JP6321724B2 - ペプチドの改造および複合糖質化 - Google Patents

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Description

本発明は、ペプチドの改造および複合糖質化に関する。
天然に存在するほとんどのペプチドは、主ペプチド鎖長に沿って選択された数のアミノ酸へ特異的な連結を介してペプチドに結合している炭水化物部分を含む。このように多くの天然に存在するペプチドは「糖ペプチド(glycopeptide)」と呼ばれている。任意の上記ペプチドに関するグリコシル化パターンの可変性は、そのペプチドの機能について膨大な意味を有する。例えばペプチド上のN−結合グリカン構造は、細胞または生物中のペプチドのプロテアーゼ感受性、細胞内トラフィッキング、分泌、組織ターゲッティング、生物学的半減期および抗原性を含むペプチドの様々な特性に影響を及ぼすことができる。これら1以上の特性の改変は、ペプチドの天然な状況でその効力に大きく影響し、そしてまたペプチドが治療薬の目的に生成された状況では、治療薬としてのペプチドの効力にも影響する。
ペプチド鎖に結合した炭水化物の構造は、「グリカン(glycan)」分子として知られている。ペプチド上の特別なグリカン構造はペプチドの可溶性および凝集特性、1次ペプチド鎖のホールディング、したがってその機能的または酵素的活性、タンパク質分解的攻撃に対するペプチドの耐性およびペプチドの不活性形から活性形への転換を導くタンパク質分解の制御に影響を及ぼす。重要なことはグリカン分子上に存在する末端シアル酸残基が哺乳動物の循環系でペプチドの半減期の長さに影響することである。グリカンが末端シアル酸残基を含まないペプチドは肝臓により循環から急速に除去され、この出来事がペプチドの潜在的な治療的利益を無効にする。
天然に存在する糖ペプチドに見いだされるグリカン構造は典型的には2種類、N−結合およびO−結合グリカンに分けられる。
真核細胞で発現されるペプチドは、典型的には配列アスパラギン−X−セリン/トレオニン(ここでXはプロリンおよびアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であることができる)を含むペプチドの1次構造中の部位のアスパラギン残基上でN−グリコシル化されている。そのようなペプチドの炭水化物部分はN−結合グリカンとして知られている。N−グリコシル化の初期の反応(event)は小胞体(ER)中で起こり、そして哺乳類、植物、昆虫および他の高等真核生物で同一である。最初に14個の糖残基を含んでなるオリゴ糖が脂質担体分子上に構築される。新生ペプチドはERへ翻訳およびトランスロケーションされるので、全オリゴ糖鎖は膜結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素により触媒される反応でアスパラギン残基のアミド基に転移する。N−結合グリカンはさらにERおよびゴルジ装置内の両方でプロセッシングされる。さらなるプロセッシングは一般に除去および付加される糖残基について特異的なグリコシラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼにより触媒される反応で、幾つかの糖残基の除去および他の糖残基の付加を伴う。
典型的にはN−結合グリカンの最終的構造はペプチドが生産される生物に依存する。例えば一般に、細菌中で生産されるペプチドは完全に非グリコシル化である。昆虫細胞中で発現されるペプチドは中でも高マンノース、ポンチ(paunci)−マンノースN−結合オリゴ糖鎖を含む。哺乳動物の細胞培養で生産されるペプチドは通常、例えば種および細胞培養条件に依存して様々にグリコシル化される。同じ種および同じ条件下でも、時々、グリコシル鎖における特定量の異質性に遭遇する。さらに植物細胞中で生産されるペプチドは、動物細胞中で生産されるものとは有意に異なるグリカン構造を含んでなる。組換えペプチドの生産分野、特にペプチドが治療薬として使用される時のジレンマは、正しくグリコシル化されたペプチドを生成できることであり、すなわち天然に存在するペプチドの形態上に存在するものに似ているか、または同一のグリカン構造を有するペプチドを生成できることである。組換え手段により生産されるほとんどのペプチドが、天然に存在するグリカンとは異なるグリカン構造を含んでなる。
当該技術分野において様々な方法がペプチドのグリコシル化パターンをカスタマイズするために提案され、それらにはとりわけ特許文献1、特許文献2、特許文献3および特許文献4を含む。本質的にはペプチドのインビトログリコシル化に必要な多くの酵素がクローン化され、そして配列決定された。中にはこれらの酵素がインビトロで使用され、そして特異的な糖がペプチド上の不完全なグリカン分子に加えられた場合もある。他の例では、発現したペプチド上へ所望の糖部分の付加が細胞内で起こるように、細胞を遺伝的に操作して酵素および所望のペプチドの組み合わせを発現させた。
ペプチドはO−結合グリカンの付加によっても修飾することができ、これはそれらのムチン様糖ペプチド上での広がり(prevalence)によりムチン−型グリカンとも呼ばれている。アスパラギン残基に結合し、そして脂質−結合中間体からのオリゴ糖のen bloc転移により形成されるN−グリカンとは異なり、O−グリカンは主にセリンおよびトレオニン残基に結合し、そしてヌクレオチド糖から糖の段階的付加により形成される(非特許文献1;および非特許文献2)。ペプチドの機能はそれに存在するO−結合グリカン構造により影響され得る。例えばP−セレクチンリガンドの活性は、それに存在するO−結合グリカン構造により影響を受ける。O−結合グリカン構造の総説については、非特許文献3を参照にされたい。他のグリコシル化パターンはグリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル−末端カルボキシル基に連結することにより形成される(非特許文献4;および非特許文献5)。
現在、ペプチドのN−結合グリカンを修飾するために様々な技術が存在するが、当該技術分野には所望する、すなわちカスタマイズされたグリコシル化パターンを有するペプチドの一般的に応用できる生産法の必要性が存在する。当該技術分野では生成するペプチドを工業的規模で生産することができる、ペプチドのカスタマイズされたインビトログリコシル化について特別な必要性が存在する。この、および他の必要性が本発明により満たされる。
特定の生理学的応答を生じるためにグリコシル化および非−グリコシル化ペプチドを投与することは医学分野では周知である。中でもこの目的に使用されている最も知られているペプチドは、糖尿病を処置するために使用されているインスリンである。酵素もそれらの治療的利益のために使用されてきた。治療用ペプチドの使用を制限する主な要因は、ほとんどのペプチドの免疫原性である。患者では投与されたペプチドに対する免疫原性応答がペプチドを中和し、かつ/または患者にアレルギー応答の発生を導き得る。治療用ペプチドの他の欠点には最適状態には及ばない効力および急速な排除速度(clearance rate)を含む。ペプチド治療薬に固有の問題が当該技術分野では認識されており、そしてこの問題の様々な排除法が調査された。可溶性ペプチド治療薬を提供するために、合成ポリマーがペプチド骨格に付けられた。
ポリ(エチレングリコール)(“PEG”)はペプチドに結合されたポリマーの1例である。ペプチド治療薬を誘導化するためのPEGの使用はペプチドの免疫原性を下げ、そして循環からの排除時間を長くすることが示された。例えば特許文献5(Davis et al.)は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールにカップリングした酵素およびペプチドホルモンのような非−免疫原性ペプチドに関する。
1モルのペプチドあたり10から100モルの間のポリマーが使用され、そして少なくとも15%の生理学的活性が維持される。
特許文献6(Veronese et al.)は、ポリエチレングリコール−修飾化タンパク質分解酵素の活性を、タンパク質分解酵素を高分子化インヒビターに連結することにより維持する方法に関する。結合物は医学的応用を意図している。
ペプチドへのPEG結合の主な様式およびその誘導体は、ペプチドのアミノ酸残基を介する非特異的結合である。例えば特許文献7は、PEGに共有結合した酵素の酵素的に活性なポリマー−酵素結合物を開示する。同様に特許文献8は、α−1プロテアーゼインヒビターと、PEGまたはメトキシポリ(エチレングリコール)(“mPEG”)のようなポリマーの共有結合複合体を開示する。Abuchowski et al.,(非特許文献6)は、mPEGのウシ血清アルブミンのアミン基への共有結合を開示する。特許文献9はインターフェロンをポリ(エチレン無水琥珀酸)のようなジカルボン酸の無水物に結合することにより、インターフェロンをより低い疎水性にする方法を開示する。特許文献10はPEGおよびポリ(オキシエチル化)ポリオールの、インターフェロン−β、インターロイキン−2およびイムノトキシンのようなタンパク質への結合を開示する。特許文献11は、リンホカインの少なくとも1つの1級アミノ基に直接結合したPEGを含有するIL−2のような化学的に修飾したリンホカインを開示し、そして特許請求する。特許文献12は、多糖のようなポリマー性基質に共有結合したタンパク質分解酵素の水溶性複合体の製薬学的組成物を開示する。
PEGをペプチドに結合する別の様式は、ペプチド上のグリコシル残基の非−特異的な酸化を介する。酸化された糖はPEG部分をペプチドに結合させるための部位として利用する。例えばM’Timkulu(特許文献13)は、PEGを糖タンパク質へ付加するためにヒドラジン−またはアミノ−PEGの使用を開示する。グリコシル部分は対応するアルデヒドに無作為に酸化され、これは続いてアミノ−PEGにカップリングされる。
上記に開示した各方法では、ポリ(エチレングリコール)が無作為な非特異的様式でペプチド骨格の反応性残基に付加される。治療用ペプチドを生産するために、特異的に標識され、容易に特性決定可能な、本質的に均一な生成物をもたらす誘導化法を利用することが望ましいのは明らかである。
主要な2種類の酵素、グリコシルトランスフェラーゼ(例えばシアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)およびグリコシダーゼが炭水化物の合成に使用されている。グリコシダーゼはさらにエキソグリコシダーゼ(例えばβ−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ)およびエンドグリコシダーゼ(例えばエンド−A、エンド−M)に分類される。これらの種類の各酵素は、炭水化物を調製するために成功裏に合成的に使用されてきた。一般的な総説については、非特許文献7を参照にされたい。
グリコシルトランスフェラーゼはペプチド上のオリゴ糖構造を修飾する。グリコシルトランスフェラーゼは良好な立体化学的および位置化学的制御で特異的生成物を生産するために効果的である。グリコシルトランスフェラーゼはオリゴ糖を調製し、そして末端N−およびO−結合炭水化物構造、特に哺乳動物細胞で生産されたペプチドを修飾するために使用されてきた。例えば糖ペプチドの末端オリゴ糖は完全にシアル化および/またはフコシル化されてより一貫した糖構造を提供し、これは糖ペプチドの薬物動態学および種々の他の生物学的特性を改善する。例えばβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してラクトサミンを合成し、これは炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの用途の具体例である(例えば非特許文献8を参照にされたい)。さらに多くの合成手順がシチジン−5’−モノホスホ−N−アセチルノイラミン酸からシアル酸をガラクトースの3−OHまたは6−OHへ転移するために、α−シアリルトランスフェラーゼを使用した(非特許文献9を参照にされたい)。フコシルトランスフェラーゼはグアノシン−5’−ジホスホフコースからフコース単位をサッカリド受容体の特異的なヒドロキシルへ転移させるための合計経路で使用される。例えばIchikawaは、クローン化されたフコシルトランスフェラーゼを用いてシアリル化ラクトサミンのフコシル化が関与する方法により、シアリルルイス−Xを調製した(非特許文献10)。治療的使用について複合糖質合成における最近の進歩についての考察は、非特許文献11を参照にされたい。また特許文献14;15;16;17;および18も参照にされたい。
グリコシダーゼはまた、サッカリドを調製するためにも使用することができる。グリコシダーゼは通常はグリコシド結合の加水分解を触媒する。しかし適切な条件下でそれらはこの結合を形成するために使用することができる。炭水化物合成に使用するほとんどのグリコシダーゼはエキソグリコシダーゼであり;グリコシル転移は基質の非−還元末端で起こる。グリコシダーゼはグリコシル−酵素中間体中のグリコシル供与体に結合し、これは水に遮断されて加水分解産物を生じるか、または受容体により遮断されて新たなグリコシドまたはオリゴ糖を生じるいずれかである。エキソグリコシダーゼを使用した経路の例は、β−マンノシダーゼの作用により形成されるβ−マンノシド結合を含むすべてのN−結合糖ペプチドのコア(core)となる三糖の合成である(非特許文献12)。
グリコシド結合を形成するためのグリコシダーゼの使用の別の応用例では、突然変異グリコシダーゼが調製され、ここで活性部位内の標準的な求核性アミノ酸が非求核性アミノ酸に変えられる。突然変異酵素はグリコシド結合を加水分解しないが、それらを形成することはできる。そのような突然変異グリコシダーゼは、α−グリコシルフルオリド供与体およびグリコシド受容体分子を使用してオリゴ糖を調製するために使用される(Withers et al.,特許文献19)。
エンドグリコシダーゼの使用はエキソグリコシダーゼよりも一般的ではないが、エンドグリコシダーゼも炭水化物を調製するために使用されている。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、単糖よりもオリゴ糖を転移する利点を有する。オリゴ糖フラグメントは、エンド−F、エンド−Mのようなエンド−β−N−アセチルグルコサミンを使用して基質に加えられた(非特許文献13;および非特許文献14)。
上記酵素の炭水化物の調製における使用に加えて、それらは糖ペプチドの合成にも応用される。リボヌクレアーゼBの均一なグリコフォーム(glycoform)の合成が報告された(非特許文献15)。リボヌクレアーゼBの高いマンノースコア(core)は、糖ペプチドをエンドグリコシダーゼHで処理することにより開裂された。この開裂は2つのコアGlcNAc残基間で特異的に起こる。次に四糖のシアリルルイスXが、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−2,3−シアリルトランスフェラーゼおよびα−1,3−フコシルトランスフェラーゼVの順次使用により、今、均一なタンパク質に残るGlcNAcアンカー部位で酵素的に再構築された。しかし各々の酵素的に触媒される工程は優れた収量で進行するものの、そのような手順は工業的規模での糖ペプチドの生成に適合しなかった。
化学的および酵素的合成要素を組み合わせる方法が当該技術分野では知られている。例えばYamamotoおよび共同研究者(非特許文献16)は、エンドグリコシダーゼを使用した糖ペプチド、グリコシル化ペプチドTの化学酵素的合成を報告した。N−アセチルグルコサミニルペプチドは純粋に化学的な手段で合成された。このペプチドは続いてヒトトランスフェリンペプチドのオリゴ糖を用いて酵素的に仕上げられた(elaborated)。サッカリド部分はエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼで処理することによりペプチドに付加された。生成したグリコシル化ペプチドは、ペプチドTおよびN−アセチルグルコサミニルペプチドTと比べた時、高度に安定であり、しかもタンパク質分解に耐性であった。
レポーター基を用いてペプチド構造を修飾するために、グリコシルトランスフェラーゼの使用が調査された。例えばBrossmer et al.(特許文献20)は、シアル酸の蛍光−標識シチジンモノリン酸(“CMP”)誘導体の形成、およびシアリルトランスフェラーゼ活性のアッセイ、および細胞表面、糖タンパク質およびペプチドの蛍光−標識のアッセイに蛍光グリコシドの使用を開示する。Gross et al.,(非特許文献17)は、同様のアッセイを記載する。Bean et al.,(特許文献21)は、不十分に(deficiently)グリコシル化されたタンパク質の再グリコシル化を利用した、グリコシル化欠損疾患のためのアッセイを開示する。欠損タンパク質は蛍光−標識CMPグリコシドにより再グリコシル化される。各蛍光シアル酸誘導体は、9−位またはシアル酸内で通常はアセチル化されているアミンのいずれかで蛍光部分に置き換えられる。蛍光シアル酸誘導体を使用するこの方法は、グリコシルトランスフェラーゼの存在または非−グリコシル化またはグリコシル化されていないまたは不適切にグリコシル化された糖タンパク質に関するアッセイである。このアッセイは生物起源のサンプル中の少量の酵素または糖タンパク質について行われる。修飾したシアル酸を使用して調製用または工業的規模でグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドを酵素的に誘導化することは、従来技術では開示も示唆もされなかった。
細胞表面を、それらの表面に提示されるグリコシル残基を改変させることにより修飾することに対してかなりの努力が向けられた。例えばFukudaおよび共同研究者は、定めた構造のグリコシドを細胞表面に結合する方法を開発した。この方法は、多様なグリコシル基質を有する、フコースおよびフコース類似体を転移することができるフコシルトランスフェラーゼの弛緩した基質特異性を活用する(非特許文献18)。
酵素的方法は続いて化学的合成(chemical elaboration)に向けて、糖ペプチド上のグリコシル残基を活性化するためにも使用されてきた。グリコシル残基は典型的には、末端のガラクトース残基を対応するアルデヒドに転換するガラクトースオキシダーゼを使用して活性化される。アルデヒドは続いてアミンを含む修飾基にカップリングされる。例えばCasares et al.,(非特許文献19)は、ドキソルビシンを組換えMHCII−ペプチドキメラの酸化されたガラクトース残基に結合させた。
グリコシル残基はケトン基を含むようにも修飾された。例えばMahalおよび共同研究者(非特許文献20)は、天然な基質ではアセチル基により通常は占められている位置にケトン官能基を有するN−レブリノイルマンノサミン(“ManLev”)を調製した。細胞はManLevで処理され、これによりケトン基を細胞表面に包含した。また非特許文献21;非特許文献22;非特許文献23;および非特許文献24も参照にされたい。
国際公開第99/22764号パンフレット 国際公開第98/58964号パンフレット 国際公開第99/54342号パンフレット 米国特許第5,047,335号明細書 米国特許第4,179,337号明細書 国際公開第93/15189号パンフレット 米国特許第4,088,538号明細書 米国特許第4,496,689号明細書 米国特許第4,414,147号明細書 国際公開第87/00056号パンフレット 欧州特許第154,316号明細書 米国特許第4,055,635号明細書 国際公開第94/05332号パンフレット 米国特許第5,876,980号明細書 米国特許第6,030,815号明細書 米国特許第5,728,554号明細書 米国特許第5,922,577号明細書 国際公開第98/31826号パンフレット 米国特許第5,716,812号明細書 米国特許第5,405,753号明細書 米国特許第5,432,059号明細書
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細胞表面の修飾法は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドを修飾するために細胞の不存在下では適用されなかった。さらに細胞表面の修飾法は、修飾されたグリコシル供与体部分をペプチドへ移す酵素的包含には利用されていない。さらにいずれの細胞表面修飾法も、工業的規模でグリコシル−修飾ペプチドを生産するために現実的ではない。
サッカリド構造の酵素的合成(enzymatic elaboration)に向けられた努力にもかかわらず、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子等のような修飾基を用いて、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドを修飾するための工業的に現実的な方法の必要性がいまだに存在する。特に興味深いのは、修飾ペプチドが治療薬または診断薬としての使用を強化する改善された特性を有する方法である。本発明はこれらの、および他の必要性を満たす。
発明の要約
本発明はペプチドに結合した特別なグルカン構造を有するペプチドの多数の改造方法を含む。特別なグリカン構造を本明細書に記載するが、本発明は任意の1つの特定のグリカン構造に限定されると解釈されるべきではない。加えて本明細書には特別なペプチドを記載するが、本発明は記載するペプチドの性質に限定されるべきではなく、むしろ任意のすべての適当なペプチドおよびその変形物を包含するべきである。
本発明を具体的に説明する目的で、本発明の特定な態様を描く図面がある。しかし本発明は図面に表す態様のまさにその組み合わせ方および手段に限定されない。
図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図1Aから図1Zおよび図1AAから図1CCから成る図1は、本発明の方法に有用なペプチドの一覧である。 図2は、トリマンノシルコア(core)グリカン(左側)およびバイセクティングGlcNAcを有するグリカンの酵素的生成法を表すスキームである。 図3は、基本的なトリマンノシルコア構造および種々の完成度の複雑な鎖を表すスキームである。バイセクティングGlcNAc残基を含まない複雑な炭水化物グリカン構造から基本的なトリマンノシルコア構造のインビトロの酵素的生成は、バイセクティングGlcNAcを含むものからのグリカン構造の生成のように示す。記号:四角:GlcNAc;明るい丸:Mn;暗い丸:Gal;三角:NeuAc。 図4は、トリマンノシルコアおよびバイセクティングGlcNAcを有するグリカン(左側)から始まるシアリル化グリカン構造(右側)の酵素的生成のスキームである。 図5は、典型的な高マンノース含有グリカン(左側)および基本的なトリマンノシルコア構造に対するこの構造の酵素的減少法のスキームである。 図6は、典型的には植物細胞で生産されるN−結合グリカン構造を含むフコースおよびキシロースの図解である。 図7は、典型的には昆虫細胞で生産されるN−結合グリカン構造を含むフコースの図解である。 図8は、高マンノース構造を改作し、そしてそれから複雑な糖鎖を合成するための種々の経路を表すスキームである。記号:四角:GlcNAc;丸:Man;菱形:フコース;五角形:キシロース。 図9は、基本的なトリマンノシルコア構造から複雑な構造を合成するためのインビトロ法を表すスキームである。記号:暗い四角:GlcNAc;明るい丸:Man;暗い丸:Gal;暗い三角:NeuAc;GnT:N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ;GalT:ガラクトシルトランスフェラーゼ;ST:シアリルトランスフェラーゼ。 図10は、基本的なトリマンノシルコア構造から合成することができる種々の複雑な構造を表すスキームである。記号:暗い四角:GlcNAc;明るい丸:Man;暗い丸:Gal;暗い三角:NeuAc;暗い菱形:フコース;FTおよびFucT:フコシルトランスフェラーゼ;GalT:ガラクトシルトランスフェラーゼ;ST:シアリルトランスフェラーゼ;Le:ルイス抗原;SLe:シアリル化ルイス抗原。 図11は、セリンまたはトレオニンから始まるO−結合糖ペプチドの調製スキームの例である。 図12は、コア1から4と名付けられた4つの型のO−グリカン構造を表す一連の図解である。コア構造は点線で輪郭を描く。 図13Aおよび図13Bからなる図13は、炭水化物残基が第1世代の2アンテナ(biantennary)構造に戻るように改作された複雑な炭水化物構造および/または高マンノース高マンノース構造を含んでなる、本発明の例示態様を示す一連スキームである。水溶性ポリマー(WSP)を持つ修飾糖を、次に戻し改作法(trimming back process)により暴露した1以上の糖残基に結合させる。 図13Aおよび図13Bからなる図13は、炭水化物残基が第1世代の2アンテナ(biantennary)構造に戻るように改作された複雑な炭水化物構造および/または高マンノース高マンノース構造を含んでなる、本発明の例示態様を示す一連スキームである。水溶性ポリマー(WSP)を持つ修飾糖を、次に戻し改作法(trimming back process)により暴露した1以上の糖残基に結合させる。 図14は図2に示すスキームと同様であり、ここで高マンノース構造がマンノースに「戻し改作」され、次にこれから2アンテナ構造枝および水溶性ポリマーを持つ修飾糖を次に戻し改作法に暴露された1以上の糖残基に結合させる。 図15は図2に示すスキームと同様であり、ここで高マンノースがGlcNAcに戻し改作され、これに第1マンノースが結合し、そして次に水溶性ポリマーを持つ修飾糖を、戻し改作法により暴露した1以上の糖残基に結合する。 図16は図2に示すスキームと同様であり、ここで高マンノースがペプチドのAsnに結合した第1GlcNAcに戻し改作され、この後に続いて付加された1以上の糖残基に水溶性ポリマーを結合する。 図17Aおよび17Bからなる図17は、N−結合炭水化物が戻し改作され、そして続いて水溶性ポリマーを持つ修飾糖部分(GlcNAc)で誘導化されるスキームである。 図17Aおよび17Bからなる図17は、N−結合炭水化物が戻し改作され、そして続いて水溶性ポリマーを持つ修飾糖部分(GlcNAc)で誘導化されるスキームである。 図18Aおよび18Bからなる図18は、N−結合炭水化物が戻し改作され、そして続いて水溶性ポリマーを持つシアル酸部分で誘導化されるスキームである。 図18Aおよび18Bからなる図18は、N−結合炭水化物が戻し改作され、そして続いて水溶性ポリマーを持つシアル酸部分で誘導化されるスキームである。 図19は、N−結合炭水化物が戻し改作され、そして続いて1以上のシアル酸部分で誘導化され、そして水溶性ポリマーで誘導化されたシアル酸で終結するスキームである。 図20は、O−結合サッカリドが「戻し改作」され、そして続いて水溶性ポリマーを持つ修飾糖に結合させる。例示のスキームでは、炭水化物部分が2アンテナ構造の第1世代に「戻し改作」される。 図21は、O−結合糖ペプチドの炭水化物部分を戻し改作して、炭水化物部分に結合した水溶性ポリマーを有する修飾糖との結合物に利用することができるマンノースを生産すするための例示スキームである。 図22Aから図22Cからなる図22は、一連の例示スキームである。図22AはPEG化糖の付加、続いて非−修飾糖の付加を説明するスキームである。図22Bは1種類より多くの修飾糖を1つのグリカンへ付加することを説明するスキームである。図22Cは異なる修飾糖のO−結合グリカンおよびN−結合グリカンへの付加を具体的に説明するスキームである。 図22Aから図22Cからなる図22は、一連の例示スキームである。図22AはPEG化糖の付加、続いて非−修飾糖の付加を説明するスキームである。図22Bは1種類より多くの修飾糖を1つのグリカンへ付加することを説明するスキームである。図22Cは異なる修飾糖のO−結合グリカンおよびN−結合グリカンへの付加を具体的に説明するスキームである。 図22Aから図22Cからなる図22は、一連の例示スキームである。図22AはPEG化糖の付加、続いて非−修飾糖の付加を説明するスキームである。図22Bは1種類より多くの修飾糖を1つのグリカンへ付加することを説明するスキームである。図22Cは異なる修飾糖のO−結合グリカンおよびN−結合グリカンへの付加を具体的に説明するスキームである。 図23は結合を含むグリカン改造によるペプチドの治療的機能の種々の改善法の図解である。 図24はゴーシェ病を処置するための治療用ペプチドのグリカン改造に関する1組のスキームである。 図25は末端−マンノース−6−ホスフェート部分を有するグリカンを生成するためのグリカン改造に関するスキームである。 図26はシアリル化後のCHO−生産グルコセレブロシダーゼ(Cerezyme(商標))に見いだされるグリカン構造の配列を具体的に説明する図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図27Aから27Gからなる図27は、顆粒球コロニージ刺激因子(G−CSF)に関するグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図27Aは、グリカンが結合するアミノ酸残基を示すG−CSFペプチド、およびそれに結合した例示グリカンの式を表す図解である。図27Bから27Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図27A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図28Aから28AAからなる図28は、インターフェロン−アルファのグリカン構造を改造するための例示的スキームを説明する。図28Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Bから28Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Eはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム14cペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Fから28Nは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Oはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−アルファ アイソフォーム2aまたは2bペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図28Pから28Wは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28O中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28Xは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチド、およびそれに結する例示グリカンの式を表す図解である。図28Yから28AAは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28X中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図28BBは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインターフェロン−アルファ ムチン融合ペプチドおよびインターフェロン−アルファペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図28CCから28EEは、ペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図28BB中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図29Aから29Sからなる図29は、インターフェロン−ベータのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図29Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Bから29Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図29Pはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターフェロン−ベータペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図29Qから29Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図29P中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図30Aから30Dからなる図30は、第VII因子および第VIIa因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図30Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第VII因子および第VIIa因子ペプチドA(実線)およびB(点線)、およびグリカンの式を表す図解である。図30Bから30Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図30A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図30Aから30Dからなる図30は、第VII因子および第VIIa因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図30Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第VII因子および第VIIa因子ペプチドA(実線)およびB(点線)、およびグリカンの式を表す図解である。図30Bから30Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図30A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図30Aから30Dからなる図30は、第VII因子および第VIIa因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図30Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第VII因子および第VIIa因子ペプチドA(実線)およびB(点線)、およびグリカンの式を表す図解である。図30Bから30Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図30A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図30Aから30Dからなる図30は、第VII因子および第VIIa因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図30Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第VII因子および第VIIa因子ペプチドA(実線)およびB(点線)、およびグリカンの式を表す図解である。図30Bから30Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図30A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図31Aから31Gからなる図31は、第IX因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図31Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す第IX因子ペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図31Bから31Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図31A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図32Aから32Jからなる図32は、αおよびβサブユニットを含んでなる濾胞刺激ホルモン(FSH)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図32Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す濾胞刺激ホルモンペプチドFSHαおよびFSHβ、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図32Bから32Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図32A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図33Aから33Jからなる図33は、エリトロポエチン(EPO)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図33Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すEPOペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図33Bから33Jはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図33A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図34Aから34Kからなる図34は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図34Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Bから34Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図34Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すGM−CSFペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図34Iから34Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図34H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図35Aから35Nからなる図35は、インターフェロン−ガンマのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図35Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Bから35Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図35Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すインターフェロン−ガンマペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図35Iから35Nはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図35H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図36Aから36Oからなる図36は、α−アンチトリプシン(ATT、またはα−1プロテアーゼインヒビター)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図36Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示ATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Bから36Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Iから36Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図36Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すATTペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図36Mから36Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図36L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図37Aから37Kからなる図37は、グルコセレブロシダーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図37Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Bから37Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図37Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すグルコセレブロシダーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図37Iから37Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図37H中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 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図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図38Aから38Wからなる図38は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図38Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Bから38Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すTPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Iから38Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Lは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Mから38Oはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38L中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Pは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Qから38Sはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38P中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図38Tは改造を企図するグリカンに結合する残基を示す突然変異TPAペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図38Uから38Wはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図38T中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図39Aから39Gからなる図39は、インターロイキン−2(IL−2)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図39Aはグリカンが結合するアミノ酸残基を示すインターロイキン−2ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図39Bから39Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図39A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図40Aから40Nからなる図40は、第VIII因子のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図40Aは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Bから40Fはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図40Gは第VIIIペプチドのN−結合グリコシル化部位(AおよびA’)およびO−結合部位(B)に結合するグリカンに関する式である。図40Hから40Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図40G中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図41Aから41Mからなる図41は、ウロキナーゼのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図41Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Bから41Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図41Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すウロキナーゼペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図41Iから41Mはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図41H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図42Aから42Kからなる図42は、ヒトDNase(hDNase)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図42Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Bから42Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図42Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒトDNaseペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図42Iから42Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図42H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図43Aから43Lからなる図43は、インスリンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図43AはNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Bから43Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Eは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチド、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図43Fから43Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43E中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図43Iは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すインスリン−ムチン融合ペプチドおよびインスリンペプチド、およびグリカンの式を表す図解である。図43Jから43Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図43I中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図44Aから44Kからなる図44は、B型肝炎表面タンパク質のM抗原(preSおよびS)(HbsAg)のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図44Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Bから44Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図44Hは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すM−抗原ペプチドおよびグリカンの式を表す図解である。図44Iから44Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図44H中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図45Aから45Kからなる図45は、N、Vおよびそれらの変異体を含むヒト成長ホルモンのグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図45Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すヒト成長ホルモンペプチドおよびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図45Bから45Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図45Eはヒト成長ホルモンペプチドおよびムチンペプチドの一部および全部を含んでなる3つの融合ペプチドを表し、そして改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示し、およびそれに結合する例示グリカンの式(1つまたは複数)を表す図解である。図45Fから45Kはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図45E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図46Aから46Gからなる図46は、TNF−受容体−IgG領域融合タンパク質(Enbrel(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図46Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すさらなるN−グリコシル化部位を含むように突然変異させることができるTNF−受容体−IgGFc領域融合ペプチドを表す図解である。TNF受容体ペプチドは太線で示し、そしてIgGFc領域は実線で示す。図46Bから46Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図46A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図47は、抗−HER2モノクローナル抗体(Herceptin(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図47Aは改造を企図するグリカンに結合する抗体重鎖上の残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた抗−HER2モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンを表す図解である。図47Bから47Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図47A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図47は、抗−HER2モノクローナル抗体(Herceptin(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図47Aは改造を企図するグリカンに結合する抗体重鎖上の残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた抗−HER2モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンを表す図解である。図47Bから47Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図47A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図47は、抗−HER2モノクローナル抗体(Herceptin(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図47Aは改造を企図するグリカンに結合する抗体重鎖上の残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた抗−HER2モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンを表す図解である。図47Bから47Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図47A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図47は、抗−HER2モノクローナル抗体(Herceptin(商標))のグリカン構造を改造するための例示スキームを提供する。図47Aは改造を企図するグリカンに結合する抗体重鎖上の残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた抗−HER2モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンを表す図解である。図47Bから47Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図47A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図48Aから48Dからなる図48は、呼吸合胞体ウイルスのプロテインFに対するモノクローナル抗体(Synagis(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図48Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させるプロテインFペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図48Bから48Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図48A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図48Aから48Dからなる図48は、呼吸合胞体ウイルスのプロテインFに対するモノクローナル抗体(Synagis(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図48Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させるプロテインFペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図48Bから48Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図48A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図48Aから48Dからなる図48は、呼吸合胞体ウイルスのプロテインFに対するモノクローナル抗体(Synagis(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図48Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させるプロテインFペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図48Bから48Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図48A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図48Aから48Dからなる図48は、呼吸合胞体ウイルスのプロテインFに対するモノクローナル抗体(Synagis(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図48Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させるプロテインFペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図48Bから48Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図48A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図49Aから49Dからなる図49は、TNF−αに対するモノクローナル抗体(Remicade(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図49Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたTNF−αに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図49Bから49Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図49A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図49Aから49Dからなる図49は、TNF−αに対するモノクローナル抗体(Remicade(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図49Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたTNF−αに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図49Bから49Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図49A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図49Aから49Dからなる図49は、TNF−αに対するモノクローナル抗体(Remicade(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図49Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたTNF−αに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図49Bから49Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図49A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図49Aから49Dからなる図49は、TNF−αに対するモノクローナル抗体(Remicade(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図49Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたTNF−αに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図49Bから49Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき、企図する図49A中のペプチドの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図50Aから50Dからなる図50は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するモノクローナル抗体(Reopro(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図50Aは改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させた糖タンパク質IIb/IIIaに対する突然変異モノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Bから50Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基を示す糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Fから50Hはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図50Iは、改造を意図するグリカンに結合する残基を含む糖タンパク質IIb/IIIa−ムチン融合ペプチドに対するモノクローナル抗体および糖タンパク質IIb/IIIaペプチドに対するモノクローナル抗体、およびそれらに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図50Jから50Lはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図51Aから51Dからなる図51は、CD20に対するモノクローナル抗体(Rituxan(商標))上のグリカン構造を改造するための例示スキームを説明する。図51Aは改造を企図するグリカンに結合する残基を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Bから51Dはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51A中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。図51Eは、改造を企図するグリカンに結合する残基(1つまたは複数)を示すN−グリコシル化部位(1つまたは複数)を含むように突然変異させたCD20に対するモノクローナル抗体、およびそれに結合する例示グリカンの式を表す図解である。図51Fから51Gはペプチドが発現される細胞の型に基づき企図する図51E中のペプチドのグリカンの改造工程、および望ましい改造グリカン構造の図解である。 図52Aおよび52Bからなる図52は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号1および2)。 図52Aおよび52Bからなる図52は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号1および2)。 図53Aおよび53Bからなる図53は、インターフェロンアルファ(IFN−アルファ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号3および4)。 図53Aおよび53Bからなる図53は、インターフェロンアルファ(IFN−アルファ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号3および4)。 図54Aおよび54Bからなる図54は、インターフェロンベータ(IFN−ベータ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号5および6)。 図54Aおよび54Bからなる図54は、インターフェロンベータ(IFN−ベータ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号5および6)。 図55Aおよび55Bからなる図55は、第VIIa因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号7および8)。 図55Aおよび55Bからなる図55は、第VIIa因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号7および8)。 図56Aおよび56Bからなる図56は、第IX因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号9および10)。 図56Aおよび56Bからなる図56は、第IX因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号9および10)。 図57Aから57Dからなる図57は、濾胞刺激ホルモン(FSH)のアルファおよびベーター鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号11から14)。 図57Aから57Dからなる図57は、濾胞刺激ホルモン(FSH)のアルファおよびベーター鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号11から14)。 図57Aから57Dからなる図57は、濾胞刺激ホルモン(FSH)のアルファおよびベーター鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号11から14)。 図57Aから57Dからなる図57は、濾胞刺激ホルモン(FSH)のアルファおよびベーター鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号11から14)。 図58Aおよび58Bからなる図58は、エリトロポエチン(EPO)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号15および16)。 図58Aおよび58Bからなる図58は、エリトロポエチン(EPO)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号15および16)。 図59Aおよび59Bからなる図59は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号17および18)。 図59Aおよび59Bからなる図59は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号17および18)。 図60Aおよび60Bからなる図60は、インターフェロンガンマ(IFN−ガンマ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号19および20)。 図60Aおよび60Bからなる図60は、インターフェロンガンマ(IFN−ガンマ)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号19および20)。 図61Aおよび61Bからなる図61は、α−1−プロテアーゼインヒビター(A−1−PI、またはα−アンチトリプシン)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号21および22)。 図61Aおよび61Bからなる図61は、α−1−プロテアーゼインヒビター(A−1−PI、またはα−アンチトリプシン)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号21および22)。 図62A−1から62A−2および62Bおよびからなる図62は、グルコセレブロシダーゼの例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号23および24)。 図62A−1から62A−2および62Bおよびからなる図62は、グルコセレブロシダーゼの例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号23および24)。 図62A−1から62A−2および62Bおよびからなる図62は、グルコセレブロシダーゼの例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号23および24)。 図63Aおよび63Bからなる図63は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号25および26)。 図63Aおよび63Bからなる図63は、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号25および26)。 図64Aおよび64Bからなる図64は、インターロイキン−2(IL−2)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号27および28)。 図64Aおよび64Bからなる図64は、インターロイキン−2(IL−2)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号27および28)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図65A−1から65A−4および65B−1から65B−4からなる図65は、第VIII因子の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号29および30)。 図66Aおよび66Bからなる図66は、ウロキナーゼの例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号33および34)。 図66Aおよび66Bからなる図66は、ウロキナーゼの例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号33および34)。 図67Aおよび67Bからなる図67は、ヒト組換えDNase(hrDNase)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号39および40)。 図67Aおよび67Bからなる図67は、ヒト組換えDNase(hrDNase)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号39および40)。 図68Aおよび68Bからなる図68は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するヒト化モノクローナル抗体の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号43および44)。 図68Aおよび68Bからなる図68は、糖タンパク質IIb/IIIaに対するヒト化モノクローナル抗体の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号43および44)。 図69Aおよび69Bからなる図69は、B型肝炎ウイルスに由来するS−タンパク質(HbsAg)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号45および46)。 図69Aおよび69Bからなる図69は、B型肝炎ウイルスに由来するS−タンパク質(HbsAg)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号45および46)。 図70Aおよび70Bからなる図70は、ヒト成長ホルモン(HGH)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号47および48)。 図70Aおよび70Bからなる図70は、ヒト成長ホルモン(HGH)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号47および48)。 図71Aおよび71Bからなる図71は、Enbrel(商標)(腫瘍壊死因子受容体(TNF−R)/IgG融合)の一部を含んでなる75kDaの腫瘍壊死因子受容体(TNF−R)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号31および32)。 図71Aおよび71Bからなる図71は、Enbrel(商標)(腫瘍壊死因子受容体(TNF−R)/IgG融合)の一部を含んでなる75kDaの腫瘍壊死因子受容体(TNF−R)の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号31および32)。 図72Aおよび72Bからなる図72は、Herceptin(商標)(Her−2、ヒト上皮増殖因子受容体に対するモノクローナル抗体(MAb))のそれぞれ軽および重鎖の例示アミノ酸配列である(それぞれ配列番号35および36)。 図72Aおよび72Bからなる図72は、Herceptin(商標)(Her−2、ヒト上皮増殖因子受容体に対するモノクローナル抗体(MAb))のそれぞれ軽および重鎖の例示アミノ酸配列である(それぞれ配列番号35および36)。 図73Aおよび73Bからなる図73は、Synagis(商標)(呼吸合胞対ウイルスのFペプチドに対するMAb)のそれぞれ重および軽鎖の例示アミノ酸配列である(それぞれ配列番号37および38)。 図73Aおよび73Bからなる図73は、Synagis(商標)(呼吸合胞対ウイルスのFペプチドに対するMAb)のそれぞれ重および軽鎖の例示アミノ酸配列である(それぞれ配列番号37および38)。 図74Aおよび74Bからなる図74は、Remicade(商標)(TNFαに対するMAb)の非−ヒト可変領域の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号41および42)。 図74Aおよび74Bからなる図74は、Remicade(商標)(TNFαに対するMAb)の非−ヒト可変領域の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号41および42)。 図75Aおよび75Bからなる図75は、ヒトIgGのFc部分の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号49および50)。 図75Aおよび75Bからなる図75は、ヒトIgGのFc部分の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号49および50)。 図76は、抗−糖タンパク質IIb/IIIaマウス抗体の成熟可変領域軽鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号52)。 図77は、抗−糖タンパク質IIb/IIIaマウス抗体の成熟可変領域重鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号54)。 図78は、ヒトIgGの可変領域軽鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号51)。 図79は、ヒトIgGの可変領域重鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号53)。 図80は、ヒトIgGの軽鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号55)。 図81は、ヒトIgGの重鎖の例示アミノ酸配列である(配列番号56)。 図82Aおよび図82Bからなる図82は、抗−CD20マウス抗体の軽鎖の成熟可変領域軽鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号59および60)。 図82Aおよび図82Bからなる図82は、抗−CD20マウス抗体の軽鎖の成熟可変領域軽鎖の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号59および60)。 図83Aおよび図83Bからなる図83は、抗−CD20マウス抗体の重鎖の成熟可変領域の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号61および62)。 図83Aおよび図83Bからなる図83は、抗−CD20マウス抗体の重鎖の成熟可変領域の例示ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列である(それぞれ配列番号61および62)。 図84Aから図84Eからなる図84は、タンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号57)。 図84Aから図84Eからなる図84は、タンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号57)。 図84Aから図84Eからなる図84は、タンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号57)。 図84Aから図84Eからなる図84は、タンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号57)。 図84Aから図84Eからなる図84は、タンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号57)。 図85Aから図85Eからなる図85は、抗−CD20マウス抗体の軽および重可変ドメインを含むタンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号58)。 図85Aから図85Eからなる図85は、抗−CD20マウス抗体の軽および重可変ドメインを含むタンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号58)。 図85Aから図85Eからなる図85は、抗−CD20マウス抗体の軽および重可変ドメインを含むタンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号58)。 図85Aから図85Eからなる図85は、抗−CD20マウス抗体の軽および重可変ドメインを含むタンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号58)。 図85Aから図85Eからなる図85は、抗−CD20マウス抗体の軽および重可変ドメインを含むタンデムキメラ抗体発現ベクターTCAE8のヌクレオチド配列である(配列番号58)。 図86はTP10のシアリル化前後のFACE分析の結果の表すアクリルアミドゲルの像である。BiNA種はシアル酸残基が無い。BiNA種は1つのシアル酸残基を有する。BiNA種は2つのシアル酸残基を有する。Bi=2アンテナ;NA=ノイラミン酸。 図87はラットに注射したシアル化前後のTP10の経時的な血漿濃度をμg/mlで表すグラフである。 図88はシアル化前後のTP10について、血漿濃度−時間曲線(AUC)下の面積をμg/時間/mlで表すグラフである。 図89はTP10のフコシル化前後のFACE分析の結果の表すアクリルアミドゲルの像である。BiNA種は2つのノイラミン(NA)酸残基および2つのフコース残基(F)を有する。 図90はインビトロ(菱形)およびLec11 CHO細胞(四角)内のインビボでグリコシル化されたTP20(sCR1sLe)のインビトロ結合を表すグラフである。 図91はEPOのGlcNAc−化に由来するグリコフォームの2−AA HPLCによる分析を表すグラフである。 図92Aおよび92Bからなる図92は、RNaseBのMALDI−TOFスペクトル(図92A)およびN−グリカナーゼによりRNaseBから開裂されたオリゴ糖のHPLCプロフィール(図92B)を表す2つのグラフである。ペプチドのN−グリコシル化部位の大部分が、5〜9個のマンノース残基からなるマンノースオリゴ糖で修飾される。 図92Aおよび92Bからなる図92は、RNaseBのMALDI−TOFスペクトル(図92A)およびN−グリカナーゼによりRNaseBから開裂されたオリゴ糖のHPLCプロフィール(図92B)を表す2つのグラフである。ペプチドのN−グリコシル化部位の大部分が、5〜9個のマンノース残基からなるマンノースオリゴ糖で修飾される。 図93は高マンノースN−グリカンのハイブリッドN−グリカンへの転換を表すスキームである。酵素1は、トリコダーマ レーゼイ(Tricodoma reesei)またはスルペルギルス サイトイ(Aspergillus saitoi)に由来するα1,2−マンノシダーゼである。酵素2は、GnT−I(β−1,2−−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI)である。酵素3はGalT−I(β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼI)である。酵素4はα2,3−シアリルトランスフェラーゼまたはα2,6−シアリルトランスフェラーゼである。 図94Aおよび94Bからなる図94は、組換えT.(レーゼイ)reeseiのα1,2−マンノシダーゼで処理したRNaseBのMALDI−TOFスペクトル(図94A)および修飾RNaseBからN−グリカナーゼにより開裂されたオリゴ糖のHPLCプロフィール(図94B)を表す2つのグラフである。 図94Aおよび94Bからなる図94は、組換えT.(レーゼイ)reeseiのα1,2−マンノシダーゼで処理したRNaseBのMALDI−TOFスペクトル(図94A)および修飾RNaseBからN−グリカナーゼにより開裂されたオリゴ糖のHPLCプロフィール(図94B)を表す2つのグラフである。 図95はA.サイトイ(saitoi)から精製された市販されているα1,2−マンノシダーゼ(グリコ&カルビオケム:Glyko & CalbioChem)で処理したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図96は組換えGnT−I(GlcNAc−トランスフェラーゼI)で図94に示した生成物を処理することにより修飾したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図97は組換えGnT1(ガラクトシルトランスフェラーゼ1)で図96に示した生成物を処理することにより修飾したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図98はトランスフェラーゼの供与体としてCMP−SAを使用して、組換えST3GalIII(α2,3−シアリルトランスフェラーゼIII)で図97に示した生成物を処理することにより修飾したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図99はトランスフェラーゼの供与体としてCMP−SA−PEG(10kDa)を使用して、組換えST3GalIII(α2,3−シアリルトランスフェラーゼIII)で図97に示した生成物を処理することにより修飾したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図99はトランスフェラーゼの供与体としてCMP−SA−PEG(10kDa)を使用して、組換えST3GalIII(α2,3−シアリルトランスフェラーゼIII)で図97に示した生成物を処理することにより修飾したRNaseBのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図100は高マンノースN−グリカンの複雑なN−グリカンへの転換を表すスキームである。酵素1は、トリコダーマ レーゼイ(Tricodoma reesei)またはスルペルギルス サイトイ(Aspergillus saitoi)に由来するα1,2−マンノシダーゼである。酵素2は、GnT−Iである。酵素3はGalT1である。酵素4はα2,3−シアリルトランスフェラーゼまたはα2,6−シアリルトランスフェラーゼである。酵素5はα−マンノシダーゼIIである。酵素6はα−マンノシダーゼである。酵素7はGn−IIである。酵素8はα1,6−マンノシダーゼである。酵素9はα1,3−マンノシダーゼである。 図101は、−アセチルグルコサミントランスフェラーゼIにより触媒されるVI(GnT I−VI)への連結の図解である。R=GlcNAcβ1,4GlcNAc−Asn−X。 図102Aおよび102Bからなる図102は、N−アセチルグルコサミンが付加されたEPOの2つのロットに関する2−AA HPLC分析を表すグラフである。図102AはロットAの分析を表し、そして図102BはロットBの分析を表す。 図102Aおよび102Bからなる図102は、N−アセチルグルコサミンが付加されたEPOの2つのロットに関する2−AA HPLC分析を表すグラフである。図102AはロットAの分析を表し、そして図102BはロットBの分析を表す。 図103はGnT−VでEPOに第3グリカン枝を導入する反応の生成物の2−AA HPLC分析を表すグラフである。 図104は適当な供与基を用いて、GnT−I、GnT−II、GnT−III、GnT−IVおよびGalT1で処理した後のEPO調製物のグリカンのMALDI−TOFスペクトルを表すグラフである。 図105はヒト下垂体FSHの脱シアリル化反応の生成物を表す等電点電気泳動(IEF)ゲルの像である。レーン1および4は等電点電気泳動(IEF)の標準である。レーン2は天然の(native)FSHである。レーン3は脱シアリル化FSHである。 図106はrFSHのPEG−シアリル化を作成するための反応の生成物のSDS−PAGEゲルの像である。レーン1および8は、SeeBlue+2分子量標準である。レーン2は15μgの天然のFSHである。レーン3は15μgのアシアロ−FSH(AS−FSH)である。レーン4はAS−FSHとCMP−SAの15μgの反応生成物である。レーン5はAS−FSHとCMP−SA−PEG(1kDa)の15μgの反応生成物である。レーン6はAS−FSHとCMP−SA−PEG(5kDa)の15μgの反応生成物である。レーン7はAS−FSHとCMP−SA−PEG(10kDa)の15μgの反応生成物である。 図107はFSHのPEG−シアリル化を作成するための反応の生成物の等電点電気泳動ゲルの像である。レーン1および8はIEF標準である。レーン2は15μgの非変性FSHである。レーン3は15μgのアシアロ−FSH(AS−FSH)である。レーン4はAS−FSHとCMP−SAの15μgの反応生成物である。レーン5はAS−FSHとCMP−SA−PEG(1kDa)の15μgの反応生成物である。レーン6はAS−FSHとCMP−SA−PEG(5kDa)の15μgの反応生成物である。レーン7はAS−FSHとCMP−SA−PEG(10kDa)の15μgの反応生成物である。 図108はヒト下垂体細胞で生産される非変性非−組換えFSHのSDS−PAGEゲルの像である。レーン1、2および5はSeeBlue(商標)+2分子量標準である。レーン3および4はそれぞれ5μgおよび25μgの天然のFSHである。 図109はrFSHのアシアリル化反応の生成物を表す等電点電気泳動ゲル(pH3−7)の像である。レーン1および4はIEF標準である。レーン2は天然のrFSHである。レーン3はアシアロ−rFSHである。 図110はアシアロ−rFSHのPEG−シアリル化の結果を表すSDS−PAGEゲルの像である。レーン1は非変性rFSHである。レーン2はアシアロ−FSHである。レーン3はアシアロ−FSHと0.5mMのCMP−SAの反応生成物である。レーン4〜7はアシアロ−FSHとCMP−SA−PEG(10kDa)との間のそれぞれ2時間、5時間、24時間および48時間の反応生成物である。レーン8は、アシアロ−FSHと1.0mMのCMP−SA−PEG(10kDa)との間の48時間の反応生成物である。レーン9はアシアロ−FSHと1.0mMのCMP−SA−PEG(1kDa)との間の48時間の反応生成物である。 図111はアシアロ−rFSHとCMP−SA−PEG(1kDa)のPEG−シアリル化の生成物を示す等電点電気泳動ゲルの像である。レーン1は非変性rFSHである。レーン2はアシアロ−rFSHである。レーン3はアシアロ−FSHとCMP−SAとの24時間の反応生成物である。レーン4〜7はアシアロ−rFSHと0.5mM CMP−SA−PEG(1kDa)のそれぞれ2時間、5時間、24時間および48時間の反応生成物である。レーン8はブランクである。レーン9および10は、アシアロ−rFSHとそれぞれ0.5mMおよび1.0mMのCMP−SA−PEG(10kDa)の48時間の反応生成物である。 図112はrFSHおよびrFSH−AS−PEG(1KDaおよび10KDa)の薬物動態学のグラフである。このグラフはグリコPEG化rFSHについて、非−PEG化rFSHに比べて、ラットの血流中にあるrFSH化合物の時間と血流中のrFSH化合物の平均濃度との間の関係を具体的に説明する。 Sertoli細胞を使用したFSHバイオアッセイの結果のグラフである。このグラフはインキューベーション培地中のSertoli細胞中のFSH濃度とSertoli細胞から放出された17−βエストラジオールの量との間の関係を具体的に説明する。 図114はSDS−PAGEゲルの像である:標準(レーン1);天然のトランスフェリン(レーン2);アシアロトランスフェリン(レーン3);アシアロトランスフェリンおよびCMP−SA(レーン4);レーン5および6、アシアロトランスフェリンおよびそれぞれ0.5mMおよび5mMのCMP−SA−PEG(1KDa);レーン7および8、アシアロトランスフェリンおよびそれぞれ0.5mMおよび5mMのCMP−SA−PEG(5KDa);レーン9および10、アシアロトランスフェリンおよびそれぞれ0.5mMおよび5mMのCMP−SA−PEG(10KDa)。 図115はIEFゲルの像である:天然のトランスフェリン(レーン1);アシアロトランスフェリン(レーン2);アシアロトランスフェリンおよびCMP−SA、24時間(レーン3);アシアロトランスフェリンおよびCMP−SA、96時間(レーン4)レーン5および6、それぞれ24時間および96時間のアシアロトランスフェリンおよびCMP−SA−PEG(1kDa);レーン7および8、それぞれ24時間および96時間のアシアロトランスフェリンおよびCMP−SA−PEG(5KDa);レーン9および10、それぞれ24時間および96時間のアシアロトランスフェリンおよびCMP−SA−PEG(10KDa)。 図116はアシアロ−第VIIa因子の等電点電気泳動ゲル(pH3−7)の像である。レーン1は第rVIIa因子;レーン2〜5はアシアロ−第VIIa因子である。 図117は第VIIa因子のMALDIスペクトルのグラフである。 図118は第VIIa因子−PEG(1kDa)のMALDIスペクトルのグラフである。 図119は第VIIa因子−PEG(10kDa)のMALDIスペクトルのグラフである。 図120はPEG化第VIIa因子のSDS−PAGEゲルの像である:レーン1はアシアロ−第VIIa因子である。レーン2はST3Gal3を用いた48時間後のアシアロ−第VIIa因子とCMP−SA−PEG(1kDa)との反応の生成物である。レーン3はST3Gal3を用いた48時間後のアシアロ−第VIIa因子とCMP−SA−PEG(1kDa)との反応の生成物である。レーン4はST3Gal3を用いた96時間のアシアロ−第VIIa因子とCMP−SA−PEG(10kDa)との反応の生成物である。 図121は脱シアリル化手順の生成物のpIを表すIEFゲルの像である。レーン1および5はIEF標準である。レーン2は第IX因子タンパク質である。レーン3はr第IXタンパク質である。レーン4はr第IXタンパク質の20時間の脱シアリル化反応である。 図122は、CMP−SA−PEGとの反応後、SA−PEG(1kDa)またはSA−PEG(10kDa)のいずれかと結合した第IX因子の分子量を表すSDS−PAGEゲルの像である。レーン1および6は、SeeBlue+2分子量標準である。レーン2はrF−IXである。レーン3は脱シアリル化rF−IXである。レーン4はSA−PEG(1kDa)に結合したr第IX因子である。レーン5はSA−PEG(10kDa)に結合したr第IX因子である。 図123は、第IX因子の直接−シアリル化および第IX因子−SA−PEGのシアル酸キャッピングの反応生成物を表すSDS−PAGEゲルの像である。レーン1はタンパク質標準であり、レーン2はブランクであり;レーン3はr第IX因子であり;レーン4はSAキャップ化r第IX因子−SA−PEG(10KDa)であり;レーン5はr第IX因子−SA−PEG(10KDa)であり;レーン6はST3Gal1であり;レーン7はST3Gal3であり;レーン8、9、10は事前のシアリダーゼ処理無しのr第IX因子−SA−PEG(10KDa)である。 図124は非変性EPOのグリカンのMALDIスペクトルを表すグラフである。 図125はCMP−NAN−PEG(1KDa)およびCMP−NAN−PEG(10KDa)を使用したPEG化の生成物のSDS−PAGEゲルの像である。 図126はPEG化EPOのインビトロバイオアッセイの結果を表すグラフである。菱形はPEG分子を持たないシアリル化EPOからのデータを表す。四角はPEG(1KDa)を持つEPOを使用して得たデータを表す。三角はPEG(10KDa)を持つEPOを使用して得たデータを表す。
以下に記載する説明は本発明の好適な態様を開示し、そして本発明に添付する請求の範囲の文章による説明を提供する。本発明は明らかな、または本明細書を読んだ後に明らかになるこのような態様の任意の、そしてすべての変形態様を包含する。
本発明は、 式:
Figure 0006321724
式中、
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり;
−Xは該AAに共有結合したサッカリドであり、ここで
は第1グリコシル残基であり;そして
はXに共有結合した第2グリコシル残基であり、ここでXおよびXは単糖およびオリゴ糖残基から選択される、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法を提供する。この方法は:
(a)Xまたはその糖サブユニットを該ペプチドから除去し、これにより短縮化グリカンを形成し;そして
(b)短縮化グリカンを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を短縮化グリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
1つの観点では、この方法はさらに
(c)Xを除去し、これによりAAを露出し;そして
(d)AAを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体をAAへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
別の観点では、本発明はさらに:
(e)工程(b)の前に、翻訳後修飾中にサッカリドに付加した基を除去する、
ことを含んでなる。
1つの態様では、基がホスフェート、スルフェート、カルボキシレートおよびそれらのエステルから選択される員である。
別の態様では、ペプチドは式:
Figure 0006321724
式中、
ZはO、S、NHおよびクロスリンカーから選択される員である、
を有する。
少なくとも1つのグリコシル供与体は修飾基を含んでなり、そして修飾基は水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであり、そしてより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。さらにより好ましくはポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
この、および幾つかの他の態様では、ペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群から選択され得る。
また本発明に含まれるのは、式:
Figure 0006321724
式中、
、X、X、X、XおよびX17は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して選択され;そして
a、b、c、d、eおよびxは、整数0、1および2から独立して選択されるが、ただしa、b、c、d、eおよびxから選択される少なくとも1つの員は1または2である、を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法は;
(a)少なくとも1つのX、X、X、X、XまたはX17、またはその糖サブユニットをペプチドから除去し、これにより短縮化グリカンを形成し;そして
(b)短縮化グリカンを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を該短縮化グリカンヘ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
1つの観点では工程(a)の除去は、a、b、c、eおよびxがそれぞれ0である短縮化グリカンを生成する。
別の観点では、X、XおよびXは(マンノース)および(マンノース)−(X
式中、
は単−およびオリゴ−糖から選択されるグリコシル部分であり;
yは0および1から選択される整数であり;そして
zは1から20の間の整数であり、ここで
Zは3以上である時、(マンノース)は直鎖および分岐構造から選択される、
から成る群から選択される。
別の観点では、XはGlcNAcおよびキシロースからなる群から選択される。別の観点ではX、XおよびXが(マンノース)であり、ここでuは1から20の間の整数から選択され、そしてuが3以上である時、(マンノース)は直鎖および分岐構造から選択される。
少なくとも1つの該グリコシル供与体は修飾基を含んでなり、そして修飾基は水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであり、そしてより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。より一層好ましくはポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
さらにペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群から選択され得る。
また含まれるのは式:
Figure 0006321724
式中、
r、sおよびtは、0および1から独立して選択される整数である、
を有するグリカンを含んでなるペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法は:
(a)ペプチドを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体をグリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
好適な態様では、少なくとも1つのグリコシル供与体は修飾基を含んでなり、そして修飾基は水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基が水溶性ポリマーであり、そしてより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。より一層好ましくはポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
さらにペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群から選択され得る。
さらに別の観点では、ペプチドは式:
Figure 0006321724
式中、
およびX10は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して選択され;そして
m、nおよびfは0および1から選択される整数である、
を有する。
別の観点では、ペプチドは式:
Figure 0006321724
式中、
11およびX12は、独立して選択されるグリコシル部分であり;そして
rおよびxは0および1から独立して選択される整数である、
を有する。
好適な態様では、X11およびX12が(マンノース)であり、ここでqは1から20の間の整数から選択され、そしてqが3以上である時、(マンノース)は直鎖および分岐構造から選択される。
別の観点では、ペプチドは式:
Figure 0006321724
式中、
13、X14およびX15は、独立して選択されるグリコシル残基であり;そして
g、h、i、j、kおよびpは整数0および1から独立して選択されるが、ただし少なくとも1つのg、h、i、j、kおよびpは1である、
を有する。
本発明の観点の1つの態様では、X14およびX15がGlcNAcおよびSiaから独立して選択される員であり;そしてiおよびkが整数0および1から独立して選択されるが、ただし少なくとも1つのiおよびkは1であり、そしてkが1ならばg、hおよびjは0である。
本発明の別の観点では、ペプチドは式:
Figure 0006321724
式中、
16
Figure 0006321724
ここでs、uおよびiは整数0および1から独立して選択される、
から選択される員である、
を有する請求項1に記載の方法。
本発明の1つの態様では除去がグリコシダーゼを利用する。
また本発明に含まれるのは式:
Figure 0006321724
式中、
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり;
は、単糖およびオリゴ糖残基から選択される、AAに共有結合したグリコシル残基であり;そして
uは0および1から選択される整数である、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法は:ペプチドを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を該短縮化グリカンへ転移させるために適する条件下で接触させ、ここで該グリコシル供与体は修飾基を含んでなり、これにより該ペプチドを改造することを含んでなる。
好適な態様では、少なくとも1つのグリコシル供与体が修飾基が修飾基を含んでなり、そして修飾基が水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであり、そしてより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。
さらにより一層好ましくは、ポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
加えてペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群から選択され得る。
本発明はさらに、ペプチドとペプチドの特性を改変する修飾基との間の共有結合物(covalent conjugate)を含み、ここで修飾基は完全なグリコシル連結基を介してペプチドの予め定めたグリコシルまたはアミノ酸残基で該ペプチドに共有結合している。
1つの観点では、修飾基は水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択される員である。
別の観点では、修飾基および完全なグリコシル連結基前駆体が、酵素の作用を介して共有結合した単位としてペプチドに結合し、酵素が該前駆体を完全なグリコシル連結基に転換し、これにより該結合物を形成する。
本発明の共有結合物は:
第1の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第1残基に共有結合した第1修飾基、および
第2の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第2残基に結合した第2グリコシル連結基、
を含んでなる。
1つの態様では、第1残基および第2残基が構造的に同一である。別の態様では、第1残基および第2残基が異なる構造を有する。さらなる態様では、第1残基および第2残基がグリコシル残基である。別の態様では、第1残基および第2残基はアミノ酸残基である。
さらに別の態様では、ペプチドが結合物(conjugate)を形成する前に改造される。好ましくはペプチドは完全なグリコシル連結基の受容部分を導入するために改造される。
別の態様では、修飾基はポリ(エチレングリコール)を含んでなる水溶性ポリマーであり、別の態様では、これは本質的に均一分散である分子量分布を有することができる。
さらなる態様では、ペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群から選択される。
別の態様では、完全なグリコシル連結単位が、シアル酸残基、Gal残基、GlcNAc残基およびGalNAc残基からなる群から選択される員である。
また本発明で提供されるのは、ポリマーとグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドとの間に共有結合物を形成する方法であって、ここでポリマーは、間に挿入され、そしてペプチドとポリマーの両方に共有結合した完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合している。この方法はペプチドを、ポリマーに共有的に連結したヌクレオチド糖および該ヌクレオチド糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる混合物と、結合物を形成するために十分な条件下で接触させることを含んでなる。
好適な態様では、ポリマーは水溶性ポリマーである。別の好適な態様では、グリコシル連結基が、ペプチドに共有結合したグリコシル残基に共有結合し、そして別の態様ではグリコシル連結基がペプチドのアミノ酸残基に共有結合する。
さらなる態様では、ポリマーはポリアルキレンオキシドおよびポリペプチドからなる群から選択される員を含んでなる。本発明の1態様ではポリアルキレンオキシドはポリ(エチレングリコール)でよい。別の態様では、ポリ(エチレングリコール)は約1〜約20,000の、約1〜約5,000の重合度、また好ましくは約1〜約1,000の重合度を有する。
別の態様では、グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、GalNAcトランスフェラーゼ、GlcNAcトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびマンノシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。1つの態様ではグルコシルトランスフェラーゼは組換え的に生産され、そして別の態様ではグルコシルトランスフェラーゼは組換え原核酵素、または組換え真核酵素である。
さらなる態様では、ヌクレオチド糖がUDP−グリコシド、CMP−グリコシドおよびGDP−グリコシドからなる群から選択され、そして好ましくはUDP−ガラクトース、UDP−ガラクトサミン、UDP−グルコース、UDP−グルコサミン、UDP−N−アセチルガラクトサミン、UDP−N−アセチルグルコサミン、GDP−マンノース、GDP−フコース、CMP−シアル酸、CMP−NeuAcからなる群から選択される。
別の態様ではペプチドは治療薬である。
さらに別の態様では、グリコシル化ペプチドが接触前に部分的に脱グリコシル化されている。
さらなる態様では、完全なグリコシル連結基がシアル酸残基である。
さらにこの方法は無細胞環境で行われる。
そして別の態様では、共有結合物は単離されることができ、そして好ましくは共有結合物が膜濾過により単離される。
また、リンカー部分により連結された第1のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドと第2のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチド、
ここで
リンカー部分は、第1ペプチドおよびリンカー部分の間に挿入され、そして両方を共有結合した第1の完全なグリコシル連結基を介して第1ペプチドに結合し、そして
リンカー部分は、第2ペプチドおよ該リンカー部分の間に挿入され、そして両方に共有結合した第2の完全なグリコシル連結基を介して該第2ペプチドに結合している、
との間に共有結合物を形成する方法を提供する。この方法は:
(a)第1ペプチドを、第1の完全なグリコシル連結基の前駆体および第2の完全なグリコシル連結基の前駆体を含んでなるリンカー部分前駆体の誘導体と接触させ;
(b)(a)からの混合物を、第1グリコシル連結基の前駆体が基質であるグリコシルトランスフェラーゼと、第1の完全なグリコシル連結基の前駆体を第1の完全なグリコシル連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これによりリンカー部分前駆体と第1ペプチドとの間に第1結合物を形成し;
(c)第1結合物を、第2ペプチドおよび第2の完全なグリコシル基の前駆体が基質であるグリコシルトランスフェラーゼと、第2の完全なグリコシル連結基の前駆体を第2のグリコシル連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これによりリンカー部分と第1グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間、および第2グリコシル化または非−グリコシル化ペプチドとの間に該結合物を形成する、
ことを含んでなる。
1つの観点では、リンカー部分が水溶性ポリマーを含んでなり、そして1つの態様では、水溶性ポリマーがポリ(エチレングリコール)を含んでなる。
また、リンカー部分により連結された第1のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドと第2のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチド、
ここで
リンカー部分は第1ペプチドに共有結合し、そして
リンカー部分は、第2ペプチドとリンカー部分の間に挿入され、そして両方に共有結合した完全なグリコシル連結基を介して第2ペプチドに結合している、
との間に共有結合物を形成する方法を提供する。この方法は:
(a)第1ペプチドを、
第1ペプチド上の残基に相補的な反応性の反応性官能基、および完全なグリコシル連結基の前駆体、
を含んでなるリンカー部分の活性化誘導体と、反応性官能基と残基との間に共有結合を形成するために十分な条件下で接触させ、これにより第1結合物を形成し;そして
(b)第1結合物を、第2ペプチドおよび完全なグリコシル連結基の前駆体が基質であるグリコシルトランスフェラーゼと、完全なグリコシル連結基の前駆体を完全なグリコシル連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これにより第1グリコシル化または非グリコシル化ペプチドと、第2グリコシル化または非−グリコシル化ペプチドとの間にリンカー部分により連結された結合物を形成する、
ことを含んでなる。
1つの態様では、リンカー部分はポリ(エチレングリコール)であることのできる水溶性ポリマーを含んでなる。
また提供されるのは、製薬学的に許容され得る希釈剤およびポリマーとグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合物を含んでなる製薬学的組成物であり、ここでポリマーは、ペプチドとポリマーとの間に挿入され、そして両ペプチドとポリマーとに共有結合した完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合している。
本発明はさらに、ペプチドと修飾された糖との間に結合物を形成するための組成物を含み、この組成物は:修飾された糖、グリコシルトランスフェラーゼおよびペプチド受容体基質混合物を含んでなり、ここで修飾された糖は、ポリマー、治療部分および生体分子から選択されるそれに共有結合した員を有する。
また本発明は 本発明の方法を使用して改造されたペプチドおよび改造されたペプチドを含んでなる製薬学的組成物を含む。
また本発明で提供するのは、式:
Figure 0006321724
式中、
MSは修飾基に共有結合した糖を含んでなる修飾された糖であり;
Nuはヌクレオシドであり;そして
bは0から2の整数である、
を有する化合物である。
1つの観点では、式:
Figure 0006321724
式中、
X、Y、Z、AおよびBは、S、OおよびNHから独立して選択される員であり;
21、R22、R23、R24およびR25は、Hおよびポリマーから独立して選択される員であり;
26は、H、OHおよびポリマーから選択される員であり;
27はCOOおよびNaから選択される員であり;
Nuはヌクレオシドであり;そして
aは1から3の整数である、
を有する化合物を含む。
本発明はさらに、式:
Figure 0006321724
式中、
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基である、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法を提供する。この方法は;
該ペプチドを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を該アミノ酸残基へ転移させるために適する条件下で接触させ、ここでグリコシル供与体は修飾基を含んでなり、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
以下に検討する各態様では、具体的な改造スキームおよびペプチドが単に本発明の好適態様を強調するために確認される。
したがって本発明は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してG−CSFペプチドに共有結合し、G−CSFペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、cおよびeは、0および1から独立して選択される員であり;
dは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)G−CSFペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび該修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基の形成に適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様ではこの方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをシアリダーゼと、G−CSFペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:
(c)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをG−CSFペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法はさらに:
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:
(e)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAcをG−CSFペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法はさらに:
(f)工程(a)の前に、G−CSFペプチドを、合成的に作用するエンド−N−アセチルガラクトサミニダーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAc該G−CSFペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
上記に程度するG−CSFペプチドの式に関する具体的な態様では、a、b、cおよびeが0である。あるいはaおよびeが0および1から独立して選択される員であり;そしてb、cおよびdが0である。あるいはa、b、c、dおよびeが0および1から独立して選択される員である。
本発明はさらに上記方法により形成されたG−CSFペプチド結合物を含む。
また、インターフェロンアルファペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も含み、ここで修飾基は完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが:
Figure 0006321724
ここで
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、bb、cc、ddおよびeeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり、
R’はH、グリコシル残基、修飾基または複合糖質である、
から選択される式を有するグリコシル残基を含んでなる。
この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼ、合成的に作用するエンド−アセチルガラクトサミニダーゼおよびトランス−シアリダーゼから選択される員、および修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらなる態様では、この方法はさらに:
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法はさらに:
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法はさらに:
(f)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法はまた:
(g)工程(a)の前に、糖ペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法はさらに:
(h)工程(b)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
本発明はさらに:
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをマンノシダーゼと、糖ペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて本発明はさらに:
(j)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基がポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
本発明に従い、そして上記に開示したインターフェロンアルファペプチドに関して、a、b、c、d、aaおよびbbが1であり;e、f、gおよびhが、1から4の整数から独立して選択される員であり;i、j、k、l、m、r、s、t、uおよびccが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、o、p、q、v、w、x、y、z、ddおよびeeが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、o、p、q、s、u、v、w、x、y、z、cc、ddおよびeeが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;hが1から3の整数から独立して選択される員であり;dd、v、w、xおよびyが0であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yおよびddが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびddが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;j、k、l、m、v、w、x、yおよびddが0であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;hが1から3の整数から独立して選択される員であり;v、w、x、yおよびddが0であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yおよびddが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはn、oおよびpが0および1から独立して選択される員であり;qが1であり;そしてz、ccおよびeeが0である。あるいはnおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてo、p、z、ccおよびeeが0である。あるいはnが0であり;qが1であり;そしてo、p、z,ccおよびeeが0である。あるいはn、o、pおよびfが0および1から独立して選択される員であり;qが1であり;そしてzおよびeeが0である。あるいはn、o、pおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてz、ccおよびeeが0である。あるいはnおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてo、p、z、ccおよびeeが0である。あるいはn、o、p、q、z、ccおよびeeが0である。
また開示された方法により形成されたインターフェロンアルファペプチド結合物を提供する。
本発明は、インターフェロンベータペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法であって、修飾基が完全なグリコシル連結基を介してインターフェロンベータペプチドに共有結合し、インターフェロンベータペプチドが式:
Figure 0006321724
ここで
a、b、c、d、i、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、またはグリコシル、修飾基または複合糖質基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)インターフェロンベータペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよびトランス−シアリダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをシアリダーゼと、インターフェロンベータペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:
(c)工程(a)からの生成物を、修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法もさらに:
(d)工程(a)の前に、上記インターフェロンベータペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法はさらに:
(e)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをエンドグリカナーゼと、インターフェロンベータペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法はさらに:
(f)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをインターフェロンベータペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えてこの方法はさらに:
(g)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法はさらに:
(h)工程(b)の前に、インターフェロンベータペプチドをエンドグリカナーゼと、インターフェロンベータペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法はさらに:
(i)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをマンノシダーゼと、インターフェロンベータペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて、この方法はさらに:
(j)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基がポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記に開示したベータインターフェロンペプチドの式に関してhが1から3の間の整数から独立して選択される員であり;a、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてq、pが1である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてq、pが1である、。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;p、qが1であり;そしてiが0および1から独立して選択される。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、I、j、k、l、m、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてp、qが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;p、qが1であり;そしてr、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;j、k、l、m、n、v、w、xおよびyが0であり;そしてq、pが1である。あるいはa、b、c、d、h、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、gが0から3の間の整数から選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてq、pが1である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、pおよひqが0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。
さらに含まれるのは、上記方法により形成されたインターフェロンベータペプチド結合物である。
本発明はまた、第VIIa因子ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して第VIIa因子ペプチドに共有結合し、第VIIa因子ペプチドが:
Figure 0006321724
ここで
a、b、c、d、i、o、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、g、hおよびnは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノース、オリゴマンノース、シアリルルイス(SialylLewis)またはシアリルルイス(SialylLewis)である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。
この方法は:
(a)第VIIa因子ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
好適な態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをシアリダーゼと、第VIIa因子ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法はさらに:
(c)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをガラクトシダーゼと、第VIIa因子ペプチドからガラクトースを除去するためにに適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを第VIIa因子ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記に開示した第VIIa因子の式に関して、a、b、c、d、e、g、i、j、l、o、pおよびqが、0および1から独立して選択される員であり;rおよびtが1であり;f、h、k、m、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてnが0から4の整数から選択される。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;v、w、xおよびyが0であり;そしてnが0から4の整数から選択される員である。
加えて、本明細書に開示する方法により形成された第VIIa因子ペプチド結合物を含む。
本発明はさらに第IX因子ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで、修飾基が完全なグリコシル連結基を介して第IX因子ペプチドに共有結合し、第IX因子ペプチドが:
Figure 0006321724
ここで
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、bb、cc、dd、ee、ffおよびggは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、g、hおよびaaは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)第IX因子ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、第IX因子ペプチドをシアリダーゼと、第IX因子ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:(c)工程(a)で形成された生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えてこの方法は:
(d)工程(b)からの生成物を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(e)工程(d)からの生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法はさらに:
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
また、修飾基がポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員であるという事実も含む。
さらなる態様において、および上記に開示した第IXペプチド因子の式に関して、a、b、cおよびdが1であり;e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であり;aa、bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、n、o、p、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、yおよびggが0である。あるいはa、b、c、d、n、qが0および1から独立して選択され;aa、e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であり;bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。あるいはa、b、c、d、n、bb、cc、ddおよびffが1であり;e、f、g、hおよびaaが1から4の整数から独立して選択される員であり;q、ee、i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。あるいはa、b、c、dおよびqが1であり;e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であり;aa、bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、n、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。あるいはa、b、c、d、q、bb、cc、ddおよびffが1であり;aa、e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であり;ee、i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。
また上記に開示した方法により形成された第IX因子ペプチド結合物も含む。
本発明は濾胞刺激ホルモン(FSH)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してFSHペプチドに共有結合し、FSHペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)FSHペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、FSHペプチドをシアリダーゼと、FSHペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、該FSHペプチドをガラクトシダーゼと、FSHペプチドからガラクトースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、FSHペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)の前に、FSHペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをFSHペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)からの生成物を、修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成する。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(b)の前に、FSHペプチドをエンドグリカナーゼと、FSHペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)の前に、FSHペプチドをN−アセチルアセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをFSHペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、修飾基がポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
さらに好適な態様において、および上記に開示したFSHペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてv、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、lおよびmが0であり;i、q、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択され;pが1であり;R(分岐または直鎖)はマンノースおよびオリゴマンノースから選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、s、t、u、v、wおよびyが0であり;iが0または1であり;そしてqが1である。
また上記の方法により形成されたFSHペプチド結合物も含む。
本発明はさらに、エリトロポエチン(EPO)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してEPOペプチドに共有結合し、EPOペプチドが:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)EPOペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、EPOペプチドをシアリダーゼと、EPOペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、EPOペプチドを合成的に作用するガラクトシダーゼと、EPOペプチドにガラクトースを付加するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、EPOペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをEPOペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(f)工程(e)からの生成物をST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
またこの方法は:
(h)工程(a)の前に、EPOペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをEPOペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記のEPOペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、nおよびqが1であり;hが1から3の間の整数から選択される員であり;i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、q、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員あり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、nおよびqが1であり;hが1から3の間の整数から選択される員であり;i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、n、q、rおよびtが0および1から独立して選択される。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員である。あるいはqが1であり;a、b、c、d、e、f、g、h、i、n、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてj、k、l、m、o、p、v、w、xおよびzが0である。
また、上記の方法により形成されたEPOペプチド結合物も含む。
本発明はさらに、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してGM−CSFペプチドに共有結合し、GM−CSFペプチドが:
Figure 0006321724
ここで、
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、bbおよびccは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はHまたはグリコシル残基または修飾基または複合糖質である、
から選択される式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)GM−CSFペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをシアリダーゼと、GM−CSFペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをエンドグリカナーゼと、、GM−CSFペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法は:
(f)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをGM−CSFペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(g)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをマンノシダーゼと、GM−CSFペプチドからマンノース残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(h)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物に転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
さらに好適な態様において、および上記のGM−CSFペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてcc、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが0および1から独立して選択される員であり;そしてcc、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはcc、a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、n、q、r、tおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;そしてbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、zおよびccが0であり;q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが、0および1から独立して選択される員であり;bbが1であり;そしてRがマンノースまたはオリゴマンノースである。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、o、q、r、s、t、u、aaおよびbbが0および1から 独立して選択される員であり;n、p、v、w、x、y、zおよびccが0である。
さらに上記方法により形成されたGM−CSFペプチド結合物を含む。
本発明は、インターフェロンガンマペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してインターフェロンガンマペプチドに共有結合し、インターフェロンガンマペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
該方法は:
(a)インターフェロンガンマペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび合成的に作用するガラクトシダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをシアリダーゼと、インターフェロンガンマペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
この方法はまた:
(e)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをエンドグリカナーゼと、インターフェロンガンマペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて本発明は:
(f)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをインターフェロンガンマペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
また本発明は:
(g)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、本発明は:
(h)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
上記のインターフェロンガンマペプチドに関して、さらに好適な態様にはa、b、c、d、i、j、k、l、m、q、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0であるものを含む。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;p、q、e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;q、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1であり;そしてRがマンノースまたはオリゴマンノースである。a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、g、hおよびpが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。
さらに上記方法により形成されるインターフェロンガンマペプチド結合物を含む。
本発明はさらに、アルファ1プロテアーゼインヒビター(A−1−PI)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してA−1−PIペプチドに共有結合し、A−1−PIペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
この方法は:
(a)A−1−PIペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをシアリダーゼと、A−1−PIペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、こうして完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
この方法はまた:
(d)工程(a)の前に、A−1−PIペチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせ物と接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(e)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをエンドグリカナーゼと、A−1−PIペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをA−1−PIペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて本発明は:
(g)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをマンノシダーゼと、A−1−PIペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに本発明は:
(h)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびその組み合わせから選択される員と、A−1−PIペプチドからグリコシル残基を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
他の好適な態様では、および上記A−1PIペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてe、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員である。あるいはn、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、lおよびmが0であり;そしてq、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、pおよびqが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;p、v、w、xおよびyが0であり;そしてnおよびqが1である。
また上記記載の方法により形成されるアルファ1プロテアーゼインヒビターペプチド結合物も提供する。
また本発明にはベータグルコシダーゼペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してベータグルコシダーゼペプチドに共有結合し、ベータグルコシダーゼペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
この該方法は:
(a)ベータグルコシダーゼペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをシアリダーゼと、ベータグルコシダーゼペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法はさらに:
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせ物と接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをエンドグリカナーゼと、ベータグルコシダーゼペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて、この方法は:
(f)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを該ベータグルコシダーゼペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(g)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記のベータグルコシダーゼペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;p、e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはn、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、lおよびmが0であり;q、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;pが1であり;そしてRがマンノースまたはオリゴマンノースである。
本発明はまた、上記記載の方法により形成されたベータグルコシダーゼペプチド結合物も含む。
本発明はさらに組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してTPAペプチドに共有結合し、TPAペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w、xおよびyは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の整数から独立して選択される員であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R’はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基であり;そして
R”はグリコシル基、複合糖質または修飾基である、
を含んでなるグリコシルサブユニットを有する。この方法は:
(a)TPAペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび合成的に作用するグリコシダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、TPAペプチドをシアリダーゼと、TPAペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、TPAペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをTPAペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、上記TPAペプチドをグリルコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(g)工程(a)の前に、上PAペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをTPAプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えてこの方法は:
(h)工程(a)の前に、TPAペプチドをエンドグリカナーゼと、TPAペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(i)工程(a)の前に、TPAペプチドをマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびそれらの組み合わせから選択される員と、TPAペプチドからグリコシル残基を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様では、および上記のTPAペプチドの式に関して、a、b、c、dが1であり;e、f、gおよびhが1から3の間の整数から選択される員であり;i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、o、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてqおよびpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、p、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、gおよびpが1であり;hが1から3の間の整数から選択される員であり;j、k、l、m、i、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;oが1であり;そしてR”がキシロースである。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてe、f、gおよびhが1であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、o、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびqが0および1から独立して選択される員であり;pが0であり;そしてnが1である。
また上記方法により形成されたTPAペプチド結合物も含む。
本発明は、インターロイキン2(IL−2)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してIL−2プチドに共有結合し、IL−2ペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、cおよびeは0および1から独立して選択される員であり;
dは0であり;そして
Rは修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)IL−2ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法はさらに:
(b)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをシアリダーゼと、IL−2ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、IL−2ペプチドを合成的に作用するエンド−N−アセチルガラクトサミニダーゼと、GalNAcをIL−2ペプチドに付加するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、本発明は:
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらに、本発明は:
(e)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAcをIL−2ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて本発明は:
(f)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをIL−2ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様では、および上記のIL−2ペプチドの式に関して、aおよびeが0および1から独立して選択される員であり;そしてb、cおよびdが0である。あるいはa、b、c、dおよびeが0である。
本発明は加えて、上記の方法により形成されたIL−2ペプチド結合物を含む。
また本発明に含まれるのは、第VIII因子ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法であり、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して該糖ペプチドに共有結合し、該糖ペプチドが:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、ccおよびddは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R’はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)該糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法は:
(e)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
さらにこの方法は:
(f)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えてこの方法は:
(g)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
この方法はまた:
(h)工程(a)の前に、糖ペプチドをST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをマンノシダーゼと、糖ペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記の第VIII因子ペプチドの式に関して、e、f、gおよびhが1から4の間の整数から独立して選択される員であり;a、b、c、d、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、aaおよびccが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびがddが0である。
また上記の方法により形成された第VIIIペプチド結合物も提供する。
さらに本発明では、腫瘍壊死因子(TNF)アルファ受容体/IgG融合ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、t、u、w、wwおよびzは0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)該糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記TNFアルファ受容体/IgG融合ペプチドの式に関して、a、c、i、jおよびlが0および1から独立して選択される員であり;e、g、q、r、tおよびzが1であり;そしてb、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
また上記の方法により形成されたTNFアルファ受容体/IgG融合結合物も提供する。
本発明はウロキナーゼペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も含み、修飾基が完全なグリコシル連結基を介してウロキナーゼペプチドに共有結合し、ウロキナーゼペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
この方法は:
(a)該ウロキナーゼペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをシアリダーゼと、ウロキナーゼペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをウロキナーゼペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、記ウロキナーゼペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これによりの完全なグリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
加えて、この方法は:
(g)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをウロキナーゼペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(h)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをエンドグリカナーゼと、ウロキナーゼペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記のウロキナーゼペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;v、w、xおよびyが0であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてpが1である。あるるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが、0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iが0または1であり;そしてqおよびpが1である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが0、1、2、3および4からから独立して選択され;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;qが1であり;そしてnが0または1である。
また提供するのは、上記記載の方法により形成されたウロキナーゼペプチド結合物である。
本発明は抗−糖タンパク質IIb/IIIaモノクローナル抗体ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して該糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよびeeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、x、yおよびddは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドを合成的に作用するガラクトシダーゼと、ガラクトシダーゼを糖ペプチドに付加するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えてこの方法は:
(f)工程(a)からの生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
またこの方法は:
(h)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらにこの方法は:
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記の抗−糖タンパク質IIb/IIIaモノクローナル抗体ペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびrが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはaa、bb、ccおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてddが0である。あるいはaaおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてbb、ccおよびddが0である。あるいはaa、bb、cc、ddおよびeeが0である。
また提供するのは、上記記載の方法により形成された抗−糖タンパク質IIb/IIIaモノクローナル抗体ペプチド結合物である。
さらに本発明では、キメラ抗−HER2抗体ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法であって、修飾基が完全なグリコシル連結基を介してキメラ抗−HER2抗体ペプチドに共有結合し、キメラ抗−HER2抗体ペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;
mは0〜20であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’は水素およびグリコシル残基および修飾基から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)キメラ抗−HER2抗体ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、キメラ抗−HER2抗体ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをキメラ抗−HER2抗体ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、キメラ抗−HER2抗体ペプチドをエンドグリカナーゼと、キメラ抗−HER2抗体ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記の抗−HER2抗体ペプチドの式に関して、a、cおよびiが、0および1から独立して選択される員であり;e、g、rおよびtが1であり;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。あるいはiが0または1であり;qおよびzが1であり;そしてa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
また提供するのは、上記記載の方法により形成された抗HER2抗体ペプチド結合物である。
本発明はさらに、抗−RSV Fペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗−RSV Fペプチドに共有結合し、抗−RSV Fペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、p、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はHおよびグリコシル残基、複合糖質および修飾基から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)抗−RSV Fペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、抗−RSV Fペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを抗−RSV Fペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(b)の前に、抗−RSV Fペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−RSV Fペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
好適な態様において、および上に提示した抗−RSV Fペプチドの式に関して、a、c、e、gおよびiが、0および1から独立して選択される員であり;rおよびtが1であり;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、s、t、u、v、w、x、yが0であり;iおよびpが0または1から独立して選択され;qおよびzが1であり;そしてnが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
また提供するのは、上記の方法により形成された抗RSV Fペプチド結合物である。
また提供するのは、抗−CD20抗体ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法であり、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗−CD20抗体ペプチドに共有結合し、抗−CD20抗体ペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独立して選択される整数であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択され;
n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、複合糖質または修飾基から選択される員である、
を含んでなるグリコシルサブユニットを有する。この方法は:
(a)抗−CD20抗体ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトシル供与体と、ガラクトシル供与体を抗−CD20抗体ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(b)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−CD20抗体ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをマンノシダーゼと、抗−CD20抗体ペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
別の観点では、グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼであり、そして修飾されたグリコシル供与体が修飾されたガラクトシル供与体である。
好適な態様において、そして上記に提示した抗−CD20抗体ペプチドの式に関して、a、c、e、gおよびiが0および1から独立して選択される員であり;r、t、qおよびzが1であり;そしてb、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、c、e、g、i、q、rおよびtが、0および1から独立して選択される員であり;b、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yが0であり;そしてzが1である。あるいはe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはiが0または1であり;qおよびzが1であり;そしてa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、r、t、v、xおよびzが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、wおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;nおよびqが1であり;そしてiが0または1である。
また上記の方法により形成された抗−CD20抗体ペプチド結合物を含む。
加えて本発明は、組換えDNaseペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して組換えDNaseペプチドに共有結合し、組換えDNaseペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rはポリマー、複合糖質、マンノース、オリゴマンノースおよび修飾基から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなり、該方法が
(a)組換えDNaseペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをシアリダーゼと、組換えDNaseペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを組換えDNaseペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
この方法はまた:
(g)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを該組換えDNaseペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて、この方法は:
(h)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをエンドグリカナーゼと、組換えDNaseペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
好適な態様において、および上記に提示したDNaseペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;e、f、g、hおよびpが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;pが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iが0または1であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、lおよびmが0であり;i、q、r、s、t、u、v、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;pが1であり:そしてRがマンノースまたはオリゴマンノースである。
また上記の方法により形成された組換えDNaseペプチド結合物も提供する。
本発明はさらに、抗−腫瘍壊死因子(TNF)アルファペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗TNFアルファペプチドに共有結合し、抗−TNFアルファペプチドが式:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R’は複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)抗−TNFアルファペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、抗−TNFアルファペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを抗−TNFアルファペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、抗−TNFアルファペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−TNFアルファペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記に提示した抗−TNFアルファペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;nが1であり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、c、e、gおよびiが0および1から独立して選択される員であり;rおよびtが1であり;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびy;そしてqおよびzが1である。
また上記の方法により形成された抗−TNFアルファペプチド結合物を含む。
また本発明は、インスリンペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法も提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、該糖ペプチドが:
Figure 0006321724
式中、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよびeeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
dd、n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である、式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、糖ぺプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、糖プチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分および複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記に提示したインスリンペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびrが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;zが1である。あるいはaa、bb、ccおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてddが0である。あるいはaaおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてbb、ccおよびddが0である。aa、bb、cc、ddおよびeeが0である。
本発明はさらに、上記の方法により形成されたインスリンペプチド結合物を含む。
加えて本発明では、B型肝炎表面抗原(HBsAg)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法が提供され、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してHBsAgペプチドに共有結合し、HBsAgペプチドが:
Figure 0006321724
ここで、
aa、bb、a、b、c、d、i、n、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
o、p、j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
cc、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、またはグリコシル残基、複合糖質、または修飾基である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。
この方法は:
(a)HBsAgペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをシアリダーゼと、HBsAgペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをガラクトシダーゼと、HBsAgペプチドからグリコシル残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
この方法は:
(e)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをHBsAgペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて、この方法は:
(f)工程(d)の生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法は:
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
またこの方法は:
(h)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをHBsAgペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
加えて、この方法は:
(i)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをマンノシダーゼと、HBsAgペプチドからマンノースを開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
またこの方法は:
(j)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをエンドグリカナーゼと、HBsAgペプチドからグリコシル基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの観点では、修飾基はポリマー、トキシン、放射性同位体、治療部分、アジュバントおよび複合糖質から選択される員である。
好適な態様において、および上記に提示したHBsAgペプチドの式に関して、a、b、c、d、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが、0および1から独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてcc、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが、0および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが0、1、2、3または4から独立して選択され;cc、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてbbが1である。あるいはcc、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてq、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;そしてbbが1である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、o、q、r、s、t、uおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてn、p、cc、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはbb、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびzが0および1から独立して選択される員であり;ccが1であり;そしてnが0または1である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、y、zおよびccが0であり;bbが1であり;e、g、i、n、q、r、tおよびaaが0および1から独立して選択される員である。a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、zおよびccが0であり;q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;そしてbbが1である。
また、上記の方法により形成されたHBsAgペプチド結合物も含む。
本発明はさらに、ヒト成長ホルモン(HGH)ペプチドと修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが:
Figure 0006321724
ここで、
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよびeeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、x、yおよびddは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R’はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
1つの態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
別の態様では、この方法は:
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらに別の態様では、この方法は:
(d)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
さらなる態様では、この方法は:
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシダーゼと、糖ペプチドからグリコシル残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
好適な態様において、および上記に提示するHGHペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびrが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはaaおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてbb、ccおよびddが0である。あるいはaa、bb、cc、ddおよびeeが0である。あるいはaa、bb、cc、dd、eeおよびnが0である。
また上記の方法により形成されたHGHペプチド結合物も含む。
発明の詳細な記述
本発明は、特別にカスタマイズされた、または所望のグリコシル化パターンを有する糖ペプチド分子を提供する様式で、ペプチド分子に、またはペプチド分子から糖を無細胞でインビトロ付加および/または削除するための方法および組成物を含み、ここで糖ペプチドは工業的規模で生産される。本発明の好適な態様では、そのように生産された糖ペプチドは酵素反応を介してペプチドに付加された修飾糖が糖ペプチドに結合している。本発明の重要な特徴は、任意の細胞型により生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコアグリカン構造を生成し、その後にグリカン構造をインビトロで改造して、哺乳動物の治療的使用に適するグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するように改造することである。より具体的には、結合分子がペプチドに有利な特性を付与するように、本発明に従い修飾された糖分子またはそれに結合した他の化合物を有する糖ペプチド分子を調製することが可能である。本発明により、結合分子のペプチドへの酵素に基づく付加は位置選択性および立体選択性の利点を有するので、結合分子はペプチドに酵素的に付加される。したがって本明細書に提供する方法および組成物を使用することにより、ペプチドを改造して好ましくはペプチドに結合した修飾された糖を有する望ましいグリカン構造をペプチドに付与することが可能である。また本発明の方法および組成物を使用することにより、工業的規模で所望する、かつまたは修飾されたグリカン構造を有するペプチド分子を生成することも可能であり、これにより初めて当該技術分野に改善された治療用ペプチドを効率的に生産するための現実的解決を提供する。
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術でおよび科学的用語は、一般に本発明が属する分野で当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。一般に細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションで本明細書で使用する命名法および研究手順は、当該技術分野において周知なものであり、そして普通に使用されている。核酸およびペプチド合成については標準的な技術を使用する。これらの技法および手順は当該技術分野の常法および様々な一般的参考書(例えばSambrook et al.,1989,モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)に従い一般に行われ、これらはこの文献全体にわたって提供されている。本明細書で使用する命名法および以下に記載する分析化学および有機合成で使用する研究手順は周知で、しかも当該技術分野では普通に使用されているものである。標準技法およびそれらの変法を、化学合成および化学分析に使用する。
本明細書で使用する冠詞“a”および“an”は1以上(すなわち少なくとも1)の物体の文法的対象を指す。例として“要素(an element)”は1または1より多くの要素を指す。
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源または組換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には四量体の免疫グロブリン分子である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在することができる(Harlow et al.、1999、抗体を使用して:ア ラボラトリーマニュアル(Using Antibodies:A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州;Harlow et al.、1989、抗体:ア ラボラトリーマニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク;Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879−5883;Bird et al.,1988,Science242:423−426)。
本明細書で使用する用語「合成抗体」は、例えば本明細書に記載するバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えDNA技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語は抗体をコードするDNA分子の合成により生成された抗体を意味するとも解釈すべきであり、そしてこのDNA分子は抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでDNAまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能であり、しかも周知な合成DNAまたはアミノ酸配列技法を使用して既に得られている。
本明細書で使用する「機能的な」生物学的分子は、特徴とする特性を現す形態の生物学的分子である。例えば機能的酵素は、その酵素の特徴とする特徴的な触媒活性を示すものである。
本明細書で使用する構造
Figure 0006321724
は、ペプチド中のアミノ酸とグリカン構造との間の連結点である。
「N−結合」オリゴ糖は、アスパラギン−N−アセチルグルコサミン結合によりアスパラギンを介してペプチド骨格に連結しているオリゴ糖である。N−結合オリゴ糖は「N−グリカン」とも呼ぶ。すべてのN−結合オリゴ糖は共通するManGlcNAcの五糖コアを有する。それらはN−アセチルグルコサミン、ガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸のような周辺糖の存在および分岐(アンテナとも呼ぶ)の数が異なる。場合によりこの構造はコアのフコース分子および/またはキシロース分子を含んでもよい。
「基本的なトリマンノシルコア構造」とは、さらなる糖は結合していないトリマンノシルコア構造のみから構成されるグリカン部分を称する。用語「基本的な」が「トリマンノシルコア構造」の記載に含まれない時、グリカンはグリカンはそれに結合したさらなる糖を持つトリマンノシルコア構造を構成する。場合によりこの構造はコアフコース分子および/またはキシロース分子を含んでもよい。
用語「基本的なトリマンノシルコア糖ペプチド」は、本明細書では主に基本的なトリマンノシルコア構造から構成されるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する。場合によりこの構造はコアフコース分子および/またはキシロース分子を含んでもよい。
「O−結合」オリゴ糖は、トレオニンまたはセリンの介してペプチド骨格に結合したオリゴ糖である。
本明細書に記載するすべてのオリゴ糖は、非還元サッカリド(すなわちGal)に関する名前および記号で記載し、次にグリコシド結合の立体配置(αまたはβ)、環結合(1または2)、結合に関与する還元サッカリドの環の位置(2、3、4、6または8)、そして次に還元サッカリドの名前または記号(すなわちGlcNAc)を記載する。各サッカリドは好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学命名法に関する総説は、例えば糖生物学の本質(Essential of Glycobiology)、Varki et al.,編集、1999、CSHL出版を参照にされたい。
用語「シアル酸」は、9−炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意の員を指す。シアル酸ファミリーの最も普通の員は、N−アセチル−ノイラミン酸(2−ケト−5−アセトアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクトノヌロピラノソ−1−ン酸(しばしばNeu5Ac、NeuAcまたはNANAと略記される)。このファミリーの第2の員は、N−グリコリル−ノイラミン酸(Nue5GcまたはNeuGc)であり、ここでNeuAcのN−アセチル基はヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリーの員は、2−ケト−3−デオキシ−ノヌロン酸(KDN)である(Nadano et al.,(1986)J.Biol.Chem.261:11550−11557;Kanamori et al.,J.Biol.Chem.265:21811−21819(1990))。また含まれるのは9−O−C−Cアシル−Neu5Ac様の9−O−ラクチル−Neu5Acまたは9−O−アセチル−Neu5Ac、9−デオキシ−9−フルオロ−Neu5Acおよび9−アジド−9−デオキシ−Neu5Acのような9−置換シアル酸である。シアル酸ファミリーの総説については、例えばVarki,Glycobiology,2:25−40(1992);シアル酸:化学、代謝および機能(Sialic Acid:Chemistry,Metabolism and Function)、R.Schauer、編集(スプリンガーファーラーグ、ニューヨーク(1992))を参照にされたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、1992年、10月1日に公開された国際公開第92/16640号パンフレットに開示されている。
本明細書で使用する「所望のグリコシル化」を有するペプチドは、ペプチドの効率的な生物学的活性に必要な1以上のオリゴ糖分子を含んでなるペプチドである。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、そして疾患が改善されなければ、動物の健康状態は悪化し続ける動物の健康状態である。
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する「曲線下の面積」または「AUC」は、ゼロから無限大の時間の関数として患者の全身循環における薬剤濃度を記載する曲線下の総面積と定義する。
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する「半減期」または「t」は、患者の血漿薬剤濃度が半分に減少するために必要な時間と定める。多くの排除(clearence)メカニズム、再分布および当該技術分野で周知な他のメカニズムに依存して、ペプチド薬剤に関連する1より多くの半減期が存在するかもしれない。
通常、アルファ期が再分布に関連し、そしてベータ期が排除に関連するような、アルファおよびベータ半減期が定義されている。しかしタンパク質薬剤については、ほとんどの部分が血流に限定され、少なくとも2つの排除半減期が存在し得る。幾つかのグリコシル化ペプチドに関しては、急速なベータ期排除はマクロファージ上のレセプター、あるいは末端ガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、N−アセチルグルコサミン、マンノースまたはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介される。より遅いベータ期排除は有効半径(effective radius)<2nm(約68kD)の分子については腎臓の糸球体濾過を介して、および/または組織中の特異的もしくは非特異的取り込みおよび代謝を介して起こり得る。糖PEG化(GlycoPEGylation)は末端糖(例えばガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミン)をキャップすることができ、そしてこれによりこれらの糖を認識するレセプターを介する急速なアルファ期排除を遮断する。より大きな有効半径を与え、そしてこれにより分布の容量および組織の取り込みを下げ、これにより後期ベータ期を延長することもできる。このようにアルファ期およびベータ期半減期に及ぼす糖PEG化の明確な影響は、サイズ、グリコシル化の状態および当該技術分野で周知な他のパラメーターに依存して変動するだろう。「半減期」のさらなる説明は、製薬学的バイオテクノロジー(Pharmaceutical Biotechnology)、(1997,DFA Crommelin and RD Sindelar、編集、ハウウッド出版、アムステルダム、第101−120頁)に見いだすことができる。
患者にペプチド薬剤を投与する内容において、本明細書で使用する用語「滞留時間」とは、薬剤が投薬後に患者の身体に留まる平均時間と定義する。
「単離された核酸」とは天然に存在する状態でそれを挟む配列、例えばフラグメントに通常隣接する配列から取り出されたDNAフラグメント、例えば天然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントを称する。この用語は、核酸に天然に付随する他の成分、例えば通常は細胞中で付随するRNAまたはDNAまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する。したがってこの用語には、例えばベクターに、自律複製プラスミドまたはウイルスに、または原核または真核生物のゲノムDNAに包含されるか、または他の配列から独立して別個の分子として存在する(cDNAまたはゲノムもしくはPCRまたは制限酵素消化により生成されるcDNAフラグメントのような)組換えDNAを含む。またさらなるペプチド配列をコードするハイブリッド核酸の一部である組換えDNAも含む。
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖またはパラレルおよび抗−パラレル鎖を意味する。すなわちポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖核酸のいずれかでよい。
用語「核酸」は典型的には大きなポリヌクレオチドを称する。用語「オリゴヌクレオチド」は典型的には短いポリヌクレオチド、一般には約50ヌクレオチド未満を指す。
本明細書では従来の表記法を使用してポリヌクレオチド配列を記載する:一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は5’−末端である;2本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、5’−方向を指す。新生RNA転写物に対してヌクレオチドの5’から3’付加の方向は転写方向と称する。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖を「コード鎖」と称し;DNA上の参照点に対して5’に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と称し;DNA上の参照点に対して3’に位置するDNA鎖上の配列は「下流配列」と称する。
「コードする」とは、ヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)の定めた配列、またはアミノ酸の定めた配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として役立つ遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特別な配列に固有の特性を称する。すなわち核酸配列は、その核酸に対応するmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物系であるタンパク質を生産する場合、そのタンパク質をコードする。両コード鎖は、そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、そして通常は配列表に提供され、そして遺伝子またはcDNAの転写に鋳型として使用される非コード鎖は、その核酸またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は互いの縮重形物であり、そして同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
本明細書で使用する「相同的」とは2つの重合性分子の間、例えば2つの核酸分子の間、例えば2つのDNA分子または2つのRNA分子の間、または2つのペプチド分子の間のサブユニット配列類似性を称する。2つの両分子中のサブユニット位置が同じモノマー性サブユニットに占有されている時、例えば2つの各DNA分子の1つの位置がアデニンで占められているならば、それらはその位置で相同的である。2つの配列間の相同性は対合するか、または相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば2つの化合物の配列で位置の半分(例えば10個のサブユニット長のポリマー中の5箇所)が相同的ならば、2つの配列は50%相同的であり、90%の位置、例えば10のうちの9が対合または相同的ならば、2つの配列は90%の相同性を共有する。例として、DNA配列3’ATTGCC5’および3’TATGGCは50%の相同性を共有する。
本明細書で使用するように、「相同性」は「同一性」と同義的に使用する。
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。例えば2つの配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、Karlin and Altschul(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)におけるように改良されたKarlin and Altschul(1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268)のアルゴリズムである。このアルゴリズムはAltschul,et al.(1990,J.Mol.Biol.215:403−410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに包含され、そして例えばホームページのURL“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/”を有するナショナル センター フォー バイオテクノロジー インフォメーション(NCBI)の世界的なウェッブサイトからアクセスすることができる。BLASTのヌクレオチド調査は、以下のパラメーターを使用してNBLASTプログラムを用いて行うことができる(NCBIウェッブサイトで“blastn”と命名):本明細書に記載する核酸に対して相同的なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティー=5;ギャップエクステンションペナルティー=2;ミスマッチペナルティー=3;マッチリワード=1;期待値=10.0;およびワードサイズ=11。BLASTのタンパク質調査は、以下のパラメーターを使用してXBLASTプログラム(NCBIウェッブサイトで“blastn”と命名)またはNCBI“blastp”プログラムを用いて行うことができる:本明細書に記載するタンパク質分子に対して相同的なアミノ酸配列を得るために、期待値=10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックス。比較目的のギャップ化アライメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul,et al.(1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)に記載されているように利用することができる。あるいはPSI−BlastまたはPHI−Blastを使用して、分子間の距離関係(Id.)および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復調査を行うことができる。BLAST、Gapped化BLAST、PSI−BlastおよびPHI−Blastプログラムを使用する時、各プログラムのデフォルトパラメーター(例えばXBLASTおよびNBLAST)を使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照にされたい。
2つの配列間の同一性の割合は、ギャップを割り当てるか、または割り当てずに上記の技術に類似する技術を使用して決定することができる。同一性の割合の計算では、多くの場合、正確な対合をカウントする。
ペプチドをコードする「ヘテロロガスな核酸発現単位」は、プロモーターおよび/またはリプレッサー配列(ここで少なくとも1つの配列はヘテロロガス、すなわち宿主細胞中に通常は見いだされない)のような1以上の発現制御配列に操作可能に連結された、問題のペプチドのコード配列を有する核酸と定義する。
2つのポリヌクレオチドが「操作可能に連結された」と記載することは、一本鎖または二本鎖核酸部分が、2つのポリヌクレオチドの少なくとも1つがその特徴とする生理学的効果をもう一方に及ぼすことができる様式で、核酸部分内に配列されている2つのポリヌクレオチドを含んでなることを意味する。例として核酸のコード領域と操作可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
本明細書で使用する用語「プロモーター/調節配列」は、プロモーター/調節配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある場合ではこの配列はコアプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列は遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素を含んでもよい。プロモーター/調節配列は、例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
「構成的プロモーターは、それが操作可能に連結された遺伝子の発現を細胞中で一定の様式で駆動するプロモーターである。例として、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターである。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結された時、プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在する時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列である。
「組織−特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結された時、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列である。
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなり、そして単離された核酸を細胞の内部へ送達するために使用することができる物質の組成物である。当該技術分野では数々のベクターが知られており、それらには限定するわけではないが線状ポリヌクレオチド、イオン性または両イオン性化合物を付随するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む。このように用語「ベクター」には自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリシン化合物、リポソーム等のような核酸の細胞への転移を促進する非−プラスミドおよび非−ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、限定するわけではないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含む。
「発現ベクター」は発現されるべきヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを称する。発現ベクターは発現に十分なシス−作用要素を含んでなり;発現のための他の要素は宿主細胞またはインビトロ発現系により供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを包含するコスミド、プラスミド(例えば裸の、またはリポソームに含まれた)およびウイルスのような、当該技術分野で既知のこれらすべてを含む。
「遺伝的に操作された」または「組換え」細胞は、細胞の遺伝的物質に対して1以上の修飾を有する細胞である。そのような修飾には限定するわけではないが、遺伝的物質の挿入、遺伝的物質の削除、およびそのような物質が安定に維持さるか、またはされなくても染色体外の遺伝的物質の挿入に見られる。
「ペプチド」はオリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質または糖タンパク質である。本明細書における用語「ペプチド」の使用は、糖部分がペプチドに結合している時、ペプチドに結合した糖部分を有するペプチドを含む。
本明細書で使用する「天然の形態」は、天然に見いだされる、細胞および/または生物により生産される時のペプチドの形態を意味する。ペプチドが複数の細胞および/または生物により生産される時、ペプチドは種々の天然な形態を有することができる。
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合を介して一緒に連結されているポリマーを称するか、あるいはペプチドと呼ぶ。さらに天然には存在しないアミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含む。核酸がコードしないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されたアミノ酸も本発明に有用となり得る。本発明で使用するすべてのアミノ酸は、そのD−またはL−同位体のいずれかであり得る。L−同位体が一般に好ましい。さらに他のペプチド模造物も本発明に有用である。本明細書で使用するように、「ペプチド」はグリコシル化および非グリコシル化ペプチドの両方を指す。またペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されたペプチドも含む。一般的な総説については、Spatola,A.F.、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学(CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS,PEPTIDES AND PROTEINS)、B.Weinstein編集、マルセルデッカー(Marcel Dekker)、ニューヨーク、第267(1983)頁を参照にされたい。
「ペプチド結合物(peptide conjugate)」は、ペプチドが本明細書で説明する修飾された糖を用いて結合されている本発明の種を称する。
用語「アミノ酸」は、天然に存在する、および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模造物を称する。天然に存在するアミノ酸は遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびO−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学的構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを称する。そのような類似体は修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模造物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。 本明細書で使用するアミノ酸は、以下の表1に示すように、その完全名により、それらに対応する3文字コードにより、またはそれらに対応する1文字コードにより表す:
Figure 0006321724
本発明はまた、上で確認されたようなタンパク質を含んでなるタンパク質またはペプチドの類似体も提供する。類似体は保存的アミノ酸配列の差異により、または配列に影響しない修飾により、あるいはその両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なることができる。例えばタンパク質またはペプチドの1次配列は変えるが、通常はその機能を変えない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換には典型的には以下の群内の置換を含む:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リシン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
修飾(通常は1次配列を変えない)には、 インビボまたはインビトロの、ペプチドの化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。またグリコシル化の修飾、例えばペプチドの合成およびプロセッシング中、またはさなるプロセッシング段階でのペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより;例えばペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素に暴露することにより作られるものを含む。またリン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンも含む。
もちろんペプチドは活性に影響を及ぼさずに修飾されるアミノ酸残基を含むことができると考える。例えば末端を誘導化してブロッキング基、すなわち「望ましくない分解」(この用語は化合物の機能に影響を及ぼすと思われる化合物の末端で任意の種類の酵素的、化学的または生化学的分解、すなわちその末端での化合物の順次分解を意味する)からN−末端およびC−末端を保護し、かつ/または安定化するために適する化学置換基を含むことができる。
ブロッキング基にはペプチドのインビボ活性に悪い影響を及ぼさないペプチド化学の分野で従来から使用されている保護基を含む。例えば適当なN−末端ブロッキング基は、N−末端のアルキル化またはアシル化により導入することができる。適当なN−末端ブロッキング基の例には、C−C分岐もしくは非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル(Acm)、FmocまたはBoc基のようなそれらの置換形を含む。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なN−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのN−末端にカップリングされるか、またはN−末端残基の代わりに使用されるかのいずれかであり得る。適当なC−末端ブロッキング基(ここでC−末端のカルボキシル基が含まれるか、または含まれない)には、エステル、ケトンまたはアミドを含む。エステルまたはケトン−形成アルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルのような低級アルキル基、および1級アミン(−NH)のようなアミド形成アミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基は、C−末端ブロッキング基の例である。アグマチンのようなデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なC−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのC−末端残基にカップリングされるか、またはそれに変えて使用することができる。さらに末端の遊離アミノおよびカルボキシル基はペプチドから一緒に取り出して、ペプチドの活性に影響を及ぼすことなくそれらのデスアミノおよびデスカルボキシル化形を生じることができると考えられる。
他の修飾も活性に悪影響を及ぼさずに包含することができ、そしてこのような修飾には限定するわけではないが天然のL−異性体における1以上のアミノ酸をD−異性体中のアミノ酸に置換することを含む。このようにペプチドは1以上のD−アミノ酸残基を含んでもよく、あるいはすべてがD−形のアミノ酸から構成されてもよい。本発明に従いペプチドのレトロ−インベルソ(retro−inverso)形、例えばすべてのアミノ酸がD−アミノ酸形に置換されている転化(inverted)ペプチドも企図する。
本発明の酸付加塩も機能的均等物として企図する。すなわちペプチドの水溶性塩を提供するために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸で、あるいは酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸で処理した本発明のペプチドは、本発明での使用に適している。
タンパク質分解的分解に対するペプチドの耐性を改善し、または溶解特性の至適化し、またはペプチドを治療薬としてより適するようにするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたペプチドも含む。そのようなペプチドの類似体には、天然に存在するL−アミノ酸以外の残基、例えばD−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。本発明のペプチドは本明細書に掲載する具体的な例示法の生成物に限定されない。
本明細書で使用する用語「MALDI」はマトリックス支援レーザー脱離イオン化の略である。イオン化中、SA−PEG(シアル酸−ポリ(エチレングリコール))は糖タンパク質のN−グリカン構造から部分的に排除され得る。
本明細書で使用する用語「グリコシルトランスフェラーゼ(glycosyltransferase)」とは、供与体の糖を受容部分(acceptor moiety)に転移する能力を有する任意の酵素/タンパク質を称する。
本明細書で使用する用語「修飾された糖(modified suger)」は、本発明の方法でペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加された天然に存在する、または天然には存在しない炭水化物を称する。修飾された糖は限定するわけではないが糖ヌクレオチド(モノ−、ジ−およびトリ−ホスフェート)、活性化糖(例えばグリコシルハライド、グリコシルメシラート)および活性化もされず、ヌクレオチドでもない糖を含む多数の酵素基質から選択される。
「修飾された糖」は「修飾基(modifying group)」を用いて共有的に官能化される。有用な修飾基には限定するわけではないが、水溶性ポリマー、治療部分、診断部分、生体分子等を含む。修飾基での官能化の位置は、「修飾された糖」がペプチドに酵素的に加えられることを妨げないように選択される。
用語「水溶性(water−soluble)」とは水中で幾らかの検出可能な溶解度を有する部分を称する。水溶性を検出し、かつ/または定量するための方法は当該技術分野では周知である。例として水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカリド、ポリ(エーテル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)等を含む。ペプチドは混合配列を有するか、または単一アミノ酸からなる(例えばポリ(リシン))ことができる。同様にサッカリドは混合配列であるか、または単一サッカリドサブユニット(例えばデキストラン、アミロース、キトサンおよびポリ(シアル酸))からなることができる。ポリ(エーテル)の例はポリ(エチレングリコール)である。ポリ(エチレンイミン)はポリアミンの例であり、そしてポリ(アスパラギン)酸は代表的なポリ(カルボン酸)である。
本明細書で使用する用語「グリコシル連結基(glycosyl linking group)」とは、作用物質(例えば水溶性ポリマー、治療部分、生体分子)が共有結合するグリコシル残基を指す。本発明の方法において「グリコシル連結基」は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに共有結合するようになり、これにより作用物質をペプチド上のアミノ酸および/またはグリコシル残基に連結する。「グリコシル連結基」は、一般に「修飾された糖」をペプチド上のアミノ酸および/またはグリコシル残基に酵素的に結合することにより、「修飾された糖」に由来する。「完全なグリコシル連結基(intact glycosyl linking group)」はグリコシル部分に由来する連結基を称し、ここで結合物を連結する個々のサッカリドモノマーは分解、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化されない。本発明の「完全なグリコシル連結基」はグリコシル単位(1つまたは複数)の付加により、または元のサッカリド構造から1以上のグリコシル単位の除去により天然に存在するオリゴ糖に由来することができる。
本明細書で使用する用語「標的部分(targeting moiety)」および「標的剤(targeting agent)」は、身体の特定の組織または領域に選択的に局在化する種を称する。局在化は分子決定基の特異的認識、標的剤または結合物の分子サイズ、イオン的相互作用、疎水的相互作用等により媒介される。作用物質を特定の組織または領域に標的化する他のメカニズムは、当業者により知られている。
本明細書で使用する「治療部分(therapeutic moiety)」は、治療に有用な任意の作用物質を意味し、それらには限定するわけではないが抗生物質、抗−炎症剤、抗−腫瘍剤、サイトトキシンおよび放射性剤を含む。「治療部分」には生物活性剤(1より多くの治療部分が担体に結合している構築物、例えば多機能剤(multivalent agent))のプロドラッグを含む。治療部分はペプチドおよびペプチドを含む構築物も含む。例示ペプチドには図1および本明細書中の表5および表6に開示されているものを含む。
本明細書で使用する「抗−腫瘍剤」とはガンを克服するために有用な任意の作用物質を意味し、限定するわけではないがサイトトキシンおよび代謝拮抗物質、アルキル化剤、アンスラサイクリン、抗生物質、抗有糸分裂剤、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロンおよび放射性剤のような作用物質を含む。また用語「抗腫瘍剤」の範囲内に包含されるのは、ペプチドと−腫瘍活性、例えばTNF−αとの結合物である。結合物は限定するわけではないが、治療用タンパク質と本発明の糖タンパク質との間で形成されるものを含む。代表的な結合物は、PSGL−1とTNF−αとの間で形成される結合物である。
本明細書で使用する「サイトトキシンまたは細胞傷害剤(cytotoxic agent)」は、細胞に有害な任意の作用物質を意味する。例にはタキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノルオールおよびピューロマイシンおよびそれらの類似体または相同体を含む。他のトキシンには例えばリシン、CC−1065および類似体、ヅオカルマイシンを含む。さらに別のトキシンにはジフテリアトキシンおよび蛇毒(例えばコブラ毒)を含む。
本明細書で使用するように、「放射性剤」には腫瘍を診断し、または破壊するために効果的な任意の放射性同位体を含む。例には限定するわけではないが、インジウム−111、コバルト−60およびテクネチウムを含む。さらにウラン、ラジウムおよびトリウムのような天然に存在する放射性同位体元素(これらは典型的には放射性同位体の混合物を表す)は、放射性剤の適切な例である。金属イオンは典型的には有機錯化部分で錯化される。
多くの有用な錯化基、クラウンエーテル、クリプタンド等が当該技術分野では知られており、そして本発明の化合物に包含することができる(例えばEDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等、およびDTPP、EDTP、HDTP、NTP等のようなそれらのホスホネート類似体)。例えばPitt et al.、「鉄過剰負荷の処置のための錯化剤の設計(The Design of Chelating Agents for The Treatment of Iron Overload)」、生物学および医学における無機化学(INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE)で;Martell編集;アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.、1980、第279〜312頁;Lindoy、大環リガンド錯体の化学(THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES);ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、1989;Dugas、生物有機化学(BIOORGANIC CHEMISTRY);スプリンガー−ファーラーク、ニューヨーク、1989、およびそれらの中に含まれている参考文献を参照にされたい。
さらに錯化剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンを他の分子に付ける多数の経路を当業者は利用することができる。例えばMeares et al.,「インビボのキレート−標識タンパク質およびポリペプチドの性質(Properties of In Vivo Chelate−Tagged Proteins and Polypeptides)」、タンパク質の修飾:食品、栄養および薬理学的観点(MODIFICATION OF PROTEINS:FOOD,NUTRITIONAL,AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS)」で、Feeney et al.、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.、1982、第370〜387頁;Kasina et al.,Bioconjugate Chem.,9:108−117(1988);Song et al.,Bioconjugate Chem.,8:249−255(1997)を参照にされたい。
本明細書で使用するところの「製薬学的に許容され得る担体」には、結合物と合わせた時に結合物活性の活性を保持し、そして個体の免疫系とは非反応性の任意の物質を含む。
例には限定するわけではないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油/水型乳液のような乳液、および様々な種類の湿潤剤のような標準的な製薬学的担体を含む。他の担体には、滅菌溶液、コート錠剤を含む錠剤およびカプセルを含んでもよい。典型的にはそのような担体は澱粉、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物油脂または油、ガム、グリコールのような賦形剤、または他の既知の賦形剤を含む。そのような担体はまた、香料および着色用添加剤または他の材料を含んでもよい。そのような担体を含んでなる組成物は、周知な常法により配合される。
本明細書で使用するように、「投与する」とは個体への経口投与、座薬としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内(intralesional)、鼻内または皮下投与、鞘内投与、または緩効性デバイス(例えばミニ−浸透圧ポンプ)の移植を意味する。
用語「単離された」とは、物質を生産するために使用する成分を実質的または本質的に含まない物質を称する。本発明のペプチド結合物について、用語「単離された」とはペプチド結合物を調製するために使用する混合物中の物質を通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を称する。「単離された」および「純粋な」とは互換的に使用する。典型的には本発明の単離されたペプチド結合物は好ましくは範囲として表される純度のレベルを有する。ペプチド結合物に関する純度範囲の下限は約60%、約70%または約80%であり、そして純度範囲の上限は約70%、約80%、約90%または約90%より高い。
ペプチド結合物が約90%より高い純度である時、それらの純度も好ましくは範囲で表される。純度範囲の下限は約90%、約92%、約94%、約96%または約98%である。純度範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%または約100%である。
純度は技術的に認識されている分析法(例えば銀染色ゲル上のバンドの強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLCまたは類似の手段)により決定される。
本明細書で使用する「群の本質的な各員」とは、ペプチドに付加される選択された割合の修飾された糖が、ペプチド上の多数の同一な受容体部位(acceptor site)に付加されている、本発明のペプチド結合物群の特徴を説明する。「群の本質的な各員」は、修飾された糖に対するペプチド結合物上の部位の「均一性」にも言及しており、そして少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、そしてより好ましくは少なくとも約95%均一である本発明の結合物を称する。
「均一性」とは、修飾された糖が結合する受容体部分の群全域の構造的一貫性を称する。すなわち各修飾された糖が、それぞれ他の修飾された糖が結合する受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に結合している本発明のペプチド結合物では、ペプチド結合物は約100%均一であると言える。均一性は典型的には範囲で表される。ペプチド結合物について均一性の範囲の下限は約60%、約70%または約80%であり、そして純度範囲の上限は約70%、約80%、約90%または約90%より高い。
ペプチド結合物が約90%以上均一である時、それらの均一性も好ましくは範囲で表される。均一性の範囲の下限は約90%、約92%、約94、約96%または約98%である。純度範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%または約100%の均一性である。ペプチド結合物の純度は典型的には当業者に既知の1以上の方法、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)、飛行スペクトロメトリーのマトリックス支援レーザー脱離質量時間(MALDI−TOF)、キャピラリー電気泳動等により決定される。
糖ペプチド種に関して言う時、「実質的に単一なグリコフォーム(substantially uniform glycoform)」または「実質的に単一なグリコシル化パターン(glycosylation pattern)」とは、問題のグリコシルトランスフェラーゼ(例えばフコシルトランスフェラーゼ)によりグリコシル化される受容体部分の割合を指す。例えばα1,2−フコシルトランスフェラーゼの場合では、実質的にすべての(以下に定義するように)Galβ1,4−GlcNAc−Rおよびそのシアリル化類似体が本発明のペプチド結合物中でフコシル化される場合、実質的に単一なフコシル化パターンが存在する。当業者は出発原料がグリコシル化受容体部分(例えばフコシル化Galβ1,4−GlcNAc−R部分)を含んでもよいと理解するだろう。すなわち計算されるグリコシル化の割合は、本発明の方法によりグリコシル化される受容体部分、ならびに出発原料中ですでにフコシル化された受容体部分を含む。
「実質的に単一」の上記定義において用語「実質的に」とは、一般に特定のグリコシルトランスフェラーゼについて少なくとも約40%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、そしてさらに好ましくは少なくとも約95%の受容体部分がグリコシル化されることを意味する。
発明の説明
I.グリカン鎖の改造するための方法
本発明は、好ましくは修飾された糖をペプチドに付加することを含む特別にカスタマイズされた、または所望のグリコシル化パターンを有するペプチド分子を提供するような様式で、糖ペプチド分子へ、またはそれから糖をインビトロで付加および/または削除するための方法および組成物を含む。したがって本発明の重要な特徴は、任意の細胞型により生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコアグリカン構造を生成し、その後にグリカン構造をインビトロで改造して哺乳動物における治療的使用に適するグリコシル化パターンを有するペプチドを生成することである。
ペプチドのグリコシル化パターンの重要性は、正しくグリコシル化されたペプチドを生産するための現在のインビボ法の、特にこれらのペプチドが組換えDNAの方法論を使用して生産される時の限界から当該技術分野では周知である。さらに本発明まで、ペプチドは工業的規模で生産できるが、ペプチド上に所望のグリカン構造を有する糖ペプチドを生成することは可能でなかった。
本発明では、本明細書のいたるところで記載するような「所望のグリコシル化」を有する糖ペプチドを提供する様式で、ペプチド上に存在すべきではない糖部分が除去され、そしてペプチドに付加されるべき、場合により修飾された糖を含む糖部分が付加されるように、細胞により生産されるペプチドが適当な酵素およびその基質の体系的付加によりインビトロで酵素的に処理される。
A.N−結合グリカンを改造する方法
1つの観点では、本発明は商業的または製薬学的に興味深いほとんどのペプチドが本明細書でトリマンノシルコア(trimannosyl core)と呼ぶ共通する5個の糖構造を含んでなり、これはペプチド鎖上の配列Asn−X−Ser/ThrでアスパラギンにN−結合しているという事実を利用する。基本的なトリマンノシルコアは本質的にペプチドに結合した2個のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基および3個のマンノース(Man)残基からなり、すなわちこれは場合によりフコース残基を含むことができる場合を除き、このような5個の糖残基を含んでなり、そしてさらなる糖は含まない。第1GlcNAcはアスパラギンのアミド基に結合し、そして第2のGlcNAcはβ1,4−結合を介して第1に結合している。マンノース残基はβ1,4−結合を介して第2のGlcNAcに結合し、そして2個のマンノース残基がそれぞれα1,3およびα1,6結合を介してこのマンノースに結合している。トリマンノシルコア構造の図解的説明は図2、左側に示す。ほとんどのペプチド上のグリカン構造はトリマンノシルコアに加えて他の糖を含んでなるのが通例であるが、トリマンノシルコア構造は哺乳動物のペプチド上のN−結合グリカンの本質的特徴を表す。
本発明は、ペプチド上にグリカン分子の構造の基本的要素としてトリマンノシルコア構造を有するペプチドの生成を含む。系がそれ自体天然に存在するものであるか、あるいはそれらは組換えDNA法を含むかどうかにかかわらず、ペプチドを生産するために使用する種々の細胞系を考慮して、本発明は任意の細胞型で生産されるペプチド上のグリカン分子が基本的なトリマンノシルコア構造に減少できる方法を提供する。いったん基本的なトリマンノシルコア構造を生成したら、次いで本明細書に記載する方法を使用して、ペプチドにペプチドの治療的効果を強化する1以上の特性を付与するペプチド上の所望するグリカン構造をインビトロでペプチドに生成することが可能である。
本明細書に記載する考察から、用語「トリマンノシルコア」は図2、左側に示すグリカン構造を記載するために使用することは明らかなはずである。トリマンノシルコア構造を有する糖ペプチドは、それらに加えられたさらなる糖を有してもよく、そしてほとんどの部分について、糖が所望するグリカン構造を有するペプチドを生じるかどうかには無関係に、それに加えられたさらなる構造を有する。用語「基本的なトリマンノシルコア構造」は、本明細書中のいたるところで定義している。用語「要素」が「トリマンノシルコア構造」の記載には含まれない時、グリカンはさらにそれに付いた糖を含むトリマンノシルコア構造を含んでなる。
用語「基本的なトリマンノシルコア糖ペプチド」は、本明細書では主に基本的なトリマンノシルコア構造を含んでなるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する。
しかし場合によりそれに結合したフコース残基を含んでもよい。本明細書に記載するように、基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドは1つの最適例であり、したがって本発明のグリカン改造方法の好適な出発原料である。
本発明のグリカン改造方法の別の最適な出発原料は、1または2個のさらなるGlcNAc残基が各α1,3およびα1,6−マンノース残基に加えられたトリマンノシルコアを有するグリカン構造である(例えば図3の第2行の、図の左から2番目の構造を参照にされたい)。この構造は本明細書では「Man3GlcNAc4」と呼ぶ。場合により、この構造はコアフコース分子を含んでもよい。いったんMan3GlcNAc4構造が生成したら、本明細書に記載する方法を使用してペプチドの治療的効果を強化する1以上の特性を糖ペプチド上に付与する所望のグリカン構造を糖ペプチド上にインビトロで生成することが可能である。
それらの天然の形態では、本発明のN−結合糖ペプチド、そして特に本発明に有用な哺乳動物およびヒトの糖ペプチドは、トリマンノシルコア構造およびそれに結合した1以上の糖を用いてN−結合グリコシル化される。
用語「糖ペプチド」および「糖ポリペプチド」は本明細書では同義的に使用し、そしてペプチドに結合した糖部分を有するペプチド鎖を指す。本明細書では小さい糖ポリペプチドまたは糖ペプチドを、大きな糖ポリペプチドまたは糖ペプチドから区別する識別は行わない。すなわち大変わずかなアミノ酸をそれらのペプチド鎖中に有するホルモン分子(例えばしばしばわずか3アミノ酸)および他の大変大きなペプチドも、それらが結合した糖部分を有するならば総称用語「糖ポリペプチド」および「糖ペプチド」に含める。しかし用語「ペプチド」の使用はペプチドが糖ペプチドであることを除外しない。
所望のグリコシル化を有するN−結合糖ペプチドの例は、それに結合した少なくとも1つのGlcNAc残基を含むトリマンノシルコアを有するN−結合グリカンを有するペプチドである。この残基はN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT−I)を使用してトリマンノシルコアに加えられる。第2のGlcNAc残基を加える場合、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII(GnT−II)を使用する。場合によりさらなるGlcNAc残基をGnT−IVおよび/またはGnT−Vを用いて加えてもよく、そして第3のバイセクティング(bisecting)GlcNAc残基をN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnT−III)を使用してトリマンノシルコアのβ1,4マンノースに結合することができる。場合により、この構造は、ガラクトース残基を各非−バイセクティングGlcNAcに加えるためにβ1,4ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて処理することにより延長してもよく、そしてさらに場合により、α2,3またはα2,6−シアリルトランスフェラーゼ酵素を使用して、シアル酸残基を各ガラクトース残基に加えてもよい。バイセクティングGlcNAcをグリカンに付加することは、引き続きガラクトースおよびシアル酸残基の付加に必要ではない;しかしラットおよびヒトGnT−III酵素の基質親和性に関して、グリカン上の1以上のガラクトース残基の存在は、ガラクトースを含むグリカンがこれらGnT−III形の基質ではないのでバイセクティングGlcNAcの付加を防止する。このようにバイセクティングGlcNAcの存在が望まれ、そしてこのような形のGnT−IIIを使用する場合、グリカンはバイセクティングGlcNAcの付加前に除去されるさらなるガラクトースおよび/またはシアル酸残基を含べきであることが重要である。他のGnT−III形はそれらの活性にこの特異的な基質の順序を必要としない。
「所望のグリコシル化」を有するペプチドの種々の観点を表すグリカン構造の例は、本明細書に提供する図面に示す。「所望のグリコシル化」を有するペプチドのインビトロ生成に関する正確な手順は、本明細書のいたるところに記載する。しかし本発明は本明細書に開示する任意の1つのグリカン構造のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ本発明は本明細書に提供する方法論を使用して作成され得るありとあらゆるグリカン構造を含むと解釈すべきである。
場合により、基本的なトリマンノシルコア構造のみがペプチドの所望するグリコシル化を構成するかもしれない。例えば唯一のトリマンノシルコアを有するペプチドは、ゴーシェ病に関与することが示された(Mistry et al.,1966,Lancet348:1555−1559;Bijsterbosch et al.,1996,Eur.J.Biochem.237:344−349)。
本発明に従い、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために以下の手順が明らかとなる。
a)共通する特徴としてトリマンノシルコア構造およびそれに結合した1以上の糖の少なくとも1以上の異種または均一な混合物を有する1以上のグリカン分子を有する糖ペプチドから始めて、唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造を有するか、または唯一のグリカン構造としてMan3GlcNAc4を有する糖ペプチドの比率を上げることが可能である。これはグリカン構造の糖の異種または均一混合物が基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少するまで、それを開裂する適当数の酵素を適当な順序で糖ペプチドに体系的に加えることによりインビトロで達成される。どのようにこれがなされるかの具体例は、ペプチドが生産される細胞型、それゆえに細胞により最初に生産されたペプチド上に存在するグリカン構造(1つまたは複数)の複雑さの程度を含む種々の因子に大部分が依存する。どのように複雑なグリカン構造が基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少できるかを図3に提示し、そして本明細書のいたるところで詳細に記載する。
b)細胞のグリコシル化機構が唯一のグリカン構造としてペプチド上に基本的なトリマンノシルコア構造を有するペプチドを生産する、天然に存在する細胞を単離することにより、そのようなペプチドを生成することが可能である。次に選択したペプチドが唯一のグリカン構造としてペプチド上に基本的なトリマンノシルコア構造を有するように、選択するペプチドをコードするDNAを、DNAが転写、翻訳、そしてグリコシル化される細胞にトランスフェクトする。例えば機能的GnT−I酵素を欠く細胞は数種の糖ペプチドを生産するだろう。場合によってはこれらはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖を伴わない糖ペプチドとなることもある。しかし別の場合では、生産されるペプチドはトリマンノシルコアに結合した2つのさらなるマンノース残基を有することができ、Man5グリカンを生じる。これも本発明の改造方法に望ましい出発原料である。そのようなグリカン構造の生成の具体例を本明細書に記載する。
c)あるいはペプチド上に唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドが生産されるように、特異的なグリコシル化機構を付与するために細胞を遺伝的に工作することが可能である。選択したペプチドが基本的なトリマンノシルコア構造のみを含んでなる増加した数のグリカンを有するように、選択したペプチドをコードするDNAを、DNAが転写、翻訳、そしてグリコシル化される細胞にトランスフェクトする。例えばGnT−Iを欠くように遺伝的に工作されたある種の細胞は、基本的なトリマンノシルコア構造を有するグリカンを生産するか、あるいは細胞に依存して、結合した2つのさらなるマンノース残基が加えられたトリマンノシルコアを有するグリカン(Man5)を生産することができる。細胞がMan5グリカン構造を生産する時、細胞は2つのさらなるマンノース残基を開裂してトリマンノシルコアを生成するマンノシダーゼ3を発現するようにさらに遺伝的に工作されることができる。あるいはこのMan5グリカンはインビトロでマンノシダーゼ3とインキューベーションして同じ効果を有することが可能である。
d)b)およびc)での考察から、細胞は基本的なトリマンノシルコアまたはそれに結合したMan3GlcNAc4構造を有するペプチドのみを生産する必要はないことが容易に明らかである。むしろb)およびc)で記載した細胞が100%の基本的なトリマンノシルコア構造(すなわち、それに結合したさらなる糖を持たない)、あるいは100%のMan3GlcNAc4構造を有するペプチドを生産しなければ、細胞は実際には唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造、またはMan3GlcNAc4構造を、それに結合したさらなる糖を有するこれらの構造に加えて組み合わせて有するペプチドの異種の混合物を生産する。結合したさらなる糖を有するトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドの比率は、1つの構造を有するペプチドの比率とは反対に、それらを生産する細胞に依存して変動するだろう。グリカンの複雑さ(すなわちトリマンノシルコアにどの糖がどれくらい結合しているか)も、それらを生産する細胞に依存して変動するだろう。
e)いったん基本的なトリマンノシルコアまたは1または2個のGlcNAc残基がそれに結合したトリマンノシルコアを有する糖ペプチドが上記のa)、b)またはc)に従い生産されれば、本発明に従い、さらなる糖分子をインビトロでトリマンノシルコア構造に加えて、所望のグリコシル化を有するペプチド(すなわち、インビトロでカスタマイズされたグリカン構造を有するペプチド)を生成する。
f)しかしすべてではないが幾らかの所望する糖を結合して含む基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドが生産される場合の時は、グリカン構造を基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少することなく、残りの所望の糖を付加することのみが必要である。したがって場合により、さらなる糖を結合したトリマンノシルコア構造を有するグリカン構造を有するペプチドは、改造の適当な出発原料である。
基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドの単離
本発明の基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4糖ペプチドは、必要ならばペプチド精製の分野で周知な技術を使用して単離し、そして精製することができる。適当な技術にはクロマトグラフィー技法、等電点電気泳動技法、超遠心技法等を含む。そのような任意の技法を使用して、本発明の組成物を調製することができ、ここで本発明の糖ペプチドは通常、細胞培養基内に見いだされる他のペプチドおよび他の成分から単離されている。精製の程度は例えば他のペプチドに関して90%または95%、あるいは一層高い、例えば98%となり得る。例えばDeutscher et al.(編集、1990、ペプチド精製に対する手引き(Guide to Peptide Purification)、Harcourt Brace Jovanovich、サンディエゴ)を参照にされたい。
従来技術の方法により生産された糖ペプチド中に存在するN−結合グリカンの異質性は通常、所望の糖ペプチドを生産するために修飾することができる少ない割合の標的糖ペプチドを単離することを可能にするだけである。本発明では、大量の基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドおよびMan3GlcNAc4グリカンを含む他の所望する糖ペプチドを生産することができ、次いでこれらはさらに修飾されて所望するグリコシル化を有する大量のペプチドを生成することができる。
ペプチドに結合した特定の型のグリカンの特異的濃縮は、所望のグリカンに親和性を有するレクチンを使用して達成することができる。そのような技術は糖生物学の分野では周知である。
以下により詳細に記載する本発明の重要な特徴は、いったんペプチド上にコアグリカン構造が生成されれば、次いでこのグリカン構造は哺乳動物において改善された治療的使用を有する望ましいグリコシル化を有するペプチドを生成するためにインビトロで改造されることである。哺乳動物は任意の適当な種でよく、そして好ましくはヒトである。
所望のグリコシル化を持つペプチドを調製するのための種々のシナリオおよび正確な方法および組成物が、以下の開示から明らかになるだろう。
哺乳動物で治療に使用するためのペプチド生産の最終的な目的は、ペプチドがペプチドの治療的利益を無効にするというよりは促進するグリカン構造を含んでなるべきであるということである。本明細書を通して開示するように、細胞中で生産されるペプチドは、所望のグリコシル化を有し、こうして哺乳動物での治療的使用に適するペプチドが生成するように、グリカン上に存在すべきではない糖の開裂およびグリカン上に存在すべき糖の付加を触媒する種々の酵素を用いて、インビトロで処理されることができる。細胞中でペプチドの種々のグリコ形の生成は、上に記載する。所望するグリコシル化を有するペプチド生成の様々なメカニズムをこれから記載し、ここで出発原料、すなわち細胞により生産されるペプチドは細胞型毎に異なってもよい。本開示から明らかになるように、出発原料はそのグリカン組成に関して単一である必要はない。しかし出発原料は、大量の最終産物、すなわち正しくグリコシル化されたペプチドが生産されるために、ある一定のグリコ形について豊富にすることが好ましい。
本発明に従い好適な態様では、所望のグリコシル化を有するペプチドをもたらす分解および合成反応(event)には、ある点で基本的なトリマンノシルコア構造またはMan3GlcNAc4構造をペプチド上に生成することを含む。
本発明はペプチドに1以上の選択したグリコシル残基を加える手段も提供し、その後に修飾した糖をペプチドの少なくとも1つの選択したグリコシル残基に結合させる。本態様は例えば、修飾された糖を、ペプチド上には存在しないか、または望ましい量で存在しないいずれかの選択したグリコシル残基に結合させることが望ましい時に有用である。このように修飾された糖をペプチドにカップリングさせる前に、選択したグリコシル残基を酵素または化学的カップリングによりペプチドに結合させる。別の態様ではペプチドのグリコシル化パターンは、ペプチドから炭水化物残基を除去することにより修飾された糖の結合前に改変させる。例えば国際公開第98/31826号パンフレットを参照にされたい。
ペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の付加または除去は、化学的にまたは酵素的に行う。化学的な脱グリコシル化は好ましくはペプチド変異体を化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物に暴露することにより行われる。この処理は連結糖(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)を除くほとんどすべての糖の開裂をもたらすと同時に、ペプチドは完全なままである。化学的な脱グリコシル化は、Hakimuddin et al/.1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52およびEdge et al.,1981,Anal.Biochem.118:131に記載されている。ペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により、Thotakura et al.,1987,Meth.Enzymol.138:350に記載されているように行うことができる。
グリコシル部分の化学的付加は、任意の技術的に認識されている方法により行う。糖部分の酵素的付加は好ましくは本明細書に説明する方法の変法を使用して行い、天然のグリコシル単位を本発明で使用する修飾された糖に置換する。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第5,876,980号、同第6,030,815号、同第5.728,554号および同第5,922,577号明細書に開示されている。
選択されたグリコシル残基の結合点の例には、限定するわけではないが:(a)N−およびO−結合グリコシル化の部位;(b)グリコシルスランスフェラーゼの受容体である末端グリコシル部分;(c)アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン;(d)遊離カルボキシル基;(e)システインのもののような遊離スルフヒドリル基;(f)セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基;(g)フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもののような芳香族残基;あるいは(h)グルタミンのアミド基を含む。本発明での使用法の例は、1987年9月11日に公開された国際公開第87/05330号パンフレットおよびAplin and Wriston CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259−306(1981)に記載されている。
本明細書で提供する幾つかの図面に示す例を特に扱って、ペプチド上に所望のグリカンを生産するためのインビトロ酵素反応の順序に関する説明をこれから与える。以下に開示する各酵素転換の正確な反応条件は糖生物学の当業者には周知であり、故にここでは繰り返さない。このような種類の反応に関する反応条件の総説は、Sadler et al.,1982,Methods in Enzymology83:458−514およびそれに引用されている文献を参照にされたい。
図2では、左側に基本的なトリマンノシルコアグリカンの構造を示す。この構造は、基本的なトリマンノシルコア構造をGnT−I、続いてGnT−II、そしてさらにGnT−III、およびUDP−GlcNAcを含んでなる糖供与体の存在下でインキューベーションすることにより、バイセクティングGlcNAcを有する完全なグリカン構造に転換することが可能であり、ここでGlcNAcは順次、基本的なトリマンノシルコア構造に付加されてバイセクティングGlcNAcを有するトリマンノシルコアを生成する。
図4では、バイセクティングGlcNAcを含むトリマンノシルコアグリカンの、ガラクトースおよびN−アセチルノイラミン酸を含んでなる複雑なグリカン構造への転換を示す。バイセクティングGlcNAcを含むトリマンノシルコアグリカンを最初にガラクトシルトランスフェラーゼおよび供与体分子としてUDP−Galとインキューベーションし、ここで2個のガラクトース残基が分子上の周辺GlcNAc残基に加えられる。次いで酵素NeuAc−トランスフェラーゼを使用して2個のNeuAc残基を1から各ガラクトース残基に加える。
図5では、高マンノースグリカン構造の基本的なトリマンノシルコアグリカンへの転換を示す。高マンノースグリカン(Man9)はマンノシダーゼ1の存在下で順次インキューベーションされて、Man5構造を生成し、そして次にマンノシダーゼ3の存在下でインキューベーションされて、すべて、しかし3個のマンノース残基を残してグリカンから除去される。あるいはMan9構造のインキューベーションは、単にマンノシダーゼ3の存在下でのインキューベーションによりトリマンノシルコア構造のみに戻し改作されてもよい。上記図2および4に提示するスキームに従い、次にこの基本的なトリマンノシルコアグリカンの複雑なグリカン分子への転換が可能である。
図6では、植物細胞により生産される典型的な複雑なN−結合グリカン構造を示す。植物細胞がGnT−I酵素活性を欠く時、キシロースおよびフコースはグリカンに付加されることはできないことに注目することが重要である。すなわちGnT−Iノック−アウト細胞の使用は、これらの細胞がどのような「戻し改作」反応を行うことなくさらなる糖を付加することができる基本的なトリマンノシルコアを有するペプチドを生産する点で本発明に特定の利点を提供する。同様に、植物細胞中で生産される構造がグリカンのMan5変形物であり、GnT−Iがこれらの細胞に存在しなければ、キシロースおよびフコースはこの構造に付加されることができない。この場合、マンノシダーゼ3を使用してMan5構造を基本的なトリマンノシルコア(Man3)に戻し改作することができる。本明細書に提供する方法に従い、今、所望する糖部分をトリマンノシルコアに付加して所望するグリカン構造を生成することが可能である。
図7では、昆虫細胞で生産される典型的な複雑なN−結合グリカン構造を示す。明らかに、例えばフコースのようなさらなる糖も存在する。さらにここでは示さないが、昆虫細胞は9個ものマンノース残基を有する高マンノースグリカンを生産することができ、そしてそれに結合したさらなる糖を含むかもしれない。昆虫細胞ではGnT−Iノックアウト細胞がフコース残基をグリカンに付加することを妨げる場合もある。このように昆虫細胞中でのペプチドの生産は、好ましくはGnT−Iノックアウト細胞で達成される。このようにして生産されたグリカンは、次いで必要ならば本明細書に記載する任意の方法およびスキームを使用してインビトロで戻し改作されることができ、そしてさらなる糖を本明細書に提供する方法およびスキームを使用してインビトロでそれらに加えてもよい。
図3では、様々な完成段階のグリカン構造を示す。特にバイセクティングGlcNAc残基を含まない複雑な炭水化物グリカン構造から基本的なトリマンノシルコア構造のインビトロの酵素的生成を示す。またそれらからのバイセクティングGlcNAcを含むグリカン構造の生成を示す。生産することができる幾つかの中間体グリカン構造を示す。これらの構造は細胞により生産されることができ、あるいは本明細書に記載するインビトロ戻し改作反応で生産されることができる。糖部分はインビトロで基本的なトリマンノシルコア構造に、または所望するグリカンを生産するために任意の適当な中間体構造に付加することができる。
図8では、高マンノース構造から始まるグリカンを戻し改作またはそれに付加するために行うことができる一連の可能なインビトロ反応を示す。例えばMan9グリカンはマンノシダーゼ1を使用して改作してMan5グリカンを生成するか、あるいはこれはマンノシダーゼ3または1以上の微生物マンノシダーゼを使用してトリマンノシルコアに改作してもよい。次いでGnT−IおよびまたはGnT−IIを使用してさらなるGlcNAc残基をグリカンに転移することができる。さらにグリカン分子がGnT−Iを持たない細胞中で生産される時には起こらない状況を示す(影を付けた箱を参照にされたい)。例えばフコースおよびキシロースは、GnT−Iが活性であり、そしてGlcNAcの分子への転移を促進する時にのみグリカンに付加され得る。
図9はトリマンノシルコア構造から始まり、2アンテナ、3アンテナそしてさらには4アンテナグリカン構造を合成するための周知法を表す。本発明の方法に従い、これらの各構造は糖生物学の分野で周知の適切な酵素および反応条件を使用して、インビトロで合成することが可能である。
図10では、トリマンノシルコア構造から始まり、さらにより一層複雑な炭水化物構造を合成するためのスキームを示す。例えばシアリル化されていてもいなくてもよいルイスxおよびルイスa抗原構造をインビトロで生産するためのスキームを示す。そのような構造はペプチド上に存在する時、免疫応答をアップレギュレート(upregulating)またはダウンレギュレート(downregulating)するために免疫学的な利点をペプチドに付与することができる。さらにそのような構造は、これらの構造の型が細胞接着ペプチド等への結合に関与するので、ペプチドを特異的な細胞に標的化するためにも有用である。
図11はセリンまたはトレオニンから始まる多くのO−結合ペプチドを調製するための例示スキームである。
図12はコア1から4と名付けられた4種類のO−結合グリカン構造を表す一連の図解である。コア構造は点線で囲む。この構造に含むことができる糖には、ガラクトース残基に加えられたシアル酸残基およびGlcNAc残基に加えられたフコース残基を含む。
このように好適な態様では、本発明は基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造が結合する単離および精製された糖ペプチドを提供し、この糖ペプチドをグリコシルトランスフェラーゼ酵素およびグリコシル部分を有する供与体分子と、グリコシル部分を糖ペプチドに転移させるために適する条件下で接触させることにより、N−結合グリコシル化糖ペプチドを作成する方法を提供する。次に所望のグリコシル化パターンを有するペプチドを生産するためのトリマンノシルコア糖ペプチドまたはMan3GlcNAc4糖ペプチドのカスタマイズ化が、当該技術分野で周知の技術を使用して所望の糖部分の順次付加により達成される。
グリカン1次構造の決定
N−結合糖ペプチドが細胞により生産される時、本明細書のいたるところで記載するように、これは他の糖部分をそれに付加する前に共通の、一般的には基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少されなければならないグリカン構造の異種の混合物を含んでなるかもしれない。どの糖を特定のグリカン構造から除去するべきであるかを正確に決定するために、1次グリカン構造を同定することが必要となる場合がある。グリカンの1次構造を決定するための技術は当該技術分野では周知であり、そして例えばMontreuil、「糖ペプチドの構造および生合成(Structure and Biosynthesis of Glycopeptides)」、医学的応用における多糖(Polysaccharides in Medicinal Applications)、第273〜327頁、1996、Severian Damitriu編集、マルセルデッカー、ニューヨーク州、に詳細に記載されている。したがって糖生物学の分野の当業者には、細胞により生産されたペプチド群を単離し、そしてそれに結合しているグリカンの構造(1つまたは複数)を決定することは単純な事柄である。例えば(i)加水分解、アセトリシス、ヒドラジン分解のような化学的開裂により、または亜硝酸のデアミネーションによりいずれかでグリコシド結合を分解し(splitting);(ii)メチル化を完成し、続いて加水分解またはメタノリシスを行い、そして部分的にメチル化された単糖のガス−液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行い;そして(iii)エキソグリコシダーゼを使用して単糖間のアノマー結合を決定し、これはまた順次分解により1次グリカン構造の洞察も提供するための効率的な方法を利用することができる。特に質量分析および核磁気共鳴(NMR)分光法の技術、特に高磁場NMRはグリカン1次構造を決定するために成功裏に使用されてきた。
炭水化物分析用のキットおよび装置も市販されている。フルオロフォア支援炭水化物電気泳動(Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis:FACE(商標))は、グリコ(Glyko)社(ノバト、カリフォルニア州)から販売されている。FACE分析では、N−結合グリカンに関してはエンドHまたはN−グリカナーゼ(PNGaseF)のいずれかを用いて、あるいはSer/Thr結合グリカンに関してはヒドラジンを用いて、ペプチドから複合糖質が放出される。次いでグリカンは還元末端でフルオロフォアにより非−構造識別様式で標識される。フルオロフォアで標識したグリカンは次いでポリアクリルアミドゲルでサッカリドの荷電/質量比ならびに流体力学的容量に基づき分離される。像をUV光の下で取り、そしてグリカンの組成は標準と比較した移動距離により決定される。オリゴ糖はエキソグリコシダーゼ消化によりサッカリドの順次除去による移動シフトを分析することにより、この様式で配列決定することができる。
例示態様
N−結合グリコシル化の改造は、式1:
Figure 0006321724
式中、X、X、X、X、XおよびX17は、(独立して選択された)単糖またはオリゴ糖残基であり;そして
a、b、c、d、eおよびxは(独立して選択された)0、1または2であるが、ただしa、b、c、d、eおよびxから選択される少なくとも1つの員は1または2である、を参照にして最もよく説明される。
式1はトリマンノシルコアを含んでなる、好ましくはペプチド骨格のアスパラギン残基に共有結合しているグリカン構造を記載する。好適な発現系は、トリ−マンノシルコアを含んでなるN−結合グリカンを含む外因性のペプチドを発現し、そして分泌する。本発明の改造方法を使用して、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造に都合よく改造することができる。例示的な反応条件は、実施例および参考文献全体に見いだされる。
好適な態様では、式1に記載するグリカンは構造が特異的な決定基を有するように改造される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい生物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去し、またはとりわけ天然のペプチドのグリコシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
第1の好適な態様では、ペプチドN−結合グリカンを改造して天然のヒトのタンパク質のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
およびX=|−GlcNAc−Gal−SA;
aおよびc=1;
d=0または1;
b、eおよびx=0
を有するように改造される。
この態様は異質な細胞発現系で発現するヒトペプチドに特に有利である。N−結合グリカン構造をこの立体配置に改造することにより、ペプチドはとりわけヒト患者中での免疫原性が低くなり、かつ/またはより安定となる。
第2の好適な態様では、ペプチドN−結合グリカンがトリ−マンノシルコア上にバイセクティングGlcNAc残基を有するように改造される。この態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
およびXは|−GlcNAc−Gal−SA;
aおよびc=1;
がGlcNAcであり;
b=1;
d=0または1;
eおよびx=0
を有するように改造される。
この態様は異質な細胞系で発現する組換え抗体分子に特に有利である。抗体分子がFc−媒介型細胞傷害性を含む時、Fcドメインに結合したバイセクティングオリゴ糖の存在が抗体−依存性の細胞傷害性を著しく増すことが知られている。
第3の好適態様では、ペプチドN−結合グリカンがシアリル化ルイスX部分を有するように改造される。この態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
およびX
Figure 0006321724
であり;
a、c、d=1;
b、eおよびx=0;
=フコース
を有するように改造される。
この態様は改造されるペプチドがセレクチン分子およびそれを発現する細胞を標的にすることを意図する時に特に有利である。
第4の好適な態様では、ペプチドN−結合グリカンが結合部分を有するように改造する。この結合部分は、とりわけPEG分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。この態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
およびXは|−GlcNAc−Gal−SA−R;
aおよびc=1または2;
d=0または1;
b、d、eおよびx=0;
ここでR=結合基
を有するように改造される。
結合部分は、とりわけPEG分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。したがってこの態様はペプチドを、患者の血流からペプチドの排除を遅らせるPEG分子に、両ペプチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使用の別のペプチドに結合させるために有用である。
当業者には本発明が上記の好適なグリカン分子に限定されないことは明らかであろう。
好適態様は本発明の改造方法により作成することができる多くの有用なグリカン分子のわずか2〜3である。当業者は他の有用なグリカンをどのように設計するかを知っているだろう。
第1の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いCHO(チャイニーズハムスター卵母細胞系)で発現させる。N−結合グリカンの共通(consensus)部位を持つペプチドがCHO細胞から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカンは図3の上段に表す構造を有する。これらすべての構造が存在することができるが、断然最も多くの構造は右側の2つである。式1の用語において、
およびXは|−GlcNAc−Gal−(SA)であり;
aおよびc=1;
b、d、eおよびx=0
である。
したがって1つの例示態様では、CHO細胞で発現するペプチドのN−結合グリカンは、ペプチドをガラクトース受容体分子およびシアル酸供与体分子に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと接触させることにより、好適なヒト化グリカンに改造する。この工程を図3および実施例2で具体的に説明する。別の例示態様では、CHO細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのN−結合グリカンを、好適なPEG化構造に改造する。ペプチドを最初にシアル酸に特異的なグリコシダーゼと接触させて末端SA部分を除去し、そして次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼとPEG−シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の存在下で接触させる。場合によりペプチドは次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の存在下で接触させて、すべてのグリカン分子の完全なSAキャッピングを確実とする。
他の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いSF−9細胞系のような昆虫細胞中で発現させる。N−結合グリカンと共通部位を持つペプチドがSF−9細胞から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカンは図7の上段に表す構造を有する。式1の用語において:
およびXは|−GlcNAcであり;
aおよびc=0または1;
b=0;
はフコースであり;
d=0、1または2;そして
eおよびx=0
である。
トリマンノースコアは昆虫細胞により作られるN−結合グリカンのほとんどすべてに存在し、そして時折、アンテナGlcNAcおよび/またはフコース残基(1つまたは複数)も存在する。1つの例示態様では、昆虫細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのN−結合グリカンは、最初にグリカンをフコース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させ、次いでグリカンをトリマンノースコアの各アンテナ上のマンノース受容体分子、GlcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GlcNAc分子の存在下で接触させ;次いでグリカンをGlcNAc受容体分子、Gal供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gal分子の存在下で接触させ;そして次にグリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−SA分子の存在下で接触させることにより好適なヒト化グリカンに改造される。当業者は存在するならばフコース分子はこの方法の任意の時点で除去できると考えるだろう。別の例示態様では、前例のヒト化グリカンはグリカンをGlcNAc受容体分子、フコース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼとヌクレオチド−フコース分子の存在下で接触させることにより、シアリル化ルイスXグリカンにさらに改造する。この工程は図10および実施例3で具体的に説明する。
さらに他の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従いサッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母で発現させる。N−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがS.セルビシエ(cerevisiae)細胞から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカンは図5の左に表す構造を有するだろう。N−結合グリカンは常にトリマンノシルコアを有し、これはしばしばマンノースまたは関連する多糖を用いて1000残基まで合成される。式1の用語において、
およびX=|−Man−Man−(Man)0−1000
aおよびc=1または2;
b、d、eおよびx=0
である。
1つの例示態様では、酵母細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのN−結合グリカンは、最初にグリカンをα2マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させ、次にグリカンをα6マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させることにより、基本的なトリマンノースコアに改造される。この工程を図5および実施例6で具体的に説明する。別の例示態様では、N−結合グリカンは、基本的なトリマンノースコアグリカンをトリマンノースコアの各アンテナ上のマンノース受容体分子、GlcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GlcNAc分子の存在下で接触させ;次いでグリカンをトリマンノースコアの真ん中のマンノース受容体分子、GlcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GlcNAc分子の存在下で接触させ;次いでグリカンをGlcNAc受容体分子、Gal供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gal分子の存在下で接触させ;そして次にグリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−SA分子の存在下で接触させることにより、Fc媒介型の細胞毒性機能を持つ組換え抗体に適するグリカンを作成するためにさらに改造される。
この工程は図2、3および4で具体的に説明する。
別の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い細菌細胞、特に大腸菌(E.coli)細胞で発現させる。N−結合グリカンの共通部位を持つペプチドが(E.coli)細胞で発現する時、N−結合共通部位はグリコシル化されない。例示態様では、ヒト化グリカン分子はペプチドをN−結合共通部位およびGlcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチドGlcNAcの存在下で接触させ;そしてさらに成長しているグリカンを受容体および供与体部分に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、必要な供与体部分の存在下で所望のグリカン構造が完成するまで順次接触させることにより、ペプチド骨格から構築される。N−結合グリカンを持つペプチドが真核細胞で発現するが、新生ペプチドをゴルジ装置に向ける正しいリーダー配列が無い時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もペプチドは前述のペプチドN−結合共通部位から構築することにより、N−結合グリコシル化を与えることができる。タンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時、タンパク質を前述のように構築することができる。
これらの例は本発明を具体的に説明するものであり、そして本発明を限定するものではないことを意味している。当業者は各例で取られる工程が状況によっては異なる順序で行われ、同じ結果を得ることができると考えるだろう。また当業者は、異なる工程の組が同じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。好適な改造されたグリカンはペプチドが発現される発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造されたグリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載していないグリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれらを種々の発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
B.O−結合グリカンの改造方法
O−グリコシル化は種々の単糖がO−グリコシド結合でヒドロキシアミノ酸へ結合していることが特徴である。O−グリコシル化は動物および植物界で広く行き渡った翻訳後修飾である。タンパク質にO−結合したグリカンの構造的複雑さは、N−結合グリカンのそれをはるかに越える。新たに翻訳されたペプチドのセリンまたはトレオニン残基は、ペプチドのGalNAcトランスフェラーゼによりゴルジのシスからトランス区画で修飾されるようになる。O−グリコシル化の部位はグリコシルトランスフェラーゼの配列特異性により決定されだけでなく、異なる基質部位間の競合およびグリカンを形成する原因となる他のグリコシルトランスフェラーゼとの競合により媒介される後成的調節によっても決定される。
O−結合グリカンは任意に3つの領域:コア、骨格領域および周辺領域を有すると任意に定義された。O−結合グリカンの「コア」領域はペプチドに近いグリカン鎖の最も内側の2または3つの糖である。骨格領域は単一な延長により形成されたグリカン鎖の長さに主に貢献している。周辺領域は高度な構造の複雑性を現す。O−結合グリカンの構造的複雑さはコア構造から始まる。多くの場合で、O−結合グリカン共通部位に加えた第1の糖残基はGalNAcであり;しかし糖は中でもGlcNAc、グルコース、マンノース、ガラクトースまたはフコースでもよい。図11は既知のO−結合グリカンコア構造およびそれらのインビボ合成の原因となる酵素の図解である。
哺乳動物細胞では、少なくとも8つの異なるO−結合コア構造が見いだされ、すべてコア−α−GalNAc残基に基づく。図12に表す4つのコア構造が最も一般的である。
コア1およびコア2は哺乳動物細胞で最も豊富な構造であり、そしてコア3およびコア4はより限定された、器管−特徴的発現系で見いだされる。O−結合グリカンはMontreuil、糖ペプチドの構造および合成(Structure and Synthesis of Glycopeptides)、医学的応用における多糖(Polysaccharides in Medicinal Applications)で、第273−327頁、1996、Severian Damitriu編集、マルセルデッカー、ニューヨーク州、およびSchachter and Brockhausen、分岐O−結合グリカンの生合成(The Biosynthesis of Branched O−Linked Glycans)、1989、実験生物学会、第1〜26頁(英国)で総説されている。
本開示からO−グリコシル化ペプチドのグリカン構造は、N−結合グリカンについて記載したものに類似の技術を使用して改造できることは明らかであろう。O−グリカンはアスパラギン残基ではなくセリンまたはトレオニン残基に結合している点でN−グリカンとは異なる。N−グリカンの改造に関して本明細書に記載するように、加水分解酵素を使用してO−結合グリカン中の望ましくない糖部分を開裂し、そして次にさらに望ましい糖をそれらに付加して、カスタマイズされたO−グリカン構造をペプチド上に構築することができる(図11および12を参照にされたい)。
哺乳動物細胞におけるO−グリコシル化の最初の段階は、各々が限定された受容体ペプチド特異性を有する少なくとも11種の既知のα−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの任意のファミリーを使用したN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)の結合である。一般に各酵素により認識される受容体ペプチドは少なくとも10個のアミノ酸の配列を構成する。1つの特定のGalNAc−トランスフェラーゼにより認識されるアミノ酸配列を含むペプチドは、それらがこの酵素を発現している細胞中で発現し、そしてそれらがUDP−GalNAcも存在するゴルジ装置に適切に局在するならば、この受容体部位でO−グリコシル化されるようになる。
しかし組換えタンパク質の場合、最初のGalcNAcの結合は起こらないかもしれない。発現している細胞に天然なα−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ酵素は、組換えペプチドが発現している細胞とは異なる共通配列特異性を有するかもしれない。
所望の組換えペプチドは、グリカン鎖を合成しない大腸菌(E.coli)のような細菌細胞できる発現させることができる。これらの場合、最初のGalNAc部分をインビトロで付加することが有利である。GalNAc部分は、いったん組換えペプチドが可溶性の状態で回収されれば、ペプチドを適切なGalNAcトランスフェラーゼとUDP−GalNAcの存在下で接触させることによりインビトロでペプチドに導入することができる。
1つの態様では、O−結合糖を転移されるために効果的な受容体を構成するアミノ酸のさらなる配列が存在し得る。そのようなアミノ酸配列はペプチドのコード配列に対する枠内で融合したDNA配列によりコードされるか、または化学的手段により導入してもよい。あるいはペプチドはグリカン鎖を欠いているかもしれない。場合によりペプチドはN−および/またはO−結合グリカン鎖を有することができるが、例えばさらなるグリカン置換を望む時、さらなるグリコシル化部位が必要である。
例示態様では、アミノ酸配列PTTTK−COOH(これはヒトのムチンMUC−1中の天然なGalNAc受容体配列である)を融合タグとして加える。次いで融合タンパク質は大腸菌(E.coli)中で発現し、そして精製される。次いでペプチドを組換えヒトGalNAc−トランスフェラーゼT3またはT6と、UDP−GalNAcの存在下で接触させてGalNAc残基をペプチドにインビトロで転移させる。
このペプチド上のグリカン鎖は、次いでN−結合またはO−結合グリカンに関して本明細書に記載した方法を使用してさらに延長することができる。あるいはGalNAcトランスフェラーゼ反応は、O−3、4または6位あるいはN−2位でPEGに共有的に置換されるUDP−GalNAcの存在下で行うことができる。複合糖質化(Glycoconjugation)は本明細書のいたるところで詳細に記載する。新たなペプチド配列によりペプチドに導入される抗原性は、結合するグリカンのPEG化により都合よく遮蔽することができる。受容体部位融合技術はPEG部分を導入するだけでなく、限定するわけではないがトキシン、抗−感染剤、細胞傷害剤、放射性核種のキレーターおよび組織ターゲッティングのような他の官能性を有するグリカンを含む他のグリカンおよび非−グリカン部分を導入するためにも使用することができる。
例示態様
O−結合グリコシル化の改造は、式2を参照にして最もよく具体的に説明される:
Figure 0006321724
式2は、好ましくはペプチド骨格上のセリンまたはトレオニン残基に共有結合しているGalNAcを含んでなるグリカン構造を記載する。この構造はO−結合グリカンの最も普通の形態を具体的に説明するために使用するが、本発明はこれらO−結合グリカンに単に限定されると解釈されるべきではない。O−結合グリカンの他の形態は図11に具体的に説明する。本発明に有用な好適な発現系は、GalNAc残基を含んでなるO−結合グリカンを有する外因性ペプチドを発現し、そして分泌する。本発明の改造方法を使用して、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造を生成するために都合よく改造することができる。当業者はいったん本開示から着手すれば、当該技術分野で利用可能なものと同じ原理、酵素および反応条件を使用してO−結合グリカンを改造できると考えるだろう。例示的な反応条件は、実施例中に見いだされる。
好適な態様では、グリカン構造は式2に記載する構造が特異的な部分を有するように改造される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい生物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去または改変させ、または天然のペプチドのグリコシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
第1の好適な態様では、ペプチドO−結合グリカンを改造して天然のヒトのタンパク質のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式2に記載するグリカン構造が以下の部分:
は|−SA;または|−SA−SAであり;
fおよびn=0または1;
10はSAであり;
m=0
を有するように改造される。
この態様は異質な細胞発現系で発現するヒトペプチドに特に有利である。O−結合グリカン構造をこの立体配置を有するように改造することにより、ペプチドはヒト患者中での免疫原性が低くなり、かつ/またはより安定となる。
別の好適な態様では、ペプチドO−結合グリカンはシアリル化ルイスX抗原を表すように改造される。この態様では、式2に記載するグリカン構造が以下の部分:
は|−SAであり; X10はFucまたは|−GalNAc(Fuc)−Gal−SAであり;
fおよびn=1;
m=0
を有するように改造される。
この態様は改造されるペプチドがセレクチン分子を標的とし、そして細胞がそれを発現している時に最も効果的である時、特に有利である。
さらに別の好適な態様では、ペプチドO−結合グリカンは結合部分を含むように改造される。この結合部分は、とりわけPEG分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。この態様では、式2に記載するグリカン構造が下の部分:
は|−SA−Rであり;
f=1;
nおよびm=0
ここでRは結合基である
を有するように改造される。
この態様はペプチドを、患者の血流からペプチドの排除を遅らせるPEG分子に、両ペプチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使用の別のペプチドに結合させるために有用である。
当業者には本発明が上記の好適なグリカン分子に限定されないことは明らかであろう。
好適態様は本発明の改造方法を使用して作成することができる多くの有用なグリカン分子のわずか2〜3である。当業者はいったん本発明から着手すれば他の有用なグリカンをどのように設計するかを知るだろう。
第1の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従いCHO(チャイニーズハムスター細胞系)で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがCHO細胞から発現され、そして分泌される時、O−結合グリカンの大部分が式2の用語において、
=|−SA;
f=1;
mおよびn=0
である構造を有することが多い。
したがってCHO細胞中のほとんどのグリカンは、ヒト患者での使用に許容され得るために改造を必要としない。別の例示態様では、CHO細胞から発現され、そして分泌されるペプチドのO−結合グリカンは、グリカンをGalNAc受容体部分およびフコース供与体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存在下で接触させることにより、シアリル化ルイスX構造を含むように改造される。この工程は図10および実施例3でN−結合グリカンに関して具体的に説明している。
他の例示態様では、ペプチドを当該技術分野で周知の方法に従いsf9のような昆虫細胞中で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがほとんどのsf9細胞から発現され、そして分泌される時、O−結合グリカンの大部分は式2の用語において、 X=H;
f=0または1;
nおよびm=0
である構造を有する。
例えばMarchal et al.,(2001,Biol.Chem.382:151−159)を参照にされたい。1つの例示態様では、昆虫細胞で発現されるペプチド上のO−結合グリカンは、グリカンをGalNAc受容体分子およびガラクトース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Galの存在下で接触させ;そして次にグリカンをGal受容体分子およびSA供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼとヌクレオチド−SAの存在下で接触させることにより、ヒト化グリカンに改造される。別の例示態様では、O−結合グリカンをさらにヒト化形態から、グリカンをさらにGalNAc受容体分子およびフコース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存在下で接触させることにより、シアリル化ルイスX形態に改造する。
さらに他の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い真菌細胞、特にS.セルビシエ(cerevisiae)細胞で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがS.セルビシエ(cerevisiae)細胞から発現され、そして分泌される時、ほとんどのO−結合グリカンは構造:
|−AA−Man−Man1−2
を有する。Gemmill and Trimble(1999,Biochim.Biophys.Acta 1426:227−237)を参照にされたい。このようなO−結合グリカンをヒトでの使用に改造するために、グリカンをアミノ酸レベルで開裂し、そしてここから再構築することが好ましい。
1つの例示態様では、グリカンは真菌細胞で発現されるペプチド上のO−結合グリカンであり、そしてグリカンをアミノ酸−GalNAc結合に特異的なエンドグリコシダーゼと接触させ;そして次いでグリカンをO−結合共通部位およびGalNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GalNAcの存在下で接触させ;グリカンをGalNAc受容体分子およびガラクトース供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Galの存在下で接触させ;そして次にグリカンをGal受容体分子およびSA供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−SAの存在下で接触させることにより、ヒト化グリカンに改造する。
あるいは別の例では、グリカンは真菌細胞で発現されるペプチド上のO−結合グリカンであり、そしてグリカンをタンパク質O−マンノースβ−1,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(POMGnTI)と、GlcNAc−ヌクレオチドの存在下で接触させ;次いでグリカンをヌクレオチド−Galの存在下でガラクトシルトランスフェラーゼと接触させ;そして次にグリカンをヌクレオチド−SAの存在下でシアリルトランスフェラーゼと接触させることによりヒト化グリカンに改造する。
別の例示態様では、ペプチドは当該技術分野で周知の方法に従い細菌細胞、特に大腸菌(E.coli)細胞で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドが(E.coli)細胞で発現する時、O−結合共通部位はグリコシル化されない。この場合、所望するグリカン分子は上記のS.セルビシエ(cerevisiae)について記載した様式に準じて、ペプチド骨格から構築しなければならない。さらにO−結合グリカンを有するペプチドが新生ペプチドをゴルジ装置に向けるための正しいリーダー配列無しで真核細胞で発現する時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もO−結合グリコシル構造は、グリカンをペプチドO−結合共通部位から直接構築することによりペプチドに加えることができる。さらにタンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時、タンパク質は前述のように改造される。
これらの例は本発明を具体的に説明するものであり、そして本発明を限定するものではないことを意味している。当業者は同じ結果を得るために各例で取られる工程を状況によっては異なる順序で行うことができると考えるだろう。また当業者は異なる工程の組が同じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。さらに好適な改造されたグリカンはペプチドが発現する発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造されたグリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載していないグリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれらを異なる発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
C.複合糖質化(Glycoconjugation)、総論
本発明はグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの結合物の調製法を提供する。本発明の結合物はペプチドと水溶性ポリマー、治療部分、診断部分、標的部分等のような多様な種との間で形成される。また提供されるのはリンカーアーム(linker arm)を介して一緒に連結された2以上のペプチドを含む結合物、すなわち多機能性結合物(multifunctional conjugate)である。本発明の多機能性結合物は、同じペプチドの2以上のコピー、または異なる構造および/または特性を持つ多様なペプチドの集合を含むことができる。
本発明の結合物は、修飾された糖のグリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの酵素的結合により形成される。修飾された糖はペプチドと糖上の修飾基との間に挿入された時、本明細書でのいわゆる「完全なグリコシル連結基」となる。グリコシルトランスフェラーゼのような酵素の優れた選択性を使用して、本方法は1以上の特異的な位置に所望する基を持つペプチドを提供する。すなわち本発明に従い、修飾された糖はペプチド鎖上の選択された位置に直接結合させられるか(attached)、あるいは修飾された糖はペプチドの炭水化物部分につけられる(appended)。修飾された糖がペプチド炭水化物に、およびペプチド骨格のアミノ酸残基に直接、両方で結合したペプチドも本発明の範囲内である。
既知の化学的および酵素的なペプチドの合成(elaboration)法とは対照的に、本発明の方法はペプチドおよび実質的に均一な誘導化パターンを有する糖ペプチドを集成させることが可能であり;本発明で使用する酵素は、一般にペプチドの特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせに選択的である。この方法はまた修飾されたペプチドおよび糖ペプチドの大規模生産にも現実的である。このように本発明の方法は前以て選択された実質的に単一な誘導化パターンを有するペプチドの大規模調製のための現実的手段を提供する。この方法は限定するわけではないが、細胞培養細胞(例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、酵母細胞または原核細胞)またはトランスジェニック植物または動物中での生産中に不完全にグリコシル化されたペプチドを含め、治療用ペプチドの修飾にも特によく適している。
本発明の方法は、例えば排除速度の低下または免疫もしくは細網内皮系(RES)による取り込み率の低下により、上昇した治療的半減期を有するグリコシル化および非グリコシル化ペプチドの結合物も提供する。さらに本発明の方法はペプチド上の抗原決定基を遮蔽するための手段を提供し、これがペプチドに対する宿主免疫応答を下げるか、または排除する。標的剤の選択的結合を使用して、ペプチドを特定の標的剤に特異的な特定の組織または細胞表面レセプターを標的とするためにも使用できる。さらに治療部分を用いて特異的に修飾された種類のペプチドを提供する。
1.結合物(conjugate)
第1の観点では、本発明はペプチドと選択部分との間に結合物を提供する。ペプチドと選択部分との間の連結には、ペプチドと選択部分の間に挿入された完全なグリコシル連結基を含む。本明細書で検討するように、選択部分は、サッカリド単位に結合することができる本質的には任意の種であり、ペプチドに修飾された糖を付ける適切なトランスフェラーゼ酵素により認識される「修飾された糖」を生じる。修飾された糖のサッカリド成分は、ペプチドと選択部分との間に挿入された時、「完全なグリコシル連結基」となる。このグリコシル連結基は、選択部分を用いた修飾後に適切なトランスフェラーゼの基質となる単−またはオリゴ糖から形成される。
本発明の結合物は典型的には一般構造:
Figure 0006321724
ここで、記号a、b、c、dおよびsは正のゼロではない整数を表し;そしてtは0または正の整数である、
に相当する。「作用物質(agent)」は治療薬、生物活性剤、検出可能な標識、水溶性部分等である。この「作用物質」はペプチド、例えば酵素、抗体、抗原等であることができる。リンカーは任意の広い配列の上記連結基であることができる。あるいはリンカーは単結合または「ゼロ次リンカー(zero order linker)」でもよい。
ペプチドの同一性には限界がない。ペプチドの例を図1に提供する。
例示態様では、選択部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは完全なグリコシル連結基を介してペプチドに共有結合する。グリコシル連結基はペプチド上のアミノ酸残基またはグリコシル残基のどちらかに共有結合する。あるいはグリコシル連結基は糖ペプチドの1以上のグリコシル単位に結合する。本発明はグリコシル連結基がアミノ酸残基およびグリコシル残基の両方に結合した結合物も提供する。
酵素的に付加される完全なグリコシル連結基を介して形成される結合物を提供することに加えて、本発明はそれらの置換パターンが高度に均一な結合物を提供する。本発明の方法を使用して、本発明の結合物群の全域で本質的にすべての修飾された糖部分が、構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の複数のコピーに結合しているペプチド結合物を形成することが可能である。すなわち第2の観点では、本発明は完全なグリコシル連結基を介してペプチドに共有結合する水溶性ポリマー部分の群を有するペプチド結合物を提供する。本発明の好適な結合物では、本質的に群の各員がグリコシル連結基を介してペプチドのグリコシル残基に結合し、そしてグリコシル連結基が結合するペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有する。
また完全なグリコシル連結基を介してペプチド結合物に共有結合した水溶性ポリマー部分の群を有するペプチド結合物も提供する。好適な態様では、本質的に水溶性ポリマー部分群の各員が完全なグリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基に結合し、そして完全なグリコシル連結基を結合して有する各アミノ酸残基は同じ構造を有する。
また本発明は、ペプチドが完全なグリコシル連結基を介して治療部分、診断部分、標的部分、トキシン部分等に結合した上記のものに類似する結合物を提供する。上に引用した各部分は、低分子、天然ポリマー(例えばペプチド)または合成ポリマーであることができる。
例示態様ではインターロイキン−2(IL−2)が、PEG部分の各末端で完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合させられる(スキーム1)。例えばPEGリンカーの1末端をトランスフェリンに結合する完全なシアル酸リンカーで官能化し、そしてもう1端をIL−2に結合する完全なGalNAcリンカーで官能化する。
別の例示態様ではEPOをトランスフェリンに結合する。別の例示態様ではEPOをグリア由来神経栄養増殖因子(GDNF)に結合する。これらの態様では、各結合は上記のようにPEG部分の各末端に完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してなされる。トランスフェリンはタンパク質を血液脳関門をわたって移動させる。
本明細書に添付する図面で説明するように、本発明の結合物は単−または多−価である(例えばアンテナ構造)完全なグリコシル連結基を含むことができ、図13〜21を参照にされたい。本発明の結合物はセリンまたはトレオニンから始まるO−結合グリカンであるグリコシル連結基も含む(図10)。このように本発明の結合物は、選択部分が単価のグリコシル連結基を介してペプチドに結合している両方の種を含む。また本発明の範囲内に含まれるのは、1より多くの選択部分が多価連結基を介してペプチドに結合している結合物も含む。1以上のタンパク質を一緒に結合して、それらの生物物理的および生物学的特性を利用することができる。
さらなる態様では、本発明は結合物の成分として標的剤の存在により、特定の組織中に選択的に局在する結合物を提供する。例示態様では、標的剤はタンパク質である。タンパク質の例にはトランスフェリン(脳、血液プール)、ヒト血清(HS)−糖タンパク質(骨、脳、血液プール)、抗体(脳、抗体−特異的抗原を含む組織、血液プール)、凝固第V−XII因子(損傷組織、凝血、ガン、血液プール)、血清タンパク質、例えばα−酸性糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児タンパク質(脳、血液プール)、β2−糖タンパク質(肝臓、アテローム硬化症斑、脳、血液プール)、G−CSF、GM−CSF、M−CSFおよびEPO(免疫刺激、ガン、血液プール、赤血球過剰生産、神経保護)、およびアルブミン(半減期の上昇)。
上記で検討した結合物に加えて、本発明はこれらのおよび他の結合物を調製する方法を提供する。すなわちさらなる観点では、本発明は選択部分とペプチドとの間の共有結合物を形成する方法を提供する。したがって本発明は本発明の結合物を身体の特定の組織または領域を標的とさせるための方法を提供する。
例示態様では、結合物は水溶性ポリマー、治療部分、標的化部分または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間に形成される。ポリマー、治療部分または生体分子は、間に挿入され、そしてペプチドおよび修飾基(例えば水溶性ポリマー)の両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合させる。この方法はペプチドを、修飾された糖および修飾された糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含む混合物と接触させることを含む。反応は修飾された糖とペプチドとの間に共有結合を形成するために十分な条件下で行う。修飾された糖の糖部分は、好ましくはヌクレオチド糖、活性化糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない糖から選択される。
1つの態様では、本発明は2以上のペプチドを連結基を介して連結するための方法を提供する。連結基は任意の有用な構造であり、そして直−鎖および分岐鎖構造から選択することができる。好ましくはペプチドに結合するリンカーの各末端には、修飾された糖(すなわち新生の完全なグリコシル連結基)を含む。
本発明の方法の例では、2つのペプチドがPEGリンカーを含むリンカー部分を介して一緒に連結される。この構築物は上記の絵で説明する一般構造と同じである。本明細書で記載するように、本発明の構築物は2つの完全なグリコシル連結基(すなわちs+t=1)を含む。2つのグリコシル基を含むPEGリンカーに焦点をあてているのは明瞭さを目的とするものであり、そして本発明のこの態様でのリンカーアームの使用の同一性に限定すると解釈されるべきではない。
このようにPEG部分を第1末端で第1のグリコシル単位を用いて、そして第2末端で第2のグリコシル単位を用いて官能化する。第1および第2のグリコシル単位は好ましくは異なるトランスフェラーゼの基質であり、第1および第2ペプチドのそれぞれ第1および第2グリコシル単位への直交(orthogonal)結合を可能とする。実際には(グリコシル)−PEG−(グリコシル)リンカーを、第1ペプチドおよび第1グリコシル単位が基質である第1トランスフェラーゼと接触させ、これにより(ペプチド)−(グリコシル)−PEG−(グリコシル)を形成する。次いで第1トランスフェラーゼおよび/または未反応ペプチドを場合により反応混合物から除去する。第2ペプチドおよび第2グリコシル単位が基質である第2トランスフェラーゼを、(ペプチド)−(グリコシル)−PEG−(グリコシル)結合物に加え、(ペプチド)−(グリコシル)−PEG−(グリコシル)−(ペプチド)を形成する。当業者は上記に概説した方法が2より多くのペプチド間の結合物を、例えば分岐PEG、樹状物、ポリ(アミノ酸)、多糖等の使用により形成するためにも応用できると考えるだろう。
すでに記載したように例示態様では、インターロイキン−2(IL−2)は、PEG部分の各末端で完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合される(スキーム1)。IL−2結合物は結合物のより大きな分子量サイズにより、IL−2単独よりも上昇したインビボ半減期を有する。さらにIL−2のトランスフェリンへの結合は、結合物が脳を選択的に標的とするために役立つ。例えば、PEGリンカーの1つの末端をCMP−シアル酸を用いて官能化し、そしてもう1端をUDP−GalNAcを用いて官能化する。リンカーはGalNAcトランスフェラーゼの存在下でIL−2と合わせられ、リンカーアームのGalNAcの、IL−2上のセリンおよび/またはトレオニン残基への結合を生じる。
別の例示態様では、トランスフェリンを遺伝子治療に使用するために核酸に結合する。
Figure 0006321724
上記の工程は望みの数のサイクルを通して行うことができ、そして2つのペプチドと1つのリンカーとの間に結合物を形成することに限定されない。さらに当業者はペプチドを含むPEG(または他の)リンカーの末端で完全なグリコシル連結基を官能化する反応が、同じ反応槽中で同時に起こることができるか、あるいはそれらの反応は段階的様式で行うことができると考えるだろう。反応を段階的様式で行う時、各段階で生成される結合物は任意に1以上の反応成分(例えば酵素、ペプチド)から精製される。
さらなる例示態様をスキーム2に説明する。スキーム2は選択したタンパク質、例えばEPOが骨を標的とし、そして選択したタンパク質の循環半減期を上昇させる結合物の調製法を示す。
Figure 0006321724
1以上のペプチド部分をリンカーに結合するために、PEG(または他のリンカー)の反応性誘導体の使用は、本発明の範囲内である。本発明は反応性PEG類似体の同一性に限定されない。ポリ(エチレングリコール)の多くの活性化誘導体が市販されており、そして文献で利用可能である。本発明に有用な基質を調製するために用いる適当な活性化PEG誘導体を選択し、そして必要ならば合成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.,7:175−186(1984);Abuchowski et al.,J.Biol.Chem.,252:3582−3586(1977);Jackson et al.,Anal.Biochem.,165:114−127(1987);Koide et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.111:659−667(1983))、トレシレート(Nilsson et al.,Methods Enzymol.,104:56−69(1984);Delgado et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,12:119−128(1990));N−ヒドロキシスクシンイミド誘導化活性エステル(Buckmann et al.,Makromol.Chem.,182:1379−1384(1981);Joppich et al.,Makromol.Chem.,180:1381−1384(1979);Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.,7:175−186(1984);Katreet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:1487−1491(1987);Kitamura et al.,Cancer Res.,51:4310−4315(1991);Boccu et al.,Z.Naturforsch.,38C:94−99(1983);カーボネート(Zalipsky et al.,ポリ(エチレングリコール)化学:生物工学的および生物医学的応用(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS)、Harris編集、プレナム出版、ニューヨーク、1992、第347−370頁;Zalipsky et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,15:100−114(1992);Veronese et al.,Appl.Biochem.Biotech.,11:141−152(1985));イミダゾリルホルメート(Beauchamp et al.,Anal.Biochem.,131:25−33(1983);Berger et al.,Blood,71:1641−1647(1988));4−ジチオピリジン(Woghiren et al.,Bioconjugate Chem.,4:314−318(1993));イソシアネート(Byun et al.,ASAIO Journal,M649−M−653(1992))およびエポキシド(Noishiki et al.へ発効された米国特許第4,806,595号明細書(1989)を参照にされたい。他の連結基にはアミノ基と活性化PEGとの間のウレタン結合を含む。Veronese,et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,11:141−152(1985)を参照にされたい。
反応性PEG誘導体を利用する別の例示態様では、本発明はペプチドを糸球体によるタンパク質の濾過を遅らせるためにペプチドを、十分なサイズの合成もしくは天然のポリマーに結合させることにより、本質的に血液プールにペプチドを標的させて、選択したペプチドの血液循環半減期を伸ばす方法を提供する(例えばアルブミン)。本発明のこの態様はスキーム3で具体的に説明するが、ここでエリトロポエチン(EPO)を化学的および酵素的修飾の組み合わせを使用してPEGリンカーを介してアルブミンに結合する。
Figure 0006321724
このようにスキーム3で示すように、アルブミンのアミノ酸残基はX−PEG−(CMP−シアル酸)(ここでXは反応性基:例えば活性エステル、イソチオシアネート等)であるような反応性PEG誘導体を用いて修飾される。PEG誘導体およびEPOは合わせられ、そしてCMP−シアル酸が基質であるトランスフェラーゼと接触させる。別の具体的説明の態様では、リシンのε−アミンをPEG−リンカーのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させてアルブミン結合物を形成する。リンカーのCMP−シアル酸はEPO上の適切な残基、例えばGalに酵素的に結合し、これにより結合物が形成する。
当業者は上記の方法が説明した反応パートナーに限定されないと考えるだろう。さらにこの方法は、例えば2以上の末端を有する分岐リンカーを利用することにより2より多くのタンパク質部分を含む結合物を形成するために実施できる。
2.修飾された糖
修飾されたグリコシル供与体種(「修飾された糖」)は好ましくは、修飾された糖ヌクレオチド、活性化された修飾された糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない単なるサッカリドである修飾された糖から選択される。任意の所望する炭水化物構造が本発明の方法を使用してペプチドに加えられる。典型的には構造は単糖であるが、本発明は修飾された単糖の糖の使用に限定されず;オリゴ糖および多糖も有用である。
修飾された基は酵素的手段、化学的手段またはそれらの組み合わせにより糖部分に結合させ、これにより修飾された糖を生成する。糖は修飾部分の結合を可能とする任意の位置で置換されるが、それでもこれは糖を、修飾された糖がペプチドに連結するために使用する酵素の基質として機能することを可能とする。好適な態様ではシアル酸が糖である時、シアル酸はピルビル側の鎖上の9−位または通常はシアル酸中でアセチル化されるアミン部分上の5−位のいずれかで修飾基に置換される。
本発明の特定の態様では、修飾された糖ヌクレオチドが修飾された糖をペプチドに加えるために利用される。本発明の方法において修飾された状態で使用される糖ヌクレオチドの例には、ヌクレオチドモノ−、ジ−またはトリ−ホスフェートまたはそれらの類似体を含む。好適な態様では修飾された糖ヌクレオチドは、UDP−グリコシド、CMP−グリコシドまたはGDP−グリコシドから選択される。さらにより一層好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドは、UDP−ガラクトース、UDP−ガラクトサミン、UDP−グルコース、UDP−グルコサミン、GDP−マンノース、GDP−フコース、CMP−シアル酸またはCMP−NeuAcから選択される。糖ヌクレオチドのN−アセチルアミン誘導体も本発明の方法で使用される。
本発明は、修飾された糖、例えば修飾された−ガラクトース、−フコースおよび−シアル酸を使用して修飾された糖ペプチドの合成法も提供する。修飾されたシアル酸を使用する時、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ(α2,3−結合シアル酸のみ)をこれらの方法に使用することができる。
別の態様では、修飾された糖は活性化された糖である。本発明に有用な活性化された修飾された糖は、典型的には活性化された脱離基を含むように合成的に改変させたグリコシドである。本明細書で使用する用語「活性化された脱離基」は、酵素が調節する求核性置換反応で容易に置き換わる部分を称する。多くの活性化された糖が当該技術分野では知られている。例えばVocadlo et al.,炭水化物の化学および生物学(CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY)、第2巻、Ernst編集、ウィリー−VCHファーラーグ;ヴァインハイム、ドイツ;Kodama et al.,Tetrahedron Lett.34:6419(1993);Lougheed et al.,J.Biol.Chem.274:37717(1999))を参照にされたい。
活性基(脱離基)の例にはフルオロ、クロロ、ブロモ、トシラートエステル、メシラートエステル、トリフラートエステル等を含む。本発明での使用に好適な活性化された脱離基は、グリコシドの受容体への酵素的転移を有意に立体的に妨害しないものである。したがって活性化されたグリコシド誘導体の好適態様には、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシラートを含み、グリコシルフルオリドが特に好適である。グリコシルフルオリドの中でもα−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グリコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアルフルオリド、α−N−アセチルグリコサミニルフルオリド、α−N−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グリコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−N−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−N−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好適である。
具体的説明として、グリコシルフルオリドは最初に糖をアセチル化し、そして次にそれをHF/ピリジンで処理することにより遊離糖から調製することができる。これは保護された(アセチル化)グリコシルフルオリドの熱力学的に最も安定なアノマーを生じる(すなわちα−グリコシルフルオリド)。より安定性が低いアノマー(すなわちβ−グリコシルフルオリド)を所望するならば、これはアノマー性ブロミドまたはクロライドを生成するために前アセチル化糖をHBr/HOAcまたはHClを用いて転換することにより調製することができる。この中間体を臭化銀のような臭化物塩と反応させて、グリコシルフルオリドを生成する。アセチル化グリコシルフルオリドは、メタノール中の穏やか(触媒的)な塩基(例えばNaOMe/MeOH)との反応により脱保護される。さらに、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。
他の活性化されたグリコシル誘導体は、当該技術分野で既知の常法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシラートは完全にベンジル化されたヘミアセタール状態の糖をメシルクロライドで処理し、続いてベンジル基を除去するための触媒的水素添加により調製することができる。
さらなる例示態様では、修飾された糖はアンテナ構造を有するオリゴ糖である。好適な態様では1以上のアンテナの末端が修飾部分を持つ。1つの修飾部分がアンテナ構造を有するオリゴ糖に結合する時、オリゴ糖は修飾基を「増幅」するために有用であり;ペプチドに結合した各オリゴ糖単位は、修飾基の多数のコピーをペプチドに結合する。上記の図に説明する本発明の典型的なはさみ状(chelate)の一般構造は、アンテナ構造を利用して本発明の結合物を調製することから生じる多価種を包含する。多くのアンテナ状サッカリド構造が当該技術分野では知られており、そして本発明は限定することなくそれらを用いて実施することができる。
修飾基の例を以下で検討する。修飾基は1以上の望ましい特性のために選択することができる。特性の例には限定するわけではないが、強化された薬物動態学、強化された薬力学、改善された生体分布、多価種を提供すること、改善された水溶性、強化または縮小した親油性および組織ターゲッティングを含む。
D.ペプチド結合物
a)水溶性ポリマー
選択したペプチドの親水性は、アミン−、エステル−、ヒドロキシル−およびポリヒドロキシル−含有分子のような極性分子との結合により強化される。代表例には限定するわけではないがポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレングリコール)を含む。好適な水溶性ポリマーは本質的に非−蛍光性であるか、あるいはアッセイで蛍光マーカーとして使用するためには不適当であるような最少量の蛍光を発する。天然に存在しない糖であるポリマーを使用してもよい。さらに他の物質(例えばポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレン グリコール)、ポリ(アスパルテート)、生体分子、治療部分、診断部分等)の共有結合により修飾されている外は天然に存在する糖の使用も意図している。別の例示態様では、治療用の糖部分をリンカーアームに結合し、そして糖−リンカーアームを続いて本発明の方法を介してペプチドに結合する。
水溶性ポリマーおよび糖を活性化するための方法および化学、ならびにサッカリドおよびポリマーを種々の種に結合する方法は、技術文献に記載されている。ポリマーを活性化するために共通して使用する方法には、官能基の臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハライド、トリクロロトリアジン等での活性化を含む(R.F.Taylor,(1991)、タンパク質の固定化.基礎および応用(PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS)、マルセルデッカー、ニューヨーク;S.S.Wong,(1992)、タンパク質結合および架橋化の化学(CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING)、CRC出版、ボカラトン;G.T.Hermanson et al.,(1993)、固定化アフィニティーリガンド技術(IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES)、アカデミック出版、ニューヨーク;Dunn,R.L.,et al.,編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AND DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第469巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991)を参照にされたい。
反応性PEG分子を調製し、そして反応性分子を使用して結合物を形成する経路は、当該技術分野では既知である。例えば米国特許第5,672,662号明細書は、直鎖もしくは分岐ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)およびポリ(アクリロモルホリン)から選択されるポリマー性酸の活性エステルの水溶性および単離可能な結合物を開示し、ここでポリマーは約44個以上の反復単位を有する。
米国特許第6,376,604号明細書は、ポリマーの末端ヒドロキシルをジ(1−ベンゾトリアゾイル)カーボネートと有機溶媒中で反応させることにより、水溶性および非ペプチド性ポリマーの水溶性の1−ベンゾトリアゾリルカルボン酸エステルの調製法を説明する。活性エステルを使用してタンパク質またはペプチドのような生物学的な活性剤との結合物を形成する。
国際公開第99/45964号パンフレットは、生物学的な活性剤および活性化された水溶性ポリマー(安定な連結を介してポリマー骨格に連結された少なくとも1つの末端を有するポリマー骨格を含んでなり、ここで少なくとも1つの末端は、分岐部分に連結された近接反応基を有する分岐部分を含んでなり、ここで生物学的な活性剤が少なくとも1つの近接反応基に連結している)を含んでなる結合物を記載する。他の分岐ポリ(エチレングリコール)は、国際公開第96/21469号パンフレットに記載され、そして米国特許第5,932,462号明細書は、反応性官能基を含む分岐末端を含む分岐PEG分子を用いて形成された結合物を記載する。遊離反応基はタンパク質またはペプチドのような生物学的な活性剤と反応することが可能であり、ポリ(エチレン グリコール)と生物学的な活性種との間に結合物を形成する。米国特許第5,446,090号明細書は二官能性PEGリンカーおよび各PEGリンカー末端にペプチドを有する結合物の形成におけるその使用を記載する。
分解性PEG結合を含む結合物は国際公開第99/34833号:および同第99/14259号パンフレットならびに米国特許第6,348,558号明細書に記載されている。そのような分解性結合は本発明に応用することができる。
反応性PEG誘導体およびこの誘導体を使用して形成した結合物の両方が当該技術分野で知られているが、本発明まで結合物がPEG(または他のポリマー)とペプチドまたは糖ペプチドのような別の種との間に完全なグリコシル連結基を介して形成される得ることは認識されなかった。
多くの水溶性ポリマーが当業者により知られ、そして本発明を実施するするために有用である。水溶性ポリマーという用語は、サッカリド(例えばデキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ(シアル酸)、ヘパラン、ヘパリン等);ポリ(アミノ酸);核酸;合成ポリマー(例えばポリ(アクリル酸)、ポリ(エーテル)、例えばポリ(エチレングリコール);ペプチド、タンパク質等のような種を包含する。本発明は任意の水溶性ポリマーを用いて実施することができ、唯一の限定はポリマーが結合物の残部(remainder)を結合することができる点を含まなければならないということだけである。
ポリマーの活性化法は国際公開第94/17039号パンフレット、米国特許第5,324,844号明細書、国際公開第94/18247号、同第94/04193号パンフレット、米国特許第5,219,564号、同第5,122,614号明細書、国際公開第90/13540号パンフレット、米国特許第5,281,698号明細書、そしてさらに国際公開第93/15189号パンフレットにも見いだすことができ、そして活性化ポリマーとペプチドとの間の結合物に関しては例えば、凝固第VIII因子(国際公開第94/15625号パンフレット)、ヘモグロビン(国際公開第94/09027号パンフレット)、酸素運搬分子(米国特許第4,412,989号明細書)、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ(Veronese et al.,App.Biochem.Biotech.11:141−45(1985))に見いだすことができる。
好適な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中の実質的な割合のポリマー分子がおよそ同じ分子量であるものであり;そのようなポリマーは「単分散(homodisperse)」である。
本発明は、ポリ(エチレングリコール)結合物を参照にすることによりさらに具体的に説明される。PEGの官能化および結合について、幾つかの総説および小論が入手可能である。例えばHarris,Macronol.Chem.Phys.C25:325−373(1985);Scouten,Methods in Enzymology 135:30−65(1987);Wong et al.,Enzyme Microb.Technol.14:866−874(1992);Delgado et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249−304(1992);Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150−165(1995);およびBhadra,et al.,Pharmazie,57:5−29(2002)を参照にされたい。
本発明の使用に適するポリ(エチレン グリコール)分子には限定するわけではないが、以下の式3により記載されるものを含む:
Figure 0006321724
R=H、アルキル、ベンジル、アリール、アセタール、OHC−、HN−CHCH−、HS−CH−CH−、
Figure 0006321724
−糖−ヌクレオチド、タンパク質、メチル、エチル:
X、Y、W、U(独立して選択される)=O、S、NH、N−R’;
R’、R”’(独立して選択される)=アルキル、ベンジル、アリール、アルキルアリール、ピリジル、置換アリール、アリールアルキル、アシルアリール;
n=1〜2000;
m、q、p(独立して選択される)=0〜20
o=0〜20
Z=HO、NH、ハロゲン、S−R”’、活性化エステル、
Figure 0006321724
−糖−ヌクレオチド、タンパク質、イミダゾール、HOBT、テトラゾール、ハライド;そして
V=HO、NH、ハロゲン、S−R”’、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌクレオチド、タンパク質。
好適な態様では、ポリ(エチレングリコール)分子は以下から選択される:
Figure 0006321724
本発明の結合物を形成するために有用なポリ(エチレングリコール)は、直鎖もしくは分岐している。本発明の使用に適する分岐ポリ(エチレングリコール)分子には、限定するわけではないが以下の式により記載されるものを含む:
Figure 0006321724
R’、R”、R”’(独立して選択される)=H、アルキル、ベンジル、アリール、アセタール、OHC−、HN−CHCH−、HS−CH−CH−、−(CHCY−Z、−糖−ヌクレオチド、タンパク質、メチル、エチル、ヘテロアリール、アシルアルキル、アシルアリール、アシルアルキルアリール:
X、Y、W、A、B(独立して選択される)=O、S、NH、N−R’(CH; n、p(独立して選択される)=1〜2000;
m、q、o(独立して選択される)=0〜20
Z=HO、NH、ハロゲン、S−R”’、活性化エステル、
Figure 0006321724
−糖−ヌクレオチド、タンパク質;
V=HO、NH、ハロゲン、S−R”’、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌクレオチド、タンパク質。
治療用ペプチドのインビボ半減期、曲線下面積および/または滞留時間も、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)のような水溶性ポリマーを用いて強化することができる。例えばPPGを用いたタンパク質の化学的修飾(PEG化:PEGylation)はそれらの分子量サイズを上げ、そしてそれらの表面−および官能基−接近性(accessibility)を下げるが、それぞれがタンパク質に結合したPPGのサイズに依存する。これは血漿半減期およびタンパク質溶解的−安定性に改善をもたらし、そして免疫原性および肝臓の取り込みを下げる(Chaffee et al.J.Clin.Invest.89:1643−1651(1992);Pyatak et al.,Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29:113−127(1980))。インターロイキン−2のPEG化は、インビボで抗腫瘍効力を上昇させることが報告され(Katre et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:1487−1491(1987))、そしてモノクローナル抗体A7に由来するF(ab’)2のPEG化は、その腫瘍への局在化を向上させた(Kitamura et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.28:1387−1394(1990))。
1つの好適な態様では、本発明の方法により水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドのインビボ半減期は、非−誘導化ペプチドのインビボ半減期に比べて上昇する。別の好適な態様では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの曲線下の面積は、非−誘導化ペプチドの曲線下面積に比べて上昇する。別の好適な態様では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの滞留時間は、非−誘導化ペプチドの滞留時間に比べて上昇する。インビボ半減期、曲線下面積および滞留時間を決定する技法は、当該技術分野では周知である。そのような技法の説明は、J.G.Wagner、1993、製薬科学者のための薬物動態学(Pharmacokinetics for the Pharmaceutical Scientist)、テクノミック出版社(Technomic Publishing Company Inc.)、ランカスター、ペンシルベニア州)に見出すことができる。
ペプチドのインビボ半減期の上昇は、この量における上昇の割合の範囲で最も良く表される。上昇の割合の範囲の下限は約40%、約60%、約80、約100%、約150%または約200%である。この範囲の上限は約60%、約80%、約100%、約150%または約250%以上である。
例示態様では、本発明はPEG化された濾胞刺激ホルモンを提供する(実施例9および10)。さらなる例示態様では、本発明はPEG化トランスフェリンを提供する(実施例13)。
本発明で使用する他の水溶性ポリマーの例には、限定するわけではないが直鎖もしくは分枝ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)およびポリ(アクリロモルホリン)、デキストラン、澱粉、ポリ(アミノ酸)等を含む。
b)水−不溶性ポリマー
本発明の結合物は1以上の水−不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの態様は、治療用ペプチドを制御された様式で送達する賦形剤としての結合物の使用により具体的に説明される。ポリマー性の薬剤送達系は当該技術分野では既知である。例えばDunn et al.、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUG AND DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第469巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991を参照にされたい。当業者は実質的に任意の既知の薬剤送達系を本発明の結合物に応用できると考えるだろう。
代表的な水−不溶性ポリマーには限定するわけではないが、ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシル アクリレート)ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ(ビニルアセテート)、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびそれらのコポリマーを含む。
本発明の結合物で使用する合成的に修飾された天然ポリマーには、限定するわけではないがアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステルおよびニトロセルロースを含む。広い種類の合成的に修飾された天然ポリマーの特に好適な員には、限定するわけではないがメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩およびアクリル酸およびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーを含む。
本明細書で検討するこれらのおよび他のポリマーは、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)(セントルイス、モンタナ州)、ポリサインエンス(Polyscience)、ウァレントン、ペンシルベニア州)、アルドリッチ(Aldrich)(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)、フルカ(ロンコンコーマ、ニューヨーク州)およびバイオラッド(BioRad)(リッチモンド、カリフォルニア州)のような市販の供給源から容易に得ることができ、あるいはこれらの供給元から得たモノマーから標準技術を使用して合成することができる。
本発明の結合物に使用する代表的な生分解性ポリマーには、限定するわけではないがポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンドおよびコポリマーを含む。特別な使用は、コラーゲン、プルロニック等を含むもののようなゲルを形成する組成物である。
本発明におけるポリマーの使用には、それらの構造の少なくとも一部の中に生物再吸収性(bioresorbable)分子を有する水不溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーを含む。そのようなポリマーの例は、ポリマー鎖あたり生物再吸収性領域、親水性領域および複数の架橋結合可能な官能基を有する水−不溶性コポリマーを含むものである。
本発明の目的のために、「水−不溶性材料」には水または水を含有する環境中で実質的に不溶性である材料を含む。すなわちコポリマーの特定領域またはセグメントは親水性または水溶性でもよく、全体としてポリマー分子は任意の実質的な限界まで水に溶解しない。
本発明の目的のために、用語「生物再吸収性分子」には代謝または分解され、そして再吸収および/または身体による正常な排出経路を介して排除され得る領域を含む。そのような代謝産物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に非毒性である。
生物再吸収性領域は、コポリマー組成物を全体として水溶性にしない限り、疎水性または親水性のいずれかでよい。すなわち生物再吸収性領域はポリマーが全体として水−不溶性を保持することの優先性に基づき選択される。したがって関連する特性、すなわち含まれる官能基の種類、および生物再吸収性領域の相対的割合、および親水性領域は、有用な生物再吸収性組成物が水−不溶性を保持することを確実にするように選択される。
再吸収性ポリマーの例には、例えばポリ(α−ヒドロキシ−カルボン酸)/ポリ(オキシアルキレン)の合成的に生成される再吸収性ブロックコポリマーを含む(Cohn et al.、米国特許第4,826,945号明細書を参照にされたい)。これらのコポリマーは架橋結合されず、そして水溶性であるので身体は分解したブロックコポリマー組成物を排出することができる。Younes et al.,J.Biomed.Mater.Res.21:1301−1316(1987);およびCohn et al.,J.Biomed.Mater.Res.22:993−1009(1988)を参照にされたい。
現在好適な生物再吸収性ポリマーには、ポリ(エステル)、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ(ラクトン)、ポリ(アミド)、ポリ(エステル−アミド)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(カーボネート)、ポリ(ホスファジン)、ポリ(ホスホエステル)、ポリ(チオエステル)、多糖およびそれらの混合物から選択される1以上の成分を含む。より好ましくはさらに生物再吸収性ポリマーにはポリ(ヒドロキシ)酸成分を含む。ポリ(ヒドロキシ)酸の中で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカルプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸およびそれらのコポリマーおよび混合物が好ましい。
インビボで吸収される(「生物に吸収される」)フラグメントを形成することに加えて、本発明の方法での使用に好適なポリマー性コーティングも、排出可能かつ/または代謝可能なフラグメントを生成することができる。
高次コポリマーも本発明に使用することができる。例えば1984年、3月20日に発効されたCasey et al.、米国特許第4,438,253号明細書は、ポリ(グリコール酸)およびヒドロキシル−末端化ポリ(アルキレングリコール)のエステル交換反応から生産されるトリ−ブロックコポリマーを開示する。そのような組成物は再吸収性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。そのような組成物の柔軟性は、テトラ−p−トリルオルトカーボネートのような芳香族オルトカーボネートをコポリマー構造に包含させることにより制御される。
乳酸および/またはグリコール酸に基づく他のコーティングも利用することができる。
例えば1993年4月13日に発効されたSpinu、米国特許第5,202,413号明細書は、ラクチドおよび/またはグリコリドのオリゴジオールまたはジアミン残基への開環重合、続いてジイソシアネート、ジアシルクロライドまたはジクロロシランのような二官能性化合物を用いた鎖延長により生産されたポリラクチドおよび/またはポリグリコリドを順次に配置した(ordered)ブロックを有する生分解性マルチ−ブロックコポリマーを開示する。
本発明に有用なコーティングの生物再吸収性領域は、加水分解的かつ/または酵素的に開裂できるように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂可能な」とは、水中または水を含む環境下で加水分解に対するコポリマー、特に生物再吸収性領域の感受性を指す。同様に本明細書で使用する「酵素的に開裂可能な」とは、内因性または外因性酵素による開裂に対するコポリマー、特に生物再吸収性領域の感受性を指す。
身体内に置かれた時、親水性領域は排出可能かつ/または代謝可能なフラグメントに処理され得る。すなわち親水性領域には例えばポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキル オキサゾリン)、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびそれらのコポリマーおよび混合物を含むことができる。さらに親水性領域は例えばポリ(アルキレン)オキシドであることもできる。そのようなポリ(アルキレン)オキシドには、例えばポリ(エチレン)オキシド、ポリ(プロピレン)オキシドおよびそれらの混合物およびコポリマーを含むことができる。
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明に有用である。ヒドロゲルは比較的大量の水を吸収することができるポリマー性材料である。ヒドロゲル形成化合物の例には限定するわけではないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラゲーナンおよび他の多糖、ヒドロキシエチレンメタクリル酸(HEMA)ならびにそれらの誘導体等を含む。安定で、生分解性の、そして生物再吸収性であるヒドロゲルを生成することができる。さらにヒドロゲル組成物は1以上のこれらの特性を現すサブユニットを含むことができる。
完全性が架橋結合を介して制御され得る生物適合性(bio−compatible)ヒドロゲル組成物が知られており、そして現在、本発明の方法で使用するために好適である。例えば1995年4月25日に発効されたHubbell et al.、米国特許第5,410,016号明細書および1996年6月25日に発効された米国特許第5,529,914号明細書は、2つの加水分解的に不安定な延長物の間に挟まれた水溶性の中央ブロックセグメントを有する架橋結合したブロックコポリマーである水溶性の系を開示する。そのようなコポリマーは光重合性アクリレート官能基を用いてさらにエンド−キャップ化されている。架橋結合する時、これらの系はヒドロゲルになる。そのようなコポリマーの水溶性の中央ブロックには、ポリ(エチレングリコール)を含むことができ;一方加水分解的に不安定な延長物はポリグリコール酸またはポリ乳酸のようなポリ(α−ヒドロキシ酸)であることができる。Sawhney et al.,Macromolecules 26:581−587(1993)を参照にされたい。
別の好適な態様では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせのような成分を含む熱可逆性ゲルが現在好適である。
さらに別の例示態様では、本発明の結合物はリポソームの成分を含む。リポソームは例えば1985年、6月11日に発効されたEppstein et al.、米国特許第4,522,811号明細書に記載されているように、当該技術分野で既知の方法に従い調製することができる。例えばリポソーム配合物は適当な脂質(1つまたは複数)(ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイル ホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリンおよびコレステロールのような)を無機溶媒に溶解し、これを次いで蒸発させ、容器の表面上の乾燥脂質の薄いフィルムを残しておくことにより調製することができる。次いで活性化合物またはその製薬学的に許容され得る塩の水溶液を容器に注ぐ。次いで容器を手で旋回して、容器の側面から脂質材料を解放し(free)、そして脂質凝集物を分配し、これによりリポソーム懸濁液を形成する。
上記に引用した微粒子および微粒子の調製法は例として提供され、そしてそれらは本発明で使用する微粒子の範囲を定めることを意図しない。当業者は異なる方法により作成される多くの微粒子を本発明に使用できると考えるだろう。
c)生体分子
別の好適な態様では、修飾された糖は生体分子を持つ。さらに好適な態様では、生体分子は機能的タンパク質、酵素、抗原、抗体、核酸(例えばシングルヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび1−およびより多い鎖の核酸)、レクチン、レセプターまたはそれらの組み合わせである。
幾つかの好適な生体分子は本質的に非−蛍光性であり、またはアッセイで蛍光マーカーとして使用するには不適切な最少量の蛍光を発する。他の生体分子は蛍光でもよい。別の物体(例えばPEG、生体分子、治療部分、診断部分等)の共有結合により修飾されている外は天然に存在する糖の使用が適当である。例示態様では、生体分子である糖部分をリンカーアームに結合し、そして糖−リンカーアームカセットを続いて本発明の方法を介してペプチドに結合する。
本発明の実施に有用な生体分子は、任意の供給源に由来することができる。生体分子は天然な供給源から単離することができ、またはそれらは合成法により生成することができる。ペプチドは天然なペプチドまたは突然変異したペプチドであることができる。突然変異は化学的な突然変異誘発法、部位−特異的突然変異誘発法または当業者に既知の突然変異を導入する他の手段により行うことができる。本発明の実施で有用なペプチドには例えば、酵素、抗原、抗体およびレセプターを含む。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでよく;完全またはフラグメントのいずれかであることができる。ペプチドは任意に方向付けされた進化(directed evolution)のプログラムの産物である。
天然に由来する、および合成ペプチドの両方および核酸も本発明と共に使用される;これらの分子は糖残基成分または架橋結合剤に利用可能な反応基により結合することができる。例えばペプチドは反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基を介して結合することができる。反応基はペプチド末端またはペプチド鎖に対して内部に存在することができる。核酸は塩基(例えばエキソ環式アミン)上の反応基または糖部分の利用可能なヒドロキシル基(例えば3’−または5’−ヒドロキシル)を介して結合することができる。ペプチドおよび核酸鎖はさらに1以上の部位で誘導化されて、適切な反応基を鎖に付けることが可能となる。例えばChrisey et al.,Nucleic Acids Res.24:3031−3039(1996)を参照にされたい。
さらに好適な態様では、生体分子を選択して本発明の方法により修飾したペプチドを特異的組織に向け、これによりその組織に送達される非誘導化ペプチドの量に比べてペプチドのその組織への送達を強化する。さらなに好適な態様では、選択した時間内に特異的な組織へ送達される誘導化ペプチドの量は、誘導化により少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、そしてより好ましくは少なくともさらに約100%まで強化する。現在、標的化に応用するために好適な生体分子には抗体、ホルモンおよび細胞表面レセプターのリガンドを含む。
現在好適な態様では、修飾基はタンパク質である。例示態様では、タンパク質はインターフェロンである。ヒトではインターフェロンは、ウイルスまたは二本鎖RNAで誘導した後にヒトの1次繊維芽細胞により分泌される抗ウイルス糖タンパク質である。インターフェロンは治療薬として、例えば抗ウイルス剤および多発性硬化症の処置に興味深い。インターフェロン−βを考察した参考文献については、例えばYu,et al.,J.Neuroimmunol.,64(1):91−100(1996);Schmidt,J.,J.Neurosci.Res.,65(1):59−67(2001);Wender,et al.,Folia Neuropathol.,39(2):91−93(2001);Martin,et al.Springer Semin.Immunopathol.,18(1):1−24(1996);Takane,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,294(2):746−752(2000);Sburlati,et al.,Biotechnol .Prog.,14:189−192(1998);Dodd,et al.,Biochimica et Biophysica Acta,787:183−187(1984);Edelbaum,et al.,J.Interferon Res.,12:449−453(1992);Conradt,et al.,J.Biol.Chem.,262(30):14600−14605(1987);Civas,et al.,Eur.J.Biochem.,173:311−316(1988);Demolder,et al.,J.Biotechnol.,32:179−189(1994);Sedmak,et al.,Interferon Res.,9(Suppl 1):S61−S65(1989);Kagawa,et al.,J.Biol.Chem.,263(33):17508−17515(1988);Hershenson,et al.,U.S.Patent No.4,894,330;Jayaram,et al.,J.Interferon Res.,3(2):177−180(1983);Menge,et al.,Develop.Biol.Standard.,66:391−401(1987);Vonk,et al.,J.Interferon Res.,3(2):169−175(1983);and Adolf,et al.,J.Interferon Res.,10:255−267(1990).For references relevant to interferon−,see,Asano,et al.,Eur.J.Cancer,27(Suppl 4):S21−S25(1991);Nagy,et al.,Anticancer Research,8(3):467−470(1988);Dron,et al.,J.Biol.Regul.Homeost.Agents,3(1):13−19(1989);Habib,et al.,Am.Surg.,67(3):257−260(3/2001);およびSugyiama,et al.,Eur.J.Biochem.,217:921−927(1993)を参照にされたい。
インターフェロン結合物の例では、インターフェロンβはリンカーアームを介して第2ペプチドに結合する。リンカーアームには完全なグリコシル連結基を含み、これを通して本発明の方法を介して第2ペプチドに連結する。リンカーアームも場合により第2の完全なグリコシル連結基も含み、これを通してインターフェロンに結合する。
別の例示態様では、本発明は濾胞刺激ホルモン(FSH)の結合物を提供する。FSHは糖タンパク質ホルモンである。例えばSaneyoshi,et al.,Biol.Reprod.,65:1686−1690(2001);Hakola,et al.,J.Endocrinol.,158:441−448(1998);Stanton,et al.,Mol.Cell.Endocrinol.,125:133−141(1996);Walton,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.,86(8):3675−3685(08/2001);Ulloa−Aguirre,et al.,Endocrine,11(3):205−215(12/1999);Castro−Fernadez,et al.I,J.Clin.Endocrinol.Matab.,85(12):4603−4610(2000);Prevost,Rebecca R.,Pharmacotherapy,18(5):1001−1010(1998);Linskens,et al.,The FASEB Journal,13:639−645(04/1999);Butnev,et al.,Biol.Reprod.,58:458−469(1998);Muyan,et al.,Mol.Endo.,12(5):766−772(1998);Min,et al.,Endo.J.,43(5):585−593(1996);Boime,et al.,Recent Progress in Hormone Research,34:271−289(1999);およびRafferty,et al.,J.Endo.,145:527−533(1995)を参照にされたい。FSH結合物はインターフェロンについて上に記載した様式に準じて形成することができる。
さらに別の例示態様では、結合物はエリトロポエチン(EPO)を含む。EPOは低酸素に対する反応を媒介し、そして赤血球の生産を刺激することが知られている。関連する参考文献については、Cerami et al.,Seminars in Oncology,28(2)(Suppl8):66−70(04/2001)を参照にされたい。例示のEPO結合物は、インターフェロンの結合物に準じて形成される。
さらなる例示態様では、本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の結合物を提供する。G−CSFはニュートロポイエティック(neutropoietic)前駆細胞の機能的に成熟した好中球への増殖、分化および活性化を刺激する糖タンパク質である。注入されたG−CSFは身体から急速に排除されることが知られている。例えばNohynek,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,39:259−266(1997);Lord et al.,Clinical Cancer Research,7(7):2085−2090(07/2001);Rotondaro,et al.,Molecular Biotechnology,11(2):117−128(1999);およびBoenig,et al.,Bone Marrow Transplantation,28:259−264(2001)を参照にされたい。G−CSFの例示結合物は、インターフェロンの結合物について上に記載したように調製される。当業者は多くの他のタンパク質が、限定するわけではないが表6(本明細書のいたるところに記載する)および図1、および個々の修飾スキームが提示されている図27〜51に掲げるペプチドを含む本発明の方法および組成物を使用して、インターフェロンに結合することができると考えるだろう。
さらなる例示態様では、ビオチンとの結合物が提供される。すなわち例えば選択的にビオチン化されたペプチドは、1以上の修飾基を持つアビジンまたはストレプトアビジン部分の結合により仕上げられる。
さらに好適な態様では、生体分子は本発明の方法により修飾したペプチドを特異的な細胞内コンパートメントへ向けるために選択され、これにより組織に送達される非誘導化ペプチドの量に比べて細胞内コンパートメントへのペプチドの送達を強化する。さらに好適な態様では、選択した時間内に特異的な細胞区画へ送達される誘導化ペプチドの量を誘導化により、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、そしてさらにより好ましくは少なくとも約100%まで強化する。別の特に好適な態様では生体分子は、いったん内面化されると加水分解することができる開裂可能なリンカーによりペプチドに連結される。細胞内ターゲッティングの応用に現在好適な生体分子には、トランスフェリン、ラクトトランスフェリン(ラクトフェリン)、メラノトランスフェリン(p97)、セルロプラスミンおよび二価のカチオン輸送体を含む。意図する連結には限定するわけではないが、タンパク質−糖−リンカー−糖−タンパク質、タンパク質−糖−リンカー−タンパク質およびそれらの多価形態、および薬剤がとりわけ低分子、ペプチド、脂質を含むタンパク質−糖−リンカー−薬剤を含む。
治療薬の部位特異的および標的−指向的送達は、種々の悪性疾患および特定の神経障害のようなヒトの広い種々の疾患を処置する目的に望ましい。そのような手順は薬剤のより少ない副作用およびより高い効率で達成される。これらの送達系の設計は様々な原理に頼るものであった。総説については、Garnett,Advanced Drug Delivery Reviews 53:171−216(2001)を参照にされたい。
組織を特異的に標的するために、薬剤送達系の設計における1つの重要な考察。腫瘍表面抗原の発見により、定めることができる表面抗原を提示している腫瘍細胞を特異的に標的とし、そして殺す治療的取り組みを開発することが可能となった。悪性疾患の処置においてヒトの臨床試験で効果が証明された3つの主要のクラスの治療用モノクローナル抗体(MAb)がある:(1)非結合MAb、これは成長阻害および/またはアポトーシスを直接誘導するか、あるいは抗腫瘍細胞傷害性を媒介するために宿主の防御メカニズムを間接的に活性化する;(2)薬剤を結合したMAb、これは有力な細胞傷害性トキシンを腫瘍細胞に優先的に送達し、したがって従来の化学療法に普通は付随する全身性の細胞傷害性を最少とする;および(3)放射性同位体を結合したMAb、これは腫瘍に殺菌用量の放射線を送達する。Reff et al.,Cancer Control 9:152−166(2002)による総説を参照にされたい。
悪性細胞を殺す力を持つMAbを準備するために、MAbを植物、細菌または菌類の供給源から得たトキシンに結合して、イムノトキシンと呼ばれるキメラタンパク質を形成することができる。頻繁に使用される植物トキシンは2種類に分類される:(1)リシン、アブリン、アメリカヤドリギ レクチン、およびモデクシン(modeccin)のようなホロトキシン(またはクラスIIリボソーム不活性化タンパク質)、および(2)アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAP)、サポリン、Bryodin1、ボウガニン(bouganin)およびゲロニン(gelonin)のようなヘミトキシン(クラスIリボソーム不活性化タンパク質)。よく使用される細菌トキシンには、ジフテリアトキシン(DT)およびシュードモナスのエキソトキシン(PE)を含む。Kreitman,Current Pharmaceutical Biotechnology 2:313−325(2001)。
通例のイムノトキシンは、正常細胞への結合を最少にするために突然変異または化学的に修飾したトキシンに化学的に結合したMAbを含む。例にはCD5を標的とする抗−B4−ブロック化リシン;およびCD22を標的とするRFB4−脱グリコシル化リシンA鎖を含む。より最近開発された組換えイムノトキシンは、組換えDNA技術を使用してタンパク質トキシンに融合させた腫瘍抗原に対して向けられた抗体の可変領域からなるキメラタンパク質である。トキシンはまた、正常組織結合部位は除去するが、その細胞傷害性を保持するために、頻繁に遺伝的に修飾される。造血性ガン、グリオーマおよび胸部、結腸、卵巣、膀胱および胃腸管のガンを含む種々の悪性疾患を処置するために、イムノトキシンの標的として多数の分化抗原、過剰発現したレセプターまたはガン−特異的抗原、例えばCD19、CD22、CD20、IL−2レセプター(CD25)、CD33、IL−4レセプター、EGFレセプターおよびその突然変異体、ErB2、ルイス炭水化物、メソセリン(mesothelin)、トランスフェリンレセプター、GM−CSFレセプター、Ras、Bcr−Ab1およびc−Kitが同定された。例えばBrinkmann et al.,Expert Opin.Biol.Ther.1:693−702(2001);Perentesis and Sievers,Hematology/Oncology Clinics of North Amereica 15:677−701(2001)を参照にされたい。
放射性同位体に結合したMAbは、ヒトの悪性疾患、特に造血性の悪性疾患を高レベルの特異性および効力で処置する別の手段として使用される。最もよく使用される治療用の同位体は、131Iおよび90Yのような高エネルギー−エミッターである。最近、213Bi−標識抗−CD33ヒト化MAbも、フェイズIのヒト臨床試験で試験された。Reff et al.,同上。
多数のMAbが治療目的に使用されてきた。例えば特定の造血性悪性疾患を処置するために、リツキシマブ(rituximab:Rituxan(商標))、組換えキメラ抗−CD20MAbの使用が1997年にFDAにより認可された。それからヒトのガンの処置に治療的使用が認められた他のMAbには:アレムツズマブ(alemtuzumab:Campath−1H(商標))、CD52に対するヒト化ラット抗体;およびジェンツズマブ オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin:Mylotarg(商標))、カリーチマイシン(calichemicin)−結合ヒト化マウス抗CD33MAbを含む。現在、FDAはまた細胞傷害剤または照射、例えば放射標識Zevalin(商標)およびBexxar(商標)の部位特異的送達を目的にするための数種の他のMAbの安全性および効力も調査している。Reff et al.,同上。
薬剤送達系の設計において2番目に重要な考察は、標的とする組織の治療薬への接近性である。これは血液脳関門が高分子の拡散を妨害する中枢神経系(CNS)の疾患を処置する場合に特に関心のある事柄である。治療薬のCNSへの効率的送達のために、血液脳関門をバイパスするための幾つかの取り組みが開発された。
血漿から脳への鉄輸送メカニズムを解明することは、血液脳関門(BBB)のバイパスに有用な道具を提供した。トランスフェリンにより血漿中で輸送される鉄は、ほとんどすべての種類の細胞に必須な成分である。脳は代謝プロセスに鉄を必要とし、そして脳の毛細管内皮細胞に位置するトランスフェリンレセプターを通して、レセプターが媒介するトランスサイトーシスおよびエンドサイトーシスを介して鉄を受容する。Moor and Morgan,Cellular and Molecular Neurobiology 20:77−95(2000)。トランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用に基づく送達系が、ペプチド、タンパク質およびリポソームを脳に効率的に送達するために確立された。例えばペプチドは脳によるより多い取り込みを達成するために、トランスフェリンレセプターに対して向けられたMabにカップリングすることができる、Moos and Morgan、同上。同様に、トランスフェリンレセプターに向けられたMAbにカップリングした時、血液脳関門全域の塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)の輸送が強化される。Song et al.,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 301:605−610(2002);Wu et al.,Journal of Drug Targeting 10:239−245(2002)。さらに化学療法剤、ドキソルビシンのC6グリオーマへの効果的輸送のためのリポソーム送達系が報告され、ここでトランスフェリンはリポソームPEG鎖の遠位末端に結合された。Eavarone et al.,J.Biomed.Mater.Res.51:10−14(2000)。多数の米国特許もトランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用に基づき血液−脳関門をバイパスする送達法に関する。例えば米国特許第5,154,924号;同第5,182,107号;同第5,527,527号;同第5,833,988号;同第6,015,555号明細書を参照にされたい。
血液脳関門をバイパスするための製剤用に適する他の結合パートナーがある。例えば米国特許第5,672,683号、同第5,977,307号明細書および国際公開第95/02421号パンフレットは、血液脳関門をわたる神経製剤を送達する方法に関し、ここで薬剤は脳の毛細管内皮細胞レセプターと反応性のリガンドとの融合タンパク質の状態で投与される;国際公開第99/00150号パンフレットは、血液脳関門をわたる薬剤の輸送が、ヒトのインスリンレセプターに対して向けられたMAbとの結合により促進される薬剤送達系を記載する;国際公開第89/10134号パンフレットは、脳へ親水性の神経ペプチドを導入する手段として、比較的高速で血液脳関門をわたることができるペプチドおよびトランスサイトーシスできない親水性の神経ペプチドを含むキメラペプチドを開示する;国際公開第01/60411 A1号パンフレットは、製薬学的な有効成分を脳に容易に輸送することができる製薬学的組成物を提供する。有効成分は結合物として使用されるヒバーネーション(hibernation)−特異的タンパク質に結合させ、そして甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンの生産を促進する物質と共に投与される。
さらに血液脳関門をバイパスするために、別の薬剤送達経路が調査された。例えば結合を必要としない治療薬の鼻内送達は別の送達法の可能性を示した(Frey,2002,Drug Delivery Technology,2(5):46−49)。
血液脳関門をわたる薬剤の輸送を促進することに加えて、トランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作用は、多くの腫瘍細胞がそれらの表面上にトランスフェリンレセプターを過剰発現するので、特定の腫瘍細胞の特異的標的化にも有用である。この方法はトランスフェリン結合物を介してK562細胞に生物活性高分子を送達するために(Wellhoner et al.,The Journal of Biological Chemistry 266:4309−4314(1991))、そしてトランスフェリン結合物を介して腸細胞−様Caco−2細胞にインスリンを送達するために(Shah and Shen,Journal of Pharmaceutical Sciences 85:1306−1311(1996))使用されてきた。
さらにラクトトランスフェリンレセプター、メラノトランスフェリン、セルロプラスミンのような種々の鉄輸送タンパク質の機能、および二価のカチオン輸送体およびそれらの発現パターンについてより知られるようになったので、鉄輸送メカニズムに関与する幾つかのタンパク質(例えばメラノトランスフェリン)またはそれらのフラグメントは、血液脳関門をわたる治療薬の輸送、または特異的組織のターゲッティングを支援するために同様に効果的であることが分かった(国際公開第02/13843A2号、同第02/13873A2号パンフレット)。薬剤送達において、結合物としての鉄の取り込みが関与するトランスフェリンおよび関連タンパク質の使用に関する総説は、Li and Qian,Medical Research Reviews 22:225−250(2002)を参照にされたい。
治療薬の組織−特異的送達の概念は、トランスフェリンとトランスフェリンレセプターまたはそれらの関連タンパク質との間の相互作用を越える。例えば石化(mineralized)した組織へのタンパク質の送達を改善するために、タンパク質が骨を探す(bone−seeking)アミノビホスフェートと結合した骨−特異的送達系が記載された。Uludag and Yang,Biotechnol.Prog.18:604−611(2002)。この話題に関する総説は、Vyas et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 18:1−76(2001)を参照にされたい。
種々のリンカーを、治療薬の特異的送達の目的で生物結合物の生成法に使用することができる。適当なリンカーには、例えば酸−触媒型の解離により開裂され得る、あるいは非−開裂性のホモ−およびヘテロ二官能性架橋結合試薬を含む(例えば、Srinivasachar and Neville,Biochemistry 28:2501−2509(1989);Wellhoner et al.,The Journal of Biological Chemistry 266:4309−4314(1991)を参照にされたい)。ビオチンおよびアビジン/ストレプトアビシンのような多くの既知の結合パートナー間の相互作用も、治療薬と治療薬の特異的かつ効果的送達を確実とする結合パートナーとを連結する手段として使用することができる。本発明の方法を使用して、タンパク質は分子を結合物として細胞内コンパートメントへ送達するために使用することができる。リガンド結合後に内面化される、特異的な細胞表面レセプターに結合するタンパク質、ペプチド、ホルモン、サイトカイン、低分子等は、結合した治療用化合物の細胞内ターゲッティングに使用することができる。典型的にはレセプター−リガンド複合体は、特異的な細胞コンパートメントへ送達される細胞内小胞中に内面化され、これらのコンパートメントには限定するわけではないがレセプターにより標的化される細胞内の位置に依存して核、ミトコンドリア、ゴルジ、ER、リソソームおよびエンドソームを含む。レセプターリガンドを所望する分子に結合することにより、薬剤はレセプター−リガンド複合体で運ばれ、そしてレセプターにより通常は標的とされる細胞内の位置へ送達される。したがって薬剤は疾患の処置が必要とされている細胞の特異的な細胞内の位置へと送達され得る。
多くのタンパク質が治療薬を特異的な組織および器官を標的とするために使用することができる。標的化タンパク質には限定するわけではないが増殖因子(とりわけEPO、HGH、EGF、神経成長因子、FGF)、サイトカイン(とりわけGM−CSF、G−CSF、インターフェロンファミリー、インターロイキン)、ホルモン(とりわけFSH、LH、ステロイドファミリー、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン)、血清タンパク質(とりわけアルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、ヒト血清タンパク質、抗体および抗体のフラグメント)、およびビタミン(とりわけ葉酸、ビタミンC、ビタミンA)を含む。ほとんどの細胞型上のレセプターに特異的な標的化剤も利用可能である。
企図する連結の立体配置には、限定するわけではないがタンパク質−糖−リンカー−糖−タンパク質およびそれらの多価の形態、タンパク質−糖−リンカー−タンパク質およびそれらの多価の形態、タンパク質−糖−リンカー−治療薬(ここで治療薬には限定するわけではないが低分子、ペプチドおよび脂質を含む)を含む。幾つかの態様では、いったん内面化されれば加水分解され得る加水分解可能なリンカーを使用する。酸性pHを有するエンドソームまたはリソソーム中にタンパク質結合物が内面化される場合、酸に不安定なリンカーを使用することは有利となり得る。いったんエンドソームまたはリソソーム中に内面化されれば、リンカーは加水分解され、そして治療薬が標的剤から放出される。
例示態様では、トランスフェリンは、患者中でトランスフェリンレセプターを提示する細胞を標的することが望まれる酵素にリンカーを介して連結される。患者は例えばその特定の酵素について酵素代替療法を必要とすることができる。特に好適な態様では、酵素はリソソーム蓄積疾患の患者に欠けているものである(表4を参照にされたい)。いったん循環に入れば、トランスフェリン−酵素結合物はトランスフェリンレセプターに結合し、そして早期にエンドソームにより内面化される(Xing et al.,1998,Biochem.J.336:667;Li et al.,2002,Trends in Pharmacol.Sci.23:206;Suhaila et al.,1998,J.Biol.Chem.273:14355)。トランスフェリンに関する他の企図する標的剤には、限定するわけではないがラクトトランスフェリン(ラクトフェリン)、メラノトランスフェリン(p97)、セルロプラスミンおよび二価カチオン輸送体を含む。
別の例示態様では、トランスフェリン−ジストロフィン結合物がトランスフェリン経路によりエンドソームに入る。いったん入れば、ジストロフィンが加水分解可能なリンカーにより放出され、これは次いで必要とされる細胞内コンパートメントに取り込まれることができる。この態様は、トランスフェリンに結合された機能的ジストロフィンペプチドを用いて、遺伝的に欠損性のジストロフィン遺伝子および/またはタンパク質を補充することにより筋ジストロフィーの患者を処置するために使用することができる。
E.治療部分
別の好適な態様では、修飾された糖は治療部分を含む。当業者は治療部分と生体分子の範疇の間で重複する部分があると考えるだろう;多くの生体分子が治療特性または潜在性を有する。
治療部分は臨床的使用がすでに許容された作用物質であることができ、あるいはそれらはその使用が実験的であるか、またはその活性もしくは作用メカニズムが調査中の薬剤であることができる。治療部分は所定の疾患状態で証明された作用を有することができ、あるいは所定の疾患状態で望まれる作用を示すと仮定されるだけであることができる。好適な態様では、治療部分は選択した組織と相互作用するそれらの能力についてスクリーニングされている化合物である。本発明の方法を実施するために有用な治療部分は、種々の薬理学的活性を有する薬剤の広範な種類からの薬剤を含む。幾つかの態様では、糖ではない治療部分を使用することが好ましい。この好適例の例外は、PEG、生体分子、治療部分、診断分子等のような別の物体と共有結合することにより修飾された糖である。別の例示態様では、治療用の糖部分をリンカーアームと結合させ、そして続いて糖−リンカーアームカセットを本発明の方法を介してペプチドに結合させる。
治療および診断薬を様々な他の種に結合する方法は、当業者には周知である。例えばHermanson,バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE TECHNIQUES)、アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびDunn et al.,編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第469巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991を参照にされたい。
例示態様では、治療部分は選択した条件下で開裂する連結を介して修飾された糖に結合させる。条件の例には、限定するわけではないが、選択されたpH(例えば胃、腸、エンドサイトーシスの液胞)、活性な酵素の存在(例えばエステラーゼ、プロテアーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ)、光、熱等を含む。多くの開裂可能な基が当該技術分野では知られている。例えばJung et al.,Biochem.Biophys.Acta,761:152−162(1983);Joshi et al.,J.Biol.Chem.,265:14518−14525(1990);Zarling et al.,J.Immunol.,124:913−920(1980);Bouizar et al.,Eur.J.Biochem.,155:141−147(1986);Park et al.,J.Biol.Chem.,261:205−210(1986);Browning et al.,J.Immunol.,143:1859−1867(1989)を参照にされたい。
有用な治療部分の種類には、限定するわけではないが非−ステロイド性抗−炎症剤(NSAIDS)を含む。NSAIDSは例えば以下の範疇から選択することができる:(例えばプロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体およびオキシカム(oxicams));ヒドロコルチゾン等を含むステロイド性抗−炎症剤;アジュバント:抗−ヒスタミン剤(例えばクロロフェニラミン(chlorpheniramine)、トリプロリジン(triprolidine));鎮咳剤(例えばデキストロメトルファン(dextromethorphan)、コデイン(codein)、カラミフェン(caramiphen)、およびカルベタペンタン(carbetapentane);止痒剤(例えばメトジラジン(methdilazine)およびトリメプラジン(trimeprazine);抗コリン作用剤(例えばスコポラミン(scopolamine)、アトロピン(atropine)、ホマトロピン(homatropine)、レボドパ(levodopa);嘔吐抑制剤および抗めまい剤(例えばシクリジン(cyclizine)、メクリジン(meclizine)、クロルプロマジン(chlorpromazine)、ブクリジン(buclizine);食欲減退剤(例えばベンズフェタミン(benzphetamine)、フェンテルミン(phentermine)、クロルフェンテルミン(chlorphentermine)およびフェンフルラミン(fenfluramine);中枢刺激剤(例えばアンフェタミン(amphetamine)、メタンフェタミン(methamphetamine)、デクストロアンフェタミン(dextroamphetamine)およびメチルフェニデート(methylphenidate));抗不整脈剤(例えばプロパノルオール(propanolol)、プロカインアミド(procainamide)、ジソピラミド(disopyramide)、キニジン(quinidine)、エンカイニド(encainide);β−アドレナリン遮断薬(例えばメトプロロール(metoprolol)、アセブトロール(acebutolol)、ベタキソロール(betaxolol)、ラベタロール(labetalol)およびチモロール(timolol);強心剤(例えばミルリノン(milrinone)、アムリノン(amrinone)およびドブタミン(dobutamine);降圧剤(例えばエナラプリル(enalapril)、クロニジン(clonidine)、ヒドララジン(hydralazine)、ミノキシジル(minoxidil)、グアナドレル(guanadrel)、グアネチジン(guanethidine);利尿剤(例えばアミロライド(amiloride)およびヒドロクロロチアジド(hydrochlorothiazide);冠血管拡張薬(例えばジルチアゼム(diltiazem)、アミオダロン(amiodarone)、イソクスプリン(isoxspurine)、ナイリドリン(nylidrin)、トラゾリン(tolazoline)およびベラパミル(verapamil);血管収縮薬(例えばジヒドロエルゴタミン(dihydroergotamine)、エルゴタミン(ergotamine)およびメチルセルギド(methylsergide);抗潰瘍剤(例えばラニチジン(ranitidine)およびシメチジン(cimetidine);麻酔薬(例えばリドカイン(lidocaine),ブピバカイン(bupivacaine)、クロロプロカイン(chloroprocaine)、ジブカイン(dibucaine);抗鬱剤(例えばイミプラミン(imipramine)、デシプラミン(desipramine)、アミトリプチリン(amitryptiline)、ノルトリプチリン(nortryptiline);精神安定剤および鎮静剤(例えばクロルジアゼポキシド(chlordiazepoxide)、ベナシチジン(benacytyzine)、ベンズキナミド(benzquinamide)、フルラゼパム(flurazepam)、ヒドロキシジン(hydroxyzine)、ロキサピン(loxapine)およびプロマジン(promazine));抗精神病薬(例えばクロルプロチキセン(chlorprothixene)、フルフェナジン(fluphenazine)、ハロペリドール(haloperidol)、モリンドン(molindone)、チオリダジン(thioridazine)およびトリフルオペラジン(trifluoperazine);抗微生物剤(抗バクテリア、抗菌・カビ、抗原生生物および抗ウイルス剤)。
有用な治療部分の種類にはアジュバントを含む。アジュバントは例えば、とりわけ当該技術分野で周知のキーホールリンペットヘモシアニン結合物、モノホスホリル脂質A、マイコプラズマ−由来リポペプチドMALP−2、コレラトキシンBサブユニット、大腸菌(Esherichia coli)熱不安定性トキシン、破傷風トキソイドに由来するユニバーサルTヘルパーエピトープ、インターロイキン−12、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、シクロデキストリン、スクワレン、アルミニウム塩、髄膜炎菌の外膜小胞(OMV)、モンタニド(montanide)ISA、TiterMax(商標)(モンタナ州、セントルイスのシグマから入手可能)、ニトロセルロース吸着、QuilAのような免疫−刺激複合体、Gerbu(商標)アジュバント(ゲルブ バイオテクニーク(Gerbu Biotechnik)、キルヒバルド、ドイツ)、トレオニルムラミルジペプチド、チモシン アルファ、ブピバカイン、GM−CSF、不完全フロインドアジュバント、MTP−PE/MF59(チバ/ガイギー(Ciba/Geigy)、バーゼル、スイス)、ポリホスファゼン、セッケンボクの木(Quillaja saponaria)に由来するサポニンおよびSyntexアジュバント製剤(バイオカイン(Biocine)、エミリーヴァレ、カリフォルニア州)から選択することができる。
本発明の組成物に包含するために好適な抗微生物剤には、例えばβ−ラクタム剤、キノロン剤、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタムブトール、ヘキサミジンイソチオネート、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メタンアミド、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾールおよびアマンタジンの製薬学的に許容され得る塩を含む。
本発明の実施に使用する他の薬剤部分には、抗癌剤(例えばアンチアンドロゲン(例えばロイプロリド(leuprolide)またはフルタミド(flutamide))、殺細胞剤(例えばアドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β−2−インターフェロン)抗−エストロゲン剤(例えばタモキシフェン)、代謝拮抗物(例えばフルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン)を含む。またこの分類に含まれるのは、診断および治療の両方のための放射性同位体に基づく作用物質およびリシンのような結合トキシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン(mytansin)、CC−1065、C−1027、デュオカルマイシン、カリーチマイシンおよび関連する構造およびそれらの類似体である。
治療部分はホルモン(例えばメドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲステロール、オクトレチドまたはソマトスタチン);筋弛緩剤(例えばシンナメドリン(cinnamedrine)、シクロベンザプリン(cyclobenzaprine)、フラボキセート(flavoxate)、オルフェナドリン(orphenadrine)、パパヴェリン(papaverine)、メベヴェリン(mebeverine)、イダヴェリン(idaverine)、リトドリン(ritodrine)、ジフェノキシレート(diphenoxylate)、ダントロレン(dantrolene)およびアズモレン(azumolen));抗痙剤;骨−活性剤(例えばジホスホネートおよびホスホノアルキルホスフィネート剤化合物);内分泌調節(modulating)物質(例えば、避妊薬(例えばエチノジオール(ethinodiol)、エチニルエストラジオール、ノレチンドロン(norethindrone)、メストラノール(mestranol)、デソゲステレル(desogestrel)、メドロキシプロゲステロン(medroxyprogesterone))、糖尿病の調節物質(例えばグリブリド(glyburide)またはクロルプロパミド(chlorpropamide)、テストラクトンまたはスタノゾロールのような同化産物、アンドロゲン類(例えばメチルテストステロン、テストステロンまたはフルオキシメステロン)、抗利尿物(例えばデスモプレッシン(desmopressin)およびカルシトニン(calcitonin))であることができる。
また本発明に使用するのはエストロゲン(例えばジエチルシチルベステロール)、グルココルチコイド(例えばトリアムシノロン、ベタメサゾン等)、およびノレチンドロン、エチノジオール、ノレエチンドロン、レボノルゲストレルのようなプロゲステロン;甲状腺剤(例えばリオチロニン(liothyronine)またはレボチロキシン(levothyroxine)または抗−甲状腺剤(例えばメチマゾール(methimazole));抗過プロラクチン血症剤(例えばカベルゴリン(cabergoline);ホルモンサプレッサー(例えばダナゾール(danazol)またはゴセレリン(goserelin))、子宮収縮剤(例えばメチルエルゴノビン(methylergonovine)またはオキシトシン(oxytocin)およびミオプロストール(mioprostol)、アルプロスタジル(alprostadil)またはジノプロストーン(dinoprostone)のようなプロスタグランジンである。
他の有用な修飾基には免疫調節剤(例えば抗ヒスタミン剤、ロドキサミド(lodoxamide)および/またはクロモリン(cromolyn)のようなマスト細胞安定化剤、ステロイド(例えばトリアムシノロン(triamcinolone)、ベクロメタゾン(beclomethazone)、コルチゾン(cortisone)、デキサメタゾン(dexamethasone)、プレドニゾロン(prednisolone)、メチルプレドニゾロン(methylprednisolone)、ベクロメタゾン(beclomethasone)またはクロベタゾル(clobetasol))、ヒスタミンH2アンタゴニスト(例えばファモチジン(famotidine)、シメチジン(cimetidine)、ラニチジン(ranitidine))、免疫抑制剤(例えばアザチオプリン(azathioprine)、シクロスポリン(cyclosporin))等を含む。
スリンダク(sulindac)、エトドラク(etodolac)、ケトプロフェン(ketoprofen)およびケトロラク(ketorolac)のような抗炎症活性を有する群も使用する。本発明と一緒に使用する他の薬剤は、当業者には明らかである。
F.修飾された糖の調製法
本発明の結合物を形成するために有用な修飾された糖を本明細書で検討する。この検討は説明の簡明さのために水溶性ポリマーで修飾された糖の調製に焦点をあてる。特にこの検討はポリ(エチレングリコール)部分を含む修飾された糖の調製に焦点をあてる。当業者は本明細書に記載する方法が修飾された糖の調製に広く応用可能であり、したがってこの検討は本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないと考えるだろう。
一般に糖部分および修飾基は、典型的には連結法により新規な有機官能基または非反応性種に転移される反応基の使用を介して一緒に連結される。糖の反応性官能基(1つまたは複数)は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明の実質に有用な反性基および反応の種類は、一般にバイオコンジュゲート(bioconjugate)化学の分野で周知なものである。反応性糖部分を用いて利用可能な現在好適な種類の反応は、比較的穏和な条件下で進行するものである。これらには限定するわけではないが、求核性置換(例えばアミンおよびアルコールとアシルハライド、活性エステルとの反応)、求電子置換(例えばエナミン反応)、および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加(例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加)を含む。これらのおよび他の有用な反応は、例えばSmith and March、進歩した有機化学(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY)、第5版、ジョン ウィリー&サンズ、ニューヨーク、2001;Hermanson、バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE TECHNIQUES)、アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびFeeney et al.,タンパク質の修飾:化学シリーズの進歩(MODIFICATION OF PROTEINS:Advances in Chemistry Series)、第198巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.、1982で検討されている。
糖核または修飾基から下がる(pendant)有用な反応性官能基には、限定するわけではないが以下を含む:
(a)カルボキシル基およびそれらの種々の誘導体、限定するわけではないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、p−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む;
(b)例えばエステル、エーテル、アルデヒド等に転換できるヒドロキシル基;
(c)ハロアルキル基、ここでハライドは例えばアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンのような求核性基に後で置き換わることができ、これによりハロゲン原子の官能基で新たな基の共有結合をもたらす;(d)ディールス−アルダー反応に参加することができるジエノフィル基、例えばマレイミド基;
(e)後の誘導化が例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムのようなカルボニル誘導体の形成を介して、あるいはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加のようなメカニズムを介して可能となるようなアルデヒドまたはケトン基;
(f)例えばスルホンアミドを形成するために、アミンとの後の反応のためのスルホニルハライド基;(g)例えばジスルフィドに転換されるか、またはアルキルおよびアシルハライドと反応することができるチオール基;
(h)例えばアシル化、アルキル化または酸化され得るアミンまたはスルフヒドリル基;(i)例えば付加環化、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン;および
(j)例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
反応性官能基は、それらが反応性糖の核(reactive suger nucleus)または修飾基の集成に必要な反応に参加せず、または妨害しないように選択することができる。あるいは反応性官能基は保護基の存在により反応へ参加することから保護することができる。当業者は選択した組の反応条件を妨害しないように、どのように特定の官能基を保護するかを理解している。例えば有用な保護基は、Greene et al.、有機合成における保護基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、ジョン ウィリー&サンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク、1991を参照にされたい。
以下に続く検討では、本発明の実施に有用な多数の修飾された糖の具体例を説明する。
例示態様ではシアル酸誘導体を糖の核として利用して、これに修飾基を結合する。シアル酸誘導体についての検討に焦点をあてるのは、具体的説明の明瞭性のみのためであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は例としてシアル酸を使用して説明した様式に準じて、種々の他の糖部分を活性化し、そして誘導化することができると考えるだろう。例えばガラクトース、グルコース、N−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾して、当該技術分野で認識されている方法により容易に修飾される幾つかの糖基質を挙げるために多数の方法を利用することができる。例えばElhalabi et al.,Curr.Med.Chem.6:93(1999):およびSchafer et al.,J.Org.Chem.65:24(2000)を参照にされたい。
例示態様では、本発明の方法により修飾するペプチドは哺乳動物細胞(例えばCHO細胞)またはトランスジェニック動物で生産されるペプチドであり、すなわちN−および/またはO−結合オリゴ糖鎖を含み、これらは不完全にシアル化されている。シアル酸を欠き、そして末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、PEG化、PPG化またはそうではなく修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。
スキーム4では、マンノサミングリコシド1を保護されたアミノ酸(例えばグリシン)誘導体の活性化エステルを用いて処理し、糖のアミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に転換する。付加物をアルドラーゼを用いて処理してシアル酸2を形成する。化合物2をCMP−SAシンテターゼの作用により対応するCMP誘導体へ転換し、続いてCMP誘導体の触媒的水素付加により化合物3を生成する。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンは、化合物3を活性化PEGまたはPPG誘導体と反応させることによりPEGまたはPPG結合の位置として利用して(例えばPEG−C(O)NHS、PPG−C(O)NHS)、それぞれ4または5を生成する。
Figure 0006321724
表2はPEGまたはPPG部分により誘導化される糖モノホスフェートの代表例を説明する。表2の相当の化合物がスキーム1の方法により調製される。他の誘導体は技術的に認識されている方法により調製される。例えばKeppler et al.,Glycobiology 11:11R(2001);およびCharter et al.,Glycobiology 10:1049(2000)を参照にされたい。他のアミン反応性PEGおよびPPG類似体は市販されているか、または当業者が容易に入手できる方法により調製することができる。
Figure 0006321724
本発明の実施に使用する修飾された糖ホスフェートは、上記に説明したものと同じく他の位置でも置換され得る。現在好適なシアル酸の置換を式5に説明する。
Figure 0006321724
式中、Xは好ましくは−O−、−N(H)−、−S、CH−およびN(R)から選択される連結基であり、ここで各RはR〜Rから独立して選択される員である。記号Y、Z、AおよびBは、各々がXの同一性について上に説明した基から選択される基を表す。X、Y、Z、AおよびBはそれぞれ独立して選択され、したがってそれらは同じかまたは異なることができる。記号R、R、R、RおよびRはH、ポリマー、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子または他の部分を表す。記号R6はH、OHまたはポリマーを表す。あるいはこれらの記号はポリマー、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子または他の部分に結合したリンカーを表す。
別の例示態様では、スキーム5に説明するように無水クロロ酢酸の使用による求核置換のためにマンノサミンが同時にアシル化そして活性化される。
Figure 0006321724
生成したクロロ−誘導化グリカンをピルベートとアルドラーゼの存在下で接触させ、クロロ−誘導化シアル酸を形成する。対応するヌクレオチド糖はシアル酸誘導体を適当なヌクレオチドトリホスフェートおよびシンテターゼと接触させることにより調製する。シアル酸部分のクロロ基をチオ−PEGのような求核性PEG誘導体に置き換える。
さらなる例示態様では、スキーム6に示すように、マンノサミンをビス−HOPTジカルボキシレートを用いてアシル化し、対応するアミド−アルキル−カルボン酸を生成し、これを続いてシアル酸誘導体に転換する。このシアル酸誘導体をヌクレオチド糖に転換し、そしてカルボン酸を活性化し、そしてアミノ−PEGのような求核性PEG誘導体と反応させる。
Figure 0006321724
スキーム7に説明する別の例示態様では、アミン−およびカルボキシル−保護ノイラミン酸を、1級ヒドロキシル基を対応するp−トルエンスルホン酸エステルに転換することにより活性化し、そしてメチルエステルを開裂する。活性化されたノイラミン酸は対応するヌクレオチド糖に転換され、そして活性基はチオ−PEGのような求核性PEG種に置き換える。
Figure 0006321724
スキーム8に説明するようなさらなる例示態様では、アミン−およびカルボキシル−保護ノイラミン酸誘導体の1級ヒドロキシル部分を、クロロ−PEGのような求電子性PEGを使用してアルキル化する。続いてメチルエステルを開裂し、そしてPEG−糖をヌクレオチド糖に転換する。
Figure 0006321724
シアル酸以外のグリカンは、本明細書に説明する方法を使用してPEGで誘導化することができる。誘導化されたグリカンそれ自体が本発明の範囲内である。すなわちスキーム9はPEG化ガラクトースヌクレオチド糖への例示合成経路を提供する。ガラクトースの1級ヒドロキシル基は対応するトルエンスルホン酸エステルのように活性化され、これは続いてヌクレオチド糖に転換される。
Figure 0006321724
スキーム10は、ガラクトース−6−アミン部分に基づくガラクトース−PEG誘導体を調製する例示経路を説明する。すなわちガラクトサミンをヌクレオチド糖に転換し、そしてガラクトサミンのアミン部分を活性なPEG誘導体で官能化する。
Figure 0006321724
スキーム11はガラクトース誘導体の別の例示経路を提供する。スキーム11の出発点はガラクトース−2−アミンであり、これをヌクレオチド糖に転換する。ヌクレオチド糖のアミン部分は、メトキシ−PEG(mPEG)カルボン酸のようなPEG誘導体を結合するための位置である。
Figure 0006321724
本明細書で開示する結合物に結合する部分の例には、限定する訳ではないがPEG誘導体(例えばアシル−PEG、アシル−アルキル−PEG、アルキル−アシル−PEGカルバモイル−PEG、アリール−PEG、アルキル−PEG)、PPG誘導体(例えばアシル−PPG、アシル−アルキル−PPG、アルキル−アシル−PPGカルバモイル−PPG、アリール−PPG)、ポリアスパラギン酸、ポリグルタメート、ポリリシン、治療部分、診断部分、マンノース−6−ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、SLe、マンノース、マンノース−6−ホスフェート、シアリルルイスX、FGF、VFGF、タンパク質(例えばトランスフェリン)、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、デキストラン、修飾されたデキストラン、アミロース、ビスホスフェート、ポリ−SA、ヒアルロン酸、ケリタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ状オリゴ糖、ペプチド等を含む。種々の修飾基をサッカリド部分に結合する方法は、当業者が容易に入手できるものである(ポリ(エチレングリコールの化学:生物工学的および生物医学的応用(POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS)、J.Milton Harris編集、プレナム出版社、1992;ポリ(エチレングリコール)の化学および生物学的応用(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS)、J.Milton Harris編集、ACSシンポジウムシリーズ、No.680、アメリカ化学学会、1997;Hermanson、バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE TECHNIQES)、アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびDunn et al.編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、No.469、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991)。
糖、ヌクレオチド糖および誘導体の精製
上記の方法により生成されたヌクレオチド糖および誘導体は、精製せずに使用することができる。しかし通常、生成物を回収することが好ましい。薄または厚層(thick layer)クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過のような標準的な周知技法を使用することができる。膜濾過を使用すること、より好ましくは逆浸透膜を使用することが好ましく、または回収のためにはこれから、そして本明細書に引用する技術文献で検討するように1以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好適である。例えば膜濾過(ここで膜は約3000〜約10,000の分子量カットオフを有する)を使用して、10,000Da未満の分子量を有する試薬についてタンパク質を取り出すために使用することができる。次に膜濾過または逆浸透を使用して塩を除去し、かつ/または生成物サッカリドを精製するために使用することができる(例えば国際公開第98/15581号パンフレットを参照にされたい)。ナノフィルター(nanofilter)膜は1種の逆浸透膜であり、これは使用する膜に依存して1価の塩を通すが、多価の塩および約100から約2,000ダルトンより大きい非電荷溶質は保持する。このように典型的な応用では、本発明の方法により調製されるサッカリドは膜内に保持され、そして混入する塩は通過する。
G.架橋性基
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製には、修飾基の糖残基への結合、そしてグリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物の形成を含む。このように修飾基を糖へ結合するために架橋剤を使用することが好ましいことが多い。修飾基を炭水化物部分に結合するために使用することができる二官能性化合物の例には、限定するわけではないが二官能性ポリ(エチレングリコール)、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル等を含む。炭水化物を他の分子に連結するための一般的取り組みは、技術文献にて知られている。例えば、Lee et al.,Biochemistry 28:1856(1989);Bhatia et al.,Anal.Biochem.178:408(1989);Janda et al.,J.Am.Chem.Soc.112:8886(1990)およびBednarski et al.、国際公開第92/18135号パンフレットを参照にされたい。以下の考察は反応基が新生の修飾された糖の糖部分上で良性(benign)として処置される。この考察に焦点をあてるのは具体的説明の明瞭性のためである。当業者はこの考察が修飾基上の反応基にも関連すると考えるだろう。
例示の方法には、ヘテロ二官能性クロスリンカーSPDP(n−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート)を使用して、保護されたスルフヒドリルの糖への包含、そして次に修飾基上の別のスルフヒドリルとジスルフィド結合を形成するためにスルフヒドリルの脱保護が関与する。
SPDPがグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する修飾された糖の能力に悪影響を及ぼす場合、2−イミノチオランまたはN−スクシンイミジルS−アセチルチオアセテート(SATA)のような多数のクロスリンカーの1つを使用して、ジスルフィド結合を形成する。2−イミノチオランは1級アミンと反応し、即座に非保護スルフヒドリルをアミノ−含有分子に包含する。SATAも1級アミンと反応するが保護されたスルフヒドリルを包含し、これは後にヒドロキシルアミンを使用して脱アセチル化されて遊離のスルフヒドリルを生成する。各々の場合で、包含されたスルフヒドリルは他のスルフヒドリルまたは保護されたスルフヒドリルとSPDPのように自由に反応し、必要なジスルフィド結合を形成する。
上記の方法は例であり、そして本発明で使用するリンカーを限定するものではない。修飾基をペプチドに架橋するための様々な方法に使用できる他のクロスリンカーを入手することができる。例えばTPCH(S−(2−チオピリジル)−L−システインヒドラジドおよびTPMPH(S−(2−チオピリジル)メルカプト−プロピオノヒドラジド)は、穏和な過ヨウ素酸塩処理により前以て酸化された炭水化物部分と反応し、このようにクロスリンカーのヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩が生成したアルデヒドとの間にヒドラゾン結合を形成する。TPCHおよびTPMPHは2−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を糖に導入し、これはDTTで脱保護することができ、そして次いで成分間にジスルフィド結合を形成するように結合物に使用される。
ジスルフィド結合が安定な修飾された糖を生成するには適さないことが分かった場合、成分間により安定な結合を包含する他のクロスリンカーを使用することができる。ヘテロ二官能性クロスリンカーGMBS(N−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド)およびSMCC(スクシンイミジル4−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサン)は1級アミンと反応し、これがマレイミド基を成分上に導入する。続いてマレイミド基は前に挙げたクロスリンカーにより導入することができる他の成分上のスルフヒドリルと反応し、このようにして成分間に安定なチオエーテル結合を形成する。成分間の立体障害がいずれかの成分の活性または修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質として作用する能力を妨害する場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、そして前に挙げた幾つかのクロスリンカー(例えばSPDP)の誘導体を含むクロスリンカーを使用することができる。このように有用な適当なクロスリンカーが豊富に存在し:その各々が最適なペプチド結合物および修飾された糖の生成に及ぼす効果に依存して選択される。
さまざまな試薬が、分子内の化学的架橋で修飾糖の成分を修飾するために使用される(架橋試薬および架橋結合手順の総説に関しては:Wold,F.Meth.Enzymol.25:623−651,1972;Weetall,H.H.,and Cooney,D.A.:薬剤としての酵素(ENZYME AS DRUGS)で、(Holcenberg and Roberts編集)、第395〜442頁、ウィリー、ニューヨーク、1981;Ji,T.H,Meth.Enzymol.91:580−609,1983:Mattson et al.,Mol.Biol.Rep.17:167−183,1993を参照にされたい(これらすべては引用により本明細書に編入する))。
好適な架橋剤は種々のゼロ−長(zero−length)、ホモ−二官能性およびヘテロ−二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ−長架橋試薬には、外因性の物質の導入が無い、2つの必須の化学基の直接的結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する試薬は、この範疇に属する。別の例はカルボキシルと1級アミノ基の縮合を導入してアミド結合を形成する、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード(Woodward’s)試薬K−(2−エチル−5−フェニルイソオキサゾリウム−3’−スルホネート)およびカルボニルイミダゾールのような試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トラスングルタミナーゼ(グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ;EC2.3.2.13)をゼロ−長の架橋試薬として使用することができる。この酵素は通常、基質として1級アミノ基を用いて、タンパク質−結合グルタミン残基のカルボキサミド基でアシル転移反応を触媒する。好適なホモ−およびヘテロ−二官能性試薬はそれぞれ2つの同一または2つの似ていない部位を含み、これらはアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドールまたは非特異的基と反応性となり得る。
2.架橋試薬中の好適な特異的部位
a.アミノ−反応基
1つの好適な態様では、クロス−リンカー上のこの部位はアミノ−反応基である。アミノ−反応基の有用な非限定的例には、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、イミドエステル、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、p−ニトロフェニルエステル、アルデヒドおよびスルホニルクロライドを含む。
NHSエステルは修飾された糖成分の1級(芳香族を含む)アミノ基と優先的に反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は1級アミンと反応を競合するが、反応生成物は不安定であり、そして容易に加水分解される。この反応にはNHSエステルの酸カルボキシル上でアミンの求核的攻撃が関与し、アミドを形成してN−ヒドロキシスクシンイミドを放出する。このようにして元のアミノ基の正電荷が失われる。
イミドエステルは修飾された糖成分のアミン基との反応のための最も特異的なアシル化試薬である。7から10の間のpHで、イミドエステルは1級アミンとのみ反応する。1級アミンは求核的にイミデートを攻撃し、高pHでアミジンに、または低pHで新しいイミデートに分解する中間体を生成する。この新たな中間体は別の1級アミンと反応させることができ、これにより単官能性イミデートが二官能的に反応すると仮定する場合、2つのアミノ基を架橋する。1級アミノとの反応の主な生成物は、元のアミンよりも強力な塩基であるアミジンである。したがって元のアミノ基の正電荷が保持される。
イソシアネート(およびイソチオシアネート)は修飾された糖成分の1級アミンと反応して、安定な結合を形成する。スルフヒドリル、イミダゾールおよびチロシル基とそれらの反応は、比較的不安定な生成物を生じる。
アシルアジドもアミノ−特異的試薬として使用され、ここで親和性成分の求核性アミンがわずかにアルカリ性の条件下、例えばpH8.5で酸性カルボキシル基を攻撃する。
1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンのようなアリールハライドは、修飾された糖成分のアミノ基およびチロシンのフェノール性基と優先的に反応するが、スルフヒドリルおよびイミダゾール基とも反応する。
モノ−およびジカルボン酸のp−ニトロフェニルエステルも有用なアミノ−反応基である。試薬の特異性はそれほど高くないが、α−およびε−アミノ基は最も急速に反応するようである。
グルタルアルデヒドのようなアルデヒドは、修飾された糖の1級アミンと反応する。不安定なシッフ塩基がアミノ基とアルデヒドのアルデヒドとの反応で形成されるが、グルタルアルデヒドは安定な架橋により修飾糖を修飾することができる。pH6〜8で(このpHは典型的な架橋条件である)、環式ポリマーは脱水を受けてα−β不飽和アルデヒドポリマーを形成する。しかしシッフ塩基は別の二重結合と結合した時に安定である。両二重結合の共鳴的相互作用は、シッフ結合の加水分解を防止する。さらに高い局所的濃度でアミンはエチレン二重結合を攻撃して安定なマイケル付加生成物を形成することができる。
芳香族スルホニルクロライドは、修飾された糖成分の種々の部位と反応するが、安定なスルホンアミド結合を生じるアミノ基との反応が最も重要である。
b.スルフヒドリル−反応基
別の好適な態様では、部位はスルフヒドリル−反応性基である。スルフヒドリル−反応基の有用な非限定的例には、マレイミド、アルキルハライド、ピリジルジスルフィドおよびチオフタルイミドを含む。
マレイミドは修飾された糖成分のスルフヒドリル基と優先的に反応して安定なチオエーテル結合を形成する。それらはまた、より一層遅い反応速度でヒスチジンの1級アミノ基およびイミダゾール基とも反応する。しかしpH7では、このpHで単純なチオールの反応速度は対応するアミンの反応速度よりも1000倍大きいので、マレイミド基はスルフヒドリルに特異的な基と考えられる。
アルキルハライドはスルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾールおよびアミノ基と反応する。しかし中性からわずかにアルカリ性のpHで、アルキルハライドは主にスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。より高pHではアミノ基との反応が有利である。
ピリジルジスルフィドはジスルフィド交換を介して遊離のスルフヒドリルと反応して、混合ジスルフィドを与える。結果としてピリジルジスルフィドは最も特異的なスルフヒドリル−反応基である。
チオフタルイミドは遊離のスルフヒドリル基と反応してジスルフィドを形成する。
c.カルボキシル−反応性残基
別の態様では、水および有機溶媒に可溶性のカルボジイミドをカルボキシル−反応試薬として使用する。これらの化合物は遊離のカルボキシル基と反応してプソイドウレアを形成し、次にこれは利用可能なアミンにカップリングしてアミド結合を形成することができる。カルボジイミドを用いてカルボキシル基を修飾する手順は、当該技術分野では周知である(Yamada et al.,Biochemistry 20:4836−4842,1981を参照にされたい)。
3.架橋試薬中の好適な非特異的部位
部位−特異的な反応性部分に加えて、本発明は糖を修飾基に連結するための非特異的な反応性基も企図する。
非特異的なクロス−リンカーの例には、暗中では完全に不活性な光活性化可能な(photoactivatable)基を含み、これは適切なエネルギーの光子を吸収すると反応性種に変換される。好適な態様では、光活性化可能な基は、アジドの加熱または光分解で生成するニトレンの前駆体から選択される。電子−欠損ニトレンは極めて反応性であり、そしてN−H、O−H、C−HおよびC=Cを含む種々の化学結合と反応することができる。3種類のアジド(アリール、アルキルおよびアシル誘導体)を使用することができるが、アリールアジドが現在好適である。光分解でのアリールアジドの反応性は、C−H結合よりもN−HおよびOHでより良い。電子−欠損アリールニトレンは急速に環が拡大してデヒドロアゼピンを形成し、これはC−H挿入生成物を形成するよりは求核性物質と反応する傾向がある。アリールアジドの反応性は環中のニトロまたはヒドロキシル基のような電子−吸引置換基の存在により上げることができる。そのような置換はより長い波長にアリールアジドの最大吸収を支援する(push)。非置換アリールアジドは260〜280nmに範囲の最大吸収を有し、一方、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは305nmを越えて有意な光を吸収する。したがってヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、非置換アリールアジドよりも親和性成分に関してより害が少ない光分解条件を使用するので最も好ましい。
別の好適な態様では、光活性化可能な基はフッ素添加されたアリールアジドから選択される。フッ素添加されたアリールアジドの光分解産物はアリールニトレンであり、そのすべてが高い効率でのC−H結合の挿入を含むこの基に特徴的な反応を受ける(Keana et al.,J.Org.Chem.55:3640−3647,1990)。
別の態様では、光活性化可能な基はベンゾフェノン残基から選択される。ベンゾフェノン試薬は一般にアリールアジド試薬よりも高い架橋結合収量を与える。
別の態様では、光活性化可能な基はジアゾ化合物から選択され、これが光分解で電子−欠損カルベンを形成する。これらのカルベンはC−H結合への挿入、二重結合への付加(芳香族系を含む)、水素誘引および求核中心への配位を含む種々の反応を受け、炭素イオンを与える。
さらに別の態様では、光活性化可能な基はジアゾピルベートから選択される。例えばp−ニトロフェニルジアゾピルベートのp−ニトロフォニルエステルは脂肪族アミンと反応してジアゾピルビン酸アミドを与え、これは紫外線の光分解を受けてアルデヒドを形成する。光分解したジアゾピルベートで修飾された親和性成分はホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドのように反応して架橋を形成する。
4.ホモ二官能性試薬
a.第一アミンと反応性のホモ二官能性クロスリンカー
アミン−反応性クロス−リンカーの合成、特性および応用は、技術文献で工業的使用のために記載されている(架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい)。多くの試薬が利用可能である(例えば、ピアスケミカル(Pierce Chemical)社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
ホモ二官能性NHSエステルの好適な非限定的例には、ジスクシンイミジルグルタレート(DSG)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS)、ジスクシンイミジルタルトレート(DST)、ジスルホスクシンイミジルタルトレート(スルホ−DST)、ビス−2−(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチルスルホン(BSOCOES)、ビス−2−(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチルスルホン(スルホ−BSOCOES)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)およびジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(スルホ−DSP)を含む。ホモ二官能性イミドエステルの好適な非−限定的例には、ジメチルマロンイミデート(DMM)、ジメチルスクシンイミデート(DMSC)、ジメチルアジピミデート(DMA)、ジメチルピメリミデート(DMP)、ジメチルスベリミデート(DMS)、ジメチル−3,3’−オキシジプロピオンイミデート(DODP)、ジメチル−3,3’−(メチレンジオキシ)ジプロピオンイミデート(DMDP)、ジメチル−3’−(ジメチレンジオキシ)ジプロピオンイミデート(DDDP)、ジメチル−3,3’−(テトラメチレンジオキシ)−ジプロピオンイミデート(DTDP)およびジメチル−3,3’−ジチオビスプロピオンイミデート(DTBP)を含む。
ホモ二官能性イソチオシアネートの好適な非限定的例には:p−フェニレンジイソチオシアネート(DITC)、および4,4’−ジイソチオシアノ−2,2’−ジスルホン酸スチルベン(DIDS)を含む。
ホモ二官能性イソシアネートの好適な非限定的例には、キシレン−ジイソシアネート、トルエン−2,4−ジイソシアネート、トルエン−2−イソシアネート−4−イソチオシアネート、3−メトキシジフェニルメタン−4,4’−ジイソシアネート、2,2’−ジカルボキシ−4,4’−アゾフェニルジイソシアネートおよびヘキサメチレンジイソシアネートを含む。
ホモ二官能性アリールハライドの好適な非限定的例には、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(DFDNB)、および4,4’−ジフルオロ−3,3’−ジニトロフェニル−スルホンを含む。
ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の好適な非限定的例には、グリオキサール、マロンジアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む。
ホモ二官能性アシル化試薬の好適な非限定的例には、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルを含む。
ホモ二官能性芳香族スルホニルクロライドの好適な非限定的例には、フェノール−2,4−ジスルホニルクロライドおよびα−ナフトール−2,4−ジスルホニルクロライドを含む。
さらなるアミノ−反応性ホモ二官能性試薬の好適な非限定的例には、アミンと反応してビスカルバメートを与えるエリトリトールビスカルボネートを含む。
b.遊離スルフヒドリル基と反応性のホモ二官能性クロスリンカー
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい)。多くの試薬が市販されている(例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
ホモ二官能性マレイミドの好適な非限定的例には、ビスマレイミドヘキサン(BMH)、N,N’−(1,3−フェニレン)ビスマレイミド、N,N’−(1,2−フェニレン)ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミドおよびビス(N−マレイミドメチル)エーテルを含む。
ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの好適な非限定的例には、1,4−ジ−3’−(2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミドブタン(DPDPB)を含む。
ホモ二官能性アルキルハライドの好適な非限定的例には、2,2’−ジカルボキシ−4,4’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α,α’−ジヨード−p−キシレンスルホン酸、α,α’−ジブロモ−p−キシレンスルホン酸、N,N’−ビス(b−ブロモメチル)ベンジルアミン、N,N’−ジ(ブロモアセチル)フェニルヒドラジンおよび1,2−ジ(ブロモアセチル)アミノ−3−フェニルプロパンを含む。
c.ホモ二官能性の光活性化可能なクロスリンカー
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい)。数種の試薬が市販されている(例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
ホモ二官能性の光活性化可能なクロスリンカーの好適な非限定的例には、ビス−β−(4−アジドサリチルアミド)エチルジスルフィド(BASED)、ジ−N−(2−ニトロ−4−アジドフェニル)−シスタミン−S,S−ジオキシド(DNCO)および4,4’−ジチオビスフェニルアジドを含む。
5.ヘテロ二官能性試薬
a.ピリジルジスルフィド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋結合の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい)。多くの試薬が市販されている(例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
ピリジルジスルフィド部分およびアミノ−反応性NHSエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル6−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオンアミドヘキサノエート(LC−SPDP)、スルホスクシンイミジル6−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオンアミドヘキサノエート(スルホ−LCSPDP)、4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)およびスルホスクシンイミジル6−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルアミドヘキサノエート(スルホ−LC−SMPT)を含む。
b.マレイミド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。マレイミド部分およびアミノ−反応性NHSエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、スクシンイミジルマレイミジルアセテート(AMAS)、スクシンイミジル3−マレイミジルプロピオネート(BMPS)、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)N−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−GMBS)スクシンイミジル6−マレイミジルヘキサノエート(EMCS)、スクシンイミジル3−マレイミジルベンゾエート(SMB)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、スルホスクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)、スクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)およびスルホスクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(スルホ−SMPB)を含む。
c.アルキルハライド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。アルキルハライド部分およびアミノ−反応性NHSエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、N−スクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)、スルホスクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−SIAB)、スクシンイミジル−6−(ヨードアセチル)アミノヘキサノエート(SIAX)、スクシンイミジル−6−(6−((ヨードアセチル)−アミノ)ヘキサノイルアミノ)ヘキサノエート(SIAXX)、スクシンイミジル−6−(((4−ヨードアセチル)−アミノ)−メチル)−シクロヘキサン−1−カルボニル)アミノヘキサノエート(SIACX)およびスクシンイミジル−4((ヨードアセチル)−アミノ)−メチルシクロヘキサン−1−カルボキシレート(SIAC)を含む。
アミノ−反応性NHSエステルおよびアルキルジハライド部分を持つヘテロ二官能性試薬の好適な例には、N−ヒドロキシスクシンイミジル 2,3−ジブロモプロピオネート(SDBP)を含む。SDBPは、クロスリンカーをアミノ基に結合することにより親和性成分に分子内クロスリンカーを導入する。1級アミン基に対するジブロモプロピオニル部分の反応性は、反応温度により制御される(McKenzie et al.,Protein Chem.7:581−592(1988))。
アルキルハライド部分およびアミノ−反応性p−ニトロフェニルエステル部分を持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、p−ニトロフェニルヨードアセテート(NPIA)を含む。
他の架橋結合剤も当業者に知られている。例えばPomato et al.、米国特許第5,965,106号明細書を参照にされたい。特定の応用のための適切な架橋剤を選択する能力は、当業者の能力の範囲内である。
d.開裂性リンカー基
さらなる態様では、リンカー基には開裂して糖残基から修飾基を放出することができる基が提供される。多くの開裂性基が当該技術分野では知られている。例えばJung et al.,Biochem.Biophys.Acta 761:152−162(1983);Joshi et al.,J.Biol.Chem.265:14518−14525(1990);Zarling et al.,J.Immunol.124:913−920(1980);Bouizar et al.,Eur.J.Biochem.155:141−147(1986);Park et al.,J.Biol.Chem.261:205−210(1986);Browning et al.,Immunol.143:1859−1867(1989)を参照にされたい。さらに広範な開裂性の二官能性(ホモ−およびヘテロ−二官能性の両方)リンカー基がピアスのような供給元から市販されている。
例示する開裂性部分は、光、熱またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩等のような試薬を使用して開裂することができる。さらに特定の好適な基はエンドサイトーシスされる反応でインビボで開裂される(例えばシス−アコニチル;Shen et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.102:1048(1991)を参照にされたい)。好適な開裂性基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択される員である開裂性部分を含んでなる。
e.修飾された糖のペプチドへの結合
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素を使用してグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに結合される。好ましくは修飾された供与体の糖(1つまたは複数)、酵素(1つまたは複数)および受容体ペプチド(1つまたは複数)の濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下に検討する考察は、シアリルトランスルフェラーゼの内容について説明すると同時に、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に応用することできる。
グリコシルトランスフェラーゼを使用して所望のオリゴ糖構造を合成する多数の方法が知られており、そして一般に本発明に応用することができる。例示方法は例えば、国際公開第96/32491号パンフレット、Ito et al.,Pure Appl.Chem.65:753(1993)、および米国特許第5,352,670号、同第5,374,541号および同第5,545,553明細書に記載されている。
本発明は単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して実施される。例えばシアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用することができる。1以上の酵素を使用するそれらの態様では、酵素および基質は好ましくは最初の反応混合物で合わせられるか、または第2の酵素反応用の酵素および試薬はいったん第1酵素反応が完了したら、またはほぼ完了したら反応媒質に加えられる。2つの酵素反応を1つの反応槽で順次行うことにより、中間体種が単離される手順よりも全体的な収量が改善する。さらに過剰な溶媒および副産物の洗浄および廃棄が減少する。
好適な態様では、各第1および第2酵素がグリコシルトランスフェラーゼである。別の好適な態様では、1つの酵素がエンドグリコシダーゼである。別の好適な態様では、1つの酵素がエキソグリコシダーゼである。さらに好適な態様では、2より多くの酵素を使用して本発明の修飾された糖タンパク質を集成する。酵素は、修飾された糖をペプチドに加える前または後の任意の時点で、ペプチド上のサッカリド構造を改変させるために使用する。
別の好適な態様では、少なくとも2つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そしてペプチドのサッカリド構造に加えられる最後の糖は修飾されていない糖である。代わりに修飾された糖がグリカン構造の内部にあり、したがってグリカン上に最終的な糖は必要ない。例示態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼはGal−PEGのUDP−Gal−PEGからグリカンへの転移を触媒することができ、続いてST3Gal3およびCMP−SA(これは「キャッピング」する非修飾シアル酸をグリカンに加えるために役立つ)の存在下でインキューベーションする(図22A)。
別の態様では、使用する少なくとも2つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そして少なくとも2つの修飾された糖がペプチド上のグリカン構造に加えられる。この様式で、2以上の異なる複合糖質をペプチド上の1以上のグリカンに加えることができる。この方法は、2以上の機能的に異なる修飾された糖を有するグリカン構造を生成する。
例示態様では、ペプチドとGnT−I、IIとUDP−GlcNAc−PEGとのインキューベーションは、GlcNAc−PEG分子をグリカンに付加するために役立ち;次いでガラクトシルトランスフェラーゼとUDP−Galのインキューベーションは、Gal残基をそれに付加するために役立ち;そしてST3Gal3とCMP−SA−Man−6−ホスフェートのインキューベーションは、SA−マンノース−6−ホスフェート分子のグリカンへの付加に役立つ。この反応順序で、PEG化グリカンの機能的特徴ならびにマンノース−6−ホスフェート標的化活性を有するグリカン鎖をもたらす(図22B)。
別の態様では、反応に使用する少なくとも2つの酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、そしてここでも異なる修飾された糖がペプチド上のN−結合およびO−結合グリカンに加えられる。この態様は2つの異なる修飾された糖がペプチドのグリカンに加えられるようになる時、しかしペプチド上の修飾された糖を互いに空間的に離すことが重要である時に特に有用である。例えば修飾された糖が、限定するわけではないがPEGおよびリンカー分子のような他の分子を含む嵩高の分子を含んでなる時、この方法が好ましいかもしれない。修飾された糖はペプチド上のグリカン構造に同時に加えるか、またはそれらを順次加えてもよい。例示態様では、ST3Gal3およびCMP−SA−PEGとのインキューベーションは、シアル酸−PEGをN−結合グリカンに加えるために役立つが、ST3Gal1およびCMP−SA−ビスホスホネートとのインキューベーションはシアル酸−ビスホスホネートをO−結合グリカンへ加えるために役立つ(図22C)。
別の態様では、この方法は1以上のエキソ−またはエンド−グリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは典型的には突然変異体であり、これはグリコシル結合を破壊というようは形成するように工作されている。突然変異体のグリカナーゼは時折、グリコシンターゼと呼ばれるが、典型的には活性部位の酸性アミノ酸残基にアミノ酸残基の置換を含む。
例えばエンドグリカナーゼがエンド−Hである時、置換される活性部位の残基は典型的には130位のAsp、132位のGlu、またはそれらの組み合わせである。アミノ酸は一般にセリン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンに置換される。トランスシアリリダーゼのようなエキソグリコシダーゼも有用である。
突然変異酵素は通常、エンドグリカナーゼの加水分解工程の逆反応に準じる合成工程により反応を触媒する。これらの態様では、グリコシル供与体分子(例えば所望するオリゴ−またはモノ−サッカリド構造)が脱離基を有し、そして反応は供与体分子をタンパク質上のGlcNAc残基へ加えることにより進行する。例えば脱離基はフルオリドのようなハロゲンであることができる。別の態様では脱離基はAsnまたはAsn−ペプチド部分である。さらなる態様では、グリコシル供与体分子上のGlcNAc残基が修飾される。
例えばGlcNAc残基は1,2オキサゾリン部分を含んでなることができる。
好適な態様では、本発明の結合物を生成するために使用する各酵素は触媒量で存在する。特定酵素の触媒量は、その酵素基質の濃度ならびに温度、時間、pH値のような反応条件に従い変動する。予め選択した基質濃度および反応条件下での所定の酵素の触媒量を決定する手段を、当業者は周知である。
上記方法が行なわれる温度は、ちょうど凍結より上から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲で変動することができる。好適な温度範囲は約0℃から約55℃、そしてより好ましくは約30℃から約37℃である。別の例示態様では、本方法の1以上の成分が好熱性酵素を使用して高温で行われる。
反応混合物は受容体がグリコシル化されるために十分な時間、維持され、これにより所望の結合物を形成する。結合物の中にはしばしば数時間後に検出できるものもあり、回収可能な量は通常、24時間以内に得られる。当業者は反応速度は多数の可変性因子(例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒容量)に依存し、これは選択する系に至適化されると理解している。
本発明は修飾されたペプチドの工業的規模の生産も提供する。本明細書で使用するように、工業的規模では一般に少なくとも1グラムの完成され、精製された結合物が生産される。
以下の検討では、本発明は修飾されたシアル酸分子のグリコシル化ペプチドへの結合により例示される。例示する修飾されたシアル酸はPEGで標識される。以下の検討をPEG−修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に焦点をあてるのは具体的説明の明瞭さのためであり、本発明がこれら2つのパートナーの結合に限定されることを意味するものではない。当業者はこの検討が一般にシアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に応用できることを理解している。さらにこの検討は他の水溶性ポリマー、治療部分および生体分子を含むPEG以外の作用物質を含むグリコシル単位の修飾にも等しく応用できる。
酵素的取り組みは、PEG化またはPPG化炭水化物のペプチドまたは糖ペプチドへの選択的導入に使用することができる。この方法はPEG、PPG、または遮蔽された反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、そして適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わせる。所望する炭水化物結合を作るグリコシルトランスフェラーゼを選択し、そして供与体基質として修飾された糖を利用することにより、PEGまたはPPGをペプチド骨格に、糖ペプチドに既存の糖残基に、またはペプチドに加えられた糖残基に直接導入することができる。
シアリルトランスフェラーゼの受容体は本発明の方法により修飾されるペプチド上に、天然に存在する構造として、または組換え的に、酵素的にまたは化学的にそこに配置されたものとして存在する。適当な受容体には例えばGalβ1,4GlcNAc、Galβ1,4GalNAc、Galβ1,3GalNAc、ラクト−N−テトラオース、Galβ1,3GlcNAc、Galβ1,3Ara、Galβ1,6GlcNAc、Galβ1,4Glc(ラクトース)のようなガラクトシル受容体、および当業者に知られている他の受容体を含む(例えば、Paulson et al.,J.Biol.Chem.253:5617−5624(1978)を参照にされたい)。
1つの態様では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は修飾されるペプチド上にペプチドのインビボ合成で存在する。そのようなペプチドは、ペプチドのグリコシル化パターンの前修飾無しで特許請求する方法を使用してシアリル化することができる。あるいは本発明の方法を使用して、適切な受容体を含まないペプチドをシアリル化することができ;最初にペプチドを当該技術分野で既知の方法により受容体を含むように修飾する。例示態様では、GalNAc残基をGalNAcトランスフェラーゼの作用により加える。
例示態様では、ガラクトシル受容体はガラクトース残基をペプチドに連結された適切な受容体(例えばGlcNAc)に結合することにより集成する。この方法には修飾されるペプチドを適当量のガラクトシルトランスフェラーゼ(例えばgalβ1,3またはgalβ1,4)および適当なガラクトシル供与体(例えばUDP−ガラクトース)を含む反応混合物とインキューベーションすることを含む。反応は実質的に完了するまで進行するように行うか、あるいは反応は前以て選択した量のガラクトース残基が加えられた時に終了する。選択したサッカリド受容体を集成する他の方法は、当業者には明らかである。
さらに別の態様では、ペプチド−結合オリゴ糖は最初に全体的または部分的「改作(trimmed」されて、シアリルトランスフェラーゼの受容体または適当な受容体を得るために1以上の適切な残基を加えることができる部分のいずれかを露出する。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素(例えば米国特許第5,716,812号明細書を参照にされたい)は、付加および改作反応に有用である。「改作」およびN−結合およびO−結合グリカンの改造に関する詳細な検討は、本文献のいたるところに提供されている。
以下の検討では、本発明の方法が水溶性ポリマーを結合した修飾された糖の使用により例示される。これに焦点をあてるのは具体的説明の明瞭さのためである。当業者はこの検討は修飾される糖が治療部分、生体分子等を持つ態様にも等しく関連すると考えるだろう。
修飾される糖を加える前に炭水化物残基が「改作」される本発明の例示態様を図13に説明し、これは高マンノースが第1世代の2アンテナ構造に戻し改作されるスキームを説明する。水溶性ポリマーを持つ修飾された糖は、「戻し改作(trimming back」により露出した1以上の糖残基に結合される。1つの態様では水溶性ポリマーは水溶性ポリマーに結合したGlcNAc部分を介して加えられる。修飾されるGlcNAcは2アンテナ構造の1または両末端マンノース残基に付けられる。あるいは非修飾GlcNAcを分岐種の1または両末端に加えることができる。
別の例示態様では、水溶性ポリマーが、末端マンノース残基上に加えられるGlcNAc残基に結合するガラクトース残基を有する修飾された糖を介して、2アンテナ構造の1または両方の末端マンノース残基に加えられる。あるいは非修飾Galを1または両方の末端GlcNAc残基に加えることができる。
さらなる態様では、水溶性ポリマーが修飾されたシアル酸を使用してGal残基に加えられる。
別の例示態様を図14で説明し、これは図13に示すスキームと同様であり、ここで高マンノース構造がマンノースに「戻し改作」され、それから2アンテナ構造が分岐する。
1例では、水溶性ポリマーがポリマーで修飾されたGlcNAcを介して加えられる。あるいは非修飾GlcNAcをマンノースに加え、続いて結合した水溶性ポリマーを持つGalを加える。さらに別の態様では、非修飾GlcNAcおよびGal残基を順次マンノースに加え、続いて水溶性ポリマーで修飾したシアル酸部分を加える。
図15は図13に類似したスキームを使用してさらなる例示態様を説明し、ここで高マンノースをGlcNAcに「戻し改作」し、これに第1マンノースを結合させる。GlcNAcは水溶性ポリマーを持つGal残基に結合する。あるいは非修飾GalをGlcNAcに加え、続いて水溶性糖で修飾したシアル酸を加える。さらなる例では、末端GlcNAcをGalに結合し、そして続いてGlcNAcを水溶性ポリマーを持つ修飾されたフコースでフコシル化する。
図16は図13に示したものに類似するスキームであり、ここで高マンノースはペプチドのAsnに結合した第1GlcNAcに戻し改作される。1例では、GlcNAc−(Fuc)残基のGlcNAcを、水溶性ポリマー持つGlcNAcに結合させる。別の例では、GlcNAc−(Fuc)残基のGlcNAcを、水溶性ポリマーを持つGalで修飾する。さらに別の態様では、GlcNAcをGalで修飾し、続いて水溶性ポリマーで修飾したシアル酸をGalに結合する。
別の例示態様を図17〜21に説明する。本発明を実施することができる反応型の順序の説明は、前述の各図面に提供されている。
上で説明した例は、本明細書で説明する方法の威力の具体的説明を提供する。本発明の方法を使用して「戻し工作」し、そして実質的に任意の所望する構造の炭水化物残基に構築することが可能である。修飾された糖は上記に説明したように炭水化物部分の末端に加えることができ、あるいはこれはペプチドコアと炭水化物の末端との間の中間体となることができる。
例示態様では、既存のシアル酸はシアリダーゼを使用して糖ペプチドから除去し、これにより元となるガラクトシル残基のすべてまたはほとんどを露出する(unmasking)。あるいはペプチドもしくは糖ペプチドをガラクトース残基、あるいはガラクトース単位で終了したオリゴ糖残基で標識する。ガラクトース残基を露出または付加した後、適切なシアリルトランスフェラーゼを使用して修飾されたシアル酸を加える。この取り組みをスキーム12にまとめる。
Figure 0006321724
スキーム13にまとめるさらなる取り組みでは、遮蔽した反応性官能基がシアル酸上に存在する。遮蔽した反応基は好ましくは、修飾されたシアル酸をペプチドに結合するために使用する条件に影響を受けない。修飾されたシアル酸のペプチドへの共有結合後、遮蔽を除き、そしてペプチドをPEG、PPG、治療部分、生体分子または他の作用物質と結合させる。作用物質は、修飾された糖残基上の露出した反応基との反応により特異的様式でペプチドに結合する。
Figure 0006321724
任意の修飾された糖は、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に依存して、それに適切なグリコシルトランスフェラーゼと使用することができる(表3)。上で検討したように、PEG化またはPPG化構造の導入に必要な糖ペプチドの末端糖は、発現中に天然に導入できるか、あるいは適切なグリコシダーゼ(1つまたは複数)、グリコシルトランスフェラーゼ(1つまたは複数)またはグリコシダーゼ(1つまたは複数)およびグリコシルトランスフェラーゼ(1つまたは複数)の混合を使用して発現後に生成することができる。
Figure 0006321724
さらなる例示態様では、UDP−ガラクトース−PEGを牛乳のβ1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させ、これにより修飾されたガラクトースを適切な末端N−アセチルグルコサミン構造に転移させる。糖ペプチドの末端GlcNAc残基は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌のような発現系で起こるように発現中に生成され得るが、糖ペプチドを必要に応じてシアリダーゼおよび/またはグリコシダーゼおよび/またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することにより生成することもできる。
別の例示態様では、GnTI−VのようなGlcNAcトランスフェラーゼをPEG化−GlcNAcを糖ペプチドのマンノース残基に転移するために利用する。さらなる例示態様では、N−および/またはO−結合グリカン構造を糖ペプチドから酵素的に除去してアミノ酸または末端グリコシル残基を露出し、次いでこれを修飾された糖に結合する。例えばエンドグリカナーゼを使用して糖ペプチドのN−結合構造を除去して、末端GlcNAcを糖ペプチド上のGlcNAc−結合−Asnとして露出する。UDP−Gal−PEGおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG−またはPPG−ガラクトース官能基を露出したGlcNAc上に導入する。
別の態様では、修飾された糖は糖残基をペプチド骨格に転移することが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用してペプチド骨格に直接加える。この例示態様はスキーム14で説明する。本発明を実施するために有用なグリコシルトランスフェラーゼの例には、限定するわけではないがGalNAcトランスフェラーゼ(GalNAcT1−14)、GlcNAcトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ等を含む。この取り組みの使用は、炭水化物を欠くペプチド上へ、あるいは既存の糖ペプチド上への修飾された糖の直接的付加を可能とする。両方の場合で、修飾された糖の付加はグルコシルトランスフェラーゼの基質特異性により定められるペプチド骨格上の特異的な位置で起こり、そして化学的な方法を使用したタンパク質のペプチド骨格の修飾中に起こる様式のような無作為の様式では起こらない。適当なアミノ酸配列をペプチド鎖に工作することにより、多くの作用物質がグルコシルトランスフェラーゼの基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチドに導入され得る。
Figure 0006321724
上に説明した各例示態様では、1以上のさらなる化学的または酵素的修飾工程を、修飾された糖がペプチドに結合した後に利用することができる。例示態様では、酵素(例えばフコシルトランスフェラーゼ)を使用してグルコシル単位(例えばフコース)をペプチドに結合した末端修飾糖に付加(append)する。別の例では酵素反応を利用して修飾された糖が結合できなかった部位を「キャップ」する。あるいは化学反応を利用して結合した修飾糖の構造を改変させる。例えば結合した修飾糖を、修飾糖が結合しているペプチド成分との結合を安定化または不安定化する作用物質と反応させる。別の例では、修飾された糖の成分をそのペプチドへの結合後に脱保護する。当業者は修飾された糖がペプチドに結合した後の段階で本発明の方法に有用な多数の酵素的または化学的手順があると考えるだろう。修飾された糖−ペプチド結合物のさらなる仕上げ(elaboration)は、本発明の範囲内である。
マンノース−6−ホスフェートでのペプチドの標的化
例示態様では、ペプチドを少なくとも1つのマンノース−6−ホスフェート部分で誘導化する。マンノース−6−ホスフェート部分はペプチドを細胞のリソソームに標的し、そして例えばリソソーム蓄積疾患(lysosomal storage disease)の治療に治療用タンパク質をリソソームに標的するために有用である。
リソソーム蓄積疾患は、細胞のリソソーム内の糖脂質または多糖廃棄産物を分解する酵素をコードする遺伝子の欠損の結果である40を越える疾患群である。次いで酵素産物、例えば糖および脂質は新たな生成物に再使用される。これら各疾患はリソソーム中の酵素レベルに影響を及ぼす遺伝する常染色体またはX−結合劣性形質から生じる。一般に影響を受けている個体の細胞および組織中には、影響を受けた酵素の生物学的または機能的活性が無い。表4は代表的蓄積疾患および疾患に関連する酵素的欠失の一覧を提供する。そのような疾患では、酵素機能の欠乏が身体の細胞中のリソソームに脂質または炭水化物基質の進行的な全身性の沈積を生じ、最終的には器官の機能損失および死を引き起こす。遺伝的病因論、臨床的発現、分子生物学およびリソソーム蓄積疾患の可能性は、Scriver et al.編集、遺伝疾患の代謝および分子的基礎(THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DISEASE)、7.sup.th.Ed、Vol.II、マグローヒル(1995)に詳細に記載されている。
Figure 0006321724
De Duveは損失しているリソソーム酵素を外因性の生物学的に活性な酵素で代用することがリソソーム蓄積疾患を処置する貴重な取り組みであると最初に提案した(De Duve,Fed.Proc.23:1045(1964))。その時から、酵素代替治療が様々なリソソーム蓄積疾患を処置するために有益になり得るという種々の研究が提案された。最高の成功は、胎盤から(Ceredase(商標))またはより最近では組換え的(Cerezyme(商標))に調製した外因性酵素(β−グルコセレブロシダーゼ)で処置したI型ゴーシェ病を持つ個体で示された。酵素代替はファブリー病ならびに他のリソソーム蓄積疾患を処置するためにも有益であることが示唆された。例えばDawson et al.,Ped.Res.7(8):684−690(1973)(インビトロ)およびMapes et al.,Science 169:987(1970)(インビボ)を参照にされたい。酵素代替治療の臨床試験は、正常血漿(Mapes et al.,Science 169:987−989(1970))、胎盤から精製したα−ガラクトシダーゼA(Brady et al.,N.Eng.J.Med.279:1163(1973));または脾臓または血漿から精製したα−ガラクトシダーゼA(Desnick et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5326−5330(1979))の潅流を使用したファブリー患者について報告され、そしてファブリー病の直接的酵素代替の生物化学的効力が証明された。これらの研究は反復した酵素代替により病理学的な糖脂質蓄積を排除し、または有意に減少するための可能性を示す。例えば1つの実験では(Desnick et al.,同上)、精製された酵素の静脈内注入で、蓄積される脂質物質、グロボトリアシルセラミドの血漿レベルに一過性の減少がもたらされた。
したがって当該技術分野には、ヒトα−ガラクトシダーゼAのような十分な量の生物学的に活性なリソソーム酵素を、欠乏細胞に提供するための方法の必要性が存在する。最近、組換え的な方法でこれらの必要性に取り組んだ、例えば米国特許第5,658,567号、同第5,580,757明細書;Bishop et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4859−4863(1986);Medin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7917−7922(1996);Novo,F.J.,Gene Therapy.4:488−492(1997);Ohshima et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2540−2544(1997);およびSugimoto et al.,Human Gene Therapy 6:905−916(1995)を参照にされたい。マンノース−6−ホスフェートは治療用ペプチドがリソソームを標的とすることを媒介し、本発明は十分量の生物学的に活性なリソソームペプチドを欠損細胞に送達するための組成物および方法を提供する。
このように例示態様では、本発明はマンノース−6−ホスフェートで誘導化した表6によるペプチドを提供する(図23および図24)。ペプチドは組換え的または化学的に調製することができる。さらにペプチドは完全に天然な配列であるか、または例えば短縮化、延長により修飾することができ、あるいは置換または欠失を含んでもよい。本発明の方法を使用して改造されるタンパク質の例は、グルコセレブロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼA、酸性−α−グルコシダーゼ(酸性マルターゼ)を含む。臨床的に使用する代表的な修飾されたペプチドには、限定するわけではないがCeredase(商標)、Cerezyme(商標)およびFabryzyme(商標)を含む。修飾され、そして臨床的に関連するペプチド上のグリコシル基も、本発明の方法を利用して改変させることができる。マンノース−6−ホスフェートはグリコシル連結基を介してペプチドに結合させる。例示態様では、グリコシル連結基はシアル酸に由来する。シアル酸−由来グリコシル連結基の例は表2に説明し、ここで1以上の“R”部分がマンノース−6−ホスフェートまたは結合した1以上のマンノース−6−ホスフェート部分を有するスペーサー基である。修飾されたシアル酸部分は好ましくはペプチドの表面に結合したオリゴ糖の末端残基である(図25)。
マンノース−6−ホスフェートに加えて、本発明のペプチドは水溶性ポリマー、治療部分、またはさらなる標的部分のような部分を用いて誘導化することができる。これらのおよび他の基を結合する方法は本明細書で説明する。例示態様では、マンノース−6−ホスフェート以外の基を、表2に従い誘導化されたシアル酸誘導体を介してペプチドに結合させ、ここで1以上の“R”部分がマンノース−6−ホスフェート以外の基である。
例示態様では、Cbz−保護グリシンに基づくリンカーアームで修飾されたシアル酸部分を調製する。対応するヌクレオチド糖を調製し、そしてCbz基は触媒的水素添加により除去する。生成するヌクレオチド糖は、利用可能な反応性アミンを有し、これを活性化マンノース−6−ホスフェート誘導体と接触させて、本発明の方法の実施に有用であるマンノース−6−ホスフェート誘導化ヌクレオチド糖を提供する。
以下のスキーム(スキーム15)に示すように、活性化マンノース−6−ホスフェート誘導体の例は、2−ブロモ−ベンジル−保護ホスホトリエステルを対応するトリフラートにその場で転換し、そしてトリフラートと反応性酸素を含有する部分を有するリンカーとを反応させ、糖とリンカーとの間にエーテル結合を形成することにより形成される。ベンジル保護基は触媒的水素添加により除去され、そしてリンカーのメチルエステルは加水分解され、対応するカルボン酸を提供する。カルボン酸は当該技術分野で既知の方法により活性化される。活性化手順の例は、カルボン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの転換に依る。
Figure 0006321724
別の例示態様では、以下のスキーム(スキーム16)に示すように、N−アセチル化シアル酸をピルビル部分の操作によりアミンに転換する。このように1級ヒドロキシルをスルホン酸エステルに転換し、そしてアジ化ナトリウムと反応させる。アジドを対応するアミンに触媒的に還元する。続いて糖はヌクレオチド類似体に転換し、そしてアミン基を介して上記のように調製したリンカーアーム−誘導化マンノース−6−ホスフェートにカップリングする。
Figure 0006321724
リソソーム蓄積疾患を処置するために有用なペプチドは、限定するわけではないがトランスフェリン、(血液脳関門をわたり、そしてエンドソームにペプチドを送達するために)、カルニチン(ペプチドを筋肉細胞に送達するために)、およびホスホネート、例えばビスホスホネート(ペプチドを骨および他の炭酸カルシウムを含む組織を標的とさせるために)を含む他の標的部分で誘導化することができる。標的部分および治療用ペプチドは本明細書に記載する任意の方法または当該技術分野で既知の方法により結合される。
例示態様では、標的剤および治療用ペプチドはリンカー部分を介してカップリングされる。この態様では、少なくとも1つの治療用ペプチドまたは標的剤が本発明の方法に従い、リンカー部分に完全なグリコシル連結基を介してカップリングされる。例示態様では、リンカー部分にはポリ(エチレングリコール)のようなポリ(エーテル)を含む。別の例示態様ではリンカー部分は、結合物を身体中の標的とする組織または領域に送達した後、インビボで分解されて標的剤から治療用ペプチドを放出する少なくとも1つの結合を含む。
さらに別の例示態様では、治療用ペプチドを標的部分に結合することなく治療部分のグリコホームの改変を介して治療部分のインビボ分布が改変される。例えば治療用ペプチドはシアル酸(またはその誘導体)でグリコシル基の末端ガラクトース部分をキャッピングすることにより、網内系による取り込みからそらすことができる(図23および26)。
末端Galを覆うシアリル化は、肝臓のアシアロ糖タンパク質(ASGP)レセプターによるペプチドの取り込みを回避し、そしてシアリル化が無い複雑なグリカン鎖のみを有するペプチドに比べてペプチドの半減期を伸ばすことができる。
II.本発明のペプチド/糖ペプチド
1つの態様では、本発明は基本的なトリマンノシルコアを主要なグリカン構造としてペプチドに結合して有する1つのペプチドの多数のコピーを含んでなる組成物を提供する。
好適な態様では、ペプチドは治療用分子である。ペプチドの天然な形態は複雑なN−結合グリカンを含んでなることができ、あるいは高マンノースグリカンでよい。ペプチドは哺乳動物のペプチドでよく、そして好ましくはヒトのペプチドである。幾つかの態様では、ペプチドは免疫グロブリン、エリスロポエチン、組織型アクチベーターペプチドおよびその他からなる群から選択される(図1を参照にされたい)。
グリカンが本発明の方法を使用して改造できるペプチドの例を図1に説明する。
Figure 0006321724
Figure 0006321724
本発明に有用なペプチドのより詳細な一覧およびそれらの供給源を図1に提供する。
本発明の方法により修飾されるペプチドの他の例には、免疫グロブリンファミリーの員(例えば抗体、MHC分子、T細胞レセプター等)、細胞間レセプター(例えばインテグリン、ホルモンまたは増殖因子のレセプター等)レクチン、およびサイトカイン(例えばインターロイキン)を含む。さらなる例にはとりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)、レニン、第VIII因子およびIX因子のような凝固因子、ボンベシン、トロンビン、造血増殖因子、コロニー刺激因子、ウイルス抗原、補体ペプチド、α1−アンチトリプシン、エリトロポエチン、P−セレクチン糖ペプチドリガンド−1(PSGL−1)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、抗−トロンビンIII、インターロイキン、インターフェロン、ペプチドAおよびC、フィブリノーゲン、herceptin(商標)、レプチン、グリコシダーゼを含む。ペプチドの一覧は例であり、排他的であると考えるべきではない。むしろ本明細書に提供する開示から明らかなように、本発明の方法は所望するグリカン構造を形成することができる任意のペプチドに応用可能である。
本発明の方法は、限定するわけではないがIgGのような免疫グロブリンに由来する部分を含むキメラペプチドを含むキメラペプチドの修飾にも有用である。
本発明の方法により修飾されるペプチドは合成または野生型ペプチドであることができ、あるいはそれらは部位指向的突然変異誘発法のような当該技術分野で既知の方法により生成される突然変異したペプチドであることができる。ペプチドのグリコシル化は典型的にはN−結合またはO−結合である。N−結合の例は、修飾された糖のアスパラギン残基の側鎖への結合である。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−トレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸である)は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。このようにペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在が潜在的なグリコシル化部位を作成する。本明細書のいたるところで開示するように、O−結合グリコシル化は、1つの糖(例えばN−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、GlcNAc、グルコース、フコースまたはキシロース)の、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖への結合を指すが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンも使用することができる。
本発明の数種の例示態様を、以下で検討する。これらの態様の幾つかは商用名で記載される名前を有するペプチド、および例示ペプチドとして他の具体的なペプチドを使用するが、これらの例は具体的ペプチドに限定するものではない。以下の例示態様はすべてのペプチド均等物および任意のペプチドの変異体を含むことを意図している。そのような変異体には限定するわけではないが、N−結合およびO−結合グリコシル化部位の付加または削除、および加えたグリコシル化部位との融合タンパク質を含む。当業者は以下の態様およびそこに開示されている基本的方法が多くのペプチドに応用でき、等しく成功すると考えるだろう。
1つの例示態様では、本発明は顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を修飾するための方法を提供する。図27A〜27Gは、本明細書に開示する方法論を使用してこれがどのようになされるかの幾つかの例を説明する。図27Bでは、哺乳動物細胞系で発現したG−CSFペプチドをシアリダーゼを使用して戻し改作する。このように露出した残基は、それに適切な供与体およびST3Gal1を使用してシアル酸−ポリ(エチレングリコール)部分(PEG部分)の付加により修飾される。図27Cは昆虫細胞で発現したG−CSFペプチドを修飾するための例示スキームを説明する。このペプチドは、それに適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトース部分を加えることにより修飾する。ガラクトース残基は、シアル酸−PEG誘導体を介してST3Gal1の作用を通してPEGで官能化される。図27Dでは、細菌が発現したG−CSFをN−アセチルガラクトサミン供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼと接触させる。このペプチドはPEG化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼを使用してPEGで官能化する。図27Eでは、哺乳動物細胞が発現したG−CSFをレブリン酸で修飾したシアル酸供与体と接触させ、反応性ケトンをシアル酸供与体に加える。ペプチド上のグリカン上のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図27Fでは細菌が発現したG−CSFを、ペプチドをエンド−GalNAc酵素と、これが加水分解的様式ではなく合成的に機能する条件下で接触させ、これによりPEG−Gal−GalNAc分子をそれらの活性化誘導体から加える。図27Gは細菌が発現したG−CSFの別の改造経路を提供する。ポリペプチドはPEG化N−アセチルガラクトサミン残基を用いて、ポリペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適切なPEG化N−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させることにより誘導化する。
別の例示態様では、本発明は図28A〜28Nに示すようにインターフェロンα−14C(IFNα14C)を修飾する方法を提供する。様々なIFNα形態を本明細書のいたるところに開示する。図28Bでは哺乳動物細胞で発現したIFNα14Cを最初にシアリダーゼで処理してそれらの上のシアル酸単位を戻し改作し、そして次いでこの分子をST3Gal3およびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Cでは最初にN−アセチルグルコサミンを昆虫もしくは真菌細胞で発現したIFNα14Cに加え、ここで反応はGnT−Iおよび/またはIIの作用を介してN−アセチルグルコサミン供与体を使用して行う。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG化−ガラクトースの供与体を使用してPEG化される。図28Dでは酵母で発現したIFNα14Cを最初にエンド−Hで処理してその上のグリコシル単位を戻し改作する。この分子はガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、そして次にこれをST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図28Fでは哺乳動物細胞により生産されたIFNα14Cが、ST3Gal3およびPEG化−シアル酸の供与体を使用して修飾されてPEG部分が少しづつ動かれされる(inched)。図28Gでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNα14Cは、最初に1以上のGnT I、II、IVおよびV、およびN−アセチルグルコサミン供与体を使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパク質は次いで適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでIFNα14CはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図28Hでは酵母が生産したIFNα14Cを最初にマンノシダーゼで処理してマンノシル基を戻し改作する。次いでN−アセチルグルコサミンが、N−アセチルグルコサミンの供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用して加えられる。さらにIFNα14Cは適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでポリペプチドはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図28IではNSO細胞が発現したIFNα14Cを、適切な末端残基をレブリン酸で修飾したシアル酸供与体でキャッピングすることにより修飾し、これにより反応性ケトンをシアル酸供与体に付加する。ペプチドのグリコシル残基へ加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図28Jでは哺乳動物細胞により発現されたIFNα14Cが、PEG−シアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してPEG化される。図28Kでは哺乳動物細胞により生産されたIFNα14Cが最初にシアリダーゼを用いて末端シアル酸残基を戻し改作され、そして次に分子はトランス−シアリダーゼおよびPEG化シアル酸−ラクトース複合体を使用してPEG化される。図28Lでは哺乳動物系で発現したIFNα14Cがシアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル化される。図28Mでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNα14Cに、最初に適切な供与体およびGnTIおよび/またはIIを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。次いで分子をガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化したガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびガラクトース残基を介して反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチドをST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。図28Nでは昆虫または酵母細胞のいずれかで発現したIFNα14Cを、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化されたガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドにリンカーおよびガラクトース残基を介して反応性シアル酸を結合させる。ついで分子をST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。
別の例示態様では、本発明は図28O〜28EEに示すようにインターフェロンα−2aまたは2b(IFNα)を修飾する方法を提供する。図28Pでは哺乳動物細胞で生産されたIFNαを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Qでは昆虫細胞で発現したIFNαを最初に適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal1およびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Rは細菌中で発現したIFNαの別の改造方法を提供する:PEG化N−アセチルガラクトサミンは、適切な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図28Sでは哺乳動物細胞で発現したIFNαを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体を用いて適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基に加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図28Tでは細菌で発現したIFNαを、加水分解的様式の代わりに合成的に機能する修飾された酵素であるエンド−N−アセチルガラクトサミダーゼを使用して、およびPEG部分で誘導化したN−アセチルガラクトサミン供与体を使用してPEG化する。図28UではN−アセチルガラクトサミンを最初に、適当な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してIFNαに加え、そして次いでシアリルトランスフェラーゼおよびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Vでは哺乳動物系で発現したIFNαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次に適当な供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3を使用してPEG化する。図28Wでは哺乳動物細胞で発現したIFNαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでこのポリペプチドをST3Gal1およびリンカーで連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび2番目のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。続いてポリペプチドをST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてトランスフェリンがシアル酸残基を介して結合するようになる。図28Yでは哺乳動物細胞で発現したIFNαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次にST3Gal1およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
図28Zでは昆虫細胞により生産されたIFNαを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG化ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図28AAでは細菌が発現したIFNαに、最初に適切な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してアセチルガラクトサミンを加える。このタンパク質は次いで、シアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図28CCでは細菌で発現したIFNαが別の手順で修飾される;PEG化N−アセチルガラクトサミンを、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼによりPEG化N−アセチルガラクトサミンの供与体を使用してタンパク質に加える。図28DDでは細菌で発現したIFNαを別のスキームで改造する。ポリペプチドを最初にN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸を用いて誘導化されたN−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、IFNαをリンカーおよびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性のシアル酸に結合させる。次いでIFNαをST3Gal3およびアシアロトランスフェリンと反応させて、これがシアル酸残基を介してトランスフェリンに連結するようになる。次いでIFNαはST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングされる。細菌が発現したIFNαを修飾するさらなる方法を図28EEに開示し、ここでIFNαは最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPに暴露され、そして次いでリンカーを介して反応性シアル酸に連結される。これは続いてST3Gal3およびトランスフェリンを使用してトランスフェリンに結合する。
別の例示態様では、本発明は図29A〜29Sで示すようにインターフェロンβ(IFN−β)の修飾法を提供する。図29Bでは哺乳動物系で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質はST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図29Cは昆虫細胞により生産されたIFN−βを修飾するためのスキームである。最初にN−アセチルグルコサミンを、適切な供与体およびGnT−iおよび/または−IIを使用してIFN−βに加える。次いでタンパク質はガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。最後にIFN−βはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEGされる。図29Dでは酵母で発現したIFN−βを最初にエンド−Hで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29Eでは哺乳動物細胞で生産されたIFN−βを、ST3Gal3およびPEG部分ですでに誘導化したシアル酸の供与体を使用してPEG化することにより修飾する。図29Fでは昆虫細胞で発現したIFN−βは最初に、N−アセチルグルコサミン供与体を使用して1以上のGnT I、II、IVおよびVによりN−アセチルグルコサミンが加えられ、そして次にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化され、そして次にST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図29Gでは酵母で発現したIFN−βを最初にマンノシダーゼで処理してマンノシル単位を戻し改作し、次いでN−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパク質はさらにガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化され、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化される。図29Hでは哺乳動物細胞が発現したIFN−βを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基でキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図29Iでは哺乳動物系で発現したIFN−βを、PEG−シアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してPEG化する。図29Jでは哺乳動物細胞により発現されたIFN−βを最初にシアリダーゼで処理してその末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでトランスシアリダーゼおよびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29Kでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図29Lでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29Mでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作する。これを次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図29Nでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図29Oでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図29Qでは昆虫細胞により発現されたIFN−βに、最初にN−アセチルグルコサミンの供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンを加え、そしてさらにPEG−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してさらにPEG化する。図29Rでは酵母で発現したIFN−βを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG化−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
図29Sでは哺乳動物系で発現したIFN−βを最初にST3Gal3およびリンカーを介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸と連結する。次いでポリペプチドをST3Gal3および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが結合するようになる。次いでIFN−βはシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してさらにシアリル化される。
別の例示態様では、本発明は図30A〜30Dに示す第VII因子または第VIIa因子を修飾するための方法を提供する。図30Bでは哺乳動物系により生産された第VIIまたはVIIa因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図30Cでは哺乳動物細胞により発現された第VIIまたはVIIa因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。さらにポリペプチドをST3Gal3およびシアル酸供与体でシアリル化する。図30Dは哺乳動物細胞により生産される第VIIまたはVIIa因子の別の修飾スキームを提供する:ポリペプチドを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作し、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、そして次にST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
別の例示態様では、本発明は第IX因子の修飾法を提供し、その幾つかの例が図31A〜31Gに含まれる。図31Bでは哺乳動物細胞により生産された第IX因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでPEG化シアル酸の供与体を使用してST3Gal3でPEG化する。図31Cでは哺乳動物細胞により発現された第IX因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、これを次いでST3Gal3およびPEG化−シアル酸供与体を使用してPEG化し、そしてさらにST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。哺乳動物細胞が生産した第IX因子の改造の別のスキームは、図31Dに見いだすことができる。ポリペプチドを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、さらにシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化し、そして次いでPEG化シアル酸の供与体およびST3Gal1を使用してPEG化する。図31Eでは哺乳動物系で発現した第IX因子が、PEG−シアル酸の供与体を使用してST3Gal3により触媒されるシアリル化の方法を通してPEG化される。図31Fでは哺乳動物細胞で発現した第IX因子を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンはヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化される。図31Gは第IX因子のさらなる修飾法を提供する。哺乳動物細胞で生産されたポリペプチドは、PEG−シアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してPEG化される。
別の例示態様では、本発明は濾胞刺激ホルモン(FSH)の修飾法を提供する。図32A〜32Jは幾つかの例を提示する。図32Bでは、FSHが哺乳動物系で発現し、そしてシアリダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作され、続いてST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化されることにより修飾される。図32Cでは哺乳動物細胞で発現したFSHを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図32Dは哺乳動物系で発現したFSHを修飾するスキームを提供する。ポリペプチドをシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図32Eでは哺乳動物系で発現したFSHを以下の手順で修飾する:FSHを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図32Fは哺乳動物細胞により生産されたFSHの別の修飾例を提供する:ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図32Gでは哺乳動物系で発現したFSHを別の手順で修飾する:ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加を用いて改造される。図32HではFSHを昆虫細胞で発現させ、そして以下の手順で修飾する:N−アセチルグルコサミンを適切なN−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用して最初にFSHに加え;次いでFSHはPEG−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化される。図32Iは酵母により生産されたFSHの修飾スキームを表す。このスキームに従い、FSHを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体でPEG化する。図32Jでは哺乳動物細胞により発現されたFSHを最初に、ST3Gal3およびリンカーを介した2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび2番目のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをST3Gal1およびCHOで生産された脱シアリル化絨毛性ゴナドトロピン(CG)と接触させ、そしてこのようにしてCGが第2シアル酸残基を介して連結するようになる。ついでFSHはシアル酸供与体およびST3Gal3および/またはST3Gal1を使用してシアリル化される。
別の例示態様では、本発明はエリトロポエチン(EPO)の修飾法を提供し、図33A〜33Jは、野生型および突然変異EPOペプチドの両方の改造に関する幾つかの例を説明する。図33Bでは、種々の哺乳動物系で発現したEPOが、発現したタンパク質をシアリダーゼと接触させて末端シアル酸残基を除去することにより改造される。生成したペプチドを、シアリルトランスフェラーゼおよびPEG部分で誘導化したCMP−シアル酸と接触させる。図33Cでは昆虫細胞で発現したEPOが、GnT Iおよび/またはGnT、IIを使用してN−アセチルグルコサミンを用いて改造される。次いでガラクトースがガラクトシルトランスフェラーゼを使用してペプチドに加えられる。PEG基は、改造されたペプチドをシアリルトランスフェラーゼおよびPEG部分で誘導化されたCMP−シアル酸と接触させることにより改造されたペプチドに加えられる。図33Dでは哺乳動物細胞系で発現したEPOが、シアリダーゼの作用を介して末端シアル酸を除去することにより改造される。ガラクトースはガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用して新たに露出した末端に加えられる。N−結合グリコシル単位の末端ガラクトース残基は、ST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアル酸で「キャップ化」される。末端ガラクトース残基は、適切なシアル酸供与体およびST3Gal1を使用してPEG部分を持つシアル酸で官能化される。図33Eでは哺乳動物細胞系で発現したEPOを、PEG−誘導化シアル酸部分でN−結合グリコシル残基を官能化することにより改造する。ペプチドをST3Gal3および適切な修飾されたシアル酸供与体と接触させる。図33Fでは昆虫細胞系で発現したEPOが、ペプチドをN−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnTI、GnTIIおよびGnTVと接触させることにより、1以上の末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。次いでペプチドはPEG化ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによりPEG化される。図33Gでは昆虫細胞系で発現したEPOを、適切なN−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnTI、GnTIIおよびGnTVを使用して、末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造する。加水分解的様式ではなく合成的に作用するように作られたガラクトシダーゼを利用して、活性化PEG化ガラクトース供与体をN−アセチルグルコサミン残基に加える。図33Hでは哺乳動物細胞で発現した突然変異EPOを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより改造する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図33Iは哺乳動物細胞系で発現した突然変異EPOの例示改造経路を説明する。PEGは、PEG−修飾シアル酸およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してグリコシル残基へ加える。図33Jは哺乳動物細胞系で発現した突然変異EPOに関する別の例示改造経路を説明する。シアル酸はシアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼでグリコシル残基に加えられる。
別の例示態様では、本発明は図34A〜34Kに示すように顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の修飾法を提供する。図34Bでは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図34Cでは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでシアル酸供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3を使用してさらにシアリル化する。図34DではNSO細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化し、そして次いでST3Gal1およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図34Eでは、哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。図34Fは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図34Gでは哺乳動物細胞で発現しGM−CSFを、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図34Iでは昆虫細胞で発現したGM−CSFが、適当な供与体および1以上のGnTI、II、IVおよびVを使用したN−アセチルグルコサミンの付加、続いて適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG化ガラクトースの付加により修飾される。図34Jでは酵母が発現したGM−CSFを最初にエンドグリカナーゼおよび/またはマンノシダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして続いてガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図34Kでは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。次いでポリペプチドをST3Gal1およびリンカーを介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。ポリペプチドはさらにST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてトランスフェリンと連結するようになる。
別の例示態様では、本発明はインターフェロンガンマ(IFNγ)の修飾法を提供する。図35A〜35Nは幾つかの例を含む。図35Bでは、種々の哺乳動物細胞で発現したIFNγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図35Cでは哺乳動物系で発現したIFNγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでポリペプチドをST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そしてさらにST3Gal3およびシアル酸の供与体を使用してシアリル化する。図35Dでは哺乳動物細胞が発現したIFNγを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでIFNγはPEG−シアル酸の供与体およびST3Gal3を使用してPEG化される。図35Eでは哺乳動物系で発現したIFNγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化され、そしてさらにST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図35Fは哺乳動物系で発現したIFNγを修飾するための別の方法を記載する。タンパク質はレブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図35Gは哺乳動物細胞で発現したIFNγは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加により改造される。図35Iでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNγが、適切な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンを付加することにより修飾される。このタンパク質はさらに、PEG化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG部分の付加により修飾される。図35Jは酵母で発現したIFNγを修飾するための方法を提供する。ポリペプチドを最初にエンドグリカナーゼで処理してサッカリド鎖を戻し改作し、そして次にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次にIFNγはPEG化シアル酸の供与体およびST3Gal3を使用してPEG化される。図35Kでは哺乳動物細胞により生産されたIFNγが以下のように修飾される:ポリペプチドを最初にST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図35Lに具体的に説明するスキームでは、哺乳動物系で発現したIFNγがST3Gal3の作用を介して修飾され:PEG化シアル酸が適当な供与体からIFNγに転移する。図35Mは昆虫または真菌細胞で発現したIFNγを修飾する例であり、ここでポリペプチドのPEG化はGnT Iおよび/またはIIを使用してPEG化N−アセチルグルコサミンを供与体からIFNγに転移することにより達成される。図35Nでは哺乳動物系で発現したIFNγが、適当な供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したPEG化シアル酸の付加により改造される。
別の例示態様では、本発明はαアンチ−トリプシン(α1−プロテアーゼインヒビター)の修飾法を提供する。そのような例の幾つかは図36A〜36Oに見いだすことができる。図36Bでは、種々の哺乳動物細胞で発現したαアンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでPEG化シアル酸残基がCMP−SA−PEGのような適当な供与体およびST3Gal3のようなシアリルトランスフェラーゼを使用して加えられる。図36Cではαアンチ−トリプシン修飾の別のスキームを示す。哺乳動物系で発現したαアンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでPEGで誘導化されたシアル酸残基が、適当な供与体およびST3Gal3のようなシアリルトランスフェラーゼを使用して加えられる。続いて分子はシアル酸供与体およびST3Gal3を使用したシアル酸残基の付加によりさらに修飾される。図36Dでは、哺乳動物細胞が発現したαアンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理して末端シアル酸およびα−結合ガラクトース残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラーゼおよび適当なガラクトース供与体を使用してガラクトシル化される。さらにPEGで誘導化したシアル酸が、PEG化シアル酸供与体を使用してST3Gal3の作用により加えられる。図36Eでは哺乳動物系で発現したαアンチ−トリプシンは最初に、シアリダーゼを使用して末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでPEGが、PEG化シアル酸をCMP−SA−PEGのような供与体からαアンチ−トリプシンへ転移することを媒介するST3Gal3の作用を介してN−結合グリコシル残基に加えられる。引き続きより多くのシアル酸残基を、シアル酸供与体およびST3Gal3を使用して結合させる。図36Fはαアンチ−トリプシンを改造する別の方法を具体的に説明する。哺乳動物細胞で発現したαアンチ−トリプシンを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図36Gはαアンチ−トリプシン修飾の別の方法を開示する。哺乳動物発現系から得たαアンチ−トリプシンは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸の付加により改造する。図36Iではαアンチ−トリプシンが昆虫または酵母細胞で発現し、そしてポリペプチドをUDP−N−アセチルグルコサミンおよび1以上のGnT I、II、IVまたはVと接触させることにより、末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。ついでこのポリペプチドは、PEG化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG部分を用いて修飾される。図36Jは酵母細胞で発現したαアンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作する。これを次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化する。次にポリペプチドはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図36Kではαアンチ−トリプシンが哺乳動物系で発現する。ポリペプチドを最初にST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図36Mでは酵母で発現したαアンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してそのグリコシル基を戻し改作する。次いでタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG部分を持つガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図36Nでは植物細胞で発現したαアンチ−トリプシンをヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシロシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして続いてN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用して、PEG部分で誘導化されたN−アセチルグルコサミンで修飾する。図36Oでは哺乳動物細胞で発現したαアンチ−トリプシンを、ST3Gal3およびPEGで誘導化したシアル酸の供与体を使用してPEG化シアル酸残基を加えることにより修飾する。
別の例示態様では、本発明は図37A〜37Kに示すグルコセレブロシダーゼ(β−グルコシダーゼCerezyme(商標)またはCeredase(商標))の修飾法を提供する。図37Bでは、哺乳動物系で発現したCerezyme(商標)を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図37Cでは哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびマンノース−6−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸を使用してマンノース−6−ホスフェート基を結合させ、次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図37DではNSO細胞が発現したCerezyme(商標)を最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、そして次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次いでマンノース−6−ホスフェート部分がST3Gal3およびマンノース−6−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸を使用して分子に加えられる。図37Eでは、哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、これを次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図37Fでは、哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンを1以上のマンノース−6−ホスフェート基のような部分で誘導化する。図37Gは哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。
図37Iでは昆虫細胞で発現したCerezyme(商標)は、最初に適当な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられ、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化される。図37Jでは酵母で発現したCerezyme(商標)を最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次にST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図37Kでは哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を、最初にST3Gal3およびリンカーを介して連結した2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチドをST3Gal3および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこれによりトランスフェリンが連結するようになる。次いでこのポリペプチドはシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化される。
別の例示態様では、本発明は組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)およびその突然変異体の修飾法を提供する。幾つかの具体的修飾スキームを図38A〜38Wに提示する。図38Bは1つの修飾手順を具体的に説明する:TPAが哺乳動物細胞により発現された後、これを1以上のマンノシダーゼ(1つまたは複数)およびシアリダーゼで処理してマンノシルおよび/またはシアル酸残基を戻し改作する。次いで末端N−アセチルグルコサミンを、ポリペプチドと適切なN−アセチルグルコサミンおよび1以上のGnT I、II、IVおよびVとを接触させることにより加える。TPAはさらにガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでPEGは、ST3Gal3により触媒されるシアル化により、そしてPEG部分で誘導化されたシアル酸の供与体を使用して分子に結合させる。図38Cでは、TPAが昆虫または真菌細胞で発現する。修飾には、適切なN−アセチルグルコサミンの供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用したN−アセチルグルコサミンの付加:ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したガラクトシル化:およびST3Gal3およびPEGで誘導化されたシアル酸の供与体を使用したシアリル化によるPEGの結合工程を含む。図38Dでは、TPAが酵母で発現し、そして続いてエンドグリカナーゼで処理されてサッカリド鎖を戻し改作する。ポリペプチドは、供与体からTPAへのPEG−ガラクトースの転移を触媒するガラクトシルトランスフェラーゼの作用を介してさらにPEG化される。図38Eでは、TPAが昆虫または酵母細胞で発現する。ついでポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作する。さらにPEG部分は、ガラクトシルトランスフェラーゼにより媒介される適当な供与体からTPAへのPEG−ガラクトースの転移を介して分子へ結合させる。図38Fは昆虫または酵母系から得たTPAの異なる修飾法を提供する:ポリペプチドは、N−アセチルグルコサミンの供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用したN−アセチルグルコサミンの付加、続いてガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG化ガラクトースの供与体を使用したガラクトシル化により改造される。図38Gは昆虫または酵母細胞で発現したTPAの別の改造スキームを提供する。末端N−アセチルグルコサミンは、N−アセチルグルコサミンの供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用して加える。加水分解的様式というよりむしろ合成的に作用するように修飾されたガラクトシダーゼを利用して、適切な供与体からN−アセチルグルコサミン残基へPEG化ガラクトースを加える。図38Iでは、哺乳動物系で発現したTPAを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ポリペプチドはさらに、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図38Jでは、哺乳動物系で発現したTPAをこのスキームに従い改造する:最初にポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作する:次いでシアル酸残基をシアル酸供与体およびST3Gal3を使用して末端ガラクトシル残基に結合させる:さらにTPAは、ガラクトシルトランスフェラーゼにより触媒される供与体からN−アセチルグルコサミニル残基へのPEG化ガラクトースの転移を介してPEG化される。図38KではTPAが植物細胞で発現する。この例の修飾手順は以下の通りである:TPAを最初にヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシロシダーゼで処理してそのグリコシル基を戻し改作する;次いでPEG化N−アセチルグルコサミンを、適当な供与体およびN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを使用してTPAに加える。図38Mでは、哺乳動物細胞で発現したTPA突然変異体(TNK TPA)を改造する。末端シアル酸残基を最初にシアリダーゼを使用して戻し改作する;次いでポリペプチドがPEG化されるようにST3Gal3を使用してPEG化シアル酸を供与体からTNK TPAへ転移する。図38Nでは、哺乳動物系で発現したTNK TPAを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質を、供与体としてCMP−SA−PEGおよびST3Gal3を使用してPEG化し、そしてさらにシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化する。図38Oでは、NSO細胞が発現したTNK TPAを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理して末端シアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ついでTNK TPAは、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。この改造スキームの最終工程は、PEG部分で誘導化されたシアル酸を、シアリルトランスフェラーゼまたはST3Gal3を使用して供与体からTNK TPAへ転移することである。図38QではTNK TPAが哺乳動物系で発現し、そして最初にシアリダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでタンパク質はST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してシアリル化される。次いでタンパク質はシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化される。図38Rでは哺乳動物系で発現したTNK TPAを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。
ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図38Sでは哺乳動物細胞で発現したTNK TPAを異なる方法を介して修飾する:ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加により改造する。図38Uでは、昆虫細胞で発現したTNK TPAを、適当な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンの付加により改造する。このタンパク質はさらに、PEG化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG部分の付加により修飾される。図38Vでは、TNK TPAは酵母で発現する。ポリペプチドを最初にエンドグリカナーゼで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでPEGで誘導化したガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化する。図38WではTNK TPAが哺乳動物系で生産される。ポリペプチドを最初に、ST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化したシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応性ガラクトースに結合させる。次いでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびCHOで生産された抗−TNF IGキメラと接触させて、これによりキメラはガラクトース残基を介して連結するようになる。
別の例示態様では、本発明はインターロイキン−2(IL−2)を修飾する方法を提供する。図39A〜39Gは幾つかの例を提供する。図39Bは2段階の修飾スキームを提供する:哺乳動物細胞により生産されたIL−2を最初にシアリダーゼで処理してその末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図39Cでは、昆虫細胞が発現したIL−2を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。
続いてIL−2を、ST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図39Dでは細菌で発現したIL−2を、適切な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してN−アセチルガラクトサミンで、続いてPEG−シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼを用いたPEG化工程で修飾する。図39Eでは、哺乳動物系により生産されたIL−2を修飾する別のスキームを提供する。
ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図39Fは大腸菌(E.coli)で発現したIL−2の改造例を具体的に説明する。ポリペプチドは、PEG基で誘導化した反応性N−アセチルガラクトサミン複合体および加水分解的酵素というよりはむしろ合成的酵素として機能するように修飾された酵素を使用してPEG化する。図39Gでは、細菌が発現したIL−2を適切な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してPEG化N−アセチルガラクトサミンの付加により修飾する。
別の例示態様では、本発明は図40A〜40Nに示すように第VIII因子の修飾法を提供する。図40Bでは哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図40Cでは、哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3および適切な供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal1およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。
図40Eでは、哺乳動物細胞が生産した第VIII因子を、ST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化の1工程により修飾する。図40Fは哺乳動物細胞により発現された第VIII因子の別の修飾例を提供する。タンパク質は、ST3Gal1およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図40Gでは哺乳動物細胞が発現した第VIII因子を別のスキームに従い改造する:これはα2,8−シアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図40Iでは哺乳動物細胞により生産された第VIII因子を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図40Jでは哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を、最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作する。ついでこれをガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図40Kでは哺乳動物系で発現した第VIII因子を、最初にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化し、ついでエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体でPEG化する。図40Lでは哺乳動物系で発現した第VIII因子を、最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、次いで適当な供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用してN−アセチルグルコサミン基を加え、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図40Mでは哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を最初にマンノダーゼで処理してマンノシル単位を戻し改作し、次いでN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用してN−アセチルグルコサミン基を加える。これはさらにガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化され、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図40Nでは第VIII因子が哺乳動物細胞で生産され、そして以下のように修飾される:これは最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル基を戻し改作する。次いでPEG化N−アセチルグルコサミン基が、GnTIおよびPEG化N−アセチルグルコサミンの適当な供与体を使用して加えられる。
別の例示態様では、本発明は図41A〜41Mに示すようにウロキナーゼを修飾する方法を提供する。図41Bでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Cでは、哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図41Dでは哺乳動物系で発現したウロキナーゼを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Eでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。図41Fでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図41Gでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図41Iでは昆虫細胞で発現したウロキナーゼを以下の工程で修飾する:最初にN−アセチルグルコサミンを、N−アセチルグルコサミンの適当な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してポリペプチドに加え:次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化ガラクトースを加える。図41Jでは酵母で発現したウロキナーゼを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Kでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを、最初にST3Gal3およびリンカーを介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2シアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをST3Gal1および哺乳動物細胞で生産された脱シアリル化ウロキナーゼと接触させ、そしてこれによりウロキナーゼの第2分子と連結するようになる。次いで全分子はさらにシアル酸供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3を使用してシアリル化される。図41Lは単離したウロキナーゼを最初にスルホヒドロラーゼで処理してスルフェート基を除去し、そして次にシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Mでは単離したウロキナーゼを最初にスルホヒドロラーゼおよびヘキソサミニダーゼで処理してスルフェート基およびヘキソサミン基を除去し、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。
別の例示態様では、本発明は図42A〜42Kに示すようにDNaseIを修飾する方法を提供する。図42Bでは哺乳動物系で発現したDNaseIを以下の工程で修飾する:最初にタンパク質をシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する;次いでタンパク質をST3Gal3でPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図42Cでは、哺乳動物細胞で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3でPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図42Dでは哺乳動物系で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼに暴露してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図42Eでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3でシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図42Fでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図42Gでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図42Iでは昆虫細胞で発現したDNaseIには、最初に適当な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。次いでタンパク質は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化される。図42Jでは酵母で発現したDNaseIを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図42Kでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを、最初にST3Gal3およびリンカーを介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2シアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをST3Gal1および脱シアリル化α1−プロテアーゼインヒビターと接触させ、そしてこれによりシアル酸残基を介してインヒビターと連結するようになる。次いでポリペプチドはさらに適当な供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3を使用してシアリル化される。
別の例示態様では、本発明は図43A〜43Lに示すようにNグリコシル化部位を含むように突然変異させたインスリンを修飾する方法を提供する。図43Bでは哺乳動物系で発現したインスリンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化する。図43Cでは昆虫細胞で発現したインスリンを、適当な供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用してPEG化N−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図43Dでは酵母で発現したインスリンを最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図43Fでは哺乳動物細胞で発現したインスリンを、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal1およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図43Gでは昆虫細胞で発現したインスリンを、適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化ガラクトースの付加により修飾する。図43Hでは細菌で発現したインスリンに最初に、適当な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してN−アセチルガラクトサミンを加える。次いでポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図43Jでは細菌で発現したインスリンが異なる方法を通して修飾される:PEG化N−アセチルガラクトサミンを、適当な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図43Kでは細菌で発現したインスリンを以下の別のスキームに従い修飾する:ポリペプチドを最初にN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介した反応性シアル酸で誘導化した反応性N−アセチルガラクトサミンと接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、それゆえにトランスフェリンに連結するようになる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図43Lでは細菌で発現したインスリンをさらに別の方法を使用して修飾する:ポリペプチドは最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPに暴露されて、リンカーを介して反応性シアル酸残基に連結するようになる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびアシアロトランスフェリンを使用してトランスフェリンに連結される。次いでポリペプチドはST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化される。
別の例示態様では、本発明は図44A〜44Kに示すようにB型肝炎抗原(M抗原−preS2およびS)を修飾する方法を提供する。図44BではM−抗原が哺乳動物系で発現され、そして最初にシアリダーゼで処理されてシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3およびリンカーを介して脂質Aに連結した反応性シアル酸を使用して脂質Aに結合することにより修飾される。図44Cでは哺乳動物細胞で発現したM−抗原を、シアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal1およびリンカーを介しトキシンに連結した反応性シアル酸を使用してリンカーを介して破傷風トキシンに結合し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図44Dでは哺乳動物系で発現したM−抗原を最初にガラクトシダーゼで処理してガラクトシル残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。次いでポリペプチドは、ST3Gal1および適当な供与体を使用して加えたKLHでシアル酸を誘導化する。図44Eでは酵母で発現したM−抗原を最初にマンノダーゼで処理してマンノシル残基を戻し改作し、そして次いでGnT Iおよびジフテリアトキシンに連結したN−アセチルグルコサミンの供与体を使用してジフテリアトキシンに結合させる。図44Fでは哺乳動物細胞が発現したM−抗原を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図44Gでは哺乳動物系から得たM−抗原が、シアル酸供与体およびポリα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアリル化により改造される。図44Iでは昆虫細胞で発現したM−抗原を、GnT IIおよびナイセリア(Neisseria)タンパク質に連結したN−アセチルグルコサミンの適当な供与体を使用することによりナイセリア(Neisseria)タンパク質に結合させる。図44Jでは酵母が発現したM−抗原を、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびナイセリア(Neisseria)タンパク質に連結されたガラクトースの適切な供与体を使用してナイセリア(Neisseria)タンパク質に結合する。図44Kは酵母で発現したM−抗原の修飾の別の例である。ポリペプチドを最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、そして次いでGnT Iおよび/またはIIを使用してN−アセチルグルコサミンを加える。続いてポリペプチドを、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
別の例示態様では、本発明は図45A〜45Kに示すようにヒト成長ホルモン(N、Vおよびそれらの変異体)を修飾する方法を提供する。図45BではN−結合部位を含むように突然変異させたか、または哺乳動物により生産されたN−結合部位を有する天然に存在するアイソフォーム(すなわち胎盤の酵素)のいずれかのヒト成長ホルモンを、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3を用いて、そしてPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図45Cでは昆虫細胞で発現したヒト成長ホルモンが、GnT Iおよび/またはIIおよびPEG化N−アセチルグルコサミンの適切な供与体を使用してPEG化N−アセチルグルコサミンの付加により修飾される。図45Dでは、ヒト成長ホルモンを酵母で発現させ、エンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、そしてさらにPEG化ガラクトースの供与体を使用してガラクトシルトランスフェラーゼを用いてPEG化する。図45Fでは哺乳動物系で発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質を、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてPEG−シアル酸の供与体およびST3Gal1を使用したPEG化により修飾する。図45Gでは昆虫細胞で発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質を、ガラクトシルトランスフェラーゼでPEG化ガラクトースの供与体を使用したPEG化により改造する。図45Hではヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質が細菌で生産される。N−アセチルガラクトサミンが最初にN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用によりN−アセチルガラクトサミンの供与体を使用して融合タンパク質に加えられ、続いてPEG−シアル酸の供与体およびシアリルトランスフェラーゼを使用して融合タンパク質をPEG化する。図45Iでは細菌が発現したヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質の別の修飾スキームを記載する:融合タンパク質は、PEG化N−アセチルガラクトサミンの供与体を使用してN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用を介してPEG化される。図45Jはヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質のさらなる改造スキームを提供する。融合タンパク質を最初にN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化したN−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、融合タンパク質をリンカーおよびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いで融合タンパク質をシアリルトランスフェラーゼおよびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、このようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。次いで融合タンパク質は、ST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングする。図45Kでは、細菌で生産されたヒト成長ホルモン(N)の修飾についてさらに別のスキームを与える。ポリペプチドを最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPと接触させ、そしてリンカーを介して反応性シアル酸とカップリングされるようになる。次いでポリペプチドをST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてシアル酸残基を介してトランスフェリンと連結するようになる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。
別の例示態様では、本発明は図46A〜Gに示すようにTNFレセプターIgG融合タンパク質(TNFR−IgG、またはEnbrel(商標))を改造する方法を提供する。図46Bは哺乳動物系で発現したTNFR−IgGが最初にシアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ST3Gal1でシアリル化され;次いで融合タンパク質がガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化され;次いで融合タンパク質がST3Gal3の作用およびPEGで誘導化されたシアル酸の供与体を介してPEG化される修飾手順を具体的に説明する。図46Cでは哺乳動物細胞で発現したTNFR−IgGを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。続いてPEG部分は、ST3Gal1により触媒される反応で供与体から融合タンパク質へPEG化シアル酸を転移することによりTNFR−IgGに結合させる。図46DではTNFR−IgGが哺乳動物系で発現され、そしてPEG−ガラクトース供与体を使用したガラクトシルトランスフェラーゼにより媒介されるガラクトシル化法を介したPEGの付加により修飾される。図46EではTNFR−IgGが哺乳動物系で発現される。融合タンパク質の改造における第1工程は、シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ST3Gal1を使用したO−結合シアル酸残基の付加である。続いてPEG化ガラクトースを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG部分を有するガラクトースの適当な供与体を使用して融合タンパク質に加える。図46Fでは哺乳動物細胞で発現したTNFR−IgGを最初に、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。融合タンパク質のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図46Gでは哺乳動物細胞で発現したTNFR−IgGは、PEG化シアル酸をPEG部分を持つシアル酸の供与体から融合タンパク質へ転移する反応を触媒する2,8−シアリルトランスフェラーゼにより改造する。
別の例示態様では、本発明は図47A〜47Dに示すようにHereceptin(商標)結合物の生成法を提供する。図47BではHereceptin(商標)を哺乳動物系で発現させ、そして最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。次いでHereceptin(商標)は、反応性シアル酸−トキシン複合体を使用してST3Gal3の作用を通してシアル酸を介してトキシンに結合させる。図47Cでは哺乳動物細胞または真菌のいずれかで生産されたHereceptin(商標)は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび反応性ガラクトース−トキシン複合体を使用してガラクトシル化の工程を通してトキシンに結合させる。図47DはHereceptin(商標)結合物の別の作成スキームを含む:真菌で生産されたHereceptin(商標)を最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3および反応性シアル酸−放射性同位体複合体を使用することによるシアリル化により放射性同位体と結合させる。
別の例示態様では、本発明は図48A〜48Dに示すようにSynagis(商標)結合物の生成法を提供する。図48Bでは哺乳動物細胞で発現したSynagis(商標)を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図48Cでは哺乳動物または真菌細胞で発現したSynagis(商標)は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図48Dは発現したSynagis(商標)を最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
別の例示態様では、本発明は図49A〜49Dに示すようにRemicade(商標)結合物の生成法を提供する。図49Bでは哺乳動物系で発現したRemicade(商標)を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図49Cでは哺乳動物系で発現したRemicade(商標)は、適当な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化ガラクトースの付加により修飾する。図49Dは真菌で発現したRemicade(商標)を最初にエンド−Hで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3および放射性同位体で誘導化した反応性シアル酸を使用して放射性同位体に結合する。
別の例示態様では、本発明はNグリコシル化部位を含むように突然変異させたReoproを修飾する方法を提供する。図50A〜50Lはそのような例を含む。図50Bでは哺乳動物系で発現したReoproを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そしてST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図50Cでは昆虫細胞で発現したReoproを、適当な供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用したPEG化N−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図50Dでは酵母で発現したReoproを最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作する。続いてタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEGする。図50Fでは哺乳動物細胞で発現したReoproを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal1で、PEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図50Gでは昆虫細胞で発現したReoproを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化により修飾する。図50Hでは細菌で発現したReoproは最初に、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。次いでタンパク質はシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図50Jでは細菌で発現したReoproが異なるスキームで修飾される:これはPEG化N−アセチルガラクトサミンの供与体を使用して、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用を介したPEG化である。図50Kでは細菌で発現したReoproを別の方法で修飾する:最初にポリペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化したN−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、これによりシアル酸残基を介してトランスフェリンに連結するようになる。次いでポリペプチドは適当な供与体およびST3Gal3を使用してシアル酸残基でキャッピングする。図50Lでは細菌で発現したReoproのさらなる修飾スキームを提供する。
ポリペプチドを最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPに暴露して、リンカーを介して反応性シアル酸に連結するようにする。次いでポリペプチドはST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してトランスフェリンと連結するようにする。次いでポリペプチドは適切な供与体およびST3Gal3を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
別の例示態様では、本発明はRituxan(商標)結合物を生産する方法を提供する。図51A〜51Gはその幾つかの例を提示する。図51Bでは種々の哺乳動物系で発現したRituxan(商標)は、最初に適切なガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでペプチドは、シアル酸供与体およびST3Gal3を使用してトキシン部分で誘導化したシアル酸で官能化される。図51Cでは哺乳動物細胞または真菌細胞で発現したRituxan(商標)を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、これは薬剤部分を含有するペプチドガラクトースを提供する。図51Dでは真菌系で発現したRituxan(商標)を改造する別の例を提供する。ポリペプチドのグリコシル基を最初にエンド−Hを使用して戻し改作する。次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトースを加える。続いて放射性同位体を、放射同位体−複合化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ST3Gal3を介して分子に結合させる。図51FではRituxan(商標)を哺乳動物系で発現させ、そして最初にガラクトシルトランスフェラーゼおよび適切なガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し;PEG部分を持つシアル酸を、次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸供与体を使用して分子に結合させる。図51Gに示すように、真菌、酵母または哺乳動物細胞で発現したRituxan(商標)は以下の方法で修飾することもできる:最初にポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を除去する;次いでGlcNAcを、GnT−I、IIおよびGlcNAc供与体を使用して分子に結合させ、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよび放射性同位体を結合することができる錯化部分にカップリングしたガラクトースの供与体を使用したガラクトシル化により放射性同位体を結合する。
A.N−結合グルコシル化部位の作成または排除
本発明は、ペプチド上のグリカン鎖(1つまたは複数)の部位が天然なペプチドグリカン鎖から改変されたペプチドの使用を意図する。典型的にはN−結合グリカン鎖はアスパラギン残基で1次ペプチド構造に連結され、ここでアスパラギン残基は小胞体(ER)内の膜−結合グリコシルトランスフェラーゼにより認識されるアミノ酸配列内にある。典型的には1次ペプチド構造上の認識部位は配列アスパラギン−X−セリン/トレオニでンあり、ここでXはプロリンおよびアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸であることができる。この認識部位は典型的なものであるが、本発明はさらに、N−結合鎖が天然なまたは組換えグリコシルトランスフェラーゼを使用して加えられた他の認識部位にN−結合グリカン鎖を有するペプチドを包含する。
ペプチドのN−結合グリコシル化の認識部位は知られているので、天然なN−結合グリコシル化認識部位が除去されるか、あるいはさらに1以上のさらなるN−グリコシル化認識部位が作成される突然変異した1次ペプチド配列を作成することは十分に当業者の技術範囲内である。最も単純な場合では、アスパラギン残基をペプチドの1次配列から除去し、これによりグリカンの結合部位を除去し、このようにして成熟ペプチドから1つのグリカンを除去することができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの配列をもつ天然な認識部位は、配列ロイシン−セリン−セリンを有するように遺伝的に操作して、この位置でのN−結合グリコシル化部位を排除することができる。
さらにN−結合グリコシル化部位は、たとえアスパラギン残基が存在しても1以上のさらなる認識残基が存在しないように、認識部位中の残基を改変することにより除去することができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの天然な配列をアスパラギン−セリン−リシンに突然変異させて、これによりその位置でのN−グリコシル化部位を排除することができる。上記の典型的な認識部位以外の残基を含んでなるN−結合グリコシル化部位の場合では、当業者は適切なグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるために必要な配列および残基を決定し、そして次に適切なグリコシルトランスフェラーゼがもはやその部位を認識しないように少なくとも1つの残基を突然変異させることができる。換言すると、グリコシル化部位の作成または除去、あるいは両方を行い、これにより改変されたグリコシルパターンを有するペプチドを生成するために、ペプチドの1次配列を操作することは十分に当業者の技術範囲内である。したがって本発明はグリカン改造の唯一の配列として本明細書に提供する1次ペプチド配列に限定されると解釈するべきではなく、むしろグリカン改造に適する任意かつすべてのペプチド配列を含むと解釈するべきである。
突然変異ペプチドを作成するために、天然なアミノ酸残基をコードする天然なコドンを突然変異させて別のアミノ酸残基をコードするコドンを生成するように、ペプチドの1次配列をコードする核酸配列を改変させる。核酸配列を改変させる技術は当該技術分野で一般的であり、そして例えば任意の周知な分子生物学マニュアルに記載されている。
さらに1次ペプチド構造をコードする核酸は、標準的な技術を使用してインビトロで合成することができる。例えば核酸分子はホスホロアミダイト法のようなプロトコールを使用する「遺伝子機械」で合成することができる。化学的に合成した二本鎖DNAが核酸またはそのフラグメントの合成のような応用に必要な場合、各相補鎖を別個に合成する。短い核酸(60〜80塩基対)の生成は技術的には単純であり、そして相補鎖を合成し、そして続いてそれらをアニーリングすることにより行うことができる。長い核酸(>300塩基対)の生成については、化学的なDNA合成中の各サイクルのカップリング効率がめったに100%とはならないので特別な方法が必要かもしれない。この問題を克服するために、合成遺伝子(二本鎖)を、20〜100ヌクレオチド長の一本鎖であるフラグメントからの組み立て形態で集成する。ポリヌクレオチド合成に関する総説は、例えばGlick and Pasternak(モレキュラーバイオテクノロジー、組換えDNAの原理および応用:Molecular Biotechnology,Principles and Applications of Recombinant DNA)、1994、ASM出版)、Itakura et al.,(1984,Annu,Rev.Biochem.53:323)、およびClimie et al.,(1990,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 87:633)を参照にされたい。
さらにペプチドをコードする核酸配列中の変化は部位指向的突然変異誘発法により作成することができる。明らかであるように、この技術は典型的には一本鎖および二本鎖状態の両方で存在するファージベクターを使用する。部位指向的突然変異誘発法に有用な典型的なベクターには、M13ファージのようなベクターを含む。これらのファージは容易に入手可能であり、そしてそれらの使用は当業者にとって周知である。二本鎖プラスミドも部位指向的突然変異誘発法に日常的に使用され、これは問題の核酸をプラスミドからファージへ移す工程を排除する。
一般に部位指向的突然変異誘発法は最初に、その配列内に所望のペプチドをコードするDNA配列を含む一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの二本鎖を融解することにより行なわれる。所望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを一般には合成的に調製する。このプライマーを次いで一本鎖ベクターとアニーリングし、そして突然変異を持つ鎖の合成を完成するために大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIクレノーフラグメントのようなDNA重合酵素に供する。これによりヘテロ二本鎖が形成され、ここで1つの鎖がもとの非突然変異配列をコードし、そして2番目の鎖が所望の突然変異を持つ。このヘテロ二本鎖ベクターを次いで大腸菌(E.coli)細胞のような適切な細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用し、そして突然変異した配列の配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。突然変異したオリゴヌクレオチドを包含するクローンを濃縮するための遺伝子選択スキームは、Kunkel et al.(1987,Kunkel et al.,Methods Enzymol.154:367−382)により考案された。あるいはPCR(商標)と市販されているTaqポリメラーゼのような熱安定性酵素との使用を、増幅したDNAフラグメントに突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを包含させるために使用し、これは次いで適切なクローニングまたは発現ベクターにクローン化することができる。Tomic et al.(1990,Nucl.Acids Res.,12:1656)およびUpender et al.(1995,Biotechniques,18:29−31)のPCR(商標)媒介突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの2例を提供する。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するPCR(商標)を使用して、リン酸化された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを増幅したDNAフラグメントに包含させることもでき、これは次いで適当なクローニングまたは発現ベクターにクローン化することができる。Michael(1994,Biotechniques,16:410−412)により記載された突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの1例を提供する。
すべてのAsn−X−Ser/Thr配列がN−グリコシル化されていないことは、提示されているモチーフの内容が重要であることを示唆している。別の取り組みでは、インビボでグリコシル化され、そして活性、安定性またはペプチドの他の特性に対して有利である新規なN−結合部位を同定するために、新規N−結合共通部位を有する突然変異ペプチドのライブラリーを作成する。
前に記載したように、糖タンパク質中にN−結合グリカン鎖を付加するための共通配列はAsn−X−Ser/Thr(ここでXは任意のアミノ酸であることができる)である。Asnのカルボキシル末端側から2つの目のアミノ酸位をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な手順を使用してSerおよび/またはThr残基をコードするように突然変異させることができる。上記のように、すべてのAsn−X−Ser/Thr部位がグリカンの付加により修飾されるわけではない。したがって各組換え突然変異糖タンパク質は真菌、酵母または動物または哺乳動物発現系で発現され、そしてN−結合グリカン鎖の付加に関して分析されなければならない。グリコシル化部位を特性決定するための技術は当業者には周知である。さらに突然変異した組換え糖タンパク質の生物学的機能は、調査する特定のタンパク質に関して標準的なアッセイを使用して決定することができる。このようにペプチドの1次配列を操作し、そしてそれに含まれる新規なグリコシル化部位を同定し、そしてさらにペプチドの生物学的活性に及ぼす新規部位の効果を決定することは簡単な問題となる。
別の態様では、Ser/Thr残基のアミノ末端側から2つ目のアミノ酸位をコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な手順を使用してAsnをコードするように突然変異させることができる。新規なグリコシル化部位が作成されたかどうか、およびこの部位がペプチドの生物学的活性に及ぼす効果を決定する手順は上に記載している。
B.O−結合グリコシル化部位の作成または排除
ペプチドにO−結合グリコシル化部位を付加することは、ペプチドの始めの1次アミノ酸配列に比べてペプチドの1次アミノ酸配列が1以上のさらなるO−結合グリコシル化部位を含むように、ペプチドの1次アミノ酸配列を改変させることにより都合よく行う。ペプチドにO−結合グリコシル化部位を加えることは、OH基が接近可能となり、そしてO−結合グリコシル化に利用できるようになるように、ペプチドの配列内に−OH基、好ましくはセリンまたはトレオニン残基を含んでなる1以上のアミノ酸種をペプチドに包含させることにより行うこともできる。ペプチド内のN−結合グリコシル化部位の改変の検討と同様に、ペプチドの1次アミノ酸配列は好ましくはヌクレオチドレベルで改変する。ペプチドをコードするDNA配列中の特別なヌクレオチドは、所望のアミノ酸が配列にコードされるように改変することができる。DNA中の突然変異(1つまたは複数)は好ましくは、上記のホスホロアミダイト法のDNA合成および部位指向的突然変異誘発法の技術のような当該技術分野で既知の方法を使用して作成される。
あるいはO−結合グリカンを付加する推定部位をコードするヌクレオチド配列はDNA分子に、1または幾つかのコピーで分子の5’または3’末端に加えることができる。次いで改変されたDNA配列を真菌、酵母または動物もしくは哺乳動物発現系の任意の1つで発現させ、そしてペプチドへの配列の付加およびこの配列が機能的なO−結合グリコシル化部位であるか否かが分析される。簡単に説明すると合成ペプチドの受容体配列をヌクレオチド分子の5’または3’末端に導入する。原理的には、この型の配列の付加は適当な発現系で発現した時に生じる糖タンパク質に対して破壊性が低い。次いで改変したDNAはCHO細胞または他の適切な発現系で発現させ、そしてこれにより発現したタンパク質をO−結合グリコシル化部位の存在について調査する。さらにグリカン鎖の存在または不存在を決定することができる。
別の取り組みでは、新規なO−結合部位に有利な部位を、様々な新規O−結合部位を含むペプチドのライブラリーを作成することによりペプチド中に見いだすことができる。例えばN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによるN−アセチルガラクトサミン付加のための共通アミノ酸配列は、使用する特異的なトランスフェラーゼに依存する。
ペプチドのアミノ酸配列を走査して、O−結合グリカン鎖の付加の可能性部位を生じるように突然変異させることができるアミノ酸の連続する基を同定することができる。これらの突然変異はすでに記載したような当業者には知られている標準的手順を使用して生成することができる。見いだされたグリコシル化部位が実際にグリコシル化されるかどうかを決定するために、次に各組換え突然変異ペプチドを適当な発現系で発現させ、そして続いてO−結合グリカン鎖の部位および/または存在の付加について分析する。
C.ペプチドの化学合成
本発明に有用なペプチドの1次構造は細胞に基づく発現系で最も効率的に生成され得るが、ペプチドが合成的に生成できることも本発明の範囲内である。ペプチドの化学合成は当該技術分野では周知であり、そして限定するわけてはないが段階的な固相合成、および溶液中または固相上でのフラグメント縮合を含む。古典的な段階的固相合成には、所望のペプチド鎖のカルボキシ−末端アミノ酸に対応するアミノ酸を固体支持体に共有結合し、そしてペプチド鎖を、活性化カルボキシル基を有する活性化アミノ酸誘導体の段階的カップリングにより、アミノ末端に向けて延長することを含む。完全に保護された固相結合ペプチド鎖の集成体が完成した後、ペプチド−固相の共有結合を適当な化学により開裂し、そして保護基を除去して生成物であるペプチドを得る。R.Merrifield、固相ペプチド合成:テトラペプチドの合成(Solid Phase Peptide Synthesis:The Synthesis of Tetrapeptide)、J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)を参照にされたい。より長いペプチド鎖ほど、高純度の十分に規定された生成物を得ることが難しくなる。
複雑な混合物の生産のために、段階的な固相合成法にはサイズに限界がある。一般に100の連続するアミノ酸残基またはそれ以上の十分に規定されたペプチドが、段階的な固相合成を介して日常的に調製されることはない。
セグメント縮合法は、固相の段階的方法による数種のペプチドセグメントの調製、続いて固相からの開裂、そしてこれら最大に保護されたセグメントの精製を含む。保護されたセグメントは固相に結合した最初のセグメントまで1つずつ縮合される。
本発明に有用なペプチドは、排他的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合または古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者には周知である(例えばMerrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963)、Stewart et al.、「固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」(第2版)、(ピアスケミカル社、1984)、Bayer and Rapp,Chem.Pept.Prot.3:3(1986)、Atherton et al.,固相ペプチド合成:実践的とりくみ(Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(IRL出版、1989)、Fields and Colowick、「固相ペプチド合成(Solid−Phase Peptide Synthesis)」、Methods in Enzymology 第289巻(アカデミック出版1997)、およびLloyd−Williams et al.、ペプチド合成の化学的取り組みおよびペプチド(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Peptides)(CRC出版社、1997)を参照にされたい)。「天然な化学的連結」および「発現したペプチドの連結」のような全化学合成法における変更も標準的である(例えばDawson et al.,Science 266:776(1994),Hackeng et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 94:7845(1997),Dawson,Methods Enzymol.287:34(1997),Muir et al,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:6705(1998),and Severinov and Muir,J.Biol.Chem.273:16205(1998))を参照にされたい)。また有用であるのは、カリフォルニア州、サウスサンフシンシスコのグリフォン サイエンス(Gryphon Science)により開発された固相ペプチド合成法である。米国特許第6,326,468号、同第6,217,873号、同第6,174,530号および同第6,001,364号明細書を参照にされたい(これらすべては全部、引用により本明細書に編入する)。
D.翻訳後修飾
当業者はペプチドがN−結合および/またはO−結合グリカンを付加される上に、翻訳後修飾も受け得ると考えるだろう。グリコシル化以外の翻訳後修飾を有するペプチドは、ペプチドの所望する生物学的活性または機能を保持または改善するかぎり、本発明でペプチドとして使用できることを意図している。そのような翻訳後修飾は通常、インビボで起こる天然な修飾、またはペプチドにインビトロで行われる操作された修飾であることができる。意図する既知の修飾には限定するわけではないがアセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫黄化、アルギニレーションのようなトランスファー−RNAが媒介するアミノ酸のペプチドへの付加、およびユビキチン化を含む。多くのこれらの修飾を行うために使用され得る酵素は当該技術分野では周知であり、そして中でもベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)(インディアナポリス、イリノイ州)およびシグマケミカル社(セントルイス、モンタナ州)のような会社から市販されている。
そのような修飾は当業者には周知であり、そして科学技術文献で大変詳細に記載されてきた。幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫黄化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル化は、ペプチド−構造および分子的特性(Peptides−Structure and Molecular Properties)、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1993)のようなほとんどの基本的な教科書に記載されている。この主題については、Wold,F.、ペプチドの翻訳後の共有的修飾(Post−translational Covalent Modification of Peptides)、B.C.Johnson編集、アカデミック出版、ニューヨーク、1−12(1983);Seifer et al.,(Meth.Enzymol.182:626−646(1990))およびRattan et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48−62(1992))によるような多くの詳細な総説が入手可能である。
ペプチドの共有的修飾も、選択した側鎖または末端アミノ酸残基と反応することができる有機誘導化剤を用いてペプチドの標的とするアミノ酸残基と反応させることにより、インビトロで分子に導入することもできる。最も一般的に誘導化される残基はシステイン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、チロシン、グルタミン、アスパラギンおよびアミノ末端残基である。プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンおよびトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、ヒスチジンのアルファ−アミノ基およびヒスチジン側鎖のメチル化、N−末端アミンのアセチル化およびC−末端カルボキシル基のアミド化。そのような誘導化された部分は溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善する。この部分はまた、ペプチド等の望ましくない副作用も排除または弱めることができる。
さらに二官能性試薬での誘導化もペプチドを水不溶性支持体マトリックスまたは他の高分子担体に架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤にはグルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、1,1−ビス(−ジアゾロアセチル)−2−フェニルエタンおよび二官能性マレイミドを含む。メチル−3−[9p−アジドフェニル)]ジチオプロピオイミデートのような誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。あるいは臭化シアンで活性化した炭水化物および米国特許第3,969,287号および同第3,691,016号明細書に記載されている反応性物質のような反応性の水不溶性マトリックスをペプチドの固定化に使用してもよい。
E.融合ペプチド/ペプチド
本発明に有用なペプチドは融合ペプチドを含んでなることができる。融合ペプチドは2つのペプチドの生物学的および/または機能的特性が1つのペプチド分子内に組み合わされることが望まれる場合、特に有利である。そのような融合ペプチドは、治療用および工業的応用の新規かつ有用な分子を作成するために、天然には見いだされない生物学的活性および機能の組み合わせを提示することができる。問題の生物学的活性には限定するわけではないが酵素活性、レセプターおよび/またはリガンド活性、免疫原性モチーフおよび構造的ドメインを含む。
そのような融合ペプチドは当該技術分野では周知であり、そして作成法は当業者には周知である。例えばヒトα−インターフェロン−ヒト融合ペプチドがすでに作成され、ここで生成したペプチドはアルブミンの長期循環寿命と組合わされたα−インターフェロンの治療的利益を有し、これにより減少した投与頻度、および患者に副作用の可能性が低下した治療用組成物が作られる。ヒトゲノムサイエンス(Human Genome Science)社からのAlbuferon(商標)および米国特許第5,766,883号明細書を参照にされたい。他の融合ペプチドには、本明細書のいたるところに記載する抗体分子を含む。
F.より小さな「生物学的に活性な」分子の生成
本発明で使用するペプチドは天然なペプチドの変異体でよく、ここで天然なペプチドのフラグメントが完全長の天然なペプチドの代わりに使用される。さらにプレ−プロ−およびプレ−ペプチドを企図する。変異体ペプチドは天然なペプチドよりもサイズが小さくてもよく、そしてより大きなペプチドの1以上のドメインを含んでなってもよい。特別なペプチドドメインの選択は、ペプチド中の特定のドメインの生物学的活性が望まれるが、ペプチドの他のドメインの生物学的活性は望まない時に有利となり得る。またペプチドの所望する治療的効果を強化することができるペプチドの短縮化および内部削除も含む。そのような任意な形のペプチドは、ペプチドの所望する活性が保存される限り、本発明に有用となることを意図している。
ペプチドのより短い変形物は天然なペプチドには見いだされない独自の利点を有することができる。ヒトのアルブミンの場合、天然なアルブミンペプチドのわずか63%を含んでなる短縮化形態が、血漿容量増量剤として有利であることが分かった。短縮化アルブミンペプチドは、天然なヒト血清アルブミンあるいは組換えヒト血清アルブミンの2分の1から3分の2の個々のペプチド用量が均等なコロイド浸透効果(colloid osmotic effect)に必要とされるだけなので、治療目的のために天然なペプチドよりも良いと考えられている。米国特許第5,380,712号明細書(この内容は全部、引用により本明細書に編入する)を参照にされたい。
より小さい「生物学的に活性な」ペプチドも、天然なペプチドに比べて強化された治療的活性を有することが見いだされた。IL−2の治療的効力は、血管漏出症候群により支配される種々の副作用により制限される。全α−ヘリックスに対応する残基1〜30から成るより短く化学的に合成したペプチドの変形物は正しく折り畳まれ、そして天然なIL−2の生物学的的活性を副作用を伴うこと無しに含むことが分かった。
G.新規ペプチドの生成
本発明のペプチドは天然なペプチドの1次配列に由来するものでよく、または当業者に知られている多くの手段を使用して工作することができる。そのように工作したペプチドは、天然なペプチドに比べて強化された、または新規な特性から設計され、かつ/または選択されることができる。例えばペプチドは、上昇した酵素反応速度、上昇したまたは低下した基質もしくはリガンドへの結合親和性、上昇または低下したレセプターへの結合親和性、基質、リガンド、レセプターまたは他の結合パートナーに対する改変された特異性、上昇または低下したインビトロおよび/またはインビボの安定性、あるいは動物において上昇または低下した免疫原性を有するように工作することができる。
H.突然変異
1.合理的な設計の突然変異
本発明の方法に有用なペプチドは、所望する生物学的活性または機能を強化し、ペプチドの望ましくない特性を縮小し、かつ/またはペプチドに新規活性または機能を加えるために突然変異させることができる。「合理的なペプチド設計」はそのような改変されたペプチドを生成するために使用することができる。いったんペプチドのアミノ酸配列および構造を知り、そして所望する突然変異を計画すれば、突然変異は突然変異させることを望むアミノ酸残基をコードする対応する核酸コドンに対して最も都合良く作成することができる。当業者は一般的(universal)な遺伝子コード、および選択した発現系でのコドン優先性の知識に基づき、どのように核酸配列を改変すべきかを容易に決定することができる。コドン中の突然変異は翻訳中にペプチドに重合化されるアミノ酸残基を変化させるために作ることができる。あるいはコドンは対応するコードされるアミノ酸残基は同じであるが、コドンの選択が所望のペプチド発現系により適するように突然変異させることができる。例えばシス−残基を別のアミノ酸に置き換えて成熟ペプチドからジスルフィド結合を除去してもよく、触媒ドメインを突然変異させて生物学的活性を改変してもよく、そして一般にペプチドのアイソフォームを工作することができる。そのような突然変異はとりわけ点突然変異、削除、挿入および短縮であることができる。
ペプチド中の特別なアミノ酸を突然変異させる技術は当該技術分野において周知である。上で検討した部位指向的突然変異誘発法はコドンの指向的突然変異によく適している。
オリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法もSambrook et al.,(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、15.51頁から始まる)により詳細に検討されている。体系的な削除、挿入および短縮化は、当該技術分野で周知な他の方法の中でもリンカー挿入突然変異誘発法、ヌクレアーゼBal31での消化、およびリンカー走査(linker−scanning)突然変異誘発法を使用して作成することができる(Sambrook et al.、2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)。
合理的なペプチドの設計は、熱不活性化および酸化に対する酵素の安定性を上げるために成功裏に使用されてきた。例えば酵素の安定性はα−アミラーゼ中のアスパラギン残基の除去(Declerck et al.,2000,J.Mol.Biol.301:1041−1057)、プロリンのようなより硬い構造的要素のα−アミラーゼ(Igarashi et al.,1999,Biosci.Biotechnol.Biochem.63:1535−1540)およびD−キシロースイソメラーゼ(Zhu et al.,1999,Peptide Eng.12:635−638)への導入により向上した。さらに疎水的接触の導入が3−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(Akanuma et al.,1999,Eur.J.Biochem.260:499−504)およびシュードモナス種(Pseudomonas)種から得たギ酸デヒドロゲナーゼ(Rojkova et al.,1999,FEBS Lett.445:183−188)を安定化した。これら突然変異の安定化効果の背後にあるメカニズムは、一般に多くのペプチドに応用することができる。これらのおよび同様の突然変異は、本発明の方法で改造されるペプチドに関して有用になると予想する。
2.ランダム変異導入(Random mutagenesis)技術
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、核酸のコード配列にランダムな突然変異を導入する技術を使用して生成することができる。次いで核酸は望ましい発現系で発現され、そして生成したペプチドを問題の特性について評価する。ランダムな突然変異をDNA配列に導入するための技術は当該技術分野では周知であり、そしてPCR突然変異誘発法、飽和(saturation)突然変異誘発法および縮重オリゴヌクレオチド法を含む。Sambrook and Russell(2001、モレキュラークローニング、ア ラボラトリーアプローチ、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)およびAusubel et al.(2002、分子生物学の現在の手法(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン ウィリー&サンズ、ニューヨーク州)を参照にされたい。
PCR突然変異誘発法では、低下したTaqポリメラーゼの忠実度を使用してランダムな突然変異をDNAのクローン化したフラグメントに導入する(Leung et al.,1989,Technique 1:11−15)。これはランダムの突然変異をDNA配列に導入する大変有力で、しかも比較的迅速な方法である。突然変異させるDNA領域は、例えば改変したdGTP/dATP比を使用することにより、およびMn2+をPCR反応に加えることにより、TaqDNAポリメラーゼによるDNA合成の忠実度が下がる条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅させる。増幅したDNAフラグメントのプールは適切なクローニングベクターに挿入してランダムな突然変異ライブラリーを提供する。
飽和突然変異誘発法は、多数の1塩基置換をクローン化したDNAフラグメントに迅速に導入することを可能とする(Mayers et al.,1985,Science229:242)。この技術には例えばインビトロでの化学的処理または一本鎖DNAの照射による突然変異の作成、そして相補的DNA鎖の合成を含む。突然変異の頻度は処理の厳しさを調節(modulating)することにより調節することができ、そして本質的にすべての可能な塩基置換を得ることができる。この手順には突然変異フラグメントに関する遺伝子選択が関与しないので、中性の置換ならびに機能を改変する置換の両方が得られる。点突然変異の分布は保存された配列要素に片寄らない。
核酸相同体のライブラリーは、1組の縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することもできる。縮重オリゴヌクレオチド配列の化学的合成は、自動化DNA合成器で行うことができ、そして合成遺伝子は次に適切な発現ベクターに連結することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野では知られている(例えばNarang,SA(1983)Tetrahedron39:3;Itakura et al.(1981)組換えDNA(Recombinant DNA)、Proc 3rd、クリーブランド シンポ。高分子(Macromolecules)編集、AG ヴァルトン、アムステルダム:エルセビア(Elsevier)273−289頁;Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura et al.(1984)Science198:1056;Ike et al.(1983)Nucleic Acids Res.11:477を参照にされたい。そのような技術は他のペプチドの方向性のある進化(directed evolution)にも使用された(例えばScott et al.(1990)Science249:386−390;Roberts et al.(1992)PNAS89:2429−2433;Devlin et al.(1990)Science249:404−406;Cwirla et al.(1990)PNAS87:6378−6382;ならびに米国特許第5,223,409号、同第5,198,346号および同第5,096,815号明細書を参照にされたい)。
a.方向付けされる進化(Directed evolution)
本発明の方法で有用なペプチドは、「方向付けされる進化」の技術を使用して生成することもできる。ペプチドの構造の知識を必要とする部位指向的突然変異誘発技術とは対照的に、今ではペプチドの構造的特徴の知識無しで改善された特性を持つペプチドが得られる突然変異のライブラリーを作成する方法が存在する。これらの方法は一般に「方向付けされる進化」の技術として知られ、そして問題のペプチドをコードする核酸配列を循環的(recursive round)な突然変異、スクリーニングそして増幅に供する点でこれまでのランダムな変異誘導手順とは異なる。
幾つかの「方向付けされる進化」技術では、得られた核酸の多様性は核酸配列に点突然変異をランダムに作成する突然変異法により生成される。点突然変異技術には限定するわけではないが、「誤−傾向(error−prone)PCR(商標)」(Caldwell and Joyce,1994:PCR Methods Appl.2:28−33;およびKe and Madison,1997,Nucleic Acids Res.2:3371−3372)、反復オリゴヌクレオチド−指向的突然変異誘発法(repeated oligonucleotide−directed mutagenesis)(Reidhaar−Olson et al.,1991,Methods Enzymol,208:564−586)、および前記の任意なランダム変異導入法を含む。
方向付けされる進化が作用し得る多様性を作成する別の方法は、突然変異誘発遺伝子の使用である。問題の核酸を、ゲノムが典型的には欠損性DNA修復遺伝子をコードする突然変異誘発細胞株の中で培養する(米国特許第6,365,410号明細書、Selifonova et al.,2001,Appl.Environ.Microbiol.67:3645−3649;Long−McGie et al.,2000,Biotech.Bioeng.68:121−125;ジェネンコール インターナショナル社(Genencor International Inc.)、パロアルト、カリフォルニア州を参照にされたい)。
方向付けされる進化の技術を使用して多様性を達成することは、縮重プライマーと一緒に飽和突然変異誘発法を使用しても行うことができる(Gene Site Saturation Mutagenesis(商標)、ディバーサ社(Diversa Corp)、サンディエゴ、カリフォルニア州)。この種の飽和突然変異誘発法では、多様化されるべき核酸配列長を覆うように設計された縮重プライマーを使用して、PCR反応でポリメラーゼをプライムする。この様式では、アミノ酸のコード配列の各コドンを突然変異させて、残りは一般的な各19個のアミノ酸をコードするようにする。この技術は核酸コード配列の特別な領域に突然変異、削除および挿入を導入するためにも使用できると同時に、残りの核酸分子を手付かずにしておく。遺伝子飽和技術に関する手順は当該技術分野では周知であり、そして米国特許第6,171,820号明細書に見いだすことができる。
b.DNAシャフリング(shuffling)
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、遺伝子−シャフリング、モチーフ−シャフリング、エキソン−シャフリングおよび/またはコドン−シャフリング(集合的に「DNAシャフリング」と呼ぶ)を使用して生成することもできる。DNAシャフリング技術は本発明に有用なペプチドの活性をモジュレートするために使用することができ、そして改変した活性を有するペプチドを生成するために使用することができる。一般に米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;および同第5,837,458号明細書、およびStemmer et al.(1994,Nature 370(6488):389−391);Crameri et al.(1998,Nature 391(6664):288−291);Zhang et al.(1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(9):4504−4509);Stemmer et al.(1994,Proc.Natl.Acad.Sci USA 91(22):10747−10751),Patten et al.(1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724−33);Harayama,(1998,Trends Biotechnol.16(2):76−82);Hansson,et al.,(1999,J.Mol.Biol.287:265−76);and Lorenzo and Blasco(1998,Biotec hniques 24(2):308−13)
を参照にされたい(これら各々は、引用により本明細書に編入する)。
DNAシャフリングにはポリヌクレオチド配列に変化を生じるために、2以上のDNAセグメントの相同的または部位特異的組換えを集合することが関与する。DNAシャフリングはヒト免疫不全ウイルス1型タンパク質(Pekrun et al.2002,J.Virol.76(6):2924−35)、トリアジンヒドロラーゼ(Raillard et al.2001,Chem Biol8(9):891−898)、マウス白血病ウイルス(MLV)タンパク質(Powell et al.2000,Nat Biotechnol 18(12):1279−1282)、およびインドールグリセロールホスフェートシンターゼ(Merz et al.2000,Biochemistry 39(5):880−889)の新規変化を生成するために使用されて来た。
DNAシャフリングの技術は、DNAのインビトロ相同的組換えを可能にすることにより天然な組換えを模することによる生体分子の多様性を作成するために開発された(Stemmler,1994,Nature 370:389−391;およびStemmler,1994,PNAS 91:10747−10751)。一般にこの方法では関連する遺伝子群を断片化し、そして変性の循環サイクル、再ハイブリダイゼーション、そして続いてTaqポリメラーゼによる5’突出部の延長に供する。各サイクルでフラグメントの長さが増し、そしてDNA組換えは異なる遺伝子に由来するフラグメントが互いにハイブリダイズする時に起こる。DNAの最初の断片化は通常、ヌクレアーゼ消化、典型的にはDNaseを使用して達成されるが(Stemmlerの参考文献、同上を参照にされたい)、切断(interrupted)PCR合成により行うこともできる(米国特許第5.965,408号明細書、引用により全部、本明細書に編入する;ディバース社、サンディエゴ、カリフォルニア州を参照にされたい)。DNAシャフリング法は各回のシャフリングにより、生成される有利な突然変異の指向的な組換えが達成され、したがってペプチドの改善された表現型について自己選択がある点で、ランダムな点突然変異法よりも有利である。
DNAシャフリングの技術は当該技術分野では周知である。そのような技術の詳細な説明は、Stemmler,1994,Nature 370:389−391およびStemmler,1994,PNAS 91:10747−10751に見いだされる。DNAシャフリング技術は米国特許第6,180,406号、同第6,165,793号、同第6,132,970号、同第6,117,679号、同第6,096,548号、同第5,837,458号、同第5,834,252号、同第5,830,721号、同第5,811,238号および同第5,605,793号明細書にも記載されている(これらはすべて引用により全部、本明細書に編入する)。
この技術はまた、さらに最近ではDNAシャフリングの基本的技術の変法も提供する。
1例では、エキソンシャフリングでペプチドの特別なドメインをコードするエキソンまたはエキソンの組み合わせがキメラオリゴヌクレオチドを使用して増幅される。増幅された分子は次いで自己−プライミングアッセンブリー(self−priming PCR assembly)により組換えられる(Kolkman and Stemmler,2001,Nat.Biotech.19:423−428)。別の例では一過性の鋳型ライブラリー構築に関するランダムなキメラ誘発法(random chimeragenesis:RACHITT)の技術を使用して、1本鎖の元のDNAフラグメントを完全長の1本鎖の鋳型にアニーリングする(Coco et al.,2001,Nat.Biotechnol.19:354−359)。さらに別の例では、付着伸長法(staggered extension process:StEP)、大変省略されたアニーリング/延長サイクルでの熱サイクリングを使用して、フランキングプライマーからDNA重合を反復して切断する(Zhao et al.,1998,Nat.Biotechnol.16:258−261)。CLERYとして知られている技術では、酵母を対象としてインビトロのファミリーシャフリングをインビボの相同的組換えと組み合わせる(Abecassis et al.,2000,Nucleic Acids Res.28:E88;)。遺伝子間組換えを最大にするために、各核酸の相補鎖からの1本鎖DNAをDNaseで消化し、そしてアニーリングする(Kikuchi et al.,2000,Gene 243:133−137)。次いで開裂可能な配列により連結されている可変長の2つの短縮化核酸の平滑末端を連結して、相同的組換え無しに遺伝子融合を生成する(Sieber et al.,2001,Nat.Biotechnol.19:456−460;Lutz et al.,2001,Nucleic Acids Res.29:E16;Ostermeier et al.,1999,Nat.Biotechnol.17:1205−1209;Lutz and Benkovic,2000,Curr.Opin.Biotechnol.11:319−324)。小さい配列相同性を持つ核酸間の組換えは一般に、DNAフラグメントのエキソヌクレアーゼが媒介する平滑末端化、そしてフラグメントを一緒に連結してそれらを組換えることによっても強化された(米国特許第6,361,974号明細書、引用により全部、本明細書に編入する)。本発明は本発明の方法に有用なペプチドおよび/または酵素の生物学的特性を強化する手段として、上記の各々、およびすべての変異の使用を意図する。
方向性のある進化および遺伝子シャフリング技術を詳細に記載する公開されたプロトコールに加えて、今では選択したペプチドの遺伝子シャフリングおよび選択手順を請け負う商業的サービスも利用することができる。マキシジェン(Maxygen:レッドウッドシティ、カリフォルニア州)は、カスタムDNAシャフリングライブラリーを作成するための商業的サービスを提供する。さらにこの会社は、遺伝子シャフリングおよび選択するペプチドファミリーの選択を含むカスタマイズされた方向付けされる進化の手順も行う。
オプティジェニックス社(Optigenix Inc.、ニューアーク、デラウエア州)、プラスミドシャフリングに関連したサービスを提供する。オプティジェニックスは新たな特性を有する突然変異をその中に得るために、遺伝子ファミリーを使用する。問題の核酸をアスペルギルス(Aspergillus)発現系中のプラスミドにクローン化する。次いで関連するファミリーのDNAを発現系に導入し、そしてファミリーの保存された領域中の組換えが宿主中で起こる。次いで生成した突然変異DNAが発現し、そしてそれらから生産されたペプチドを、所望の特性の存在および望ましくない特性の不存在についてスクリーニングする。
c.スクリーニング手順
「進化」の各循環後、突然変異した遺伝子により発現された所望のペプチドを問題の特性についてスクリーニングする。次いで「候補」遺伝子を増幅し、そして次回のDNAシャフリング用にプールする。使用するスクリーニング手順は、「進化」したペプチドおよび問題の特性に高度に依存する。中でもとりわけペプチド安定性、生物学的活性、抗原性のような特性は、当該技術分野で周知な手順を使用して選択することができる。本発明の方法に有用な好適ペプチドの生物学的活性に関する個々のアッセイは、本明細書のいたるところに記載する。
d.技術の組み合わせ
当業者には突然変異および選択の上記技術は、本発明の方法に有用な最高に可能なペプチド分子を生成するために、互いに、そしてさらなる手順と組み合わせることができると考えるだろう。すなわち本発明はペプチドの生成に関して任意の1つの方法に限定されることはなく、そして本明細書に記載するありとあらゆる方法論を包含すると解釈すべきである。例えば点突然変異を核酸配列に導入する手順を最初に行い、続いて循環的DNAシャフリング、選択および増幅を行うことができる。初期の点突然変異の導入を使用して、それを欠く遺伝子群に多様性を導入し、次回のDNAのシャフリングおよびスクリーニングにより有利な点突然変異を選択し、そして組み合わせることができる。
III.グリコシダーゼおよびグリコトランスフェラーゼ
A.グリコシダーゼ
グリコシダーゼは受容体分子として水を使用し、そしてそのままで典型的なグリコシド−加水分解酵素であるグリコシルトランスフェラーゼである。グリコシダーゼは、反応混合物の熱力学または動力学を制御することによりインビトロでグリコシド結合を形成するために使用することができる。変更された反応条件でも、グリコシダーゼ反応はうまく作用することが難しく、そしてグリコシダーゼは可逆的なトランスグリコシラーゼ反応および競合する加水分解反応の結果、低い合成収量を与える傾向がある。
グリコシダーゼは加水分解中に破壊される結合で立体化学を維持することにより、あるいは加水分解中に破壊される結合で立体化学を逆転することにより機能することができ、それぞれ「維持(retaining)」グリコシダーゼまたは「逆転(inverting)」グリコシダーゼのいずれかに分類される。維持グリコシダーゼは活性部位に存在する2つの重要なカルボン酸部分を有し、1つのカルボキシレートは酸/塩基触媒として作用し、そしてもう1つは求核性として作用するが、逆転グリコシダーゼは1つのカルボン酸が酸として、そしてもう1つが塩基として作用する。
任意のグリコシダーゼの活性および結合特性を決定する方法は当該技術分野では周知であり、それらには簡略化HPLCプロトコール(Jacob and Scudder,1994,Methods in Enzymol.230:280−300)を含む。
グリコシダーゼおよびグリコシダーゼ処理の一般的考察は、糖生物学、実践的取り組み(Glycobiology,A Practical Approach)、(1993,Fukuda and Kobata編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク)に見いだせる。
本発明に有用なグリコシダーゼには限定するわけではないが、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、エンドグリカナーゼ、マンノシダーゼ(すなわちαおよびβ、ManI、ManIIおよびManIII)、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、アグロバクテリウム種(Agrobacterium sp.)のβ−グリコシダーゼ、セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)のマンノシダーゼ2A、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)のグリコシダーゼ、スルホロブス ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)のグリコシダーゼおよびバチルス リケニホルミス(Bacillus licheniformis)のグリコシダーゼを含む。
本発明で使用するフコシダーゼの選択はフコースの他の分子に対する結合に依存する。
本発明の方法に有用な多くのα−フコシダーゼの特異性は当該技術分野では周知であり、そしてまた多種のフコシダーゼが市販されている(とりわけグリコ(Glyko)、ノバト、カリフォルニア州;プロザイム(PROzyme)、サンレアンドロ、カリフォルニア州;カルビオケム−ノババイオケム(Calbiochem−Novabiochem)社、サンディエゴ、カリフォルニア州)。興味深いα−フコシダーゼには限定するわけではないが、タルボ コルナタス(Turbo cornutus)、カロニア ランパス(Charonia lampas)、バチルス フルミナンス(Bacillus fulminans)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、クロストリジウム パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、ウシ腎臓(グリコ)、ニワトリ肝臓(Tyagarajan et al.,1996,Glycobiology 6:83−93)に由来するα−フコシダーゼ、およびザントモナス マニホティス(Xanthomonas manihotis)(グリコ、プロザイム)由来のα−フコシダーゼIIを含む。ニワトリ肝臓のフコシダーゼはN−結合グリカンからコアフコースの除去に特に有用である。
B.グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは活性化糖(供与体NDP−糖)のタンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質への、あるいは成長しているオリゴ糖の非還元末端への付加を段階的様式で触媒する。N−結合糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質−結合オリゴ糖供与体Dol−PP−NAGGlcManをenブロック転移で、続いてコアの改作を介して合成される。この場合、「コア」サッカリドの性質は後の結合とは幾分異なる。大変多数のグリコシルトランスフェラーゼが当該技術分野で知られている。
本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、それが糖供与体として修飾された糖を利用できる限り任意のものでよい。そのような酵素の例はガラクトシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼ等のようなルロアール経路のグリコシルトランスフェラーゼを含む。
グリコシルトランスフェラーゼ反応に関与する酵素的サッカリド合成については、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化することができ、あるいは任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼ、およびそれらのポリヌクレオチド配列も知られている。例えばTaniguchi et al.,2002,グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック(Handbook of glycosyltransferases and related genes)、スプリンガー、東京、を参照にされたい。
グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列を推定することができるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列も、GenBank、Swiss−Prot、EMBLおよびその他を含む様々な公開されているデーターベースに見いだすことができる。
本発明の方法で採用できるグリコシルトランスフェラーゼには、限定するわけではないがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼおよびオリゴ糖トランスフェラーゼを含む。適当なグリコシルトランスフェラーゼには真核生物ならびに原核生物から得られるものを含む。
グリコシルトランスフェラーゼをコードするDNAは化学合成により、適切な細胞または細胞系カルチャーに由来するmRNAの逆転写物をスクリーニングすることにより、適切な細胞に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、あるいはこれらの手法の組み合わせにより得ることができる。mRNAまたはゲノムDNAのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列から生成したオリゴヌクレオチドプローブを使用して行うことができる。プローブは限定するわけではないが蛍光基、放射性原子または化学発光基のような検出可能な標識で既知の手順に従い標識し、そして通例のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。あるいはグリコシルトランスフェラーゼの核酸配列から生成されるPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)手法を使用して得ることができる。Mullis et al.に対する米国特許第4,683,195号明細書およびMullisに対する米国特許第4,683,202号明細書を参照にされたい。
グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNAを含むベクターで形質転換した宿主細胞で合成することができる。ベクターは複製可能なDNA構築物である。ベクターはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNAを増幅し、かつ/またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNAを発現させるいずれかのために使用する。発現ベクターは複製可能なDNA構築物であり、ここでグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNA配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を行うことができる適切な制御配列に操作可能に連結されている。そのような制御配列の必要性は選択した宿主および選択した形質転換法に依存して変動する。一般に制御配列には転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。
必要なすべてのものは、通常は複製起点により付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための遺伝子の選択である。
1.フコシルトランスフェラーゼ
幾つかの態様では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは当業者に知られている。フコシルトランスフェラーゼの例には、L−フコースをGDP−フコースから受容体の糖のヒドロキシ部位へ転移する酵素を含む。非−ヌクレオチド糖から受容体へ転移するフコシルトランスフェラーゼも本発明で使用される。
幾つかの態様では、受容体の糖が例えばオリゴ糖のグリコシド中のGalβ(1→3,4)GlcNAcβ−基のGlcNAcである。この反応に適当なフコシルトランスフェラーゼには、最初にヒトの乳から特性決定されたGalβ(1→3,4)GlcNAcβ1−α(1→3,4)フコシルトランスフェラーゼ(FTIII E.C.No.2.4.1.65)、(Palcic et al.,Carbohydrate Res.190:1−11(1989);Prieels,et al.,J.Biol.Chem.256:10456−10463(1981);およびNunez,et al.,Can.J.Chem.59:2086−2095(1981)を参照にされたい)、およびヒトの血清で見いだされたGalβ(1→4)GlcNAcβ−αフコシルトランスフェラーゼ(FTIV、FTV、FTVI)を含む。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)、シアリルα(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβフコシルトランスフェラーゼも特性決定された。Galβ(1→3,4)GlcNAcβ−α(1→3,4)フコシルトランスフェラーゼの組換え形も特性決定された(Dumas,et al.,Bioorg.Med.Letters 1:425−428(1991)およびKukowska−Latallo,et al.,Genes and Development 4:1288−1303(1990)を参照にされたい)。他のフコシルトランスフェラーゼの例には例えば、α1,2フコシルトランスフェラーゼ(E.C.No.2.4.1.69)を含む。酵素的フコシル化はMollicone et al.,Eur.J.Biochem.191:169−176(1990)または米国特許第5,374,655号明細書に記載されている方法により行うことができる。
2.ガラクトシルトランスフェラーゼ
別の態様群では、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼの例にはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(E.C.No.2.4.1.151、Dabkowski et al.,Transplant Proc.25:2921(1993)およびYamamoto et al.,Nature345:229−233(1990)を参照にされたい)、ウシ(GenBank j04989、Joziasse et al.,J.Biol.Chem.264:14290−14297(1989))、マウス(GenBank m26925;Larsen et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86:8227−8231(1989)、ブタ(GenBank L36152;Strahan et al.,Immunogenetics 41:101−105(1995)を含む。別の適当なα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液のB抗原群の合成に関与するものである(E.C.2.4.1.37、Yamamoto et al.,J.Biol.Chem.265:1146−1151(1990)(ヒト))。
また本発明の方法での使用に適するのはβ(1,4)ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには例えばEC2.4.1.90(LacNAcシンテターゼ)およびEC2.4.1.22(ラクトースシンテターゼ)、ウシ(D’Agostaro et al.,Eur,J.Biochem.183:211−217(1989))、ヒト(Masri et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.157:657−663(1988))、マウス(Nakazawa et al.,J.Biochem.104:165−168(1988))、ならびにEC.2.4.1.38およびセラミド ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC2.4.1.45、Stahl et al.,J.Neurosci.Res.38:234−242(1994))を含む。他の適当なガラクトシルトランスフェラーゼには例えば、α1,2ガラクトシルトランスフェラーゼ(例えばシゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)に由来、Chapell et al.,Mol.Biol.Cell 5:519−528(1994)を参照にされたい)を含む。さらに適当なグリコシルトランスフェラーゼについては、Taniguchi et al.(2002、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、プリンガー、東京)、Guo et al.(2001,Glycobiology,11(10):813−820)およびBreton et al.(1998,J.Biochem.123:1000−1009)を参照にされたい。
遺伝子操作によりクローン化した遺伝子に由来する酵素GalNAc TI−XIVのようなタンパク質の生産も周知である。例えば米国特許第4,761,371号明細書を参照にされたい。1つの方法は十分なサンプルの収集、次いで酵素のアミノ酸配列をN−末端シークエンシングにより決定することを含む。次いでこの情報を使用して完全長の(膜に結合した)トランスフェラーゼをコードするcDNAクローンを単離し、これは昆虫細胞系Sf9中で発現して完全に活性な酵素の合成をもたらす。次いで酵素の受容体特異性を、16種のタンパク質における既知のグリコシル化部位の周辺のアミノ酸の半定量的分析、続いて合成ペプチドのインビトロのグリコシル化の実験により決定する。この作業では特定のアミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメント中で過剰に提示され(overrpresented)、そしてグリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基周辺の特異的位置の残基が、受容体効率に他のアミノ酸部分よりも顕著な効果を有し得ることが示された。
3.シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物に有用な別の種類のグリコシルトランスフェラーゼである。本発明の使用に適するシアリルトランスフェラーゼの例には、ST3GalIII(例えばラットまたはヒトST3GalIII)、ST3GalIV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalII、ST6GalNAcI、ST6GalNAcIIおよびST6GalNAcIIIを含む(本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Tsuji et al.,Glycobiology,6:v−xiv(1996)に記載されている)。
α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)と呼ぶα(2,3)シアリルトランスフェラーゼの例は、シアル酸をGalβ1→3Glc二糖またはグリコシドの非還元末端のGalへ転移する。Van den Eijnden et al.,J.Biol.Chem.256:3159(1981)、Weinstein et al.,J.Biol.Chem.257:13845(1982)およびWen et al.,J.Biol.Chem.267:21011(1992)を参照にされたい。別の例のα2,3シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.4)は、シアル酸を二糖またはグリコシドの非還元末端のGalへ転移する。Rearick et al.,J.Biol.Chem.254:4444(1979)およびGillespie et al.,J.Biol.Chem.267:21004(1992)を参照にされたい。さらなる酵素の例にはGal−β−1,4−GlcNAcα−2,6−シアリルトランスフェラーゼを含む(Kurosawa et al.Eur.J.Biochem.219:375−381(1994)を参照にされたい)。
好ましくは糖ペプチドの炭水化物のグリコシル化について、シアリルトランスフェラーゼは完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の下にある最も多くの終わりから2番目の配列である配列Galβ1,4GlcNAc−、Galβ1,3GlcNAc−またはGalβ1,3GalNAc−にシアル酸を転移させることができる(表7を参照にされたい)。2,8−シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を本発明の方法に有用なα2,3Galβ1,4GlcNAcに転移させることができる。
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特許請求する方法に有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ST3GalIIIであり、これはα(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)とも呼ばれる。この酵素はシアル酸をGalβ1,3GlcNAcまたはGalβ1,4GlcNAcグリコシドのGalへ転移させることを触媒し(例えばWen et al.,J.Biol.Chem.267:21011(1992);Van den Eijnden et al.,J.Biol.Chem.256:3159(1991)を参照にされたい)、そして糖ペプチド中のアスパラギン−結合オリゴ糖のシアリル化の原因である。シアル酸はGalと結合して2つのサッカリド間にα−結合を形成する。サッカリド間の結合(連結)は、NeuAcの2−位とGalの3−位との間である。この特別な酵素はラットの肝臓(Weinstein et al.,J.Biol.Chem.257:13845(1982));ヒトcDNA(Sasaki et al.(1993)J.Biol.Chem.268:22782−22787;Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.269:1394−1401)、およびゲノム(Kitagawa et al.(1996)J.Biol.Chem.271:931−938)から単離することができる。DNA配列も既知であり、組換え発現によるこの酵素の生産を促進する。好適な態様では、特許請求するシアリル化法はラットのST3GalIIIを使用する。
本発明に使用する他のシアリルトランスフェラーゼの例には、α(2,3)を含むカンピロバクター ジェジュニ(Camphylobacter jejuni)から単離されるものを含む。例えば国際公開第99/49051号パンフレットを参照にされたい。
表7に掲げるものも含む他のシアリルトランスフェラーゼも、工業的に重要な糖ペプチドの経済的かつ効率的な大規模シアリル化法に有用である。このような他の酵素の有用性を見いだすための単純な試験として、様々な量の酵素(1〜100mU/mgタンパク質)をアシアロ−αAGP(1〜10mg/mlで)と反応させて、糖ペプチドをシアリル化する問題のシアリルトランスフェラーゼの能力を、ウシのST6Gal、ST3GalIIIまたは両シアリルトランスフェラーゼのいずれかと比較する。あるいは他の糖ペプチドまたは糖ペプチド、またはペプチド骨格から酵素的に放出されるN−結合オリゴ糖を、この評価のためにアシアロ−αAGPの代わりに使用することができる。ST6GalIよりも効率的に糖ペプチドのN−結合オリゴ糖をシアリル化する能力を持つシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドをシアリル化するための現実的な大規模法に有用である(本開示においてST3GalIIIについて具体的に説明するように)。
4.他のグリコシルトランスフェラーゼ
当業者は他のグリコシルトランスフェラーゼを、シアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載したように同様なトランスフェラーゼサイクルで置き換え得ることができると理解するだろう。特にグリコシルトランスフェラーゼは例えばグルコシルトランスフェラーゼ、例えばAlg8(Stagljov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5977(1994))またはAlg5(Heesen et al.,Eur.J.Biochem.224:71(1994))であることもできる。
N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼも本発明の実施に使用する。適当なN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼには限定するわけではないが、α(1,3)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Nagata et al.,J.Biol.Chem.267:12082−12089(1992)およびSmith et al.,J.Biol.Chem.269:15162(1994))およびペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Homa et al.,J.Biol.Chem.268:12609(1993))を含む。適当なN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼにはGnTI(2.4.1.101、Hull et al.,BBRC176:608(1991))、GnTII、GnTIII(Ihara et al.,J.BioChem.113:692(1993))、GnTIV、GnTV(Shoreibah et al.,J.Biol.Chem.268:15381(1993))およびGnTVI、O−結合N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(Bierhuizen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9326(1992))、N−アセチルグルコサミン−1−ホスフェートトランスフェラーゼ(Rajput et al.,Biochem J.285:985(1992))およびヒアルロナン シンターゼを含む。
マンノシルトランスフェラーゼは、修飾されたマンノース部分を転移するために使用する。適当なマンノシルトランスフェラーゼにはα(1,2)マンノシルトランスフェラーゼ、α(1,3)マンノシルトランスフェラーゼ、α(1,6)マンノシルトランスフェラーゼ、β(1,4)マンノシルトランスフェラーゼ、Dol−P−Manシンターゼ、OCh1およびPmt1を含む(Kornfelds et al.,Annu.Rev.Biochem.54:631−664(1985)を参照にされたい)。
キシロシルトランスフェラーゼも本発明に有用である。例えばRodgers,et al.,Biochem J.288:817−822(1992);およびElbain,et al.、米国特許第6,168,937号明細書を参照にされたい。
他の適当なグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ichikawa et al.,JACS114:9283(1992)、Wong et al.,J.Org.Chem.57:4343(1992)およびIchikawa et al.、炭水化物および炭水化物ポリマー(CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS)、Yaltami編集(ATL出版、1993)に記載されている。
原核生物のグリコシルトランスフェラーゼも本発明の実施に有用である。そのようなグリコシルトランスフェラーゼには多くのグラム陰性細菌により生産されるリポオリゴ糖(LOS)の合成に関与する酵素を含む。LOSは典型的には、ヒト上皮細胞の表面または宿主の分泌に見いだされる複合糖質を模する末端グリカン配列を有する(Preston et al.、Critical Reviews in Microbiology23(3):139−180(1996))。そのような酵素には限定するわけではないが、β1,6ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼを含む大腸菌(E.coli)およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)のような種のrfaオペロンのタンパク質(例えばEMBL寄託番号M80599およびM86935(大腸菌(E.coli));EMBL寄託番号S56361(ネズミチフス菌(S.typhimurium)を参照にされたい)、グルコシルトランスフェラーゼ(スイス−プロット寄託番号P25740(大腸菌(E.coli))、β1,2−グルコシルトランスフェラーゼ(rfaJ)(スイス−プロット寄託番号P27129(大腸菌(E.coli))およびスイス−プロット寄託番号P19817(ネズミチフス菌(S.typhimurium))、およびβ1,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(rfaK)(EMBL寄託番号U00039(大腸菌(E.coli))を含む。アミノ酸配列が既知の他のグリコシルトランスフェラーゼには、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸菌(E.coli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、サルモネラ エンテリカ(Salmonella enterica)、腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)、マイコバクテリウム レプロサム(Mycobacterium leprosum)のような微生物で特徴付けられたrfaBのようなオペロン、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のrh1オペロンにコードされるものを含む。
また本発明での使用に適するのは、ラクト−N−ネオテトラオース、D−ガラクトシル−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミニル−β−1,3−D−ガラクトシル−β−1,4−D−グルコース、およびP血液型の三糖配列、D−ガラクトシル−α−1,4−D−ガラクトシル−β−1,4−D−グルコースを含む構造の生産に関与するグリコシルトランスフェラーゼであり、これらは粘膜病原菌である淋菌(Neisseria gonorrhoeae)および髄膜炎菌(N.meningitidis)のLOSで同定された(Scholten et al.,J.Med.Microbiol.41:236−243(1994))。グリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌(N.meningitidis)および淋菌(N.gonorrhoeae)由来の遺伝子は、髄膜炎菌(N.meningitidis)のイムノタイプL3およびL1(Jennings et al.,Mol.Microbiol.18:729−740(1995))、および淋菌(N.gonorrhoeae)突然変異体のF62(Gotshlich,J.Exp.Med.180:2181−2190(1994))から同定されたこれらの構造の生合成に関与した。髄膜炎菌(N.meningitidis)では、3つの遺伝子、lgtAlgtBおよびlgEからなる位置がラクト−N−ネオテトラオース鎖に最後の3つの糖を付加するために必要であるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする(Wakarchuk et al.,J.Biol.Chem.271:19166−73(1996))。最近、lgtBおよびlgtA遺伝子産物の酵素活性が証明され、それらの提案されたグリコシルトランスフェラーゼ機能について直接的な証拠が提供された(Wakarchuk et al.,J.Biol.Chem.271(45):28271−276(1996))。淋菌(N.gonorrhoeae)では2つのさらなる遺伝子、β−D−GalNAcをラクト−N−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの3位に加えるlgtD、および短縮化LOSのラクトース要素に末端α−Galを加えるlgtCがあり、これによりP血液型抗原構造を作成する(Gotshlich(1994)、同上)。髄膜炎菌(N.meningitidis)では、別のイムノタイプL1もP血液型抗原を発現し、そしてlgtC遺伝子を持つことが示された(Jennings et al.,(1995)、同上)。ナイセリア(Neisseria)のグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子も、米国特許第5,545,553号明細書(Gotschlich)に記載されている。ヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)に由来するα1,2−フコシルトランスフェラーゼおよびα1,3−フコシルトランスフェラーゼに関する遺伝子も特性決定された(Martin et al.,J.Biol.Chem.272:21349−21356(1997))。また本発明で使用するのはカンピロバクター ジェジュニ(Camphylobacter jejuni)のグリコシルトランスフェラーゼである(Taniguchi et al.,2002、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、スプリンガー、東京を参照にされたい)。
B.スルホトランスフェラーゼ
本発明は、例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラゲニン(carragenen)のような硫黄化多糖および関連化合物を含む硫黄化した分子を含むペプチドの生産法を提供する。適当なスルホトランスフェラーゼには例えば、コンドロイチン−6−スルホトランスフェラーゼ(Fukuta et al.,J.Biol.Chem.270:18575−18580(1995)により記載されたニワトリcDNA;GenBank寄託番号D49915)、グルコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ1(Dixon et al.,Genomics 26:239−241(1995);UL18918)、およびグルコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ2(Orellana et al.,J.Biol.Chem.269:2270−2276(1994)およびEriksson et al.,J.Biol.Chem.269:10438−10443(1994)に記載されたマウスcDNA;GenBank寄託番号U2304に記載されたヒトcDNA)を含む。
C.細胞−結合グリコシルトランスフェラーゼ
別の態様では、本発明の方法で採用する酵素は細胞−結合グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られているが(例えば米国特許第5,032,519号明細書を参照にされたい)、グリコシルトランスフェラーゼは細胞に付随する時は一般に膜に結合している状態である。これまでに研究された多くの膜に結合酵素は内在性のタンパク質であると考えられ;すなわちそれらは超音波により膜から放出されず、そして可溶化に界面活性剤を要する。表面のグリコシルトランスフェラーゼは脊椎動物および無脊椎動物の細胞上の表面で同定され、そしてこれら表面のトランスフェラーゼが生理学的条件下で触媒活性を維持していることも認識された。しかし細胞表面のグリコシルトランスフェラーゼのより認識されている機能は細胞間の認識である(Roth,1990,超細胞現象に対する分子的取り組み(Molecular Approaches to Supracellular Phenomena)。
細胞により発現されるグリコシルトランスフェラーゼを改変させるための方法が開発された。例えばLarsen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8227−8231(1989)は、細胞表面のオリゴ糖構造およびそれらのコグネイトグルコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化cDNA配列を単離する遺伝的取り組みを報告する。UDP−ガラクトース;β−D−ガラクトシル−1,4−N−アセチル−D−グルコサミニドα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼをを発現することが知られているマウスの細胞系から単離したmRNAから作成したcDNAライブラリーをCOS−1細胞にトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした細胞を培養し、そしてα1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。
Francisco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2713−2717(1992)は、β−ラクタマーゼを大腸菌(Escherichia coli)の外面に足掛けする(anchoring)方法を開示する。(i)外膜タンパク質のシグナル配列、(ii)外膜タンパク質の膜−拡張区分(spanning section)、および(iii)完全な成熟β−ラクタマーゼ配列からなる三者(tripartite)融合が生産され、活性な表面結合β−ラクタマーゼ分子を生じる。しかしFranciscoの方法は原核細胞系にのみ限定され、著者により認識されているように、正しく機能するには完全な三者融合を必要とする。
D.融合酵素
別の例示態様では、本発明の方法は所望の糖ペプチド結合物の合成に関与する1より多くの酵素活性を有する融合ペプチドを利用する。融合ペプチドは例えば、アクセサリー酵素の触媒的に活性なドメインに連結されたグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインからなることができる。アクセサリー酵素の触媒ドメインは、例えばグリコシルトランスフェラーゼの供与体であるヌクレオチド糖の形成における工程を触媒するか、あるいはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒することができる。例えばグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドはフレイム内で、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに結合され得る。生成した融合ペプチドは次いでヌクレオチド糖合成を触媒するだけでなく、アクセプター分子への糖部分の転移も触媒する。融合ペプチドは1つの発現可能なヌクレオチド配列に連結された2以上のサイクル酵素であることができる。別の態様では融合ペプチドは2以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインを含む。例えば米国特許5,641,668第号明細書を参照にされたい。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適切な融合ペプチドを利用して容易に設計し、そして製造することができる(例えば国際公開第99/31224号パンフレットとして1999年6月24日に公開されたPCT特許出願PCT/CA98/01180を参照にされたい)。
E.固定化酵素
細胞に結合した酵素に加えて、本発明は固体および/または可溶性支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示態様では、本発明の方法に従い完全なグリコシルリンカーを介してPEGに結合されたグリコシルトランスフェラーゼを提供する。PEG−リンカー−酵素結合物は、場合により固体支持体に結合される。本発明の方法において固体に支持された酵素の使用は、反応混合物の処理および反応生成物の精製を簡単にし、そしてまた酵素の容易な回収を可能とする。このグリコシルトランスフェラーゼ結合物は本発明の方法に利用する。他の酵素および支持体の組み合わせも当業者には明らかであろう。
F.グリコシルトランスフェラーゼの突然変異誘発法
本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよび任意の他の酵素の新規形態は、これまでに記載した任意の方法ならびに当該技術分野で周知の他の方法を使用して作成することができる。特に興味深いのは、改変された受容体特異性および/または供与体特異性を持つトランスフェラーゼである。また興味深いのは、中でもより高い転換速度およびより高い安定性を持つ酵素である。
合理的な設計の突然変異誘発技術は、ペプチドの配列が知られている時に使用することができる。本発明で使用するトランスフェラーゼおよびグルコシダーゼ配列ならびに3次構造の多くは知られているので、これらの酵素は突然変異の合理的な設計に理想的である。例えば酵素の触媒部位を突然変異させて酵素の供与体および/または受容体特異性を改変することができる。
グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼヒドロラーゼに関する膨大な3次構造に関するデータにより、これらの酵素はドメイン交換が関与する突然変異にも理想的なものとなる。グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼヒドロラーゼはモジュラー酵素(modular enzyme)である(Bourne and Henrissat,2001,Current Opinion in Structural Biology 11:593−600)。グリコシルトランスフェラーゼはそれらの構造に基づき2つのファミリーに分類される:GT−AおよびGT−B。GT−Aファミリーのグリコシルトランスフェラーゼは2つの似ていないドメインを含んでなり、1つはヌクレオチド結合に関与し、そしてもう1つは受容体結合に関与する。このように1つの遺伝子に由来するドメインをコードするDNA配列を、第2の遺伝子に由来するドメインとフレイム内で都合よく融合して、新たな受容体/供与体特異性を持つタンパク質をコードする新たな遺伝子を作成することができる。そのようなドメインの交換にはさらに炭水化物モジュールおよび他のアクセサリードメインを含むことができる。
上記のようなランダム変異導入および/または方向性のある進化の技術は、本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼの新規な形態を作成するためにも使用することができる。
IV.インビトロおよびインビボの発現系
A.糖ペプチドを生産するための細胞
グリコシルトランスフェラーゼの作用はペプチドのグリコシル化に重要であり、すなわち所定の細胞型での1組のグリコシルトランスフェラーゼの発現における差異は、その細胞で生産される所定のペプチドのグリコシル化パターンに影響を及ぼす。宿主細胞に依存的なペプチドのグリコシル化の総説に関しては、Kabata and Takasaki、「細胞表面の炭水化物の構造および生合成(Structure and Biosynthesis of Cell Surface Carbohydrates)」、細胞表面の炭水化物および細胞生育(Cell Surface Carbohydrates and Cell Development)で、1991、第1〜24頁、編集.Minoru Fukuda、CRC出版、ボカ ラトン、フロリダ州を参照にされたい。
本開示に従いペプチドが生産される細胞の型は、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために必要な改造の程度に対してのみ関係がある。例えば所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために、インビトロで必要な酵素的消化反応の回数および順序および酵素的合成反応の回数および順序は、特定の細胞型により生産されるペプチド上のグリカンの構造に依存して変動する。本発明は本明細書に開示する任意の細胞型を含む任意の1つの特定の細胞型に由来するペプチドの生産に限定されるとは全く解釈されるべきではなく、本発明の威力およびペプチドが生成される細胞系の独立性を確立する幾つかの細胞系の検討をこれから提示する。
一般に、そしてペプチドをコードする核酸からペプチドを発現させるために、核酸はプロモーター要素、ターミネーター要素およびこの2つの間に操作可能に連結されたペプチドのコード配列を含んでなる発現カセットに包含されなければならない。次いで発現カセットをベクターに操作可能に連結する。この末端に向けてアダプターまたはリンカーを使用してヌクレオチドフラグメントを連結することができ、あるいは便利な制限部位、余分なヌクレオチドの除去、制限部位の除去等を提供するために他の操作が関与してもよい。
このために、インビトロの突然変異誘発法、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジッションおよびトランスバージョンを含むことができる。シャトルベクターは細胞中で複製に必要な遺伝子要素を有する。ベクターの中には原核細胞中でのみ複製できるもの、あるいは原核および真核細胞の両方で複製できるものがある。そのようなプラスミド発現ベクターは1以上の複製系、好ましくは発現の目的で酵母宿主細胞内で、そしてクローニングの目的で原核宿主内で安定に維持されることができる2つの複製系で維持される。今では多様な特性を持つ多くのベクターが市販されている。ベクターは通常、プラスミドまたはファージであるが、コスミドまたはミニ−染色体でもよい。都合が良いことに、多くの市販されているベクターはすでに存在する発現カセットにプロモーターおよびターミネーター、および問題のペプチド用のコード配列を挿入できるマルチ−リンカー部位を有する。次いで発現カセットを含むシャトルベクターは大腸菌(E.coli)中で形質転換され、ここでベクターは細胞分裂中に複製して選択した発現系の宿主細胞を形質転換するのに十分なベクターの調製物を生成する。上記の方法は当業者には周知であり、そして行なわれるプロトコールはSambrook et al.(2001,モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)に見いだすことができる。
ベクターはいったん増幅された細胞から精製されれば、次に発現系の細胞に形質転換される。形質転換のプルトコールは細胞の種類およびベクターの性質に依存する。形質転換体を適当な栄養培地中で成長させ、そして適当な場合には内因性DNAの維持を選択圧下で維持する。発現が誘導性である場合、成長により酵母宿主が高密度の細胞を生じることができるようになり、次いで発現が誘導される。分泌した成熟したヘテロロガスなペプチドは通常の手段により回収することができ、そしてクロマトグラフィー、電気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出等により精製され得る。
分子クローニングの技術は当該技術分野では周知である。さらに分子クローニングの手順に関する技術は、Sambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州);Glover et al.,(1985、DNAクローニング:実践的取り組み(DNA Cloning:A Practical Approach)、第IおよびII巻);Gait et al.,(1985、オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis));Hames and Higgins(1985、核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization));Hames and Higgins(1984、転写および翻訳(Transcription and Translation));Freshney et al.,(1986、動物細胞培養(Animal Cell Culture));Perbel、(1986、固定化細胞および酵素(Immobilized Cells And Enzymes)、IRL出版);Perbel、(1984、分子クローニングに関する実践的指針(A Practical Guide To Molecular Cloning));Ausubel et al.(2002、分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン ウィリー&サンズ社)に見いだすことができる。
B.真菌および酵母
酵母で生産されたペプチドはグリコシル化されており、そしてそこに存在するグリカン構造は主に高マンノース構造である。N−グリカンの場合では、酵母で生産されたグリカン構造は、9以上ものマンノース残基を含むことができ、この残基はそれに結合したさらなる糖を含んでも、含まなくてもよい。酵母細胞により生産されるペプチド上のこの型のグリカンの例を、図5の左側に示す。マンノース残基の番号およびそれに結合したさらなる糖の型および複雑さに関係なく、酵母細胞で生産されたペプチドの成分としてN−グリカンは、図5に示すトリマンノシルコア構造を含んでなる。酵母細胞で生産されたペプチド上のグリカン構造が高マンノース構造である時、当業者が利用可能なマンノシダーゼ酵素を使用してグリカンのトリマンノシルコアを含んでなる残基を除き、分子からすべてのマンノース残基をインビトロで除去することは単純なことであり、これにより結合した基本的なトリマンノシルコア構造を有するペプチドを生成する。ここで今、当該技術分野で利用可能な技術を使用し、そして本開示から着手すれば、インビトロで酵素的にさらなる糖部分を基本的なトリマンノシルコア構造に加え、所望のグリカン構造をトリマンノシルコアに結合して有するペプチドを生成することは簡単である。同様に酵母細胞により生産されたペプチドが、結合した他の複雑な糖に加えて高マンノース構造を含んでなる時、余分なマンノース残基を含めさらなる糖のすべてを酵素的に開裂して基本的なトリマンノシルコア構造に到達することは簡単な事柄である。いったん基本的なトリマンノシルコアが生成されれば、所望のグリコシル化を有するペプチドの生成は本明細書に提供する指針に従い可能となる。
「酵母」は無胞子酵母(Endomycetales)、担子胞子酵母(basidiosporogenous)、および不完全菌類(Blastomycetes)に属する酵母を意図している。無胞子酵母は2つのファミリー、スペルモフィトラ科(Spermophthoraceae)およびサッカロミセス科(Saccharomycetaceae)に分類される。後者は4つのサブファミリー、シゾサッカロミセス科(Schizosaccharomycoideae)(例えばシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属)、ナドゾニア科(Nadsonioideae)、リポミセス科(Lipomycoideae)およびサッカロミセス科(Saccharomycoideae)(例えばピヒア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、およびサッカロミセス(Saccharomyces)属)からなる。担子胞子酵母にはロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、スポリディオボルス(Sporidiobolus)、フィロバシジウム(Filobasidium)およびフィロバシジーラ(Filobasidiella)属を含む。不完全菌類に属する酵母は2つのファミリー、スポロボロミセス科(Sporobolomycetaceae)(例えば、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、ブレラ(Bullera)属)およびクリプトコッカス科(Cryptococcaceae)(例えばカンジダ(Candida)属)に分類される。本発明で特に興味深いのは、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピヒア(Pichia)、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、特にK.ラクティス(lactis)およびK.ドロソフィラム(drosophilum)、カンジダ(Candida)、ハンセニューラ(Hansenula)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)およびクリソポリウム(Chrysoporium)属内の種である。酵母の分類は将来、変わるかもしれないので、本発明の目的のための酵母は、Skinner et al.編集、1980)、酵母の生物学および活性(Bilogy and Activities of Yeast)(Soc.App.Bacteriol.Symp.Series No.9)に記載されてように定義されるものである。
先の記述に加えて、当業者は恐らく酵母の生物学および酵母遺伝子の操作に関して精通している。例えばBacila et al.編集(1978、酵母の生化学および遺伝学(Biochemistry and Genetics of Yeast)、アカデミック出版、ニューヨーク);およびRose and Harrison.(1987、酵母(The Yeasts)(第2版)、アカデミック出版、ロンドン)を参照にされたい。外因性のDNAを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野で周知である。酵母の形質転換のためには広範な種々の方法がある。スフェロプラスト形質転換はHinnen et al(1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1919−1933);Beggs,(1978,Nature275(5676):104−109);およびStinchcomb et al.,(欧州特許出願公開第45,573号明細書;引用により本明細書に編入する)により教示され、電気穿孔はBecker and Gaurante,(1991,Methods Enzymol.194:182−187)により教示され、酢酸リチウムはGietz et al.(2002,Methods Enzymol.350:87−96)およびMount et al.(1996,Methods Mol Biol.53:139−145)により教示されている。非サッカロミセス(Saccharomyces)酵母の形質転換系の総説に関しては、Wang et al.(Crit Rev Biotechnol.2001;21(3):177−218)を参照にされたい。酵母の遺伝子操作に関する一般的手順については、Barr et al.,(1989、酵母の遺伝子操作(Yeast genetic enginerring)、バターワース、ボストン)を参照にされたい。
野生型酵母および真菌細胞に加えて、外因性遺伝子の発現レベル、純度、生成したペプチドの翻訳後修飾プロセッシングおよび成熟ペプチドの回収および純度を強化するように突然変異および/または選択された酵母および真菌の株が存在する。外因性ペプチドの発現は、インスリンの発現により具体的に説明されるように細胞の分泌経路に向けることもできる(Kjeldsen,2000,Appl.Microbiol.Biotechnol.54:277−286、およびその中の参考文献を参照にされたい)。一般に酵母細胞から外因性ペプチドの分泌を引き起こすためには、キラートキシン(Stark and Boyd,1986、EMBO J.1995−2002)、またはアルファフェロモン(Kurjan and Herskowitz,1982,Cell 30:933;Brake et al.,1988,Yeast 4:S436)の遺伝子のもののような酵母遺伝子に由来する分泌シグナルを使用することができる。
一般に糸状菌に関して、遺伝子操作法はKinghorn and Turner(1992,糸状菌の応用分子遺伝学(Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi)、ブラッキー アカデミック アンド プロフェッショナル(Blackie Academic and Professional)、ニューヨーク)に見いだすことができる。適切なベクターに関するガイダンスは、Martinelli and Kinghorn(1994,アルペルギルス:50年(Aspergillus:50 years)、エルセビア、アムステルダム)に見いだすことができる。
1.サッカロミセス(Saccharomyces)
サッカロミセス(Saccharomyces)では、ペプチドを生産するために使用する適当な酵母ベクターにはYRp7(Struhl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:1035−1039,1978)、YEp13(Broach et al.,Gene 8:121−133,1979)、POTベクター(Kawasaki et al.,米国特許第4,931,373号明細書、これは引用により本明細書に編入する)、pJDB249およびpJDB219(Beggs,Nature 275:104−108,1978)およびそれらの誘導体を含む。酵母での使用に好適なプロモーターは、酵母の解糖遺伝子の発現に関するプロモーター(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:12073−12080,1980;Alber and Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1:419−434,1982;Kawasaki,米国特許第4,599,311号明細書)、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.、化学品のための微生物の遺伝子工学(Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals)、Hollaender et al.,(編集)、第355頁、プレナム出版、ニューヨーク、1982;Ammerer,Meth.Enzymol.101:192−201,1983)、およびADH2−4プロモーター(Russell et al.,Nature 304:652−654,1983;Irani and Kilgore,米国特許出願第07/784,653号明細書、カナダ国特許第1,304,020号明細書および欧州特許第284 044号明細書、これらは引用により本明細書に編入する)を含む。発現単位は転写ターミネーターも含むことができる。好適な転写ターミネーターはTPI1ターミネーター(Alber and Kawasaki,同上)である。
そのような酵母−細菌シャトルベクターの例には、Yep24(Botstein et al.(1979)Gene 8:17−24;pC1(Brake et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4642−4646)、およびYrp17(Stnichomb et al.(1982)J.Mol.Biol.158:157)を含む。さらにプラスミド発現ベクターは高または低コピー数プラスミドでよく、コピー数は一般に約1〜約200の範囲である。高コピー数酵母ベクターの場合、一般に1つの宿主中に少なくとも10、好ましくは少なくとも20、そして通常は約150コピーを越えない。選択したヘテロロガスなペプチドに依存して、高または低コピー数ベクターのいずれかが、ベクターおよび組換えペプチドが宿主に及ぼす効果に依存して望ましい。例えばBrake et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4642−4646を参照にされたい。本発明のDNA構築物はベクターに組み込むことにより酵母ゲノムに組み込んでもよい。そのようなベクターの例は当該技術分野で知られている。例えばBotstein et al.(1979)Gene 8:17−24を参照にされたい。
本発明を実施するために適当な酵母および他の微生物宿主に関する選択は、当該技術分野の技術内である。特に興味深いのは、サッカロミセス(Saccharomyces)のS.セルビシエ(cerevisiae)、S.カールスベルゲンシス(carlsbergensis)、S.ジアスタティカス(diastaticus)、S.ドウグラシー(douglasii)、S.クルイベリ(kluyveri)、S.ノルベンシス(norbensis)およびS.オビホルミス(oviformis)種である。所望のペプチドを発現させるために酵母宿主細胞を選択する時、適当な宿主細胞は、中でも良好な分泌能力、低いタンパク質分解活性、および全体的な成長力(vigor)を有することが示されたものを含むことができる。酵母および他の微生物は一般に様々な供給源から入手可能であり、それらにはカリフォルニア州、バークレーのカリフォルニア大学、生物物理学および医学物理学部(Department of Biophysics and Medical Physics)、酵母遺伝子ストックセンター(Yeast Genetic Stock Center);およびバージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションを含む。総説に関しては、Strathern et al.編集.(1981、酵母、サッカロミセスの分子生物学(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)をに参照にされたい。
外因性DNAを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野では周知である。
2.ピヒア
組換えペプチドの生産のための宿主としてピヒア メタノリカ(Pichia methanolica)の使用は、PCT出願、国際公開第97/17450号、同第97/17451号、同第98/02536号および同第98/02565号パンフレットに開示されている。P.メタノリカ(methanolica)の形質転換に使用するDNA分子は一般に、形質転換前に好ましくは直線化される二本鎖の環状プラスミドとして調製される。P.メタノリカ(methanolica)でのペプチド生産には、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、P.メタノリカ(methanolica)のアルコール利用遺伝子(AUG1またはAUG2)のようなP.メタノリカ(methanolica)遺伝子のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターにはジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のもの、ならびに米国特許第5,252,726号明細書に開示されているものを含む。DNAの宿主染色体への組み込みを容易にするために、宿主DNA配列により両末端を挟まれたプラスミドの全発現セグメントを有することが好ましい。
ピヒア メタノリカ(Pichia methanolica)での使用に好適な選択マーカーは、ホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC;EC4.1.1.21)をコードするP.メタノリカ(methanolica)ADE2遺伝子であり、これはade2宿主細胞がアデニンの不存在下で成長することを可能とする。メタノールの使用を最少にすることが望まれる大規模な工業的方法には、両方のメタノール利用遺伝子(AUG1およびAUG2)が削除されている宿主細胞が好ましい。分泌するペプチドの生産には、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4およびPRB1)を欠く宿主細胞が好適である。目的のペプチドをコードするDNAを含むプラスミドを、P.メタノリカ(methanolica)細胞に導入することを容易にするために、電気穿孔を使用する。指数的に減少する、2.5〜4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/cmの場の強さを有するパルス電場、および1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の時間定数(t)を使用して、電気穿孔によりP.メタノリカ(methanolica)細胞を形質転換することが好ましい。抗体フラグメントの大規模生産のためのピヒア パストリス(Pichia pastoris)の使用に関する総説は、Fischer et al.(1999,Biotechnol.Appl Biochem.30(Pt2):117−120)を参照にされたい。
3.アスペルギルス(Aspergillus)
アスペルギルス(Aspergillus)種でペプチドを発現させる方法は当該技術分野では周知であり、それらには限定するわけではないが引用により全部、本明細書に編入するCarrez et al.,1990,Gene 94:147−154;Contreras,1991,Bio/Technology 9:378−381;Yelton et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470−1474;Tilburn et al.,1983,Gene 26:205−221;Kelly and.Hynes,1985,EMBO J.4:475−479;Ballance et al.,1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.112:284−289;Buxton et al.,1985,Gene 37:207−214,and U.S.Pat.No.4,935,349に記載されているものを含む。アスペルギルス(Aspergillus)で有用なプロモーターの例は、米国特許第5,252,726号明細書に見いだされる。ペプチドの発現に有用なアスペルギルス(Aspergillus)の株は、米国特許第4,935,349号明細書に見いだされる。外因性ペプチドの工業的生産は、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)およびアスペルギルス オリーゼ(Aspergillus oryzae)についてノボエンザイム(Novoenzymes)から入手可能である。
4.トリコデルマ(Trichoderma
トリコデルマ(Trichoderma)は所望のペプチドを発現させるために、他の種の組換え宿主細胞に優るある一定の利点を有する。この微生物は大量に成長させることが容易であり、そしてグリコシル化する能力を有し、そして組換え哺乳動物ペプチドを培地に高い収量で効率よく分泌し、ペプチドの単離を比較的容易とする。さらに発現したペプチド上のグリコシル化パターンは、他の系で発現されるものよりもヒトペプチドに類似している。しかしこれらの細胞から発現したペプチド上のグリカン構造にも差異が存在する。例えば末端シアル酸残基は、グリカン構造の末端のこれらの部分の存在が哺乳動物の血流からペプチドの排除を遅らせるので、哺乳動物系におけるペプチドの治療的機能に対して重要である。シアリル化分子が生物学的半減期を上昇させる背後にあるメカニズムは、レクチンによるそれらの認識の低下にあると考えられる(Drickamer,1988,J.Biol.Chem.263:9557−9560)。しかし一般に真菌細胞は末端シアル酸残基をペプチド上のグリカンに加えず、故に真菌細胞で合成されたペプチドはシアル酸が除かれている。本発明に従い、この欠如は本明細書のいたるところに詳細に記載する本発明のインビトログリカン改造方法を使用して補修する(remedied)ことができる。
改造するペプチドの生産のために宿主として有用なトリコデルマ(Trichoderma)種には、QM6a、ALKO2442またはCBS383.78(セントラールビュロー、フォーア シンメルカルチャー(Centraalbureau voor Schimmelcultures)、オースターストラート 1、私書箱273、3740 バールン社(AG Baarn)、オランダ)、またはATCC13631(アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州、10852、米国、型)のようなT.レーゼイ(reesei);T.ビリデ(viride)(CBS189.79のような(det.W.Gams);CBS816.68のようなT.ロンギブラキアタム(longibrachiatum)(型);T.シュードコニンギー(pseudokoningii)(MUCL19358のような;Mycotheque de l’Universite Catholique de Louvain);T.サチュルニスポラム(saturnisporum)CBS330.70(型);T.ハルジアナム(harzianum) CBS316.31(det.W.Gams);T.ビルガタム(virgatum)(T.シュードコニンギー(pseudokoningii))ATCC24961を含む。最も好ましくは宿主はT.レーゼイ(reesei)であり、そしてより好ましくはこれはT.レーゼイ(reesei)のQM9414(ATCC26921)、RUT−C−30(ATCC56765)およびQM9414に由来するVTT−D−79125株のような高度に生産的な突然変異体(Nevalainen、テクニカル リサーチ センター オブ フィンランド(Technical Research Centre of Finland)公報26、(1985)、エスポー、フィンランド)である。
DNAでのトリコデルマ(Trichoderma)の形質転換は、欧州特許第0244234号明細書、Harkki(1989,Bio/Technology 7:596−601)およびUusitalo(1991,J.Biotech.17:35−50)に教示されている技術を含め当該技術分野で既知の技術を使用して行う。トリコデルマ(Trichoderma)の培養は、工業的規模の発酵技術でのこれまでの豊富な経験により支持されている;例えばFinkelstein,1992,糸状菌のバイオテクノロジー:技術および産物(Biotechnology of Filamentous Fungi:Technology and Products)、バターワース−ヘイネマン出版、ストーンハム、マサチューセッツ州を参照にされたい。
5.クルイベロミセス(Kluyveromyces
クルイベロミセス(Kluyveromyces)属に属する酵母は、組換えペプチドの生産に宿主微生物として使用されてきた。この属の酵母により生産されるペプチドは特にキモシン(欧州特許第96430号明細書)、タウマチン(欧州特許第96910号明細書)、アルブミン、インターロイキン−1β、TPA、TPA、TIMP(欧州特許第361991号明細書)および治療的機能を有するアルブミン誘導体(欧州特許第413622号明細書)である。クルイベロミセス(Kluyveromyces)属の中で特に興味深い種にはK.ラクティス(lactis)を含む。
クルイベロミセス(Kluyveromyces)種での組換えペプチドの発現法は、当該技術分野で周知である。クルイベロミセス(Kluyveromyces)でのヒト組換えペプチドの発現および分泌のためのベクターは、組換えペプチドの形質転換および発現のための生産体として当該技術分野(Yeh,J.Cell.Biochem.Suppl.14C:68,Abst.H402;Fleer,1990,Yeast6(特集):S449)で既知である(Ito et al.,1983,J.Bacteriol.153:163−168;van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135−139;米国特許第5,633,146号明細書、国際公開第8304050A1号パンフレット、欧州特許第0096910号、同第0241435号、同第0301670号、同第0361991号明細書、すべて引用により全部、本明細書に編入する)。遺伝子ターゲッティングおよびプラスミドシャフルによるクルイベロミセス ラクティス(Kluyveromyces lactis)の線状DNAプラスミドの遺伝子操作の総説に関しては、Schaffrath et al.(1999,FEMS Microbiol Lett.178(2):201−210)を参照にされたい。
6.クリソポリウム(Chrysoporium
真菌の属であるクリソポリウム(Chrysoporium)は最近、外来組換えペプチドの発現に使用された。外来ペプチドを発現するために当業者がクリソポリウム(Chrysoporium)を使用することができる手順の記載は、国際公開第00/20555号明細書に見いだされる(これは引用により全部、本明細書に編入する)。発現系に特に適する種は限定するわけではないが、C.ボトリオイデス(botryoides)、C.カルミカエリー(carmichaelii)、C.クラッシツニカタム(crassitunicatum)、C.ヨーローパ(europae)、C.エボルセアンヌイ(evolceannui)、F.ファスチジウム(fastidium)、C.フィリホルメ(filiforme)、C.ゲロギエ(gerogiae)、C.グロビフェラム(globiferum)、C.グロビフェラム 変種 アーチクラタム(globiferum var.articulatum)、C.グロビフェラム 変種 ニベウム(globiferum var.niveum)、C.ヒルンド(hirundo)、C.ヒスパニカム(hispanicum)、C.ホルミー(holmii)、C.インジカム(indicum)、C.イノプス(inops)、C.ケラチノフィラム(keratinophilum)、C.クレイセリー(kreiselii)、C.クズロビアナム(kuzurovianum)、C.リグノラム(lignorum)、C.ロバタム(lobatum)、C.ラックノヴェンセ(lucknowense)、C.ラックノヴェンセ(lucknowense)Garg27K、C.メディウム(medium)、C.メディウム 変種 スピッセスセンス(medium var.spissescens)、C.メフィチカム(mephiticum)、C.メルダリウム(merdarium)、C.メルダリウム 変種 ロゼウム(merdarium var.roseum)、C.マイナー(minor)、C.パンニコーラ(pannicola)、C.パルバム(parvum)、C.パルバム 変種 クレセンス(parvum var.crescens)、C.ピロサム(pilosum)、C.ペオドメルデリウム(peodomerderium)、C.ピリホルミス(pyriformis)、C.クィーンズランディカム(queenslandicum)、C.シグレリ(sigleri)、C.スルフレウム(sulfureum)、C.シンクロナム(synchronum)、C.トロピカム(tropicum)、C.ウンダラタム(undulatum)、C.バレレナレンス(vallenarense)、C.ベスペルチリウム(vespertilium)およびC.ゾナタム(zonatum)を含む。
7.その他
シュワニオマイセス(Schwanniomyces)を形質転換する方法は欧州特許第394538号明細書に開示されている。アクレモニウム クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、米国特許第5,162,228号明細書に開示されている。ニューロスポーラ(Neurospora)を形質転換する方法は、米国特許第4,486,533号明細書に開示されている。またシゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)に特異的な発現系も知られている(欧州特許第385391号明細書)。分裂酵母シゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)でペプチドを発現させるための一般的方法は、Giga−Hama and Kumagai(1997、分裂酵母:シゾサッカロミセス ポンベでの外来遺伝子発現(Foreign gene expression in fission yeast:Schizosaccharomyces pombe)、スプリンガー、ベルリン)に見いだすことができる。
C.哺乳動物系
上記のように、哺乳動物細胞は典型的にはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖の数および配列について変動するN−グリカン構造のヘテロロガスな混合物を生産する。典型的には哺乳動物細胞は図4右側に示すような複雑なグリカン構造を有するペプチドを生産する。本発明の方法を使用して、最初に1次グリカン構造を同定し、次にグリカン構造を改造するためにはどの糖が除去されるなけれければならないかを決定することにより、哺乳動物細胞で生産されたペプチドをインビトロで改造して、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成することができる。本明細書で検討するように、除去される糖によりどの開裂酵素が使用されるかが決定され、すなわ改造方法の正確な工程は最初の基質として使用される1次グリカン構造に依存して変動するだろう。哺乳動物細胞で一般に生産されるグリカン構造を改造するための実例スキームは図3に示す。哺乳動物細胞でのN−グリカン生合成経路は十分に特徴付けられた(Moremen,1994,Glycobiology4:113−125を参照にされたい)。グリカン合成に必要な酵素の多くが同定され、そしてチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系Lec23(アルファ−グルコシダーゼI欠損)およびLec18(新規GlcNAc−TVIII)を含め、この酵素的経路を欠く突然変異体細胞系が単離された。これらの突然変異体細胞により生産されるペプチドのグリコシル化パターンは、正常CHO細胞に対して改変されている。本明細書で検討するように、これらおよび他の突然変異体細胞におけるグリコシル化の欠損は、複雑なグリカン構造を欠くペプチドを生産する目的に活かすことができる。例えばLec23細胞により生産されたペプチドはシアル酸残基を欠き、すなわち基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNac4にグリカン構造を減少させるために必要な酵素的操作が少ない。このようにこれらの細胞で生産されるペプチドはグリカン改造用の好適な基質として役立つ。当業者は既知の方法、例えばStanley et al.,1990,Somatic Cell Mol.Genet.,16:211−223に記載されている方法に基づき、他のグリコシル化−欠損細胞系を単離し、そして同定することができる。同定された、または未だ同定されていないグリコシル化−欠損細胞系の使用は、本明細書に記載する改造方法のための好適なペプチド基質を生成する目的で本発明に含まれる。
哺乳動物細胞中で外因性ペプチドを発現させるための発現ベクターは膨大にあり、そして当該技術分野では周知である。現在、多くの哺乳動物発現ベクターがとりわけノバジェン(Novagen)社(マジソン、ウィスコンシン州)、ジーンセラピーシステム(Gene Therapy System)(サンディエゴ、カリフォルニア州)、プロメガ(Promega)(マジソン、ウィスコンシン州)、クローンテック(ClonTech)社(パロ アルト、カリフォルニア州)およびストラタジーン(Stratagene)(ラ ジョラ、カリフォルニア)を含む会社から市販されている。
外因性ペプチドの発現に特に適合した数種の哺乳動物細胞系がある。典型的には哺乳動物細胞系は不死化した哺乳動物から抽出した腫瘍細胞(すなわちそれらは培養中、本質的に無限に複製できる)に由来する。これらの細胞系には限定するわけではないがCHO(チャイニーズハムスター卵巣、例えばCHO−K1;ATCC No.CCL61)およびそれらの変異体、NS0(マウス 骨髄腫)、BNK、BNK570(ATCC No.CRL10314)、BHK(ATCC No.CRL1632)、Per.C6(商標)(不死化ヒト細胞、Crucell N.V.,ライデン、オランダ)、COS−1(ATCC No.CRL1650)、COS−7(ATCC No.CRL1651)、HEK293、マウスL細胞、Tリンパ球細胞系、BW5147細胞およびMDCK(Madin−Darby イヌ腎臓)、HeLa(ヒト)、A549(ヒト肺癌腫)、293(ATCC No.CRL1573;Graham et al.,1977,Gen.Virol.36:59−72)、BGMK(バッファローグリーンモンキーの腎臓)、Hep−2(ヒト類表皮咽頭癌腫)、LLC−MK(アフリカグリーンモンキーの腎臓)、McCoy、NCI−H292(ヒト肺粘膜類表皮癌腫管)、RD(横紋筋肉腫)、Vero(アフリカグリーンモンキーの腎臓)、HEL(ヒト胚性肺)、ヒト胎児Lung−Chang、MRC5(ヒト胚性肺)、MRHF(ヒト包皮)、およびWI−38(ヒト胚性肺)を含む。幾つかの場合では、治療用ペプチドが発現される細胞は処置する患者のものでよく、あるいはそれらは別の関連または非関連哺乳動物に由来するものでもよい。例えば繊維芽細胞は哺乳動物の皮膚組織から単離し、そして培養し、そしてインビトロで形質転換させることができる。この技術はトランスカリオティック セラピー(Transkaryotic Therapies)社(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)から市販されている。ほとんどすべての現在使用されている細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、マナッサス、バージニア州)およびバイオウィッタカー(BioWhittaker)(ウォーカーズヴィル、メリーランド州)から入手可能である。
哺乳動物細胞は、当該技術分野で周知な幾つかの技術の1つを使用してDNAを用いて形質転換させることができる。そのような技術には限定するわけではないが、とりわけリン酸カルシウム形質転換(Chen and Okayama,1988;Graham and van der Eb,1973;Corsaro and Pearson,1981,Somatic Cell Genetics 7:603),ジエチルアミノエチル(DEAE)−デキストラン トランスフェクション(Fujita et al.,1986;Lopata et al.,1984;Selden et al.,1986,),電気窄孔(Neumann et al.,1982,;Potter,1988,;Potter et al.,1984,;Wong and Neuman,1982),カチオン性脂質試薬のトランスフェクション(Elroy−Stein and Moss,1990;Feigner et al.,1987;Rose et al.,1991;Whitt et al.,1990;Hawley−Nelson et al.,1993,Focus 15:73;Ciccarone et al.,1993,Focus 15:80),レトロウイルス(Cepko et al.,1984;Miller and Baltimore,1986;Pear et al.,1993;Austin and Cepko,1990;Bodine et al.,1991;Fekete and Cepko,1993;Lemischka et al.,1986;Turner et al.,1990;Williams et al.,1984;Miller and Rosman,1989,BioTechniques 7:980−90;Wang and Finer ,1996,Nature Med.2:714−6),ポリブレン(Chaney et al,1986;Kawai and Nishizawa,1984),マイクロインジェクション(Capecchi,1980),およびプロトプラスト融合(Rassoulzadegan et al.,1982;Sandri−Goldin et al.,1981;Schaffer,1980)を含む。一般に形質転換技術に関しては、Sambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)およびAusubel et al.(2002、分子生物学の現在のプロトコール、ジョン ウィリー&サンズ、ニューヨーク)を参照にされたい。
最近、昆虫細胞の形質転換で広く知られているバキュロウイルス系が哺乳動物細胞の安定な形質転換に適合させられた(総説に関しては、Koat and Condreay,2002,Trends Biotechnol.20:173−180、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい)。培養した哺乳動物細胞中の組換えペプチドの生産が、例えば米国特許第4,713,339号、同;第4,784,950号;同第4,579,821号;および同第4,656,134号明細書に開示されている。セルトレンド(Cell Trends)(ミドルタウン、メリーランド州)を含む数社が、哺乳動物細胞の形質転換および培養のサービスを提供している。哺乳動物細胞を培養する技術は当該技術分野で周知であり、そしてさらにHauser et al.(1997,哺乳動物細胞のバイオテクノロジー(Mammalian Cell Biotechnology)、ウォルター デ グルイャー(Walter de Gruyer)社、ホーソーン、ニューヨーク州)、およびSambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーおよびそこに引用されている参考文献)に見いだされる。
D.昆虫
昆虫細胞、そして特に培養した昆虫細胞は、シアリル化されることが稀で、そして通常は結合したさらなるフコース残基を持つかまたは持たないかもしれないマンノース残基を含んでなるN−結合グリカン構造を有するペプチドを発現する。培養した昆虫細胞で生産されるペプチド上に存在するグリカン構造の型の例は、図7およびそれらのマンノースグリカンに示す。
昆虫細胞中でバキュロウイルスが媒介する発現は、組換えペプチドの生産について特によく樹立されるようになった(Altmann et al.,1999,Glycoconjugate J.16:109−123)。ペプチドのホールディングおよび翻訳後プロセッシングに関して、昆虫細胞は唯一、哺乳動物細胞に次ぐ。しかし上記のように昆虫細胞中でのペプチドのN−グリコシル化は、多くの観点で哺乳動物細胞でのN−グリコシル化とは異なり、特に昆虫細胞は3個だけ、または時にわずか2個のマンノース残基を含むオリゴ糖を含んでなる短縮化されたグリカン構造を頻繁に生成する点で異なる。これらの構造はさらにフコース残基で置換されているかもしれない。
本発明に従い昆虫細胞で生産されるペプチドは最初に、場合により任意の置換フコース残基を適切なフコシダーゼ酵素を使用して除去することにより、インビトロで改造されて所望のグリコシル化を持つペプチドを生成することができる。ペプチドがフコース残基の除去後に基本的なトリマンノシルコア構造を含んでなる場合、所望のグリコシル化を有するペプチドを生成するために必要なすべてのことは、適切な糖をトリマンノシルコア構造にインビトロで付加することである。ペプチドがフコース残基の除去後のグリカン構造に2個のマンノース残基のみを含む場合、第3のマンノース残基をマンノシルトランスフェラーゼ酵素およびGDP−マンノースのような適切な供与体分子を使用して加え、そしてその後に適切な残基を加えて所望するグリコシル化を有するペプチドを生成する。
昆虫細胞を形質転換するためのバキュロウイルスの使用に関するプロトコールは当業者には周知である。昆虫細胞中でペプチドを発現させるためのバキュロウイルス系の使用に対する手順を提供する数冊の本が出版された。これらの本には限定するわけではないが、Richardson(バキュロウイルス発現プロトコール(Baculovirus Expression Protocols)、1998,Methods in Molecular Biology、39巻、ヒュマナ出版)、O’Reilly et al.(1994、バキュロウイルス発現ベクター:ア ラボラトリーマニュアル(Baculovirus Expression Vector:A Laboratory Manual)、オックスフォード大学出版)、およびKing and Possee(1992、バキュロウイルス発現系:ア ラボラトリーガイド(Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide)、チャップマン&ホール(Chapman&Hall))を含む。さらにLucklow(1993,Curr.Opin.Biotechnol.4:564−572)およびMiller(1993,Curr.Opin.Genet.Dev.3:97−101)のような報告もある。
外来タンパク質のバキュロウイルス発現用の系に関する多くの特許も発効された。これらの特許には限定するわけではないが、米国特許第6,210,966号明細書(グルタミンを欠き、そしてアンモニウム塩を含む昆虫細胞に関する培養基)、米国特許第6,090,584号明細書(組換えペプチドを生産するためのBVACs(バキュロウイルス人工染色体)の使用)、米国特許第5,871,986号明細書(哺乳動物細胞中で組換え核酸を発現させるためのバキュロウイルスの使用)、米国特許第5,759,809号明細書(昆虫細胞中でのペプチドの発現法および昆虫を殺す方法)、米国特許第5,753,220号明細書(システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルス、その生産法、およびそれを使用することによる経済的なペプチドの生産法)、米国特許第5,750,383号明細書(バキュロウイルスクローニングシステム)、米国特許第5,731,182号明細書(哺乳動物細胞中で組換え核酸を発現させるための非−哺乳動物DNAウイルス)、米国特許第5,728,580号明細書(昆虫細胞系で単一細胞懸濁液を誘導する方法および培養基)、米国特許第5,583,023号明細書(修飾されたバキュロウイルス、その調製法および遺伝子発現ベクターとしてのその応用)、米国特許第5,571,709号明細書(修飾されたバキュロウイルスおよびバキュロウイルス発現ベクター)、米国特許第5,521,299号明細書(バキュロウイルス感染を検出するためのオリゴヌクレオチド)、米国特許第5,516,657号明細書(分泌および膜−結合ペプチドを発現させるためのバキュロウイルスベクター)、米国特許第5,475,090号明細書(宿主昆虫のウイルス感染を強化するペプチドをコードする遺伝子)、米国特許第5,472,858号明細書(昆虫の幼虫での組換えペプチドの生産)、米国特許第5,348,886号明細書(細菌での組換え真核ウイルスの生産法)、米国特許第5,322,774号明細書(組換えバキュロウイルス発現系での原核リーダー配列)、米国特許第5,278,050号明細書(昆虫系での組換え遺伝子のプロセッシングおよび分泌の効率を改善するための方法)、米国特許第5,244,805号明細書(バキュロウイルス発現ベクター)、米国特許第5,229,293号明細書(組換えバキュロウイルス)、米国特許第5,194,376号明細書(組換えペプチドを高レベルで生産することができるバキュロウイルス発現系)、米国特許第5,179,007号明細書(組換えペプチド精製のための方法およびベクター)、米国特許第5,169,784号明細書(バキュロウイルス二重プロモーター発現ベクター)、米国特許第5,162,222号明細書(安定に形質転換された昆虫細胞または組換えバキュロウイルスでの組換え核酸の発現のためのバキュロウイルス初期プロモーターの使用)、米国特許第5,155,037号明細書(昆虫系での組換え核酸のプロセッシングおよび分泌の効率を改善するために有用な昆虫シグナル配列)、米国特許第5,147,788号明細書(バキュロウイルスベクターおよび使用法)、米国特許第5,110,729号明細書(培養した細胞中でバキュロウイルスベクターを使用してペプチドを生産する方法)、米国特許第5,077,214号明細書(安定に形質転換された昆虫細胞で組換え遺伝子を発現するためのバキュロウイルス初期プロモーターの使用)、米国特許第5,023,328号明細書(鱗翅目AKHシグナル配列)および米国特許第4,879,236号および同第4,745,051明細書(組換えバキュロウイルス発現ベクターを生産する方法)を含む。前述のすべての特許は引用により全部、本明細書に編入する。
現在、幾つかの異なる種起源の昆虫細胞系がペプチド発現に使用され、そしてこれらの系は当業者には周知である。問題の昆虫細胞系は限定するわけではないが、中でも一般に双翅目および鱗翅目の昆虫細胞、Sf9およびそれらの変異体(ヤガ(Spodoptera frugiperda)、アメリカヒトリガ(Estigmene acrea)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、カイコガ(Bombyx mori)、マラコソマ ジシットリ(Malacosoma disstri)、キイロショウジョウバエ属のKc1およびSL2系および蚊を含む。
E.植物
ペプチド生産体としての植物細胞は、別口の話題を提示する。植物により生産されるN−結合グリカンはトリマンノシルコア構造を含んでなり、この五糖骨格は図6に示すように数個の異なるさらなる糖を含んでなることができる。例えば例として、トリマンノシルコア構造はβ1,2結合キシロース残基およびα1,3結合フコース残基に置き換えられる。さらに植物細胞はMan5GlcNAc2構造も生産することができる。植物細胞中で生産されたペプチドはしばしば、グリカン構造上のコアα1,3フコースおよびキシロースの存在の結果として高度に抗原性であり、そして末端シアル酸残基の不存在から哺乳動物に導入された時、血流から迅速に排除される。したがってこれらのペプチドは本明細書で提供する方法を使用して改造されない限り、それらは一般には哺乳動物の治療薬としては適さないと考えられる。植物細胞中で発現した幾つかのモノクローナル抗体がマウスで非−免疫原性であることが判明したが、これはグリカン鎖がこれらの抗体中のFc領域に埋め込まれたので免疫原性ではなかったらしい(Chargelegue et al.,2000,Transgenic Res.9(3):187−194)。
本明細書で提供する指示に従い、今、植物細胞で生産されたペプチドを生成することが可能であり、ここでペプチド上に存在する増加した数のグリカン構造が基本的なトリマンノシルコア構造またはMan3GlcNAc4構造を含んでなる。これはフコシダーゼを含む適切なグリコシダーゼの組み合わせを使用して、基本的なトリマンノシルコア構造またはMan3GlcNAc4構造に到達するまでインビトロでさらなる糖を開裂することにより達成される。これらの開裂反応には、哺乳動物に導入した時に最終的なペプチドの抗原性を縮小させるために、構造からフコースまたはキシロース残基の除去も含むべきである。フコースおよびキシロース残基をトリマンノシルコア構造に付加することを阻害する突然変異を有する植物細胞は、当該技術分野では知られている(von Schaewen et al.,1993,Plant Physiology 102:1109−1118)。フコースおよびキシロースを欠いたグリカンを有するペプチドを生産するためのこれらの細胞の使用は本発明の意図するところである。基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造の生産で、さらなる糖がそれらに結合されて、哺乳動物での治療薬的使用に適する所望のグリコシル化を有するペプチドに達することができる。
多くの人がトランスジェニック植物は製薬学的ペプチドの発現系として選択されると考えている。潜在的に植物は組換えペプチドのより廉価な供給源を提供することができる。
植物での組換えペプチドの生産コストは、同じペプチドを大腸菌(E.coli)で生産するコストよりも10から50倍低くできると予想された。動物と較べて植物でのコドン利用頻度にわずかな差異があるものの、これらは組換えDNA配列を調整することにより相補できる(Kusnadi et al.,1997,Biotechnol.Bioeng.56:473−484;Khoudi et al.,1999,Biotechnol.Bioeng.135−143;Hood et al.,1999,Adv.Exp.Med.Biol.464:127−147を参照されたい)。さらにペプチド合成、分泌および翻訳後修飾は植物のグリコシル化にわずかな差異があるだけで、植物と動物で大変似ている(Fischer et al.,2000,J.Biol.Regul.Homest.Agents 14:83−92を参照にされたい)。次いでトランスジェニック植物からの産物は動物病原体、微生物トキシンおよび発癌性配列の混入も少ないと思われる。
植物細胞中での組換えペプチドの発現は当該技術分野では周知である。トランスジェニック植物に加えて、ペプチドはトランスジェニック植物細胞培養(Lee et al.,1997,Mol.Cell.7:783−787)、および組換え植物ウイルスを接種した非−トランスジェニック植物でも生産され得る。植物細胞の遺伝子形質転換に関するプロトコールを記載する数冊の本が出版された:Potrykus(1995、植物への遺伝子転移(Gene transfer to plants)、スプリンガー、ニューヨーク)、Nickoloff(1995、植物細胞の電気穿孔および電気融合プロトコール(Plant cell electroporation and electrofusion protocols)、ヒューマナ出版、トトワ、ニューヨーク)およびDraper(1988、植物遺伝子形質転換(Plant genetic transformation)、オックスフォード出版、ボストン)。
現在、組換え遺伝子材料を用いて植物細胞を安定に形質転換させるために、幾つかの方法が使用されている。これらの方法は限定するわけではないがアグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換(Bechtold and Pelletier,1998;Escudero and Hohn,1997;Hansen and Chilton,1999;Touraev et al.,1997),バイオリスティックス(ミクロプロジェクティル(microprojectiles))(Finer et al.,1999;Hansen and Chilton,1999;Shilito,1999),プロトプラストの電気窄孔(Fromm et al.,1985,Ou−Lee et al.,1986;Rhodes et al.,1988;Saunders et al.,1989;Trick et al.,1997),ポリエチレン グリコール処理(Shiltio,1999;Trick et al.,1997),植物内 マイクロインジェクション(Leduc et al.,1996;Zhou et al.,1983),種子 インビビッション(Trick et al.,1997),レーザー ビーム(1996),およびシリコン カーバイド ウイスカ(Thompson et al.,1995;米国特許出願第20020100077号明細書、引用
により全部、本明細書に編入する)を含む。
多くの種類の植物は、形質転換され、そして外因性ペプチドを発現し易い。本発明の改造方法で使用されるペプチドを発現するために特に興味深い植物には、限定するわけではないが、Arabidopsis thalliana,ナタネ(Brassica spp.;Ruiz and Blumwald,2002,Planta 214:965−969)),ダイズ(Glycine max),ヒマワリ(Helianthus unnuus),ギニア アブラヤシ(Elaeis guineeis),アメリカホドイモ(ラッカセイ,Arachis hypogaea;Deng et al.,2001,Cell.Res.11:156−160),ココヤシ(Cocus nucifera),キャスター(Ricinus communis),ベニバナ(Carthamus tinctorius),カラシナ(Brassica spp.and Sinapis alba),コリアンダー,(Coriandrum sativum),カボチャ(Cucurbita maxima;Spencer and Snow,2001,Heredity 86(Pt 6):694−702),亜麻子/亜麻(Linum usitatissimum;Lamblin et al.,2001,Physiol Plant 112:223−232),ブラジル ナッツ(Bertholletia excelsa),ホホバ(Simmondsia chinensis),トウモロコシ(Zea mays;Hood et al.,1999,Adv.Exp.Med.Biol.464:127−147;Hood et al.,1997,Mol.Breed.3:291−306;Petolino et al.,2000,Transgenic Research 9:1−9),アルファルファ(Khoudi et al.,1999,Biotechnol.Bioeng.64:135−143),タバコ(Nicotiana tabacum;Wright et al.,Transgenic Res.10:177−181;Frigerio et al.,2000,Plant Physiol.123:1483−1493;Cramer et al.,1996,Ann.New York Acad.Sci.792:62−8−71;Cabanes−Macheteau et al.,1999,Glycobiology 9:365−372;Ruggiero et al.,2000,FEBS Lett.469:132−1 36),キャノーラ(Bai et al.,2001,Biotechnol.Prog.17:168− 174;Zhang et al.,2000,J.Anim.Sci.78:2868−2878)),ジャガイモ(Tacket et al.,1998,J.Infect.Dis.182:302−305;Richter et al.,2000,Nat.Biotechnol.18:1167−1171;Chong et al.,2000,Transgenic Res.9:71−78),アルファルファ(Wingdorovitz et al.,1999,Virology 255:347−353),エンドウ(Pisum sativum;Perrin et al.,2000,Mol.Breed.6:345−352),コメ(Oryza sativa;Stoger et al.,2000,Plant Mol.Biol.42:583−590),ワタ(Gossypium hirsutum;Kornyeyev et al.,2001,Physiol Plant 113:323−331),オオムギ(Hordeum vulgare;Petersen et al.,2002,Plant Mol Biol 49:45−58);コムギ(Triticum spp.;Pellegrineschi et al.,2002,Genome 45:421−430)およびインゲン(Vicia spp.;Saalbach et al.,1994,Mol Gen Genet 242:226−236)を含む。
組換え核酸の発現が培養した細胞中ではなく植物全体であることを望む場合、植物細胞は最初にペプチドをコードするDNAで形質転換され、その後、植物を再生させる。これには典型的には各植物種に至適化された組織培養手順が関与する。植物を再生するプロトコールはすでに多くの種について当該技術分野で周知である。さら他の種に関するプロトコールは、日常的な実験を使用して当業者により開発され得る。植物の再生に関する手順を記載する多数の研究用マニュアルが利用可能であり、それらには限定するわけではないがSmith(2000、植物組織培養:技法および実験(Plant tissue culture:techniques and experiments)、アカデミック出版、サンディエゴ)、Bhojwani and Razdan(1996、植物組織培養:理論および実践(Plant tissue culture:theory and practice)、エルセビア サイエンス出版、アムステルダム)、Islam(1996、植物組織培養(Plant tissue culture)、オックスフォード&IBH出版社、ニューデリー、インド)、Dodds and Roberts(1995、植物組織培養における実験(Experiments in plant tissue culture)、ニューヨーク;ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、イギリス)、Bhojwani(植物組織培養:応用および限界(Plant tissue culture:applications and limitations)、エルセビア、アムステルダム、1990)、Trigiano and Gray(2000、植物組織培養の概念および実験実習(Plant tissue culture concepts and laboratory exercises)、CRC出版、ボカ ラトン、フロリダ州)およびLindsey(1991、植物組織培養マニュアル:基礎および応用(Plant tissue culture manual:fundamentals and applications)、クルヴァー アカデミック(Kluwer Academic)、ボストン)を含む。
植物から組換えペプチドを精製することは潜在的に経費がかさみ、これらの経費を最少にするために幾つかの系が開発された。1つの方法は合成されるペプチドを種子の内胚乳に向け、ここからペプチドを容易に抽出することができる(Wright et al.,2001,Transgenic Res.10:177−181,Guda et al.,2000,Plant Cell Res.19:257−262;および米国特許第5.767,379号明細書、これらは引用により全部、本明細書に編入する)。
別の取り組みは組換えペプチドと澱粉、粉または油のような従来の植物産物とを同時抽出することである。油−種子のナタネでは、植物中で発現させた時にオレオシン−ヒュルディン(hurudin)の融合ペプチドは種子の油体に結合し、そして油と一緒に植物の種子から抽出することができる(Parmenter,1995,Plant Mol.Biol.29:1167−1180;米国特許第5,650,554号、同第5,792,922号、同第5,948,682号および同第6,288,304号明細書、ならびに米国特許出願第2002/0037303号明細書、これらすべてが引用により全部、本明細書に編入される)。この取り組みに関する変更では、オレオシンを外因性の問題の同時発現ペプチドに親和性を有するペプチドに融合させる(米国特許第5,856,452号明細書、引用により全部、本明細書に編入する)。
クロロプラストのような植物プラスチド中での組換えペプチドの発現は、原核細胞での状況と同様、それに結合したグリカン構造を持たないペプチドを生じる。しかしそのようなペプチドの収量はこれらの植物細胞オルガネラで発現させた時に格段に大きく、すなわちこの種の発現系は他の系に優る利点を有することができる。外因性ペプチドの高等植物中のプラスチド発現に関する技術の一般的総説については、Hager and Beck(2000,Appl.Microbiol.Biotechnol.54:302−310およびそれに引用されている文献)を参照にされたい。プラスチド発現はタバコ(例えばStaub et al.,2000,Nat.Biotechnol.18:333−338を参照にされたい)で特に成功した。
F.トランスジェニック動物
動物(例えば哺乳動物)の受精卵への組換えDNAの導入は、トランスジェニック動物技術で標準的な多数の技術を使用して行うことができる。例えばHogan et al.,マウス胚の操作;ア ラボラトリーマニュアル(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1986;および米国特許第5,811,634号明細書(これは引用により全部、本明細書に編入する)を参照にされたい。最も普通には組換えDNAは前核マイクロインジェクションにより胚に導入されるGordon et al.,1980,PNAS 77:7380−7384;Gordon and Ruddle,1981,Science 214:1244−1246;Brinster et al.,1981,Cell 27:223−231;Costantini and Lacy,1981,Nature 294:92−94)。マイクロインジェクションは広範な様々な種に応用可能な利点を有する。着床前の胚もレトロウイルスで形質転換することができる(Jaenisch and Mintz,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71:1250−1254;Jaenisch et al.,1976,Hamatol Bluttransfus.19:341−356;Stuhlmann et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:7151−7155)。レトロウイルスが媒介する形質転換は1コピーの組換え核酸を細胞へ加える利点があるが、高度なモザイク現象を生じる。最も最近では、胚性幹細胞が媒介する技法が使用され(Gossler et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,83:9065−9069)、全染色体セグメントの転移(Lavitrano et al.,1989,Cell 57:717−723)およびインビトロ受精と組み合わせた配偶子トランスフェクション(Lavitrano et al.,1989,Cell 57:717−723)も使用された。これらの技法を開示した研究手順に関する数冊の本が出版された:Cid−Arregui and Garcia−Caaranca(1998,マイクロインジェクションおよびトランスジェネシス:方法およびプロトコール(Microinjection and Transgenesis:Strategies and Protocols)、スプリンガー、ベルリン)、Clarke(2002、トランスジェネシス技法:原理およびプロトコール(Transgenesis Techniques:Principles and Protocols)、ヒューマナ出版、トトワ、ニュージャージー州)およびPinkert(1994、トランスジェニック動物技法:ア ラボラトリーハンドブック(Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook)、アカデミック出版、サンディエゴ)。
いったん組換えDNAが卵に導入されれば、卵を短時間インキューベーションし、そして次いで卵を得た同じ種の偽妊娠動物に移す(Hogan et al.,同上)。哺乳動物の場合、1回の実験あたり典型的には125個の卵を注入し、そのおよそ3分の2がこの手順で生き残る。20個の生きている卵を偽妊娠哺乳動物に移し、その4〜10個が生きている子孫に生育する。典型的には10〜30%の子孫(マウスの場合)が組換えDNAを持つ。
全動物体を本発明のペプチドの発現系として使用することができるが、好適な態様では外因性ペプチドは動物の産物中に蓄積し、そこから動物を傷つけずに回収できる。好適な態様では、外因性ペプチドは乳、卵、毛髪、血液および尿に蓄積する。
組換えペプチドが動物の乳に蓄積する場合、適当な哺乳動物は反芻動物、有蹄動物、家畜および酪農動物である。特に好適な動物はヤギ、ヒツジ、ラクダ、雌ウシ、ブタ、ウマ、牡ウシおよびラマである。乳の中に組換えペプチドを蓄積するトランスジェニック雌ウシを作出する方法は周知である:Newton(1999,J.Immunol.Methods231:159−167)、Ebert et al.(1991,Biotechnology 9:835−838)および米国特許第6,210,736号、同第5,849,992号、同第5,843,705号、同第5,827,690号、同第6,222,094号明細書(これらすべては引用により全部、本明細書に編入する)を参照にされたい。所望する組換えペプチドを生産するトランスジェニック哺乳動物の子孫(generation)は、マサチューセッツ州、フラミンガムのGTCバイオセラピューティックス(Biotherapeutics)から販売されている。
組換えペプチドが卵に蓄積される場合、適当な鳥には限定するわけではないがニワトリ、アヒルおよび七面鳥を含む。他の興味深い動物には限定するわけではないが、鳥類の他の種、魚、爬虫類および両生類を含む。レトロウイルス形質転換による組換えDNAのニワトリへの導入は、当該技術分野では周知である:Thoraval et al.(1995,Transgenic Research 4:369−376),Bosselman et al.,(1989,Science 243:533−535),Petropoulos et al.(1992,J.Virol.66:3391−3397)、米国特許第5,162,215号明細書(引用により全部、本明細書に編入する)。組換えDNAを用いたニワトリの成功裏の形質転換も達成され、ここでDNAは胚盤葉細胞に導入され、そしてそのようにしてトランスフェクトされた胚盤葉細胞が胚に導入された:Brazolot et al.(1991,Mol.Reprod.Dev.30:304−312),Fraser,et al.(1993,Int.J.Dev.Biol.37:381−385),and Petitte et al.(1990,Development 108:185−189)。トランスジェニックニワトリが所望のペプチドを発現するかどうかを評価するために、高処理技法が開発された(Harvey et al.,2002,Poult.Sci.81:202−212、米国特許第6,423,488号明細書、引用により全部、本明細書に編入する)。組換えDNAを用いたニワトリのレトロウイルス形質転換を使用して、外因性ベータ−ラクタマーゼがニワトリの卵白中に蓄積した(Harvey et al.,2002,Nat.Biotechol.20(4):396−399)。ニワトリが生産する卵中の外因性ペプチドの生産物は、ジョージア州、アテネのアビジェニックス(AviGenics)から販売されている。
G.細菌
細菌で組換え的に発現したペプチドは一般にグリコシル化されていない。しかしペプチドをグリコシル化することができる細菌系は明らかになりつつあり、したがって将来はグリコシル化された組換えペプチドを細菌で生産することができるかもしれない。
多数の細菌発現系が当該技術分野では知られている。好適な細菌種には限定するわけではないが大腸菌(E.coli)およびバチルス(Bacillus)種を含む。
大腸菌(E.coli)での組換えペプチドの発現は当該技術分野では周知である。大腸菌(E.coli)に基づく発現系に関するプロトコールは、とりわけ米国特許出願第20020064835号明細書、米国特許第6,245,539号、同第5,606,031号、同第5,420,027号、同第5,151,511号明細書およびRE33,653号明細書に見いだされる。細菌を形質転換するための方法には限定するわけではないが、塩化カルシウム(Cohen et al.,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,69:2110−2114;Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557−580;Mandel and Higa,1970,J.Mol.Biol.53:159−162)および電気穿孔(Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques 6:742−751)、およびSambrook et al.,2001(同上)に記載されているものを含む。微生物の形質転換および発現系に関する実験室用のプロトコールの総説は、Saunders and Saunders(1987、バイオテクノロジーに応用される微生物遺伝学:遺伝子転移および操作の原理および技法(Microbial Genetics Applied to Biotechnology:Principales and Techniques of Gene Transfer and Manipulation)、クルーム ヘルム、ロンドン)、Puahler(1993、微生物の遺伝子工学(Genetic Engineering of Microorganism)、ヴァインヘイム、ニューヨーク)、Lee et al.,(1999、代謝工学(Metabolic Engineering)、マルセルデッカー、ニューヨーク)、Adolph(1996、微生物のゲノム法(Microbial Genome Methods)、CRC出版、ボカ ラトン)、およびBirren and Lai(1996、非哺乳動物ゲノム分析:実践的指針(Nonmammalian Genomic Analysis:A Practical Guide)、アカデミック出版、サンディエゴ)を参照にされたい。
大腸菌(E.coli)でのペプチドの発現に関する技術文献の一般的総説については、Balbas(2001,Mol.Biotechnol.19:251−267)を参照にされたい。今では数社が大腸菌(E.coli)のRosetta(商標)株のような哺乳動物ペプチドの発現系のために選択された細菌株を提供している(ノバジェン社、マジソン、ウィスコンシン州;細菌細胞で通常使用されていない真核コドンの強化された発現、および強化されたジスルフィド結合の形成を含む)。
H.細胞工学
本開示から、細胞により生産される出発原料が均一なほど、より効率的に所望のグリコシル化を有する大量のペプチドがインビトロで生成されることは明白である。すなわち本明細書で開示するインビトロの酵素的反応の出発原料として、均一にグリコシル化されたペプチドを生産するための宿主細胞の遺伝子工学は、ヘテロロガスな組のグリカン構造を結合して有するペプチド出発原料を使用することよりも有意な利点を提供する。本発明で使用するために好適な1つのペプチド出発原料は、基本的なトリマンノシルコア構造のみからなる1次グリカン分子を有するペプチドである。別の好適な出発原料はMan3GlcNAc4である。改造方法の後、好適なペプチドは所望のグリコシル化、すなわち改善された臨床的効力を有する最大量のペプチドを生じるようになる。しかし他のグリカン出発原料も、例えば高マンノースグリカンは一連のマンノシダーゼを使用してインビトロで基本的なトリマンノシルコア構造に容易に減少されるので、本明細書に記載する方法での使用に適する。本明細書のいたるところに記載するように、基本的なトリマンノシルコア構造またはMan3GlcNAc4が生成されるようにすべての過剰な糖部分が開裂可能であるならば、他のグリカン出発原料も使用することができる。このように本発明のペプチドを生産するために、遺伝的に工作した細胞を使用する目的は、出来る限り均一なグリカン構造を結合して有するペプチドを生成することであり、ここでグリカン構造はインビトロで改造されて所望のグリコシル化を有するペプチドを生成することができる。これによりこのようなペプチドの生産コストに劇的な減少をもたらす。この方法を使用して生産された糖ペプチドは、大部分が同じN−結合グリカン構造を有するので、生産後修飾プロトコールはバッチ毎の一貫性がより高い最終産物を生成するために標準化し、そして至適化することができる。結果として、最終的に完成された−鎖(chain)生成物は、現在入手可能なものよりも異質性が低くなり得る。この生成物は従来技術の生成物よりも改善された生物学的半減期および生物学活性を有する。あるいは所望により本発明は、例えば異なる糖部分の付加をもたらす反応条件を選択することにより、限定され、そして特異的な異質性を導入するために使用することができる。
好ましくは厳しい要件ではないが、遺伝的に工作した細胞は主に基本的なトリマンノシルコア構造またはMan3GlcNAc4からなるグリカン構造を有するペプチドを生産する細胞である。最少限、遺伝的に工作された細胞により生産されるこれらの好適な構造の比率は、改造プロトコールの後に望ましいグリコシル化を有するペプチドを生じるために十分でなければならない。
一般に任意の真核細胞型を修飾して本発明の宿主細胞とすることができる。基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドまたはMan3GlcNAc4糖ペプチドの生産をもたらす酵素活性の適切な付加/削除を同定するために、最初に微生物により生産される内因性および組換え糖ペプチドの両方のグリコシル化パターンを決定する。これは典型的にはグリコシルトランスフェラーゼ反応の基質としてトリマンノシル糖ペプチドを使用する酵素活性の削除、およびより短い鎖を生成するためにより複雑なN−結合グリカンを分解する酵素活性の挿入を伴う。さらに遺伝的に工作された細胞は高マンノースグリカンを生成することができ、これはマンノシダーゼにより開裂されて所望の出発グリカン構造を生成することができる。マンノシダーゼは細胞中、インビボで活性であることができ(すなわち、細胞はそれらを生産するように遺伝的に工作することができる)、あるいはそれらは生産後の反応にインビトロで使用することができる。
発現したペプチドのグリコシル化プロフィールを改変するために、遺伝的に修飾した宿主細胞に関する技法は周知である。例えばAltmann et al.(1999,Glycoconjugate J.16:109−123),Ailor et al.(2000,Glycobiology 10(8):837−847),Jarvis et al.,(In vitrogen Conference,March,1999,abstract),Hollister and Jarvis,(2001,Glycobiology 11(1):1−9),and Palacpac et al.,(1999,PNAS USA 96:4697),Jarvis et al.,(1998.Curr.Opin.Biotechnol.9:528−533),Gerngross(米国特許出願20020137134第号明細書)を参照にされたい、これらすべてが昆虫または植物細胞をグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションすることにより、昆虫または植物発現系を「哺乳動物化する(mammalianize)」ための技術を開示する。
大腸菌(E.coli)で発現したペプチドのグリコシル化プロフィールを遺伝的に改変する技法も存在する。大腸菌(E.coli)は、インビボでオリゴ糖を生産するように、細菌である髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)およびアゾリゾビウム(Azorhizobium)に由来する種々のグリコシルトランスフェラーゼで工作された(Bettler et al.,1999,Glycoconj.J.16:205−212)。髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)のβ1,3NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼlgtA遺伝子を過剰に発現するように遺伝的に工作された大腸菌(E.coli)は、外因性ラクトースを効率的にグリコシル化する(Priem et al.,2002,Glycobiology 12:235−240)。
真菌細胞も遺伝的に修飾されて外因性のグリコシルトランスフェラーゼを生産した(Yoshida et al.,1999,Glycobiology,9(1);53−58;Kalsner et al.,1995,Glycoconj.J.12:360−370;Schwientek and Ernst,1994,Gene 145(2):299−303;Chiba et al.,1995,Biochem J,308:405−409)。
このように1つの観点では、本発明は細胞により生産される糖ペプチドの比率が基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するように、糖ペプチド群をグリコシル化する細胞を提供する。好ましくは細胞は基本的なトリマンノシルコアのみからなるグリカン構造を有するペプチドを生産する。最少限、基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドの比率は、改造方法後に所望のグリコシル化を有するペプチドを生じるために十分である。細胞は1以上のヘテロロガスな核酸発現単位を導入され、その各々は1以上の問題のペプチドをコードする1以上の核酸配列を含んでなることができる。問題の糖ペプチドの天然な形態は、1以上の複雑なN−結合グリカンを含んでなることができ、あるいは単に高マンノースグリカンであり得る。
細胞は任意の型の細胞でよく、そして好ましくは真核細胞である。この細胞はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターのような哺乳動物細胞または他の型の哺乳動物細胞でよい。細胞が哺乳動物細胞である時、哺乳動物細胞は非−ヒトトランスジェニック哺乳動物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで哺乳動物中の細胞は、所望の糖ペプチド分子の生産に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵素をコードする。加えて細胞は真菌細胞、好ましくは酵母細胞でよく、あるいは細胞は昆虫または植物細胞でよい。同様に細胞が植物細胞である時、植物細胞はトランスジェニック植物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで植物は所望の糖ペプチド分子の生産に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵素をコードする。
いくつかの態様では、宿主細胞は1以上のヘテロロガスなグリコシルトランスフェラーゼ酵素および/または1以上のヘテロロガスなグリコシダーゼ酵素を発現する真核細胞でよく、ここで宿主細胞中での組換え糖ペプチドの発現は、1次グリカン構造としてペプチドに結合した基本的なトリマンノシルコアを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらす。
いくつかの態様では、細胞中で有用なヘテロロガスなグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えばTaniguchi et al.(2002,グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、スプリンガー、ニューヨーク)で利用可能なグリコシルトランスフェラーゼのリストに含まれる既知のグリコシルトランスフェラーゼ酵素からなる群から選択することができる。
別の態様では、ヘテロロガスなグリコシラーゼ酵素はマンノシダーゼ1、マンノシダーゼ2、マンノシダーゼ3および限定するわけではないが微生物のマンノシダーゼを含む他のマンノシダーゼからなる群から選択することができる。本発明の方法に有用な酵素に関するさらなる開示は、本明細書のいたるところに提供している。
さらに別の態様では、宿主細胞は真核細胞でよく、ここで1以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および/または1以上の内因性グリコシダーゼ酵素は、宿主細胞での組換え糖ペプチドの発現が1次グリカン構造として結合した基本的なトリマンノシルコアを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらすように不活性化されている。
さらなる態様では、宿主細胞はヘテロロガスなグリコシルトランスフェラーゼ酵素および/またはグリコシダーゼ酵素を発現することができると同時に、1以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および/またはグリコシダーゼ酵素が不活性化されている。
内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および/またはグリコシダーゼ酵素は、限定するわけではないがアンチセンス技法および核酸を宿主細胞のゲノムに挿入することが関与する技法を含む当業者に既知の技法を使用して不活性化することができる。幾つかの態様では、内因性酵素はGnT−Iからなる群から選択することができ、マンノシダーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、コアα1,3フコシルトランスフェラーゼ、セリン/トレオニンO−マンノシルトランスフェラーゼ等の選択であることができる。
あるいは、N−結合グリカンが主にトリマンノシルコア型またはMan3GlcNAc4型となるように、天然にペプチドをグリコシル化する発現系を利用することができる。
トリマンノシルコアを生産する細胞型の例は、Sf9細胞である。他のそのような発現系は、天然にまたは組換え的に細胞で発現した糖ペプチドを分析し、所望のグリコシル化特性を現す糖ペプチドを選択することにより同定することができる。本発明は、本発明のペプチドを生産するためにありとあらゆるそのような細胞を含むと解釈すべきである。
V.改造されたグリカンおよび/または複合糖質化ペプチドの精製
修飾された糖タンパク質が細胞内で生産され、または分泌される場合、第1工程として特定の屑、宿主細胞、分解したフラグメントを、例えば遠心または超遠心により除去し;場合によりタンパク質は市販されているタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮することができ、続いてペプチド変異体はイムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラム分画(例えばジエチルアミノエチル(DEAE)またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックス)、Blue−Sepharose、CM Blue−Sepharose、MONO−Q、MONO−S、レンチルレクチン−Sepharose、WGA−Sepharose、ConA−Sepharose、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl ToyopearlまたはプロテインA Sepharoseでのカラムクロマトグラフィー、SDS−PAGE−クロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相HPLC(RP−HPLC)、ゲル濾過(例えばSephadex分子篩またはサイズ−排除クロマトグラフィー)、ペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィー、およびエタノール、pHまたは硫酸アンモニウム沈殿、膜濾過および種々の技法から選択される1以上の工程により他の不純物から分離することができる。
培養で生産された修飾ペプチドは通常、細胞、酵素等からの初期の抽出、続いて1以上の濃縮、塩析、水性イオン−交換またはサイズ−排除クロマトグラフィー工程により単離される。さらに修飾糖タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。次いで最終精製工程にHPLCを使用することができる。
タンパク質分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビター、例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を前述の任意工程に含めることができ、そして偶発的な混入物の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。
別の態様では、本発明の修飾ペプチドを生産する系からの上清を、最初に市販されているタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン(Amicon)またはミリポアペリコン(Millipore Pellicon)超遠心ユニットを使用して濃縮する。濃縮工程後、濃縮物を適当な精製マトリックスに乗せる。例えば適当なアフィニティーマトリックスは適当な支持体に結合したペプチド用のリガンド、レクチンまたは抗体分子を含んでなることができる。あるいはアニオン−交換樹脂、例えばペンダントDEAE基を有するマトリックスまたは支持体を使用することができる。適当なマトリックスにはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用されている他の種類のものを含む。あるいはカチオン−交換工程を使用してもよい。適当なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性マトリックスを含む。スルホプロピル基が特に好適である。
次いで疎水性のRP−HPLC媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用した1以上のRP−HPLC工程を使用してさらにペプチド変異体組成物を精製することができる。前述の精製工程の幾つかまたは全ては、種々に組み合わせて使用して均一な修飾糖タンパク質を提供することもできる。
大規模な発酵から得られた本発明の修飾ペプチドは、Urdal et al.,J.Chromatog.296:171(1984)により開示された方法に類似する方法により精製することができる。この参考文献は調製用HPLCカラムで組換えヒトIL−2を精製するために、2つの順次のRP−HPLC工程を記載する。あるいはアフィニティークロマトグラフィーのような技法を使用して修飾糖タンパク質を精製することができる。
VI.好適なペプチドおよび好適なペプチドをコードする核酸
本発明は種々のペプチドおよびタンパク質、および同様な分子またはそれらのフラグメントをコードする単離された核酸を含む。そのようなペプチドには限定するわけではないが、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、ヒトインターフェロンアルファ(IFN−アルファ)、ヒトインターフェロンベータ(IFN−ベータ)、ヒト第VII因子(第VII因子)、ヒト第IX因子(第IX因子)、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒトエリトロポエチン(EPO)、ヒト顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、ヒトインターフェロンガンマ(IFN−ガンマ)、ヒト−アルファ−1プロテアーゼインヒビター(アルファ−1アンチトリプシンまたはアルファ−1−トリプシンインヒビター、A−1−P1としても知られている)、グルコセレブロシダーゼ、ヒト組織型アクチベーター(TPA)、ヒトインターロイキン−2(IL−2)、ヒト第VIII因子(第VIII因子)、ヒトIgG免疫グロブリンFc部分に融合した75kDa腫瘍壊死因子レセプター(ENBREL(商標)またはETANERCEPT(商標)(キメラTNFR)として商業的に知られている)、ヒトウロキナーゼ(ウロキナーゼ)、糖タンパク質IIb/IIIaおよびビトロネクチンアルファベータレセプターに特異的に結合するヒト/マウスキメラモノクローナル抗体のFabフラグメント(REOPRO(商標)またはABCIXIMAB(キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa)として商業的に知られている)、ヒトHER2に特異的に結合するマウス/ヒトキメラモノクローナル抗体(HERCEPTIN(商標)(キメラ抗−HER2)として商業的に知られている)、呼吸合胞体ウイルスのA抗原部位またはFタンパク質に特異的に結合するヒト/マウスキメラ抗体(SYNAGIS(商標)またはPALIVIZUMAB(キメラ抗−RSV)として商業的に知られている)、ヒトB−細胞上のCD20に特異的に結合するキメラヒト/マウスモノクローナル抗体(RITUXAN(商標)またはRITUXAMAB(商標)(キメラ抗−CD20)として商業的に知られている)、ヒト組換えDNase(DNase)、ヒト腫瘍壊死因子に特異的に結合するキメラヒト/マウスモノクローナル抗体(REMICADE(商標)またはINFLIXIMAB(キメラ抗−TNF)として商業的に知られている)、ヒトインスリン、B型肝炎ウイルスの表面抗原(adwサブタイプ;HBsAg)、およびヒト成長ホルモン(HGH)等を含む。
本発明の単離された核酸は、本発明で上に確認した任意のペプチド、およびそれらの任意の修飾された形態(ヌクレオチド配列が無細胞である時、または細胞に付随する時、ヌクレオチド配列をより安定にするDNAまたはRNAの化学的修飾を含む)をコードするRNAまたはDNA配列を含むと解釈するべきである。非限定的な例として、少なくとも1つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼに対して強化された耐性を付与することが知られている。修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間(「骨格」)結合を含むものを含む。さらにモルホリノ骨格構造(米国特許第5,034,506号明細書)またはポリアミド骨格構造(Nielsen et al.,1991,Science254:1497)を有するオリゴヌクレオチドも使用することができる。
ヌクレオチドの化学修飾を使用して、細胞によるヌクレオチド配列の取り込み効率、または細胞でヌクレオチド配列が発現される効率を強化することもできる。ヌクレオチド配列の修飾のありとあらゆる組み合わせが本発明では企図されている。
本発明は本明細書に開示する核酸およびアミノ酸配列のみに限定されると解釈されるべきではない。本明細書のいたるところにより詳細に記載するように、いったん本発明を着手すれば、当業者には本発明のペプチドをコードする他の核酸が本明細書に記載する手順(例えば部位指向的突然変異誘発法、フレイムシフト突然変異等)、および当該技術分野で周知の手順に従うことにより得られるのは明らかである
またペプチドのフラグメントをコードする単離された核酸も含み、ここでペプチドのフラグメントはペプチドの所望する生物学的活性を保持している。さらに好適なペプチドをコードする核酸の例を具体的な配列番号と関連して本明細書に開示するが、本発明は本明細書に開示する具体的な核酸には限定されることは全くないと解釈すべきである。むしろ本発明は核酸が本明細書に開示する所望の生物学的活性を有するペプチドをコードするように、本明細書に開示する配列と十分な同一性の割合を有するありとあらゆる核酸分子を含むと解釈するべきである。また完全長よりも短い単離された核酸も意図し、ここでそれによりコードされるペプチドの生物学的活性は保持されている。1つの核酸ともう1つの核酸との間の同一性の割合を決定する方法は、任意の特に好適なペプチドの生物学的活性を決定するためのアッセイとして本明細書のいたるところに開示する。
また本明細書のいたるところに開示するように、例えばSambrook et al.、(1989、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)およびAusubel et al.(1997、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)のような当該技術分野で周知な組換えDNA法を使用して、本発明のペプチドの誘導体、突然変異体または変異体を生成するための多数の他の手順を使用することができる。ペプチドをコードするDNA配列を改変することによりペプチドまたはポリペプチド中にアミノ酸の変化を導入するための手順は当該技術分野では周知であり、そしてSambrook et al.(1989、同上);Ausubel et al.(1997、同上)にも記載されている。
本発明は、G−CSF、IFN−アルファ、IFN−ベータ、第VII因子、第IX因子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN−ガンマ、A−1−P1、グルコセレブロシダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子、キメラTNFR、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIa、キメラ−抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20、DNase、キメラ抗−TNF、ヒトインスリン、HBsAgおよびHGHをコードする核酸を含み、ここで標識ペプチドをコードする核酸はそれに共有結合している。すなわち本発明は、標識ペプチドをコードする核酸配列が本発明のペプチドをコードする核酸に共有結合しているキメラ核酸を包含する。そのような標識ペプチドは当該技術分野では周知であり、そして例えばグリーン蛍光タンパク質(GFP)、myc、myc−ピルベートキナーゼ(myc−PK)、His、マルトース結合タンパク質(MBP)、インフルエンザウイルス赤血球凝集素標識ポリペプチド、フラッグ標識ポリペプチド(FLAG)、およびグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)標識ポリペプチドを含む。しかし本発明は上記に掲載した標識ペプチドをコードする核酸に限定すべきものとは全く解釈されない。むしろこれらの標識ペプチドに実質的に類似する様式で機能することができるペプチドをコードする任意の核酸配列を、本発明に含むと解釈すべきである。
標識ペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸は、本発明のペプチドを細胞、組織内に、および/または生物全体(例えば哺乳動物の胚)に局在させ、細胞から分泌された本発明のペプチドを検出し、そして細胞中でのペプチドの役割(1つまたは複数)を研究するために使用することができる。さらに標識ペプチドの付加により「標識」されたペプチドの単離および精製が容易になるので、本発明のペプチドが生産され、そして容易に精製され得る。
本発明は以下の好適な単離ペプチドを含む:G−CSF、IFN−アルファ、IFN−ベータ、第VII因子、第IX因子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN−ガンマ、A−1−P1、グルコセレブロシダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子、キメラTNFR、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ−抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20、DNase、キメラ抗−TNF、ヒトインスリン、HBsAgおよびHGH。
本発明は本発明のペプチド(またはそれをコードするDNA)の「誘導体」、「突然変異体」および「変異体」を包含すると解釈され、この誘導体、突然変異体および変異体は1以上のアミノ酸が改変されている(またはそれをコードするヌクレオチド配列を指す時は、1以上の塩基対が改変されている)ので、生成するペプチド(またはDNA)は本明細書に引用する配列とは同一ではないが、そのペプチドがG−CSF、IFN−アルファ、IFN−ベータ、第VII因子、第IX因子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN−ガンマ、A−1−P1、グルコセレブロシダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子、キメラTNFR、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ−抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20、DNase、キメラ抗−TNF、ヒトインスリン、HBsAgおよびHGHの生物学的/生化学的特性を有するという点で本明細書に開示するペプチドと同じ生物学的特性を有する。
さらにペプチドの長さに関係なく、望ましいペプチドの生物学的活性を保持するペプチドのフラグメントを含む。本発明に有用な任意のペプチドの完全長形態よりも小さいものを単離し、そして本明細書に提供するアッセイを使用して単離したどのフラグメントが所望の生物学的活性を保持するか、したがって本発明に有用なペプチドであるかを決定することは当業者の技術範囲内である。
本発明のタンパク質の生物学的特性は、炎症の減少、免疫応答の顕在化、血液凝固、造血産出力の上昇、プロテアーゼ阻害、免疫系の調節、抗原の結合、成長、疾患の処置の軽減、DNA開裂等のような、限定するわけではなく含む本明細書に記載する生物学的アッセイおよび環境においてペプチドが機能する能力を含むと解釈されるべきである。
A.G−CSF
本発明はG−CSF上のグリカン構造を修飾する方法を包含する。G−CSFは活性化T−細胞、マクロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイトカインとして当該技術分野では周知である。G−CSFは主に骨髄に作用して炎症性白血球の生産を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費される好中球の補充を開始する。またG−CSFは化学療法後の骨髄代用に臨床的応用を有する。
G−CSFは哺乳動物、特にヒトにおける治療的応用に重要でしかも有用な化合物であると示されてきたが、組換え細胞からG−CSFを生産するための現在の方法は、比較的短い生物学的寿命、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の損失を有する生成物、および同じ効果を達成するためにより大量およびより頻繁な投与の両方の必要性の増加をもたらす。
G−CSFは単離そしてクローン化され、その核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号1および配列番号2(それぞれ図52Aおよび52B)に示す。本発明はG−CSFを、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するG−CSFの能力に関係するように飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれば、本発明がG−CSFを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理解するだろう。
本発明はさらに当該技術分野で周知なG−CSF変異体を包含する。例として、しかし本発明を限定することは全く意味せずに、G−CSF変異体はすでに米国特許第6,166,183号明細書に記載され、ここでG−CSFはリシン残基の天然な補体を含んでなり、そしてさらに1または2個のポリエチレングリコール分子に結合したものが記載されている。さらに米国特許第6,004,548号、同第5,580,755号、同第5,582,823号および同第5,676,941号明細書は、1以上のシステイン残基が17、36、42、64および74位でアラニンあるいはセリンに置き換えられたG−CSF変異体を記載する。米国特許第5,416,195号明細書は、17位のシステイン、27位のアスパラギン酸、および65および66位のセリンがそれぞれセリン、セリン、プロリンおよびプロリンに置き換えられたG−CSF分子を記載する。別の変異体は当該技術分野で周知であり、そして例えば米国特許第5,399,345号明細書に記載されている。
本発明の修飾されたG−CSF分子の発現および活性は、当該技術分野で周知な、そして例えば米国特許第4,810,643号明細書に記載されているような方法を使用してアッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジンの取り込みアッセイを使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄をFicoll−Hypaqueでの密度カットに供し(1.077g/ml、ファルマシア(Pharmacia)、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)、そして低密度細胞を、10%ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を含むIscoveの培地(ギブコ(GIBCO)、ラジョラ、カリフォルニア州)に懸濁する。約2X10個のヒト骨髄細胞を対照培地またはG−CSFまたは本発明のいずれかと、96−ウェル平底プレート中で約37℃で空気中5%COで約2日間、インキューベーションする。次いでカルチャーは約4時間、0.5μCi/ウェルのH−チミジン(ニューイングランドヌクレアー(New England Nuclear)、ボストン、マサチューセッツ州)でパルスをかけ、そして取り込みを例えばVentua,et al.(1983,Blood 61:781)に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比べて、H−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性なそして能力のあるG−CSF化合物の指標である。
B.IFNアルファおよびIFNベータ
本発明はさらに、IFNアルファおよびIFNベータの改造および修飾法を包含する。
IFNアルファは重量が約18kDaの約20個のペプチドのファミリーの一部である。
IFNアルファおよびIFNベータは集合的にI型インターフェロンとして知られるが、同じ細胞レセプターに結合し、そして類似の応答を誘導する。I型IFNは中でも、ウイルス複製を阻害し、NK細胞の溶解能力を上げ、MHC分子の発現を調節し、そして細胞増殖を阻害する。I型IFNはウイルス感染、特に肝炎ウイルスの治療として、および多発性硬化症の治療として使用されてきた。
I型IFNの現在の組成物は上記のように、異型の免疫学的応答の調節、および種々の疾患の治療の両方に有用な化合物である。しかしそれらは天然なグリコシル化の補体を含んでなる天然なサイトカインと比べて、体内での能力および機能の低下、および限定された半減期により阻まれている。
IFNアルファの原型ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号3および配列番号4(それぞれ図53Aおよび53B)として説明する。IFNベータは約20kDaの単一の遺伝子産物を含んでなり、その核酸およびアミノ酸配列は、本明細書では配列番号5および配列番号6(それぞれ図54Aおよび543B)として表す。本発明は本明細書のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に限定されない。当業者はIFNアルファの多くの変異体が天然な、および工作された誘導体として両方が存在すると容易に考えるだろう。同様に、IFNベータはより有利な治療的プロフィールを達成することを試みるために修飾された。修飾されたI型IFNの例は当該技術分野では周知であり(表8を参照にされたい)、そして例えば米国特許第6,323,006号明細書(ここでシステイン−60がチロンシに置換されている)、米国特許第4,737,462号、同第4、588,585号、同第5,545,723号および同第6,127,332号明細書(ここで種々のアミノ酸の置換を持つIFNベータが記載されている)に記載されている。さらに米国特許第4,966,843号、同第5,376,567号、同第5,795,779号明細書は、IFNアルファ−61およびIFN−アルファ−76を記載する。米国特許第4,748,233号および同第4,695,543号明細書は、IFNアルファgx−1を記載し、一方米国特許第4,975,276号明細書はIFNアルファ54を記載する。米国特許第4,695,623号、同第4,897,471号、同第5,661,009号および同第5,541,293号明細書はすべて共通IFNアルファ配列を記載し、提出日までに知られているすべての変異体を表す。このI型IFNおよびその変異体のリストは網羅的であること全く意味せず、当業者は本発明が既知の、または将来見いだされるIFNベータおよびIFNアルファ分子、誘導体および変異体を包含すると容易に理解するだろう。
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組換え細胞中のIFNの発現法は周知であり、そして例えば米国特許第4,966,843号明細書およびSambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)およびAusubel et al.(1997、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)に記載されている技法を使用して容易に行われる。
本発明の方法により修飾されたI型IFNの生物学的活性を測定するアッセイは、当業者には周知である。例えばRubinstein et al.,(1981,Journal of Virology 37:755−758)に記載されているアッセイは、細胞群に及ぼすウイルス感染の細胞病理学効果を測定することにより、I型IFNの効果を決定するために一般的に使用されている。この方法はIFN型の生物学的機能をアッセイするために当該技術分野で知られている多くの1つにすぎない。
C.第VIIa因子
さらに本発明は第VII因子の改造および修飾法を包含する。血液凝固経路は、多くの出来事(event)を含んでなる複雑な反応である。この経路の中間の出来事が第VII因子であり、これは組織因子およびカルシウムイオンの存在下で第X因子をXa因子に転換することにより(第VIIa因子への活性化で)、血液凝固の外因系経路に参加するプロ酵素である。次に第Xa因子は、第Va因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下でプロトロンビンをトロンビンに転換する。第X因子から第Xa因子への活性化は、内因系および外因系の血液凝固経路の両方により分けられる(shared)出来事であり、したがって第VIIa因子は第VIII因子の欠損またはインヒビターを有する患者の処置に使用することができる。また第VIIa因子が内因系の経路にも参加できることを示唆する証拠もあるので、血液凝固における第VII因子の役割の突出および重要性が増している。
第VII因子は約50kDaの分子量を持つ一本鎖の糖タンパク質である。この状態で、この因子は血液中を不活性なプロ酵素として循環する。第VII因子のVIIaへの活性化は、第XIIa因子のような数種の血漿プロテアーゼにより触媒され得る。第VII因子の活性化は、少なくとも1つのジスルフィド結合により一緒に保たれる重鎖および軽鎖の形成をもたらす。さらに第VIIa因子に転換されることができない修飾された第VII因子分子が記載され、そしてこれらは血液凝固、血栓症等のような場合に抗−凝固薬として有用である。血液凝固経路における第VII因子の重要性、および上昇または減少した凝固レベルの両方の処置としての使用を仮定すると、より長い生物学的半減期、上昇した能力および一般に野生型の第VII因子により似ている治療プロフィールを有する分子が、健康なヒトで合成され、そして分泌されれば、血液凝固障害の処置に有益でしかも有用となるだろう。
第VII因子はクローン化そして配列決定され、そして核酸およびアミノ酸配列が本明細書に配列番号7および配列番号8(それぞ図55Aおよび55B)として提示されている。本発明は本明細書で説明する第VII因子の核酸およびアミノ酸配列に全く限定されないと解釈されるべきである。第VII因子の変異体も例えば米国特許第4,784,950号および同第5,580,560号明細書に記載され、ここでリシン−38、リシン−32、アルギニン−290、アルギニン−341、イソロイシン−42、チロシン−278およびチロシン332が種々のアミノ酸に置き換えられている。さらに米国特許第5,861,374号、同第6,039,944号、同第5、833,982号、同第5,788,965号、同第6,183,743号、同第5,997,864号および同第5,817,788号明細書は、第VIIa因子の形態に開裂されない第VII因子変異体を記載する。当業者は、血液凝固経路およびその中での第VII因子の役割については周知であり、したがって天然に存在するか、または上記のように工作された多くの変異体が本発明に含まれることを認識するだろう。
第VII因子の発現および活性の測定法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第4,784,950号明細書に記載されている。簡単に説明すると、第VII因子、またはその変異体の発現は、大腸菌(E.coli)、CHO細胞、BHK細胞、昆虫細胞を含む様々な原核および真核系で、バキュロウイルス発現系を使用して行うことができ、そのすべてが当該技術分野では周知である。
本発明の方法に従い調製された修飾第VII因子の活性のアッセイは、当該技術分野で周知な方法を使用して行うことができる。非限定的な例として、Quick et al.(出血性疾患および血栓症(Hemorragic Disease and Thrombosis)、第2版、リート フェビガー(Leat Febiger)、フィラデルフィア、1966)は、本発明の方法に従い調製した第VII因子分子の生物学的活性を測定するために有用な1段階凝固アッセイを記載している。
D.第IX因子
本発明はさらに第IX因子を改造および/または修飾するための方法を包含する。上記のように第IX因子は血液凝固カスケードで活性で(vital)ある。体内での第IX因子の欠損は、血友病(B型)の型の特徴である。この疾患の処置は通常、ヒト血漿タンパク質の第IX因子濃縮物の静脈内輸血に限られている。しかし時間および経費の現実的な欠点に加えて、血液濃縮物の輸血にはウイルス性肝炎、後天的免疫不全症候群の伝播、または受容者に対する血栓塞栓性疾患の危険性を含む。
第IX因子はそれ自体が治療的応用に重要かつ有用な化合物であることが示されたが、組換え細胞から第IX因子を生産する現在の方法(米国特許第4,770,999号明細書)は、生成物にやや短い生物学的半減期、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能損失、同じ効果等を達成するためにより大量かつ頻繁な投与の必要性の増加をもたらす。
第IX因子の核酸アミノ酸配列は、本明細書では配列番号9および配列番号10(それぞれ図56Aおよび56B)に説明する。本発明は本明細書に説明する配列に全く限定されない。第IX因子の変異体は例えば米国特許第4,770,999号、同第5,521,070号明細書(ここでチロシンが第一位でアラニンに置換されている)、米国特許第6,037,452号(ここで第XI因子はアルキレンオキシド基に結合している)、および米国特許第6,046,380号明細書(ここで第IX因子をコードするDNAが少なくとも1つのスプライス部位で修飾されている)に記載されているように、当該技術分野で周知である。本明細書で示すように第IX因子の変異体も当該技術分野では周知であり、そして本開示はこれらの既知のまたは将来開発もしくは見いだされる変異体を包含する。
本発明の方法に従い調製された修飾第IX因子を活性を測定する方法は、上記の方法を使用して、またはさらに例えばBiggs(1972,ヒト血液凝固止血および血栓症(第1版)(Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis)、オックスフォード、ブラックウェル、サイエンティフィック、第614頁)に記載されているような1段階の活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイのような周知方法を使用して行うことができる。簡単に説明すると、本発明の方法により開発された第IX分子の生物学的活性をアッセイするために、このアッセイは等容量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、B型血友病患者から単離した第IX因子欠損血漿を用いて、当該技術分野で周知の滅菌瀉血技法、および標準として正常プール血清またはサンプルを使用して行うことができる。このアッセイでは1単位の活性を、1ミリリットルの正常プール血清に存在する量と定める。さらに正常に対して第IX因子欠損患者に由来する血漿の凝固時間を下げる第IX因子の能力に基づく生物学的活性に関するアッセイが、例えばProctor and Rapaport(1961,Amer.J.Clin.Path.36:212)に記載されているように行うことができる。
E.FSH
本発明はさらFSHを改造および/または修飾する方法を含む。ヒトの生殖機能は部分的には、共通する92アミノ酸糖タンパク質アルファサブユニットを有するが、ホルモン−特異的ベータサブユニットが異なるヘテロ二量体のヒト糖タンパク質ホルモンのファミリーにより制御されている。このファミリーには濾胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、チロトロピンまたは甲状腺−刺激ホルモン(TSH)およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を含む。ヒトFSHおよびLHは治療的に使用されて、ヒト女性において生殖に関する様々な代謝的な観点を調節する。例えば尿から部分精製されたFSHは、無排卵症候群または黄体期欠損の無排卵女性の小胞成熟を刺激するために臨床的に使用されている。黄体形成ホルモン(LH)およびFSHは、インビトロの受精のために卵胞の生育の刺激に組み合わせて使用されている。生殖サイクルにおけるFSHの役割は十分によく知られているので治療的使用が可能であるが、部分的には天然な供給源からの調製物の異質性および不純さから困難に遭遇した。
FSHはインビトロの受精およびインビボでの受精の刺激の両方に価値ある道具であるが、上述のようにその臨床的効力はタンパク質のグリコシル化の一貫性の無さから妨げられている。したがってFSHを改造する方法が生殖科学に大変有益となるのは明らかと思われる。
FSHはクローン化そして配列決定され、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本明細書でそれぞれ配列番号11および配列番号12(アルファサブユニット)およびそれぞれ配列番号13および配列番号14(ベータサブユニット)として表す(それぞれ図57Aおよび57B)。当業者には本発明が、当該技術分野で周知であるFSHの変異体のように本明細書に表す配列に限定されないと容易に考えるだろう。非限定的例として、米国特許第5,639,640号明細書は2つの異なるアミノ酸配列を含んでなるベータサブユニットを記載し、そして米国特許第5,338,835号明細書はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータサブユニットに由来する約27個のアミノ酸のさらなるアミノ酸配列を含んでなるベータサブユニットを記載する。したがって本発明は天然のまたは人の手により工作されたFSH変異体(すべて当該技術分野では周知である)を含んでなる。
原核および真核の両方の細胞中でFSHを発現するための方法は当該技術分野では周知であり、そして技術文献に豊富に記載されている(米国特許第4,840,896号、同第4,923,805号、同第5,156,957号明細書)。さらに本発明の改造されたFSH分子の生物学的活性を評価する方法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第4,589,402号明細書(ここでFSHが受精、卵の生産および妊娠率に及ぼす効果を測定する方法が、非ヒト霊長類およびヒト個体の両方について記載されている)に記載されている。
F.EPO
本発明はさらEPOを改造および/または修飾する方法を含んでなる。EPOは約34kDaの酸性糖タンパク質であり、そして3つの天然な形態で存在することができる:アルファ、ベータおよびアシアロ。アルファおよびベータ形は炭水化物成分がわずかに異なるが、同じ能力、生物学的活性および分子量を有する。アシアロ形はアルファまたはベータ形であり、末端シアル酸が除去されている。EPOは身体が健康な状態である時は血漿中に大変低濃度で存在し、ここで組織は既存の数の赤血球から十分な酸素を受容する。この正常濃度は通常は加齢を通して失われる赤血球細胞の代替を刺激するために十分である。循環中のエリトロポエチンの量は、循環中の血液細胞による酸素輸送が低下する時の低酸素の条件下で増加する。低酸素は出血による大量の血液損失、照射に過剰暴露された赤血球細胞の破壊、高山病または長期の意識不明による酸素取り込みの低下、または様々な状態の貧血によるより引き起こされ得る。したがってEPOは、照射療法後の赤血球細胞の補充、貧血および他の生命を脅かす状態に有用な化合物である。
種々の疾患および障害から回復することを目的とするEPOの重要性に鑑みて、本発明は天然な、したがってより効果的なサッカリド成分を持つEPOの生産に有用である。現在合成されているようにEPOは完全なグリコシル化補体を欠くので、したがって体内でのその短い半減期により、より頻繁に、そしてより高用量で投与されなければならない。
EPOはクローン化そして配列決定され、そしてヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本明細書でそれぞれ配列番号15および配列番号16に表す(それぞれ図58Aおよび58B)。当業者には本明細書で説明する配列がEPOをコードし、そして含んでなる配列の単なる一例であると容易に理解するだろう。例として、米国特許第6,187,564号明細書は2以上のEPOペプチドのアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質を記載し、米国特許第6,048,971号および同第5,614,184号明細書は、101、103、104および108位でアミノ酸置換を有する突然変異体EPO分子を記載する。
米国特許第5,106,954号明細書は短縮化されたEPO分子を記載し、そして米国特許第5,888,772号明細書は33、139および166位に置換を持つEPO類似体を記載する。したがって当業者は本発明が技術文献および当該技術分野で十分に記載されたEPOおよびEPO誘導体および変異体を全部、包含すると認識するだろう。
さらに細胞中でEPOを発現する方法は当該技術分野で周知である。とりわけ米国特許第4,703,008号、同第5,688,679号および同第6,376,218号明細書に例示されるように、EPOは原核および真核発現系で発現することができる。EPOの生物学的活性を測定する方法も、等しく当該技術分野では周知である。例としてKrystalアッセイ(Krystal,1983,Exp.Hematol.11:649−660)を使用して、本発明の方法に従い調製したEPOの活性を測定することができる。簡単に説明すると、アッセイはエリトロポエチンが完全なマウス脾臓細胞に及ぼす効果を測定する。マウスはエリトロポエチン−反応性赤血球細胞の子孫細胞の生産を刺激するために、フェニルヒドラジンで処置される。処置後、脾臓を摘出し、完全な脾臓細胞を単離し、そして様々な量の野生型エリトロポエチンまたは本明細書に記載するエリトロポエチンタンパク質とインキューベーションする。一晩インキューベーションした後、H−チミジンを加え、そして細胞内DNAの取り込みを測定する。H−チミジンの取り込み量は、エリトロポエチンと細胞レセプターとの間の相互作用を介してエリトロポエチンが刺激する血液細胞生産の指標である。本発明のエリトロポエチンのタンパク質濃度ならびに野生型エリトロポエチンの濃度は、当該技術分野で周知の競合的ラジオイムノアッセイ法により定量される。比活性は、ラジオイムノアッセイにより免疫沈降可能なタンパク質として測定された時、ミリグラムで除算されたKrystalアッセイで測定した国際単位として算出する。
G.GM−CSF
本発明はGM−CSFを修飾する方法を包含する。GM−CSFは活性化T−細胞、マクロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイトカインとして当該技術分野では周知である。GM−CSFは主に骨髄に作用して炎症性白血球の生産を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費される好中球の補充を開始する。さらにGM−CSFはマクロファージ活性化因子であり、そしてランゲルハンス細胞の樹状細胞への分化を促進する。G−CSFと同様に、GM−CSFは化学療法後の骨髄代用にも臨床的応用を有する。
G−CSFはそれ自体が治療的応用に重要でしかも有用な化合物であると示されてきたが、組換え細胞からのG−CSFを生産するための現在の方法は比較的短い生物学的寿命、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の損失を有する生成物、および同じ効果等を達成するためにより大量およびより頻繁な投与の両方の必要性の増加をもたらす。
GM−CSFは単離そしてクローン化され、その核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号17および配列番号18(それぞれ図59Aおよび59B)に示す。本発明はGM−CSF、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するGM−CSFの能力に関係するように修飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の技術をもってすれば、本発明がGM−CSFを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理解するだろう。
本発明はさらに当該技術分野で周知なGM−CSF変異体を包含する。例として、しかし本発明を限定することは全く意味せずにGM−CSF変異体はすでに国際公開第86/06358号パンフレットに記載され、ここでタンパク質は選択的な(alternative)4次構造に修飾されている。さらに米国特許第6,287,557号明細書は、遺伝子治療の応用のためにヘルペスウイルスのゲノムに連結されたGM−CSFの核酸配列を記載する。さらに欧州特許出願公開第0288809号明細書(国際公開第87/02060号パンフレットに対応する)は、IL−2およびGM−CSFを含んでなる融合タンパク質を報告する。IL−2配列は、融合タンパク質の酸開裂後に、N−またはC−末端配列修飾のいずれかを有するGM−CSFが生成できるように、GM−CSFのN−またはC−末端配列であることができる。したがってGM−CSF誘導体、突然変異体および変異体は当該技術分野では周知であり、そして本発明の方法の中に包含される。
本発明の修飾されたGM−CSF分子の発現および活性は、当該技術分野で周知な、そして例えば米国特許第4,810,643号明細書に記載されているような方法を使用してアッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジン取り込みアッセイを使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄をFicoll−Hypaqueでの密度カットに供し(1.077g/ml、ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)、そして低密度細胞を、10%ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を含むIscoveの培地(ギブコ、ラジョラ、カリフォルニア州)に懸濁する。約2X10個のヒト骨髄細胞を対照培地またはGM−CSFまたは本発明のいずれかと、96−ウェル平底プレート中で約37℃で空気中5%COで約2日間、インキューベーションする。次いでカルチャーは約4時間、0.5μCi/ウェルのH−チミジン(ニューイングランドヌクレアー、ボストン、マサチューセッツ州)でパルスをかけ、そして取り込みを例えばVentua,et al.(1983,Blood 61:781)に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比べて、H−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性な、そして活力のあるGM−CSF化合物の指標である。
H.IFN−ガンマ
IFN−ガンマを修飾および/または改造する方法を包含することは、本発明の目的である。IFN−ガンマはII型インターフェロンとしても知られているが、IFNアルファおよびIFNベータとは対照的に、約21〜24kDaの2つのサブユニットを含んでなるホモ二量体糖タンパク質である。サイズの変動は、当該技術分野で知られている種々の発現系で組換え的に再生した時、通常は複製しない可変性のグリコシル化パターンによるものである。IFN−ガンマはマクロファージの有力なアクチベーターであり、MHCクラスI分子の発現、そして程度は低いがMHCクラスII分子刺激物を上昇させる。さらにIFN−ガンマはT−細胞の分化およびB−細胞中でのアイソタイプスイッチを促進する。IFN−ガンマはまた好中球、NK細胞、および食細胞が媒介する排除を導く抗体応答の刺激物としてもよく知られている。IFN−ガンマは、結核症およびリーシュマニアのような細胞内病原体による感染と関連して使用される処置として、および種々の癌および他の新形成のような、顕著な特徴として異常な細胞増殖を伴う状態に有用な抗−増殖性治療剤としても提案された。
IFN−ガンマは有力な免疫学的活性が証明されたが、IFN−ガンマを発現するために現在使用されている系に由来するグリコシル化の変動により、治療薬の能力、効力、生物学的半減期、および他の重要な因子は最善の状態では可変的である。本発明はこの重要な欠点を正す方法を包含する。
IFN−ガンマのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書ではそれぞれ配列番号19および配列番号20に示す(それぞれ図60Aおよび60B)。本明細書で説明する配列は、本発明を限定するものでは全くないことは容易に理解される。対照的にIFN−ガンマの変異体、誘導体および突然変異体は当業者には周知である。例として米国特許第6,083,724号明細書は、組換えトリIFN−ガンマを記載し、そして米国特許第5,770,191号明細書は、ヒトIFN−ガンマのC−末端変異体を記載する。さらに米国特許第4,758,656号明細書は新規IFN−ガンマ誘導体および種々の発現系でそれらを合成する方法を記載する。したがって本発明は本明細書のいたるところに開示するIFN−ガンマの配列に限定されず、当該技術分野で周知なすべての誘導体、変異体、突然変異体等を包含する。
IFN−ガンマの発現系も等しく当該技術分野では周知であり、そして原核および真核系、ならびに植物および昆虫細胞調製物を含み、その方法は当業者に知られている。例として米国特許第4,758,656号明細書は大腸菌(E.coli)でIFN−ガンマ誘導体を発現させる系を記載し、一方米国特許第4,889,803号明細書はチャイニーズハムスター卵巣細胞およびSV40プロモーターを使用する発現系を記載する。
本明細書に開示された方法に従い調製されたIFN−ガンマの生物学的活性のアッセイは、当業者には周知である。IFN−ガンマ発現の生物学的アッセイは、例えば米国特許第5,807,774号明細書に見いだすことができる。簡単に説明すると、IFN−ガンマを、IL−3,c−kitリガンドおよびIL−1、IL−6またはG−CSFのいずれかのようなサイトカインの組み合わせにより刺激したCD34++CD38細胞(ウェルあたり100個の細胞)のカルチャーに加えて、CD34++CD38細胞の増殖を誘導する。細胞増殖および2次コロニー形成細胞の生成は用量依存的様式で大いに阻害され、5000U/ミリリットルのIFN−ガンマでほぼ完全な阻害が起こる。IFN−ガンマの阻害効果に対する確認試験として、対照としてIFN−ガンマ抗体の添加を行うことができる。
I.アルファ−プロテアーゼインヒビター(α−アンチトリプシン)
本発明はさらに、アルファ−アンチトリプシンとしても知られているアルファ−プロテアーゼインヒビター(A−I−PI、α−1−アンチトリプシンまたはα−1−トリプシンインヒビター)の改造方法を含む。A−I−PIは53kDaの分子量を有する糖タンパク質である。A−I−PIは内因性のセリンプロテアーゼによる組織破壊の制御に役割を有し、そして血漿中で最も有名なセリンプロテアーゼインヒビターである。特にA−I−PIは好中球エラスターゼを含む種々のエラスターゼを阻害する。エラスターゼは組織を破壊するプロテアーゼであり、そしてその活性が肺組織で調節されない時、特に問題を生じる。このプロテアーゼは外来タンパク質を分解することにより機能する。しかしAPIがエラスターゼ活性を調節するために十分な量で存在しない時、エラスターゼは肺組織を分解する。早晩、この平衡失調が慢性の肺組織傷害および気腫をもたらす。実際に、A−1−PIの遺伝的欠損は、肺気腫の未成熟な発生を伴うことが示された。A−1−PIの補充はこの状態の気腫の治療に成功裏に使用された。さらにA−1−PIの欠損は嚢胞性繊維症および関節炎のような他の疾患の悪化にも関与し、この場合、白血球は感染と戦うために肺または関節に移動する。
したがってA−1−PIは恐らく、インヒビターとプロテアーゼ(1つまたは複数)、特に好中球エラスターゼとの間の平衡失調が疾患状態の進行を引き起こす疾患を処置するために使用できるだろう。抗ウイルス活性もA−1−PIに起因した。この観点で本発明は論理上、肺の空気の永久的な交換に、安全で、効果的で、しかも有力であるA−1−PIの生産に有用となる。
A−1−PIはクローン化そして配列決定され、そして配列番号21および配列番号22に説明する(それぞれ図61Aおよび61B)。当業者に理解されるように、A−1−PIの天然な、および工作された変異体が存在し、そして本発明に包含される。例として米国特許第5,723,316号明細書は、356〜361位にアミノ酸置換を有し、そしてさらに約3個のアミノ酸のN−末端延長を含んでなるA−1−PI誘導体を記載する。米国特許第5,674,708号明細書は、1次アミノ酸配列の358位にアミノ酸置換を持つA−1−PI類似体を記載する。当業者は本発明が既知の、または今後見いだされるA−1−PI変異体、誘導体および突然変異体を包含すると容易に認識するだろう。
本発明の方法に従い生産された改造A−1−PI活性の発現および測定法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第5,674,708号および同第5,723,316号明細書に記載されている。簡単に説明すると生物学的活性は、例えばDelMar et al.,(1979,Anal.Biochem.99:316)に記載されているように、基質N−suc−Ala−−Ala−−Pro−−Phe−p−ニトロアニリド(90%DMSO中、0.1mlの10mM溶液)のキモトリプシンが触媒する加水分解の阻害を測定することにより、アンチキモトリプシン活性に関するアッセイを使用して測定することができる。典型的なキモトリプシンアッセイは、1.0ミリリットル中に:100mM Tris−Clバッファー、pH8.3、0.005(容量/容量)% TritonX−100、ウシ膵臓キモトリプシン(18キロモル)および本発明のA−1−PIを含む。アッセイ混合物を室温で5分間、プレ−インキューベーションし、基質(90%DMSO中、0.01mlの10mM溶液)を加え、そして残りのキモトリプシン活性を、p−ニトロアニリンの放出により生じる410nmでの吸収の変化の割合により決定する。光学的吸収の測定は、温度制御サンプル区画を備えた分光光度計を使用して25℃で行う。
J.グルコセレブロシダーゼ
本明細書に記載する本発明はさらに、グルコセレブロシダーゼを修飾する方法を含む。
グルコセレブロシダーゼは糖脂質であるグルコセレブロシドをグルコースおよびセラミドへ加水分解することを触媒するリソソームの糖タンパク質酵素である。グルコセレブロシダーゼの変異体は、Cerezyme(商標)およびCeredase(商標)として市販されており、ゴーシェ病の処置に治療薬として認可されている。Ceredase(商標)は完全なN−結合構造を有するグルコセレブロシダーゼの胎盤に由来する形態である。Cerezyme(商標)は497アミノ酸長で、CHO細胞で発現されたグルコセレブロシダーゼの組換え変異体である。Cerezymeの4N−結合グリカンはトリマンノースコアで終結するように修飾された。
グルコセレブロシダーゼは現在、組換え哺乳動物細胞培養で生産され、したがってこれらの細胞、通常、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベビーハムスター腎臓細胞のような齧歯類の細胞のグリコシル化パターンを反映し、これはヒトのグリコシル化パターンとは劇的に異なり、中でも免疫原性および能力の欠如を導く。
グルコセレブロシダーゼの核酸およびアミノ酸配列は本明細書で配列番号23および24に説明する(それぞれ図62Aおよび62B)。しかし当業者には明らかであるように、本明細書で提示する配列は原型配列であり、そして本発明を限定するものではない。実際にグルコセレブロシダーゼの変異体は周知であり、そして例えば米国特許第6,015,703号明細書に記され、これはグルコセレブロシダーゼ同族体およびその変異体の強化された生産を記載する。さらに米国特許第6,087,131号明細書は、別のグルコセレブロシダーゼ変異体のクローニングおよびシークエンシングを記載する。既知の、または将来見いだされるこれらおよび他の誘導体、変異体および突然変異体を包含することは本発明の意図するところである。
標準的な技法を使用したグルコセレブロシダーゼの発現法は周知であり、そして例えば米国特許第6,015,703号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調製されたグルコセレブロシダーゼ分子の生物学的効力のアッセイも同様に当該技術分野では周知であり、そして評価のためのマウスのゴーシェ病モデルおよびグルコセレブロシダーゼ治療薬の使用は、例えばMarshall et al.,(2002,Mol.Ther.6:179)に記載されている。
K.TPA
本発明はさらに組織−型アクチベーター(TPA)の改造方法も包含する。TPAはプラスミノーゲンを活性化して、フィブリン(血栓のタンパク質物質の主成分)を溶解するプラスミンを形成する。TPA調製物は、心筋梗塞および脳梗塞を引き起こす血栓症の血栓溶解処置において血栓に対して大変高い選択性を有する血栓溶解剤として開発された。
さらにフィブリンに対する高い親和性および天然なTPAよりも長い血液中の半減期を得る目的で、様々な修飾されたTPAが遺伝子工学により生産されてきた。原核生物から生産された修飾TPAの形態は天然のTPAとは異なりグリコシル化されていない。TPAは、一般に水に溶解することが極端に難しいタンパク質である。特に修飾されたTPAは天然なTPAよりも水に溶解することが難しく、修飾されたTPAの調製を大変難しくしている。このように修飾されたTPAは患者に投与する時に水に溶解することが難しい。しかし修飾されたTPAはフィブリンに対して上昇した親和性および血液中でのより長い半減期のような種々の利点を有する。本発明の目的は修飾されたTPAの可溶性を上昇させることである。
TPAの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号25および配列番号26として本明細書に説明する(それぞれ図63Aおよび63B)。上記のようにTPAの変異体は治療的応用に構築され、そして使用されてきた。例えば米国特許第5,770,425号明細書はフィブリンドメインの幾つか、またはすべてが削除されたTPA変異体を記載する。さらに米国特許第5,736,134号明細書は、276位のアミノ酸に対する修飾が開示されているTPAを記載する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれば、本発明が本明細書に説明するTPA配列ならびに技術文献に精通した人に周知なそれら変異体を含んでなることを容易に認識するだろう。
TPAをコードする核酸配列からのTPAの発現は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第5,753,486号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調製したTPA分子の生物学的特性を測定するアッセイも、当該技術分野では同様に周知である。簡単に説明すると、本明細書のいたるところに開示するように合成したTPA分子は、Carlsen et al.(1988,Anal.Biochem.168:428)の方法に従い、飽和濃度のプラスミノーゲンの存在下でフィブリンを溶解するそれらの能力についてアッセイすることができる。インビトロの血塊溶解アッセイは、微遠心(microcentrifugal)分析機を使用した比濁法により組織−型アクチベーターの活性を測定する。トロンビンおよびTPAの混合物をフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンの混合物中で遠心して血塊形成を開始し、そして引き続き血塊を溶解する。生成した吸収 対 時間のプロフィールを分析してアッセイの終点を決定する。TPA変異体の活性はTPAの標準曲線と比較する。アッセイを通じて使用するバッファーは、0.01(容量/容量)%TWEEN80および0.01(重量/容量)%のアジ化ナトリウムを含有する0.06Mリン酸ナトリウム、pH7.4である。ヒト トロンビンは約33単位/mlの濃度である。フィブリノーゲン(2.0mg/mlの血塊性タンパク質)を湿った氷上で冷却してフィブロネクチンを沈殿させ、そして次いで重力により濾過する。Glu−プラスミノーゲンは1mg/mlの濃度である。分析機のチャンバーの温度は37℃に設定する。ローダーは、標準曲線用のサンプルとして20マイクロリットルのTPA(約500ナノグラム/ミリリットル〜約1.5マイクログラム/ミリリットル)を、または標準曲線の範囲内で溶解を引き起こす濃度で20マイクロリットルの変異体TPAを分配するように設定する。第2試薬として20マイクロリットルのトロンビン、および1次試薬として200マイクロリットルの50:1(容量/容量)のフィブリノーゲン:プラスミノーゲン混合物。吸収/時間プログラムは5分間のインキュベーション時間、340−ナノメーターのフィルターおよび90秒間隔の読み取りで使用する。
L.IL−2
本発明はさらにIL−2を改造および修飾する方法を包含する。IL−2はTリンパ球の主要な増殖因子であり、そして細胞傷害性CD8T細胞およびNK細胞を刺激することにより液性および細胞性免疫応答を上昇させる。したがってIL−2は腫瘍およびウイルス感染に対する防御メカニズムにおいて重要である。IL−2は転移性メラノーマおよび腎腺癌に対する治療にも使用され、そして臨床試験で多くの形態の癌に使用されてきた。
さらにIL−2は、CD4カウントの有意な上昇を導くHIVに感染した患者にも使用されてきた。
IL−2が様々な癌およびAIDSのような生命を脅かす疾患の管理および処置において証明した成功を考慮すれば、本発明の方法はより長い生物学的半減期、上昇した能力、そして一般に健康なヒトで合成分泌されるような野生型のIL−2に似た治療プロフィールを有するIL−2分子を開発するために有用ということになるだろう。
IL−2はクローン化そして配列決定され、そして核酸およびアミノ酸配列を本明細書で配列番号27および配列番号28に示す(それぞれ図64Aおよび64B)。本発明は本明細書に説明するIL−2の核酸およびアミノ酸配列に限定されると全く解釈されるべきではない。IL−2の変異体は例えば米国特許第6,348,193号明細書に記載され、ここで88位のアスパラギンがアルギニンに置換され、そして米国特許第5,206,344号明細書では、種々のアミノ酸置換を持つIL−2変異体を含んでなるポリマーが記載されている。本発明はこれらのIL−2変異体および当該技術分野で周知なその他を包含する。
IL−2の発現および活性の測定法は当該技術分野で周知であり、そして例えば米国特許第5,417,970号明細書に記載されている。簡単に説明すると、IL−2またはその変異体の発現は、大腸菌(E.coli)、CHO細胞、BHK細胞、昆虫細胞を含む種々の原核および真核系の両方で、バキュロウイルス発現系を使用して行うことができ、それらすべてが当該技術分野では周知である。
本発明の方法に従い調製された修飾IL−2の活性についてのアッセイは以下のように進めることができる。末梢血リンパ球は、例えばA.Boyum et al.(Methods in Enzymology,1984,Vol.108,page88、アカデミック出版社)に記載された方法により、Ficoll−Hypaque(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージージー州)勾配での遠心により、赤血球および顆粒球から分離することができる。続いてリンパ球は、RRMI1640(ギブコ−BRL、ラジョラ、カリフォルニア州)に熱(56℃で1時間)不活性化した10%ABヒト血清(CTSパーパン(Purpan)、トゥールーズ、フランス)、2mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、4mM L−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび0.25μg/mlのアンホテリシンを加えてなる培養基(完全培地)で約3回洗浄する。
接着細胞(単核およびマクロファージ)はプラスティックに接着させることにより排除し、そして残りの細胞を完全培地にミリリットル当たり約5〜10X10細胞の濃度で懸濁し、そして平方センチメートルあたり約1〜2X10細胞の密度で培養フラスコに播種した。次いでフラスコを37℃で5%COの雰囲気中で約1時間インキューベーションし、その後、非−接着リンパ球は培養フラスコをゆるやかに撹拌した後、吸引により回収する。
非−接着リンパ球を1回洗浄し、そしてミリリットルあたり約10細胞の濃度で本発明のIL−2の存在下、完全培地中で約48時間、上記のインキューベーター中で培養する。次いで細胞を1回洗浄する。
細胞の細胞傷害活性は、Salahuddin et al.(1983,Virology 129:51−64;1984,Science:223,703−707)により記載されているように、NK細胞の細胞傷害性に対して耐性のヒトTリンパ系C8166−45/C63(HT1細胞)の標的細胞と約4時間接触させた後に評価する。6X10HT1細胞を約200μCiの51Cr(クロム酸ナトリウム、アマーシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州)で、37℃で約1時間、血清を含まない完全培地中で放射−標識し、次いで数回洗浄する。標的細胞およびエフェクティブ細胞は丸底マイクロタイタープレートに、エフェクティブ細胞 対 標的細胞の比率を変動させながら分配する(50:1、10:1、1:1)。マイクロタイタープレートを遠心し、そして上記のようにインキューベーションした後、各ウェルからの上清を回収し、そして放射性をガンマカウンターを使用して測定する。細胞傷害性は死んだ標的細胞により放出された51Crの量から決定する。非−特異的細胞傷害性は、エフェクティブ細胞の不存在下で、標的細胞から天然に放出された放射性の量から決定する。
本方法はエフェクター細胞の細胞傷害性を測定するために当該技術分野で周知な多くの方法のうちの1つであり、そして本発明を限定するとは解釈すべきではない。
M.第VIII因子
本発明はさらに第VIII因子の改造および修飾法を包含する。第VIIおよび第IX因子について前に記載したように、第VIII因子は血液凝固経路の重要な成分である。
ヒト第VIII因子(抗血友病因子;FVIII:C)は2つのペプチド(80kDaの軽鎖分子量、およびグリコシル化状態に依存して90から220kDaまで可変の重鎖分子量)からなるヒト血漿タンパク質である。これは凝固経路の必須なコファクターであり、そして第X因子がその活性状態(第Xa)因子に転換するために必要である。第VIII因子は、2050aaペプチドの二量体であるフォン ビルブラント(von Willibrand)因子(aka FVIII:RP)との非共有複合体として血漿中を循環する(米国特許第6,307,032号明細書を参照にされたい)。正常の20%未満の第VIII因子の血液濃度は、血友病Aと呼ばれる出血性障害を引き起こす。1%未満の第VIII因子の血液レべルは、重篤な出血障害を生じ、最も共通する症状である天然な関節出血を伴う。
他の血液凝固因子と同様に、第VIII因子は血友病Aおよび血友病Bのような様々な出血性障害の処置に相当有力な治療薬である。重鎖のグリコシル化により、組換え細胞から第VIII因子を調製する現在の方法は、天然な第VIII因子ほど効果的な生成物をもたらさない。ヒト血漿からの精製法は効果が低く、そして組換え第VIII因子を調製するよりも難しい粗組成物をもたらす。本発明はこの状況の改善を求める。
第VIII因子の核酸およびアミノ酸配列は、本明細書で配列番号29および配列番号30にそれぞれ表す(それぞれ図65Aおよび65B)。当該技術分野では例えば米国特許第5,668,108号明細書に記載されているように(ここで1241位のアスパラギン酸がグルタミン酸に置き換えられ、関連する核酸も変わる)、第VIII因子のおびただしい数の変異体が存在する。米国特許第5,149,637号明細書はグリコシル化されているか、または非グリコシル化のC−末端画分を含んでなる第VIII因子変異体を記載し、そして米国特許第5,661,008号明細書はアミノ酸1649〜2332に少なくとも3個のアミノ酸残基で連結したアミノ酸1〜740を含んでなる第VIII因子変異体を記載する。したがって第VIII因子の変異体、誘導体、修飾および複合体は当該技術分野では周知であり、そして本発明に包含される。
第VIII因子を生産するための発現系は当該技術分野では周知であり、そして米国特許第5,633,150号、同第5,804,420号および同第5,422,250号明細書に例示されるように原核および真核細胞を含む。
本発明の方法に従い合成された第VIII因子分子の生物学的活性を測定するために、当業者は第VII因子および第IX因子を評価するために本明細書に記載したアッセイが第VIII因子にも応用可能であることを認識するだろう。
N.ウロキナーゼ
本発明はウロキナーゼを改造および/または修飾する方法も含む。ウロキナーゼはプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するセリンプロテアーゼである。このタンパク質は内皮および腎臓を含む種々の組織中で合成され、そして尿中に微量分泌される。精製されたウロキナーゼは2つの活性形態、高分子量形(HUK:約50kDa)および低分子量形(LUK:約30kDa)で存在する。LUKはHUKから最初の135アミノ酸を放出するリシン35以降のタンパク質分解により、HUKから誘導されることが示された。HUKまたはLUKは、プロウロキナーゼと呼ばれる1本鎖前駆体の、リシン158とイソロイシン159との間のタンパク質分解的加水分解によりタンパク質分解的に活性な形に転換されて、二本鎖の活性化形(これはHUKまたはLUKをいずれかに対応し続ける)を生じるはずであるという従来の見識が維持された。この加水分解的切断から生じるタンパク質分解的に活性なウロキナーゼ種は、1つのジスルフィド結合により一緒に保持される2つのアミノ酸鎖を含む。活性化切断により形成された2つの鎖をAまたはA鎖(それぞれHUKまたはLUK)と呼び、そしてB鎖は分子のプロテアーゼドメインを含んでなる。 ウロキナーゼは効果的な血栓溶解剤であることが示されてきた。しかしこれは天然には微量でしか生産されないので、効果的な投薬用量のための酵素のコストは高い。ウロキナーゼは組換え細胞培養で生産され、そしてウロキナーゼをコードするDNAは適当なベクターおよび宿主微生物と一緒に知られている。ウロキナーゼを含んでなる現在の組成物およびウロキナーゼを組換え的に生産する方法はグリコシル化パターンが欠如した産物により阻まれ、そしてウロキナーゼの活性化を取り巻く複雑なタンパク質分解的開裂を考慮すると、この異型のグリコシル化は効果が低く、そして能力が低い生成物を導く。
ウロキナーゼの1次アミノ酸鎖をコードするヌクレオチドの配列を、配列番号33および配列番号34に表す(それぞれ図66Aおよび66B)。ウロキナーゼの変異体は当該技術分野では周知であり、したがって本発明は本明細書に説明する配列に限定されない。
実際に当業者は例えば米国特許第5,219,569号、同第5,648,253号および同第4,892,826号明細書に記載されているウロキナーゼ変異体が機能的部分として存在し、したがって本明細書に包含されることを容易に認識するだろう。
本発明の方法に従い調製されたウロキナーゼ分子の発現および評価は、同様に当該技術分野では周知である。非限定的な例として、様々な系でのウロキナーゼの発現が米国特許第5,219,569号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調製されたウロキナーゼの活性および機能性を測定するためアッセイは本明細書で説明され、そして技術文献を通して記載され、そしていたるところにあまねく記載されている他のプラスミノーゲンのアッセイおよびフィブリン関連アッセイに類似している。本明細書に記載するように合成したウロキナーゼ分子の活性を測定するためのアッセイの1例は、例えば1.25%アガロース、4.1mg/mlヒトフィブリノーゲン、0.3単位/mlのトロンビンおよび0.5μg/mlのダイズトリプシンインヒビターを含んでなるフィブリンプレートを使用するPloug,et al.(1957,Biochim.Biophys.Acta24:278−282)に記載されているアッセイであることができる。
O.ヒトDNase
本発明はさらに組換えヒトDNaseを改造および/または修飾する方法を包含する。
ヒトDNaseIは治療薬として試験され、そしてインビトロで嚢胞性線維症の粘液の粘度を低下させることが示された。化膿した粘液は約10〜13mg/mlのDNAを含むと測定され、イオン性ポリマーが気道流体の流動学的特性に影響を及ぼすと予想された。
したがってウシ膵臓DNaseI(DNAを分解する酵素)が粘液溶解剤として何年も前に試験されたが、抗原性および/または混入プロテアーゼにより誘導される副作用から臨床的実施には入らなかった。組換えヒトDNaseは現在、嚢胞性線維症のような疾患の症状を緩和するために治療薬として使用されている。
ウシ起源のDNaseと同様に、組換えヒトDNaseには幾つかの困った問題をかかえ、ほとんどが現在使用されている哺乳動物発現系により伝えられた不適切なグリコシル化により低下した効力による。本発明はDNaseを改造する方法を記載し、上昇した効力およびより良い治療的結果を導く。
ヒトDNaseのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書では配列番号39および配列番号40に提示する(それぞれ図67Aおよび図67B)。DNaseを含んでなるペプチドの変異体は当該技術分野では周知である。例として米国特許第6,348,343号明細書は1次構造全体にわたり多数のアミノ酸置換を持つヒトDNaseを記載する。さらに米国特許第6,391,607号明細書は9、14、74、75および205位に多数のアミノ酸置換を持つDNaseの超活性変異体を記載する。この例および当該技術分野で他の周知の変異体、または将来見いだされる変異体は本発明に包含する。
DNaseペプチドを生産するための発現系は当業者には周知であり、そして原核および真核系で記載された。例えばPCT特許出願、国際公開第90/07572号パンフレットはかなり詳細にこれらの方法を記載する。
本発明の方法に従い開発したDNase分子の生物学的活性を測定するアッセイは、当該技術分野で周知である。例として、しかし本発明を限定するとは全く意味せずに、ヒトDNaseIのDNA−加水分解活性を測定するアッセイを本明細書に提示する。簡単に説明すると、2種類のプラスミド消化アッセイを使用する。第1アッセイ(「スーパーコイル化DNA消化アッセイ」)は、スーパーコイル化二本鎖プラスミドDNAの、弛緩した(ニック入り)、線状および分解形への転換を測定する。第2アッセイ(「線状DNA消化アッセイ」)は、線状の二本鎖プラスミドDNAの分解形への転換を測定した。具体的には、本発明の方法に従い調製したDNaseを、25mM HEPES、pH7.1、100μg/mlウシ血清アルブミン、1mM MgCl、2.5mM CaCl、150mM NaCl中に、25マイクログラム/ミリリットルのスーパーコイル化プラスミドDNAまたはEcoR −消化線状化プラスミドDNAのいずれかを含んでなる160マイクロリットルの溶液に加え、そしてサンプルを室温でインキューベーションする。様々な時間で、反応混合物のアリコートを取り出し、そして25mM EDTAをキシレンシアノール、ブロモフェノールブルーおよびグリセロールと一緒に加えることにより止める。止めたサンプル中のプラスミドDNAの完全性はアガロースゲルでのサンプルの電気泳動により分析する。電気泳動後、ゲルはエチジウムブロミドの溶液で染色し、そしてゲル中のDNAを紫外線光により視覚化する。スーパーコイル形、弛緩形および線形のプラスミドDNAの相対的量は、ゲルを蛍光造影機で走査し(モレキュラーダイナミックス(Molecular Dynamics)モデル575FluorImager)、そしてゲルのバンド中の異なる状態に対応するDNA量を定量することにより決定する。
P.インスリン
本発明はさらにインスリンの改造方法を含む。インスリンは、血中グルコースレベルを調節するために膵臓のベータ小島細胞がインスリンを生産しないI型糖尿病に最も効果的な処置であることは周知である。糖尿病の系統および非制御血中グルコースには、循環器系および足の問題、および失明、挙げることはしないが糖尿病の悪化からもたらされるか、または悪化のいずれかである他の様々な合併症を含む。
ヒトインスリンのクローニングおよびシークエンシング以前は、ブタのインスリンが糖尿病の処置に使用された。インスリンは今では組換え的に生産されているが、成熟分子の短い、51アミノ酸配列は多数のスルフィド結合を含んでなる複雑な構造である。インスリンを組換え的に生産する現在の方法は、健康な非−糖尿病個体で生産されるような天然なタンパク質との類似性を欠く生成物を生じる。本発明はこの弱点を修復することを試みる。
ヒトインスリンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号43および配列番号44に描かれている(それぞれ図68Aおよび68B)。インスリンの変異体は当該技術分野を通して豊富に存在する。米国特許第6,337,194号明細書はインスリン融合タンパク質同族体を記載し、米国特許第6,323,311号明細書はジカルボン酸の環式無水物を含んでなるインスリン誘導体を記載し、そして米国特許第6,251,856号明細書は多数のアミノ酸置換および親油性基を含んでなるインスリン誘導体を記載する。当業者はインスリン誘導体の以下の例が網羅的では全くなく、単に当該技術分野で周知な誘導体の小さい実例を表すだけであると認識するだろう。したがって本発明は既知のおよびこれから見いだされるインスリン誘導体を含んでなる。
インスリンを生産するための発現系は当該技術分野では周知であり、そして例えばSambrook et al.(1989、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)に記載されているような分子生物学的技法を使用して行うことができる。
本発明の方法に従い調製されたインスリン分子の機能性を測定するアッセイも、当該技術分野では周知である。例えばグルコース抑制のインビボモデルは、本発明の方法を使用して合成されたインスリンの生物学的活性を評価するために使用することができる。この目的に有用であるのはラットモデルである。動物は実験前に一晩絶食させ(16時間)、次いでペントバルビタールナトリウムまたはケタミンのような他の適当な麻酔剤を腹腔内投与することにより麻酔をかける。各動物は特定のインスリン誘導体(20μg/ml/kg)のi.v.注射(尾の静脈)を受ける。血液サンプルは頸静脈から注射の15および5分前、および注射から15、30、60、90、120、180および240分後に採血する。血中グルコースレベルは、種々の商業的提供源から入手可能な血液グルコースモニターで測定する。
Q.B型肝炎ワクチン(HBsAg)
本発明はさらにB型肝炎ワクチン(HbsAgまたはB型肝炎sAg)で使用する抗原を改造する方法を含んでなる。HBsAgはB型肝炎S−タンパク質の組換え的に生産される表面抗原であり、そしてB型肝炎ウイルス(とりわけ肝硬変および癌腫を含む肝臓疾患を引き起こす危険なウイルスを増やし、そして世界中で年間に百万人以上の死をもたらす)に対する免疫応答を誘導するために使用される。現在HBsAgワクチンは防御および中和免疫応答を誘導するために、6カ月間の間隔で3回投与される。
現在、HBsAgは酵母株で生産され、したがって真菌に天然なグリコシル化パターンを反映する。本発明はHBsAgを改造するための方法を提供し、とりわけ改善された免疫原性、ウイルスに対して改善された親和性を有する抗体等をもたらす。
B型肝炎ウイルス(HBsAg)に由来するS−タンパク質の核酸および1次アミノ酸鎖配列は、本明細書中に配列番号45および配列番号46として説明する(それぞれ図69Aおよび69B)。ヌクレオチドは1203塩基長である。アミノ酸は400残基長である。最後の226アミノ酸残基は小さいS−抗原であり、これはグラクソスミスクライン(GlaxoSmithKline)のワクチンおよびメルク(Merck)のワクチンに使用されている。小さいS−抗原から上流の55個のアミノ酸はプレ−S出発コドンである。プレS+S領域は中央S抗原であり、これはアベンティス パスツール(Aventis Pasteur)のワクチンに使用されている。第1出発コドンからプレ−S出発コドンまでは残りのS−タンパク質を含んでなり、そして大きいS−タンパク質と呼ばれている。これはワクチンに使用されているHBsAgの1例であるが、GenBank Acc No.に例示されているように他のサブタイプも周知である:AF415222、AF415221、AF415220およびAF415219。本明細書に提示された配列は単に当該技術分野で知られているHBsAgの例である。同様な抗原がB型肝炎ウイルスの他の株から単離され、そしてワクチン候補として抗原性および能力を評価されたかもしれないし、またはされなかったかもしれない。したがって本発明は既知の、または今後見いだされるB型肝炎ワクチンS−タンパク質表面抗原を包含する。
発現系でのHBsAgの発現は当業者には日常的な手順であり、そして例えば米国特許第5,851,823号明細書に記載されている。ワクチンの免疫原性に関するアッセイは当該技術分野では周知であり、そして中和抗体を生産するための種々の試験を含んでなり、そしてELISA、中和アッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降等のような技法を使用する。簡単に説明すると、効果的な抗−HBsAg抗体を検出するためのサンドイッチELISAが記載されている。Enzygnost HBsAgアッセイ(アベンティス ベーリング(Behring)、キングオブプルシア、ペンシルバニア州)をそのような方法に使用する。ウェルは抗−HBsでコートされる。血清血漿または精製したタンパク質および適切な対照をウェルに加え、そしてインキューベーションする。洗浄後、HBsAgに対するペルオキシダーゼ−標識抗体を残りの抗原決定基と反応させる。非結合酵素−結合抗体を洗浄により除き、そして固体相上の酵素活性を当該技術分野で周知な方法により測定する。過酸化水素および発色源の酵素的に触媒される反応は、希釈した硫酸を加えることにより止める。色の強度はサンプルのHBsAg濃度に比例し、そして未知のサンプルの色の強度は、付随する負および正の対照血清の色の強度と分光的に比較することにより得られる。
R.ヒト成長ホルモン
本発明はさらにヒト成長ホルモン(HGH)の改造方法を包含する。ヒト下垂体で分泌されるHGHのアイソフォームは、191個のアミノ酸からなり、そして約21,500の分子量を有する。胎盤で作られるHGHのアイソフォームはグリコシル化形である。HGHは、とりわけ一次成長(linear growth)(体細胞発生)、哺乳期、マクロファージの活性化およびインスリン−様および糖尿病原性効果を含む正常なヒトの成長および発生の調節に大いに関与している。
HGHは複雑なホルモンであり、そしてその効果は種々の細胞レセプターとの相互作用の結果として変動する。HGHを含んでなる組成物は臨床的な状況、特に萎縮発育症で使用されてきたが、効力は組換え的に生産されるHGHのグリコシル化構造により制限されている。
HGHの核酸およびアミノ酸配列は、本明細書で配列番号47および配列番号48としていたるところに説明する(それぞれ図70Aおよび70B)。当業者はHGHの変異体、誘導体および突然変異体が周知であることを認識している。例は10、14、18、21、167、171、174、176および179位のアミノ酸残基が置換されている米国特許第6,143,523号明細書に見いだすことができ、そして米国特許第5,962,411号明細書はHGHのスプライス変異体を記載する。本発明は、当該技術分野で知られている、またはこれから見いだされるこのようなHGH変異体を包含する。
組換え細胞中でのHGHの発現法は、例えば米国特許第5,795,745号明細書に記載されている。とりわけ原核、真核、昆虫細胞系、植物、およびインビトロ翻訳系でのHGHの発現法は、当該技術分野では周知である。
本発明の方法を使用して生産したHGH分子は、活性について当業者に知られてる様々な方法を使用してアッセイすることができる。例えば米国特許第5,734 024号明細書は、発現したHGHの生物学的機能を測定する方法を記載する。
S.抗体
本発明はさらに、キメラTNFR、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20およびキメラ抗−TNFを含む種々のキメラ抗体調製物を改造する方法を含んでなる。キメラ抗体調製物は、IgG抗体に由来するヒトのFc部分および抗原に特異的なモノクローナル抗体に由来する可変領域を含んでなる。他の調製物はレセプター、例えばヒトIgGFc部分に融合した75kDaのTNFレセプターを含んでなる。これらの分子はさらに、ヒトおよびマウスに由来する軽および重鎖を含んでなるFabフラグメントを含む。キメラTNFRは、慢性関節リウマチのような炎症性疾患の処置に有用である。キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIaは、心臓異常、血液凝固および血小板機能障害の処置に有用である。キメラ抗−HER2は胸部癌の処理として有用であり、キメラ抗−RSVは呼吸合胞体ウイルスの処理に有用であり、キメラ抗−CD20は非−ホジキンリンパ腫の処置に有用であり、そしてキメラ抗−TNFはクローン病の処置に有用である。
これらのキメラ抗体は変動する疾患の管理に有用であることが示されたが、齧歯類細胞で生産された組換えタンパク質の比較的短い半減期により、投与はかなり頻繁で、しかもかなり高用量でなければならない。キメラ抗体のほとんどがヒトであり、したがって免疫系により「自己」とみなされると同時に、それらは天然ではないグリコシル化パターン故に分解、そして破壊される。本発明はこの問題を修復し、これら新規薬剤の効力を大いに上昇させることを提案する。
抗体およびそれらの作成法
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的なエピトープに特異的な結合することができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源に由来するか、または組換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)を含む種々の形態、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体で存在することができる(Harlow et al.,1999,抗体を使用して(Using Antibodies):ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州;Harlow et al.,1989,抗体:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク;Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879−5883;Bird et al.,1988,Science242:423−426)。
本明細書で使用する用語「合成抗体」とは、例えば本明細書に記載するバクテリオファージにより発現された抗体のような組換えDNA技法を使用して作成された抗体を意味する。この用語は抗体をコードするDNA分子の合成により作成された抗体を意味すると解釈され、そしてこのDNA分子が抗体ペプチドまたは抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでDNAまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能で、しかも周知な合成DNAまたはアミノ酸配列技法を使用して得られた。
ペプチドの完全長またはペプチドフラグメントまたはペプチドに対するモノクローナル抗体は、例えばHarlow et al.(1988,抗体:ア ラボラトリーマニュアルで、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)、およびTuszynki et al.(1988,Blood,72:109−115)に記載されているような周知のモノクローナル抗体調製手順を使用して調製することができる。望ましいペプチドの量は、化学的合成技法を使用しても合成することができる。あるいは所望するペプチドをコードするDNAをクローン化し、そして大量のペプチドを作成するために適する細胞中で適当なプロモーター配列から発現させることができる。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書で参照にしたような標準的な手順を使用して、ペプチドで免疫感作したマウスから作成する。
本明細書に記載した手順を使用して得たモノクローナル抗体コードする核酸は、当該技術分野で利用可能であり、そして例えばWright et al.(1992,Critical Rev.in Immunol.12(3,4):125−168およびそこに引用されている参考文献に記載されている技術を使用してクローン化し、そして配列決定することができる。さらに本発明の抗体はWright et al.,(同上)およびそこに引用されている参考文献、およびGu et al.(1997,Thrombosis and Hematocyst 77(4):755−759)に記載されている技術を使用して「ヒト化」することができる。
ファージ抗体ライブラリーを作成するために、cDNAライブラリーを最初に細胞、例えば発現すべき所望のペプチドを、例えば所望の抗体をファージ表面に発現するハイブリドーマから単離したmRNAから得る。mRNAのcDNAコピーを逆転写酵素により生産する。免疫グロブリンフラグメントを特定するcDNAはPCRにより得、そして生成したDNAを適当なバクテリオファージベクターにクローン化して、免疫グロブリン遺伝子を特定するDNAを含んでなるバクテリオファージのDNAライブラリーを作成する。
ヘテロロガスなDNAを含んでなるバクテリオファージのライブラリーを作成する手順は当該技術分野では周知であり、そして例えばSambrook and Russell(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)に記載されている。
所望する抗体をコードするバクテリオファージは、その対応する結合ペプチド、例えば抗体が向けられる抗原に結合できる様式で、ペプチドがその表面上で表示されるように工作することができる。このように特異的な抗体を発現するバクテリオファージが対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキューベーションされる時、バクテリオファージは細胞に結合するだろう。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。そのような難しい(panning)技術は当該技術分野では周知であり、そして例えばWright et al.,(同上)に記載されている。
上記のような方法はM13バクテリオファージ表示を使用してヒト抗体を生産するために開発された(Burton et al.,1994,Adv.Immunol.57:191−280)。本質的に、cDNAライブラリーは抗体−生産細胞の1群から得たmRNAから作成する。mRNAは再配列した免疫グロブリン遺伝子をコードし、そしてすなわちcDNAはそれをコードする。増幅したcDNAをM13発現ベクターにクローン化して、表面上にヒト抗体フラグメントを発現するファージのライブラリーを作成する。問題の抗体を表示するファージは抗原の結合により選択し、そして細菌中で増殖させて可溶性のヒト免疫グロブリンを生産させる。このように従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手順はヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくヒト免疫グロブリンをコードするDNAを不滅化する。
抗体分子のグリカンの改造
ペプチドの1クラス、すなわち免疫グロブリンの特異的なグリコシル化は、これらペプチドの生物学的活性に特に重要な効果を有する。本発明はIgGクラスの免疫グロブリンのみに限定されると解釈すべきではなく、抗体のIgA、IgEおよびIgMクラスの免疫グロブリンも含むと解釈すべきである。
さらに本発明は任意の型の伝統的な抗体構造のみに限定されると解釈すべきではない。
むしろ本発明は例えば抗体のフラグメント、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等を含むすべての型の抗体分子を含むと解釈すべきである。
典型的な免疫グロブリン分子は、エフェクタータンパク質および抗原結合部分を含んでなる。免疫グロブリンの総説に関しては、;Harlow et al.,1988,抗体:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、およびHarlow et al.,1999,抗体を使用して:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州を参照にされたい。免疫グロブリン分子のエフェクター部分は分子のFc部分に存在し、そして免疫グロブリンのそのコグネイト細胞レセプターへの効率的結合に一部、寄与している。免疫グロブリン分子、特に分子のFc部分のCH2ドメイン中の不適切なグリコシル化は、免疫グロブリンの生物学的活性に影響を及ぼす。
免疫グロブリンIgGに関してさらに具体的には、IgGエフェクター機能は大部分、IgGがIgG分子のCH2ドメイン中のアスパラギン(Asn)297でN−グルカンのトリマンノシルコアの分岐マンノースの4−O位に結合したN−アセルチルグルコサミン(GlcNAc)残基を含むか否かに支配されている。この残基は「バイセクティング(bisecting)GlcNAc」として知られている。バイセクティングGlcNAcを天然なまたは組換えIgG分子もしくはIgG−Fc含有キメラ構築物のN−グリカン鎖に加える目的は、分子のFc部分のFc免疫エフェクター機能を至適化することにある。そのようなエフェクター機能には、抗体−依存性細胞傷害(ADCC)およびFcγRレセプターへの効率的結合を必要とする他の生物学的効果、および補体のC1成分への結合を含むことができる。IgG分子の最大の免疫エフェクター機能を達成するために、バイセクティングGlcNAcの重要性が記載された(Lifely et al.,1995,Glycobiology 5(8):813−822;Jeffris et al.,1990,Biochem.J.268(3):529−537)。
IgG分子のCH2ドメインのAsn297のN−グリコシル化部位に見いだされるグリカンは、ヒトおよび動物血漿中で循環中していることが分かったIgG分子、骨髄腫細胞、ハイブリドーマ細胞および種々のトランスフェクトされた不死化哺乳動物および昆虫細胞系により生産されるIgGについて構造的に特性が決定された。すべての場合でN−グリカンは高マンノース鎖または完全(Man3、GlcNAc4、Gal2、NeuAc2、Fucl)またはバイセクティングGlcNAcを持つか持たない可変性の不完全な2アンテナ鎖のいずれかである(Raju et al.,2000,Glycobiology 10(5):477−486;Jeffris et al.,1998,Immunological.Rev.163L59−76;Lerouge et al.,1998,Plant Mol.Biol.38:31−48;James et al.,1995,Biotechnology13:592−596)。
本発明はインビトロでカスタマイズされたグリコシル化免疫グロブリン分子を提供する。免疫グロブリン分子は限定するわけではないが、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等を含む任意の免疫グロブリン分子でよい。抗体分子を生成し、そしてそれらを特徴付けるための具体的方法は、本明細書のいたるところに記載する。好ましくは免疫グロブリンはIgGであり、そしてより好ましくはIgGはヒト化またはヒトIgG、最も好ましくはIgG1である。
本発明は、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)をIgG分子のCH2ドメインのAsn297でN−グリカンのトリマンノシルコアの分岐マンノースの4−O位にグリコシド結合で連結するために、インビトロの試薬としてβ1,4−マンノシル−糖ペプチドβ1,4−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、GnT−III:EC2.4.1.144を使用することを具体的に意図している。しかし本明細書に提供される開示から、本発明がバイセクティングGlcNAcを免疫グロブリン分子に提供するためにこの酵素の使用だけを含むと解釈すべきではないことは明らかである。むしろ抗体分子のグリコシル化パターンは、抗体分子が強化された生物学的活性、すなわち他の特性、例えば安定性等の強化の可能性に加えて、エフェクター機能を有するように調節することが可能であることが見いだされた。
本発明では、Fc−ガンマRIIIAへの結合を強化し、そして強化された抗体−依存性細胞傷害性を目的として、Asn(297)N−結合グリカンからフコース分子を除去する一般的方法を提供する(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277:26733−26740を参照にされたい)。この方法は抗体分子を、抗体グリカン(1つまたは複数)上のフコース分子(1つまたは複数)の結合に適当なフコシダーゼと接触させることを必要とする。あるいは組換え抗体を、CHO細胞のLec13変異体のようなフコシルトランスフェラーゼを発現する細胞で発現させることができる。抗体のグリカン(1つまたは複数)からのフコースの除去は単独で、あるいはバイセクティングGlcNAcを付加するような他のグリカン改造方法と組み合わせて行うことができる。GnT−Iを欠く細胞中での抗体の発現もコアフコースを欠いたFcグリカンを生成し、これは本発明によりさらに修飾することができる。
本発明では、CH2ドメイン中、多くはAsn297でN−結合オリゴ糖を含むIgG分子の調製物において、Fc免疫エフェクター機能を強化する目的で、バイセクティングGlcNAcの一般的導入法を提供する。この方法ではIgG分子の群は、グリカン鎖がGnT−IIIの受容体となるようなグリコシル化の状態になることが必要である。これは3つの方法の任意の1つにより達成される:1)GnT−IIIの基質であるN−グリカン鎖を持つIgGを分泌する宿主発現系の選択または遺伝子操作による;2)エキソグリコシダーゼ処理後に残るグリカン構造(1つまたは複数)がGnT−IIIの受容体となるような、IgGグリコフォーム群をエキソグリコシダーゼで処理することによる;3)上記1)および2)におけるような宿主選択およびエキソグリコシダーゼ処理の幾つかの組み合わせに加えて、GnT−IIIの受容体を作成するためにGnT−IおよびGnT−IIによる連続的なGlcNAcの付加。
例えばニワトリの血漿から得たIgGは主に高マンノース鎖を含有し、そしてGlcNAcをトリマンノシルコアのα1,3マンノース枝にGnT−Iにより付加するための基質を作成するためには、1以上のα−マンノシダーゼで消化する必要がある。この基質は基本的なトリマンノシルコア、Man3GlcNAc2であることができる。このコア構造をUDP−GlcNAcを糖供与体として使用して、GnT−I、続いてGnT−II、続いてGnT−IIIで順次処理することにより、図2に示すようなMan3GlcNAc5を生成する。場合によりこの構造はβ1,4ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた処理により延長することができる。必要ならばガラクトシル化オリゴ糖は、α2,3−またはα2,6−シアリルトランスフェラーゼを用いてさらに延長して、完全な2アンテナ状構造を達成することができる。この方法を使用して、2アンテナ状グリカン鎖は、開発中の任意の治療用IgGの最適なFc免疫エフェクター機能に必要性であるように改造することができる(図4)。
あるいはほとんどの動物の血漿中に見いだされるIgG分子、またはほとんどの動物細胞によるもしくはトランスジェニック動物による組換え産物として分泌されるIgGは、多くは完全な(NeuAc2、Gal2、GlcNAc4、Man3、±Fucl)(図4)およびバイセクティングGlcNAcを含むかまたは含まない変動性の不完全な形態を含む2アンテナ状グリコフォームのスペクトルを含む(Raju et al.,2000,Glycobiology 10(5):477−486;Jeffris et al.,1998,Immunological Rev.163:59−76)。バイセクティングGlcNAcがそのように生産された免疫グロブリン分子の群全体に存在することを確実とするために、分子の混合物を以下のエキソグリコシダーゼと連続的に、または混合物で処理することができる:ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ。生成したトリマンノシルコアは次いで上記のようにグリコシルトランスフェラーゼを使用して改造することができる。
さらにトランスジェニック動物により分泌されるか、またはトランスジェニック植物により「植物体」として貯蔵されるIgGを特性決定した。β1,2結合キシロースおよび/またはα1,3結合フコースを含むN−グリカンを有するトランスジェニック植物中で生産されるIgG分子は、トリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を作成するために上記エキソグリコシダーゼに加えて、エキソグリコシダーゼで処理してそれら残基を除去することができ、次いでそれらをグリコシルトランスフェラーゼで処理して上記のようにN−グリカンを改造する。
本発明の主な新規観点は、事前のエキソグリコシダーゼ処理を含むか、または含まずに、抗体のエフェクター機能を至適化するために正しい順序で適用される、適切なグリコシルトランスフェラーゼの適用である。1つの例示態様では、バイセクティングGlcNAcは、バイセクティングGlcNAcが必要なIgG分子または他のIgG−Fc−キメラ構築物のグリカンに導入される。別の例示態様では、コアフコースがIgG分子または他のIgG−Fc−キメラ構築物のグリカンから除去される。
TNFレセプター−IgG Fc融合タンパク質
75kDaのヒトTNFレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、本明細書でそれぞれ配列番号31および配列番号32として説明する(それぞれ図71Aおよび71B)。キメラ抗−HER2の軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号35および配列番号36として説明する(それぞれ図72Aおよび72B)。キメラ抗−RSVの軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号38および配列番号37として説明する(それぞれ図73Aおよび73B)。抗−TNFの非−ヒト可変領域のアミノ酸配列を、本明細書中でそれぞれ配列番号41および配列番号42として説明する(それぞれ図74Aおよび74B)。ヒトIgGのFc部分のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号49および配列番号50として説明する(それぞれ図75Aおよび75B)。
MAb抗−糖タンパク質IIb/IIIa
マウス抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体の可変領域のアミノ酸配列を、配列番号52(マウス成熟可変軽鎖、図76)および配列番号54(マウス成熟可変重鎖、図77)で説明する。これらのマウス配列は、米国特許第5,777.085号明細書に見いだされる手順に従い、ヒトIgGアミノ酸配列の配列番号51(ヒト成熟可変軽鎖、図78)、配列番号53(ヒト成熟可変重鎖、図79)、配列番号55(ヒト軽鎖、図80)および配列番号56(ヒト重鎖、図81)と組み合わせて、キメラヒト化マウス抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体を作成することができる。他の抗−糖タンパク質IIb/IIIaヒト化抗体は、米国特許第5,877,006号明細書に見いだされる。抗−糖タンパク質IIb/IIIa MAb 7E3を発現する細胞系は、ATCC(マナッサス、バージニア州)から寄託番号HB−8832で商業的に得ることができる。
MAb抗−CD20
キメラ抗−CD20抗体の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号59(マウス可変領域軽鎖の核酸配列、図82A)、配列番号60(マウス可変領域軽鎖のアミノ酸配列、図82B)、配列番号61(マウス可変領域重鎖の核酸配列、図83A)および配列番号62(マウス可変領域重鎖のアミノ酸配列、図83B)に説明する。マウス抗体をヒト化するために、ヒトIgG重および軽定常ドメインを含むTCAE8(配列番号57、図84A−84E)を都合よく使用することができる。上記マウス可変領域コードDNAを、米国特許第5,736,137号明細書に与えられた使用説明に従いTCAE8ベクターにクローニングすることにより、哺乳動物細胞系で形質転換した時、キメラ抗−CD20抗体を発現するベクターが作成される(配列番号58、図85A−85E)。他のヒト化抗−CD20抗体は、米国特許第6,120,767号明細書に見いだされる。抗−CD20MAb C273を発現する細胞系は、ATCC(マナッサス、バージニア州)から寄託番号HB−9303で商業的に得ることができる。
当業者は本明細書中で説明する配列が網羅的ではなく、むしろ可変領域、レセプターおよび他のキメラ抗体の結合部分の例であると直ちに考えるだろう。さらにキメラまたは「ヒト化」抗体を構築するための方法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第6,329,511号および同第6,210,671号明細書に記載されている。本開示および当該技術分野を通して周知な方法と組み合わせて、当業者は本発明が本明細書に開示した配列に限定されないことを認識するだろう。
キメラ抗体の発現は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特許第6,329,511号明細書に詳細に記載されている。発現系は原核、真核等であることができる。
さらにバキュロウイルス発現系を使用した昆虫細胞でのキメラ抗体の発現が、Putlitz et al.(1990.Bio/Technology 8:651−654)に記載されている。したがって融合またはキメラタンパク質をコードする核酸の発現法は当該技術分野では周知であり、そして例えばSambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)およびAusubel et al.(1997、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)に記載されている。
本発明の方法に従い生産されたキメラ抗体の機能および生物学的活性の測定は、当業者には同様に基本的操作である。競合アッセイによる抗体の親和性を決定する方法は、Berzofsky(J.A.Berzofsky and I.J.Berkower、1984、基本的免疫学(Fundamental Immunology)、(W.E.Paul編集)、ラベン(Raven)出版(ニューヨーク)、595)に詳細に記載されている。簡単に説明すると、キメラ抗体の親和性はそれが由来するモノクローナル抗体の親和性と、放射−ヨード化モノクローナル抗体を使用して比較する。
VII.製薬学的組成物
別の観点では、本発明は製薬学的組成物を提供する。製薬学的組成物には、製薬学的に許容され得る希釈剤および天然には存在しない、水溶性ポリマー、治療部分または生体分子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合物を含む。ポリマー、治療部分または生体分子は、ペプチドとポリマー、治療部分または生体分子との間に挿入され、そして両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合される。
本発明の製薬学的組成物は様々な薬剤送達系での使用に適している。本発明での使用に適する製剤は、レミングトンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Science)、メース(Mace)出版社、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、第17版、(1985)に見いだせる。薬剤送達に関する方法の簡単な総説については、Langer,Science249:1527−1533(1990)を参照にされたい。
製薬学的組成物は、例えば局所、経口、鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内を含む任意の適切な投与様式に配合することができる。皮下注射のような非経口投与には、担体は好ましくは水、塩水、アルコール、脂肪、蝋またはバッファーを含んでなる。
経口投与には任意の上記の担体またはマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロースおよび炭酸マグネシウムのような固体担体を使用することができる。生分解性微小球(例えばポリラクテートポリグリコレート)を本発明の製薬学的組成物に担体として使用することもできる。適当な生分解性微小球は、例えば米国特許第4,897,268号および同第5,075,109号明細書に開示されている。
一般に製薬学的組成物は非経口的、例えば静脈内に投与される。すなわち本発明は許容されうる担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝化水、塩水、PBS等に溶解または懸濁された化合物を含んでなる非経口投与用の組成物を提供する。組成物はpH調整および緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等のような生理学的状態に近づけるため必要な製薬学的に許容され得る補助物質を含むことができる。
これらの組成物は通例の滅菌技術により滅菌することができ、または滅菌濾過してもよい。生成した水溶液はそのまま使用するために包装されることができ、または凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は滅菌水性担体と投与前に合わせられる。調製物のpHは典型的には3から11の間、より好ましくは5から9、そして最も好ましくは7から8である。
幾つかの態様では、本発明のペプチドは標準的な小胞−形成脂質から形成されたリポソームに包含することができる。様々な方法が、例えばSzoka et al.,Ann.Rev.Biopys.Bioeng.9:467(1980)、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号および同第4,837,028号明細書に記載されているようにリポソームを調製するために利用可能である。様々な標的化剤(例えば本発明のシアリルガラクトシド)を使用したリポソームの標的化は当該技術分野で周知である(例えば米国特許第4,957,773号および同第4,603,044号明細書を参照にされたい)。
標的化剤をリポソームにカップリングする標準的な方法を使用することができる。これらの方法は一般に、標的化剤の結合を活性化することができるホスファチジルエタノールアミンのような脂質成分、または本発明の脂質−誘導化ペプチドのような誘導化された親油性化合物のリポソームへの包含が関与する。
標的化メカニズムは一般に、標的部分が標的、例えば細胞表面レセプターとの相互作用に利用できるような様式で、標的化剤をリポソームの表面上に配置することが必要である。本発明の炭水化物は当業者に既知の方法(例えば炭水化物上に存在するヒドロキシル基の、長鎖アルキルハライドまたは脂肪酸を用いたそれぞれアルキル化またはアシル化)を使用して、リポソームが形成される前に脂質分子に結合することができる。あるいはリポソームはコネクター部分を最初に、膜を形成する時点で膜に包含させるような様式に工夫することができる。コネクター部分は親油性部分を持たなければならず、コネクター部分は膜中に堅く包埋され、そしてしっかり固定される。これはまた反応性部分を持たなければならず、反応性部分はリポソームの水性表面上で化学的に利用可能である。反応性部分はこれが安定な化学結合を後に加える標的化剤または炭水化物と形成するために、化学的に適するように選択される。場合により標的剤をコネクター分子に直接付けることも可能であるが、ほとんどの場合で化学的ブリッジとして作用するための第3分子を使用することが適当であり、すなわち膜中にあるコネクター分子を、3次元的に小胞表面から離れて伸びる標的剤または炭水化物に連結する。本発明のペプチドの投与の投薬範囲は、免疫応答の症状がある程度の抑制を示す、所望する効果を生じるために十分に多い量である。投薬用量は副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に投薬用量は動物の年齢、状態、性別および疾患の程度で変動し、そして当業者により決定され得る。投薬用量は反対の徴候の出来事で、個々の医師により調整されることができる。
さらなる製薬学的方法を使用して、作用期間を制御することができる。放出制御調製物は、結合物に対するポリマーの使用、複合体、またはペプチドの吸収により達成することができる。制御された送達は、適当な高分子(例えばポリエステル、ポリアミノカルボキシメチルセルロースおよび硫酸プロタミン)および高分子の濃度ならびに放出を制御するための包含法を選択することにより果たすことができる。放出制御調製物により作用期間を制御するための別の可能な方法は、ペプチドをポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニル酢酸コポリマーのようなポリマー性材料の粒子に包含させることである。
ペプチドを血漿タンパク質の結合から保護するために、ペプチドはコアセルベーション法により、または界面重合法により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ(メチメタクリレート)マイクロカプセルに、あるいはコロイド状薬剤送達系、例えばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルに、またはマクロエマルジョンに封入することが好適である。そのような教示は、レミングトンの製薬科学(第16版、A.Oslo編集、マック、イーストン、ペンシルバニア州、1980)に開示されている。
本発明のペプチドは、高分子量複合体、ナノカプセル、微小球またはビーズ状の合成または天然のポリマー、および水中油型のエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび再封入赤血球(reseales erythrocyte)を含む脂質に基づく系、のような標的可能な薬剤送達系での使用によく適している。これらの系は集合的にコロイド状薬剤送達系として知られている。典型的にはそのような分散したペプチドを含有するコロイド状粒子は、直径約50nm〜2μmである。コロイド状粒子のサイズは、それらが注射によるように静脈内に、またはエーロゾルとして投与できるようにする。コロイド系の調製物に使用する材料は典型的には、濾過滅菌を介して滅菌可能な、非毒性の、生分解可能な、例えばアルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、リン脂質およびダイズ油である。ポリマー性のコロイド系はマイクロカプセル化のコアセルベーションに類似する方法により調製される。
例示態様では、ペプチドは標的化送達系として使用するリポソームの成分である。リン脂質が水性媒質にゆるやかに分散した時、それらは膨潤し、水和し、そして脂質二重層を分ける水性媒質の層を含むマルチラメラ同心二重層小胞(multilamellar concentric bilayer vesicle)を天然に形成する。そのような系は通常、多重層リポソームまたは多重層小胞(MLV)と呼ばれ、そして約100nmから約4μmの範囲の直径を有する。MLVが超音波処理される時、直径が約20〜約50nmの範囲の小1枚膜リポソーム(SUVS)が形成され、これはSUVのコアに水溶液を含む。
リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンのようなホスファチジル化合物を含む。特に有用であるのは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここで脂質部分は14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、そして飽和されている。具体的例のリン脂質には卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
本発明のペプチドを含有するリポソームの調製では、ペプチドのカプセル化効率、ペプチドの不安定性(lability)、生成されるリポソーム群の均一性およびサイズ、ペプチド−対−脂質比、調製物の浸透不安定性、および製剤の製薬学的な許容性のような変数を考慮すべきである。Szoka,et al.,Annual Review of Biophysics and Bioengineering,9:467(1980);Deamer,et al.,リポソーム(LIPOSOME)で、マルセルデッカー、ニューヨーク、1983、27:Hope et al.,Chem.Phys.Lipids,40:89(1986)。
本発明のペプチドを含有する標的化送達系は、宿主、特に哺乳動物宿主に、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、血管内、局所的、空隙内、経皮的、鼻内、および吸入のような種々の方法で投与することができる。ペプチドの濃度は特定の応用、疾患の性質、投与頻度等により変動するだろう。標的化送達系−カプセル化ペプチドは、適当な他の化合物および水性の生理学的に許容され得る媒体、例えば塩水、リン酸緩衝化生理食塩水等を含んでなる製剤で提供され得る。
本発明の方法により調製された化合物は、診断試薬としても使用を見いだすことができる。例えば標識した化合物は炎症を有することが疑われる患者の炎症または腫瘍の転移の領域を決めるために使用することができる。この使用のために、化合物は125I、14Cまたはトリチウムで標識することができる。
実験例
本発明をこれから以下の実施例を参照にして記載する。これらの実施例は具体的説明の目的のみに提供し、そして本発明がこれらの実施例に限定されるべきでは全くなく、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包含すると解釈すべきである。
A.グリコシル化
この実施例で提示するこの実験に使用する材料および方法をこれから記載する。
1.TP10のシアリル化およびフコシル化
この実施例は、シアリルルイスX部分を用いたTP10の調製および強化された生物学的活性の分析を説明する。
脳への血流を妨害することはたとえ短時間でも、大脳組織傷害を悪化させ得る大脳の微小血管内に炎症性の反応を誘発する可能性がある。天然に生じる組織傷害は、炎症および凝固カスケードの両方の活性化により増幅する。発作のマウスモデルでは、P−セレクチンおよびICAM−1の発現増加が白血球の動員(recruitment)を促進する。sCR1は補体受容体−1(CR−1)の細胞外ドメインの組換え形である。sCR−1は補体活性化の有力なインヒビターである。sCR1sLe(CD20)は、選択的に(alternately)グリコシル化されてシアリル化ルイス抗原を表示する選択的にグリコシル化されたsCR1形態である。以前は、工作されたLec11 CHO細胞中でインビボで発現され、そしてグリコシル化されたsCR−1sLeXが虚血性の大脳微小血管およびC1q−発現ニューロンに正しく局在することが見いだされ、これにより好中球および血小板の蓄積を阻害し、そして大脳の梗塞容量を減少させた(Huang et al.,1999,Science 285:595−599)。本実施例では、グリカンを改造することによりインビトロで調製されたsCR1sLeが、インビボでグリコシル化されたsCRsLeと同様の強化された生物学的活性を現した。
TP10ペプチドはDUK B11 CHO細胞で発現された。このCHO細胞系は典型的なCHO細胞のグリコシル化を有するTP10ペプチドを生産し、すべてではないが多くのグリカンがシアル酸でキャップされている。
66mgのTP10のシアリル化。TP10(2.5mg/mL)、CMPSA(5mM)およびST3Gal3(0.1U/mL)を32℃で、50mM Tris、0.15M NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、pH7.2中で48時間、インキューベーションした。放射性標識したCMPシアル酸を少量のアリコートに加えて取り込みを監視した。TP10はSEC HPLCによりヌクレオチド糖から分離した。24時間および48時間で分析したサンプルは、反応が24時間後には完了したことを示した。次いで反応混合物を凍結した。反応生成物をフルオロフォア支援炭水化物電気泳動(Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis)(FACE(商標);グリコ社、ノバト、カリフォルニア州)分析にかけた(図86)。
薬物動態学的実験。ラットは頸動脈カニューレと購入した。10mg/kgの前シアリル化または後シアリル化TP10ペプチドは、各処置で(n=3)尾の静脈注射を介して3匹のラットに与えた。14の血液サンプルを0〜50時間で採血した。血液中の後シアリル化TP10ペプチドの濃度は、前シアリル化TP10よりも0時間以降、いつも高かった(図87)。シアル酸の付加は出発原料に比べて、薬物動態学的曲線の血漿濃度−時間曲線下の面積(AUC)を二倍にした(図88)。
シアリル化TP10のフコシル化。上記シアリル化ミックスの10mL(25mgのTP10)を解凍し、そしてGDP−フコースを5mMまで、MnClを5mMまで、そしてFTVI(フコシルトランスフェラーゼ)を0.05U/mLまで加えた。反応物は32℃で48時間インキューベーションした。反応生成物をフルオロフォア支援炭水化物電気泳動((FACE(商標);グリコ社、ノバト、カリフォルニア州)分析にかけた(図89)。少量のアリコートに放射性標識したGDP−フコースを加え、取り込みを監視した。TP10はSEC HPLCによりヌクレオチド糖から分離した。24時間および48時間で分析したサンプルは、反応が24時間後には完了したことを示した。E−セレクチンへの結合を測定するインビトロアッセイは、フコースの付加が生物学的に活性なE−セレクチンリガンドを生成できることを示す(図90)。
2.組換え糖タンパク質のシアリル化
この実施例では、数種の組換えペプチドのシアリル化形態の調製を説明する。
ST3GalIIIを使用した組換え糖タンパク質のシアリル化。数種の糖タンパク質はそれらが組換えラットST3GalIIIによりシアリル化される能力について調査された。これら各々の糖タンパク質について、シアリル化は市販品としての各糖タンパク質の開発において、貴重な方法となるであろう。
反応条件。反応条件は表9にまとめた。シアリルトランスフェラーゼ反応は室温から37℃の間の温度で24時間行った。シアリル化の程度は糖タンパク質−結合オリゴ糖に取り込まれた14C−NeuAcの量を測定することにより確立した。各タンパク質に関する反応条件については表9を参照にされたい。
Figure 0006321724
「サイクル」は明細書に記載した標準的条件を使用した酵素的な「その場」でのCMP−NeuAcの生成を指す(20mM NeuAcおよび2mM CMP)。バッファーは0.1M HEPES、pH7.5であった。
表10に表す結果は、低レベルの酵素を使用したにもかかわらず、顕著な程度のシアリル化が各々の場合で達成されたことを示す。本質的に利用可能な末端ガラクトースの推定に基づき、完全なシアリル化が得られた。表10はシアリル化反応の結果を示す。様々な実験を比較する基礎として、1mgのタンパク質あたり酵素量を使用した(mU/mg)。示す幾つかの実施例では、mgのタンパク質あたりわずか7〜13mUのST3GalIIIが24時間後に本質的に完全なシアリル化を与えるために必要であった。
Figure 0006321724
供給元、または文献値(フェチュイン、アシアロ−AAAT)から決定されたN−結合オリゴ糖上の末端(露出)Gal含量。
遊離放射性標識前駆体からゲル濾過により分離した後に、14C−NeuAcの取り込みにより測定された取り込まれたNeuAc。
%Rxnは理論的な最大値として末端Gal含量に基づく反応の%完成を示す。
アンチトロンビンIII。
α1アンチトリプシン。
これらの結果は、24時間内に50mU/mg未満のタンパク質が50%未満のシアリル化を与え、そして1070mU/mgのタンパク質が約85〜90%のシアリル化を与えるウシST6Galを用いた実験で詳細に報告した結果とは顕著な対照をなす。Paulson et al.(1977)J.Biol.Chem.252:2363−2371;Paulson et al.(1978)J.Biol.Chem.253:5617−5624。別の群によるラットα2,3およびα2,6シアリルトランスフェラーゼの実験は、アシアロ−AGPの完全なシアリル化に、150〜250mU/mgタンパク質の酵素濃度が必要であることが明らかとなった(Weinstein et al.(1982)J.Biol.Chem.257:13845−13853)。これらの初期の実験と一緒にすると、ST6GalIシアリルトランスフェラーゼは、完全なシアリル化を達成するために50mU/mgより高く、そして最高150mU/mgが必要であることを示唆した。
この実施例は、ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼを使用した組換え糖タンパク質のシアリル化には予想されるよりもはるかに少ない酵素が必要であるとを示す。
1キログラムの規模の反応については、初期の実験が示した100,000〜150,000単位の代わりに約7,000単位のST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼが必要となる。天然な供給源からのこれら酵素の精製は禁じられており、1〜2カ月の作業の後の大規模調製についてわずか1〜10単位の収量である。ST6GalIおよびST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼの両方が組換えシアリルトランスフェラーゼとして生産され、2つの酵素で等レベルの発現が達成されると仮定すると、ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼに対して14〜21倍より大きな発酵規模(またはそれ以上)が、ST6GalIシアリルトランスフェラーゼでは必要となるだろう。ST6GalIシアリルトランスフェラーゼについては、酵母で0.3U/リットルの発現レベルが報告された(Borsig et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.210:14−20)。ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼの1000U/リットルの発現レベルが、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)で達成された。現行の発現レベルで、ST6GalIシアリルトランスフェラーゼを使用して1kgの糖タンパク質をシアリル化するために十分な酵素を生産するためには、300〜450,000リットルの酵母の発酵が必要である。対照的にアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)の10リットル未満の発酵が、ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼを使用した1kgの糖タンパク質のシアリル化には必要となるだろう。このように大規模シアリル化反応のためのST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼを生産するために必要とされる発酵能力は、ST6Galを生産するために必要とされるものより10〜100倍低くなるだろう;シアリルトランスフェラーゼの生産コストは比例して減少するだろう。
3.シアリルルイスXを作成するためのフコシル化
この実施例は、N−結合シアリルルイスX抗原を持つ組織組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)の調製を説明する。
シアリル化。哺乳動物細胞で発現したTPAは、ほとんどがシアル酸で終わるグリカンを含むことが多いが、完全なシアリル化を確実にするために、最初にインビトロでシアリル化を行うことが有利である。適当なバッファー(最も好ましくはpH5.5から9の間、例えばTris緩衝化塩溶液、pH7.2)中のTPAを、CMPシアル酸およびシアリルトランスフェラーゼと、シアル酸を欠く任意のグリカンがシアリル化された種に転換するために十分な時間、インキューベーションする。典型的な条件は1mg/mL TPA、3mM CMPシアル酸、0.02U/mLST3Gal3、32℃で24時間となるだろう。微生物の成長は滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含するどちらかにより止めることができる。TPA濃度は最も好ましくは0.1mg/mLからペプチドの溶解限界の範囲である。CMP−SAの濃度も、利用可能な部位を越えて過剰にあるように十分となるべきであり、そして50μMから50mMまでの範囲、そして2℃から40℃までの温度となるだろう。完全な反応に必要な時間は温度、受容体基質に対する酵素の相対的量、供与体基質濃度、およびpHに依存するだろう。2,3結合でシアル酸を加えることができる他のシアリルトランスフェラーゼにはST3Gal4を含み;微生物トランスフェラーゼも使用することができる。
フコシル化。フコシル化の典型的な条件は、1mg/mL TPA、3mM GDP−フコース、0.02U/mL FTVI、5mM MnCl、32℃で24時間、Tris緩衝化塩中となるだろう。微生物の成長は滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含することにより抑えることができる。TPA濃度は最も好ましくは0.1mg/mLからペプチドの溶解限界の範囲である。GDP−フコースの濃度も、利用可能な部位を越えて過剰にあるように十分となるべきであり、そして50μMから50mMまでの範囲、そして2℃から40℃までの温度となるだろう。完全な反応に必要な時間は温度、受容体基質に対する酵素の相対的量、供与体基質濃度、およびpHに依存するだろう。シアリルルイスxを作成することができる他のフコシルトランスフェラーゼにはFIVII 、FTV、FTIIIを含み;ならびに微生物トランスフェラーゼも使用することができる。
4.高マンノースのトリ−マンノースコア構造への改作;CHOで生産された組織プラスミノーゲンアクチベーター
この実施例は、高マンノースグリカンからの戻し改作によりトリマンノースコアを持つ組織プラスミノーゲンアクチベータの調製を説明する。
組織プラスミノーゲンアクチベータ(TPA)は現在、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で生産され、そして少量の高マンノースN−結合オリゴ糖を含む。マンノースは種々の特異的マンノシダーゼを使用して改作される(trimmed down)ことができる。第1段階はMan9GlcNAc2(Fuc0−1)からMan5GlcNAc2(Fuc0−1)を生成することである。これはマンノシダーゼIを使用して行うことができる。GlcNAcT1(GlcNAcトランスフェラーゼI)を使用してGlcNAc1Man5GlcNAc2(Fuc0−1)を作成するか、またはマンノシダーゼIIIを使用してMan3GlcNAc2(Fuc0−1)を作成する。Man3GlcNAc2(Fuc0−1)から、GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0−1)はGlcNAcTIを使用して生成することができ、あるいはGlcNAc1Man5GlcNAc2(Fuc0−1)から、GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0−1)はマンノシダーゼIIを使用して生成することができる。次いでGlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0−1)は、GlcNAcトランスフェラーゼII(GlcNAcTII)を使用してGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc0−1)に転換される。次いで2つの末端GlcNAc残基をGalTIを使用してガラクトシル化し、次いでSA−PEGでST3GalIIIを使用してシアリル化する。
逆に、TPAは酵母または真菌系で生産することができる。同様の方法が真菌に由来する材料には必要である。
5.GlcNAcのEPOへの付加
この実施例は、GlcNAc残基のトリマンノシルコア上への付加を説明する。
GlcNAcのEPOへの付加。EPOはSF−9昆虫細胞で発現し、そして精製した(プロテインサイエンス(Protein Sciences)、メリデン、コネチカット州)。EPOのトリ−マンノシルグリコフォームから「トリ−マンノシルコア+2GlcNAc」への100%の転換(ピーク1、図91のP1)は、32℃で100mU/mlのGlcNAcT−Iおよび100mU/mlのGlcNAcT−IIと24時間、以下の反応最終濃度でインキューベーションすることにより達成された:
100mM MES pH6.5、または100mM Tris pH7.5
5mM UDP−GlcNAc
20mM MnCl
100mU/ml GlcNAcT−I
100mU/ml GlcNAcT−II
1mg/ml EPO(精製され、Sf9細胞で発現した、
プロテインサイエンスから購入)
グリコフォームの分析。このアッセイはK−R Anumula and ST Dhume,Glycobiology8(1998)685−69のわずかな変法である。
N−グリカナーゼ(PNGase)放出N−グリカンを、アントラニル酸で還元的に標識した。還元的にアミノ化したN−グリカンをShodex Asahipak NH2P−50 4Dアミノカラム(4.6mmx150mm)に注入した。2つの溶媒を分離に使用した:A)水中、5(容量/容量)%酢酸、1%テトラヒドロフラン、および3%トリエチルアミン、およびB)アセトニトリル中、2%酢酸および1%テトラヒドロフラン。次いでカラムを70%Bで2.5分間のイソクラティック溶出、続いて97.5分間にわたり70から5%Bに進行する直線勾配、そして最後に5%Bで15分間のイソクラフィック溶出により溶出した。溶出したピークは、230nmの励起、そして420nmの発光波長で蛍光検出を使用して検出した。
これらの条件下で、トリマンノシルコアは22.3分の保持時間を有し、そしてGnT反応の生成物は26.3分の保持時間を有する。出発原料はコアGlcNAcを持つ排他的なトリマンノシルコアであった(図91)。
6.高マンノースN−グリカンのハイブリッドおよび複合(complex)N−グリカンへの改造:ウシ膵臓RNase
この実施例はハイブリッドまたは複雑なN−グリカンを持つウシ膵臓RNaseの調製について説明する。RNaseの高マンノースN−結合グリカンを酵素的に消化し、そしてハイブリッドN−結合グリカンを作成するために仕上げる(elaborated)。
さらにRNaseの高マンノースN−結合グリカンを酵素的に消化して、複合N−結合グリカンを作成するために仕上げる。
糖ペプチド中のN−結合オリゴ糖の高マンノース構造は、α−マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用してハイブリッドまたは複合形態に修飾することができる。この例はモデル基質として単純なN−グリカンを使用してそのような試みがもたらした結果をまとめる。
ウシ膵臓から精製したリボヌクレアーゼB(RNaseB)(シグマ)は、124アミノ酸残基からなる糖ペプチドである。これは高マンノース構造で修飾された1つのN−グリコシル化部位を有する。その単純さおよび低分子量(13.7kDa〜15.5kDa)故に、リボヌクレアーゼBは高マンノース構造からハイブリッドまたは複合N−結合オリゴ糖へN−グリカンを改造する可能性を証明する良い候補である。RNaseBのMALDI−TOFスペクトルおよびN−グリカナーゼによるRNaseBから開裂されたオリゴ糖のHPLCプロフィール(図92)は、非−修飾ペプチドの小部分以外、ペプチドのN−グリコシル化部位の大部分が5〜9マンノース残基からなる高マンノースオリゴ糖で修飾されていることを示した。
高マンノースN−グリカンからハイブリッドN−グリカンへの転換。高マンノースN−グリカンは、図93に示すようにα1,2−マンノシダーゼ、GlcNAcT−I(β−1,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、GalT−I(β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ)およびα2,3−シアリルトランスフェラーゼ/またはα2,6−シアリルトランスフェラーゼの組み合わせを使用してハイブリッドN−グリカンに転換した。
例として、RNaseBの高マンノース構造は成功裏にハイブリッド構造に転換された。
ManGlcNAc−Rは、トリコデルマ レーゼイ(Trichoderma reesei)からクローン化された単一のα1,2−マンノシダーゼにより触媒されたMan5−9GlcNAc−Rから得た(図94)。RNaseB(1g、約67マイクロモル)を30℃で45時間、15mUの組換えT.レーゼイ(reesei)のα1,2−マンノシダーゼと、10mLの総容量のMESバッファー(50mM、pH6.5)中でインキューベーションした。Man6−9GlcNAc−タンパク質構造は、組換えマンノシダーゼにより高効率でManGlcNAc−タンパク質に成功裏に転換された。
あるいはManGlcNAc−Rは、アスペルギルス サイトイ(Aspergillus saitoi)から精製した単一のα1,2−マンノシダーゼにより触媒されたMan5−9GlcNAc−Rから得た(図95)。RNaseB(40μg、約2.7ナノモル)を37℃で42.5時間、25μUの市販のA.サイトイ(saitoi)のα1,2−マンノシダーゼ(グリコまたはカルビオケム)と、20μlの総容量のNaOAcバッファー(100mM、pH5.0)中でインキューベーションした。Man6−9GlcNAc−タンパク質構造は、市販のマンノシダーゼによりManGlcNAc−タンパク質に成功裏に転換された。しかしGlcNAc−タンパク質に対応する新規ピークがスペクトル中に表れ、調製物中にエンドグリコシダーゼHの混入の可能性を示す。数種の哺乳動物アルファ−マンノシダーセがこの工程を行うために必要であったが、真菌のα1,2−マンノシダーゼはすべてのα1,2−結合マンノース残基を除去するために大変効率的であった。
次いでGlcNAcT−Iは、GlcNAc残基をManGlcNAc−Rに加えた(図96)。RNaseB(600μg、約40ナノモル)を含むT.レーゼイ(reesei)のα1,2−マンノシダーゼ反応後の反応混合物を、非−精製組換えGlcNAcT−I(34mU)と、MnCl(20mM)およびUDP−GlcNAc(5mM)を含有する400μlの総容量のMESバッファー(50mM、pH6.5)中で、37℃で42時間、インキューベーションした。GlcNAc残基は組換えGlcNAcT−IによりManGlcNAc−タンパク質に定量的に加えられた。
次いでGal残基をGalT1を使用して加えた(図97)。RNaseB(120μg、約8ナノモル)を含むGnT−I反応後の反応混合物を37℃で20時間、3.3mUの組換えGalT−1と、UDP−Gal(7.5mM)およびMnCl(20mM)を含有する100μlの総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.3)中でインキューベーションした。Gal残基を約98%のGlcNAc−ManGlcNAc−タンパク質に、組換えGalT1により加えた。
次の工程はα2.3−シアリルトランスフェラーゼまたはα2,6−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル酸の付加であった(図98)。例としてST3GalIII、α2.3−シアリルトランスフェラーゼを使用した。RNaseB(13μg、約0.87ナノモル)を含むGalT−I反応後の反応混合物を37℃で16時間、8.9mUの組換えST3GalIIIと、CMP−シアル酸(5mM)およびMnCl(20mM)を含有する20μlの総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.3)中でインキューベーションした。シアル酸残基を約90%のGal−GlcNAc−ManGlcNAc−タンパク質に、組換えST3GalIIIにより供与体としてCMP−SAを使用して加えた。収量は反応条件を調整することによりさらに改善することができる。
都合がよいことに、上記の各反応後に精製または透析工程は必要ではない。より興味深いことには、GalT1およびST3GalIIIは1ポット反応で組み合わせることができる。別個の反応と比べて同様な収量が得られた。RNaseB(60μg、約4ナノモル)を含むGlcNAcT−I反応後の反応混合物を37℃で20時間、1.7mUの組換えGalT1、9.8mUの組換えST3GalIIIと、UDP−Gal(7.5mM)、CMP−シアル酸(5mM)およびMnCl(20mM)を含有する60μlの総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.3)中でインキューベーションした。
図99に示すように、SA−PEG(10kDa)は、成功裏にRNaseBに加えられた。RNaseB(6.7μg、約0.45ナノモル)を含むGalT−I反応後の反応混合物をHOに対して1時間、室温で透析し、そして37℃で15.5時間、55mUの組換えST3GalIIIと、CMP−SA−PEG(10KDa)(0.25mM)およびMnCl(20mM)を含有する20μlの総容量のTris−HClバッファー(50mM、pH7.3)中でインキューベーションした。PEG−修飾シアル酸残基はGal−GlcNAc−ManGlcNAc−ペプチドに、組換えST3GalIIIにより成功裏に加えられた。収量は反応条件を調整することによりさらに改善することができる。
高マンノースN−グリカンの複合N−グリカンへの転換。この転換を達成するために、GlcNAcβ1,2−ManGlcNAc−ペプチド中間体を得る。図100に示すように、ManGlcNAc−ペプチドからこの中間体への反応を行うために少なくとも4つの可能な経路がある。
経路I:真菌のα1,2−マンノシダーゼにより生産されたManGlcNAc−ペプチドは、1つのGlcNAcを加えるGlcNAcトランスフェラーゼI(GlcNAcT−I、酵素2)の基質である。GlcNAcManGlcNAc−ペプチドの末端α1,3−およびα1,6−結合マンノース残基を、ゴルジα−マンノシダーゼII(ManII、酵素5)により除去する。この経路は高等な生物で行われるN−結合オリゴ糖のプロセッシングに関する天然な経路の一部である。
経路II:2つのマンノース残基を最初にα−マンノシダーゼ(酵素6)により除去し、次いでGlcNAcをGlcNAcT−I(酵素2)により加える。天然の受容体ManGlcNAc−R以外では、GlcNAcT−IはManGlcNAc−Rもその基質として認識し、そして1つのGlcNAcをマンノースコア構造に加えて、GlcNAcManGlcNAc−ペプチドを形成する。
経路III:α1,6−結合マンノースをα1,6−マンノシダーゼにより除去し、続いてGlcNAcをGlcNAcT−Iにより加え、そして末端α1,3−結合マンノースをα1,3−マンノシダーゼにより除去する。得られた実験データから、GlcNAcT−IはこのManGlcNAc−ペプチドを受容体として認識し、そして1つのGlcNAc残基を加えてGlcNAcManGlcNAc−ペプチドを形成する。
経路IV:経路IIIと同様に、α1,3−結合マンノースをα1,3−マンノシダーゼにより除去し、続いてGlcNAcT−I反応を行う。次いで末端α1,6−結合マンノースをα1,6−マンノシダーゼにより除去することができる。
GlcNAcT−I(GlcNAcβ1,2−結合をマンノースコアのα1,3−マンノースに加える原因である)、およびGlcNAcT−II(第2のGlcNAcβ1,2−結合をマンノースコアのα1,6−マンノースに加える原因である)の機能後、GlcNAcManGlcNAc−ペプチドをGalT1およびシアリルトランスフェラーゼにより処理して、2アンテナ状の複合N−グリカンを形成することができる。GlcNAcT−IV、GlcNAcT−Vおよび/またはGlcNAcT−VIのような他のGlcNAcトランスフェラーゼ(図100および図101)も、GlcNAcManGlcNAc−ペプチドをグリコシル化することができる。GalT1およびシアリルトランスフェラーゼによるさらなるグリコシル化は、多アンテナ状の複合N−グリカンを形成する。酵素GlcNAcT−IIIはバイセクティングGlcNAcの挿入を触媒し、したがってManII、GlcNAcT−II、GlcNAcT−IVおよびGlcNAcT−Vの作用を防止する。
7.多アンテナ状の複合グリカンを持つEPOの調製
この実施例は、昆虫細胞が発現したEPOからPEG化された2アンテナ状EPO、および3アンテナ状のシアリル化されたEPOの調製を説明する。
バキュロウイルス/Sf9発現系(プロテイン サイエンス社、メリデン、コネチカット州)からの組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)をグリカン分析に供し、そして生成したグリカンは主にコアフコースを持つトリマンノシルコアであり、わずかな割合のグリカンが1つのGlcNAcも有する(EPO1)ことが示された。
GnT−IおよびGn−IIを用いたN−アセチルグルコサミンの付加。2ロットのrhEPO(1mg/mL)をGnT−IおよびGn−II、5mM UDP−glcNAc、20mM MnClおよび0.02%アジ化ナトリウムと、100mM MES pH6.5中で32℃で24時間インキューベーションした。ロットAは20mgのEPOおよび100mU/mLのGnT−Iおよび60mU/mLのGnT−IIを含んだ。
ロットBは41mgのEPOおよび41mU/mLのGnT−I+50mU/mLのGnT−IIを含んだ。反応後、サンプルはゲル濾過(PD10カラム、ファルマシアLKBバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)により脱塩した。
2−AA HPLCプロファイリングにより分析したEPOグリカン。このアッセイはAnumula and Dhume,Glycobiology8(1998)685−69のわずかな変法である。還元的にアミノ化したN−グリカンを、Shodex Asahipak NH2P−50 4Dアミノカラム(4.6mmx150mm)に注入した。2つの溶媒を分離に使用した、A)水中、5(容量/容量)%酢酸、1%テトラヒドロフラン、および3%トリエチルアミン、およびB)アセトニトリル中、2%酢酸および1%テトラヒドロフラン。次いでカラムを70%Bで2.5分間のイソクラティック溶出、続いて100分間にわたり70から5%Bに進行する直線勾配、そして最後に5%Bで20分間のイソクラティック溶出により溶出した。溶出したピークは、230nmの励起、そして420nmの発光波長で蛍光検出を使用して検出した。非−シアリル化N−結合グリカンは、23〜34分のLC範囲にあり、モノシアル化は34〜42分、ジシアリル化は42〜52分、トリシアリル化は55〜65分、そしてテトラシアリル化は68〜78分にある。
2AA HPLCによるグリカンのプロファイリングは、ロットAが92%、2つのGlcNAcを持つ2アンテナ状の構造(1つのGlcNAcを有するバランス)に転換されたことが分かった。ロットBは所望の生成物に97%転換されたことが示された(図102Aおよび102B)。
GnT−Vを使用した第3アンテナ枝の導入。GnT−IおよびGnT−II反応の生成物からEPO(ロットBの1mg/mL)を、PD−10カラムで脱塩し、そして続いて濃縮した後、10mU/mLのGnT−Vおよび5mM UDP−GlcNAcと、5mM MnClおよび0.02%アジ化ナトリウムを含有する100mM MES pH6.5中で32℃にて24時間インキューベーションした。2AA HPLC分析では転換が92%の効率で起こったことが示された(図103)。
脱塩(PD−10)そして濃縮後、ガラクトースをrGalTIを用いて加えた:EPO(1mg/mL)を0.1U/mLのGalT1、5mM UDP−ガラクトース、5mM MnClと32℃にて24時間インキューベーションした。
EPOから還元的にアミノ化されたN−グリカンのMALDI分析。アントラニル酸で還元的に標識したEPOからのPNGase放出N−グリカンの小アリコートを、水上に浮いたMF−ミリポア膜フィルター(0.025μm孔、47mm直径)で45分間、透析した。透析したアリコートをスピードバック(speedvac)中で乾燥させ、少量の水に再溶解し、そして水/アセトニトリル(50:50)に溶解した2,5−ジヒドロキシ安息香酸(10g/L)溶液と混合した。混合物を標的上で乾燥させ、そして直線/陰−イオンモードで操作したアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)のDE−Pro MALDI−TOFマススペクトロメトリーを使用して分析した。オリゴ糖を観察された質量−対−荷電比および文献の手順に基づき割り当てた。
放出されたグリカンのMALDIによる分析は、ガラクトースがすべての利用可能な部位に定量的に加えられたことを示した(図104)。上記からのガラクトシル化EPOを次いでSuperdex1.6/60カラムでのゲル濾過により50mM Tris、0.15M NaCl、pH6中で精製した。
シアリル化。濃縮および脱塩(PD−10)後、10mgのガラクトシル化EPO(1mg/mL)をST3Gal3(0.05U/mL)およびCMP−SA(3mM)と、0.02%のアジ化ナトリウムを含む50mM Tris、150mM NaCl、pH7.2中でインキューベーションした。別個のアリコートは放射性標識CMP−SAを含んだ。生じた取り込み標識および遊離標識は、イソクラティックなサイズ排除クロマトグラフィー/HPLCにより、0.5mL/分で45%MeOH、0.1%TFA(7.8mmx30cmカラム、粒子サイズ5μm、TSK G2000SWXL、トーソーハース(Toso Haas)、アンシステクノロジーズ(Ansys Technologies)、レイクフォレスト、カリフォルニア州)中にて分離した。この手順を使用して、12%のカウントが取り込まれた(360マイクロモル、33マイクロモルのEPOで、すなわち約10.9モル/モル)。理論的(3N−結合部位、3−アンテナ状)は約9モル/モルの取り込みである。これらはこの方法の限界に相当する。ST3Gal3の代わりにST6Gal1を用いた同一反応では、5.7%の放射性標識、すなわちST3Gal3に比べて約48%がガラクトシル化EPOに取り込まれた。
B.グリコPEG化
8.CMP−SA−PEGの調製
この実施例はCMP−SA−PEGの調製を説明する。
2−(ベンジルオキシカルボキサミド)−グリシルアミド−2−デオキシ−D−マンノピラノースの調製。N−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(3.125g、10.2ミリモル)を、D−マンノサミン−HCl(2g、9.3ミリモル)およびトリエチルアミン(1.42mL、10.2ミリモル)を含む溶液(10mLのMeOHおよび6mLのHOに溶解)に加えた。反応物を室温で16時間撹拌し、そしてロト蒸発(rotoevaporation)を使用して濃縮した。クロマトグラフィー(シリカ、10%MeOH/CHCl)は1.71g(50%収率)の生成物を白色固体として得た:R=0.62(シリカ;CHCl:MeOH:HO,6/4/1);HNMR(CDOD,500 MHz)3.24− 3.27(m,2H),3.44(t,1H),3.55(t,1H),3.63−3.66(m,1H),3.76−3.90(m,6H),3.91(s,2H),4.0(dd,2H),4,28(d,1H,J=4.4),4.41(d,1H,J=3.2),5.03(s,1H),5.10(m,3H),7.29−7.38(m,10H)。
5−(N−ベンジルオキシカルボキサミド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製。2−(N−ベンジルオキシカルボキサミド)グリシルアミド−2−デオキシ−D−マンノピラノース(1.59g、4.3ミリモル)を、0.1M HEPES(12mL、pH7.5)およびピルビン酸ナトリウム(4.73g、43ミリモル)の溶液に溶解した。ノイラミン酸アルドラーゼ(0.1M NaClを含有する45mLの10mMリン酸緩衝化溶液、pH6.9中、540Uの酵素)、および反応物混合物を37℃で24時間加熱した。次いで反応混合物を遠心し、そして上清をクロマトグラフィーにかけた(C18シリカ、HO(100%)から30% MeOH/水への勾配)。適切な画分をプールし、濃縮し、そして残渣をクロマトグラフィーにかけた(シリカ、10%MeOH/CHClからCHCl/MeOH/HO 6/4/1への勾配)。適切な画分を集め、濃縮し、そして残渣を水に再懸濁した。凍結乾燥後、生成物(1.67g、87%収率)を白色固体として得た:R=0.26(シリカ,CHCl/MeOH/HO 6/4/1);HNMR(DO,500MHz)1.82(t,1H),2.20(m,1H),3.49(d,1H),3.59(dd,1H),3.67−3.86(m,2H),3.87(s,2H),8.89−4.05(m,3H),5.16(s,2H),7.45(m,5H)。
5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製。5−(N−ベンジルオキシカルボキサミド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(1.66g、3.6ミリモル)を、20mLの50%水/メタノールに溶解した。フラスコを繰り返し真空とし、そしてアルゴン下に置き、次いで10%Pd/C(0.225g)を加えた。繰り返し真空にした後、次いで水素(約1気圧)をフラスコに加え、そして反応混合物を18時間撹拌した。反応混合物はセライト(celite)を通して濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、そして凍結乾燥させて1.24g(100%収率)の生成物を白色固体として得た:R=0.25(シリカ,IPA/HO/NHOH 7/2/1);H NMR(DO,500 MHz)1.83(t,1H,J=9.9),2.23(dd,1H,J=12.9,4.69),3.51−3.70(m,2H),3.61(s,2H),3.75−3.84(m,2H),3.95−4.06(m,3H)。
シチジン−5’−モノホスホリル−[5−(N−フルオレニルメトキシ−カルボキサミド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート]の調製。20mLのHOに溶解した5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(0.55g、1.70ミリモル)の溶液を、Tris(1.38g、11.4ミリモル)、1M MgCl(1.1mL)およびBSA(55mg)の溶液に加えた。溶液のpHを1M NaOH(2mL)で8.8に調整し、そしてCTP−2Na(2.23g、4.2ミリモル)を加えた。反応混合物のpHは、必要に応じて1M NaOHを送るpHコントローラーで制御してpH8.8を維持した。融合タンパク質(シアリルトランスフェラーゼ/CMP−ノイラミン酸シンテターゼ)を溶液に加え、そして反応混合物を室温で撹拌した。2日後、さらなる量の融合タンパク質を加え、そして反応物をさらに40時間撹拌した。反応混合物をEtOH中で沈殿させ、そして沈殿物を冷EtOHで5回洗浄して、2.3グラムの白色固体を得た。約1.0gの粗生成物を1,4−ジオキサン(4mL)、HO(4mL)および飽和NaHCO(3mL)に溶解し、そして2mlのジオキサンに溶解したFMOC−Cl(308mg、1.2ミリモル)の溶液を滴下した。室温で16時間撹拌した後、反応混合物はロータリーエバポレーションにより約6mLに濃縮し、そしてクロマトグラフィー(C18シリカ、100%HOから30%MeOH/HOへの勾配)を使用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮した。残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して253mgの白色固体を得た:R=0.50(シリカ,IPA/HO/NHOH 7/2/1);H NMR(DO,500 MHz)1.64(dt,1H,J=12.0,6.0),2.50(dd,1H,J=13.2,4.9),3.38(d,J=9.67,1H),3.60(dd,J=11.65,6.64,1H),3.79(d,J=4.11,1H),3.87(dd,J=12.24,1.0,1H),3.97(m,2H),4.07(td,J=10.75,4.84,1H),4.17(dd,J=10.68,1.0,1H),4.25(s,2H),4.32(t,J=4.4,1H),4.37(t,J=5.8 1H),4.6−4.7(m,溶媒ピークにより不明瞭),5.95(d,J=4,1H),6.03(d,J=7.4,1H),7.43−7.53(m,3H),7.74(m,2H),7.94(q,J=7,3H).MS(ES);理論値 C354218P([M−H]),851.7;測定値 850.0。
シチジン−5’−モノホスホリル−(5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製)。ジイソプロピルアミン(83μL、0.587マイクロモル)を、水(3mL)およびメタノール(1mL)に溶解したシチジン−5’−モノホスホリル−[5−(N−フルオレニルメトキシカルボキサミド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート](100mg、0.117ミリモル)の溶液に加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、そして反応メタノールを反応混合物からロータリーエバポレーションにより除去した。粗反応混合物は水を使用してC18シリカゲルカラムを通して濾過し、そして溶出液を集め、そして凍結乾燥して(87mg、100%)の生成物を白色固体として得た:R=0.21(シリカ,IPA/HO/NHOH 7/2/1);H NMR(DO,500 MHz)1.66(td,1H,J=5.3),2.50(dd,1H,J=13.2,4.6),3.43(d,J=9.58,1H),3.63(dd,J=11.9,6.44,1H),3.88(dd,J=11.8,1.0,1H),3.95(td,J=9.0,2.3,1H),4.10(t,J=10.42,1H),4.12(td,J=10.34,4.66,1H),4.18(d,J=10.36,1H),4.24(m,2H),4.31(t,J=4.64,1H),4.35(t,1H),6.00(d,J=4.37,1H),6.13(d,J=7.71,1H),7.98(d,J=7.64,1H).MS(ES);理論値 C21 3211P([M−H]),629.47;測定値 627.9。
シチジン−5’−モノホスホリル−[5−(N−メトキシ−ポリオキシエチレン−(1KDa)−3−オキシプロピオンアミド)−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート]の調製。ベンジルトリアゾール−1−イルオキシ−トリス(ジメチルアミノ)−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフテェート(BOP、21mg、48マイクロモル)を、無水DMF(700μL)およびトリエチルアミン(13μL、95マイクロモル)に溶解したメトキシポリオキシエチレン−(1KDaの平均分子量)−3−オキシプロピオン酸(48mg、48マイクロモル)溶液に加えた。30分後、シチジン−5’−モノホスホリル−(5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート)(30mg、48マイクロモル)、水(400μL)およびトリエチルアミン(13μL、95マイクロモル)を含む溶液を加えた。この溶液を20分間、室温で撹拌し、そして次いでクロマトグラフィーにかけた(C18シリカ、メタノール/水の勾配)。適切な画分を集め、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して白色固体として40mg(50%収率)を得た:R=0.36(シリカ,IPA/HO/NHOH 7/2/1);H NMR(DO,500MHz)1.66(td,1H,J=5.3),2.50(dd,1H,J=13.2,4.6),2.64(t,J=5.99,3H)3.43(d,J=9.58,1H),3.63(m,1H),3.71(s,70H),3.79(m,3.71 ピークにより不明瞭)、3.82(t,J=6.19,1H)3.88(dd,J=11.8,1.0,1H),3.95(td,J=9.0,2.3,1H),3.98(t,J=5.06,1H),4.12(td,J=10.34,4.66,1H),4.18(d,J=10.36,1H),4.23(d,J=4.85,2H),4.31(t,J=4.64,1H),4.35(t,1H),6.00(d,J=4.55,1H),6.13(d,J=7.56,1H),7.98(d,J=7.54,1H).MS(MALDI),観測値 [M−H];1594.5,1638.5,1682.4,
1726.4,1770.3,1814.4,1858.2,1881.5,1903.5,1947.3。
シチジン−5’−モノホスホリル−[5−(N−メトキシ−ポリオキシエチレン−(10KDa)−オキシカルボキサミド)−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート]の調製。シチジン−5’−モノホスホリル−(5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート)(2.5mg、4マイクロモル)および水(180μL)を、トリエチルアミン(1.1μL、8マイクロモル)を含有する無水DMF(800μL)中の(メトキシポリオキシエチレン−(10KDa、平均分子量)−オキシカルボニル−(N−オキシベンゾトリアゾール)エステル(40mg、4マイクロモル)の溶液に加え、そして反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を水(8mL)で希釈し、そして逆層フラッシュクロマトグラフィーにより精製した(C18シリカ、メタノール/水の勾配)。適切な画分を合わせ、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して白色固体として20mgの生成物(46%収率)を得た:R=0.35(シリカ,IPA/HO/NHOH 7/2/1);H NMR(DO,500 MHz)δ1.66(td,1H),2.50(dd,1H),2.64(t,3H)3.55−3.7(m,3.71ピークのより不明瞭)、3.71(s,488H),3.72−4.0(m,3.71ピークのより不明瞭),4.23(m,3H),4.31(t,1H),4.35(t,1H),6.00(d,J=4.77,1H),6.12(d,J=7.52,1H),7.98(d,J=7.89,1H).MS(MALDI),観測値 [MCMP+Na];10780。
9.ヒト下垂体由来FSHのグリコPEG化
この実施例は本発明の結合物の集成体を説明する。濾胞刺激ホルモン(FSH)は脱シアリル化し、そしてCMP−(シアル酸)−PEGを結合した。
濾胞刺激ホルモンの脱シアリル化。濾胞刺激ホルモン(FSH)(ヒト下垂体、カルビオケム、カタログ番号869001)1mgを、500μLの50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaClに溶解した。この溶液375μLを小さいプラスチック製の試験管に移し、そして263mUのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)をそれに加えた。反応混合物は15時間、32℃で穏やかに振盪した。反応混合物を、50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaClおよび0.05%NaNで前平衡化したN−(−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロースゲル結合体、600μLに加え、そして6.5時間、4℃で穏やかに回転した。懸濁液を2分間、14,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。ビーズを0.5mLのバッファーで5回洗浄し、そしてすべての上清をプールした。酵素溶液を15時間、4℃で2リットルの溶液(50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNを含有する)を用いて透析し(7000MWCO)、そして4時間、4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNで2回、透析した。次いで溶液を2μg/μLにSpeed Vacで濃縮し、そして−20℃で保存した。反応サンプルをIEFゲルで分析した(pH3〜7)(インビトロゲン:Invitrogen)(図105)。
ヒト下垂体−由来SA−FSHおよびPEG−SA−濾胞刺激ホルモンの調製。脱シアリル化したFSH(100μg、50μL)およびCMP−シアル酸またはCMP−SA−PEG(1kDaまたは10kDa)(0.05マイクロモル)を、0.5mLのプラスチック製試験管中の13.5μLのHO(NaOHでpH8に調整)に溶解した。試験管を簡単にボルテックス混合し、そして40mUのST3Gal3(36.5μL)を加えた(総容量100μL)。試験管を再度、ボルテックス混合し、そして24時間、32℃で穏やかに振盪した。反応は−80℃に凍結することにより止めた。15μgの反応サンプルをSDS−PAGE(図106)、IEFゲル(図107)およびMALDI−TOFにより分析した。天然なFSHはSDS−PAGEにより分析した(図108)。
反応生成物のSDS PAGEおよびIEFゲルの分析。SDS PAGE分析用のノベックス(Novex)のTris−グリシン8〜16%1mmゲルをインビトロゲンから購入した。7.5μL(15μg)のFSH反応サンプルを5μLの50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05% NaNバッファーで希釈し、15μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの9M μ−メルカプトエタノールと混合し、そして6分間、85℃で加熱した。ゲルはインビトロゲンの指示に従い泳動し、そしてコロイダルブルーステイン(Colloidal Blue Stain)(インビトロゲン)で染色した。
FSHサンプル(15μg)を5μLのTrisバッファーで希釈し、そして15μLのサンプル添加バッファーと混合した(図105)。次いでサンプルは等電点電気泳動ゲル(pH3−7)(インビトロゲン)に乗せた(図108)。ゲルはインビトロゲンの指示に従い泳動そして固定し、次いでコロイダルブルーステインにより染色した。
10.CHO細胞で組換え的に生産された組換えFSHのグリコPEG化
この実施例は本発明の結合物の集成体を説明する。ジシアリル化FSHにCMP−(シアル酸)−PEGを結合した。
組換えアシアロ−濾胞刺激ホルモンの調製。CHOから生産した組換え濾胞刺激ホルモン(rFSH)をこれらの実験に使用した。7,500IUのゴナル−F(Gonal−F)を8mLの水に溶解した。FSH溶液を50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl中で透析し、そして500μLにCentricon Plus20遠心フィルター中で濃縮した。この溶液の一部(400μL)(〜0.8mgFSH)を小さいプラスチック製試験管に移し、そして275mUのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)をそれに加えた。反応混合物は16時間、32℃で混合した。反応混合物を、前洗浄したN−(−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL)に加え、そして24時間、4℃で穏やかに回転した。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。
ビーズを0.6mLのTris−EDTAバッファーで3回洗浄し、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、そしてすべての上清をプールした。上清は4℃で2リットルの50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そして50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対してさらに2回透析した。次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルター中で420μLに濃縮し、そして−20℃で保存した。
天然な、および脱シアリル化rFSHサンプルを、SDS−PAGEおよびIEF(図109)により分析した。ノベックスのTris−グリシン8〜16%1mmゲルをインビトロゲンから購入した。サンプル(7.5μ、15μg)サンプルは、5μLの50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05% NaNバッファーで希釈し、15μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの9M β−メルカプトエタノールと混合し、そして6分間、85℃で加熱した。ゲルはインビトロゲンの指示に従い泳動し、そしてコロイダルブルーステイン(インビトロゲン)で染色した。等電点電気泳動ゲル(pH3−7)はインビトロゲンから購入した。サンプル(7.5μL、15μg)を5μLのTrisバッファーで希釈し、そして15μLのサンプル添加バッファーと混合した。ゲルはインビトロゲンの指示に従い乗せ、泳動し、そして固定した。ゲルをコロイダルブルーステインにより染色した。天然な、および脱シアリル化FSHは水に対して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析した。
組換え濾胞刺激ホルモンのシアリル−PEG化。脱シアリル化したFSH(100μg、54μL)およびCMP−SA−PEG(1kDaまたは10kDa)(0.05マイクロモル)を、0.5mLのプラスチック製試験管中の28μLのTris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解した。試験管を簡単にボルテックス混合し、そして20mUのST3Gal3を加えた(総容量100μL)。試験管を再度、ボルテックス混合し、24時間、32℃で穏やかに混合し、そして反応は−80℃に凍結することにより止めた。この反応のサンプルを上記のようにSDS−PAGEゲル(図110)、IEFゲル(図111)およびMALDI−TOF MSにより分析した。
MALDIはPEG化rFSHについても行った。イオン化中、SA−PEGは糖タンパク質のN−グリカン構造から排除される。天然なFSHは13928にピークを与えた;AS−rFSH(13282);再シアリル化 r−FSH(13332);PEG100−rFSH(13515;14960(1);16455(2);17796(3);19321(4));およびPEG 10000(23560(1);24790(2);45670(3);および56760(4))。
11.グリコPEG化FSHの薬物動態学的実験
この実施例は非−PEG化FSHと比べて、本発明の方法に従い調製したグリコPEG化濾胞刺激ホルモン(FSH)の薬物動態学的特性の試験を説明する。
FSH、FSH−SA−PEG(1kDa)およびFSH−SA−PEG(10kDa)は、標準的条件を使用して放射性ヨウ素化し(アマーシャム バイオサイエンス、アーリントンハイツ、イリノイ州)、そして0.1%BSAを含有するリン酸緩衝化生理食塩水に配合した。リン酸バッファーで適切な濃度に希釈した後、各試験FSHタンパク質(それぞれ0.4μg)をメスのSprague Dawleyラット(250〜300g体重)に静脈内注射し、そして0〜80時間の時点で採血した。血液サンプル中の放射活性は、ガンマカウンターを使用して分析し、そして標準的方法を使用して薬物動態学を分析した(図112)。FSHはFSH−PEG(1KDa)よりもかなり急速に血液から排除され、これは次いでFSH−PEG(10KDa)よりも幾分く排除された。
12.FSHペプチドのバイオアッセイ
この実施例は培養したセルトリー(Sertori)細胞に基づく濾胞刺激ホルモン(FSH)活性に関するバイオアッセイを説明する。このアッセイは複合糖質化を含むグリカン改造後のFSHの生物活性を測定するために有用である。
このバイオアッセイは、黄体形成ホルモン(LH)ではなくFSHが、非成熟老ラットから得られた培養したセルトリー細胞に加えられた時、生産されるエストラジオールの量との間に存在する用量−応答関係に基づく。外因性テストステロンはFSHの存在下で17β−ヒストラジオールに転換される。
7〜10日齢のSprague Dawleyラットをセルトリー細胞を得るために使用した。屠殺後、精巣を被膜剥離し、そして組織はコラゲナーゼ(1mg/ml)、トリプシン(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(1mg/ml)およびDNase(5μg/ml)中で5〜10分間、インキューベーションすることにより分散させた。細管フラグメントはフラスコの底に沈み、そしてPBSで洗浄した(1x)。細管フラグメントは20分間、同じ酵素を含有する媒質で再インキューベーションした:コラゲナーゼ(1mg/ml)、トリプシン(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(1mg/ml)およびDNase(5μg/ml)。
細管フラグメントを均一化し、そして24ウェルプレート中の無血清培地に入れた。ウェルあたり5x10細胞を分散させた。37℃および5%COで48時間のインキューベーション後、新しい培地を細胞に加えた。無血清培地の組成:DMEM(1容量)、ハムの(Ham’s)F10栄養混合物(1容量)、インスリン 1μg/ml、トランスフェリン 5μg/ml、EGF 10ng/ml、T4 20pg/ml、ヒドロコルチゾン10−8M、レチン酸 10−6M。
刺激実験は、標準FSHまたはサンプルとの37℃および5%COでの24時間のインキューベーションからなる。変動の平均アッセイ内係数は9%であり、そして変動の平均アッセイ間係数は11%である。
17B−エストラジオールElisaキットDE2000(R&Dシステムズ(Systems)、ミネアポリス、ミネソタ州)を使用して、FSH、FSH−SA−PEG(1KDa)およびFSH−SA−PEG(10KDa)とのインキューベーション後のエストラジオールレベルを定量した。
手順は以下の通りであった:100μlのエストラジオール標準(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)、またはサンプルを17B−エストラジオールELisaプレート(1つまたは複数)のウェルにピペットで加えた:50μlの17B−エストラジオール結合物(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)を各ウェルに加えた;50μlの17B−エストラジオール抗体溶液(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)を各ウェルに加えた;プレートを2時間、室温で200rpmにてインキューベーションした;液体を各ウェルから吸引した;ウェルを4回、洗浄溶液を使用して洗浄した;すべての液体をウェルから除去した;200μlのpNPP基質(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)をすべてのウェルに加え、そして45分間インキューベーションした;50μlの停止溶液(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)を加え、そしてプレートを405nmで読んだ(図113)。FSH−PEG(10KDa)は1μg/mlでセルトリー細胞の穏やかな刺激を現したが、FSH−PEG(1KDa)は非PEG化FSHよりも最高50%多くセルトリー細胞を刺激した。
13.トランスフェリンのグリコPEG化
この実施例はアシアロトランスフェリンの調製およびPEG−CMP−シアル酸でのそのシアリル化を説明する。
アシアロ−トランスフェリンの調製。ヒト−由来ホロ−トランスフェリン(10mg)を500μLの50mM NaOAc、5mM CaCl、pH5.5に溶解した。この溶液に、500mUのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)を加え、そして反応混合物を20.5時間、37℃で穏やかに振盪した。
反応混合物を、前洗浄したN−(−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(600μL)に加え、そして24時間、4℃で穏やかに回転させてビーズを洗浄した。
混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。反応混合物は100μLの30mM EDTAを、20時間、4℃で穏やかに回転させた洗浄ビーズに加えることにより5mM EDTAに合わせた。上清を2分間、10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。ビーズを0.35mLの50mM NaOAc、5mM CaCl、5mM EDTA、pH5.5で5回洗浄し、そしてすべての上清をプールした。酵素溶液は4℃で2回、15mM Tris−HCl、1M NaCl、pH7.4中で透析した。0.3mLのトランスフェリン溶液(全部で3.3mL)を除去し、そして水に対して2回、透析した。残りは4℃でさらに2回、リン酸緩衝化生理食塩水に透析した。透析した溶液は−20℃で保存した。タンパク質サンプルはIEF電気泳動により分析した。サンプル(9μL、25μg)を16μLのTrisバッファーで希釈し、そして25μLのサンプル添加バッファーと混合し、そして等電点電気泳動ゲル(pH3−7)に乗せた。ゲルは標準的な手順を使用して泳動し、そして固定した。ゲルをコロイダルブルーステインにより染色した。
アシアロ−トランスフェリンのシアリル−PEG化。脱シアリル化トランスフェリン(250μg)およびCMP−シアル酸またはCMP−SA−PEG(1kDaまたは10kDa)(0.05マイクロモル)を、1.5mLのプラスチック製試験管中の69μLの50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解した。試験管を簡単にボルテックス混合し、そして100mUのST3Gal3を(90μL)加えた(総容量250μL)。試験管を再度、ボルテックス混合し、そして24時間、32℃で穏やかに混合した。反応は−80℃に凍結することにより止めた。
ノベックスのTris−グリシン8〜16%1mmゲルをSDS−PAGE分析に使用した(図114)。サンプル(25μL、25μg)は、25μLのサンプル添加バッファーおよび0.4μLのβ−メルカプトエタノールと混合し、そして6分間、85℃で加熱した。ゲルは標準条件を使用して泳動し、そしてコロイダルブルーステインで染色した。
IEFゲルも上記のように行った図115)。サンプルを水に対して透析し、MALDI−TOFにより分析した。
結果。MALDIも行った。天然なトランスフェリン(78729);アシアロトランスフェリン(78197);再シアリル化トランスフェリン(79626/80703);SA−PEG 1kを含む(79037(1);80961(2);82535(3);84778(4));SA−PEG 5kを含む(90003(2);96117(3);96117(4));SA−PEG 10kを含む(100336(2);111421(3);122510(4))。
14.BHK細胞で生産された組換え第VIIa因子のグリコPEG化
この実施例はCHO細胞で作られた組換え第VIIa因子のPEG化を説明する。
アシアロ−第VIIa因子の調製。組換え第VIIa因子はBHK細胞(乳児ハムスターの腎臓細胞)で生産された。第VIIa因子(14.2mg)を1mg/mlでバッファー溶液(pH7.4、0.05M Tris、0.15M NaCl、0.001M CaCl、0.05% NaN)に溶解し、そして300mU/mLのシアリダーゼ(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)−アガロース結合体と3日間、32℃でインキューベーションした。反応を監視するために、反応の少量のアリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてインビトロゲンの手順に従いIEFゲルを行った(図116)。混合物を3,500rpmで遠心し、そして上清を集めた。樹脂を3回(3×2mL)、上記バッファー溶液(pH7.4、0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05% NaN)で洗浄し、そして合わせた洗浄液をCentricon−Plus−20で濃縮した。残る溶液は0.05M Tris(pH7.4)、0.15M NaCl、0.05% NaNとバッファー交換して14.4mLの最終容量とした。
第VIIa因子−SA−PEG(1KDaおよび10KDa)の調製。脱シアリル化したr第VIIa因子溶液を2つの7.2mlの等量サンプルに分けた。各サンプルに、CMP−SA−5−PEG(1KDa)(7.4mg)またはCMP−SA−5−PEG(10kDa)(7.4mg)のいずかれを加えた。ST3Gal3(1.58U)を両方の試験管に加え、そして反応混合物を32℃で96時間インキューベーションした。反応はインビトロゲンにより記載された試薬および条件を使用して、SDS−PAGEゲルにより監視した。反応が完了した時、反応混合物をトーソー ハースTSK−Gel−3000調製用カラムを使用して、PBSバッファー(pH7.1)を使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集めた。生成物を含む合わせた画分を4℃でCentricon−Plus−20遠心フィルター(ミリポア、ベットフォード、マサチューセッツ州)中で濃縮し、そして濃縮した溶液を再配合して1.97mgの第VIIa因子−PEGを得た(ビシンクロニン酸タンパク質アッセイ、BCAアッセイ、シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)。反応生成物は、インビトロゲンにより供給された手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析した。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析した。図117は天然な第VIIa因子に関するMALDIの結果を示す。図118は、1KDaPEGでPEG化された第VIIa因子に関するMALDIの結果を含み、ここで1KDaPEGでPEG化された第VIIa因子のピークが明らかである。図119は、10KDaPEGでPEG化された第VIIa因子に関するMALDIの結果を含み、ここで10KDaPEGでPEG化された第VIIa因子のピークが明らかである。図120はすべての反応生成物のSDS−PAGE分析を表し、ここで第VII因子−SA−PEG(10−KDa)のバンドが明らかである。
15.CHO細胞で生産された第IX因子のグリコPEG化
この実施例はアシアロ第IX因子の調製およびPEG−CMP−シアル酸を用いたそのシアリル化を説明する。
r第IX因子の脱シアリル化。凝固第IX因子(r第IX因子)の組換え形は、CHO細胞で作成した。6000IUのr第IX因子を全部で12mlのUSP HOに溶解した。この溶液をCentricon−Plus−20、さらに6mLのUSP HOを含むPL−10遠心フィルターに移した。溶液を2mLに濃縮し、そして15mLの50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl、0.05%NaNで希釈し、そして再濃縮した。希釈/濃縮を4回繰り返してバッファー交換を効率的に行って3.0mLの最終容量とした。この容液から2.9mL(約29mgのr第IX因子)を小さいプラスチック製試験管に移し、そしてこれに530mUのα2−3,6,8−ノイラミニダーゼ−アガロース結合体(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae、カルビオケム、450μL)を加えた。反応混合物を26.5時間、32℃で穏やかに回転させた。混合物を2分間、10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。アガロースビーズ(ノイラミニダーゼを含む)を6回、0.5mLの50mM Tris−HCl、pH7.12、1M NaCl、0,05% NaNで洗浄した。プールした洗浄液および上清を2分間、10,000rpmで再遠心して残存するアガロース樹脂を除去した。プールした脱シアリル化タンパク質溶液を同バッファーで19mLに希釈し、そしてCentricon Plus20 PL−10遠心フィルター中で〜2mLに濃縮した。溶液を2回、15mLの50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、0.05%NaNで希釈し、そして2mLに再濃縮した。最後に脱シアリル化されたr第IX因子溶液は3mLの最終容量(〜10mg/mL)にTrisバッファーで希釈した。天然な、および脱シアリル化r第IX因子のサンプルは、IEF電気泳動により分析した。等電点電気泳動ゲル(pH3−7)は、最初に10μLのTrisバッファーで希釈し、そして12μLのサンプル添加バッファーと混合した1.5μL(15μg)のサンプルを使用して泳動した。標準的手順を使用してゲルを乗せ、泳動し、そして固定した。ゲルはコロイダルブルーステインにより染色し(図121)、脱シアリル化第IX因子に関するバンドを示した。
PEG(1KDaおよび10KDa)−SA−第IX因子の調製。脱シアリル化したr第IX因子(29mg、3mL)を、2つの15mLの遠心管中の2つの1.5mL(14.5mg)サンプルに分けた。各溶液を12.67mLの50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、0.05%NaNで希釈し、そしてCMP−SA−PEG−1kまたは10k(7.25マイクロモル)のどちらかを加えた。試験管を穏やかに上下して混合し、そして2.9UのST3Gal3(326μL)を加えた(14.5mLの総容量)。試験管を再度、上下し、そして65時間、32℃で穏やかに回転した。反応は−20℃で凍結することにより止めた。反応の10μgのサンプルをSDS−PAGEにより分析した。PEG化タンパク質はトーソー ハース Biosep G3000SW(21.5×30cm、13μm)HPLCカラムで、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.1(ギブコ)、6mL/分を使用して精製した。反応および精製は、SDSPageおよびIEFゲルを使用して監視した。ノベックスのTris−グリシン4−20%1mmゲルに、2μLの50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05%NaNバッファーで希釈し、そして12μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの0.5MDTTと混合し、そして85℃で6分間加熱した後の10μL(10μg)のサンプルを乗せた。ゲルはコロイダルブルーステインにより染色し(図122)、PEG(1KDaおよび10kDa)−SA−第IX因子に関するバンドを示した。
16.第IX因子の直接シアリル−グリコPEG化
この実施例は、事前のシアリダーゼ処理無しのペプチドのシアリル−グリコPEG化の調製を説明する。ここで第IX因子は例示ペプチドである。
第IX因子の直接シアリル−PEG化(10KDa)。第IX因子(1100IU)を5mLの20mM ヒスチジン、2%シュクロースを含む520mM グリシンバッファー、0.05%NaNおよび0.01%ポリソルベート80、pH5.0に溶解した。
次いでCMP−SA−PEG(10KDa)(27.8mg、3.5マイクロモル)をこの溶液に加え、反応混合物を上下して穏やかに混合し、そして1.4UのST3Gal3を加えた。反応混合物を19時間、32℃で穏やかに回転し、そして反応を凍結により止めた。反応混合物は、インビトロゲンにより記載された展開および染色(コロイダルブルー)条件を使用してSDS−PAGEゲルにより分析した。簡単に説明すると、サンプル(10μL)を12μLのサンプル添加バッファーおよび2μLの0.5M DTTと混合し、そして6分間、85℃で加熱した(図123、レーン8、9および10)。生成物はSuperdex200 10/20カラム(アマーシャム、ウプサラ、スウェーデン)カラムで、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.1(ギブコ)、6mL/分で精製した。図(図123はHPLCで精製したPEG化第IX因子のバンド(レーン5)を含む。
17.グリコPEG化第IX因子のシアル酸キャッピング
この実施例は、シアリル−グリコPEG化ペプチドのシアル酸キャッピングの手順を説明する。ここで第IX因子は例示ペプチドである。
第IX−SA−PEGのN−結合およびO−結合グリカンのシアル酸キャッピング(10KDa)。精製したr第IX因子−PEG(10KDa)(2.4mg)を、Centricon(商標)Plus20PL−10(ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)遠心フィルター中で濃縮し、そしてバッファーを50mM Tris−HCl、pH7.2、0.15M NaCl、0.05%NaNに交換して1.85mLの最終容量とした。タンパク質溶液を372μLの同Trisバッファーで希釈し、そして7.4mgのCMP−SA(12マイクロモル)を固体で加えた。溶液は上下することにより穏やかに混合し、そして0.1UのST3Gal1および0.1UST3Gal3を加えた。反応混合物を42時間、32℃で穏やかに回転した。
反応の10μgのサンプルをSDS−PAGEにより分析した。ノベックスのTris−グリシン4−12%1mmゲルをインビトロゲンにより記載されているように行い、そしてコロイダルブルーを使用して染色した。簡単に説明すると、サンプル、10μL(10μg)を12μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの0.5M DTTと混合し、そして6分間、85℃で加熱した(図123、レーン4)。
18.哺乳動物または昆虫系で発現したタンパク質のグリコPEG化:EPO、インターフェロンαおよびインターフェロンβ
この実施例は哺乳動物または昆虫系で発現したPEG化ペプチドの調製を説明する。
哺乳動物発現系から受容体の調製。CMP−シアル酸PEGを使用してグリコPEG化されるペプチドは、ガラクトースで終結するグリカンを持つ必要がある。哺乳動物発現系からのほとんどのペプチドは、最初に除去される必要がある末端シアル酸を有する。
シアリダーゼ消化。ペプチドはシアリダーゼを使用して脱シアリル化する。典型的な手順には、1mg/mL溶液のペプチド(Tris−緩衝化塩溶液中、pH7.2、5mM CaClを加えて含む)を、0.2U/mLの固定化シアリダーゼ(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae由来、カルビオケム)と32℃で24時間インキューベーションすることを含む。微生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含することにより止めることができる。次いで樹脂を遠心または濾過により取り出し、次いで洗浄してトラップされたペプチドを回収する。この時点で、EDTAを溶液に加えて樹脂から浸出したシアリダーゼは阻害することができる。
昆虫発現系の調製。EPO、インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−ベータは、酵母、植物または昆虫細胞のような非哺乳動物系でも発現させることができる。
CMP−シアル酸PEGを使用してグリコPEG化されるペプチドは、ガラクトースで終結するグリカンを持つ必要がある。例えば昆虫細胞で発現されるペプチド上のN−グリカンのほとんどは、トリマンノシルコアである。これらのグリカンはそれらがシアリルトランスフェラーゼの受容体である前に、最初にガラクトースで終結するグリカンに改築される。
トリマンノシルコアから受容体グリカンの構築。5mM MnCl、5mM UDP−glcNAc、0.05U/mL GLCNACT I、0.05U/mL GLCNACT IIを含むTris−緩衝化塩溶液、pH7.2中のペプチド(1mg/mL)を32℃で24時間、または反応が実質的に完了するまでインキューベーションする。微生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含することにより止めることができる。バッファー交換をしてUDPおよび他の低分子を除去した後、UDP−ガラクトースおよびMnClをそれぞれ5mMまで加え、ガラクトシルトランスフェラーゼを0.05U/mLまで加え、そして32℃で24時間、または反応が実質的に完了するまでインキューベーションする。微生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含することにより止めることができる。このペプチドはこれでグリコPEG化の準備ができている。
O−結合グリカンの構築。同様の方法をインターフェロン アルファについて使用して、酵素的に所望するO−グリカンGal−GalNAcを生成することができる。必要ならば、セリンまたはトレオニンに連結したGalNAcを、適当なペプチドGalNAcトランスフェラーゼ(例えばGalNAc T1、GalNAc T2、T3、T4等)およびUDP−GalNAcを使用して加えることができる。また必要ならば、ガラクトースをガラクトシルトランスフェラーゼおよびUDP−ガラクトースを使用して加えることができる。
シアリルトランスフェラーゼを使用したグリコPEG化。Tris緩衝化塩溶液+0.02%アジ化ナトリウム中の末端ガラクトースを持つ糖ペプチド(1mg/mL)を、CMP−SA−PEG(0.75mM)および0.4U/mLシアリルトランスフェラーゼ(EPOおよびインターフェロンベータ上のN−グリカンにはST3Gal3またはST3Gal4;インターフェロンアルファ上のO−グリカンについてはST3Gal4またはST3Gal1)と、32℃で24時間インキューベーションする。使用できる他のトランスフェラーゼには、フォトバクテリウム ダムセーラ(Photobacterium damsella)に由来する2,6−シアリルトランスフェラーゼを含む。受容体ペプチド濃度は、最も好ましくは0.1mg/mLからペプチドの溶解度の限界までの範囲である。CMP−SA−PEGの濃度は利用可能な部位を越えて過剰にあるように十分であるべきであるが、PEGによるペプチドの溶解度の問題を引き起こすほど高いべきではなく、そして50μMから5mMまでの範囲でよく、そして温度は2℃から40℃の範囲でよい。反応が完了するために必要な時間は、温度、受容体基質に対する酵素の相対的量、供与体基質濃度およびpHに依存するだろう。
19.昆虫細胞で生産されたEPOのグリコPEG化
この実施例は昆虫細胞が発現したEPOからPEG化2アンテナ状EPOの調製法を説明する。
バキュロウイルス/Sf9発現系(プロテインサイエンス社、メリデン、コネチカット州)に由来する組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)をグリカン分析に供し、そして得られたグリカンは、コアフコースを含む主にトリマンノシルコアであり、少ない割合で単一GlcNAcを有するグリカンも存在することが示された(図124)。
GnT−IおよびGnT−IIを用いたN−アセチルグルコサミンの付加。2ロットのrhEPO(1mg/mL)をGnT−IおよびGnT−II、5mM UDP−glcNAc、20mM MnClおよび0.02%アジ化ナトリウムと、100mM MES pH6.5中で32℃にて24時間インキューベーションした。ロットAは20mgのEPOおよび100mU/mLのGnT−Iおよび60mU/mLのGnT−IIを含んだ。ロットBは41mgのEPOおよび41mU/mLのGnTI+50mU/mLのGnT−IIを含んだ。反応後、サンプルはゲル濾過(PD10カラム、ファルマシアLKBバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)により脱塩した。
2AA HPLCによるグリカンのプロファイリングは、ロットAが92%、2つのGlcNAcを持つ2アンテナ状構造(1つのGlcNAcを有するバランス)に転換されたことを明らかにした。ロットBは所望の生成物に97%転換されたことが示された(図102Aおよび102B)。
EPOロットAのガラクトシル化。EPO(ロットAの〜16mg)を、GnTIIで処理してGlcNAcの付加を完成した。反応は150mM NaCl、EPOmg/ml、1mM UDP−GlcNAc、5mM MnCl、0.02%アジ化ナトリウムおよび0.02U/mlGnTIIを含む50mM Tris pH7.2中で、32Cにて4時間行った。EPOのガラクトシル化は3mMまでのUDP−ガラクトースおよび0.5U/mlまでのGalTを添加して行い、そしてインキューベーションを32Cにて48時間続行した。
次いでガラクトシル化EPOは、50mM Tris、0.15M NaCl、pH6中、Superdex1.6/60カラムでのゲル濾過により精製した。次いでEPOを含むピークを2AA HPLCにより分析した。HPLCデータに基づき、グリカンの〜85%が2個のガラクトースを含み、そしてグリカンの〜15%がガラクトシル化反応後にガラクトースを持たなかった。
ガラクトシル化EPOのシアリル化。ガラクトシル化EPOのシアリル化は、150mM NaCl、0.5mg/ml EPO、200mU/ml ST3Gal3および0.5mM CMP−NANまたはCMP−NAN−PEG(1KDa)またはCMP−NAN−PEG(10KDa)のいずれかを含む100mM Tris、pHで、48時間、32Cで行った。2個のガラクトース残基を有するほとんどすべてのグリカンが、CMP−NANとの反応後に完全にシアリル化された(2個のシアル酸/グリカン)。MALDI−TOF分析はHPLCデータを確認した。
ガラクトシル化EPOのPEG化。CMP−NAN−PEG(1KDa)およびCMP−NAN−PEG(10KDa)を使用したPEG化反応については、反応混合物のアリートをSDS−PAGEにより分析した(図125)。EPOペプチドの分子量は各糖の付加で増加し、そしてPEG化反応後には分子量がさらに劇的に増加した。
EPOのインビトロバイオアッセイ。インビトロのEPOバイオアッセイ(Hammerling et al,1996,J.Pharm.Biomed.Anal.14:1455−1469から調整)は、多レベルのEPOに対するTF−1細胞系の反応性に基づく。TF−1細胞は骨髄腫前駆体細胞の増殖および分化を調査するために良い系を提供する。この細胞系はT.Kitamura et al.により1987年10月に重篤な再生不良性貧血の35歳の日本人男性に由来するヘパリン処理した骨髄吸引サンプルで樹立された。これらの細胞はインターロイキン3または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)に完全に依存している。
TF−1細胞系(ATCC、カタログ番号CRL−2003)をPRMI+FBS10%+GM−CSF(12ng/ml)中で成長させ、そして37C5%COでインキューベーションした。細胞を5000細胞/ml(培地)の濃度に懸濁し、そして200μlを96ウェルプレートに分配した。細胞を種々の濃度のEPO(0.1μg/ml〜10μg/ml)と48時間インキューベーションした。次に25μlのMTT(シグマM5655)を5mg/mlで加え、プレートを37℃で20分〜4時間インキューベーションし、100μlのイソプロパノール/HCl溶液(100mlのイソプロパノール+333μlのHCl 6N)を加え、570nm、および630nmまたは690nmのODを読み、そして570nmの読み取りから630nmまたは690nmの読み取りを引くことによりMTT生存能アッセイを行った。
図126は、シアリル化EPOおよび1KDaまたは10KDaのPEGでグリコPEG化されたEPOをインビトロのEPO生物活性試験に供した時の結果を含む。1KDaのPEGでグリコPEG化されたEPOは、両方とも約5μg/mlの濃度である時に非グリコPEG化EPOとほとんど同じ活性を有した。10KDaのPEGでグリコPEG化されたEPOは、両方とも約5μg/mlの濃度である時に非グリコPEG化EPOの約半分の活性を有した。
20.CHO細胞で生産されたインターフェロンαのグリコPEG化
アシアロ−インターフェロンαの調製。CHO細胞から生産されたインターフェロンαを2.5mg/mLで50mM Tris 50mM Tris−HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaClに溶解し、そして500μLにCentricon Plus20遠心フィルター中で濃縮する。この溶液を300mU/mLのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)と16時間、32℃インキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルを行う。次いで反応混合物を、前洗浄したN−(−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL/mL反応容量)に加え、そして洗浄したビーズを24時間、4℃で穏やかに回転する。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズをTris−EDTAバッファーで3回洗浄し、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、すべての上清をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そして50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対してさらに2回透析する。次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存する。IEFゲルに関する条件は、インビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する。天然な、および脱シアリル化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
インターフェロン−アルファ−(アルファ2,3)−シアリル−PEGの調製。脱シアリル化インターフェロンアルファを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST3Gal1と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、および脱シアリル化インターフェロン−アルファのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
インターフェロン−アルファ−(アルファ2,8)−シアリル−PEGの調製。アルファ2,3−シアリル化O−結合グリカンを含むCHOで生産されたインターフェロン−アルファを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのCST−IIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化インターフェロン−アルファのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
インターフェロン−アルファ−(アルファ2,6)−シアリル−PEGの調製。O−結合GlcNAcのみを含むインターフェロン−アルファを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6GlcNAcIまたはIIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化インターフェロン−アルファのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
21.CHO細胞で生産されたG−CSFのグリコPEG化
アシアロ−顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)の調製。CHO細胞で生産されたG−CSFを2.5mg/mLで50mM Tris 50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaClに溶解し、そして500μLにCentricon Plus20遠心フィルター中で濃縮する。この溶液を300mU/mLのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルを行う。次いで反応混合物は前洗浄したN−(−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL/mL反応容量)に加え、そして洗浄したビーズを24時間、4℃で穏やかに回転する。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズをTris−EDTAバッファーで3回洗浄し、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、すべての上清をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そして50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対してさらに2回透析する。次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存する。IEFゲルに関する条件は、インビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する。天然な、および脱シアリル化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
G−CSF−(アルファ2,3)−シアリル−PEGの調製。脱シアリル化G−CSFを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST3Gal1と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
G−CSF−(アルファ2,8)−シアリル−PEGの調製。アルファ2,3−シアリル化O−結合グリカンを含むCHO細胞で生産されたG−CSFを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのCST−IIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
G−CSF−(アルファ2,6)−シアリル−PEGの調製。O−結合GalNAcのみを含むG−CSFを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6GalNAcIまたはIIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
22.CHO細胞で生産されたEPOのO−結合グリカンのグリコPEG化
O−結合EPO−SA−PEG(10kDa)の調製。元々CHO細胞で生産されたアシアロ−EPOを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を5mM CMP−SAおよび0.1U/mL ST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸のN−結合グリカンへの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−14Cを加え;ペプチドは、メタノール、水を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物は放射能検出器を使用して検出する。反応が完了した時、溶液はCentricon−20フィルターを使用して濃縮する。残る溶液はCMP−SAがもはや検出できなくなるまで0.05M Tris(pH7.2)、0.15M NaCl、0.05%NaNとバッファーと交換して7.2mLの最終容量とする。次いで残りを0.05M Tris(pH7.2)、0.15M NaCl、0.05%NaNに2.5mg/mLタンパク質で再懸濁する。溶液はO−結合部位をグルコシル化するために、1mMのCMP−SA−PEG(10KDa)およびST3Gal1と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために反応の小アリコートは、トーソー ハースTSK−gel−3000分析カラムを使用したゲル濾過により分離し、PBSpH7.0で溶出し、そしてUV検出により分析する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.0)を使用してトーソー ハースTSK−gel−3000調製カラムを使用して精製し、UV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
23.抗体のグリコPEG化
この実施例は、抗体分子のO−結合グリカンをPEG化するための手順を説明する。ここでEnbrel(商標)は例として使用するが、当業者はこの手順が多くの抗体分子に使用できると考えるだろう。
Enbrel(商標)−SA−PEG(10KDa)の調製。PEG化の前にシアリル化されたO−結合グリカンを持つか、または持たないいずれかのEnbrel(商標)(TNF−レセプター−IgG−キメラ)を、2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を5mMのUDP−ガラクトースおよび0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてFc領域グルカンをガラクトースでキャップする。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、メタノールおよび水でトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン検出器を使用して定量する。
反応が完了した時、溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカーPEG(10KDa)および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−リンカー−PEGの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW分析カラムでゲル濾過により分離する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースTSK−Gel−3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
24.Remicade(商標)抗体のグリコPEG化
この実施例は、PEG分子をFc領域グリカンに導入することにより組換え抗体分子をグリコPEG化するための手順を説明する。ここでRemicade(商標)、TNF−R:IgGFc領域融合タンパク質は例示ペプチドである。
Remicade(商標)−Gal−PEG(10KDa)の調製。Remicadel(商標)を、2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのUDP−ガラクトース−PEG(10KDa)および0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてFc領域グルカンにPEGを導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースTSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
25.GlcNAc−ASN構造の生成およびPEG化:酵母で生産されたTPA
この実施例は、酵母で発現されたTPAのようなペプチド上のPEG化GlcNAc−ASN構造の調製を説明する。
酵母での発現は、1つのN−結合マンナン型構造を含むTPAを生じると予想される。
この組換え糖タンパク質は最初にエンドグリコシダーゼHで処理してペプチドのアスパラギン(Asn)残基上にGlcNAc構造を生成する。
次いでペプチド/タンパク質骨格上のGlcNAc−Asn構造は、ガラクトースまたはガラクトース−PEGで、それぞれUDP−ガラクトースまたはUDP−ガラクトース−6−PEG、およびGalT1のようなガラクトシルトランスフェラーゼを使用して修飾する。1例では、ガラクトース−PEGは末端残基である。2例目はガラクトースがさらにSA−PEGでCMP−SA−PEG供与体およびST3GalIIIのようなシアリルトランスフェラーゼを使用して修飾される。別の態様では、ペプチド/タンパク質骨格上のGlcNAc−Asn構造が上記のようにガラクトシル化およびシアリル化され、そしてさらにCMP−SA−PEGおよびカンピロバクター ジェジュニ(Campylobacter jejuni)cst−II遺伝子によりコードされる酵素のようなα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化される。
26.GlcNAc−ASN構造の生成およびPEG化:サッカロミセス(Saccharomyces)で生産されたGM−CSF
この実施例は、PEG化されたGlcNAc−Asn構造を持つ組織アクチベーターの調製を説明する。
酵母で発現される組換えGM−CSFは、2N−結合および2O−結合グリカンを含むと予想される。N−結合グリカンは分枝マンナン型であるはずである。この組換え糖タンパク質は、エンドグリコシダーゼH、エンドグリコシダーゼ−F1、エンドグリコシダーゼ−F2、エンドグリコシダーゼ−F3、エンドグリコシダーゼ−Mからなる群から選択されるエンドグリコシダーゼ単独で、またはマンノシダーゼI、IIおよびIIIと組み合わせて処理してペプチド/タンパク質骨格上のアスパラギン(Asn)残基上にGlcNAc結節(nub)を生成する。
次いでペプチド/タンパク質骨格上のGlcNAc−Asn構造は、ガラクトースまたはガラクトース−PEGで、それぞれUDP−ガラクトースまたはUDP−ガラクトース−6−PEG、およびGalT1のようなガラクトシルトランスフェラーゼを使用して修飾される。1例では、ガラクトース−PEGは末端残基である。2例目はガラクトースがさらにSA−PEGでCMP−SA−PEG供与体およびST3GalIIIのようなシアリルトランスフェラーゼを使用して修飾される。別の態様では、ペプチド/タンパク質骨格上のGlcNAc−Asn構造がガラクトシル化され、そして上記のようにシアリル化され、次いでCMP−SA−PEGおよびカンピロバクター ジェジュニ(Campylobacter jejuni)cst−II遺伝子によりコードされる酵素のようなα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してさらにシアリル化される。
C.低分子の複合糖質化(Glyco−conjugation)
27.CMP−SA−レブリネートの合成
この実施例はCMP−SA−レブリネートの合成手順を説明する。
2−レブリンアミド−2−デオキシ−D−マンノピラノースの調製。イソブチルクロロホルメート(100μL、0.77ミリモル)を、レブリン酸(86μL、0.84ミリモル)、無水THF(3mL)およびトリエチルアミン(127μL、0.91ミリモル)の溶液に滴下した。この溶液を3時間、室温で撹拌し、次いでD−マンノサミンヒドロクロライド(151mg、0.7ミリモル)、トリエチルアミン(127μL、0.91ミリモル)、THF(2mL)および水(2mL)を含む溶液に滴下した。反応混合物を15時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーションにより濃縮乾固した。クロマトグラフィー(シリカ、5〜15%のMeOH/CHClの段階勾配)を使用して生成物を単離し、0.156g(73%収率)の白色固体を得た:R= 0.41(シリカ,CHCl/MeOH/ 水 6/4/1);H NMR(DO,500 MHz)2.23(s,3H),2.24(s,3H),2.57(td,J=6.54,3.68,2H)2.63(t,J=6.71,2H),2.86−2.90(m,4H),3.42(m,1H),3.53(t,J=9.76,1H),3.64(t,J=9.43,1H),3.80−3.91(m,4H),4.04(dd,J=9.79,4.71,1H),4.31(dd,J=4.63,1.14,1H),4.45(dd,J=4.16,1.13,1H),5.02(d,J=1.29,1H),5.11(s,J=1.30,1H),MS(ES);理論値 C1119NO,277.27;測定値 [M+1] 277.9。
5−レブリンアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製。ピルビン酸ナトリウム(0.616g、5.6ミリモル)およびN−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ(50U)を、2−レブリンアミド−2−デオキシ−D−マンノピラノース(0.156g、0.56ミリモル)の溶液(0.1M HEPES、pH7.5中)に加えた。反応混合物を37℃に20時間加熱し、その後、凍結した。次いで反応混合物はC18シリカを通して濾過し、凍結し、そして凍結乾燥させた。粗固体はフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、最初に10〜40%MeOH/CHCl、次いでCHCl/MeOH/HO 6/4/0.5を使用する)を使用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮して45mg(80%収率)の白色固体を得た:R=0.15(シリカ,CHCl/MeOH/水 6/4/1);H NMR(DO,500MHz)81.82(t,J=11.9,1H),2.21(dd,J=13.76,4.84,1H),2.23(s,3H),2.57(app q,J=6.6,2H),2.86−2.95(m,2H),3.15−3.18(m,1H),3.28−3.61(複合,1H),3.60(dd,J=11.91,6.66,1H),3.75(td,J=6.65,2.62,1H),3.84(dd,J=11.89,2.65,1H),3.88−4.01(複合,2H),4.04(td,J=11.8,4.67,1H),MS(ES);理論値 C1423NO10,365.33;測
定値([M−1]),363.97。
シチジン−5’−モノホスホリル−(5−レブリンアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート)の調製。5−レブリンアミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(50mg、137マイクロモル)を2mLの100mM HEPES pH7.5バッファーに溶解し、そして1MのMnCl(300μL、300マイクロモル)を加えた。
CTP−2Na(79mg、1.5マイクロモル)を5mLのHEPESバッファーに溶解し、そして糖に加えた。シアリルトランスフェラーゼ/CMP−ノイラミン酸シンテターゼ融合酵素(11U)を加え、そして反応混合物を室温で45時間撹拌した。反応混合物を10,000MWCOフィルターに通して濾過し、そして濾液(これは反応の生成物を含む)をさらに精製せずに直接使用した:R=0.35(シリカ、IPA/水/NHOH 7/2/1)。
28.CHO細胞で生産されるグルコセレブロシダーゼ−マンノース−6−ホスフェート この実施例はマンノース−6−ホスフェートをCHO細胞で生産されたグルコセレブロシダーゼのようなペプチドに複合糖質化する手順を説明する。
アシアロ−グルコセラミダーゼの調製。CHO細胞で生産されたグルコセレブロシダーゼを2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl pH7.4、0.15M NaClに溶解し、これを300mU/mLのシアリダーゼ−アガロース結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルおよびSDS−PAGEをインビトロゲンの手順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズはTris−EDTAバッファーで3回、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄する。すべての上清をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そしてさらに2回、50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析する。
次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮する。反応の生成物はインビトロゲンにより供給される手順および試薬に従い、SDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
グルコセレブロシダーゼ−SA−リンカー−マンノース−6−ホスフェートの調製(手順1)。上からのアシアロ−グルコセレブロシダーゼを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースTSK−Gel−3000分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。蛍光標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン蛍光検出器を使用して定量する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
グルコセレブロシダーゼ−SA−リンカー−マンノース−6−ホスフェートの調製(手順2)。CHOで生産されたが不完全にシアリル化されているグルコセレブロシダーゼを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースTSK−Gel−3000分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。蛍光標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン蛍光検出器を使用して定量する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
29.ミトラマイシンの抗体への複合糖質化
この実施例は、ミトラマイシンのような低分子を哺乳動物細胞で生産された抗体分子のFc領域グリカンへ複合糖質化するため手順を説明する。ここで抗体Herceptin(商標)を使用するが、当業者はこの方法が多くの他の抗体に使用できると考えるだろう。
Herceptin(商標)−Gal−リンカー−ミトラマイシンの調製。Herceptin(商標)を2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのUDP−ガラクトース−リンカー−ミトラマイシンおよび0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてミトラマイシンをFc領域のグリカンに導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
30.ゲルダナマイシンの抗体への複合糖質化
この実施例は、ゲルダナマイシンのような低分子をCHO細胞で生産されたRituxan(商標)のような抗体のFc領域グリカンへ複合糖質化するための手順を説明する。
ここで抗体Rituxan(商標)を使用するが、当業者はこの方法が多くの他の抗体に使用できると考えるだろう。
Rituxan(商標)−Gal−リンカー−ゲルダナマイシンの調製。Rituxan(商標)を2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのUDP−ガラクトース−リンカー−ゲルダナマイシンおよび0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてゲルダナマイシンをFc領域のグリカンに導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへの標識の取り込みは、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
D.ペプチドの複合糖質化(Glyco−conjugation)
31.トランスフェリン−GDNF
この実施例はタンパク質の複合糖質化、そして特にトランスフェリンをGDNFに複合糖質化する手順について説明する。トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDP−はトランスフェリンから調製する。ガラクトース残基をGNDFグリカンから除去し、そしてトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPをGNDFグリカンにガラクトシルトランスフェラーゼを使用して結合する。
アガラクト−GDNFの調製。NSO細胞(NSOマウス骨髄腫細胞)で生産されたGDNFを2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaClに溶解し、そして300mU/mLのベータ−ガラクトシダーゼ−アガロース結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルをインビトロゲンの手順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。上清は4℃で50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そしてさらに2回、50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析する。透析した溶液は次いでCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存する。IEFゲルの条件はインビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析する。
トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPの調製。アシアロ−トランスフェリンを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液をCMP−シアル酸−リンカー−Gal−UDP(1モル当量のヌクレオチド糖をトランスフェリンに加えるモル量)および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸の取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−SA−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射能標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
この溶液を5mMのCMP−シアル酸および0.1U/mLのST3Gal3(未反応トランスフェリングリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーションする。ペプチドへの取り込みは、イン−ラインUV検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−GDNFの調製。上記のように調製したトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのアガラクト−GDNFおよび0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションする。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
反応が完了した時、溶液を5mMのUDP−Galおよび0.1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼ(未反応トランスフェリングリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーションし、続いて5mMのCMP−SAおよび0.1U/mLのST3Gal3を加える。さらに2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、UV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
32.グルコセレブロシダーゼ−トランスフェリン
この実施例はタンパク質の複合糖質化、そして特にトランスフェリンをグルコセレブロシダーゼに複合糖質化する手順について説明する。GlcNAc−ASN構造をグルコセレブロシダーゼ上に構築し、そしてトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPはGNDF GlcNAc−ASN構造にガラクトシルトランスフェラーゼを使用して結合する。
GlcNAc−グルコセレブロシダーゼ(Cerezyme(商標))の調製。CHO細胞で生産されたCerezyme(商標)(グルコセレブロシダーゼ)を2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaClに溶解し、そして300mU/mLのエンド−H−アガロース結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルおよびSDS−PAGEをインビトロゲンの手順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズはTris−EDTAバッファーで3回、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、そしてすべての上清をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析し、そしてさらに2回、50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaNに対して透析する。次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮する。反応の生成物はインビトロゲンにより供給される手順および試薬に従い、SDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−グルコセレブロシダーゼの調製。上からのトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのGlcNAc−グルコセレブロシダーゼおよび0.1U/mのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションする。グルコセレブロシダーゼの取り込みを監視するために、ペプチドは、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離し、そしてU吸収により生成物を検出する。反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、UV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
33.EPO−トランスフェリン
この実施例はタンパク質のO−結合グリカンへの複合糖質化、そして特にトランスフェリンをEPOに複合糖質化する手順について説明する。シアル酸残基はEPOのO−結合グリカンから除去し、そしてEPO−SA−リンカー−SA−CMPを調製する。EPO−SA−リンカー−SA−CMPをアシアロトランスフェリンにST3Gal3で複合糖質化する。
O−結合アシアロ−EPOの調製。CHO細胞で生産されたEPO(エリトロポエチン)を2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl pH7.4、0.15M NaClに溶解し、これを300mUのシアリダーゼ(ビブリオ コレラ:Vibrio cholera)−アガロース結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてインビトロゲンの手順に従いIEFゲルを行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。上清は約2.5mg/mLのEOP濃度に50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2中で濃縮する。この溶液を5mMのCMP−シアル酸および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸の取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース G3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
EPO−SA−リンカー−SA−CMPの調製。50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2中のO−結合アシアロ−EPO2.5mg/mL。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−SA−CMPおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−リンカー−SA−CMPの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離する。
2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース G3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
トランスフェリン−SA−リンカー−SA−EPOの調製。上からのEPO−SA−リンカー−SA−CMPは2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのアシアロ−トランスフェリンおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。トランスフェリンの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物をUV吸収により検出する。反応が完了した時、溶液を5mMのCMP−SAおよび0.1U/mLのST3Gal3(未反応のトランスフェリングリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーションする。反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そして画分をUV吸収に基づき集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
34.EPO−GDNF
この実施例はペプチドの複合糖質化の手順、そして特にEPO−SA−リンカー−SA−GDNFの調製について説明する。
EPO−SA−リンカー−SA−GDNFの調製。上からのEPO−SA−リンカー−SA−CMPは2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのGDNF(NSOで生産)および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。GDNFの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物をUV吸収により検出する。反応が完了した時、溶液を5mMのCMP−SAおよび0.1U/mLのST3Gal3(未反応のGDNFグリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーションする。反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そして画分をUV吸収に基づき集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。
サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
本明細書に引用するすべての特許、特許出願、および公報の開示は、引用により全部、本明細書に編入する。
本発明は具体的な態様に関して開示してきたが、本発明の他の態様および変更は本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者により考案され得ることは明らかである。
添付する特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および均等な変更物を含むと解釈されるものとする。

Claims (11)

  1. ペプチドと水溶性ポリマーとの共有結合物であって、
    前記水溶性ポリマーが天然に存在する糖ではなく、かつ、前記水溶性ポリマーがインタクトなグリコシル連結基を介して前記ペプチドに結合し
    前記インタクトなグリコシル連結基は前記ペプチドに前記修飾基を結合する個々のサッカリドモノマーが酸化されていないグリコシル部分であり、
    前記水溶性ポリマーがポリ(アルキレンオキシド)である、共有結合物。
  2. 前記ポリ(アルキレンオキシド)がポリ(エチレングリコール)である、請求項に記載の共有結合物。
  3. 前記ポリ(エチレングリコール)が直鎖ポリ(エチレングリコール)および分岐ポリ(エチレングリコール)から選択されるメンバーである、請求項に記載の共有結合物。
  4. 前記インタクトなグリコシル連結基が炭水化物部分、アミノ酸部分、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合している、請求項のいずれか一項に記載の共有結合物。
  5. 前記インタクトなグリコシル連結基がO−またはN−結合グリカンおよびそれらの組み合わせから選択されるメンバーである炭水化物部分に結合している、請求項に記載の共有結合物。
  6. 前記インタクトなグリコシル連結基が前記アミノ酸部分のヒドロキシルもしくはアミノ基またはそれらの組み合わせに結合している、請求項に記載の共有結合物。
  7. 前記インタクトなグリコシル連結基がシアル酸、ガラクトース、N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン残基を含む、請求項に記載の共有結合物。
  8. 前記水溶性ポリマーがシアル酸残基に、前記シアル酸残基の5位及び9位から選択される位置で結合している、請求項に記載の共有結合物。
  9. 前記ペプチドが治療薬である、請求項のいずれか一項に記載の共有結合物。
  10. 前記ペプチドが顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンよりなる群から選択される、請求項のいずれか一項に記載の共有結合物。
  11. 請求項10のいずれか一項に記載の共有結合物および製薬学的に許容され得る希釈剤を含む医薬組成物。
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