントムターゼ高活性菌として選抜した。
【００６０】
実施例１：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸の分解活性
最終濃度で１６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液を調製した。また、上記反応液に最終濃度で０．１Ｍ アセトアルデヒドを添加した反応液を調製した。それぞれの反応液５０μＬを２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で２時間振とう反応させた。反応後、２−デオキシリボースの生成量及び２−デオキシリボース５−リン酸の残存量をＴＬＣ分析により測定した（表３）。両株とも、２−デオキシリボースの生成は微量であり、ホスファターゼ活性は微弱であった。
【００６１】
両株とも、２−デオキシリボース５−リン酸の減少量は、アセトアルデヒドを加えない反応液では大きかったが、アセトアルデヒドを加えた反応液では小さくなった。両株とも、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を持つが、アセトアルデヒドを添加することによりデオキシリボースリン酸アルドラーゼによる２−デオキシリボース５−リン酸の分解が抑制されたと考えられた。
【００６２】
【表３】
実施例２：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素が利用可能な核酸基質最終濃度で５０ｍＭの表４に示す各種核酸塩基、１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．３Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で２時間振とう反応させた。生成した各種ヌクレオシド化合物をＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、ＹＧＫ−６０５４及びＹＧＫ−６００８の酵素系はヒポキサンチン以外にも、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、グリオキサール−グアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシルを基質として利用し、それぞれ２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシウリジン、チミジン、グリオキサール−グアニン−２’−デオキシリボシド、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、２’−デオキシ−５−ブロモウリジンを生成できることが分かった（表４）。
【００６４】
【表４】
実験例のスクリーニングとは異なり、市販のヌクレオシドホスホリラーゼは使用していない。それにもかかわらず、表４の結果が得られたことは、ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８が、それぞれ耐熱性ホスホペントムターゼとともに耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを生産していることを示している。また、両菌株の酵素系は天然核酸塩基のみならず、人工核酸塩基も基質として利用することが示された。
【００６６】
実施例３：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素生成に対する培養条件と培地組成の影響
１Ｌあたりに表５に示す糖又はヌクレオシド２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５ｍＬを試験管に入れ、滅菌した。これらにＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８を植菌し、５０℃で１晩培養した。培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、３３３ｍＭ アセトアルデヒド、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸を含む反応液０．１ｍＬを上記静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。
【００６７】
その結果、いずれの菌株も、糖又はヌクレオシドを添加しない培地で培養したとき、デオキシイノシンの生成が認められなかった。ＹＧＫ−６０５４の場合、イノシン又はチミジンを添加した培地、ＹＧＫ−６００８の場合、リボース又は２−デオキシリボースを添加した培地で培養したとき、特にデオキシイノシンの収率が高かった（表５）。
【００６８】
【表５】
実施例４：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８の酵素生成に対する培養温度の影響
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬをＬ字型試験管に入れて滅菌し、ＹＧＫ−６０５４を植菌した。同様に上記培地のイノシンをリボースで置き換えた培地にＹＧＫ−６００８を植菌した。これらを４２〜６３℃で振とう培養し、生育度（ＯＤ６６０）の経時変化をみた。その結果、上記２株は４２〜５９℃で生育し、生育速度から見た至適培養温度は５２〜５５℃であり、最大生育（ＯＤ６６０）は、ＹＧＫ−６０５４では５２℃で、ＹＧＫ−６００８では５５℃で得られた（図１及び図２）。
【００７０】
実施例５：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬをＬ字型試験管に入れて滅菌し、ＹＧＫ−６０５４を植菌した。同様に上記培地のイノシンをリボースで置き換えた培地にＹＧＫ−６００８を植菌した。これらを５２℃で振とう培養し、生育度（ＯＤ６６０）の経時変化を見た。
【００７１】
また、培養途中で培養液を一部採取し、培養液０．４ｍＬを遠心分離して静止菌体を得た。０．１６６Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５ｍＭ ヒポキサンチン、３３３ｍＭ アセトアルデヒド、０．１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．０２ｍＭ グルコース１，６−二リン酸を含む反応液０．１ｍＬを上記静止菌体に加え、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で６時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。
【００７２】
その結果両菌株とも、増殖期初期にあたる培養０〜５時間目の菌体（栄養細胞）では、デオキシイノシンの生成はほとんど認められなかった。増殖期後期から定常期にあたる培養７〜９時間目の菌体（菌体内に内性胞子を形成した胞子のう細胞）を用いると、デオキシイノシンの収率が最大となった。死滅期にあたる培養２３時間目の菌体（胞子）では、デオキシイノシンの収率は低かった（図３及び図４）。
【００７３】
実施例６：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響
最終濃度で０〜１Ｍのアセトアルデヒド又はプロピオンアルデヒド、１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）それぞれ８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で２時間振とう反応させた後、生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも０．２〜０．３Ｍのアセトアルデヒド又はプロピオンアルデヒドを加えることによりデオキシイノシンの収率が大きく増大した（図５及び図６）。
【００７４】
上記反応液の２−デオキシリボース５−リン酸をリボース５−リン酸に置き換えて反応を行い、生成したイノシンを定量したところ、両株とも０．１〜０．３Ｍのアセトアルデヒドを加えてもイノシンの収率に影響はなかった（図７）。
【００７５】
実施例７：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響
１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）、１６６ｍＭ ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１０）、１６６ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜１０．０）、５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）について検討した。最終濃度で上記濃度の上記緩衝液、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．２Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて５０℃で２時間振とう反応させた後、生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）を用いたときにデオキシイノシンの収率が高かった（図８及び図９）。
【００７６】
実施例８：ＹＧＫ−６０５４とＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する反応温度の影響
最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．０５ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、０．２Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４又はＹＧＫ−６００８の静止菌体（後述の実施例９に示した方法で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液５０μＬを調製し、２ｍＬエッペンドルフチューブにて３０〜７０℃で２時間振とう反応させた。生成したデオキシイノシンをＨＰＬＣ分析により定量した。その結果、両株とも、５０〜６０℃で反応を行ったときにデオキシイノシンの収率が高かった（図１０）。
【００７７】
実施例９：至適培養条件と至適反応条件下でのヌクレオシド化合物の合成
・ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成
１Ｌあたりにイノシン２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬを５０ｍＬ三角フラスコへ入れ、滅菌した。これにＹＧＫ−６０５４を１白金耳植菌し、５２℃、１３０ｒｐｍで９時間往復振とうし、前培養液を得た。上記の培地１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコへ入れ滅菌し、前培養液５ｍＬを加えて５２℃、１００ｒｐｍで１８．５時間往復振とうした。培養液を遠心分離して静止菌体を得た。
【００７８】
０．８５％塩化ナトリウム溶液１００ｍＬに菌体を懸濁して再び遠心分離し、洗浄菌体を得た。湿菌体重は０．６６ｇで、胞子のう細胞の状態であった。最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ２−デオキシリボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．３Ｍ アセトアルデヒド、ＹＧＫ−６０５４の静止菌体（上記の培養で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液１８０μＬを調製した。これを２ｍＬエッペンドルフチューブにて５５℃で振とうして反応を行った。生成したデオキシイノシンを経時的にＨＰＬＣで定量したところ、反応４時間目で１７．８ｍＭのデオキシイノシンが生成し、収率は３５．６％となった（図１１）。
【００７９】
また、最終濃度で１６６ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ リボース５−リン酸、５０ｍＭ ヒポキサンチン、０．１ｍＭ グルコース１，６−二リン酸、１ｍＭ−ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、ＹＧＫ−６０５４の静止菌体（上記の培養で得られたもの）８％（ｗ／ｖ）を含む反応液１８０μＬを調製し、上記と同様に反応を行い、生成したイノシンを定量したところ、反応４時間目で１１．７ｍＭのイノシンが生成し、収率は２３．３％となった（図１２）。
【００８０】
・ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成
１Ｌあたりにリボース２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＮＨ4Ｃｌ ５ｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８ｇ、酵母エキス２ｇを含む培地（ｐＨ７．０）１０ｍＬを５０ｍＬ三角フラスコへ入れ、滅菌した。これにＹＧＫ−６００８を１白金耳植菌し、５５℃、１３０ｒｐｍで９時間往復振とうし、前培養液を得た。上記の培地１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコへ入れ滅菌し、前培養液５ｍＬを加えて５５℃、１００ｒｐｍで１４．５時間往復振とうした。培養液を遠心分離して静止菌体を得た。０．８５％塩化ナトリウム溶液１００ｍＬに菌体を懸濁して再び遠心分離し、洗浄菌体を得た。湿菌体重は０．７２ｇで、胞子のう細胞の状態であった。
【００８１】
上記ＹＧＫ−６０５４での反応条件と同様にしてＹＧＫ−６００８を用いて反応を行つた。２−デオキシリボース５−リン酸を基質とした場合は、反応４時間目で１６．７ｍＭのデオキシイノシンが生成し、収率は３３．３％となった（図１１）。また、リボース５−リン酸を基質とした場合は、反応４時間目で８．９５ｍＭのイノシンが生成し、収率は１７．９％となった（図１２）。
【００８２】
【発明の効果】
本発明によれば、リボース５−リン酸類である２−デオキシリボース５−リン酸又はリボース５−リン酸に耐熱性微生物の酵素を作用させることにより高収率で効率よく前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するリボース１−リン酸類、２−デオキシリボース１−リン酸又はリボース１−リン酸を製造することができる。また、リボース５−リン酸類である２−デオキシリボース５−リン酸又はリボース５−リン酸と核酸塩基から該微生物の酵素により高収率で効率よくヌクレオシド化合物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４の生育度に対する培養温度の影響を示すグラフ。
【図２】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８の生育度に対する培養温度の影響を示すグラフ。
【図３】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響を示すグラフ。
【図４】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する培養時間の影響を示すグラフ。
【図５】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図６】 バチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図７】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成に対するアルデヒド類の影響を示すグラフ。
【図８】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響を示すグラフ。
【図９】 バチルス・スピーシーズＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する緩衝液の種類とｐＨの影響を示すグラフ。
【図１０】 バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるヌクレオシド化合物の合成に対する反応温度の影響を示すグラフ。
【図１１】 至適培養条件及び至適反応条件下でのバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８による２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成の経時変化を示すグラフ。
【図１２】 至適培養条件及び至適反応条件下でのバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８によるリボース５−リン酸と核酸塩基からのヌクレオシド化合物の合成の経時変化を示すグラフ。
Claims (7)
- リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類に、耐熱性ホスホペントムターゼを含有し、かつホスファターゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、リボース１−リン酸及び２−デオキシリボース１−リン酸からなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するリボース１−リン酸類を得ることを特徴とするリボース１−リン酸類の製造方法。
- リボース５−リン酸及び２−デオキシリボース５−リン酸からなる群より選択されるリボース５−リン酸類と核酸塩基に、耐熱性ホスホペントムターゼと耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを含有し、かつホスファターゼ及びヌクレオシダーゼを実質的に含有しないバチルス属に属する耐熱性微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させて、ヌクレオシド及び２’-デオキシヌクレオシドからなる群より選択される、前記それぞれのリボース５−リン酸類に対応するヌクレオシド化合物を得ることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
- 微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする請求項１記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
- 微生物の菌体又は該微生物由来の酵素を作用させる際に、アルデヒド類を共存させることを特徴とする請求項２記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
- 前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である請求項１または３記載のリボース１−リン酸類の製造方法。
- 前記微生物がバチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）又はバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）である請求項２または４記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
- 耐熱性ホスホペントムターゼおよび耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼを産生する、バチルス・コアギュランス ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９８）およびバチルス・スピーシーズ ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８９７）からなる群より選択される微生物。
Priority Applications (1)
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