JP2572890B2 - ヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents
ヌクレオシド化合物の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、収率の高いヌクレオシド化合物の製造方
法に関する。
法に関する。
塩基の交換反応を用いてヌクレオシド化合物を製造す
る方法としては、N.Hori,M.Watanabe,Y.Yamazaki and
Y.Mikami,Agric.Biol.Chem.,53,197（1989）に報告され
た方法がある。この方法は、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼとを
用い、リン酸の存在下において、チミンとイノシンとを
反応させて塩基の交換反応を行ない、リボース−１−リ
ン酸を中間体として５−メチルウリジンを製造するもの
である。
る方法としては、N.Hori,M.Watanabe,Y.Yamazaki and
Y.Mikami,Agric.Biol.Chem.,53,197（1989）に報告され
た方法がある。この方法は、プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼとを
用い、リン酸の存在下において、チミンとイノシンとを
反応させて塩基の交換反応を行ない、リボース−１−リ
ン酸を中間体として５−メチルウリジンを製造するもの
である。
上記反応は、以下の二つの反応よりなる。
イノシン＋リン酸 リボース−１−リン酸＋ヒポキサンチン （１） リボース−１−リン酸＋チミン ５−メチルウリジン＋リン酸 （２） したがって、反応全体としては、 イノシン＋チミン ５−メチルウラシル＋ヒポキサンチン （３） である。
前述の塩基の交換反応（３）の平衡定数K1（K1＝［５
−メチルウリジン］［ヒポキサンチン］／［イノシン］
［チミン］）は0.21（40℃）であり、イノシンとチミン
の初期濃度が同じであれば、収率は平衡定数に規定され
るので、５−メチルウリジンの最大収率はわずか31％と
なる。これは、チミン以外の他の塩基を用いた場合も同
様であり、塩基の交換反応によるヌクレオシド化合物の
収率は低い値に止まっている。
−メチルウリジン］［ヒポキサンチン］／［イノシン］
［チミン］）は0.21（40℃）であり、イノシンとチミン
の初期濃度が同じであれば、収率は平衡定数に規定され
るので、５−メチルウリジンの最大収率はわずか31％と
なる。これは、チミン以外の他の塩基を用いた場合も同
様であり、塩基の交換反応によるヌクレオシド化合物の
収率は低い値に止まっている。
この発明は、塩基の交換反応を利用する、収率の高い
ヌクレオシド化合物の製造方法を提供することを目的と
する。
ヌクレオシド化合物の製造方法を提供することを目的と
する。
本発明者らは、上記事情に鑑み、ヌクレオシド化合物
の収率をより高めるために鋭意研究を行なった。その結
果、塩基交換により生成されるヒポキサンチンを系から
除外することによりヌクレオシド化合物をより高収率で
得る方法を見出した。
の収率をより高めるために鋭意研究を行なった。その結
果、塩基交換により生成されるヒポキサンチンを系から
除外することによりヌクレオシド化合物をより高収率で
得る方法を見出した。
すなわち、この発明のヌクレオシド化合物の製造方法
は、イノシンおよびデオキシイノシンからなる群より選
ばれるヌクレオシドと、ピリミジン塩基およびプリン塩
基からなる群より選ばれる塩基とを、リン酸もしくはリ
ン酸塩存在下の水溶液中において、前記塩基がピリミジ
ン塩基の場合にはプリンヌクレオシドホスホリラーゼお
よびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ま
た前記塩基がプリン塩基の場合にはプリンヌクレオシホ
スホリラーゼにより塩基交換反応させ、さらに、この塩
基交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチン
オキシダーゼにより尿酸に変換させることを特徴とす
る。
は、イノシンおよびデオキシイノシンからなる群より選
ばれるヌクレオシドと、ピリミジン塩基およびプリン塩
基からなる群より選ばれる塩基とを、リン酸もしくはリ
ン酸塩存在下の水溶液中において、前記塩基がピリミジ
ン塩基の場合にはプリンヌクレオシドホスホリラーゼお
よびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ま
た前記塩基がプリン塩基の場合にはプリンヌクレオシホ
スホリラーゼにより塩基交換反応させ、さらに、この塩
基交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチン
オキシダーゼにより尿酸に変換させることを特徴とす
る。
ここで、前記ピリミジン塩基としてはウラシル、シト
シン、チミン、５−フルオロウラシル、５−クロロウラ
シル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−
エチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５
−カルボキシウラシル等を、前記プリン塩基としてはア
デニン、グアニン、２−クロロプリン、６−クロロプリ
ン、2,6−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプ
リン、2,6−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、
６−メチルチオプリン、２−アミノプリン等をそれぞれ
挙げることができる。
シン、チミン、５−フルオロウラシル、５−クロロウラ
シル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−
エチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５
−カルボキシウラシル等を、前記プリン塩基としてはア
デニン、グアニン、２−クロロプリン、６−クロロプリ
ン、2,6−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプ
リン、2,6−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、
６−メチルチオプリン、２−アミノプリン等をそれぞれ
挙げることができる。
以下、この発明のヌクレオシド化合物の製造方法を、
ヌクレオシドと塩基交換反応を行なう塩基をピリミジン
塩基として詳細に説明する。
ヌクレオシドと塩基交換反応を行なう塩基をピリミジン
塩基として詳細に説明する。
まず、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、出
発物質であるイノシンまたはデオキシイノシンとリン酸
もしくはリン酸塩とから、ヒポキサンチンとリボース−
１−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸が生
成する。
発物質であるイノシンまたはデオキシイノシンとリン酸
もしくはリン酸塩とから、ヒポキサンチンとリボース−
１−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸が生
成する。
次に、生成したリボース−１−リン酸もしくはデオキ
シリボース−１−酸が、ピリミジンヌクレオシドホスホ
リラーゼにより、ピリミジン塩基と置換反応を行う。こ
れにより、リボース−１−リン酸とピリミジン塩基との
反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、デオキシリ
ボース−１−リン酸とピリミジン塩基との反応からはピ
リミジンデオキシヌクレオシドが生成する。
シリボース−１−酸が、ピリミジンヌクレオシドホスホ
リラーゼにより、ピリミジン塩基と置換反応を行う。こ
れにより、リボース−１−リン酸とピリミジン塩基との
反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、デオキシリ
ボース−１−リン酸とピリミジン塩基との反応からはピ
リミジンデオキシヌクレオシドが生成する。
これと同時に、反応溶液中に存在するピリミジンヌク
レオシドホスホリラーゼにより、逆反応として、塩基交
換反応により生成したこれらのヌクレオシドおよびリン
酸もしくはリン酸塩が、再びピリミジン塩基とリボース
−１−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸と
に分解し、系全体として平衡状態に至る。
レオシドホスホリラーゼにより、逆反応として、塩基交
換反応により生成したこれらのヌクレオシドおよびリン
酸もしくはリン酸塩が、再びピリミジン塩基とリボース
−１−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸と
に分解し、系全体として平衡状態に至る。
しかしながら、この発明の方法においては、さらに、
反応溶液中にキサンチンオキシダーゼが共存している。
これにより上記イノシンまたはデオキシイノシンの分解
により生成したヒポキサンチンは、酸素とキサンチンオ
キシダーゼにより不可逆的に酸化されてキサンチンを経
て尿酸となる。生成した尿酸は、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼの基質ではないので、塩基の交換反応には関与せ
ず、系から除外される。よって、化学量論的にイノシン
は全てリボース−１−リン酸と尿酸とになり、デオキシ
イノシンは全てデオキシリボース−１−リン酸と尿酸と
になる。したがって、イノシンまたはデオキシイノシン
と塩基との初期濃度が等しいときには、結果的にリボー
ス−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸と
塩基との濃度は等しい。よって、生成するヌクレオシド
の生成量は、下式の平衡定数にのみ依存する。
反応溶液中にキサンチンオキシダーゼが共存している。
これにより上記イノシンまたはデオキシイノシンの分解
により生成したヒポキサンチンは、酸素とキサンチンオ
キシダーゼにより不可逆的に酸化されてキサンチンを経
て尿酸となる。生成した尿酸は、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼの基質ではないので、塩基の交換反応には関与せ
ず、系から除外される。よって、化学量論的にイノシン
は全てリボース−１−リン酸と尿酸とになり、デオキシ
イノシンは全てデオキシリボース−１−リン酸と尿酸と
になる。したがって、イノシンまたはデオキシイノシン
と塩基との初期濃度が等しいときには、結果的にリボー
ス−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸と
塩基との濃度は等しい。よって、生成するヌクレオシド
の生成量は、下式の平衡定数にのみ依存する。
リボース−１−リン酸 または ＋塩基 デオキシリボース−１−リン酸 ヌクレオシド または ＋リン酸 デオキシヌクレオシド ここで、出発物質としてイノシン、塩基としてチミン
を用いた場合を考えると、最終生成物である５−メチル
ウリジンは、上記式（２）に従って生成するので、その
収量は反応式（２）の平衡定数（Ｋ＝［リボース−１−
リン酸］［チミン］／［５−メチルウリジン］［リン
酸］）0.062によって規定される。すなわち、イノシン
とリン酸の初期濃度を各々ＩおよびＰとし、イノシンと
チミンの初期濃度を等しいとするとき、反応終了時のチ
ミンおよび５−メチルウリジンの濃度ＴおよびＭは以下
の式（４）および（５）によって計算することができ
る。
を用いた場合を考えると、最終生成物である５−メチル
ウリジンは、上記式（２）に従って生成するので、その
収量は反応式（２）の平衡定数（Ｋ＝［リボース−１−
リン酸］［チミン］／［５−メチルウリジン］［リン
酸］）0.062によって規定される。すなわち、イノシン
とリン酸の初期濃度を各々ＩおよびＰとし、イノシンと
チミンの初期濃度を等しいとするとき、反応終了時のチ
ミンおよび５−メチルウリジンの濃度ＴおよびＭは以下
の式（４）および（５）によって計算することができ
る。
Ｍ＝Ｉ−Ｔ （５） ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基で
ある場合には、イノシンまたはデオキシイノシンから生
じたリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１
−リン酸とプリン塩基との置換反応は、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼによって起こる。これにより、リボ
ース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌク
レオシドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプ
リン塩基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが
生成する。また、この逆反応である、プリンヌクレオシ
ドまたはプリンデオキシヌクレオシドとリン酸またはリ
ン酸塩とからプリン塩基とリボース−１−リン酸または
デオキシリボース−１−リン酸が生じる反応もプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼによって起こる。したがっ
て、ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基
である場合には、ピリミジンヌクレオシドホスホリラー
ゼは必要ない。
ある場合には、イノシンまたはデオキシイノシンから生
じたリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１
−リン酸とプリン塩基との置換反応は、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼによって起こる。これにより、リボ
ース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌク
レオシドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプ
リン塩基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが
生成する。また、この逆反応である、プリンヌクレオシ
ドまたはプリンデオキシヌクレオシドとリン酸またはリ
ン酸塩とからプリン塩基とリボース−１−リン酸または
デオキシリボース−１−リン酸が生じる反応もプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼによって起こる。したがっ
て、ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基
である場合には、ピリミジンヌクレオシドホスホリラー
ゼは必要ない。
本発明に用いられるキサンチンオキシダーゼ、プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ、およびピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼは、いかなる起源のものでも構わ
ない。この発明において用いたキサンチンオキシダーゼ
は、ベーリンガー・マンハイム山之内社製の牛乳由来の
ものである。また、この発明において用いたプリンヌク
レオシドホスホリラーゼ、およびピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼは、この２種の酸素を同時に産生する
バチラス・ステアロサーモスフィルスJTS859より調製し
た。
ヌクレオシドホスホリラーゼ、およびピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼは、いかなる起源のものでも構わ
ない。この発明において用いたキサンチンオキシダーゼ
は、ベーリンガー・マンハイム山之内社製の牛乳由来の
ものである。また、この発明において用いたプリンヌク
レオシドホスホリラーゼ、およびピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼは、この２種の酸素を同時に産生する
バチラス・ステアロサーモスフィルスJTS859より調製し
た。
この菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所
に寄託されており、その寄託番号は、微工研菌第9666号
（FERM P−9666）である。
に寄託されており、その寄託番号は、微工研菌第9666号
（FERM P−9666）である。
この菌株の菌学的性質を、バージェイズ・マニュアル
第２巻に準じて検討した結果を以下に示す。
第２巻に準じて検討した結果を以下に示す。
1.形 態 桿菌:5.4〜5.6μｍ×0.7〜0.9μｍ 楕円形の胞子形成:2.0〜2.3μｍ×1.1×1.2μｍ、１細
胞に１個、位置は末端 2.培養的性質 NB培地:62℃、２日間培養 平板上：白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない コロニーの形は円形波状 スラント上：白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない 生育は中程度 3.生化学的性質 （１）グラム染色 陽性 （２）嫌気的培養 生育せず （３）運動性 あり、周毛 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）カタラーゼ 陽性 （６）ゼラチンの液化 液化能あり （７）リトマスミルク 凝固させる （８）OFテスト 発酵タイプ （９）Ｖ−Ｐテスト 陰性 （10）グルコースからのガス発生 発生せず （11）グルコースからの酸の産生 産生した （12）アラビノースからの酸の産生 産生せず （13）マンニトールからの酸の産生 産生した （14）キシロールからの酸の産生 産生せず （15）サンブロー培地での生育スラント 生育した 液体 生育した （16）0.001％リゾチーム下での生育 生育せず （17）0.02％アザイド下での生育 生育せず （18）７％NaC1下での生育 生育せず （２％までは生育した） （19）カゼインの加水分解 分解能あり （20）デンプンの加水分解 分解能あり （21）ジヒドロキシアセントンの生成 生成せず （22）エッグヨーク試験 生育せず （23）クエン酸の利用 陰性 （24）インドールの産生 陰性 （25）ウレアーゼ活性 陰性 （26）フェニルアラニンの脱アミノ化 陰性 （27）アルギニンデヒドロラーゼ活性 陽性 （28）チロシンの分解 陰性 （29）レバンの産生 陰性 （30）硝酸塩の還元 陽性 （31）硝酸ナトリウムの脱窒能 陰性 （32）硫化水素の生成 陽性 （33）無機窒素源の利用 NO3を唯一の窒素源として 生育した NH4を唯一の窒素源として 生育した （34）GC含量 47.3％ （35）生育温度 40〜71℃で生育 最適 60〜68℃ （36）pH範囲 pH5.7〜8.5 最適pH6.0〜7.0 この発明の方法において、反応液は、イノシンまたは
デオキシイノシン、アデニン、ウラシルおよびチミンか
らなる群より選ばれる塩基、リン酸もしくはリン酸カリ
ウム等のリン酸塩、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキ
サンチンオキシダーデを含めばよい。この反応液におけ
る、イノシンまたはデオキシイノシンの濃度は５〜100m
M、塩基の濃度は５〜100mM、およびリン酸もしくはリン
酸塩の濃度は５〜20mMであることが好ましい。イノシン
またはデオキシイノシン塩基とは同一濃度とし、イノシ
ンまたはデドキシイノシンとリン酸もしくはリン酸塩と
の濃度比は大きいほうがヌクレオシド化合物の収率は増
加する。反応液のpHは、7.0〜9.0、好ましくは7.0〜8.0
である。反応温度は35℃ないし42℃、好ましくは37℃な
いし40℃である。
胞に１個、位置は末端 2.培養的性質 NB培地:62℃、２日間培養 平板上：白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない コロニーの形は円形波状 スラント上：白色、僅かに黄色を含む 光沢あり 不透明 盛り上がらない 生育は中程度 3.生化学的性質 （１）グラム染色 陽性 （２）嫌気的培養 生育せず （３）運動性 あり、周毛 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）カタラーゼ 陽性 （６）ゼラチンの液化 液化能あり （７）リトマスミルク 凝固させる （８）OFテスト 発酵タイプ （９）Ｖ−Ｐテスト 陰性 （10）グルコースからのガス発生 発生せず （11）グルコースからの酸の産生 産生した （12）アラビノースからの酸の産生 産生せず （13）マンニトールからの酸の産生 産生した （14）キシロールからの酸の産生 産生せず （15）サンブロー培地での生育スラント 生育した 液体 生育した （16）0.001％リゾチーム下での生育 生育せず （17）0.02％アザイド下での生育 生育せず （18）７％NaC1下での生育 生育せず （２％までは生育した） （19）カゼインの加水分解 分解能あり （20）デンプンの加水分解 分解能あり （21）ジヒドロキシアセントンの生成 生成せず （22）エッグヨーク試験 生育せず （23）クエン酸の利用 陰性 （24）インドールの産生 陰性 （25）ウレアーゼ活性 陰性 （26）フェニルアラニンの脱アミノ化 陰性 （27）アルギニンデヒドロラーゼ活性 陽性 （28）チロシンの分解 陰性 （29）レバンの産生 陰性 （30）硝酸塩の還元 陽性 （31）硝酸ナトリウムの脱窒能 陰性 （32）硫化水素の生成 陽性 （33）無機窒素源の利用 NO3を唯一の窒素源として 生育した NH4を唯一の窒素源として 生育した （34）GC含量 47.3％ （35）生育温度 40〜71℃で生育 最適 60〜68℃ （36）pH範囲 pH5.7〜8.5 最適pH6.0〜7.0 この発明の方法において、反応液は、イノシンまたは
デオキシイノシン、アデニン、ウラシルおよびチミンか
らなる群より選ばれる塩基、リン酸もしくはリン酸カリ
ウム等のリン酸塩、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキ
サンチンオキシダーデを含めばよい。この反応液におけ
る、イノシンまたはデオキシイノシンの濃度は５〜100m
M、塩基の濃度は５〜100mM、およびリン酸もしくはリン
酸塩の濃度は５〜20mMであることが好ましい。イノシン
またはデオキシイノシン塩基とは同一濃度とし、イノシ
ンまたはデドキシイノシンとリン酸もしくはリン酸塩と
の濃度比は大きいほうがヌクレオシド化合物の収率は増
加する。反応液のpHは、7.0〜9.0、好ましくは7.0〜8.0
である。反応温度は35℃ないし42℃、好ましくは37℃な
いし40℃である。
反応液からの生成物の採取は、オクタデシル基の逆層
クロマトグラフィーにより好適に行なうことができる。
クロマトグラフィーにより好適に行なうことができる。
製造例１ プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの粗酸素液の調製 まず、バチルス・ステアロサーモフィルスJTS859を、
以下の手順で培養した。
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの粗酸素液の調製 まず、バチルス・ステアロサーモフィルスJTS859を、
以下の手順で培養した。
菌の培養には、ペプトン20g、イーストエキス10g、グ
ルコース3gおよび水１よりなるpH6.0の培地を用い
た。この培地２に、バチルス・ステアロサーモフィル
スJTS859の胞子3.2×107個を添加し、撹拌翼（直径60m
m、上下部各６枚）を有するジャーファーメンターを用
い、撹拌翼を680rpmで回転させつつ、通気量1.5vvm、培
養温度65℃、pH5.9〜6.2で８時間培養した。
ルコース3gおよび水１よりなるpH6.0の培地を用い
た。この培地２に、バチルス・ステアロサーモフィル
スJTS859の胞子3.2×107個を添加し、撹拌翼（直径60m
m、上下部各６枚）を有するジャーファーメンターを用
い、撹拌翼を680rpmで回転させつつ、通気量1.5vvm、培
養温度65℃、pH5.9〜6.2で８時間培養した。
培養終了後、菌体を遠心分離（10000g、４℃、15分）
により集菌した。次いで、粗酸素液を以下のようにして
調製した。
により集菌した。次いで、粗酸素液を以下のようにして
調製した。
得られた湿菌160gを500mMリン酸カリウム溶液（pH7.
0、以下単に「緩衡液」と記述する）に懸濁し、ダイモ
ミルで菌体を破壊した。次いで、緩衡液を添加して全体
を1400mlとした後、遠心分離（8300g、20分）を行な
い、上清1300mlを得た。沈殿物はさらに500mlの緩衡液
に懸濁して全体を1030mlとした後、遠心分離（8300g、2
0分）を行ない、上清990mlを得た。この上清900mlを先
の上清1300mlと合わせ、63℃で１時間穏やかに撹拌し
た。次いで、遠心分離（8300g、40分）を行ない、上清2
130mlを得た。
0、以下単に「緩衡液」と記述する）に懸濁し、ダイモ
ミルで菌体を破壊した。次いで、緩衡液を添加して全体
を1400mlとした後、遠心分離（8300g、20分）を行な
い、上清1300mlを得た。沈殿物はさらに500mlの緩衡液
に懸濁して全体を1030mlとした後、遠心分離（8300g、2
0分）を行ない、上清990mlを得た。この上清900mlを先
の上清1300mlと合わせ、63℃で１時間穏やかに撹拌し
た。次いで、遠心分離（8300g、40分）を行ない、上清2
130mlを得た。
この上清2130mlを熱処理した後、−10℃に冷却したア
セント200mlおよび緩衡液200mlの混合溶液を添加した。
さらに、−10℃に冷却したアセトン1.8を添加して５
〜10℃で15分間撹拌した後、遠心分離（9000g、５分）
を行なった。得られた上清に−10℃のアセトン2.5を
添加して15分間撹拌し、遠心分離（9000g、５分）を行
なって沈殿物を得た。この沈殿物を800mlの緩衡液に懸
濁させ、アセトン処理済み粗酸素液850mlを得た。
セント200mlおよび緩衡液200mlの混合溶液を添加した。
さらに、−10℃に冷却したアセトン1.8を添加して５
〜10℃で15分間撹拌した後、遠心分離（9000g、５分）
を行なった。得られた上清に−10℃のアセトン2.5を
添加して15分間撹拌し、遠心分離（9000g、５分）を行
なって沈殿物を得た。この沈殿物を800mlの緩衡液に懸
濁させ、アセトン処理済み粗酸素液850mlを得た。
実施例１ 5mMのイノシン、5mMのチミン、5mMのリン酸カリウ
ム、キサンチンオキシダーゼ1U、および粗酸素液（製造
例１で得られたもの）250μを含む1mlの反応液（pH7.
0）を40℃で11時間反応させ、反応液中に含まれる各成
分の濃度を測定した。その結果を第１図に示す。
ム、キサンチンオキシダーゼ1U、および粗酸素液（製造
例１で得られたもの）250μを含む1mlの反応液（pH7.
0）を40℃で11時間反応させ、反応液中に含まれる各成
分の濃度を測定した。その結果を第１図に示す。
また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
各成分の濃度を測定した。その結果を第２図に示す。
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
各成分の濃度を測定した。その結果を第２図に示す。
これらの図において、縦軸はmMで表わす各成分濃度、
横軸は反応時間を示す。また、−○−はイノシン、−●
−はヒポキサンチン、−□−は５−メチルウリジン、−
■−はチミン、−▲−は尿酸、および−△−はキサンチ
ンをそれぞれ表わす。
横軸は反応時間を示す。また、−○−はイノシン、−●
−はヒポキサンチン、−□−は５−メチルウリジン、−
■−はチミン、−▲−は尿酸、および−△−はキサンチ
ンをそれぞれ表わす。
第１図および第２図より明らかなように、キサンチン
オキシダーゼが存在する場合（第１図）には、存在しな
い場合（第２図）より、生成物である５−メチルウリジ
ンの含有量が非常に高くなっている。特に、キサンチン
オキシダーゼが存在する場合には、イノシン含有量の減
少に従ってヒポキサンチと共にキサンチンおよび尿酸が
見られるようになり、平衡状態では尿酸以外のイノシ
ン、ヒポキサンチンおよびキサンチンの含有量がほぼ０
になることが示されている。これは、キサンチンオキシ
ダーゼにより、ほぼ全てのイノシンが酸化されたことを
示している。
オキシダーゼが存在する場合（第１図）には、存在しな
い場合（第２図）より、生成物である５−メチルウリジ
ンの含有量が非常に高くなっている。特に、キサンチン
オキシダーゼが存在する場合には、イノシン含有量の減
少に従ってヒポキサンチと共にキサンチンおよび尿酸が
見られるようになり、平衡状態では尿酸以外のイノシ
ン、ヒポキサンチンおよびキサンチンの含有量がほぼ０
になることが示されている。これは、キサンチンオキシ
ダーゼにより、ほぼ全てのイノシンが酸化されたことを
示している。
具体的には、キサンチンオキシダーゼが反応系に存在
する場合には、3.8mMの５−メチルウリジンが生成し
た。存在しない場合には、５−メチルウリジンの生成量
は1.45mMであった。
する場合には、3.8mMの５−メチルウリジンが生成し
た。存在しない場合には、５−メチルウリジンの生成量
は1.45mMであった。
このように、キサンチンオキシダーゼの存在下におい
て、より高い収率で５−メチルウリジンを得ることがで
きた。
て、より高い収率で５−メチルウリジンを得ることがで
きた。
実施例２ １〜20mMのチミン、チミンと同じ濃度のイノシン、5m
Mのリン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ4U、およ
び粗酸素液（製造例１で得られたもの）250μを含む
反応液1mlを40℃で反応させ、イノシンが消失したとき
の５−メチルウリジンの生成量を測定した。その結果を
第３図に−●−で示す。この収量は、破線で示す、式
（４）、（５）で計算した理論曲線と比べて大変よい一
致をみた。
Mのリン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ4U、およ
び粗酸素液（製造例１で得られたもの）250μを含む
反応液1mlを40℃で反応させ、イノシンが消失したとき
の５−メチルウリジンの生成量を測定した。その結果を
第３図に−●−で示す。この収量は、破線で示す、式
（４）、（５）で計算した理論曲線と比べて大変よい一
致をみた。
実施例３および４ 5mMのイノシン、下記第１表に示す5mMの塩基、5mMの
リン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ1U、および粗
酸素液（製造例１で得られたもの）250μを含む1mlの
反応液（pH7.0）を40℃で８時間反応させ、反応液中に
含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
リン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ1U、および粗
酸素液（製造例１で得られたもの）250μを含む1mlの
反応液（pH7.0）を40℃で８時間反応させ、反応液中に
含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
これらの結果を、下記第１表に併記した。
実施例５〜７ 5mMの２′−デオキシイノシン、下記第２表に示す5mM
の塩基、5mMのリン酸カリウム、キサンチンオキシダー
ゼ1U、および粗酸素液（製造例１で得られたもの）250m
lを含む1mlの反応液（pH7.0）を40℃で８時間反応さ
せ、反応液中に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定
した。
の塩基、5mMのリン酸カリウム、キサンチンオキシダー
ゼ1U、および粗酸素液（製造例１で得られたもの）250m
lを含む1mlの反応液（pH7.0）を40℃で８時間反応さ
せ、反応液中に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定
した。
また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
は全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の
生成ヌクレオシドの濃度を測定した。
これらの結果を、下記第２表に併記した。
〔発明の効果〕 以上のように、この発明のヌクレオシド化合物の製造
方法は、塩基交換反応を利用して、簡便に、かつ高収率
でヌクレオシド化合物を得ることが可能である。
方法は、塩基交換反応を利用して、簡便に、かつ高収率
でヌクレオシド化合物を得ることが可能である。
第１図はこの発明の実施例１における反応液中の各成分
の濃度の経時変化を示すグラフ、第２図はキサンチンオ
キシダーゼを添加しないこと以外は第１図に示すグラフ
と同じ条件における反応液中の各成分の濃度の経時変化
を示すグラフ、および第３図は実施例２におけるチミン
濃度と５−メチルウリジン生成量との関係を示すグラフ
である。
の濃度の経時変化を示すグラフ、第２図はキサンチンオ
キシダーゼを添加しないこと以外は第１図に示すグラフ
と同じ条件における反応液中の各成分の濃度の経時変化
を示すグラフ、および第３図は実施例２におけるチミン
濃度と５−メチルウリジン生成量との関係を示すグラフ
である。
Claims (2)
- 【請求項１】イノシンおよびデオキシイノシンからなる
群より選ばれるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、リ
ン酸もしくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼおよびピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させ、さら
に、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを
キサンチンオキシダーゼにより尿酸に変換させることを
特徴とするヌクレオキシド化合物の製造方法。 - 【請求項２】イノシンおよびデオキシイノシンからなる
群より選ばれるヌクレオキシドとプリン塩基とを、リン
酸もしくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させ、
さらに、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変換させるこ
とを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32233190A JP2572890B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32233190A JP2572890B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04197193A JPH04197193A (ja) | 1992-07-16 |
| JP2572890B2 true JP2572890B2 (ja) | 1997-01-16 |
Family
ID=18142453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32233190A Expired - Fee Related JP2572890B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2572890B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU4980097A (en) * | 1996-10-21 | 1998-05-15 | University Of Iowa Research Foundation, The | Efficient synthesis of nucleosides |
| JP3864357B2 (ja) * | 1997-08-04 | 2006-12-27 | 有機合成薬品工業株式会社 | プリンヌクレオシド化合物の製造方法 |
| JP6380886B2 (ja) * | 2014-02-27 | 2018-08-29 | 大陽日酸株式会社 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
| JP2015160832A (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-07 | 大陽日酸株式会社 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
-
1990
- 1990-11-28 JP JP32233190A patent/JP2572890B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04197193A (ja) | 1992-07-16 |
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