PL181064B1 - Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy - Google Patents

Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy

Info

Publication number
PL181064B1
PL181064B1 PL95311633A PL31163395A PL181064B1 PL 181064 B1 PL181064 B1 PL 181064B1 PL 95311633 A PL95311633 A PL 95311633A PL 31163395 A PL31163395 A PL 31163395A PL 181064 B1 PL181064 B1 PL 181064B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dendrimer
polymer
genetic material
dendritic
complex
Prior art date
Application number
PL95311633A
Other languages
English (en)
Other versions
PL311633A1 (en
Inventor
Donald A. Tomalia
James R. Baker
Anna Bielinska
Herbert M. Brothers
Roberta C. Cheng
Michael J. Fazio
David M. Hedstrand
Jennifer A. Johnson
Donald A. Kaplan
Scott L. Klakamp
Jr Kruper William J.
Jolanta Kukowska-Latallo
Bartley D. Maxon
Lars. T. Piehler
Ian A. Tomlinson
Larry R. Wilson
Rui Yin
Original Assignee
Dendritech Inc
Dow Chemical Co
Univ Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dendritech Inc, Dow Chemical Co, Univ Michigan filed Critical Dendritech Inc
Publication of PL311633A1 publication Critical patent/PL311633A1/xx
Publication of PL181064B1 publication Critical patent/PL181064B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/085—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier conjugated systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/124—Macromolecular compounds dendrimers, dendrons, hyperbranched compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/01—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C211/26—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring
    • C07C211/29—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring the carbon skeleton being further substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/11—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/005—Dendritic macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/16—Dendrimers and dendritic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

1 Kompleks polimeru typu gestej gwiazdy, zawierajacy polimer i mo- dyfikalor odpowiedzi biologicznej, znam ienny tym, ze jako polimer zawie­ ra co najmniej jeden dendrymer zasocjowany z co najmniej jedna jednostka materialu genetycznego jako mody fikatorem odpowiedzi biologicznej, przy czym dendrymer stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalni­ ku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedna galaz wychodzaca z rdzenia, która to galaz zawiera co najmniej jedna grupe koncowa, z tym ze (1 ) stosunek grup koncowych do galezi rdzenia wynosi dwa lub wiecej, (2) gestosc grup koncowych w przeliczeniu na jednostke objetosci po­ limeru jest co najmniej 1,5 razy wieksza od gestosci wydluzonego konwe­ ncjonalnego polimeru gwiazdzistego o podobnym rdzeniu i skladnikach monomerycznych majacego porównywalny ciezar czasteczkowy i liczbe galezi, przy czym kazda z galezi wydluzonego konwencjonalnego polimeru gwiazdzistego zawiera tylko jedna grupe koncowa, 7 Kompleks polimeru typu gestej gwiazdy o wzorze (T)e(P)x*(M )y (II), w którym kazdy z P oznacza polimer typu gestej gwiazdy, X oznacza liczbe calkowita równa 1 lub wieksza, 11 Kompozycja do przenoszenia materialu genetycznego, znamienna tym, ze zawiera kompleks polimeru dendrytowego zasocjowanego z co naj­ mniej jedna jednostka materialu genetycznego. F IG 3 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy.
W ostatnich latach nastąpił rozwój polimerów określanych jako polimery typu gęstej gwiazdy lub polimery Starburst™(znak towarowy Dendritech Inc.). Stwierdzono, że wielkość, kształt i właściwości takich polimerów typu gęstej gwiazdy można dopasowywać na poziomie molekularnym do specjalnych zastosowań. Polimery typu gęstej gwiazdy wykazują znaczące zalety, tak że mogą stanowić środki doprowadzania przenoszonego materiału w wysokim stężeniu w odniesieniu do jednostki polimeru, doprowadzania kontrolowanego, doprowadzania ukierunkowanego i/lub doprowadzania lub zastosowania wielu składników.
Wynalazek dotyczy materiałów w postaci kompleksów polimerowych, w których polimery typu gęstej gwiazdy zasocjowane sąz żądanym materiałem genetycznym (poniżej takie kompleksy polimerowe będą często określane jako „kompleksy polimerów typu gęstej gwiazdy”, „kompleksy typu gęstej gwiazdy” lub „kompleksy”), sposobu wytwarzania takich kompleksów oraz kompozycji zawierających takie kompleksy, służących do przenoszenia materiału genetycznego.
181 064
Koniugat według wynalazku zawiera co najmniej jeden polimer typu gęstej gwiazdy zasocjowany z co najmniej jedną jednostką materiału genetycznego.
Wynalazek obejmuje także odmianę tego kompleksu, w którym polimer typu gęstej gwiazdy zasocjowany jest z co najmniej jednym prowadnikiem docelowym i z co najmniej jedną jednostką materiału genetycznego.
Kompleksy według wynalazku wraz z dopuszczalnymi nośnikami, rozcieńczalnikami lub wypełniaczami, odpowiednio do przewidywanego zastosowania, np. farmaceutycznego lub rolniczego, tworzą kompozycję, która także wchodzi w zakres wynalazku.
Kompleksy według wynalazku nadają się do wykorzystania w wielu zastosowaniach, w których pożądane jest swoiste dostarczenie materiału genetycznego.
Kompleks według wynalazku zawiera co najmniej jeden dendrymer połączony z co najmniej jedną jednostką materiału genetycznego jako modyfikatorem odpowiedzi biologicznej, przy czym dendrymer stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, przy czym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100.
Polimer dendiytowy zawiera (a) rdzeń inicjujący, (b) co najmniej dwie koncentryczne warstwy dendrytowe („generacje”) z symetrycznymi połączeniami gałęziowymi, przy czym warstwy te rozchodzą się promieniowo w postępie geometrycznym od gałęzi rdzeniowej, tak że stosunek grup końcowych do gałęzi rdzeniowej (rdzeniowych) wynosi co najmniej 4:1, oraz (c) powierzchnię zewnętrzną o końcowej funkcyjności.
W jeszcze inny sposób takie polimery typu gęstej gwiazdy można określić jako klasę polimerów dendrytowych, w której polimer dendrytowy:
(i) charakteryzuje się regularnie rozgałęzioną strukturą zasadniczo przedstawioną poniższym wzorem (1), zawierającą rdzeń (C) o liczbie (s) wartościowości lub miejsc funkcyjnych wynoszącej jeden lub więcej, przy czym co najmniej jedna z wartościowości rdzenia (C) połączona jest z grupą (B) poprzez grupę (A), grupa (B) zawiera co najmniej dwa miejsca funkcyjne (rb r2...) po połączeniu z grupą (A), zespół (AB) utworzony przez połączenie grupy (A) z grupą (B) stanowi gałąź, gałęzie (AB) powtarzają się w pożądanej liczbie generacji (G) wynoszącej co najmniej 3, a miejsca fimkcyjne grupy (B) w każdej z ostatnich gałęzi (AB) są zablokowane co najmniej dwoma atomami (rG) lub grupami atomów (X):
Wzór 1:
C[AB(AB(AB....(AB(ABXrG)rGJrG_2..J (1) gdzie każdaz liczb indeksowych 1,2....G-l iG w rb r2...·^ irG oznacza numer każdej generacji zwiększającej się gałęzi (AB), licząc pierwszą gałąź lub gałęzie (AB) połączone z rdzeniem (C) jako pierwszą generację, czyli G = 1, każdy z rb r2,.....i rG oznacza liczbę miejsc funkcyjnych w grupie (B) gałęzie (AB) odpowiedniej generacji, przy czym takie miejsce funkcyjne jest zdolne do połączenia się z grupą (A) innej gałęzi (AB) następnej generacji, s oznacza liczbę całkowitą równą co najmniej 1, ale nie większąniż liczba wartościowości lub miejsc funkcyjnych w rdzeniu (C), każda z grup (A) i (B) może być taka sama lub różna w każdej generacj i, a X oznacza atomy lub grupy atomów blokujące miejsca funkcyjne grup funkcyjnych (B) ostatnich gałęzi (AB), przy czym mogą być one takie same lub różne.
181 064
Stosowane tu określenie „materiał genetyczny” odnosi się do materiałów opartych na nukleotydach i obejmuje, ale nie wyłącznie, wirusy i fragmenty wirusów, plazmidy, fagi, kosmidy, geny i fragmenty genów (np. egzony, introny), kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), zarówno jedno jak i dwuniciowy, kwas rybonukleinowy (RNA), rybosomowy RNA (rRNA), katalityczny RNA (cRNA), mały jądrowy RNA (snRNA), informacyjny RNA (mRNA), przenośnikowy RNA (tRNA), oligonukleotydy DNA i RNA (zarówno jedno-jak i dwuniciowe) albo oligomery i (anty-sensowne)oligonukleotydy, białkowe kwasy nukleinowe (PNA) i podstawione oligonukleotydy kwasów nukleinowych. Materiał genetyczny, zwłaszcza w postaci wirusów i fragmentów wirusów, może być skompleksowany lub sprzężony z pewną ilością białka. Określenie „materiał genetyczny” obejmuje także „modyfikowane oligonukleotydy” opisane dokładniej poniżej.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy zapewniają liczne korzyści w porównaniu z innymi znanymi nośnikami z uwagi na korzystne właściwości polimerów typu gęstej gwiazdy. Polimery typu gęstej gwiazdy stanowią określony typ polimerów dendrytowych. Jednak zastosować również można inne typy polimerów dendrytowych.
„Polimer dendrytowy” stanowi polimer z regularnymi rozgałęzieniami dendrytowymi, wytworzony w wyniku sekwencyjnej lub generacyjnej addycji rozgałęzionych warstw do lub od rdzenia. Określenie polimer dendrytowy obejmuje „dendrymery”, które zawierają rdzeń, co najmniej jedną wewnętrzną rozgałęzioną warstwę i powierzchniową rozgałęzioną warstwę (patrz PetarR. Dvomic i Donald A. Tomalia, Chem. in Britain, 641-645, sierpień 1994). „Dendron” stanowi fragment dendrymeru zawierający gałęzie rozchodzące się z punktu ogniskowego, który jest lub może być połączony z rdzeniem, bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą, tworząc dendrymer. Wiele dendrymerów zawiera dwa lub więcej dendronów połączonych ze wspólnym rdzeniem. Jednakże określenie dendrymer jest używane w szerokim zakresie, tak że obejmuje również pojedynczy dendron.
Do polimerów dendrytowych należą ale nie wyłącznie, symetrycznie i niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery, cząsteczki kaskadowe, arborole itp., z tym że najkorzystniejszymi polimerami dendrytowymi są polimery typu gęstej gwiazdy. Ujawnione polimery typu gęstej gwiazdy PAMAM są symetryczne, co oznacza, że zawierają ramiona gałęzi o równej długości. Rozgałęzienie występuje przy atomach wodoru końcowej grupy - NH2 gałęzi poprzedniej generacji. Dendrymery oparte na lizynie są niesymetryczne, gdyż zawierają ramiona gałęzi o różnej długości. Jedna gałąź występuje przy ε-azocie cząsteczki lizyny, a druga gałąź występuje przy α-azocie w sąsiedztwie reaktywnej grupy karboksylowej, która przyłącza gałąź do gałęzi poprzedniej generacji.
Hiperrozgałęzione polimery, np. hiperrozgałęzione poliole, mimo iż nie zostały wytworzone przez regularną kolej nąaddycję rozgałęzionych warstw, mogą być równoważne polimerowi dendrytowemu, gdy charakter rozgałęzień wykazuje stopień regularności zbliżony do występującego w dendrymerze.
Polimery typu gęstej gwiazdy wykazują architekturę cząsteczkową charakteryzującą się regularnymi rozgałęzieniami dendrytowi z symetrią promieniową to znaczy w punkcie rozgałęzienia. Takie promieniowo symetryczne cząsteczki określa się jako cząsteczki o „topologii gęstej gwiazdy”. Polimery takie wytwarza się w sposób umożliwiający powstanie koncentrycznych dendrytowych kondygnacji wokół rdzenia inicjatora. Topologie gęstej gwiazdy uzyskuje się przez uporządkowane zestawianie organicznych merów w koncentrycznych, dendrytowych kondygnacjach wokół rdzenia inicjatora; osiąga się to wprowadzając wielokrotność i samopowielanie (w każdej kondygnacji) w postępie geometrycznym, poprzez szereg generacji cząsteczek. Uzyskane silnie fimkcjonalizowane cząsteczki określono jako „dendrymery”, aby podkreślić ich rozgałęzioną (drzewopodobną) strukturę i oligomeryczny charakter. I tak określenia oligomer typu gęstej gwiazdy i dendrymer typu gęstej gwiazdy oraz dendrymer Starburst™ objęte są określeniami polimer typu gęstej gwiazdy lub polimer Starburst™.
Polimery topologiczne z domenami o kontrolowanej wielkości i kształcie, stanowią dendrymery zasocjowane ze sobą(np. kowalencyjnie poprzez mostki lub w inny sposób, jak to opisano poniżej) poprzez ich reaktywne grupy końcowe i określane jako „dendrymery mostkowe”
181 064 typu gęstej gwiazdy. Określenie dendrymer mostkowy również wchodzi w zakres określenia „polimer typu gęstej gwiazdy” lub polimer Starburst™. Gdy więcej niż dwa dendrymery typu gęstej gwiazdy są ze sobązasocjowane, to określane sąonejako „agregaty typu gęstej gwiazdy” lub „agregaty Starburst™”, przy czym określenia te również wchodzą w zakres określenia „polimer typu gęstej gwiazdy” lub polimer Starburst™.
W związku z tym do polimerów dendrytowych należą zarówno dendrymery mostkowe jak i agregaty dendrymerów. Polimery dendrytowe obejmujągeneracyjnie zarówno monodyspersyjne jak i polidyspersyjne roztwory dendrymerów. W roztworze monodyspersyjnym zasadniczo wszystkie dendrymery są tej samej generacji i w związku z tym mająrównomiemy kształt i wygląd. Roztwory polidyspersyjne charakteryzują się rozrzutem różnych generacji dendrymerów.
Do polimerów dendrytowych należą również dendrymery modyfikowane powierzchniowo. Tak np. powierzchnia dendrymeru PAMAM może zostać zmodyfikowana w wyniku addycji aminokwasu, np. lizyny lub argininy.
Należy zdawać sobie sprawę, że odniesienie do dowolnego określonego typu polimeru dendrytowego takiego jak „polimer”, np. „polimer typu gęstej gwiazdy”, „niesymetryczny polimer dendrytowy” lub „polimer kaskadowy”, obejmuje również dendrymery mostkowe tego typu, agregaty dendrymerów tego typu, polidyspersyjne dendrymery tego typu i powierzchniowo modyfikowane dendrymery tego typu.
Kompleksy polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym są przydatne w wielu zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych. Przykładowo kompleksy polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym znajdują szerokie zastosowanie w terapii genowej, analizie, modyfikacji, aktywacji, zastosowaniach technik antysensownych itp.
Wynalazek dotyczy też kompozycji do przenoszenia materiału genetycznego zawierającej określony powyżej kompleks polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym, ewentualnie w roztworze z DEAE-dekstranem oraz dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik. Odmiana tej kompozycji, która także wchodzi w zakres wynalazku, zawiera kompleks pierwszego polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym, który został umieszczony w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, przy czym ten drugi polimer dendrytowy jest większy niż pierwszy polimer dendrytowy.
Wynalazek obejmuje swym zakresem również sposób wytwarzania takich kompleksów.
Sposobem według wynalazku kompleks wytwarza się przez (1) reakcję polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku i w temperaturze ułatwiającej skompleksowanie materiału genetycznego z polimerem dendrytowym, przy czym sposób ten ewentualnie obejmuje umieszczenie kompleksu w roztworze z DEAE-dekstranem lub z gliceryną albo (2) kompleksowanie materiału genetycznego z pierwszym polimerem dendrytowym na drodze reakcji polimeru z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku i w temperaturze ułatwiającej zasocjowanie materiału genetycznego z polimerem, umieszczenie tego kompleksu w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, przy czym ten drugi polimer dendrytowy jest większy niż pierwszy polimer dendrytowy. W szczególności w powyższym procesie (1) 1 -10 pg, materiału genetycznego/ml lub na 20 ml, zależnie od pożądanego stężenia, poddaje się reakcji z wystarczającą ilościąpolimeru dendrytowego przy pH około 5-10, w temperaturze około 20-40°C, uzyskując kompleks materiału genetycznego z polimerem o składzie od około 3:1 do 1:10 000. Dokładniejsze omówienie sposobów przedstawiono poniżej.
Kompleksy według wynalazku można stosować do transfekcji komórek w celu dostarczenia do nich materiału genetycznego. Kompleksowanie stabilizuje i ściąga materiał genetyczny, chroni go przed strawieniem w czasie dochodzenia do komórki i transfekcji w komórce, a także ułatwia przenoszenie materiału genetycznego przez błonę komórkową i do komórki, w tym do jądra komórkowego.
Kompleksy według wynalazku służą do przenoszenia materiału genetycznego przez błonę komórkową i do jądra komórkowego.
Materiał genetyczny skompleksowany z polimerem dendrytowym jest chroniony przed trawieniem go przez enzymy trawiące w czasie dochodzenia do komórki i transfekcj i w komórce.
181 064
Kompleksowanie materiału genetycznego z polimerem dendrytowym pozwala na stabilizowanie i gęste upakowanie materiału genetycznego
Krótki opis rysunków
Poniższy opis rysunków ułatwi zrozumienie wynalazku.
Na figurze 1 pokazano różne generacje dendrymerów typu gęstej gwiazdy.
Na figurze 2(A) pokazano dendrymer z niesymetrycznymi (nierównymi) połączeniami gałęziowymi.
Na figurze 2(B) pokazano dendrymer z symetrycznymi (równymi) połączeniami gałęziowymi.
Na figurze 3 pokazano rodzinę dendrymerów o różnych wielkościach [I, II, III z (B)] w porównaniu z wymiarami przeciwciała (A).
Na figurze 4 przedstawiono czasy relaksacji spinowosieciowej (T]) w 13C NMRdla aspiryny wprowadzonej do dendrymerów różnych generacji, patrz przykład 1. Na osi pionowej podano czas (s), a na osi poziomej generacje dodanego dendrymeru typu gęstej gwiazdy PAMAM.
Na figurze 5 przedstawiono wyniki analizy dynamicznej z przykładu 2. Na osi pionowej przedstawiono procent (%) leku w fazie receptorowej, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 6 przedstawiono wpływ dendrymeru o generacji 6,5 na szybkość dializy pseudoefedryny przy pH 9,5, z przykładu 2. Na osi pionowej podano procent (%) leku w przedziale receptorowym, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 7 przedstawiono wpływ hydrolizy dendrymeru na przenikanie pseudoefedryny w przykładzie 3. Na osi pionowej podano procent (%) leku w przedziale receptorowym, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 8 przedstawiono porównanie zawartości w procentach kwasu salicylowego w przedziale receptorowym w obecności polimeru typu gęstej gwiazdy (Gen = 4) przy pH 5,0 i 6,65 z kontrolnym kwasem salicylowym, przykład 4. Na osi pionowej podano procent (%) leku w przedziale receptorowym, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 9 przedstawiono porównanie ubytku w procentach kwasu salicylowego z przedziału donorowego w obecności polimeru typu gęstej gwiazdy (Gen = 4) przy pH 8,0 z kontrolnym kwasem salicylowym, przykład 4. Na osi pionowej podano procent (%) leku w przedziale receptorowym, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 10 przedstawiono porównanie ubytku w procentach kwasu salicylowego z przedziału donorowego w obecności polimeru typu gęstej gwiazdy (Gen=4,5) przy pH 8,0 z kontrolnym kwasem salicylowym, przykład 4. Na osi pionowej podano procent (%) leku w przedziale receptorowym, a na osi poziomej czas (w godzinach).
Na figurze 11 przedstawiono czasy relaksacji spinowosieciowej (T J w l3C NMR dla 2,4-D wprowadzonego do dendrymerów różnych generacji, patrz przykład 15. Na osi pionowej podano czas (s), a na osi poziomej generację dodanego dendrymeru typu gęstej gwiazdy PAMAM.
Na figurze 12 przedstawiono wykres słupkowy porównujący zdolność DNA do transfekcji dla dendrymerów o różnych stosunkach obciążania DNA: dendrymer, poprzez badanie aktywności lucyferazy po transfekcji, patrz przykład 15. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek (podane w przykładzie 44) dla próbki kontrolnej oraz różnych dendrymerów i kompleksów DNA, przy różnych stosunkach ładunków DNA : dendrymer, zestawionych w tabeli XV.
Na figurze 13 porównano zdolność wiązania DNA przez dendrymery przy różnych stosunkach ładunków DNA: dendrymer, z wykorzystaniem tych samych kompleksów DNA: dendrymer, które pokazano na fig. 12, z przykładu 44, z wykorzystaniem żelu do elektroforezy.
Na figurze 14 pokazano wykres procentowego wzrostu transfekcji w stosunku do próbki kontrolnej, w funkcji generacji dendrymeru stosowanego w kompleksie DNA: dendrymer z przykładu 45. Na osi pionowej podano procent wzrostu transfekcji w stosunku do kontrolnego dekstranu, a na osi poziomej generację dendrymeru. Pełnymi kółkami zaznaczono dendrymery
181 064 z rdzeniem z amoniaku (NH3), a pełnymi kwadratami dendrymery z rdzeniem z etylenodiaminy (EDA).
Na figurze 15 przedstawiono wykres słupkowy porównujący wpływ kolejności dodawania różnych dendrymerów do kompleksu DNA: dendrymer na wydajność transfekcji komórek RAT2, dla dendrymerów z rdzeniem z etylenodiaminy (EDA), przykład 46. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stężenie (pM) drugiego dendrymeru. Puste słupki przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G9, do którego dodano dendrymer G5. Słupki zakreskowane ukośnie przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G5, do którego dodano dendrymer G9.
Na figurze 16 przedstawiono te same informacje, co na fig. 15, ale dla dendrymerów z rdzeniem z amoniaku (NH3). NA osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stężenie (μΜ) drugiego dendrymeru. Puste słupki przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G9, do którego dodano dendrymer G5. Słupki zakreskowane ukośnie przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G5, do którego dodano dendrymer G9.
Na figurze 17 przedstawiono jednostki światła/pg białka po transfekcji przeprowadzonej z wykorzystaniem różnych koniugatów DNA-dendrymer i próbek kontrolnych, w różnych warunkach, przykład 42. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek dla próbek kontrolnych oraz różnych dendrymerów i różnych kompleksów DNA: dendrymer przy różnych stosunkach DNA: dendrymer, zestawionych w tabeli XIII.
Figura 18 jest podobna na figury 17, ale przedstawia dane dla stosunków dendrymer: DNA w szerszym zakresie. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek dla próbek kontrolnych oraz różnych dendrymerów i różnych kompleksów DNA: dendrymer przy różnych stosunkach DNA: dendrymer, zestawionych w tabeli XIV.
Na figurze 19 przedstawiono wykres słupkowy względnych jednostek światła/pg białka dla transfekcji koniugatu dendrymer: DNA w odniesieniu do dendrymerów A-S, przykład 42. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosowany dendrymer, przy czym w każdym segmencie osi wyniki podano dla stosunku DNA: dendrymer 1:2, 1:2, 1:10, 1:10, 1:20 i 1:20.
Na figurze 20 pokazano porównanie właściwości kompleksujących szeregu dendrymerów z rdzeniem z amoniaku (NH3) z 15-nukłeotydowym, syntetycznym, jednoniciowym DNA, przykład 47, na żelu do elektroforezy.
Na figurze 21 przedstawiono wchłanianie radioznaczonego 23-nukleotydowego, syntetycznego dwuniciowego oligomeru przez linię komórek monocytowych w czasie, porównując transfekcję samego DNA, transfekcję DNA skompleksowanego z dendrymerem 8 generacji (G8) z rdzeniem z amoniaku (NH3) [czyli dendrymerem G8(NH3)] oraz transfekcję kompleksów DNA-dendrymer w obecności azydku sodowego, przykład 47. Na osi pionowej podano wchłanianie w 102 impulsów/104 komórek, a na osi poziomej czas (w godzinach). Pełne kwadraty dotyczą23-nukleotydowego, syntetycznego oligomeru jednoniciowego; pełne kółka dotyczą kompleksu DNA/dendrymer G8 (NH3); apełne trójkąty do ty cząkompleksu DNA/dendrymer G8 (NH3) z dodatkiem azydku sodowego.
Na figurze 22 przedstawiono wykres słupkowy transfekcji w zależności od kompleksu dendrymer-DNA, w którym DNA jest w części liniowy, w części kolisty, a w części superskłębiony, przykład 48. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej kompleks dendrymer-DNA. Pustymi słupkami przedstawiono wyniki uzyskane bez stosowania DEAE-dekstranu. Pełnymi słupkami przedstawiono wyniki uzyskane w 0,5 μΜ DEAE w dekstranie.
Na figurze 23 (A) - (D) przedstawiono zdjęcia 4 żeli do elektroforezy pokazując zdolność do kompleksowania DNA przez dendrymer G8 (NH3) i dendrymer G8 (EDA) przy różnych stosunkach obciążania i w różnych warunkach, przykład 49.
181 064
Na figurze 24 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy porównujące zdolność do wiązania DNA przez dendrymery G8 (NH3) i G11 (EDA) przy różnych stosunkach molowych, przykład 50.
Na figurze 25 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy porównujące zdolność do wiązania DNA przez dendrymery G8 (NH3) i G8 (EDA) w szerokim zakresie pH, przykład 51.
Na figurze 26 (A) i (B) przedstawiono zdjęcia żeli do elektroforezy ilustrujące stabilność wiązania DNA-dendrymer w roztworach soli o wzrastającym stężeniu chlorku sodowego, przykład 52.
Na figurze 27 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące stabilność i ochronę DNA skompleksowanego z dendrymerami G8 (NH3) i Gil (EDA) w obecności różnych enzymów restrykcyjnych, przykład 53.
Na figurze 28 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące stabilność i ochronę DNA skompleksowanego z dendrymerami G8 (EDA) w obecności nukleaz komórkowych, przykład 54.
Na figurze 29 porównano zakres transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami przy różnych stosunkach ładunków DNA: dendrymer i przy różnych stężeniach DNA w odniesieniu do tej samej kombinacji w obecności dietyloaminoetylowego eteru dekstranu (DEAE-dekstran). Są to przykłady transfekcji lipidami, z zastosowaniem środka Lipofectin™ zamiast dendrymeru oraz bez stosowania DEAE-dekstranu, przykład 55. Na osi pionowej umieszczono plazmid kontrolny, dekstran kontrolny i różne plazmidowe kompleksy z 1 pg, 5 pg i 10 pg DNA, a na osi poziomej względne jednostki światła/pg białka. Słupki ukośnie zakreskowane reprezentują wyniki dla układu dendrymer/DEAE-dekstran. Słupki zakreskowane krzyżykami reprezentują wyniki dla samego dendrymeru. Słupki zakropkowane reprezentują wyniki dla środka Lipofectin™.
Na figurze 30 przedstawiono stopień transfekcji dla dendrymerów (NH3) i dendrymerów (EDA) przy różnych stosunkach ładunków DNA-dendrymer, w pewnych przypadkach w obecności DEAE-dekstranu, a w innych bez DEAE-dekstranu, przykład 56. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA: dendrymer. Pełne kwadraty i ciągła linia odnoszą się do dendrymeru G9 (EDA); puste kwadraty i linia kreskowana odnoszą się do dendrymerów G9 (EDA) z DEAE-dekstranem; pełne kwadraty i ciągła linia odnoszą się do dendrymeru G9 (NH3); puste kwadraty i linia kreskowana odnoszą się do dendrymerów G9 (NH3) z DEAE-dekstranem.
Figura 31 jest podobna do figury 30, lecz dotyczy dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów Gil (EDA), zawsze w obecności DEAE-dekstranu, przykład 56. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer. Pełne kółka podnoszą się do dendrymeru G8 (NH3), a pełne trójkąty odnoszą się do dendrymeru Gil (EDA).
Na figurze 32 przedstawiono wykres skuteczności transfekcji kompleksów DNA: dendrymer G7 (NH3), w obecności DEAE-dekstranu lub roztworu soli z dodatkiem buforu Hanksa (HBS), przykład 57. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer. Pełne kółka odnoszą się do roztworu soli z buforem Hanksa, a pełne trójkąty odnoszą się do DEAE-dekstranu.
Na figurze 33 przedstawiono wykres procentowego wzrostu transfekcji kompleksów dendrymer(NH3)-DNA w DEAE-dekstranie przy różnych stosunkach ładunków DNA: dendrymer, przykład 58. Na osi pionowej podano procentowy wzrost transfekcji (w stosunku do kontrolnego DEAE-dekstranu), a na osi poziomej generację dendrymeru. Słupki zakreskowane ukośnie odnoszą się do stosunku ładunków 1:1, słupki puste dotyczą stosunku ładunków 1:5, a słupki zakreskowane krzyżykami dotyczą stosunku ładunków 1:10.
Na figurze 34 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o różnym stosunku ładunków, w obecności DEAE-dekstranu i bez DEAE-dekstranu, przykład 59. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer (na końcu z prawej strony umieszczono próbkę kontrolną, plaż
181 064 mid/DEAE-dekstran). Słupki puste dotyczą DEAE-dekstranu; słupki pełne dotyczą układu bez DEAE-dekstranu.
Na figurze 35 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA: dendrymer o różnym stosunku ładunków i przy różnych stężeniach DEAE-dekstranu, przykład 60. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na górnej osi poziomej podano stężenie DEAE-dekstranu (pM); na dolnej osi poziomej podano różne stosunki ładunków DNA:dendrymer dla każdego segmentu, w tym plazmidu kontrolnego.
Na figurze 36 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o stosunku ładunków 1:5 w porównaniu z transfekcjami z udziałem Lipofectin™ w różnych liniach komórkowych, przykład 61. Liczby na osi pionowej oznaczają numery próbek identyfikujące stosowane środki transfekcyjne (podane w przykładzie 61); a na osi poziomej względne jednostki światła/pg białka. Kolejne segmenty (w dół wykresu) badanych linii komórkowych są następujące: małpa: COS 7; ludzka: HMEC-1, mysz: 10-1; mysz: NIH 3T3 i szczur: Klon 9.
Na figurze 37 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o stosunku ładunków 1:5 w dwóch trudnych do transfekowania liniach komórkowych w porównaniu z transfekcjami przeprowadzanymi w tych komórkach z udziałem Lipofectin™, przykład 62. Liczby na osi pionowej oznaczają numery próbek, a na osi poziomej podano względne jednostki światła/pg białka. Słupki zakreskowane ukośnie dotyczą linii komórkowych NRK52E, a słupki pełne linii YB2.
Na figurze 38 przedstawiono skuteczność transfekcji różnych kompleksów DNA.dendrymer z udziałem lub bez DEAE-dekstranu w porównaniu z transfekcjami z udziałem Lipofectin™ i Lipofectamine™, przykład 63. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stosunek ładunków lub dawkę, w tym dla próbki kontrolnej. Puste słupki dotyczą dendrymeru G8 (NH3); pionowo pokratkowane słupki dotyczą Lipofectin™; ukośnie zakreskowane słupki dotyczą dendrymeru G8 (NH3) z DEAE-dekstranem; słupki zakropkowane dotyczą Lipofectamine™, a słupki pokratkowane ukośnie dotyczą dendrymeru Gil (EDA) z DEAE-dekstranem.
Na figurze 39 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA: dendrymer o różnych stosunkach ładunków, w obecności DEAE-dekstranu, dimetylosulfotlenku (DMSO), mieszanin tych składników lub bez ich dodatku, przykład 64. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stosunek ładunków, w tym dla próbki kontrolnej. Słupki zakropkowane dotyczą etapu z DEAE-dekstranem i DMSO; słupki zakreskowane ukośnie dotyczą etapu z DEAE-dekstranem bez DMSO; słupki zakratkowane ukośnie dotyczą etapu bez DEAE-dekstranu, z DMSO, a słupki zakratkowane pionowo dotyczą etapu bez DEAE-dekstranu, bez DMSO.
Na figurze 40 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA ukierunkowanego ASGPR, skompleksowanego z dendrymerem skoniugowanym ztriglicerydem galaktozy, przykład 65. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej linie komórkowe i status receptora. Słupki puste dotyczą skoniugowanych dendrymerów, a słupki zakreskowane ukośnie dotyczą dendrymerów nieskoniugowanych.
Na figurze 41 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące zdolność do wiązania DNA przez Gil (EDA) ze skoniugowanym trisacharydem galaktozowym lub bez niego, przykład 65.
Na figurze 42 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerem G8 (NH3) przy różnych stężeniach dendrymeru i przy różnych stężeniach surowicy, przykład 66. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stężenie surowicy. Puste słupki dotyczą 0,05 pM dendrymerów G8 (NH3); słupki zakropkowane dotyczą 0,1 pM dendrymerów G8 (NH3); słupki zakreskowane ukośnie dotyczą 0,5 pM dendrymerów G8 (NH3); słupki; a słupki pełne dotyczą układu bez dendrymeru.
Na figurze 43 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA skompleksowanego z różnymi ukierunkowanymi, nieukierunkowanymi i powierzchniowo zmodyfikowanymi dendrymerami, przykład 67. Na osi pionowej podano procentowy wzrost w stosunku do plazmidu kontrolnego,
181 064 a na osi poziomej różne kompleksy DNA-dendrymer. Słupki puste dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:1; słupki pełne dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5, a słupki ukośnie zakreskowane dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10.
Na figurze 44 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami, w przypadku których oznaczano ekspresję transfekowanego DNA, przykład 68. Na osi pionowej podano procentowy wzrost w stosunku do plazmidu kontrolnego, a na osi poziomej różne kompleksy DNA-dendrymer. Słupki reprezentują okres czasu (w godzinach) między transfekcją i zbiorem. Słupki puste dotyczą21 godzin; słupki zakreskowane ukośnie z góry do dołu od lewej do prawej dotyczą 45 godzin; słupki zakreskowane ukośnie z góry do dołu od prawej do lewej dotyczą 69 godzin; a słupki pełne dotyczą 141 godzin.
Na figurze 45 przedstawiono wykres cytotoksyczności w linii komórek RAT2 dendrymerów G8 (NH3) i G8 (EDA) z i bez DNA oraz w obecności lub bez DEAE-dekstranu, przykład 69. Na osi pionowej podano % obumarłych komórek; a na osi poziomej stężenie dendrymeru w lewej części i stężenie dendrymeru-DEAE-dekstranu w prawej części. Słupki puste dotycządendrymeru G8 (EDA); słupki ukośnie zakreskowane dotyczą dendrymeru G8 (NH3).
Na figurze 46 przedstawiono podobny wykres cytotoksyczności dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów G8 (EDA) w różnych liniach komórek, przykład 69. Na osi pionowej podano % obumarłych komórek; a na osi poziomej stężenie różnych badanych dendrymerów. Słupki puste dotyczą układu bez DEAE-dekstranu; a słupki pełne dotyczą układu z 0,5 μΜ DEAE-dekstranu. Zastosowano następujące linie komórek (od lewej do prawej): Klon 9, NIH 3T3,10-1 i COS7.
Na figurze 47 (a) - (f) przedstawiono wykres wchłaniania przez komórki i umiejscowienie DNA w dwóch różnych liniach komórek, z których pewne transfekowano bez dendrymerów, pewne z dendrymerami i pewne z dendrymerami w obecności azydku sodowego, przykład 70. Na osi pionowej wszystkich wykresów podano wchłanianie w 102 impulsów/104 komórek, a na dolnej osi poziomej czas w godzinach. Figury (A) - (C) dotyczą komórek U937, a figury (D) - (F) komórek Rat 2. Górne osi poziome dla fig. (A) i (D) dotyczą samego DNA, dla figury (B) i (E) DNA z dendrymerem, a dla fig. (C) i (F) DNA z dendrymerem i azydkiem sodowym. Na wszystkich wykresach pełne kwadraty dotyczą jądra, pełne kółka dotyczą błony, a pełne trójkąty dotyczą części komórki.
Na figurze 48 (a) i (b) przedstawiono fotografie komórek, z których część została z powodzeniem transfekowana za pomocą RSV-lacZ DNA, który w wyniku ekspresji wytwarza enzym β-galaktozydazę, przykład 71.
Figura 49 jest podobna do figury 48, z tym że przedstawia fotografię w powiększeniu, a plazmid RSV-lacZ zastosowano w ilości 3 pg/studzienkę, przykład 71.
Figury 50 (a) i (b) są podobne do figury 48, z tym że dotyczą komórek fibroblastu szczura RAT 2; porównano komórki transfekowane (A) i nietransfekowane (B), przykład 71.
Na figurze 51 (a) - (c) zilustrowano proces transfekcji materiału genetycznego.
Na figurze 52 przedstawiono na wykresie liczbę klonów uzyskanych z komórek D5 transfekowanych plazmidem RSV-|3-gal-NEO. Oporne klony komórek wyselekcjonowano antybiotykiem, genetycyną (G418) (Gibco/BRL), po czym przeprowadzono transfekcję w komórkach macierzystych z wykorzystaniem szeregu różnych technik, w tym według wynalazku, przykład 72. Na osi pionowej podano liczbę klonów, a liczby na osi poziomej oznaczają podane w przykładzie 72 numery identyfikujące ilości DNA i warunki transfekcji w próbach. Słupki puste dotyczą glonów opornych na G418, a słupki pokratkowane pionowo dotyczą klonów wytwarzających enzym β-galaktozydazę.
Na figurze 53 przedstawiono wykres porównujący liczbę klonów uzyskanych z komórek RAT2 transfekowanych plazmidem RSV-P-gal-NEO z wykorzystaniem różnych technik, w tym według wynalazku, przykład 72. Klony wyselekcjonowano genetycyną (G418) pod względem oporności na neomycynę, a następnie oceniano ich aktywność β-galaktozydazową. Na osi pionowej podano liczbę klonów, a liczby na osi poziomej oznaczają podane w przykładzie 72 numery identyfikujące ilości DNA i warunki transfekcji w próbach. Słupki puste dotyczą glonów opor
181 064 nych na G418, a słupki zakreskowane ukośnie dotyczą klonów wytwarzających enzym β-galaktozydazę.
Na figurze 54 przedstawiono wykres ilustrujący powstawanie komórek MSU 1.2 trwale transfekowanych plazmidem EBV-A DNA. Na osi pionowej podano liczbę kolonii na 1 x 106 komórek, a na osi poziomej numery próbek (określone w przykładzie 72).
Na figurze 55 przedstawiono wyniki analizy śledzącej FACS (fluorescencja) różnych klonów komórkowych transfekowanych plazmidem ekspresji ICAM. Na wszystkich rysunkach na osi pionowej podano liczbę komórek, a na osi poziomej liczbę komórek z ekspresją ICAM (fluorescencja), przykład 72.
Na figurze 56 przedstawiono aktywność Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji kontrolowanym przez pH agregatem dendrymerowym przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Na osi pionowej względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek zastosowanych w teście, przykład 74.
Na figurze 57 przedstawiono aktywność Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji z wykorzystaniem dendrymerów zmodyfikowanych lizyną i dendrymerów niemodyfikowanych, w obecności DEAE-dekstranu, przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Na osi pionowej względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek zastosowanych w teście, przykład 75.
Na figurze 58 pokazano wyniki transfekcji dwóch linii komórek (COSI i RAT2), transfekowanych różnymi dendrymerami, dendrymerami polidyspersyjnymi i innymi środkami transfekującymi. Na osi pionowej względne jednostki światła/3 pg białka, a liczby na osi poziomej oznaczają numery próbek i stosunki ładunków różnych stosowanych środków transfekujących, przykład 76.
Na figurze 59 pokazano fotografie zabarwionych hodowli komórek czerniaka melanomy myszy D5, których komórki macierzyste zostały poddane transfekcji plazmidowym DNA RSVβ-gal. Trwałe transformanty (kolonie) wyselekcjonowano za pomocą G418 (przykład 72). Jako nośniki transfekcji w komórkach macierzystych każdej z ponumerowanych hodowli zastosowano:
1. 10 pg DNA z fosforanem wapnia
2. 10 pg DNA z DEAE-dekstranem
3. 5 pg DNA z 0,5 pM G8 (NH3)
4. 10 pg DNA z 0,5 pM G8 (NH3)
5. 5 pg DNA z 0,2 pM G8 (NH3)
Figura 60 składa się z różnych ponumerowanych zdjęć.
Zdjęcie 1 stanowi mikrofotografię sekcji tkanki nowotworu czerniaka myszy D5, do którego wstrzyknięto in vivo 10 pg DNA plazmidu RSV-3-gal skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Zajście transfekcji komórek nowotworowych potwierdziła obecność komórek D-5 wytwarzających w wyniku ekspresji β-gal, o czym świadczy ciemne (błękitne) zabarwienie widzialne na zdjęciu 1, przykład 77.
Zdjęcie 2 stanowi mikrofotografię próbki kontrolnej tkanki ze zdjęcia 1, nowotworu czerniaka myszy D5, do którego wstrzyknięto tylko dendrymer G11 (EDA), przykład 77.
Na zdjęciach 3,4 i 5 przedstawiono mikrofotografie elektronowe następujących kompleksów DNA:dendrymer, przykład 43.
Zdjęcie 3 - DNA z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10;
Zdjęcie 4 - jak zdjęcie 3, ale po dodaniu DEAE-dekstranu; oraz
Zdjęcie 5 - DNA z mieszaniną dendrymerów o polidyspersyjnej wielkości, przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10.
Na figurach 61A i 61B przedstawiono wykresy porównujące transfekcję z wykorzystaniem różnych dendrymerów typu gęstej gwiazdy lub ich kombinacji przy różnych stosunkach ładunków oraz w trzech różnych warunkach: transfekcja z wykorzystaniem samego kompleksu materiału genetycznego z dendrymerem (słupki kropkowane); te same kompleksy materiału genetycznego z dendrymerem, w obecności DEAE-dekstranu (Słupki kreskowane ukośnie); oraz te same kompleksy materiału genetycznego z dendrymerem, w obecności chlorochiny
181 064 (pełne słupki). Uzyskane wyniki przedstawione graficznie na fig. 61A wykazują że wystąpiła transfekcja komórek COSI, a wyniki na fig. 6IB wskazują że nastąpiła transfekcja komórek RAT2. Na osi pionowej względne jednostki światła/3 pg białka, a liczby na osi poziomej oznaczają numery próbek kompleksu materiał genetyczny:dendrymer z przykładu 73.
Na figurze 62 przedstawiono wykres porównujący transfekcję z zastosowaniem opartych na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzionych dendrymerów, w transfekcji przy wykorzystaniu dendrymerów typu gęstej gwiazdy, przykład 78. Na osi pionowej względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano zastosowany dendrymer. Słupki puste dotyczą układu bez DEAE-dekstranu, a słupki pełne układu z DEAE-dekstranem.
Szczegółowy opis wynalazku
Polimery typu gęstej gwiazdy zilustrowane są na fig. 1, na którym I w kółku [„rdzeń (I)”] oznacza rdzeń inicjatora (na tym rysunku trójfunkcyjny rdzeń inicjatora pokazano z lewej strony rysunku); Z oznacza grupę końcową pokazanąpo raz pierwszy na drugim rysunku od lewej strony przedstawiającym rozgałęziony oligomer gwiaździsty; A, B, C, D i E reprezentują określone generacje cząsteczkowe dendrymerów typu gęstej gwiazdy; a (A)n, (B)n, (C)n, (D)n i (E)n oznaczają rozgałęzione dendrymery typu gęstej gwiazdy.
Dendrymery typu gęstej gwiazdy stanowią zestawy jednakowych cząsteczek wykazujące trzy wyróżniające cechy strukturalne, a mianowicie (a) rdzeń inicjatora, (b) warstwy wewnętrzne (generacje, G lub Gen) składające się z powtarzalnych jednostek promieniowo przyłączonych do rdzenia inicjatora, oraz (c) powierzchnię zewnętrzną o końcowej funkcyjności (to znaczy z końcowymi grupami funkcyjnymi) przyłączonymi do zewnętrznej generacji. Wielkość i kształt cząsteczki dendrymeru typu gęstej gwiazdy oraz grupy funkcyjne występujące w cząsteczce dendrymeru można regulować dobierając rdzeń inicjatora, liczbę generacji (czyli strukturę wiążącą która tworzona jest przez każdą generację, gdy przechodzi ona w następną generację) stosowanych przy wytwarzaniu dendrymeru, a także dobierając powtarzalne jednostki stosowane w każdej generacji. W związku z tym, że dendrymery można wydzielić na poziomie dowolnej wybranej generacji, umożliwia to uzyskanie dendrymerów o wymaganych właściwościach. Właściwości dendrymerów typu gęstej gwiazdy ujawniają się wtedy, gdy występują wszystkie powyższe trzy cechy strukturalne. Cechy te zostały dokładniej przedstawione przez Petara R. Dvomica i Donalda A. Tomalię wChem. inBritain, 641-645, sierpień 1994. W opisie dendrymery określa się podając liczbę generacji i stosowany rdzeń inicjatora, np. dendrymer G7 (EDA).
Dobór składników dendrymeru typu gęstej gwiazdy wpływa na właściwości dendrymerów. Rodzaj rdzenia inicjatora może wpływać na kształt dendrymeru, tak że (w zależności od wybranego rdzenia inicjatora) uzyskuje się np. dendrymery o kształcie sferoidalnym, dendrymery o kształcie cylindrycznym lub prętowym, dendrymery o kształcie elipsoidalnym lub dendrymery w kształcie grzyba. Budowanie kolejnych generacji (czyli liczba generacji oraz wielkość i charakter powtarzalnych jednostek) decyduje o wymiarach dendrymerów i charakterze ich wnętrza.
Z uwagi na to, że dendrymery typu gęstej gwiazdy są rozgałęzionymi polimerami z dendryto wymi gałęziami zawierającymi grupy funkcyjne rozmieszczone na końcach rozgałęzień, mogą one znacznie różnić się właściwościami. Tak np. makrocząsteczki przedstawione na fig. 2A (np. patent USA nr 4 289 872, Denkelwalter) oraz dendrymery typu gęstej gwiazdy według wynalazku znacznie różnią się właściwościami na skutek różnych długości gałęzi. Dendrymery typu przedstawionego na fig. 2A zawierająmesymetryczne połączenia gałęziowe (o nierównych segmentach), zewnętrzne (czyli powierzchniowe) grupy (zaznaczone jako Z') i grupy wewnętrzne (zaznaczone jako Z) oraz bardzo mało pustej przestrzeni wewnętrznej. Korzystny typ dendrymeru przedstawiony na fig. 2B zawiera symetryczne połączenia gałęziowe (o równych segmentach) z grupami powierzchniowymi (zaznaczonymi jako Z'), dwie różne grupy wewnętrzne (zaznaczone jako X i Z) i wewnętrzną pustą przestrzeń, której wielkość zmienia się w zależności od generacji (G). Dendrymery typu przedstawionego na fig. 2B można rozwijać do osiągnięcia takiej
181 064 liczby generacji, aby były one całkowicie zamknięte i zawierały pustą przestrzeń, tak że uzyskuje się element o zasadniczo pustym wnętrzu i bardzo zagęszczonej powierzchni.
Dla dendrymerów typu gęstej gwiazdy decydujące znaczenie ma przede wszystkim struktura wiążąca, a nie skład elementarny. Z tego względu powtarzalne jednostki mogą zawierać kombinację dowolnych pierwiastków, pod warunkiem, że istnieje możliwość ich powtarzania się i można z nich stworzyć strukturę kondygnacyjną, jak to przedstawiono w opisie. Takie powtarzalne jednostki mogą składać się w całości z pierwiastków powszechnie występujących w strukturach polimerowych, takich jak węgiel, wodór, tlen, siarka, azot i krzem, albo też mogą składać się z pierwiastków mniej tradycyjnych, pod warunkiem że taka powtarzalna jednostka umożliwia utworzenie stabilnej rozgałęzionej struktury. Tak np. wiadomo, że metaloidy i metale przejściowe tworzą trwałe związki kowalencyjne i kompleksy z grupami organicznymi. Takie trwałe związki kowalencyjne i kompleksy z grupami organicznymi mogą występować jako materiały rozgałęzione, np. borowodory, borany oraz związki germanu, cyny i ołowiu, albo jako nierozgałęzione łączniki, np. dialkilocynk lub związki rtęci. Zastosowanie odpowiednich ligandów może spowodować, że metal przejściowy taki jak kobalt, będzie działać jako element rozgałęziający (w wyniku połączenia z trzema oddzielnymi ligandami) lub połączenie nierozgałęzione (w wyniku połączenia z dwoma odrębnymi ligandami). Z tego względu rozgałęzione struktury pasujące do opisanych modeli i zawierające dowolny pierwiastek, objęte są zakresem wynalazku.
Ponadto dendrymery typu gęstej gwiazdy, gdy dojdą do odpowiedniej generacji, będą wykazywać „gęste upakowanie gęstej gwiazdy”, gdy powierzchnia dendrymeru zawierać będzie taką ilość grup końcowych, że powierzchnia dendrymeru staje się zagęszczona i zamyka puste przestrzenie we wnętrzu dendrymeru. Zagęszczenie może stanowić barierę na poziomie molekularnym, którą można wykorzystać do regulowanej dyfuzji materiałów do wnętrza lub na zewnątrz dendrymerów.
Chemizm powierzchni dendrymerów można regulować przede wszystkim poprzez dobór powtarzalnych jednostek zawierających pożądane chemiczne grupy funkcyjne, albo poprzez chemiczną modyfikację całości lub części funkcyjnych grup powierzchniowych, tak aby utworzyć nowe funkcyjne grupy powierzchniowe. Tak np. powierzchnie można ukierunkować na określone miejsca docelowe albo też spowodować, że będą one odporne na wchłanianie przez określone organy lub komórki, np. przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego.
W wariantowym stosowaniu dendrymerów typu gęstej gwiazdy same dendrymery mogą być połączone w różny sposób („zasocjowane”) tworząc grupy polidendrytowe (mostkowe dendrymery typu gęstej gwiazdy lub agregaty dendrymerów) bądź tez agregaty dendrymerów typu gęstej gwiazdy, które są również przydatne jako nośniki w kompleksach.
Na dodatek wytwarzać można dendrymery tak, żeby wykazywały one odchylenia od równomiernego rozgałęzienia w określonych generacjach, powodując w ten sposób powstanie nieciągłości (czyli odchylenia od równomiernego rozgałęzienia w określonych miejscach dendrymeru) oraz odmienne właściwości dendrymeru.
Polimery typu gęstej gwiazdy stosowane w kompleksach typu gęstej gwiazdy według wynalazku wytwarzać można znanymi sposobami, np. według patentu USA nr 4 587 329, którego ujawnienie wprowadza się jako źródło literaturowe. Dendrymery poliaminowe wytwarzać można w reakcji amoniaku lub aminy zawierającej szereg pierwszorzędowych grup aminowych lub drugorzędowe grupy aminowe z N-podstawionąazyrydyną, taką jak N-tosylo- lub N-mesyloazyrydyna, uzyskując chroniony polisulfonamid pierwszej generacji. Polisulfonamid pierwszej generacji aktywuje się następnie kwasem, takim jak kwas siarkowy, solny, trifluorooctowy, fluorosulfonowy lub chlorosulfonowy, uzyskując sól poliaminy pierwszej generacji. Odsulfonylowanie korzystnie przeprowadza się stosując mocny kwas, który jest na tyle lotny, że można go usunąć na drodze destylacji, taki jak kwas solny. Sól poliaminy pierwszej generacji można nastę
181 064 pnie poddać dalszej reakcji z N-chronioną azyrydyną uzyskując chroniony polisulfonamid drugiej generacji. Sekwencję tąmożna powtarzać w celu wytworzenia poliamin wyższej generacji.
Poliamidoaminy wytwarzać można poddając najpierw amoniak (albo aminę zawierającą szereg pierwszo- i/lub drugorzędowych grup aminowych) z akrylanem metylu w warunkach umożliwiających zajście addycji Michaela jednej cząsteczki amoniaku z trzema cząsteczkami akrylanu metylu z wytworzeniem adduktu. Po usunięciu nieprzereagowanego akrylanu metylu związek poddaje się reakcji z nadmiarem etylenodiaminy w takich warunkach, że jedna grupa aminowa w cząsteczce etylenodiaminy przereagowuje z grupą metylokarboksylanową adduktu rdzenia z wytworzeniem adduktu pierwszej generacji z trzema grupami amidoaminowymi. Po usunięciu nieprzereagowanej etylenodiaminy addukt pierwszej generacji poddaje się reakcji z nadmiarem akrylanu metylu w warunkach addycji Michaela, uzyskując addukt drugiej generacji zawierający końcowe grupy estru metylowego. Addukt drugiej generacji poddaje się następnie reakcji z nadmiarem etylenodiaminy w warunkach, w których powstaje amid, uzyskując pożądany poliamidoaminowy dendrymer zawierający uporządkowane dendrytowe rozgałęzienia drugiej generacji z końcowymi grupami aminowymi. Podobne dendrymery zawierające grupy amidoaminowe wytwarzać można stosując aminy organiczne jako związek rdzeniowy, np. etylenodiaminę, z której otrzymuje się cztero-rozgałęziony dendrymer, albo dietylenotriaminę, z której otrzymuje się pięcio-rozgałęziony dendrymer.
W celu uzyskania bezwodnych polietylenoimin typu gęstej gwiazdy po rozszczepieniu wiązania sulfonamidowego kwasem dodać można rozpuszczalnik, który tworzy azeotrop z wodą, taki jak benzen, toluen, ksylen lub mezytylen, korzystnie toluen, po czym uzyskany azeotrop woda/rozpuszczalnik usuwa się na drodze destylacji azeotropowej, np. ogrzewając mieszaninę do wrzenia i usuwając wodę za pomocą nasadki Deana-Starka. W etapie osuszania można także wykorzystać chlorowane rozpuszczalniki, w których rozpuszcza się bezwodna polietylenoimina, takie jak chloroform. Poprzez dodanie chlorowanego rozpuszczalnika lub rozpuszczalnika tworzącego azeotrop z wodą unika się konieczności ogrzewania polimeru w temperaturach, w których następuje zwęglenie lub degradacja polimeru. Bezwodne polietylenoiminy są szczególnie przydatne jako nośniki materiałów antygenowych (przeciwciał lub fragmentów przeciwciał).
Wytwarzać można dendrymery o bardzo równomiernej wielkości i kształcie, przy czym najważniejsze jest doprowadzenie do uzyskania zwiększonej ilości grup funkcyjnych na jednostkę powierzchni dendrymeru, a ponadto mogą one zawierać więcej grup funkcyjnych w przeliczeniu na jednostkę objętości cząsteczki w porównaniu z innymi polimerami o takim samym ciężarze cząsteczkowym, o takim samym rdzeniu i takich samych składnikach monomerycznych oraz o takiej samej liczbie rozgałęzień od rdzenia jak polimery typu gęstej gwiazdy. Zwiększona gęstość grup funkcyjnych w gęstych polimerach typu gęstej gwiazdy umożliwić może przenoszenie większej ilości materiału przez dendrymer. W związku z tym, że liczbę grup funkcyjnych regulować można zarówno na powierzchni jak i we wnętrzu dendrymerów, umożliwia to regulację np. ilości środka biologicznie czynnego dostarczanego przez dendrymer. W szczególnie korzystnym wariancie według wynalazku polimery typu gęstej gwiazdy, a zwłaszcza dendrymery typu gęstej gwiazdy są ukierunkowanymi nośnikami środków biologicznie czynnych, zdolnymi do doprowadzenia środków biologicznie czynnych do określonego docelowego organu albo do określonego determinantu lub miejsca w docelowym organizmie.
Stwierdzić można analogię między dendrymerami typu gęstej gwiazdy wczesnych generacji (np. generacji 1-7) i klasycznymi kulistymi micelami. Analogię między dendrymerem i micelą wyciągnięto porównując wspólne cechy, takie jak kształt, wielkość i charakterystyka powierzchni.
181 064
Tabela 1
Parametr Regularne klasyczne micele Dendrymery typu gęstej gwiazdy
Kształt Kuliste Kuliste
Wielkość (średnica) 20-60 A 17-67 A
Liczba agregacji powierzchniowych 4-202 Z=6-192 (Z oznacza liczbę grup powierzchniowych (generacja 2-7)
Powierzchnia/grupę powierzchniową (A2) 130-80 A2 127-75 A2
(A = io'nm; A2 = 10'2nm2
W tabeli 1 kształt zweryfikowano metodą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Wielkość zweryfikowano na podstawie lepkości istotnej [η] i chromatografii wykluczenia według wielkości (SEC). Liczby agregacji powierzchniowych zweryfikowano na podstawie miareczkowania i NMR w wysokim polu. Wielkość powierzchni/grupę funkcyjną wyliczono na podstawie pomiarów hydrodynamicznych SEC.
Poliamidoaminowe (PAMAM) dendrymery pierwszych generacji stanowiąmikrodomeny, które ściśle imitują klasyczne kuliste micele prawie pod każdym względem (to znaczy w aspekcie kształtu, wielkości, liczby grup powierzchniowych i stosunku grup do powierzchni). Jednakże występuje podstawowa różnica związana z tym, że sąone związane kowalencyjnie i trwałe w przeciwieństwie do stanu dynamicznej równowagi występującego w micelach. Różnica ta stanowi ważną zaletę gdy takie mikrodomeny zastosuje się jako elementy kapsułkujące.
Gdy wprowadzi się kolejne koncentryczne generacje powyżej piątej, wystąpi zagęszczenie powierzchni. Zagęszczenie to może doprowadzić do wzrostu właściwości barierowych powierzchni, co objawia się zmniejszeniem powierzchni przypadającej na grupę czołową (powierzchniową), jak to pokazano w tabeli 2.
Tabela 2
Zależność cech dendrymeru PAMAM od generacji
Generacje 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Liczba grup powierzchniowych Z 3 6 12 24 48 96 192 384 768
Ciężar cząsteczkowy 275 875 2411 5147 10 619 21 563 43 541 87 227 174 779
Średnica oząaczona metodą SEC 10,4A 15,8A 22A 31A 40A 53A 67A 76A 88A
Powierzchnia na dendrymer 366A2 783A2 1519A2 3018A2 5024A2 8 820A2 14096A2 18136A2 24328A2
Powierzchnia na grupę Z 122 A2 131A2 127 A2 126 A2 104A2 92A2 73A2 47A2 32A2
Odległość między grupami Z 12,4A 12,8 A 12,7 A 12,6A 11,5A 10,8 A 9,8A 7,75A 6,28A
Objętość porów 311,6 A3 1 470A3 4 737A3 11427A3 - - - - •
* Średnice hydrodynamiczne wyznaczono metodą chromatografii z wykluczeniem wymiarowym z zastosowanie^ do kalibracji jako wzorców monodyspersyjnego (Mw/Mn = 1,02) pohtlenku etylenu 1A = 10 nm, 1A =10 nm ; 1A =10 nm
Taknp. w przypadku zakończonych aminą generacji 5,0,6,0,7,0,8,0 i 9,0 powierzchnia na grupę Z maleje z 104 odpowiednio do 92, 73, 47 i 32 A2. Taka cecha odpowiada przemianie z mniej zagęszczonej powierzchni do bardziej zagęszczonej powierzchni micelopodobnej z po
181 064 wstawaniem dwuwarstwowej/monowarstwowej powierzchni typu barierowego występującej w pęcherzykach (liposomach) lub błonach typu Langmuira-Blodgetta.
Gdy wystąpi zagęszczenie powierzchni, zaobserwować można zmianę charakterystyk fizycznych i morfologii w miarę zwiększania się generacji od generacji pośrednich (G6-G8) do generacji bardziej zaawansowanych (G9 i G10). Skaningowe transmisyjne mikrofotografie elektronowe (STEM) dla generacji (G) = 7,0,8,0 i 9,0 po usunięciu metanolu jako rozpuszczalnika z każdej z próbek i uzyskaniu bezbarwnych, jasnożółtych stałych błon, które następnie zabarwiono tetratlenkiem osmu. W stadium generacji (G) = 9,0 wystąpiła przewidywana zmiana morfologiczna. Dla G = 9 stwierdzono występowanie pustego wnętrza o średnicy około 63 Ά otoczonego zaciemnionym obrzeżem grubości około 22 A. Prawdopodobnie metanolowy rozpuszczalnik został uwięziony wewnątrz 22 Ά zewnętrznej błonopodobnej bariery tworząc bezbarwne wnętrze. W związku z tym przy G = 9,0 PAMAM typu gęstej gwiazdy zachowuje się topologicznie jak pęcherzyk (liposom). Jednakże taka gęsta gwiazda jest o rząd wielkości mniejsza i bardziej monodyspersyjna niż liposom, a ponadto jest fizycznie trwalsza niż liposom. W związku z tym dendrymery według wynalazku zawierająna tyle duże puste wnętrze, aby molekularnie kapsułkować wypełnione rozpuszczalnikiem puste przestrzenie o średnicy dochodzącej do 63 A (objętość około 131 000 A3). Okazuje się, że przy takim stadium zaawansowanej generacji takie prototypy o wielkości miceli zachowują się jak kowalencyjnie związane liposomy.
W związku z tym, że liczbę grup funkcyjnych w dendrymerze można regulować zarówno na jego powierzchni jak i we wnętrzu, stwarza to możliwość regulowania ilości przenoszonego materiału, który ma być dostarczany przez dendrymer. Dendrymery stanowią ukierunkowane nośniki środków, umożliwiające doprowadzenie przenoszonego materiału genetycznego, np. do rośliny lub szkodnika, albo do określonego determinanta lub miejsca w docelowym organizmie.
Do dendrymerów nadających się do stosowania w kompleksach według wynalazku należą polimery typu gęstej gwiazdy lub polimery typu gęstej gwiazdy ujawnione w patentach USA nr 4 507 466,4 558 120, 4 568 737 i 4 587 329.
Do kompleksów typu gęstej gwiazdy objętych zakresem wynalazku należą kompleksy określone wzorem (P)x*(M)y (I) w którym każdy z P oznacza dendrymer x oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej;
każdy z M oznacza jednostkę przenoszonego materiału genetycznego, przy czym może to być ten sam przenoszony materiał lub różny przenoszony materiał;
y oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej; a * oznacza, że przenoszony materiał jest zasocjowany z dendrymerem; oraz z tym zastrzeżeniem, że przenoszony materiał zachowuje swą skuteczność. W powyższym wzorze (I) P może stanowić polimer typu gęstej gwiazdy lub polimer dendrytowy.
W użytym znaczeniu określenie „zasocjowany” oznacza, że jeden lub więcej przenoszonych materiałów może być fizycznie kapsułkowanych lub uwięzionych w rdzeniu dendrymeru, częściowo lub całkowicie zdyspergowanych w dendrymerze, przytwierdzonych lub przyłączonych do dendrymeru, albo dowolną kombinację powyższych rozwiązań, przy czym przytwierdzenie lub przyłączenie może wystąpić w wyniku wiązania kowalencyjnego, wiązania wodorowego, adsorpcji, absorpcji, wiązania metalicznego, sił van der Waalsa lub wiązania jonowego, albo dowolnej ich kombinacji. Przy zasocjowaniu jednego lub więcej przenoszonych materiałów z dendrymerem (dendrymerami) można ewentualnie wykorzystać łączniki i/lub odstępniki dla ułatwienia wytwarzania lub stosowania kompleksów typu gęstej gwiazdy. Do odpowiednich grup łączących należą grupy, które łącząprowadnik docelowy (czyli T) z dendrymerem (czyli P), nie wpływając w znaczącym stopniu na skuteczność prowadnika lub skuteczność dowolnego z innych przenoszonych materiałów (czyli M) obecnych w koniugacie typu gęstej gwiazdy. Takie grupy łączące mogą być odszczepialne lub nieodszczepialne i są zazwyczaj stosowane, aby wyeliminować zawadę przestrzenną między prowadnikiem docelowym i dendry
181 064 merem, przy czym korzystnie grupy łączące są stabilne (czyli nieodszczepialne). W związku z tym, że wielkość, kształt i gęstość grup funkcyjnych w dendrymerach typu gęstej gwiazdy można bardzo dokładnie regulować, istnieje wiele sposobów, w jakie przenoszony materiał można zasocjować z dendrymerem. Tak np. (a) występować może asocjacja typu kowalencyjnego, kulombowskiego, hydrofobowego lub chelatującego między jednym lub więcej przenoszonymi materiałami i elementami, zazwyczaj grupami funkcyjnymi usytuowanymi na lub w sąsiedztwie powierzchni dendrymeru; (b) występować może asocjacja typu kowalencyjnego, kulombowskiego, hydrofobowego lub chelatującego między jednym lub więcej przenoszonymi materiałami i grupami znajdującymi się we wnętrzu dendrymeru; (c) wytworzyć można taki dendrymer, aby wnętrze jego było przeważająco puste, co umożliwi uwięzienie (np. fizycznie lub poprzez zasocjowanie z wewnętrznymi grupami dendrymeru typu gęstej gwiazdy) przenoszonych materiałów we wnętrzu (w objętości utworzonej przez pory) (np. magnetyczne lub paramagnetyczne rdzenie lub domeny utworzone przez chelatowanie i redukcję jonów metalu do stanu wartościowości 0 w dendrymerze), przy czym dendrymery zawierające wnętrze magnetyczne wykorzystać można do zbierania różnych elementów biologicznie czynnych, które mogą być skompleksowane z powierzchniami różnych dendrymerów poprzez zastosowanie magnesów itp., a uwalnianie przenoszonego materiału można ewentualnie regulować zagęszczając powierzchnię dendrymeru grupami regulującymi dyfuzję; albo (d) stosując różne kombinacje wyżej wspomnianych zjawisk.
Do dendrymerów oznaczanych symbolem „P” należąpolimery typu gęstej gwiazdy opisane w patentach USA nr 4 507 466, 4 558 120, 4 568 737 lub 4 587 329.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy o wzorze (I) wytwarza się w reakcji P z M, zazwyczaj w odpowiednim rozpuszczalniku, w temperaturze ułatwiającej połączenie przenoszonego materiału (M) z dendrymerem typu gęstej gwiazdy (P).
Do odpowiednich rozpuszczalników należą te rozpuszczalniki, w których P i M co najmniej częściowo mieszają się ze sobą przy czym rozpuszczalniki te są obojętne w stosunku do tworzącego się kompleksu. Jeśli P i M co najmniej częściowo mieszają się ze sobą rozpuszczalnik może nie być konieczny (ta że reakcja może przebiegać bez rozpuszczalnika). W razie potrzeby stosować można mieszaniny odpowiednich rozpuszczalników. Do przykładowych odpowiednich rozpuszczalników należy woda, metanol, etanol, chloroform, acetonitryl, toluen, dimetylosulfotlenek i dimetyloformamid.
Warunki reakcji wytwarzania kompleksu typu gęstej gwiazdy o wzorze (I) zależą od konkretnego dendrymeru (P), przenoszonego materiału (M) oraz od charakteru powstającego wiązania (*).
Stosunek M:P zależeć będzie od wielkości dendrymeru i ilości przenoszonego materiału. Tak np. stosunek molowy (stosunek moli) dowolnego jonowego M do P wynosi zazwyczaj 0,1-1 000:1, korzystnie 1-50:1, a jeszcze korzystniej 2-6:1.
Inne kompleksy typu gęstej gwiazdy, stanowią kompleksy zawierające prowadnik docelowy (oznaczony symbolem „T”), które można przedstawić wzorem (T)e*(P)x*(M)y (II) w którym każdy z T oznacza prowadnik docelowy;
e oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej;
P, x, *, M oraz y mają znaczenie podane wyżej;
przy czym M zachowuje swą skuteczność.
Korzystne są również te kompleksy, w którym e = 1 lub 2, oraz te, w których x = 1, a y = 2 lub powyżej. Szczególnie korzystne są te kompleksy, w których x=l,e=l,y = 2 lub powyżej, a M i T są zasocjowane z polimerem poprzez takie same lub różne łączniki.
Dodatkowo T i/lub M w kompleksie o wzorze (II) mogą być powlekane lub ekranowane, aby zapobiec imunogeniczności lub reakcji RSE, np. w wątrobie. Do środków, które można zastosować w tym celu, należy glikol polietylenowy (PEG) lub inne znane środki.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy o wzorze (II) otrzymywać można wytwarzając T*P, a następnie dodając M, albo wytwarzając P*M, a następnie dodając T. Reakcje według obydwu schematów przeprowadza się w warunkach nie wpływających niekorzystnie na określony składnik kompleksu (takie jak określone pH, temperatura lub stężenie soli), oraz w obecności odpowied
181 064 niego rozpuszczalnika, gdy jest to konieczne. W celu regulowania pH stosuje się bufor lub dodaje się odpowiedni kwas lub zasadę. Warunki reakcji zależą od rodzaju powstającego zasocjowania (*), stosowanego dendrymeru typu gęstej gwiazdy (P), przenoszonego materiału (M) i prowadnika docelowego (T).
Stosunek molowy T:P wynosi korzystnie 1:1, zwłaszcza wtedy, gdy T stanowi przeciwciało lub fragment przeciwciała. Stosunek molowy M:P może być taki jak poprzednio.
Do prowadników docelowych zdolnych do kierowania do celu kompleksów typu gęstej gwiazdy należą elementy, które po zastosowaniu w kompleksach typu gęstej gwiazdy według wynalazku spowodują że co najmniej część kompleksów typu gęstej gwiazdy będzie dostarczonych do żądanego celu (np. białką genu, glikoproteiny, lipoproteiny, lipidu, docelowej komórki, docelowego organu, docelowego organizmu lub innej docelowej grupy), takie jak przeciwciała, korzystnie monoklonalne przeciwciałą fragmenty przeciwciał takie jak fragmenty Fab, Fab', F^b^ lub dowolne inne fragmenty przeciwciał wykazujące wymaganą docelową specyficzność, hormony, modyfikatory odpowiedzi biologicznej; epitopy; grupy funkcyjne wykazujące docelową specyficzność itp.
Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które można zastosować w korzystnych kompleksach typu gęstej gwiazdy opisanych powyżej, wytwarzać można znanymi technikami. Do przykładowych odpowiednich przeciwciał należą immunoglobuliny takie jak IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Monoklonalne przeciwciała o wysokiej specyficzności wytwarzać można dobrze znanymi technikami hybrydyzacji, patrz np. Kohler i Milstein (1975, Naturę 256:495-497; oraz 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519). Takie przeciwciała zazwyczaj wykazują wysoce specyficzną reaktywność.
W kompleksach typu gęstej gwiazdy ukierunkowanych przeciwciałami zastosować można przeciwciała kierujące do dowolnego antygenu lub haptenu. Jakkolwiek stosować można zwykłe przeciwciała poliklonalne, to przeciwciała monoklonalne zapewniają szereg korzyści. Wybrane monoklonalne przeciwciała są wysoce specyficzne w stosunku do pojedynczego epitopu. Na dodatek duże ilości każdego monoklonalnego przeciwciała wytworzyć można w hodowli tkankowej (np. linii komórek hybrydomy). Przeciwciała stosowane w kompleksach według wynalazku mogą być ukierunkowane np. na nowotwory, bakterie, grzyby, wirusy, pasożyty, mikoplazmę, antygeny różnicowania i inne antygeny błony komórkowej, kwasy polinukleinowe, takie jak DNA lub RNA, antygeny powierzchni patogenu, toksyny, enzymy, alergeny, leki i dowolne cząsteczki biologicznie czynne. Pełniej szą listę antygenów podano w patencie USA nr 4 193 983.
Pożądane może być kompleksowanie większej ilości przeciwciał lub fragmentów z dendrymerem, a w określonych przypadkach zastosowanie przeciwciał o różnych specyficznościach. Tak np. skonstruować można dwufunkcyjny kompleksem wykazujący zdolność lokalizowania nowotworu i wiązania się z nim, a następnie oczyszczać krążenie ze związków cytotoksycznych, diagnostycznych lub biostatycznych.
W nieobecności prowadnika docelowego (lub w obecności prowadnika docelowego, gdy jest to pożądane), z uwagi na liczbę grup funkcyjnych, które mogą być zlokalizowane na powierzchni dendrymeru lub blisko niej, wszystkim grupom funkcyjnym (lub zasadniczej ich części) można nadać charakter anionowy, kationowy, hydrofobowy lub hydrofitowy, tak aby skutecznie ułatwić doprowadzanie kompleksu typu gęstej gwiazdy do pożądanego celu o przeciwnym ładunku, albo do hydrofobowego lub hydrofitowego kompatybilnego celu.
Wytwarzanie kompleksów o wzorze (II) przy wykorzystaniu P z chronionym uchwytem (S) uważa się również za sposób wytwarzania kompleksów o wzorze (II). Poniżej przedstawiono schemat reakcji:
obciążanie odblokowanie
S*P ----------► S*P*M ----------------► P*M łączenie
T*P*M <---------gdzie
181 064
S*P oznacza chroniony dendrymer;
S*P*M oznacza chroniony dendrymer skompleksowany z M;
P*M oznacza odblokowany dendrymer skompleksowany z M (kompleks typu gęstej gwiazdy);
T*P*M oznacza kompleks typu gęstej gwiazdy połączony z prowadnikiem docelowym.
Zastosować można odpowiednie rozpuszczalniki nie wpływające niekorzystnie na P*M. Tak np. jeśli S oznacza tert-butoksykarbonyl, a P*M jest stabilny w rozpuszczalniku wodnym, to S można usunąć wodnym roztworem kwasu.
Korzystne kompleksy typu gęstej gwiazdy, w których polimer jest zasocjowany bezpośrednio lub poprzez łączniki można przedstawić wzorem
[(T)eXQf]gV)x^CX(M)y]k (III) gdzie każdy z C' oznacza taką samą lub różną grupę łączącą;
każdy z C* oznacza taką samą lub różną grupę łączącą;
każdy z g oraz k niezależnie oznacza liczbę całkowitą 1 lub powyżej;
każdy z f oraz h niezależnie oznacza liczbę całkowitą 0 lub powyżej;
- oznacza wiązanie kowalencyjne w przypadku, gdy grupa łącząca występuje; a
P, x, *, M, y, T oraz e mają znaczenie podane wyżej; z tym że
M zachowuje swą skuteczność.
Korzystne są te kompleksy, w których x = 1. Do szczególnie korzystnych należą te kompleksy, w których każdy spośród x, e, f, h oraz y równy jest 1, g wynosi 1 lub powyżej, a k wynosi 2 lub powyżej. Najkorzystniejsze są te kompleksy, w których każdy spośród x, e, f, h, y oraz g równy jest 1, a k wynosi 2 lub powyżej.
Do odpowiednich grup łączących reprezentowanych przez C należą grupy, które łączą przenoszony materiał z dendrymerem nie wpływając znacząco na skuteczność przenoszonego materiału ani na skuteczność jednego lub więcej prowadników docelowych obecnych w kompleksie typu gęstej gwiazdy. Takie łączniki musząbyć stabilne (to znaczy nie ulegające rozszczepieniu) lub ulegać rozszczepieniu, w zależności od typu aktywności przenoszonego materiału, a zazwyczaj stosowane są w tym celu, aby uniknąć zawady przestrzennej między przenoszonym materiałem i polimerem.
Najkorzystniejsze są kompleksy, w których dendrymer jest zasocjowany bezpośrednio lub poprzez jedną albo więcej grup łączących z jednym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Polimer w takich korzystnych kompleksach może być ewentualnie dodatkowo zasocjowany, bezpośrednio lub poprzez jedną albo więcej grup łączących) z jednym lub więcej innymi przenoszonymi materiałami. Takie kompleksy typu gęstej gwiazdy można przedstawić wzorem:
[(PrzeciwciałoUC^ (IV) w którym:
każde z przeciwciał oznacza przeciwciało lub fragment przeciwciała zdolny do oddziaływania z pożądanym epitopem;
- oznacza wiązanie kowalencyjne lub kulombowskie w przypadkach, gdy występuje grupa łącząca; a
P, x, *, Μ, T, e, y, C', C, g, k, f oraz h mają znaczenie podane wyżej; z tym że
M zachowuje swą skuteczność.
W powyższej syntezie dendrymerów typu gęstej gwiazdy (P), które zawierają grupę funkcyjnąumożliwiającąłączenie (U lub C) z prowadnikiem docelowym (T), w korzystnym sposobie wymagane jest chronienie reaktywnych grup funkcyjnych w postaci syntetycznego prekursora. Chronienie takie jak korzystne, gdyż umożliwia to syntezę dendrymeru lub koniugatów o bardzo wysokiej jakości. Sposób taki umożliwia chemiczne wiązanie jednostki przenoszonego materiału farmaceutycznego (M) z końcowymi grupami funkcyjnymi dendrymeru typu gęstej gwiazdy (P) w sposób, który w innym przypadku mógłby spowodować reakcję z łączącą grupą funkcyjną, co uniemożliwiłoby przyłączenie prowadnika docelowego (T). Przeprowadzę
181 064 nie następnie odblokowania lub syntetyczna konwersja do łączącej grupy funkcyjnej umożliwia w ten sposób połączenie koniugatu typu gęstej gwiazdy z prowadnikiem docelowym.
Jedną z korzystnych „funkcyjnych grup łączących” (poniżej określanych jako „uchwyt”) jest grupa anilinowa. Grupa ta jest korzystna, gdyż możnająłatwo zmodyfikować uzyskując inne grupy fiinkcyjne odpowiednie w reakcji z prowadnikiem docelowym, takie jak izotiocyjanian, izocyjanian, semitiokarbazyd, semikarbazyd, bromoacetamid, jodoacetamid i maleimid. Grupa anilinowa stanowi również korzystny uchwyt w łączeniu z prowadnikami docelowymi z uwagi na to, że możnająłatwo zablokować przy stosowaniu w syntezie dendrymeru typu gęstej gwiazdy, albo też można jako prekursor zastosować grupę nitrową którą można przekształcić w pożądaną grupę aminową po zakończeniu syntezy.
Istnieje szereg grup chroniących, przydatnych do chronienia anilinowej grupy funkcyjnej w czasie syntezy dendrymeru typu gęstej gwiazdy. (Patrz Theodora W. Green, Protective Groups in Organie Synthesis, Pub. John Wiley & Son, New York, 1981). Korzystną klasę stanowią karbaminiany przedstawione poniżej, przy czym R' oznacza dendrymer.
Do chronienia amin zastosować można wiele karbaminianów. Do najkorzystniejszych karbaminianów w syntezie dendrymerów Starburst™ należy tert-butoksykarbaminian, R = -C(CH3)3. Odblokowanie osiąga się na drodze łagodnej kwaśnej hydrolizy. Korzystna jest także benzylokarbaminianowa grupa chroniąca
korzystna w przypadku dendrymerów podatnych na kwaśną hydrolizę. Odblokowanie osiąga się na drodze katalitycznego uwodornienia.
Inną grupę chroniącą którą można zastosować do ochrony reaktywnych grup na poziomie pożądanej generacji, stanowi 9-fluorenylometylokarbaminian
oraz ftalimidowa grupa chroniąca
181 064
Zgodnie z podanym schematem syntezy zastosować można również inne grupy chroniące aminy, znane z literatury. Powyższe korzystne grupy stanowią jedynie przykłady, a nie jedyne grupy chroniące, które można zastosować. Zastosować można dowolną grupę chroniącą stabilną w warunkach reakcji, którą można usunąć bez naruszenia integralności dendrymeru typu gęstej gwiazdy.
Wariantowo można przeprowadzić reakcję uaktywnionego halogenku arylu, takiego jak nitrofluorobenzen lub 2,4-dinitrofluorobenzen, z aminową grupą funkcyjną w środku do koniugowania, np. w polietylenoiminach (PEI) typu gęstej gwiazdy, a następnie katalitycznie uwodornić grupę nitrową do funkcyjnej grupy anilinowej w celu przeprowadzenia kompleksowania. Jest to szczególnie korzystne w przypadku takich środków jak poliaminy, które wymagająprzed zastosowaniem dalszej modyfikacji, z uwagi na stosunkową obojętność chemiczną grupy nitrofenylowej w warunkach wszystkich reakcji, w których nie zachodzi redukcja. Dobrze znane są różne odczynniki sprzęgające przydatne w reakcji koniugowania, takie jak środki opisane w zgłoszeniu patentowym europejskim nr 0430863 opublikowanym 5 czerwca 1991. Do często stosowanych dwufiinkcyjnych środków łączących, np. aktywnych estrów łub diizocyjanianów, reagujących w bardzo różnych warunkach reakcji, co mogłoby zapewnić ich przydatność w reakcji kompleksowania, należą:
Według wynalazku można także zastosować halogenki nitropodstawionego arylosulfonylu uzyskując sulfonamidy, np.
Zaletą takiego sposobu w porównaniu ze znanymi sposobami jest wprowadzenie grupy aminofenylowej przydatnej w koniugowaniu, jest to, że osiąga się to w ostatnim stadium syntezy. W procesie Ganslowa i innych, patent USA nr4 472 509 grupę nitrofenylową wprowadza się w pierwszym etapie długiej syntezy, co narzuca ograniczenia w dostępnych reakcjach chemicznych.
Sposób według wynalazku wprowadza uchwyt, który daje się łatwo odróżnić od reszty cząsteczki. Manabe i inni ujawnili, że otwarcie pierścienia bezwodnika bursztynowego przez
181 064 resztkowe aminy dostarcza grupy sprzęgającej umożliwiającej koniugowanie z przeciwciałem. Sposób taki nie stwarzał jednak możliwości rozróżnienia niechelatowanych miejsc w polimerze, gdyż grupy chelatujące były takie same jak grupa łącząca.
Powyższym sposobem wprowadzić można grupę aminofenylową do dowolnego środka zawierającego grupę aminową który następnie koniuguje się z pewnym środkiem biologicznie czynnym, np. z monoklonalnym przeciwciałem lub z enzymem. Środek można koniugować na drodze sprzęgania utleniającego z węglowodanami zawartymi w środku biologicznie czynnym, np. w przeciwciele. Grupę aminofenylową można ponadto przekształcić w izotiocyjanian lub izocyjanian, tak aby przeprowadzić następnie reakcję z bocznymi grupami aminowymi w reszty lizyny występujących w środku biologicznie czynnym.
Sposób według wynalazku umożliwia również bezpośrednie chelatowanie lantanowców z dendrymerami Starburst™, korzystnie poprzez dendrymer typu octanu PEI. Denkewalter, patent USA nr 4 289 872 stwierdził, że wystarczy wprowadzenie octanów na powierzchni polimeru. Jednakże przeprowadzone reakcje wykazały, że octan PEI działa lepiej niż PAMAM, tak że powierzchnia iminodioctanów to tylko część zagadnienia, gdyż istotną rolę odgrywa również charakter szkieletu oraz rozgałęzienia. Octan PEI wykazuje lepsze właściwości chelatujące niż octan PAMAM.
Do szczególnie korzystnych należą kompleksy, w których T oznacza monoklonalne przeciwciało lub jego fragment wiążący epitop; a wyjątkowo korzystne są te, w których T oznacza prowadnik docelowy taki jak przeciwciało, monoklonalne przeciwciało lub fragment przeciwciałą fragment wirusa, jednoniciowy DNA, kwas polinukleinowy lub fragment genu, albo też T nie występuje.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy wykorzystywać można w wielu zastosowaniach diagnostycznych in vitro lub in vivo, w zastosowaniach analitycznych, w zastosowaniach terapeutycznych (terapia genowa).
Wynalazek dotyczy także kompozycji kompleksu typu gęstej gwiazdy w kombinacji z odpowiednimi nośnikami i/lub rozcieńczalnikami. Kompozycje do iniekcji według wynalazku mogąbyć w postaci zawiesiny lub roztworu. W przypadku roztworu kompleks rozpuszczony jest w fizjologicznie tolerowanym nośniku. Nośniki takie zawierają odpowiedni rozpuszczalnik, środki konserwujące takie jak alkohol benzylowy, gdy jest to potrzebne, oraz bufory. Do przydat
181 064 nych rozpuszczalników należy np. woda, uwodnione alkohole, glikole oraz estry fosfonianowe lub węglanowe. Kompleks dendrymeru z lekiem można także wprowadzić do pęcherzyków lub liposomów. Kompleks można także kapsułkować w polimerowym układzie gospodarzu, który ulega degradacji (jak to jest w przypadku kopolimerów kwasu mlekowego z glikolowym lub polimeru polibezwodnikowego), albo nie ulega degradacji (kopolimer etyłen-octan winylu). Komugat można również wprowadzić do matrycy typu hydrożelu zawierającej poli(metakrylan hydroksyetylu) lub poli(alkohol winylowy). Zastosować można szereg powłokowych układów rozpuszczających się w jelitach, aby ułatwić przejście kompleksu dendrymeru przez żołądek.
Kompleks według wynalazku można przyrządzać w postaci tabletki z wykorzystaniem spoiw znanych specjalistom. Takie postaci dawkowania opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 wydanie, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Do odpowiednich tabletek należą tabletki prasowane, tabletki powlekane cukrem, tabletki powlekane błoną, tabletki z powłoką rozpuszczającą się w jelitach, wielokrotne prasowane tabletki, tabletki o kontrolowanym uwalnianiu itp.
W realizacji wynalazku szczególnie dogodne są tabletki z powłoką rozpuszczającą się w jelitach. Powłoki rozpuszczające się w jelitach są to takie powłoki, które pozostają nienaruszone w żołądku, ale rozpuszczają się i uwalniają zawartość postaci dawkowania, gdy dojdzie ona do jelita cienkiego. Celem z powłok rozpuszczających się w jelitach jest opóźnienie uwalniania leku, który może zostać zdezaktywowany przez zawartość żołądka lub może spowodować mdłości albo krwawienie poprzez podrażnienie żołądkowej błony śluzowej. Powłokę taką stosować można w tym celu, aby uzyskać w prosty sposób efekt powtórnego działania, gdy dodatkowy lek naniesiony na powłokę rozpuszczającą się w jelitach zostanie uwolniony w żołądku, a reszta leku, chroniona przez powłokę, zostanie uwolniona w dalszej części przewodu żołądkowo-jelitowego.
Działanie powłok rozpuszczających się w jelitach wynika z różnicy składu środowiska w żołądku i jelitach, w aspekcie pH i właściwości enzymatycznych. Jakkolwiek powtarzająsię próby wytwarzania powłok ulegających rozpadowi pod wpływem enzymów jelitowych, nie jest to rozwiązanie popularne, gdyż rozkład enzymatyczny błony przebiega raczej powoli. Dlatego też większość obecnie stosowanych powłok rozpuszczających się w jelitach stanowią powłoki nie ulegające dysocjacji w środowisku o niskim pH w żołądku, ale łatwo ulęgają jonizacji gdy pH wzroście do około 4 lub 5. Najskuteczniejsze powłoki rozpuszczające się w jelitach stanowiąpolikwasy o pK 3-5.
Do przydatnych polimerów stosowanych do wytwarzania tabletek z powłoką rozpuszczającą się w jelitach należy octanoflalan celulozy, polioctano-ftalan winylu, ftalan hydroksypropylometylocelulozy, kompolimery estrów kwasu metakrylowego itp.
Korzystny polimer typu gęstej gwiazdy do stosowania w koniugatach typu gęstej gwiazdy stanowi polimer, który można określić jako polimer typu gęstej gwiazdy zawierający co najmniej jedną gałąź (poniżej określaną jako gałąź rdzeniowa), korzystnie dwie lub więcej gałęzi, odchodzących od rdzenia, przy czym gałąź ta zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzeniowych jest większy od jedności, korzystnie wynosi 2 lub powyżej, (2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości jest co najmniej 1,5 razy większa niż w przypadku wydłużonego, konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i grupach monomerycznych oraz o porównywalnym ciężarze cząsteczkowym i liczbie gałęzi rdzeniowych, przy czym każda z takich gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową, oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga-Koltuna (CPK) stanowi nie więcej niż 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego. W użytym znaczeniu określenie „gęsty” w odniesieniu do „polimeru gwiaździstego” lub „dendrymeru” oznacza, że charakteryzują się one mniejszą objętością cząsteczkową niż wydłużony, konwencjonalny polimer gwiaździsty o takim samym ciężarze cząsteczkowym. Wydłużony konwencjonalny polimer gwiaździsty użyty jako podstawa do porównania z polimerem typu gęstej gwiazdy, stanowi polimer o takim samym ciężarze cząsteczkowym, tym samym rdzeniu i składnikach monomerycznych oraz o takiej samej liczbie rozgałęzień rdzeniowych jak polimer typu gęstej gwiazdy. Określenie „wydłużony” oznacza, że poszczególne gałęzie konwencjonalnego polimeru gwiaździstego są wydłużone lub rozciągnięte do maksymalnej długości. Na dodatek, mimo iż liczba
181 064 grup końcowych jest w polimerze typu gęstej gwiazdy większa niż w konwencjonalnym polimerze gwiaździstym, to budowa chemiczna grup końcowych jest taka sama.
Dendrymery stosowane w kompleksach według wynalazku wytwarzać można znanymi sposobami. Powyższe dendrymery, różne współreagenty i związki rdzeniowe, a także sposób ich wytwarzania, znaleźć można w patencie USA nr 4 587 329. Tak np. związki rdzeniowe mogą stanowić dowolne elementy, do których przyłączyć można kolejne grupy [patrz fig. 1 i 2(B)].
Dendrymery do stosowania w kompleksach według wynalazku mogą zawierać grupy końcowe, które są wystarczająco reaktywne, aby ulegać reakcji przyłączenia lub podstawienia. Do przykładowych grup końcowych należy grupa aminowa, hydroksylowa, merkaptanowa, karboksylowa, alkenylowa, nitrylowa, allilowa, winylowa, amidowa, chlorowcowa, mocznikowa, oksiranylowa, azirydynylowa, oksazolinylowa, imidazolinylowa, sulfonianowa, silanylowa, fosfonianowa, eter koronowy, bipirydyny, chlorometylofenylowa, izocyjanianowa i izotiocyjanianowa. Grupy końcowe można modyfikować tak, aby stały się one biologicznie obojętne, np. aby nadać im immunogeniczność lub zapobiec niespecyficznemu wchłanianiu przez wątrobę, śledzionę lub inny organ, np. w wyniku zastosowania grup glikolu polietylenowego (PEG) lub poliacylopolialkilenoiminy (np. poliacylopolietylenoiminy) o różnych długościach, przyłączonych do powierzchni dendrymeru. Dendrymery różnią się od konwencjonalnych polimerów gwiaździstych lub gwiaździsto-rozgałęzionych tym, że dendrymery zawierają wyższe stężenie grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości cząsteczkowej niż konwencjonalne wydłużone polimery gwiaździste o równoważnej liczbie gałęzi rdzeniowych i równoważnej długości gałęzi rdzeniowych. I tak gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości jest w dendrymerze zwykle co najmniej 1,5 razy większa od gęstości grup końcowych w konwencjonalnym wydłużonym polimerze gwiaździstym, korzystnie co najmniej 5 razy, jeszcze korzystniej co najmniej 10 razy, a najkorzystniej 15-50 razy większa. Stosunek grup końcowych do gałęzi rdzeniowych w gęstym polimerze wynosi korzystnie co najmniej 2, jeszcze korzystniej co najmniej 3, a najkorzystniej od 4 do 1024. Korzystnie dla danego ciężaru cząsteczkowego polimeru objętość cząsteczkowa polimeru typu gęstej gwiazdy stanowi mniej niż 70%, jeszcze korzystniej 16-60%, a najkorzystniej 7-50% objętości cząsteczkowej konwencjonalnego wydłużonego polimeru gwiaździstego.
Korzystne dendrymery do stosowania w kompleksach według wynalazku charakteryzują się tym, że równocennie wartościowy lub pohwartościowy rdzeń, który jest kowalencyjnie związany z gałęziami dendrytowymi. Takie uporządkowane rozgałęzienie można zilustrować następującą sekwencją, przy czym G oznacza liczbę generacji:
G = 1
G = 3
181 064
Matematycznie dokładne sekwencjonowanie uwzględniane przy wytwarzaniu dendrymerów prowadzi do dokładnych, przewidywalnych stechiometrii dla każdej cząsteczki dendrymeru. Tak np. liczba powtarzalnych jednostek w dendrymerze zależy od liczby generacji (G), krotności jednostki powtarzalnej (N,) i krotności cząsteczki rdzeniowej lub atomu rdzeniowego (Nc). W homopolimerycznych dendrymerach, gdy tą samą jednostkę powtarzalną wykorzystuje się w całej cząsteczce, całkowita liczba powtarzalnych jednostek w dendrymerze, jego stopień polimeryzacji (DP) określony jest wzorem
NrG-l
DP = NC—-7Vr-l
Całkowita walencyjność lub liczba grup końcowych w dendrymerze (Y) określona jest wzorem:
Y = NcNrG
Często wygodniejsze jest lub bardziej zrozumiałe rozważenie liczby grup końcowych w dendrymerze (Z), gdyż każda grupa może być wielowartościowa, albo też wartościowość może zmieniać się na skutek modyfikacji chemicznych. Dlatego też liczba grup końcowych określona jest wzorem:
Liczba grup końcowych w dendrymerze (Z) =
NcNrG krotność grup końcowych
Można to zilustrować na przykładzie aminowych grup końcowych, których krotność w syntezie poliaminy wynosi 2. W takim przypadku:
, . NcNrG
Liczba grup końcowych w dendrymerze (Z) = —--W przypadku prowadzonych następnie mody fikacj i dendrymerów liczba taj est wygodniejsza, gdyż wartościowość grupy aminowej zależy od chemizmu reakcji. Tak np. pierwszorzędowa końcowa grupa aminowa będzie łatwo reagować tylko z jedną cząsteczką estru z wytworzeniem amidu, z dwoma cząsteczkami środka alkilującego (w łagodnych warunkach, np. w reakcji Escheweilera-Clarke'a) z wytworzeniem aminy trzeciorzędowej, albo z trzema cząsteczkami środka alkilującego (w ostrzejszych warunkach, np. w reakcji z sulfonianami alkilu) z wytworzeniem czwartorzędowych soli amoniowych.
W związku z tym dendrymery do stosowania w kompleksach według wynalazku można przedstawić w części składowej następująco:
(Rdzeń) (jednostka Grupa powtarzalna) N G_^ [końcowa —-- N G
Nr-1 r gdzie Rdzeń (I) stanowi cząsteczka lub atom inicjujący; grupę końcową stanowi atom, cząsteczka lub grupa funkcyjna, która zajmuje miejsca wiązania w jednostce powtarzalnej, np. atom wodoru lub grupę metoksylowąw estrze; G iNc mająznaczenie podane wyżej; a wartościowość jednostki powtarzalnej wynosi Nr + 1, gdzie Nr ma znaczenie podane wyżej.
Kopolimeryczny dendrymer stanowiący korzystny dendrymer do stosowania zgodnie z wynalazkiem, stanowi unikatowy związek wytworzony z wielofunkcyjnych jednostek monome
181 064 tycznych, o układzie silnie rozgałęzionym (dendrytowym). Cząsteczkę dendrymeru wytwarza się z jednostki wielofunkcyjnego inicjatora [związku rdzeniowego, rdzenia (I)], wielofunkcyjnych jednostek powtarzalnych i jednostek końcowych, które mogą być takie same lub inne niż jednostki powtarzalne. Związek rdzeniowy można przedstawić wzorem (I)(Zc)Nc, gdzie rdzeń (I) oznacza rdzeń, Zc oznacza miejsca wiązania dostępne na rdzeniu (I), a Nc oznacza funkcyjność rdzenia lub hczbę miejsc wiązania, która wynosi korzystnie 2 lub powyżej, a najkorzystniej 3 lub powyżej. W związku z tym cząsteczka dendrymeru zawiera wielofunkcyjny rdzeń (I) połączony z szeregiem (Nc) grup funkcyjnych, Zc, z których każda połączona jest z mono funkcyjnym ogonem jednostki powtarzalnej Χ’Υ^Ζ^Ν1 pierwszej generacji, a każda z grup Z jednostki powtarzalnej jednej generacji jest połączona z monofunkcyjnym ogonem jednostki powtarzalnej następnej generacji, aż do osiągnięcia końcowej kondygnacji lub warstwy.
W cząsteczce dendrymeru powtarzalne jednostki w danej generacji są takie same, ale mogą różnić się pomiędzy poszczególnymi generacjami. Wjednostce powtarzalnej X1 Y^Z1^1 X1 oznacza jednofunkcyjny ogon jednostki powtarzalnej pierwszej generacji, Y1 oznacza grupę wchodzącą w skład pierwszej generacji, Z1 oznacza miejsce wiązania wielofunkcyjnej głowy jednostki powtarzalnej pierwszej generacji i może być takie same lub inne niż miejsca wiązania związku rdzeniowego (I)(ZC)NC lub innej generacji; a Nl oznacza liczbę równą 2 lub powyżej, najkorzystniej 2,3 lub 4, reprezentującą krotność wielofunkcyjnej głowy jednostki powtarzalnej w pierwszej generacji. Genetycznie jednostka powtarzalna określona jest wzorem ΧΎ^Ζ’^ί gdzie „i” oznacza określoną generację od generacji pierwszej do t-1.1 tak w cząsteczce korzystnego dendrymeru każdy z Z jednostki powtarzalnej pierwszej generacji połączony jest z X2jednostki powtarzalnej drugiej generacji itd. poprzez generacje, tak że każda z grup Z' jednostki powtarzalnej ΧΎ^Ζ1^1 w generacji o numerze „i” jest połączona z ogonem (Xl+1) jednostki powtarzalnej generacji o numerze „i+1”. Ostateczna lub końcowa kondygnacja korzystnej cząsteczki dendrymeru zawiera jednostki końcowe, ΧΎ^Ζ*)^, gdzie t dotyczy jednostki końcowej, a X‘, Y‘, Z‘ i N* mogą być takie same lub różne niż X', Y1, Z1 i Ν', z tym że z grupami Z‘nie jest już połączona kolejna generacja, a N1 może być mniejsze od 2 i wynosić np. 0 lub 1, a ponadto wszystkie takie jednostki końcowe ΧΎχΖ^ηΐβ muszą być identyczne. Z tego względu korzystny dendrymer określony jest wzorem cząsteczkowym, który można przedstawić następująco:
gdzie i wynosi od 1 do t-1; symbole mają znaczenie podane wyżej. Funkcja Π stanowi iloczyn wszystkich wielkości w podanych granicach. I tak i-l
Π N = (N')(N2)(N3)...(N2)(N~') n = l stanowi liczbę jednostek powtarzalnych ΧΎΧΖ1)^ stanowiących i-tą generację jednej gałęzi dendrytowej, a jeśli i równe jest 1, toJ^A = n=l
W kopolimerycznych dendrymerach jednostka powtarzalna dla jednej generacji różni się od jednostki powtarzalnej co najmniej jednej innej generacji. Korzystne dendrymery są bardzo
181 064 symetryczne, co ilustrują wzory strukturalne opisane poniżej. Korzystne dendrymery można przekształcić w dendrymery funkcjonalizowane kontaktując je z innym reagentem. Tak np. w wyniku konwersji grupy hydroksylowej w końcowej warstwie lub kondygnacji do estru w reakcji z chlorkiem kwasowym uzyskuje się funkcjonalizowany dendrymer z końcowymi grupami estrowymi. Takie funkcjonał rzowanie nie musi być wykonane z teoretycznie maksymalną wydajnością określoną przez liczbę dostępnych grup funkcyjnych, w związku z czym funkcjonalizowany dendrymer może nie wykazywać wysokiej symetrii lub może nie dać się dokładnie przedstawić wzorem cząsteczkowym, jak to jest w przypadku korzystnego dendrymeru.
W homopolimerycznym dendrymerze wszystkie jednostki powtarzalne ΧΎ^Ζ^' są identyczne. W związku z tym, że wielkości wszystkich N1 są takie same (określone jako Nr), funkcja iloczynowa przedstawiająca liczbę jednostek powtarzalnych redukuje się do prostej formy wykładniczej. W związku z tym wzór cząsteczkowy można wyrazić w prosty sposób:
ΧϋΥϋ(Ζϋ)Νή NcNr NcNr (t-1) gdzie i = 1 do t-1
Forma taka w dalszym ciągu eksponuje różnice pomiędzy odrębnymi generacjami i, z których każda zawiera NcNr (,1) jednostek powtarzalnych ΧΎ'(Ζ')Ν*. Łącząc generacje w jednągrupę uzyskuje się , , , Jednostka końcowa
Rdzeń Jednostka powtarzalna gdzie Χ^Ζ^νγ oznacza jednostkę powtarzalną zastosowaną we wszystkich generacjach i. Jest to zasadniczo taki sam wzór, jak wzór na stronie 74, wiersz 1, w którym G = t-1.
W związku z tym jeśli związek polimerowy będzie pasował do powyższych wzorów, to polimer będzie polimerem typu gęstej gwiazdy. I odwrotnie, jeśli związek polimerowy nie będzie
181 064 pasował do powyższych wzorów, to polimer nie będzie polimerem typu gęstej gwiazdy. Ponadto w celu stwierdzenia czy polimer jest polimerem typu gęstej gwiazdy, nie ma potrzeby znać sposobu jego wytwarzania, ale jedynie trzeba sprawdzić, czy pasuje do powyższych wzorów. Wzory te przedstawiają również generacje (G) lub kondygnacje dendrymerów.
Powyższe wzory matematyczne oparte są na odniesieniu się do pierwszej iteracji reakcji wokół reagentu rdzeniowego jako do generacji 1. W związku z tym dla poliamidoaminowego dendrymeru typu gęstej gwiazdy produkt reakcji akrylanu metylu z rdzeniem w postaci amoniaku będzie się określać jako generację 0,5, a produkt uzyskany w wyniku przeprowadzonej następnie reakcji EDA z akrylanem metylu będzie się określać jako generację 1,0.
W wariancie takiej nomenklatury pierwszą iterację odnosi się do generacj i 0, a nie do generacji 1. Produkt reakcji akrylanu metylu z rdzeniem w postaci amoniaku będzie się określać jako generację -0,5, a produkt uzyskany w wyniku przeprowadzonej następnie reakcji EDA z akrylanem metylu będzie się określać jako generację 0. Zgodnie z tą wariantową nomenklaturą wszystkie numery generacji podane w opisie należy zmniejszyć o 1.
W przypadku tej skorygowanej nomenklatury wzór na stopień polimeryzacji (DP) przyjmuje postać:
Wzór na liczbę ugrupowań końcowych w dendrymerze (Y) przyjmuje postać:
Y = NcNr G przy czym Y można przekształcić w Z (liczbę grup końcowych/dendrymer) dzieląc przez krotność grup końcowych, jak to opisano powyżej.
Liczba komórek gałęzi dendrymeru (NBC) określona jest następująco:
N G-1
NBC = Nc —N r -1
Teoretyczną masę cząsteczkową (M) można wyrazić następująco:
M = Mc + Nc
Nr G+1-l + MtNr G+1 albo
M = Mc + Nc
Nr-1 gdzie Mc oznacza masę molową inicjatora rdzeniowego, MRU oznacza masę molową jednostek powtarzalnych, MBC oznacza masę molową komórek gałęziowych, a Mt oznacza masę molową jednostek końcowych.
Wyraźnie istnieje wiele sposobów wyznaczania stosunku środka (M) do dendrymeru (P), zależnego od tego w jaki sposób i gdzie nastąpiła asocjacja P*M. Gdy występuje wewnętrzne kapsułkowanie, stosunek wagowy M:p wynosi zwykle 10:1, korzystnie 8.1, jeszcze korzystniej
181 064
5:1, a najkorzystniej 3:1. Stosunek ten może wynosić zaledwie 0,5:1 lub nawet 0,1:1. W odniesieniu do stereochemii wnętrza stosunek wagowy M.Pjest taki sam jak dla kapsułkowania wnętrza. W odniesieniu do stechiometrii części zewnętrznej stosunek M:P mol/mol podany jest w poniższej tabeli-
M P
(A) 5 NcN,Nr'·' 1
(B) 3 NcNtNr'·' 1
(C) 1 NcNtNr'·' 1
gdzie Nc oznacza krotność rdzenia, Nt oznacza średnią krotność grup końcowych, a Nr oznacza krotność połączeń gałęziowych. Wyrażenie NcNtNr bl podawać będzie liczbę ugrupowań końcowych. Tak np. (A) dotyczy przypadku, gdy na powierzchni znajdują się białka, enzymy lub silnie naładowane cząsteczki; (B) dotyczy obecności aspiryny, 2,4-D lub kwasu oktanowego; a (C) dotyczy przypadku przekształcania powierzchniowych grup estrowych w jony karboksylanowe.
Oczywiście specjalista łatwo może wytworzyć inne struktury o różnych wymiarach odpowiednio zmieniając składniki dendrymeru i liczbę stosowanych generacji. Trzy różne serie dendrymerów w porównaniu z przeciwciałem IgG w przybliżeniu w podobnej skali pokazano na fig. 3. Seria rysunków oznaczona jako fig. 3(B)I przedstawia poliamidoaminy (PAMAM) typu gęstej gwiazdy; seria II przedstawia polietery (PE) typu gęstej gwiazdy; a seria III przedstawia polietylenoiminy (PEI) typu gęstej gwiazdy. W podobny sposób jak na fig. 1, we wszystkich 3 seriach (I, II i III) na lewym końcu pokazano rdzeń inicjujący, na kolejnym rysunku od lewej strony pokazano gwiaździście rozgałęziony oligomer, a na pozostałych rysunkach pokazano oligomery typu gęstej gwiazdy oraz odpowiednie mostkowe dendrymery typu gęstej gwiazdy. Można stwierdzić, że w tych seriach rysunków w podanej skali pod względem wymiarów dendrymery są porównywalne, a nawet mniejsze od wymiarów pełnego przeciwciała IgG pokazanego na fig. 3(A). Przeciwciało IgG pokazano na końcu z lewej strony fig. 3. W przedstawionej skali 1 mm = 3,5 A. Na figurze 3(A) obszar zmienny przedstawiono jako (A), obszar stały jako (B), a miejsca przyłączenia węglowodanów jako (C). Przybliżone wymiary pokazane na fig. 3 sąnastępujące: (1) wynosi 35-40 A; (2) wynosi 70 A, a (3) wynosi 60 A. Takie cechy wymiarowe są korzystne np. wtedy gdy ukierunkowywanie obejmuje opuszczanie układu naczyniowego. Z tego względu średnice dendrymerów wynoszące 125 A lub poniżej są szczególnie korzystne, gdyż mogą one opuszczać układ naczyniowy przechodząc do docelowych organów zasilanych przez włośniczki nieporowate lub włośniczki okienkowate. Wymiary te są znaczące, gdyż dendrymery są mniejsze w porównaniu z potencjalnym docelowym składnikiem, takim jak przeciwciało (patrz fig. 3). Liniowy polimer o porównywalnym ciężarze cząsteczkowym charakteiyzowałby się promieniem bezwładności (w formie całkowicie rozciągniętej) znacznie większym niż dendrymer o takim samym ciężarze cząsteczkowym. Należy oczekiwać, że liniowy polimer tego typu będzie niekorzystnie wpływać na zdolność do rozpoznawania cząsteczkowego wielu zaakceptowanych składników docelowych. Pożądane jest również, aby koniugaty wykazywały jak najmniejszą objętość cząsteczkową, tak aby nie hamowały dodatkowego unaczynienia, np. w wyniku sprzęgania Fab, Fab', Fab'2 albo pojedynczych łańcuchów lub ich części, bądź też innego odpowiedniego fragmentu przeciwciała z dendrymerami o niskiej objętości cząsteczkowej.
Łączenie prowadników docelowych z dendrymerami stanowi kolejne rozwiązanie według wynalazku. W korzystnych wykonaniach według wynalazku, zwłaszcza wtedy, gdy pożądane jest zastosowanie przeciwciała jako prowadnika docelowego, na dendrymerze zastosować można reaktywne grupy funkcyjne takie jak grupa karboksylowa, sulfhydrylowa, reaktywny aldehyd, reaktywna pochodna olefinowa, grupa izotiocyjanianowa, izocyjanianowa, aminowa, reaktywny halogenek arylu lub reaktywny halogenek alkilu. Reaktywne grupy funkcyjne wprowadzić można do dendrymeru znanymi sposobami takimi jak:
(1) Zastosowanie heterofunkcyjnego inicjatora (jako materiału wyjściowego do syntezy dendrymeru), który zawiera wbudowane grupy funkcyjne o różnych reaktywnościach. W takim
181 064 heterofunkcyjnym inicjatorze co najmniej jedna z grup funkcyjnych będzie służyć jako miejsce inicjujące powstawanie dendrymeru, a co najmniej jedna z innych grup funkcyjnych będzie dostępna do połączenia się z prowadnikiem docelowym, ale nie będzie zdolna do zainicjowania syntezy dendrymeru. Tak np. zastosowanie chronionej aniliny umożliwia dalszą modyfikację grup NH2 w cząsteczce bez reagowania anilinowej grupy NH2.
Grupa funkcyjna, która będzie dostępna do połączenia się z prowadnikiem docelowym, może stanowić część cząsteczki inicjatora w jednej z trzech form, a mianowicie:
(a) W postaci, która będzie wykorzystywana do łączenia z prowadnikiem docelowym. Jest to możliwe, gdy w żadnym z etapów syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru nie nastąpi reakcja w tym centrum.
(b) Gdy grupa funkcyjna stosowana do łączenia z prowadnikiem docelowym wykazuje reaktywność w etapach syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru, można ją zablokować stosując grupę chroniącą, która nada tej grupie niereaktywność w czasie syntezy, ale którą można łatwo usunąć w taki sposób, aby nie naruszyć integralności reszty makrocząsteczki.
(c) W przypadku, gdy nie można wprowadzić prostej grupy chroniącej reaktywną grupę funkcyjną wykorzystywaną do łączenia z prowadnikiem docelowym, zastosować można syntetyczny prekursor nie reagujący we wszystkich etapach syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru. Po zakończeniu syntezy taka grupa fiinkcyjna musi dać się łatwo przekształcić w pożądanągrupę łączącą, w taki sposób, aby nie naruszyć integralności reszty makrocząsteczki.
(2) Przy sprzęganiu (kowalencyjnym) pożądanej reaktywnej grupy funkcyjnej na wstępnie uformowanym dendrymerze, stosowany reagent musi zawierać grupę funkcyjną łatwo reagującą z końcowymi grupami funkcyjnymi dendrymeru. Grupa funkcyjna wykorzystywana ostatecznie do przyłączania prowadnika docelowego może być w formie ostatecznej, jako chroniona grupa funkcyjna lub jako syntetyczny prekursor. Postać, w jakiej tą łączącą grupę funkcyjną wykorzystuje się, zależy od zachowania jej integralności w czasie przeprowadzanych syntez oraz od zdolności ostatecznej makrocząsteczki do przetrwania w warunkach niezbędnych do nadania tej grupie zdolności przyłączania. Przykłady odpowiednich środków łączących znaleźć można w literaturze, np. w publikowanym zgłoszeniu europejskim 0430683, opublikowanym 5 czerwca 1992. Tak np. w przypadku PEI korzystnie stosuje się
Do heterofunkcyjnych inicjatorów stosowanych zgodnie z powyższym sposobem (1) przykładowo należą:
O cnhch2ch2nh2
Η N—{(P- 2 7 cnhch2ch2nh2 o
181 064
NH
ch2nh2
O
II (CH3) 3COCNH
181 064 ch2ch2nh2
Ο2Ν
ch2
ch2nch2ch2nh2 2nch2ch2nh2 ch2ch2nh2
Szczególnie istotne są następujące chemizmy: 1) chemizm gęstej gwiazdy lub poliamidoaminy („PAMAM”) Starburst™;
2) chemizm gęstej gwiazdy lub polietylenoimin („PEI”) Starburst™;
3) chemizm gęstej gwiazdy lub związku Starburst™ PEI z powierzchnią PAMAM;
4) chemizm gęstej gwiazdy lub polieteru („PE”) Starburst.
Modyfikację powierzchniowej funkcyjności dendrymeru mogą zapewnić inne przydatne grupy funkcyjne takie jak:
-OPO3H2, -po3h2, -po3h(1), -po3(-2), -CO2(1), -SO2H, -SO2(1), -SO3H, -SO3 ( I>,
-NRTł2, -R5, -OH, -OR1, -NH2, polietery,
-CNHR1, -COH, octan (-OCCH3) ii u i o o o perfluorowany alkil,
gdzie
R oznacza alkil, aryl lub atom wodoru;
R1 oznacza alkil, aryl, atom wodoru lub grapę (CH2) (ch2) n
181 064
R2 oznacza alkil, aryl lub grupę ^(CH2)nx
N
R3 oznacza -OH, -SH, -CO2H, -SO2H lub -SO3H;
R4 oznacza alkil, aryl, alkoksyl, hydroksyl, grupę merkaptanową, karboksyl, grupę nitrową atom wodoru, atom bromu, chloru, jodu lub fluoru;
R5 oznacza alkil;
X oznacza NR, O lub S; a] n oznacza liczbę całkowitą równą 1, 2 lub 3;
polietery; albo inne immunologicznie niewrażliwe grupy, przy czym we wszystkich powyższych przypadkach alkil oznacza liniowy lub rozgałęziony C]-C18 węglowodór, a aryl oznacza benzyl lub naftyl, który może być podstawiony jedną lub więcej grupami CrC4 alkilowymi, bromowymi, chlorowymi, jodowymi, fluorowymi lub trifluorometylowymi.
Dobór grupy funkcyjnej zależy od konkretnego ostatecznego zastosowania dendrymeru.
Takie funkcjonalizowane dendrymery wytwarza się np. w reakcji funkcjonalizowanej grupy, takiej jak ester metylowy DO3A z epoksydem lub epoksydem podstawionym grupą CpC^ alkilową uzyskując produkt hydroksyetylowany. Produkt hydroksyetylowany poddaje się reakcji ze środkiem srzęgającym takim jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC), a następnie z polimerem PAMAM typu gęstej gwiazdy. Dendrymer zawierający DOTA jako grupę funkcyjną wytworzyć można stosując izocyjanianową pochodną DOTA taką jak l-[l-karboksy-3(4'-izotiocyjanianofenylo)propylo]-4,7, lO-tris(karboksymetylo)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan, zpolimerem PAMAM typu gęstej gwiazdy. Wprowadzać można inne odpowiednie chelaty wykorzystując znane techniki syntezy. W razie potrzeby znanymi sposobami wprowadzać można jon lantanowca lub jon pseudolantanowca.
Przenoszenie materiału genetycznego i transfekcja
A. Wprowadzenie
Przenoszenie materiałów genetycznych do komórek stwarza potencjalnie szerokie ich zastosowanie jako środków terapeutycznych i/lub diagnostycznych w chorobach ludzi. Przeprowadzić można transfekcję materiału genetycznego, a następnie transkrypcję i ekspresję uzyskując w komórkach nowe białka zastępujące białka zniekształcone lub nieobecne na skutek błędów genetycznych. Dodatkowo przeprowadzić można transfekcję drobnych fragmentów materiału genetycznego, obejmujących DNA lub RNA, w komórkach, tak aby działały one jako enzymy mogące zmieniać działanie komórki lub wydawać określone informacyjne RNA w celu skorygowania innych typów defektów genetycznych. Syntetyczny materiał genetyczny taki jak zmodyfikowane formy antysensownych oligonukleotydów, można przenosić do komórek, aby blokowały one wytwarzanie określonych białek. Może to być przydatne w tłumieniu nienormalnie rosnących komórek takich jak komórki rakowe, albo w zmianie funkcji zwykłych komórek, np. obniżaniu odporności przy transplantacji organów. Niewielkie fragmenty materiału genetycznego takie jak aptimery, mogą także działać jako leki, tak że przeniesienie takich form kwasów nukleinowych może w określony sposób wpłynąć na funkcje komórek, w sposób podobny jak leki.
Naj ważniejszączęść terapii z przenoszeniem genów stanowi nośnik lub modalność, z którą materiał genetyczny przenoszony jest do komórek. Przenoszenie jest skomplikowanym procesem obejmującym szereg odrębnych etapów. Pierwszą funkcją nośnika jest związanie i ochrona DNA przed hydrolizą i strawieniem enzymatycznym. Nośnik musi ułatwiać przenoszenie materiału genetycznego do komórki. Już w komórce nośnik powinien chronić DNA przed degradacją w endosomach i kierować materiał do określonych przedziałów w komórce. Przedziały te mogą obejmować jądro, tak aby wprowadzić materiał genetyczny do chromosomów lub wywołać przejściową ekspresję przeniesionego materiału genetycznego poprzez transkrypcję i translację. I odwrotnie, wymagane być może przenoszenie do cytoplazmatycznej siateczki śródcytoplazmatycznej,
181 064 gdzie materiał będzie działać jako rybosom edytujący lub przerywający wytwarzanie białka poprzez antysensowne inhibitowame. Po dojściu do odpowiedniego przedziału materiał genetyczny musi zostać uwolniony od nośnika, tak aby mógł funkcjonować. W związku z tym zdolność do ochrony, przenoszenia i umożliwienia działania materiału genetycznego, stanowią decydujące cechy odpowiedniego nośnika do stosowania w terapii genowej.
Poza wieloma funkcjami, które musi spełniać nośnik materiału genetycznego, istnieją pewne ważne elementy, których należy unikać w nośniku. Nośnik nie może być immunogeniczny i nie powinien wywoływać reakcji odpornościowej na przenoszony DNA, gdy stosowany jest in vivo. Na dodatek nie powinien on tworzyć nierozpuszczalnych kompleksów z DNA, co uniemożliwiałoby jego podawanie lub osłabiło zdolność do skutecznego dojścia do celu komórkowego, bez względu na to, czy jest on w hodowli tkankowej czy stanowi indywiduum. Ważne jest również, aby nośnik nie był toksyczny w stosunku do komórek in vitro lub do organizmów in vivo, gdyż mogłoby to znacznie zmniejszyć ilość materiału, jaki można podawać oraz mogłoby stworzyć potencjalne zagrożenie.
Istnieją dwa ogólne sposoby przenoszenia materiału genetycznego. Obydwa wymagają wiązania i ochrony materiału genetycznego, przenoszenia materiału genetycznego do komórki i uwalniania materiału dla ujawnienia jego aktywności. Jednakże występuje zasadnicza różnica między dwoma formami przenoszenia. W jednej formie wykorzystuje się nośnik, który wiąże się niespecyficznie z komórkami za pomocą ładunków lub innych oddziaływań i przenosi DNA zasadniczo do wszystkich komórek, z którymi styka się. Może to wystąpić in vitro lub in vivo w zamkniętej przestrzeni takiej jak połączenie. Nośnik tego typu jest szczególnie ważny w terapiach, w których przeprowadza się transfekcję komórek w hodowli tkankowej, a następnie komórki te ponownie wprowadza się do osobnika. Taka terapia „ex vżvo” jest bardzo przydatna w wielu różnych stanach chorobowych i wymaga, aby nośnik był bardzo skuteczny w wiązaniu i przenoszeniu materiału genetycznego do prawie wszystkich komórek, z którymi oddziaływuje. Drugi typ nośnika specyficznie kieruje się tylko do pewnych typów komórek. Prowadnik docelowy sprężony z takim nośnikiem ułatwia specyficzne oddziaływanie między celem na komórce i komleksem DNA z nośnikiem, co ułatwia wchłanianie przez komórki docelowe. Przy stosowaniu takiego nośnika niespecyficzna transfekcja komórek nie jest pożądana, gdyż ekspresja lub działanie transfekowanego materiału genetycznego w komórkach nie będących celem może być niepożądana. Prowadniki docelowe mogą również zwiększyć transfekcję komórek in vivo przy terapii lub diagnostyce ex vivo, poprzez zwiększone wiązanie i przenoszenie do komórek. W takim przypadku niekorzystny wpływ niespecyficznej transfekcji nie stanowi problemu, gdyż wszystkie komórki w hodowli stanowią cel.
Terapia genowa rozwija się bardzo szybko. Opublikowano szereg artykułów i podręczników pizedstawiających techniki terapii genowej. Książkę tego typu stanowi Recombinant DNA, 2 wydanie, James D. Watson i inni, 1992, rozprowadzana przez W.H. Freeman and Company, New York.
Kompleksy polimerów typu gęstej gwiazdy według wynalazku można kompleksować z materiałem genetycznym i stosować w terapii genowej organizmów ssaków, np. ludzi. Sposób zapobiegania chorobie lub jej leczenia obejmuje transfekcję komórek ssaków polimerem typu gęstej gwiazdy skompleksowanym z materiałem genetycznym. Jak to opisano powyżej, materiał genetyczny może być transfekowany do komórek z wielu różnych względów, takich jak wytwarzanie białek w komórkach, zmiana funkcji komórek, korygowanie defektów genetycznych, działanie jako lek itp. W związku z tym stosując kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym według wynalazku można w szczególności zapobiegać chorobom genetycznym, albo leczyć takie choroby.
Ilość materiału genetycznego stosowanego w roztworze kompleksu materiału genetycznego z dendrymerem powinna wystarczać do osiągnięcia pożądanego działania profilaktycznego, terapeutycznego lub diagnostycznego. Ilość ta zmienia się w zależności od oczekiwanego efektu, łatwości, z jaką osiąga się powodzenie w transfekcji docelowych komórek, skuteczności prowadnika docelowego przyłączonego do dendrymeru oraz sposobu podawania kompleksu, to
181 064 znaczy in vitro, ex vivo i in vivo, a w przypadku in vivo, podawania dożylnego, miejscowo lub poprzez bezpośrednią iniekcję do określonego nowotworu, organu, gruczołu lub innej tkanki.
Po ustaleniu ilości materiału genetycznego i jego ładunków określa się ilość stosowanego dendrymeru na podstawie stosunku ładunków materiał genetyczny:dendrymer. Stosuje się taką ilość dendrymeru w roztworze, aby uzyskać pożądany stosunek ładunków. Wybrany stosunek ładunków będzie zmieniać się w zależności od tych samych zmiennych, które wpływają na stężenie roztworu materiału genetycznego, a także od tego, czy stosuje się lub nie stosuje się DEAE-dekstranu lub gliceryny w celu synergistycznego wzmocnienia transfekcji. W szerokim zakresie stosunek ładunków materiał genetyczny:dendrymer może wynosić od około 10:1 do około 1:10 000 (a nawet może być jeszcze niższy), z tym, że korzystnie wynosi od około 3:1 do 1:1 000, od 1:1 do 1.100, od 1:1 do 1:15 lub od 1:5 do 1:10, w zależności od powyższych zmiennych.
Aby uniknąć zasadniczego przegrupowania genowego lub innych zmian, które mogłyby wpłynąć na ekspresję genów, ludzkie geny można wprowadzić do komórek ssaków na drodze transfekcji komórki ssaka jednym lub więcej polimerami dendrytowymi, korzystnie dendrymerem typu gęstej gwiazdy, skompleksowanym z materiałem genetycznym.
Przenoszenie genu osiągnąć można na drodze transfekcji różnych typów komórek takich jak komórki hematopoetyczne, fibroblasty skóry, hepatocyty itp. W związku z tym sposób zapobiegania lub leczenia chroroby genetycznej może obejmować transfekcję polimeru typu gęstej gwiazdy skompleksowanego z materiałem genetycznym do macierzystej komórki hematopoetycznej komórki fibrobłastu skóry, hepatocytu itp., wprowadzenie transfekowanej komórki do organizmu ssaka i ekspresję tej komórki w celu osiągnięcia efektu profilaktycznego lub terapeutycznego.
Transfekcję w sposób przedstawiony w opisie wykorzystać można w wielu celach obejmujących stosowanie in vitro, in vivo i ex vivo. Ponadto przy zastosowaniach in vitro kompleks polimerów typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym według wynalazku może być przydatny w wykrywaniu lub diagnozowaniu różnych stanów. Sposób diagnozowania choroby lub stanu w organizmie ssaka może obejmować wykrywanie lub diagnozowanie z wykorzystaniem kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym według wynalazku.
Działanie dendrymerów jako nośników przenoszących materiał genetyczny jest opisane poniżej. Podane zostanąprzykłady zarówno niespecyficznej transfekcji komórek jak i transfekcji specyficznie ukierunkowanej. W obydwu zastosowaniach zaobserwowano niską toksyczność lub immunogeniczność. W związku z tym nośniki dendrymerowe mogą obejmować wszystkie typy niezbędnych nośników wymaganych w terapii z przenoszeniem genu.
Jak to zaznaczono powyżej, polimery typu gęstej gwiazdy można stosować jako nośniki materiałów stosowanych w rolnictwie do przenoszenia genów.
Znanych jest szereg sposobów transfekcji materiału genetycznego do komórek roślinnych. Jeden ze sposobów obejmuje wykorzystanie Agrobacterium sp. W typowej procedurze gen wprowadza się do komórek roślinnych wykonując najpierw jego insercję w miejscu klonowania plazmidu, który może ulegać replikacji w £. coli i zawiera segment T-DNA (DNA stwierdzonego w plazmidach Ti naturalnie występujących w agrobacteria). Uzyskany pośredni wektor wrzecionowy wprowadza się następnie do komórekE. coli i przeprowadza się selekcję transformantów pod względem oporności na ampicylinę, kodowaną w sekwencjach pBR 322. Następnie plazmid przenosi się przez kojarzenie z komórki E. coli do komórki Agrobacterium. Po znalezieniu się we wnętrzu Agrobacterium plazmid integruje się w plazmidzie Ti w wyniku homologicznej rekombinacji sekwencji T-DNA na dwóch plazmidach. W taki sposób cały zintegrowany plazmid (plazmid zintegrowany w plazmidzie Ti) pomiędzy lewą i prawą granicą T-DNA. Plazmid, który nie zostanie zintegrowany, nie nagromadza się z uwagi na brak ośrodka replikacji dla Agrobacterium. Agrobacteria zawierające zrekombinowany plazmid Ti wybiera się i stosuje do zainfekowania komórek roślinnych. Komórki roślinne, które przyjęły T-DNA identyfikuje się markerem ΝΡΤΠ selekcjonującym rośliny, który nadaje odporność na kanamycynę. Komórki te zawierają również odpowiedni klonowany gen.
181 064
Materiał genetyczny transfekuje się w komórkach roślinnych z wykorzystaniem wektorów wirusowych. Wektory wirusowe stanowią wirusy, które zostały ewolucyjnie zaadoptowane tak, że rozprowadzają geny w całej zainfekowanej roślinie. Gdy genom wirusowy zawiera obcy gen, będzie on również systemowo rozprzestrzeniać się w roślinie. Wektory wirusowe mogą rozwiązać problem doprowadzania genów do roślin jednoliściennych, które są mniej podatne na agrobacteria. Materiał genetyczny może zastąpić region kodujący białka powłokowego w składniku A genomu genowirusa (np. wirusa złotej mozaiki tytoniowej). Istnieją wirusy z genomami utworzonymi przez dwie jednoniciowe cząsteczki DNA, z których każda przechodzi przez postać dwuniciową nadającą się do replikacji. Cząsteczka A może sama ulegać replikacji w komórkach roślinnych, natomiast komórka B jest wymagana do zainfekowania. Aby w komórce zaszła z powodzeniem infekcja wirusowa, muszą być w niej obecne zarówno geny A jak i B.
Inny sposób transfekcji materiału genetycznego w komórkach roślinnych obejmuje bezpośrednie wprowadzanie materiału genetycznego na drodze fizycznej. Jednąz fizycznych metod wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych jest elektroporacja. Zazwyczaj materiał genetyczny zawierający w wysokim stężeniu plazmidowy DNA dodaje się do zawiesiny protoplastów i mieszaninę poddaje się szokowi elektrycznemu w polu od 200 do 600 V/cm. Po elektroporacj i przeprowadza się hodowlę protoplastów przez 1 -2 tygodnie, po czym dokonuj e się selekcji komórek, które przyjęły DNA. Zazwyczaj wydajność takiego procesu wynosi 0,1-1%.
Jeszcze inny sposób fizycznego wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślin obejmuje zastosowanie drobnych perełek metalu (np. wolframu) powleczonych odpowiednim DNA. Perełki te czyli mikrokulki o średnicy 1 pm wstrzeliwuje się bezpośrednio do komórek. DNA po prostu wytrąca się na powierzchni perełek, które wystrzeliwuje się z „pistoletu” z szybkością około 430 m/s. Cel może stanowić zawiesina hodowli komórek embrionalnych posianych na filtrach, a także pełne liście lub nasiona. Komórki na linii strzału są uśmiercane, ale występuje koncentryczna strefa komórek, w której odłamki penetrują do komórek bez zabijania ich. Analiza morfologiczna liści bombardowanych wektorem genu reporterowego β-glukuronidazy (GUS) wykazała, że cząstki wolframu mogąpenetrować przez co najmniej jedną warstwę tkanki, naskórek liścia i dochodzą do mezofilu. Mikrokulki powleczone DNA zastosowano także do wprowadzania materiału genetycznego do chloroplastów.
Polimery dendrytowe, a zwłaszcza polimery typu gęstej gwiazdy, stosowane w kompleksach według wynalazku, zapewniają znaczne korzyści przy zastosowaniu do transfekcji materiału genetycznego w komórkach roślinnych. Można np. zmodyfikować znane techniki, aby umożliwić transfekcję komórek polimerem typu gęstej gwiazdy (np. dendrymerem typu gęstej gwiazdy) wraz z materiałem genetycznym, osiągając wyżej wspomniane korzyści. W szczególności elektroporację lub drobne perełki metalu wykorzystać można do transfekcji polimeru typu gęstej gwiazdy i materiału genetycznego w komórkach roślinnych.
B. Dendrymer
Kompleksy według wynalazku służą między innymi do przenoszenia materiału genetycznego przez polimery dendrytowe i/lub przeprowadzenia transfekcji z wykorzystaniem takich kompleksów. W szerszym znaczeniu określenie „polimer dendrytowy” użyte w opisie nie ogranicza się do polimerów typu gęstej gwiazdy, choć obejmuje takie polimery typu gęstej gwiazdy. „Polimer dendrytowy” stanowi polimer zawierający regularne rozgałęzienia dendrytowe, wytworzony w wyniku sekwencyjnej lub generacyjnej addycji rozgałęzionych warstw do lub od rdzenia. Określenie „polimer dendrytowy” obejmuje „dendrymery”, które zawierają rdzeń, co najmniej jedną wewnętrzną rozgałęzioną warstwę i powierzchniową rozgałęzioną warstwę (patrz Petar R. Dvomic i Donald A. Tomalia, Chem. in Britain, 641-645, sierpień 1994). „Dendron” stanowi fragment dendrymeru zawierający gałęzie rozchodzące się z punktu ogniskowego, który jest lub może być połączony z rdzeniem, bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą tworząc dendrymer. Wiele dendrymerów zawiera dwa lub więcej dendronów połączonych ze wspólnym rdzeniem. Jednakże określenie dendrymer jest używane w szerokim zakresie, tak że obejmuje również pojedynczy dendron.
181 064
Do polimerów dendrytowych należą, ale me wyłącznie, symetrycznie i niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery, cząsteczki kaskadowe, arborole itp., z tym że najkorzystniejszymi polimerami dendrytowymi sąpolimery typu gęstej gwiazdy. Ujawnione polimery typu gęstej gwiazdy PAMAM są symetryczne, co oznacza, że zawierają ramiona gałęzi o równej długości. Rozgałęzienie występuje przy atomach wodoru końcowej grupy - NH2 gałęzi poprzedniej generacji. Dendrymery oparte na lizynie z przykładu 78 są niesymetryczne, gdyż zawierają ramiona gałęzi o różnej długości. Jedna gałąź występuje przy ε-azocie cząsteczki lizyny, a druga gałąź występuj ea-azocie w sąsiedztwie reaktywnej grupy karboksylowej, która przyłącza gałąź do gałęzi poprzedniej generacji.
Hiperrozgałęzione polimery, np. hiperrozgałęzione poliole, mimo iż nie zostały wytworzone przez regularną kolejną addycję rozgałęzionych warstw, mogą być równoważne polimerowi dendrytowemu, gdy charakter rozgałęzień wykazuje stopień regularności zbliżony do występującego w dendrymerze.
Do polimerów dendrytowych należą zarówno dendrymery mostkowe jak i agregaty dendrymerów. Polimery dendrytowe obejmują generacyjnie zarówno monodyspersyjne jak i polidyspersyjne roztwory dendrymerów. W roztworze monodyspersyjnym zasadniczo wszystkie dendrymery sątej samej generacji i w związku z tym mają równomierny kształt i wygląd. Roztwory polidyspersyjne charakteryzują się rozrzutem różnych generacji dendrymerów. W korzystnym wykonaniu polidyspersyjne polimery dendrytowe zawierają dendrymery co najmniej trzech różnych generacji o wielkości w zakresie od około 22 do około 110 A. Próbki P i Q z przykładu 42 stanowią przykłady takich polidyspersyjnych polimerów dendrytowych.
Do polimerów dendrytowych należą również dendrymery modyfikowane powierzchniowo. Tak np. powierzchnia dendrymeru PAMAM może zostać zmodyfikowana w wyniku addycj i aminokwasu, np. lizyny lub argininy.
Należy zdawać sobie sprawę, że odniesienie do dowolnego określonego typu polimeru dendrytowego takiego jak „polimer”, np. „polimer typu gęstej gwiazdy”, „niesymetryczny polimer dendrytowy” lub „polimer kaskadowy”, obejmuje również dendrymery mostkowe tego typu, agregaty dendrymerów tego typu, polidyspersyjne dendrymery tego typu i powierzchniowo modyfikowane dendrymery tego typu.
Gdy przenoszony materiał stanowi materiał genetyczny, na powierzchni dendrymeru korzystnie znajdują się w przeważającej części dodatnio naładowane grupy funkcyjne. Jeszcze korzystniej taką dodatnią funkcyjność uzyskuje się dzięki aminowym grupom końcowym na powierzchni dendrymeru. Dodatnio naładowane grupy funkcyjne można również wprowadzić na powierzchnię na drodze chemicznej (np. jako czwartorzędowe aminy). Taką funkcyjność aminową może zapewnić poliaminowe, poliamidoaminowe lub polialkilenoiminowe (np. polietylenoiminowe i polipropylenoiminowe) dendrymery opisane powyżej, choć można to osiągnąć również w inny sposób.
Ogólnie dendrymery stosowane do przenoszenia materiałów genetycznych mają kształt kulisty, elipsoidalny ijprętopodobny. Średnica (średnice) najwęższego przekroju wynosząkorzystnie co najmniej 50 A. Wymiar ten odpowiada w przybliżeniu średnicy dendrymeru PAMAM 6 generacji z rdzeniem z amoniaku [G6 (NH3)] lub dendrymeru 6 generacji z rdzeniem z etylenodiaminy [G6 (EDA)] (który jest nieco większy niż w przypadku rdzenia a amoniaku). (Patrz przykład 44, fig. 12 i 13; przykład 45, fig. 15 oraz przykład 42, fig. 19). Górna granica wymiaru nie została określona, choć wiadomo, że dendrymery G11 (EDA) PAMAM o średnicy około 110 A zapewniają doskonałą transfekcję. W oparciu o dane wskazujące, że agregaty dendrymerów o średnicy do około 1 000 A wystarczająco ulegają transfekcji, a agregaty 2 000 - 5 000 A nie ulegają, uważa się, że cząstki dendrymeru mogą mieć średnicę nawet około 1 000 A, oraz że mniejsze cząstki mogą tworzyć agregaty o średnicy nawet około 1 000 A, korzystnie 50-110 A. Średnice takie zazwyczaj uważa się za wymrary makrocząsteczek, w związku z czym dendrymery określa się jako makrocząsteczki dendrytowe.
Dendrymery o mniejszej średnicy można także stosować do transfekcji komórek materiałem genetycznym, z tym że najlepsze wyniki uzyskuje się jeśli kompleks DNA:dendrymer w
181 064 postaci mniejszych cząstek zasocjuje się następnie z dendrymerami o większych cząstkach, o średnicy około 50 A w najwęższym wymiarze (patrz przykład 46, fig. 15 i 16). W przykładzie 46 (fig. 15 i 16) doskonałą transfekcję uzyskano kompłeksując DNA z dendrymerem G5 (EDA) lub dendrymerem G5 (NH3) (o średnicy około 40 A), a następnie dodając do kompleksu dendrymer G9 (EDA) lub dendrymer G9 (NH3) (o średnicy około 90 A). Należy zaznaczyć, że odwrotna kolejność okazała się nie tak skuteczna.
Uważa się, że przy zastosowaniu takiego sekwencyjnego sposobu drobniejsze dendrymery mogą zawierać cząstki o najmniejszej średnicy wynoszącej zaledwie około 22 A, co odpowiada dendrymerowi G3 (NE13) PAMAM. Dendrymery poniżej generacji około 3 (G3) nie kompleksują niezależnie DNA. Najmniejsza średnica większych dendrymerów może wynosić od zaledwie około 50 A aż do około 1 000 A.
Kombinacje dendrymerów o dwóch różnych wymiarach skompleksowanych z DNA mogą również wzmagać transfekcję. Jest to słuszne zwłaszcza wtedy, gdy mieszanka dendrymerów jest polidyspersyjna pod względem wielkości, np. zawiera cząstki o wielkości w zakresie od około 22 do około 110 A. Próbki P i Q z przykładu 42 stanowią przykłady takich polidyspersyjnych kompozycji.
Sferoidalny dendrymer wytworzyć można rozpoczynając sekwencję reakcji tworzenia generacji od zasadniczo kulistego inicjatora lub materiału rdzenia, najkorzystniej zawierającego trzy miejsca reaktywne wystające z rdzenia, zazwyczaj w równej odległości od siebie, takiego jak amoniak. (Patrz np. publikacja patentowa europejska 0 115 771 i patenty USA nr 4 507 466, 4 558 120,4 568 737,4 587 329 i 4 737 550). Dendrymer może mieć także kształt wydłużonej elipsoidy lub być pręto-podobny, jeśli wychodzi się z wydłużonego, polimerycznego rdzenia zawierającego szereg miejsc reaktywnych wystających promieniowo od rdzenia w różnych punktach na całej długości, takiego jak polietylenoimina. (Patrz np. publikacja patentowa europejska nr 0 234 408 i patent USA nr 4 694 064). Dendrymery elipsoidalne uzyskuje się wychodząc z krótszego materiału rdzeniowego niż rdzeń stosowany przy dendrymerach prętowych, takiego jak np. etylenodiamina (EDA).
W dendrymerze kulistym średnica kuli korzystnie przypada w zakresie korzystnych średnic podanych powyżej. W dendrymerze elipsoidalnym lub w dendrymerze pręto-podobnym średnica prostego przekroju elipsoidy lub pręta powinna korzystnie przypadać w zakresie korzystnych średnic podanym powyżej. Prosty przekrój nie musi stanowić idealnego koła, w związku z tym może wykazywać średnice o różnych długościach, zależnie od tego, gdzie przetnie się przekrój. Uważa się, że długości dendrymerów mogą wynosić do 1 000 A.
Do przenoszenia materiału genetycznego wykorzystać można również dendrymery mostkowe. Struktury takie mogą znacznie różnić się kształtem, z tym że zasadniczo utworzone są przez zasocjowanie ze sobą sąsiednich dendrymerów typu gęstej gwiazdy, zwłaszcza poprzez wiązanie kowalencyjne, z tym że możliwe są także oddziaływania niekowalencyjne. 4 lub 5 mniejszych, kulistych, elipsoidalnych lub pręto-podobnych dendrymerów może zostać połączona mostkami tworząc agregatową strukturę unimolekulamą, wykazującą skuteczność transfekcji dendrymeru wyższej generacji.
Interesujący wariant koncepcji dendrymeru mostkowego obejmuje tworzenie makrocząsteczkowych klas tró w, w których materiał DNA lub RNA służy jako niekowalencyjna siatka pomiędzy odrębnymi dendrymerami, przy czym siatka taka utworzona jest np. w oparciu o oddziaływania elektrostatyczne. Wydaje się, że przybliżenie takiego modelu stanowi kompleks z przykładu 46, wspomniany powyżej, w którym DNA najpierw kompleksuje się z dendrymerem o mniejszych cząstkach (np. G5), po czym kompleksy DNA:dendrymer miesza się z dendrymerem o większej średnicy (np. G9), co pokazano na fig. 15 i 16.
Agregaty dendrymerów o większej średnicy tworzą się w wyniku przyciągania dendrymerów zakończonych grupami aminowymi przez rdzeń z dendrymerów zakończonych grupami karboksylanowymi. W zależności od stopnia ładunków dwóch klas dendrymerów stosowanych w takiej kompozycji, a także od ich stężenia przy wytwarzaniu kompozycji, powstająróżne typy agregatów dendrymerów. Wydaje się, że skuteczność transfekcji jest wyższa, gdy w mieszaninie
181 064 dendrymeru z końcowymi grupami aminowymi i dendrymeru z końcowymi grupami karboksylanowymi stosunek ładunku dodatniego do ładunku ujemnego wynosi korzystnie od około 25:1 do około 100:1, co powoduje powstanie agregatów zawierających sumarycznie ładunek dodatni (przykład 74). Przy odpowiednich stosunkach skuteczność transfekcji może być wyższa od obserwowanej dla macierzystego dendrymeru z końcowymi grupami aminowymi stosowanego przy takim samym stosunku ładunków i w obecności DEAE-dekstranu (który także zwiększa skuteczność transfekcji).
Dendrymery pełnej generacji (z końcowymi grupami aminowymi) i generacji połówkowej (z końcowymi grupami karboksy łanowymi) tworzą agregaty dendrymerów przy pH około 6-9, w zależności od stosunku dendrymerów z końcowymi grupami aminowymi do dendrymerów z końcowymi grupami karboksylanowymi, a także od stężeń próbki. Przy pH> 9 protonowane aminy pierwszorzędowe dendrymerówpełnej generacji zaczynająulegać odprotonowaniu, co powoduje rozpad agregatu. Przy pH <6 karboksylany i aminy trzeciorzędowe we wnętrzu dendrymerów połówkowej generacji zaczynają ulegać protonowaniu, co powoduje powstanie jonów dwubiegunowych w dendrymerach połówkowej generacji, a w efekcie również rozpad agregatu. Wydaje się, że agregat dendrymeru PAMAM jest jedynym materiałem o takiej unikatowej właściwości.
Wiadomo, że pH poza komórką wynosi 7,2, a we wnętrzu komórki około 5,0. Z tego względu celowe jest zaprojektowanie i wytworzenie agregatów dendrymerów o wyższym ciężarze cząsteczkowym z dendrymerów niższej generacji przy pH 7,4 uzyskując agregat dendrymerów tak duży, że skutecznie kompleksuje cząsteczki DNA. Jednakże aby zwiększyć DNA, takie agregaty dendrymerów powinny przenosić sumarycznie ładunek dodatni, co oznacza, że powinien istnieć znaczny nadmiar dendrymerów pełnej generacji nad dendrymerami połówkowej generacji. Jednąz interesujących właściwości takiego układu dozowania jest to, że po przedostaniu się kompleksu do komórki agregaty dendrymerów ulegają rozpadowi w wyniku niższego pH we wnętrzu komórki. Taka dysocjacja również może zwiększyć skuteczność transfekcji.
Kowalencyjna modyfikacja powierzchni dendrymerów PAMAM z grupami aminowymi za pomocą aminokwasu, lizyny, spowodowała nieoczekiwany i unikatowy wzrost skuteczności transfekcji (przykład 75, fig. 57). Stosując zmodyfikowany lizyną dendrymer G7 (NH3) skompleksowany z plazmidem uzyskuje się znacznie zwiększoną ekspresję genu lucyferazy w porównaniu z niemodyfikowanym dendrymerem G7 (NH3), a ponadto kompleksy utworzone z modyfikowanym lizyną dendrymerem G7 (NH3) zapewniajątransfekcję zbliżoną do osiąganej w przypadku dendrymeru G10 (NH3) (wszystkie eksperymenty prowadzono przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10 i w obecności DEAE-dekstranu). Doświadczenie to sugeruje, że zwiększenie gęstości ładunku w dendrymerze wpływa na proces transfekcj i, gdyż pKa grupy ε-aminowej wynosi 10,53 w porównaniu z pKa około 9 dla końcowych grup aminowych w dendrymerze PAMAM. Można oczekiwać, że również inne modyfikacje powierzchni zwiększą transfekcję w podobny lub nawet w większy sposób.
C. Opis aktywności dendrymerów w niespecyficznej transfekcji
Dokładny mechanizm niespecyficznej (to znaczy nieukierunkowanej docelowo) transfekcji komórek przez kompleksy DNA-dendrymer nie jest znany, z tym że pewne sprawy są oczywiste. Nie mając zamiaru wiązań się jakąkolwiek teorią wynalazcy uważają że DNA wiąże się z dendrymerem w wyniku oddziaływania ładunków, oraz że najwydajniejsza transfekcja występuje wtedy, gdy wytwarza się kompleks przy nadmiarze ładunków dodatnich. Oddziaływanie między kompleksem DNA:dendrymer i komórkąjest prawdopodobnie spowodowane wiązaniem się dodatnio naładowanego kompleksu z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórek. Okazało się, że prowadzenie transfekcji w obecności surowicy lub niemożność wymycia surowicy z powierzchni komórek uniemożliwia transfekcję w wyniku zobojętnienia ładunków na powierzchni komórki, co uniemożliwia przyklejenie się kompleksów do komórki. Należy zwrócić uwagę, że pewne typy kompleksów DNA:dendrymer działają lepiej w przypadku niespecyficznej transfekcji określonych komórek. To odkrycie sugeruje, że istnieją różnice
181 064 w powierzchni komórek, które ułatwiają oddziaływania z pewnymi typami kompleksów DNA:dendrymer. Potencjalnie odmienne dendrymery mogą być stosowane lub opracowane w celu zapewnienia najwydajniejszej transfekcji w przypadku różnych typów komórek.
Możliwe jest również, że z uwagi na znaczne różnice w wielkości różnych form materiału genetycznego stosowanych w terapii z przenoszeniem genu, konieczne mogą się okazać dendrymery o różnych wielkościach i gęstościach ładunku dla zapewnienia skutecznej, niespecyficznej transfekcji różnych form materiału genetycznego. Teoretycznie kompleks materiału genetycznego z dendrymerem, który skutecznie wiąże się z komórkami w wyniku oddziaływania ładunków, może bardzo różnić się w przypadku małych fragmentów materiału genetycznego takich jak oligonukleotydy złożone jedynie z kilku zasad, oraz wielkich fragmentów materiału genetycznego takich jak duże plazmidy DNA. Możnaby zasadniczo oczekiwać, że materiał genetyczny tworzy niewielki kompleks, który wykazuje wysoką gęstość ładunku dodatniego na powierzchni, aby zaszła transfekcja oparta na oddziaływaniu ładunków. W związku z tym stosowanie mniejszych dendrymerów, a następnie większych dendrymerów, albo stosowanie dendrymerów polidyspersyjnych może mieć istotne znaczenie dla tworzenia unikatowych kompleksów najskuteczniej przenoszących DNA. Również dodatek DEAE-dekstranu lub gliceryny do bufora transfekcji po wytworzeniu kompleksu DNA:dendrymer powoduje zaskakujące i nieoczekiwane zwiększenie transfekcji komórek. Dodatek innych środków do buforów transfekcji, takich jak chlorochina, która może ułatwić uwalnianie DNA z endosomów lub zapobiec jego degradacji w endosomach, może także odgrywać istotną rolę w zwiększaniu transfekcji z wykorzystaniem kompleksów dendrymerów. Jednakże takie zjawiska mogą dotyczyć jedynie niespecyficznej transfekcji in vitro, a różne kombinacje warunków lub kombinacje materiałów takich jak fuzogeniczne peptydy skuteczniej zwiększajątransfekcję in vivo lub z docelowo ukierunkowanymi nośnikami dendrymerów.
D. Materiał genetyczny i jego kompleksowanie z dendrymerem z wytworzeniem kompleksu
Materiały genetyczne stanowią materiały oparte na nukleotydach i obejmują, ale nie wyłącznie, wirusy i fragmenty wirusów, plazmidy, fagi, kosmidy, geny i fragmenty genów (np. egzony, introny), kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), zarówno jedno jak i dwuniciowy, kwas rybonukleinowy (RNA), rybosomowy RNA (rRNA), katalityczny RNA (cRNA), mały jądrowy RNA (snRNA), informacyjny RNA (mRNA), przenośnikowy RNA (tRNA), oligonukleotydy DNA i RNA (zarówno jedno-jak i dwuniciowe) albo oligomery i (antysensowne) oligonukleotydy, białkowe kwasy nukleinowe (PNA) i podstawione oligonukleotydy kwasów nukleinowych. Materiał genetyczny, zwłaszcza w postaci wirusów i fragmentów wirusów, może być skompleksowany lub sprzężony z pewną ilością białka. Określenie materiał genetyczny obejmuje także „modyfikowane oligonukleotydy” opisane dokładniej poniżej. Nukleotydy mogą być modyfikowane tak, aby nadać im większą odporność na degradację enzymatyczną, zwiększyć wchłanianie przez komórki lub w innych celach. W celu zwiększenia wchłaniania przez komórki i/lub odporności na degradację enzymatyczną, naukowcy zastępują ujemny tlen w szkielecie fosfodiestrowy grupą metylową lub siarką, tworząc metylofosfoniany lub fosforylotiany. W wyniku tego uzyskuje się odporną na enzymy nić pochodnej syntetycznego oligonukleotydu, zachowującą trwale integralność po wymieszaniu z komórkowym materiałem biologicznym. Nici odporne na nukleazę można także uzyskać wprowadzając grupy 2'-O-allilowe do syntetycznych oligonici. Wytworzono także fosforyloditiany. Przeprowadzono także modyfikację poprzez wytworzenie estrów fosforanowych i fosforyloamidanów.
Inny typ zbadanej modyfikacji stanowi zastępowanie mostka fosfodiestrowego między nukleotydarni całkowicie inną grupą taką jak mostek siloksanowy, mostek węglanowy, mostek z estru karboksymetylowego, mostek acetamidowy, mostek karbaminianowy, mostek tioeterowy i mostek peptydowy. Poza zastąpieniem mostka fosforanowego można także zastąpić reszty cukrowe i fosforanowe syntetycznym polimerem, uzyskując tworzywowy DNA. Można również modyfikować same jednostki nukleozydowe.
Określenie „materiał genetyczny” użyte w opisie obejmuje również segmenty nukleotydowe zmodyfikowane dowolnym z wyżej podanych sposobów, albo w inny sposób. Zasadniczo w
181 064 znaczeniu użytym w opisie określenie „oligonukleotyd” odnosić się będzie do wszystkich krótkich form materiału genetycznego.
Materiały genetyczne (np. kwasy nukleinowe) mogą zdecydowanie różnić się długością, począwszy od 3 zasad (około 10 A) w przypadku kodonu do 10 miliardów A czyli 1 metra w przypadku ludzkiego DNA. Wiele różnych form materiałów genetycznych może być wykorzystywana w terapii genowej. [Jako przykłady takich zakresów można podać: długość typowego ludzkiego genu wynosi około 34 pm (340 000 A); średnia długość mRNA E. coli wynosi około 0,5 A; a długość tRNA uważanego za najmniejszą z cząsteczek RNA wynosi zazwyczaj około 0,003 pm]. Potencjalnie dowolny materiał genetyczny wykorzystać można w wynalazku.
Stosowany tu termin „kompleks” dotyczy takiego typu koniugatu dendrymeru z przenoszonym materiałem, w którym asocjacja przenoszonego materiału z dendrymerem tworzy się w wyniku wiązania jonowego, sił van der Waalsa, wiązania wodorowego, wiązania metalicznego lub dowolnej ich kombinacji. W kompleksie przenoszony materiał nie jest zasocjowany z dendrymerem poprzez wiązanie kowalencyjne.
Wchłanianie kompleksów DNA:dendrymer przez komórki wykazano w przypadku nukleotydów jednoniciowego DNA o stosunkowo niskim ciężarze cząsteczkowym (przykład 47, fig. 20 i 21), a także w przypadku DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Na fig. 22 przedstawiono także przenoszenie i ekspresję genu dla kolistego lub superskłębionego DNA i liniowego DNA (przykład 48, fig. 22), a w innych doświadczeniach i na innych rysunkach przedstawiono to dla całych genów i długich segmentów DNA (np. 6,5 kb). Wchłanianie obserwowane dla kompleksu DNA:dendrymer jest ułatwione w porównaniu z wchodzeniem do komórki występującym w przypadku samego DNA oraz stanowi aktywny, zależny od energii proces komórki docelowej (przykład 47).
Aby przyłączyć materiał genetyczny do dendrymeru, dendrymer, korzystnie już ukierunkowany do zastosowania in vivo w sposób opisany poniżej, miesza się z materiałem genetycznym w roztworze wodnym w temperaturze pokojowej (20-40°C) przy pH od około 5 do około 10. Ujemnie naładowane kompleksy kwasu nuldeinowego z dodatnio naładowanymi powierzchniami cząsteczek dendrymeru tworzą strukturę sieciową.
Materiał genetyczny taki jak DNA tworzy trwałe kompleksy z dendrymerami przy stosunkach ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynoszących nawet około 10:1, z tym, że większe kompleksowanie występuje przy stosunkach ładunków około 2:1 lub poniżej. (W przykładzie 42 skuteczną transfekcję zaobserwowano dla próbki 4 o stosunku ładunków 1:0,6, patrz tabela XIV, fig. 18 i 32. Taki stosunek ładunków umożliwia również pełne kompleksowanie DNA, na co wskazuje analiza na żelu agarozowym). Przy niższych stosunkach ładunków, np. 1:10 lub 1:100, kompleksy są w dalszym ciągu bardzo trwałe (patrz przykład 49, fig. 23), a transfekcję obserwuje się nawet w nieobecności DEAE-dekstranu (przykład 56 i fig. 30). Kompleksowanie osiąga minimum przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer powyżej około 40:1, jak to wynika z przykładu 49, fig. 23(A)-(D). Na drugim końcu zakresu stosunków ładunków dobre wyniki transfekcji zaobserwować można dla pewnych dendrymerów przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer około 1:1 000, a nawet tak niskich jak około 1:10 000 (przykład 56, fig. 30). Jest możliwe, że w przypadku innych układów dendrymerów stosunki ładunków wynoszące zaledwie 1:1 000 000 mogą zapewnić skuteczne uczestniczenie w transfekcji.
Okazało się, że stosunek ładunków stanowi decyduj ący parametr wpływaj ący na tworzenie się kompleksów DNA:dendrymer, na co wskazuje przykład 50 (fig. 24), gdzie przy takim samym stosunku molowym 1:16 dendrymer Gil (EDA) o większym ładunku powierzchniowym niż dendrymer G8 (NH3) tworzy trwały kompleks z DNA, podczas gdy dendrymer G8 (NH3) po wymieszaniu z DNA w tym samym stosunku molowym nie tworzy go. Oznacza to, że tworzenie kompleksu bardziej zależy od stosunku ładunków niż od stosunku molowego.
Kompleksy DNA:dendrymer sąznacząco stabilne i rozpuszczalne w wodzie we względnie szerokim zakresie pH, np. 5,2-9,8 (przykład 51, fig. 25) i w szerokim zakresie stężeń soli, np. 0-1,5 M (przykład 52, fig. 26). Kompleksowanie materiału genetycznego z dendrymerem chroni ten materiał przed strawieniem w obecności enzymów typu endonukleaz restrykcyjnych lub nu
181 064 kleaz komórkowych (przykład 53, fig. 27 i przykład 54, fig. 28). Powoduje to, że kompleksy takie nadają się do transfekcji in νινο.
Ilość materiału genetycznego w przeliczeniu na komórkę, którą można transfekować przy wykorzystaniu kompleksów DNA.dendrymer, może zmieniać się i w tym zakresie zwiększenie stężenia materiału genetycznego powoduje wzrost stopnia transfekcji (przykład 55, fig. 29). Przy danym stosunku ładunków transfekcja jest większa przy 5 pg plazmidowego DNA/studzienkę hodowli (około 200 000 komórek) niż przy 1 pg plazmidowego DNA, choć zależność ta osiąga plateau przy 10 pg plazmidowego DNA/studzienkę.
Uważa się, że roztwory materiału genetycznego/dendrymeru, w których stężenie materiału genetycznego wynosi od około 1,0 do około 10,0 pg/ml, sąprzydatne in vitro oraz in vivo. Stężenie in vivo będzie oczywiście zmieniać się w zależności od sposobu podawania. Bardziej stężony roztwór należy zastosować przy iniekcji dożylnej, gdyż nastąpi rozcieńczenie w prądzie krwi. Bardziej rozcieńczone roztwory można stosować przy miejscowo specyficznym podawaniu, np. przy bezpośredniej iniekcji do nowotworu lub organu.
Tak więc materiał genetyczny w ilości wystarczającej do uzyskania ostatecznego stężenia od około 1,0 do około 10,0 pg/ml miesza się w wodzie z odpowiednią ilością polimeru dendrytowego z zasadniczo dodatnimi powierzchniowymi grupami funkcyjnymi do uzyskania stosunku ładunków materiału genetycznego do polimeru dendrytowego od około 10:1 do około 1:10 000, jeszcze korzystniej od około 3:1 do około 1:1 000, a szczególnie korzystnie od około 1,5:1 do około 1:100 albo od około 1:1 do około 1:15 lub od około 1:5 do około 1:10, w zależności od zmiennych opisanych powyżej. Mieszanie przeprowadza się przy pH od około 5 do około 10 w temperaturze od około 20 do około 40°C.
Ogólnie stosunek ładunków materiału genetycznego:dendryirieru może wynosić od około 10:1 do około 1:10 000 (a ewentualnie może być nawet niższy), ale korzystnie wynosi od około 5:1 lub nawet od 3:1 do 1:10 000. Stosunek wybrany w tym zakresie może zmieniać się w zależności od tego, czy stosuje się środek wzmacniający taki jak DEAE-dekstran, glicerynę lub chlorochinę, albo w zależności od tego, czy stosuje się prowadnik docelowy. Jakkolwiek powyższe szerokie zakresy mogą być wykorzystywane, to korzystny zakres stosunku ładunków bez stosowania środka wzmacniającego wynosi od około 1:5 do około 1:10 000, a jeszcze korzystniej od około 1:10 do około 1:10 000. Natomiast przy stosowaniu środka wzmacniającego korzystny zakres stosunku ładunków wynosi od około5:l do około 1:10 000, jeszcze korzystniej od około 1:1 do około 1:100, szczególnie korzystnie od około 1:1 do około 1:15, a najkorzystniej od około 1:5 do około 1:10. Natomiast przy stosowaniu prowadnika docelowego uważa się, że można zastosować wyższy stosunek ładunków z lepszym rezultatem niż przy transfekcji nieukierunkowanej. W związku z tym uważa się, że korzystny zakres wynosi od około 10:1 do około 1:10, jeszcze korzystniej od około 3:1 do około 1:10, szczególnie korzystnie od około 1:1 do około 1:10, a w pewnych przypadkach stosunek ten najkorzystniej wynosi około 1:1. Zakresy te dokładniej przedstawiono poniżej.
Zazwyczaj kompleksy wstępnie miesza się tak, aby stężenie materiału genetycznego wynosiło od około 1,0 do około 10 pg/20 pl, po czym rozcieńcza się je 50-krotnie do uzyskania ostatecznego stężenia 1,0-10,0 pg materiału genetycznego/ml. Zarówno wyjściowe, bardziej stężone roztwory lub ostateczne roztwory zawierające materiał genetyczny i polimer dendrytowy mogą stanowić jako odpowiednie kompozycje diagnostyczne lub farmaceutyczne.
E. Wzmacnianie transfekcji
Można przeprowadzić transfekcję komórek materiałem genetycznym z zastosowaniem tylko polimerów dendrytowych, z tym że stosując większe dendrymery (> G8) przy niższym stosunku ładunków materiału genetycznego do dendrymeru, np. około 1:5 lub poniżej, a korzystnie poniżej około 1:10 (przykład 56, fig. 30 i 31). Transfekcję przy zastosowaniu tylko dendrymeru i materiału genetycznego można wzmocnić kompleksując najpierw materiał genetyczny z dendrymerem niższej generacji, np. G5, a następnie dodając większy dendrymer, np. G9, jak to podano powyżej (patrz przykład 46, fig. 15 i 16). Najlepsze wyniki uzyskuje się przy stosowaniu
181 064 drugiego dendrymeru w stężeniu około 0,1 -10 pmolowym, choć konkretne stężenie może zmieniać się w zależności od rodzaju dendrymeru (porównaj fig. 15 i 16). Pierwszy dendrymeri kompleksowany z nim materiał genetyczny stosuje się w stężeniach wystarczających do skompleksowania około 1 pg materiału genetycznego na studzienkę.
Kompleksy transfekujące komórki niespecyficznie powinny spełniać dwa sprzeczne cele; po pierwsze wskazane jest możliwie jak największe zagęszczenie DNA przy równoczesnym uzyskaniu dużej gęstości ładunków dodatnich na powierzchni kompleksu, które uczestniczą w wiązaniu z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na błonach komórkowych. Takie wymaganie odnośnie podwójnej aktywności sugeruje, że mieszanka dendrymerów o polidyspersyjnych wielkościach może być bardzo cenna przy niespecyficznej transfekcji, przy czym mniejsze dendrymery ułatwiają zagęszczanie DNA, a większe uczestniczą w wiązaniu z komórkami. Może to także ułatwić tworzenie kompleksów DNA:dendrymer o mniejszych wymiarach, gdyż dendrymery niższych generacji mogą niszczyć regularną siatkę utworzoną przez większe dendrymery i DNA. Tego typu koncepcje potwierdzają dane przedstawione na mikrofotografiach elektronowych (np. fig. 60, zdjęcia 3,4 i 5), że przy stosowaniu dendrymerów o polidyspersyjnych wielkościach uzyskuje się małe, zagęszczone kompleksy DNA w porównaniu z masywnymi kompleksami DNA: dendrymer powstającymi przy zastosowaniu tylko dużych dendrymerów.
Transfekcję można także wzmocnić dodając różne środki do bufora transfekcji. Nieoczekiwanie uzyskuje się synergistyczną transfekcję, gdy bufor transfekcji zawiera DEAE-dekstran wraz z kompleksem materiału genetycznego i dendrymeru. Stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 5:1 do około 1:10 000, korzystnie od około 1:1 do około 1:100, jeszcze korzystniej od około 1:1 do około 1:15, a najkorzystniej od około 1:5 do około 1:10 (przykład 56, fig. 30; przykład 57, fig. 32; przykład 58, fig. 33; przykład 59, fig. 34; przykład 42, fig. 17). Stężenie DEAE-dekstranu powinno korzystnie przypadać w stosunkowo wąskim zakresie około 0,125-2 μΜ, a jeszcze korzystniej około 0,25-1 μΜ (przykład 60, fig. 35). Materiał genetyczny musi być skompleksowany z dendrymerem przed umieszczeniem go w roztworze DEAE-dekstranu, aby wzmocnić zachodzącą transfekcję. Po zastosowaniu tego transfekcja w obecności DEAE-dekstranu dla kompleksów DNA:dendrymer przy stosunku ładunków od około 1:1 do około 1:100, ajeszcze korzystniej od około 1:5 do około l:10jestskuteczniejszaorzędy wielkości niż transfekcja samymi kompleksami DNA:dendrymer w szerokim zakresie różnych typów komórek (przykład 61, fig. 37). Jest ona również skuteczniejsza niż transfekcja z wykorzystaniem innych środków takich jak Lipofectin™ i Lipofectamine™ (przykłady 61-63, fig. 36-3 8).
Zazwyczaj kompleks materiał genetyczny:dendrymer odstawia się na 3-5 minut po wytworzeniu, a przed połączeniem z roztworem DEAE-dekstranu. Jakkolwiek DEAE-dekstran można dodać albo do bardziej stężonego roztworu kompleksu (np. zawierającego 1 -10 pg materiału genetycznego/ 20 pl roztworu) albo do buforu transfekcji, to korzystne jest dodawanie go do buforu, w którym następnie rozcieńcza się bardziej stężony roztwór kompleksu materiału genetycznego: dendrymeru.
Wiadomo, że transfekcja in vitro wzmacniana jest przez zastosowanie konwencjonalnego składnika zakłócającego działanie komórki. Z wynalazku wynika, że DEAE-dekstran działa silniej niż środek zakłócający komórkę, co można stwierdzić z przykładu 64, fig. 39, gdzie porównano wpływ DEAE-dekstranu i środka zakłócającego komórkę, DMSO. Okazuje się, że sam DMSO wywiera niewielki wpływ na transfekcję kompleksami DNA:dendrymer w porównaniu z DEAE-dekstranem. Należy zauważyć, że DMSO wydaje się synergistycznie wzmacniać działanie DEAE-dekstranu, gdy zastosuje się razem obydwa te środki, co sugeruje iż wpływ DEAE-dekstranu obejmuje działanie inne niż zakłócanie komórki.
W związku z tym, że wykazano iż dodatek DEAE-dekstranu lub innych środków do kompleksu DNA: dendrymer (po jego wytworzeniu) skutecznie wzmacnia transfekcję w unikatowy sposób, przeprowadzono innego rodzaju doświadczenie, aby lepiej zrozumieć rolę tego środka we wzmacnianiu niespecyficznej transfekcji. Wykonano mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA:dendrymer z dodatkiem i bez DEAE-dekstranu. Dodatek DEAE-dekstranu lub zastosowanie polidyspersyjnych mieszanek dendrymerów powoduje zdecydowane zmniejszenie
181 064 wielkości kompleksów DNA:dendrymer (np. fig. 60, zdjęcia 3,4 i 5). Tłumaczy to, w jaki sposób środki takie mogą wzmacniać transfekcję, gdyż istnieje większe prawdopodobieństwo, że kompleksy o mniejszych wymiarach uzyskiwane przy zastosowaniu takich środków będą miały łatwiejszy dostęp do komórek w celu osiągnięcia transfekcji.
Kompleksy DNA:dendrymer muszą zawierać gęsto dodatnio naładowany materiał, aby działać jako punkt ogniskujący wiązanie z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórki. Najlepiej można to osiągnąć stosując dendrymery wyższej generacji, o większej gęstości ładunku powierzchniowego. Niestety dendrymery takie wykazują skłonność do kompleksowania DNA w postaci dużych agregatów lub makrosiatek o wielkości około 2 000 - 5 000 A, których pinocytoza przez komórki jest utrudniona.
DEAE-dekstran działa jako dyspergator i rozbija duże agregaty na mniej sze kompleksy, co zachowuje w dalszym ciągu gęsty ładunek na powierzchni dendrymeru zapewniający wiązanie z komórkami. Polidyspersyjne polimery dendrytowe, czyli mieszaniny cząstek o różnych wymiarach od około 22 do około 110 A (patrz np. próbki P i Q z przykładu 42) nie wykazują skłonności do tworzenia agregatów 2 000 - 5 000 A. Wydaje się natomiast, że tworzą one agregaty nie większe niż około 1 000 A, co ułatwia skuteczną transfekcję materiału genetycznego bez stosowania DEAE-dekstranu. Porównanie mikrofotografii elektronowych kompleksów materiału genetycznego z dendrymerem G10 (EDA) o równomiernej wielkości, z dodatkiem (fig. 60, zdjęcie 4) i bez (fig. 60, zdjęcie 3) DEAE-dekstranu, wykazuje zńaczną różnicę w wielkości agregatów. Na mikrofotografii elektronowej materiału genetycznego skompleksowanego z polidyspersyjnym dendrymerem (fig. 60, zdjęcie 5) widoczne są agregaty bardziej porównywalne do agregatów na fig. 60, zdjęcie 4.
Nieoczekiwanie okazało się, że gliceryna, podobnie jak DEAE-dekstran również synergistyczme wzmacnia transfekcję materiału genetycznego w kompleksach materiał genetycznyrpolimer dendrytowy. Stężenie gliceryny w roztworze transfekcyjnym wynosi korzystnie około 2-10% wagowych, a jeszcze korzystniej od około 5%. Okazuje się, że spełnia ona działanie dyspergujące podobnie jak DEAE-dekstran.
Chlorochina także wzmacnia transfekcję i zapewnia to z nieoczekiwanym synergizmem, bez względu na to, czy stosowana jest sama jako środek wzmacniający, czy też w połączeniu z DEAE-dekstranem. Nie wiążąc się jakąkolwiek teorią uważa się, że chlorochina działa w zupełnie inny sposób niż DEAE-dekstran. Sądzi się, że chlorochina zobojętnia endosomy zapobiegając w ten sposób kompleksowaniu i szybkiej degradacji kompleksów materiał genetyczny:dendrymer. Umożliwia to osiągnięcie w większym stopniu transkrypcji i translacji materiału genetycznego, niż przy transfekcji samym kompleksem lub w obecności DEAE-dekstranu, ale bez dodawania chlorochiny (patrz fig. 61A i 61B oraz przykład 73). Z uwagi na różnice między komórkami w zdolności do więzienia kompleksów w endosomach działanie wzmacniające chlorochiny znacznie różni się dla różnych linii komórkowych, co ilustrują różnice w wynikach transfekcji komórek COSI (fig. 61 A) i komórek RAT2 (fig. 6IB).
Przypadkowe wprowadzenie ujemnych grup funkcyjnych na powierzchnię polimeru typu gęstej gwiazdy również wpływa na transfekcję (przykład 67, fig. 43). Taką ujemną funkcyjność uzyskuje się rozrzucając przypadkowo grupy karboksylowe na przeważające dodatnio naładowanej powierzchni (np. zawierającej powierzchniowe aminowe grupy funkcyjne). Dendrymery zawierające zarówno dodatnie (kationowe) i ujemne (anionowe) grupy funkcyjne określa się czasami w opisie jako dendrymery z powierzchnią dwubiegunową. Zmniejszenie ogólnego dodatniego ładunku na powierzchni z reguły wydaje się obniżać skuteczność transfekcji, być może z wyjątkiem niższych stosunków ładunków, np. 1:10 w porównaniu z 1:5 lub 1:1 (fig. 43).
F. Transfekcja docelowo ukierunkowana
Wprowadzenie prowadników docelowych do kompleksu dendrymer-materiał genetyczny nie tylko kieruje kompleks do pożądanych komórek, ale może także wzmocnić transfekcję komórek grupą docelową (przykład 65, fig. 40). Do makrocząsteczki przyłącza się taką ilość prowadnika docelowego, aby został on przyciągnięty i związał się z miejscami receptorowymi na
181 064 materiale komórkowym, w którym ma zajść transfekcja, ale aby nie nastąpiło zmniejszenie ładunku powierzchniowego w takim stopniu, że nie mogło będzie wystąpić kompleksowanie DNA. W związku z tym przyłączanie prowadnika docelowego przeprowadza się w taki sposób, lub w tak proporcjonalnie małych ilościach w stosunku do grup funkcyjnych na powierzchni makrocząsteczki, aby prowadnik docelowy nie zakłócał w znacznym stopniu kationowego charakteru powierzchni polimeru dendrytowego. W związku z tym zachowana zostaje zdolność dendrymeru do tworzenia trwałych kompleksów z DNA (przy wcześniej wspomnianych stosunkach ładunków) i nie zmniejsza się w wyniku obecności prowadnika docelowego (przykład 65, fig. 41).
Zastosowanie prowadników docelowych w połączeni kompleksem dendrymer-materiał genetyczny stanowi jedno z najważniejszych korzystnych rozwiązań według wynalazku. Fakt, że nieukierunkowana transfekcja nie zachodzi tak skutecznie przy stosunkach ładunków DNA: dendrymer powyżej około 1:10 lub 1:5 bez wzmacniania, może wynikać z tego, że kompleksy takie nie zawierają wystarczającego ładunku dodatniego, aby związać się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórek. Należy podkreślić, że kompleks wytworzony przy tych wyższych stosunkach ładunku materiału genetycznego:dendrymeru (czyli 1:10 do 1:1 lub ewentualnie nawet 3:1 lub nawet 10:1) może być w dalszym ciągu kierowany przez prowadnik docelowy, tak aby zaszła transfekcja określonych komórek. Nieprzewidzianej transfekcji przypadkowo napotkanych komórek (co mogłoby być niepożądane w wielu przypadkach) unika się, gdy kompleksy DNA:dendrymer wytwarza się w taki sposób przy tych wyższych stosunkach ładunków lub wtedy, gdy obecna jest surowica (przykład 66, fig. 42). Gdy stosuje się prowadnik docelowy, w wielu zastosowaniach korzystny może być stosunek ładunków 1:1.
Zastosowanie prowadnika docelowego odgrywa bardzo ważną rolę w transfekcji in vivo materiału genetycznego w komórkach. DEAE-dekstran, mimo iż nie jest toksyczny przy stosowaniu in vitro, może nie nadawać się do stosowania in vivo jako środek wzmacniający transfekcję. Kompleksy dendrymeru z materiałem genetycznym, z dodatkiem lub bez środka wzmacniającego, nie transfekują w znaczącym stopniu komórek w obecności surowicy (przykład 66, fig. 42). Prowadnik docelowy ułatwiając wiązanie kompleksu materiał genetyczny- dendrymer ze specyficznymi docelowymi komórkami ułatwia transfekcję materiału genetycznego w tych komórkach, nawet w obecności surowicy.
Prowadniki docelowe lub zmodyfikowane powierzchnie dendrymeru można także zastosować w kompleksie dendrymer-materiał genetyczny w obecności DEAE-dekstranu in vitro, aby zintensyfikować transfekcję. Okazuje się, że obecność prowadników docelowych takich jak trisacharyd galaktozowy, na dendiymerach, znacznie wzmacnia transfekcję materiału genetycznego w komórkach wytwarzających w wyniku ekspresji receptor dla tego cukru. Porównano to z transfekcją uzyskiwaną przy stosowaniu nieskompleksowanego dendrymeru Gil (EDA) PAMAM (patrz fig. 40).
Do odpowiednich prowadników docelowych należą dowolne materiały, które wiążą się specyficznie i z wysokim powinowactwem, takie jak przeciwciała, fragmenty przeciwciał takie jak fragmenty Fab, Fab' i F(ab')2, przeciwciała jednołańcuchowe lub dowolne inne fragmenty przeciwciał wykazujące wymaganą docelową specyficzność, glikoproteiny, białka, glikolipidy, hormony, dodatkowe modyfikatory odpowiedzi biologicznej, epitopy, odżywki komórkowe, chemiczne grupy funkcyjne wykazujące specyficzność względem komórek docelowych itp. Dla specjalistów oczywiste są liczne rozwiązania dotyczące łączenia prowadnika docelowego z dendrymerem.
Jeden ze sposobów przyłączania korzystnego prowadnika docelowego, biotyny, do dendrymeru zawierającego aminowe grupy funkcyjne na powierzchni, zilustrowano schematycznie poniżej:
181 064
Przyłączanie kwasu pirośluzowego, innego potencjalnego prowadnika docelowego, zawierającego aminowe grupy funkcyjne na powierzchni, przebiega zgodnie z następującym schematem reakcji, na którym pokazano sprzęganie 64 pirośluzanów z dendrymerami G5:
O O
II II
H3c - C - C - ONa godzin @ temperatura pokojowa pH = 5
N—CH i 3 (EDC) H3C
181 064
Stopień funkcjonalizowania dendrymeru prowadnikiem docelowym jest minimalny, tak aby ograniczyć do minimum zakłócający wpływ prowadnika docelowego na ogólny kationowy charakter powierzchni dendrymeru. W związku z tym stosunek stechiometryczny prowadnika docelowego do makrocząsteczki dendrymeru wynosi od około 1:1 do około NcNb G·': 1 (gdzie Nc i G mająznaczenie podane wyżej, a Nb oznacza krotność rozgałęzień). W dendrymerze, w którym Nc = 3, a Nb = 2, wymaga to jedynie wykorzystania od jednej do NcNbG·' grup końcowych, tak że pozostawia się od NcNb G·' do jednej grupy końcowej stanowiącej dodatnio naładowaną (np. aminową) grupę funkcyjną, oraz w pewnych przypadkach, rozproszoną ujemną karboksylową grupę funkcyjną. Logiczna struktura dendrymeru, zwłaszcza w przypadku polimerów lub dendrymerów typu gęstej gwiazdy, umożliwia wyjątkowo precyzyjne koniugowanie, niemożliwe do osiągnięcia w przypadku materiałów innego typu. Taka precyzja umożliwia wytwarzanie ukierunkowanych dendrymerów, które zachowujązdolność wiązania przenoszonego materiału genetycznego.
Podobnie jak można różnicować poszczególne cząsteczki dendrymerów przyłączając do nich grupę ukierunkowującą można także różnicować agregaty. Można np. przyłączyć grupę ukierunkowującą do wszystkich dendrymerów w agregacie, albo tylko do jednego lub do części dendrymerów, które można następnie agregować z innymi, nieróżnicowanymi dendrymerami. Po wymieszaniu dwóch typów w fizjologicznie łagodnych warunkach (np. przy pH 7,4), nastąpi ich asocjacja dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym. Taki nowy sposób stanowi nie tylko nową metodę syntezy zróżnicowanych agregatów dendrymerów, ale również dostarcza układu, który może dostarczać grup ukierunkowujących w warunkach fizjologicznych.
G. Zastosowanie kompleksów materiał genetyczny-dendrymer
Kompleksy materiał genetyczny-dendrymer według wynalazku można stosować do przenoszenia DNA, zarówno in vivo jak i in vitro. Zastosowanie in vivo obejmuje wprowadzanie koniugatu do prądu krwi, tak aby doszły one do docelowych komórek; tak np. kompleksy DNA: dendrymer wstrzykuje się do żyły zwrotnej, aby doszły one do hepatocytów. Kompleksy można również wstrzykiwać do określonego, interesującego zlokalizowanego obszaru, takiego jak przestrzeń stawowa lub jama otrzewna, aby osiągnąć miejscową transfekcję komórek. Można także wprowadzić kompleks do organizmu przezskómie, a także innymi sposobami wykorzystywanymi w podobny sposób do wprowadzania środków farmaceutycznych do organizmu.
Prowadnik docelowy na dendrymerze ułatwia kierowanie i wiązanie kompleksu z receptorami na powierzchni komórek, a następnie ich transfekcję na drodze endocytozy. Na fig. 51 zilustrowano hipotetyczny proces transfekcji komórek ukierunkowanym kompleksem DNA:dendrymer. W „A” DNA (10) zostaje skompleksowany i zagęszczony na szeregu dendrymerach typu gęstej gwiazdy (20) z dołączonym prowadnikiem docelowym (30). W „B” koniugat (10-20-30) przyłącza się do komórki (40) przy receptorach (50) poprzez prowadnik docelowy (30). W „C” zachodzi transfekcja, co przedstawiono jako odszczepienie DNA *(10) od dendrymeru (20, co ułatwia zajście transkrypcji i translacji.
Badania z radionuklidami wykazały, że znaczna część transfekowanego materiału genetycznego wchodzi do jąder komórek eukariotycznych (przykład 70, fig. 47, A-F). Produkt /transfekcji materiałem genetycznym z udziałem dendrymeru wykazuje doskonałą substantywność (przykład 68, fig. 44). Aktywność enzymatyczna Luciferase™ jest znacząca po 21 godzinach, jest w dalszym ciągu znacząca po 45 godzinach od transfekcji, a pewna aktywność występuje nawet po 69 godzinach. Ekspresję genu lacZ wprowadzonego do komórek z plazmidem RSV-|3-gal i dendrymerem przedstawiono na zdjęciach 48 i 49 (patrz również przykład 71). Na zdjęciach komórki wytwarzające w wyniku ekspresji gen lac Z stanowią komórki zaciemnione. W odpowiednich warunkach zabarwiona zostaje prawie każda komórka, co świadczy o tym, iż transfekcja zaszła prawie we wszystkich komórkach w hodowli.
Kompleksy DNA:dendrymer jako takie wykazująbardzo małącytotoksyczność (przykład 69, fig. 45 i 46). Normalna obumieralność komórek w hodowli stanowi około 5-10%. Dodanie kompleksów DNA.dendrymer do hodowli komórek nie powoduje w znacznym stopniu wzrostu szyb
181 064 kości zużywania się hodowli. Wprowadzanie DEAE-dekstranu wraz z kompleksem DNA:dendrymer powoduje wzrost toksyczności, ale nie w stopniu uniemożliwiającym jego zastosowanie in vivo (fig. 45 146). Powyższe zjawiska zaobserwowano dla szeregu różnych typów komórek (ibid).
Materiał genetyczny transfekowany z użyciem kompleksu według wynalazku może być trwale wprowadzony do chromosomowego DNA w komórkach, tak że z powodzeniem ulega reprodukcji i jest zawarty w klonach kolejnych generacji (przykład 72, fig. 52 i 53). Z powodzeniem przeprowadzono transfekcję genów wytwarzających w wyniku ekspresj i oporność na G418 (neomycynę) oraz β-galaktozydazę w liniach komórek D5 i RAT2 z wykorzystaniem technik według wynalazku. Obydwa geny doprowadzono na jednym plazmidzie RSV-P-gal-NEO. Linie komórek ulegają replikacji co 24 godziny. W 4 tygodnie po transfekcji nowo powstałe klony w dalszym ciągu wytwarzały w wyniku ekspresji oporność na neomycynę i β-galaktozydazę. Wyniki uzyskane z wykorzystaniem kompleksów według wynalazku są zdumiewająco korzystne w porównaniu ze znanymi sposobami takimi jak prowadzenie transfekcji z udziałem fosforanu wapnia lub samego DEAE-dekstranu. Podobne wyniki uzyskuje się przy współtransfekcji genów reporterowych z innych plazmidów ekspresji (np. neomycyny lub β-galaktozydazy).
Transfekcję materiału genetycznego można także przeprowadzić stosując inne typy polimerów dendrytowych, inne niż polimery typu gęstej gwiazdy, takie jak oparty na lizynie niesymetryczny dendrymer, co wykazano w przykładzie 73 (fig. 54). Wszystkie warunki transfekcji z wykorzystaniem polimerów typu gęstej gwiazdy odnosząsię również do transfekcji z wykorzystaniem innych typów polimerów dendrytowych. Taknp. DEAE-dekstran również synergistycznie wzmacnia taką transfekcję z asymetrycznym dendrymerem lizynowym przy stosunku ładunków DNA:dendrymer od 1:5 do 1:10.
Przykłady
Poniższe przykłady dokładniej ilustrują wynalazek, z tym że nie ograniczająjego zakresu. Przykłady oznaczone literami dotyczą wytwarzania materiałów wyjściowych; przykłady oznaczone liczbami dotyczą wytwarzania produktów według wynalazku.
W poniższych przykładach zastosowano następujące określenia i warunki, o ile nie zaznaczono tego inaczej.
Temperatura otoczenia oznacza temperaturę pokojową od około 20 do około 25°C.
ASGPR oznacza receptor asiałoglikoproteiny.
BHA oznacza benzhydryloaminę.
β-gal oznacza RSV-lacZ.
Bufor wiązania stanowi określony roztwór buforowy opisany poniżej w procedurze transfekcji dendrymeru-dekstranu, dzień 2, etap 1, omówienie wytwarzania roztworu.
BOC oznacza tert-butoksykarbonyl
St. oznacza stężony.
Cyt c oznacza białko, cytochrom c.
DCC oznacza dicykloheksylokarbodiimid.
DEAE-dekstran oznacza eter dietyloaminoetylowy dekstranu, elektrododatnio naładowany polimer.
DMEM oznacza ośrodek Dulbecco's Modified Eagles Medium.
DMF oznacza dimetyloformamid.
DMSO oznacza dimetylosulfotlenek.
DO3A oznacza kwas l,4,7,10-tetraazacyklododekano-l,4,7-trioctowy.
DOTA oznacza kwas l,4,7,10-tetraazacyklododekano-l,4,7,10-tetraoctowy.
DTAF oznacza fluoresceinę dichlorotriazynylową.
DTPA oznacza kwas dietylenotriaminopentaocowy.
DTPMP oznacza kwas dietylenotriaminopentametylenofosfonowy.
DTT oznacza 1,4-ditiotreitol.
EBV oznacza wirus Epsteina-Barra.
181 064
EBV-A oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko B fosfotransferazę higromycynową, które dezaktywuje antybiotyk Hygromycine™ z genu kinezowego pod kontroląpromotora EBV.
EDA oznacza etylenodiaminę.
EDAC oznacza l-etylo-3(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid.
EDC oznacza l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimid.
EDTA oznacza kwas etylenodiammotetraoctowy.
Analiza FACS oznacza sortowanie komórek uaktywnionych fluorescencyjnie.
FITC oznacza izotiocyjanian fluoresceiny.
G lub Gen oznacza generację dendrymeru.
GC oznacza chromatografię gazową.
GGE oznacza gradientową elektroforezę żelową.
HBS oznacza roztwór soli z buforem Hanksa.
HEPES oznacza kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy.
HOBT oznacza N-hydroksybenzotriazoL
HPLC oznacza wysokosprawną chromatografię cieczową.
HRP oznacza peroksydazę chrzanową.
Hyrgomycin B ™ oznacza aminoglikozydowy antybiotyk wytwarzany przez Streptomyces hygroscopicus.
ICAM oznacza międzykomórkową cząsteczkę adhezyjną.
Immunoglobuliny oznaczają IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, w tym również Fab, F(ab')2 i inne fragmenty.
LC oznacza chromatografię cieczową.
Luciferase™ oznacza enzym uzyskany z genu liciferazy świetlika, dostępny z Promega, Madison, WI, USA.
Luciferin™ oznacza substrat do pomiaru aktywności enzymatycznej Luciferase™.
MB+ oznacza kationową postać barwnika, błękitu metylenowego.
NHS-LC-biotyna oznacza standardowy odstępnik z łącznikiem stosowanym z biotyną.
NMP oznacza N-metylopirolidynon.
Przez noc oznacza od około 9 do 18 godziny.
PAMAM oznacza poliamidoaminę.
PBS oznacza roztwór soli buforowany fosforanem (dostępny z Sigma Chemical), zawierający 120 mM NaCl, 2,7 mM KC1 i 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4.
PEI oznacza polietylenoiminę.
P, oznacza nieorganiczny fosforan (stosowany jako bufor).
PTEE oznacza politetrafluoroetylen.
RSV-P-gal-NEO oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko β-galaktozydazę z genu lacZ i białko fosfotransferazę aminoglikozydowąz genu ΑΡΗ (NEO) pod kontroląpromotora RS V.
RSV-lac oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko β-galaktozydazę z genu lacZ pod kontroląpromotora RSV.
RSV-luc oznacza plazmid reporterowy wytwarzający w wyniku ekspresji gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora RSV.
SDS oznacza decylosulfonian sodowy.
Żywica SP-Sephadex™ C-25 stanowi żywica kationowymienna zawierająca grupy funkcyjne kwasu sulfonowego, dostępna z Pharmacia, Inc.
TREN oznacza tris(2-aminoetylo)aminę.
THF oznacza tetrahydrofuran.
TLC oznacza chromatografię cienkowarstwową.
TMB oznacza 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę.
Tris-glicyna oznacza N-[2-hydroksy-1,1 -bis(hydroksymetylo)etylo]glicynę.
TRIS oznacza bufor tris-aminowy, np. tris(hydroksymetylo)aminometan.
181 064
Tnton Χ-100 oznacza oktoksynol-9 czyli etoksylowany alkilofenol odpowiadający ogólnemu wzorowi C8H17C6H4(OCH2CH2)nOH, w którym n wynosi średnio 9, środek powierzchniowo czynny dostępny z Rohm and Haas
X-gal oznacza 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-3-D-galaktozyd.
Ogólna część doświadczalna
Widma masowe otrzymywano w spektrometrze masowym Finnigan TSQ (układ Q'MS) lub w spektrometrze masowym wysokiej rozdzielczości VG ZAB-MS (bombardowanie szybkimi atomami ksenonu, z zastosowaniem mieszanki 3:1 ditiotreitokditioerytrytol).
Widma 'H i 13C NMR wykonywano w spektrometrach Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker NR-80 lub Jeol FX400. Wszystkie widma wykonywano w 30°C, o ile nie zaznaczono inaczej. Widma *H NMR wykonywano w podanych urządzeniach odpowiednio przy 300 MHz, 80 MHz lub 400 MHz; widma 13C NMR wykonywano w podanych urządzeniach odpowiednio przy 75 MHz, 20 MHz lub 100 MHz. Wielkości NMR stanowią wielkości δ względem TMS (tetrametylosilanu), albo, w przypadku stosowania D2O, względem DSS (soli sodowej kwasu 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonowego).
Widma w podczerwieni (IR) rejestrowano w aparacie Nicolet 5SX FT/IR.
W analizach chromatograficznych większość rozpuszczalników stanowiły materiały Fisher do HPLC. Octan amonowy uzyskano z Aldrich. Wodę oczyszczano stosując układ filtracji wody Bamstead NANOpure™. Preparatywnąchromatografię związków organicznych wykonywano przeprowadzając zwykłą chromatografię grawitacyjną z wykorzystaniem standardowych technik lub chromatografię rzutową w sposób opisany przez C.W. Stilla i innych, J. Org. Chem. 43,2923-24(1978).
TLC oraz wielkości Rf dotyczą podanych układów rozpuszczalników oraz dostępnych w handlu płytek do TLC z krzemionką [GHLF 250 μ, Analtech Inc. lub Merck Kieselgel 60F254]. Preparatywną chromatografię kolumnową wykonywano na żelu krzemionkowym Merck 60,60 A.
Wszystkie procenty są wagowe, o ile nie zaznaczono tego inaczej.
pH-stat stanowi urządzenie mechaniczne, które mierzy i nastawia pH roztworu do ustalonej, pożądanej wielkości, poprzez dodanie odpowiedniej ilości wybranego kwasu i/lub zasady.
Pewne substancje stałe suszono w wyparce rotacyjnej (Buchi 461) i/lub w suszarce próżniowej w temperaturze około 55-60°C przez kilka godzin. Do usuwania rozpuszczalników wykorzystywano również automatyczną suszarkę sublimacyjną Virtis model 10-010 lub koncentrator Speed Vac™.
Stosowano następujące kolumny HPLC: ręcznie napełniana Q-Sepharose™ (Pharmacia), 1,5x25 cm lub 2,5 x 25 cm; Zorbax™ BIO Series GF-250 (9,4 mm x 25 cm) z DuPont Instruments; Yydac™ (znak towarowy Separations Group, Hesperia, CA)(4,6 z białkiem C^4 (4,6 mm x 25 cm), z Separations Group (Hesperia, CA); Mono-Q™ i SP-Sephadex™ (znak towarowy Pharmacia Biotechnology Producs) z Pharmacia; Sep-Pak™ (znak toawrowy Waters Associates), wkład C-18 dostępny z Waters Associates (Milford, MA); Sephadex™ G-25, kolumny jednorazowego użytku (2,2 ml) z Isolab Inc. (Akron, OH); Centricon™-30 (znak towarowy Amicon Division, W.R. Grace & Co., Danvers, MA), mikrokoncentratory z Amicon; oraz Spherisorb™ ODS-1 (znak towarowy Phase Separations, Ltd.).
Do wirowania i zatężania stosowano Sorvall RT 6000B (chłodzona wirówka z DuPont). Do usuwania lotnych rozpuszczalników stosowano koncentrator Speed Vac™ (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.).
Przykład A. Wytwarzanie 2-karboksyamido-3-(4'-nitrofenylo)propanamidu p-nitrobenzylomalonian (2,4 g, 8,13 mmola) rozpuszczono w 35 ml metanolu. Roztwór ogrzano do 50-5 5°C z mieszaniem i przez roztwór barbotowano strumień suchego amoniaku w ciągu 64 godzin. Roztwór schłodzono i biały, kłaczkowaty produkt odsączono, a następnie krystalizowano z 225 ml wrzącego metanolu otrzymując 1,85 g (7,80 mmola) bis-amidu z wydajnością 96% [temperatura topnienia 235,6°C (rozkład)]. Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia 'Hi l3C NMR.
181 064
Analiza: wyliczono dla C10H11O4N3:
C H N
teoretycznie 50,63 4,69 17,72
stwierdzono 50,75 4,81 17,94
Przykład B: Wytwarzanie l-amino-2-(aminometylo)-3-(4'-nitrofenylo)propanu 2-karboksyamido-3-(4'-nitrofenylo)propanamid (2,0 g, 8,43 mmola) zawieszono w 35 ml suchego THF w atmosferze azotu, z mieszaniem. Do mieszaniny dodano ze strzykawki kompleks borowodoru z THF (106 ml, 106 mmoli). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 48 godzin; w tym czasie zawieszony amid rozpuścił się. Roztwór schłodzono i THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Pozostałość zawierającą surowy produkt i borowodór rozpuszczono w 50 ml etanolu i roztwór przedmuchano bezwodnym gazowym chlorowodorem. Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy chlorowodorek rozpuszczono w 15 ml dejonizowanej wody i wyekstrahowano dwoma porcjami po 50 ml chlorku metylenu. Warstwę wodną schłodzono w łaźni z lodem w atmosferze argonu i powoli dodano 50% wodorotlenek sodowy do alkalicznego pH, 11,7. Zasadową warstwę wodną wyekstrahowano 4 porcjami po 25 ml chlorku metylenu i połączone ekstrakty odparowano w wyparce rotacyjnej uzyskując 1,45 g oleju o barwie bursztynowej. Olej ten ucierano z eterem dietylowym (50 ml) i przesączono podciśnieniemprzez krótką kolumnę na żelu krzemionkowym (typ 62, Aldrich). Kolumnę przemyto 100 ml eteru i połączone przesącze odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 1,05 g (5,02 mmola) tytułowej diaminy w postaci klarownego oleju [bischlorowodorek - temperatura topnienia = 275-278°C (rozkład)].
Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia 'H i 13C NMR.
Analiza: wyliczono dla CioHi7N3OiC12:
C Η N teoretycznie 42,57 6,07 14,89 stwierdzono 43,00 6,14 15,31
Przykład C: Wytwarzanie l-amino-2-(aminometylo)-3-(4'-aminofenylo)propanu
Roztwór borowodór/THF (70 ml, 70 mmoli) dodano z mieszaniem, w atmosferze azotu przez cewnik z igłą do kolby zawierającej 4-aminobenzylomalonamid (1,5 g, 7,24 mmola). Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 40 godzin. Bezbarwny roztwór schłodzono i nadmiar THF usunięto w wyparce rotacyjnej otrzymując klarowny galaretowaty olej. Do oleju ostrożnie dodano metanol (50 ml), z zauważalnym wydzielaniem się gazu. Przez zawiesinę barbotowano suchy chlorowodór, co spowodowało rozpuszczenie, po czym roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 minutę. Roztwór metanol/HCl usunięto w wyparce rotacyjnej, a pozostałość w postaci chlorowodorku poddano ponownie obróbce w cyklu obejmującym rozpuszczanie/ogrzewanie we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną. Otrzymany chlorowodorek rozpuszczono w 10 ml wody i schłodzono w łaźni z lodem w atmosferze argonu. Do mieszanego roztworu powoli dodano stężony (50%) wodorotlenek sodowy do pH 11. Warstwę wodną wyekstrahowano 2 porcjami po 100 ml chloroformu, po czym warstwy organiczne połączono i przesączono przez krótki wkład z żelu krzemionkowego bez suszenia. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem (w wyparce rotacyjnej) uzyskując tytułowy związek (0,90 g, 5,02 mmola), z 70% wydajnością (Rf = 0,65; CHCl3/MeOH/stężony NH40H 2/2/1). Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia ’H i l3C NMR. Związek zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład D: Wytwarzanie6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,1 l-tetraaza-5,7-dioksoundekanu 4-aminobenzylomalonian dietylu (2,03 g, 8,43 mmola) rozpuszczono w 10 ml metanolu. Roztwór ten wkroplono do mieszanego roztworu świeżo destylowanej etylenodiaminy (6,00 g, 103,4 mmola) w 10 ml metanolu, w atmosferze azotu, w ciągu 2 godzin. Klarowny roztwór mieszano przez 4 dni, gdy analiza TLC wykazała całkowitą konwersję diestru (Rf= 0,91) do bisamidu (Rf=0,42 - 20% stężony NH4OH/80% etanolu). Uzyskany materiał był silnie dodatni w próbie ninhydrynowej. Metanol i nadmiar diaminy usunięto w wyparce rotacyjnej, po czym uzyskaną
181 064 białą substancję stałą suszono pod zmniejszonym ciśnienie (10' mm, 50°C) przez noc otrzymując surowy produkt (2,45 g, 8,36 mmola) z wydajnością 99%. Próbkę analityczną rekrystalizowano z mieszaniny chloroform/heksan - temperatura topnienia 160-161°C. Widmo masowe, 'Hi l3C NMR odpowiadały strukturze tytułowego związku.
Przykład E: Reakcja mesylo-azirydyny z l-amino-2-(aminometylo)-3-(4-nitrofenylo)propanem l-amino-2-(aminometylo)-3-(4-nitrofenylo)propan (400 mg, 1,91 mmola, czystość 96%) rozpuszczono w 10,5 ml absolutnego etanolu w atmosferze azotu. Do mieszanego roztworu diaminy dodano stałą mesylo-azirydynę (950 mg, 7,85 mmola). Reakcję prowadzono w 25°C przez 14 godzin stosując mieszadło magnetyczne; w tym czasie na ściankach kolby wytrąciła się biała, żywicowata pozostałość. Etanol zdekantowano, a pozostałość ucierano z kolejnąporcją 15 ml etanolu w celu usunięcia nieprzereagowanej azirydyny. Żywicowaty produkt wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem (10' mm, 25°C) otrzymując tetrakismetylosulfonamid (1,0 g, 1,44 mmola) z wydajnością75% (Rf = 0,74, NH4OH/etanol 20/80). Budowę tytułowego związku potwierdziła spektroskopia 'Hi 13C NMR.
PrzykładF: Wytwarzanie 2-(4-nitrobenzylo)-1,3-(bis-N,N-2-aminoetylo)diaminopropanu
Surowy metylosulfonamid z przykładu E (650 mg, 0,94 mmola) rozpuszczono w 5 ml przedmuchanego azotem, stężonego (98%) kwasu siarkowego. Roztwór ten utrzymywano w atmosferze azotu i ogrzewano w 143-146°C przez 27 minut z intensywnym mieszaniem. Zaobserwowano nieznacznie ciemnienie, po czym roztwór schłodzono i wylano do mieszanego roztworu eteru (60 ml). Wytrącony biały placek soli odsączono i natychmiast rozpuszczono w 10 ml dejonizowanej wody. pH roztworu doprowadzono do 11 za pomocą 50% NaOH, w atmosferze argonu, z chłodzeniem. Uzyskany roztwór wymieszano z 90 ml etanolu i wytrąconą nieorganiczną sól odsączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując surową aminę w postaci jasno brunatnego oleju, do którego dodano 190 ml toluenu w atmosferze azotu. Mieszaninę reakcyjną intensywnie mieszano usuwając wodę przez destylację azeotropową(z nasadką Deaba-Starka) aż roztwór toluenowy przybrał jasno żółtą barwę (w kolbie pozostało 30-40 ml roztworu). Mieszaninę schłodzono i toluen zdekantowano znad ciemnej, trudnej do obróbki pozostałości i soli. Z roztworu odpędzono rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymany jasno żółty olej wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem (0,2 mm, 35°C) przez noc otrzymując 210 mg tytułowego produktu (60%), który scharakteryzowano na podstawie spektroskopii masowej, Ή i ,3C NMR.
Przykład G: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji 0,5 przedstawia następujący schemat:
Związek nr 1
O
II h2c=chcoch3 ch3oh
Związek nr 2
181 064
Akrylan metylu (2,09 g, 24 mmole) rozpuszczono w metanolu (15 ml). Związek nr 1 czyli
6-(4-aminobenzylo-l,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioksoundekan (1,1 g, 3,8 mmola) otrzymywanie związku opisano w przykładzie D) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i roztwór dodano powoli, w ciągu 2 godzin, do intensywnie mieszanego roztworu akrylanu metylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 godzin w temperaturze otoczenia. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej utrzymując temperaturę poniżej 40°C. Ester (związek nr 2) otrzymano w postaci żółtego oleju (2,6 g). Nie zaobserwowano karboksylowania grupy anilinowej.
Przykład H: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) pierwszej generacji przedstawia następujący schemat:
Związek nr 2 h2nch2ch2nh2 + --------------------CH3OH
Związek nr 3
Ester (związek nr 2) (2,6 g, 3,7 mmola) rozpuszczono w metanolu (100 ml). Uzyskany roztwór ostrożnie dodano do intensywnie mieszanego roztworu etylenodiaminy (250 g, 4,18 mola) w metanolu, z taką szybkością, aby temperatura nie wzrosła powyżej 40°C. Po zakończeniu dodawania estru mieszaninę reakcyjną mieszano przez 28 godziny w 35-40°C (płaszcz grzejny). Po 28 godzinach nie można było wykryć grup estrowych metodą spektroskopii IR. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce rotacyjnej w 60°C. Nadmiar etylenodiaminy usunięto wykorzystując potrójny azeotrop toluen-metanol-etylenodiamina. Nakoniec cały pozostały toluen usunięto stosując azeotropowanie z metanolem. Po usunięciu całości metanolu otrzymano 3,01 g tytułowego produktu (związku nr 3) w postaci pomarańczowej szklistej substancji stałej.
Przykład I: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji 1,5 przedstawia następujący schemat:
Związek nr 3
O
II h2c=chcoch3 ch3oh /Λλ\ II 11 11
H2N—U Y> CH2CH (CNHCH2CH2N(CH2CH2CNHCH2CH2N(CH2CH2COCH3) 2) 2) 2
Związek nr 4
181 064
Aminę (związek nr 3) (2,7 g, 3,6 mmola) rozpuszczono w metanolu (7 ml) i powoli dodano w ciągu 1 godziny do mieszanego roztworu akrylanu metylu (3,8 g, 44 mmole) w metanolu (15 ml) w temperaturze otoczenia. W czasie wkraplania zaobserwowano nieznaczne rozgrzewanie się roztworu. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej w 40°C. Po usunięciu całości rozpuszczalnika i nadmiaru akrylanu metylu uzyskano ester (związek nr 4) z wydajnością4,7 g, w postaci pomarańczowego oleju.
Przykład!: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji 0,5 przedstawia następujący schemat:
Η N
ch2ch (CH2NH2) o
II h2c=chcoch3 ch3oh
Związek nr 5
Związek nr 6
Triaminę (związek nr 5, którego wytwarzanie e opisano w przykładzie C) (0,42 g, 2,3 mmola) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i wkroplono w ciągu 1 godziny do akrylanu metylu (1,98 g, 23 mmole) w metanolu (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 48 godzin. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej utrzymując temperaturę nie przekraczającą40°C. Nadmiar akrylanu metylu usunięto na drodze powtarzanej destylacji azeotropowej z metanolem. Tytułowy ester (związek nr 6) wydzielono w postaci pomarańczowego oleju (1,24 g).
Przykład K: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji pierwszej przedstawia następujący schemat:
H2NCH2CH2NH2
Związek nr 6 ch3oh
Związek nr 7
Ester (związek nr 6) (1,24 g, 2,3 mmola) rozpuszczono w metanolu (50 ml) i wkroplono w ciągu 2 godzin do intensywnie mieszanej etylenodiaminy (73,4 g, 1,22 mola) w metanolu (100 ml). Zaobserwowano nieznaczną reakcję egzotermiczną. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 72 godziny. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce roacyjnej w 60°C. Nadmiar etlenodiaminy usunięto wykorzystując potrójny azeotrop toluen-metanol-etylenodiamina.
181 064
Na koniec cały pozostały toluen usunięto z metanolem i umieszczono pod pompą próżniową na 48 godzin, uzyskując tytułową aminę (związek nr 7) (1,86 g) w postaci żółto/pomarańczowego oleju.
Przykład L: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji 1,5 przedstawia następujący schemat:
Związek nr 7
H2C=CHCOCH3 ch3oh
O
Związek nr 8
Aminę (związek nr 7) (1,45 g, ze śladową pozostałością metanolu) rozpuszczono w metanolu (100 ml) i powoli dodano w ciągu 1,5 godziny do mieszanego roztworu akrylanu metylu (5,80 g) w metanolu (20 ml). Roztwór mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu rozpuszczalnika, a następnie powtarzanej destylacji azeotropowej z metanolem usunięto całość nadmiaru akrylanu metylu. Po suszeniu pod pompą próżniową przez 48 godzin otrzymano tytułowy ester (związek nr 8) w postaci pomarańczowego oleju (2,50 g, 1,8 mmola).
Przykład M: Hydroliza dendrymeru (G 4,5) i wytwarzanie soli wapniowej
PAMAM generacji 4,5 (z końcowymi grupami estrowymi, inicjowanie NH3) (2,11 g, 10,92 milirównoważnika) rozpuszczono w 25 ml metanolu i do roztworu dodano 10% NaOH (4,37 ml, 10,92 milirównoważnika) (pH 11,5-12). Po 24 godzinach w temperaturze pokojowej pH doszło do około 9,5. Po kolejnych 20 godzinach rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, dodano 50 ml toluenu i mieszaninę odparowano ponownie.
Uzyskany olej rozpuszczono w 25 ml metanolu i wytrącono w postaci białej żywicy przez dodanie 75 ml eteru dietylowego. Ciecz zdekantowano, a żywicę osuszono w wyparce rotacyjnej otrzymując bardzo drobny biały proszek, z którego w wyniku dalszego suszenia uzyskano 2,16 g produktu (98% wydajności). Metodami NMR i IR nie stwierdzono obecności grup estrowych.
Sól sodowąPAMAM generacji 4,5 (z końcowymi grupami estrowymi, inicjowanie NH3) przekształcono w sól wapniową przeprowadzając dializę. Sól sodową (1,03 g) rozpuszczono w 100 ml wody i przepuszczono przez rurę do dializy z pustymi włóknami (odcinanie 5000) z szybkością3 ml/minutę. Rura zanurzona była w kąpieli z 5% roztworu CaCl2. Procedurę powtórzono.
Uzyskany roztwór poddano ponownie dializie, tym razem względem wody, powtarzając to jeszcze dwukrotnie.
Po odparowaniu otrzymano 0,6 g wilgotnej substancji stałej, którą wymieszano z metanolem (nie wszystko rozpuściło się) i wysuszono uzyskując 0,45 g tytułowego produktu w postaci białawych kryształów.
C369H592O141N9lCa24. Ciężar cząsteczkowy = 9526,3
C H N Ca
teoretycznie 46,50 6,32 13,38 10,10
stwierdzono 47,34 7,00 13,55 8,83
Przykład N: Wytwarzanie dendrymerów z końcowymi grupami karboksylanowymi Poliamidoaminy Starburst™ generacji połówkowej hydrolizowano w celu przekształcenia końcowych grup w postaci estru metylowego w karboksylany. Uzyskano sferoidalne cząsteczki z ujemnymi ładunkami na obrzeżu. Hydrolizowano dendrymery od generacji 0,5 (3 grupy karboksylanowe) do generacji 6,5 (192 karboksylany).
181 064
Przykład O: N-tert-butoksykarbonylo-4-aminobenzylomalonian dimetylu 4-aminobezy lomalonian dimetylu (11,62 g, 49 mmoli) rozpuszczono z mieszaniem w 100 ml mieszaniny tert-butanol/woda (60:40 objętościowo). Dodano di-tert-butoksydiwęglan (19,79 g, 90 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Butanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółtą zawiesinę produktu w wodzie. Po ekstrakcji chlorkiem metylenu, wysuszeniu (MgSO4) i odparowano uzyskano żółty olej (21,05 g, zanieczyszczony di-tert-butoksydiwęglanem). Po rekrystalizacji z mieszaniny 2-propanol/woda (75:25) otrzymano blado żółte kryształy (11,1 g, 33 mmole, 67 wydajności) tytułowego produktu. Budowę potwierdziła spektroskopia 13C NMR, a czystość określono metodą HPLC (Spherisorb™ ODS-1, 0,05 M H3PO4, pH 3:CH3CN 55:45). Materiał ten zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład P:N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekan
N-tert-butoksykarbonylo-4-aminobenzylomalonian dimetylu (8,82 g, 26 mmoli) otrzymany w przykładzie O rozpuszczono w 50 ml metanolu. Roztwór ten wkroplono w ciągu 2 godzin do roztworu świeżo przedestylowanej etylenodiaminy (188 g, 3,13 mola) i 20 ml metanolu, w atmosferze azotu. Roztwór mieszano przez 24 godziny. Roztwór etylenodiamina/metanol usunięto w wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszczono w metanolu i dodano toluen. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej otrzymując surowy produkt w postaci białej substancji stałej (10,70 g, zanieczyszczony etylenodiaminą). Próbkę do oczyszczania podzielono na dwie części. Przy azeotropowym usuwaniu etylenodiaminy z toluenem w ekstraktorze Soxhleta z perełkami sulfonowanego jonitu w gilzie w celu wychwycenia etylenodiaminy nastąpił częściowy rozkład produktu, tak że uzyskano brunatny olej. Resztę produktu wydzielono w postaci białej substancji stałej przy chłodzeniu roztworu w toluenie (2,3 g, około 50%). Analiza 10% roztworu w metanolu metodą GC (kolumna Tenax 60/80) nie wykazała wykrywalnych śladów etylenodiaminy w próbce (<0,1 %). Drugą część rozpuszczono w metanolu uzyskując 10% (wagowo) roztwór, który oczyszczano od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy z zastosowaniem metanolu jako rozpuszczalnika (membrana Filmtec™FT-30 oraz cienki kanałowy separator Amicon™ TC1R; EDA prezchodzi przez membranę). Produkt wydzielono w postaci białej substancji stałej (2,7 g), w której metodą GC nie wykryto śladów etylenodiaminy. Wyniki analizy 13C NMR i HPLC (Spherisorb™ ODS-1, 0,05 M H3PO4, pH 3:CH3CN 55:45) potwierdziły zaproponowaną strukturę. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład Q: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ generacji 0,5 (GO,5) z N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aimnobenzylo)-l,4,8,l l-tetraaza-5,7-dioksoundekan (5,0 g, 13 mmoli) otrzymany w przykładzie P rozpuszczono w 100 ml metanolu. Dodano akrylan metylu (6,12 g, 68 mmoli) i roztwór mieszano w temperturze otoczenia przez 72 godziny. Reakcję śledzono mtodąHPLC (Spherisorb™ ODS1, acetonitryl:0,04M octan amonu 40:60), aby zoptymalizować konwersję do pożądanego produktu. Roztwór zatężono do zawartości części stałych 30% i dodano akrylan metylu (3,0 g, 32 mmole). Mieszaninę reakcyjną mieszano w tempereturze otoczenia, aż metodą HPLC nie można było wykryć częściowo alkilowanych produktów (24 godziny). Po usunięciu rozpuszczalnika w 30°C w wyparce rotacyjnej i suszeniu pod pompąprzy 1 mm Hg przez 24 godzny otrzymano produkt w postaci lekiego żółtego oleju, wydajność 7,81 g. Dane l3C NMR były zgodne z zaproponowaną strukturą. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład R: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ pierwszej pełnej generacji (G1,0) z N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt generacji 0,5 (przykład Q) (7,70 g, 10,45 mmola) rozpuszczono w 75 ml metanolu i wkroplono w ciągu 2 godzin do mieszanego roztworu etylenodiaminy (400 ml, 7,41 mola) w metanolu (50 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 48 godzin. Etylenodiaminę i metanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółty olej (11,8 g, zanieczyszczony etylenodiaminą). Produkt rozpuszczono w 90 ml metanolu i oczyszczono od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy (membrana Filmtec™ FT-30 oraz cienki kanałowy separator
181 064
Amicon™ TC IR, metanol jako rozpuszczalnik). Po 48 godzinach metodą GC (kolumna Tenax™ 60/80) nie można było wykryć etylenodiaminy. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej, a następnie suszenia pod pompą na linii próżniowej przez 24 godziny otrzymano produkt w postaci żółtej, szklistej substancji stałej (6,72 g). Analiza metodą HPLC, kolumna PLRP-S, acetonitryl:0,015 M NaOH, 10-20% gradient w ciągu 20 minut) i 13C NMR potwierdziły zaproponowaną strukturę.
Przykład S. Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ generacji 1 i 1,5 (G1, 5) z N-tert— butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt pierwszej generacji (przykład R) (2,14 g, 25 mmoli) rozpuszczono w 12,5 ml metanolu i dodano akrylan metylu (3,5 g, 39 mmoli) w 5 ml metanolu. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 48 godzin śledząc postęp reakcji metodą HPLC (Spherisorb™ ODS1, acetonitryl: 0,04 M octan amonu 40:60). Dodano drugąporcję akrylanu metylu (3,5 g, 39 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez kolejne 72 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej otrzymano tytułowy produkt w postaci żółtego oleju (3,9 g) po suszeniu przez noc pod pompąpróżniową. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład T: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™pełnej drugiej generacji (G2,0) zN-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-l,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt generacji 1,5 (przykład S) (3,9 g, 2,5 mmola) rozpuszczono w 50 ml metanolu i wkroplono w ciągu 2 godzin do mieszanego roztworu etylenodiaminy (600 g, 10 moli) i metanolu (50 ml). Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia w atmosferze azotu przez 96 godzin. Etylenodiaminę i metanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółtą, szklistą substancję stałą (4,4 g, zanieczyszczona etylenodiaminą). Przygotowano 10% roztwór produktu w metanolu i oczyszczono od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy (membrana Filmtec™ FT-30) oraz cienki kanałowy separator Amicon™ TC 1R, aż metodą GC (kolumna Tenax™ 60/80) nie można było wykryć etylenodiaminy. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano produkt w postaci żółtej, szklistej substancji stałej (3,52 g). 13C NMR i HPLC, kolumna PLRP-S, acetonitryl: 0,015 M NaOH, 10-20% gradient w ciągu 20 minut) potwierdziły zaproponowaną strukturę.
Przykład U: Reakcja polimeru Starburst™ drugiej generacji (G2, 0) z kwasem bromooctowym prowadząca do dendrymeru Starburst™ z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi
Produkt drugiej generacji (przykład T) (0,22 g, 0,13 mmola) rozpuszczono w 15 ml wody dejonizowanej i temperaturę doprowadzono do 40,5°C. Kwas bromooctowy (0,48 g, 3,5 mmola) i wodorotlenek litu (0,13 g, 3,3 mmola) rozpuszczono w 5 ml dejonizowanej wody, po czym roztwór dodano do mieszaniny reakcyjnej. pH mieszaniny utrzymywano dokładnie na poziomie 9,0 stosując pH-stat (miareczkowanie 0,1 N NaOH), w 40,5°C, przez noc. Reakcję śledzono metodą HPLC (Spherisorb™, kolumna ODS-1, eluowanie 0,25 M H3PO4, pH 3 [NaOH] : CH3CN 85:15), która potwierdziła, że w syntezie uzyskuje się przewagę jednego składnika.
Przykład V: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ drugiej generacj i (G2,0) z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi, fimkcjonalizowanego grupami izotiocyjanianowymi ml 2,8 mM roztworu dendrymeru Starburst™ drugiej generacji z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi (przykład U) rozcieńczono 20 ml wody i pH doprowadzono do 0,5 stężonym kwasem solnym. Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej mieszaninę zanalizowano metodą HPLC, aby potwierdzić usunięcie grupy butoksykarbonylowej, po czym dodano 50% wodorotlenek sodowy doprowadzając pH do 7. Zastosowano pH-stat (miareczkowanie 0,lN NaOH), aby utrzymywać pH 7 i dodano 225 μΐ tiofosgenu. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej pH mieszaniny doprowadzono do 5 za pomocą IN HC1. Mieszaninę przemyto chloroformem (2 x 20 ml), po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Odzyskana pozostałość, 0,91 g, stanowi mieszaninę izodiocyjanianu i soli.
Przykład W: Wytwarzaniepolietylenoimino-metanosulfonamidu Starburst™drugiej generacji (G2, 0)
Do roztworu 125 g N-metanosulfonyloazirydyny w 50 ml etanolu dodano 25,0 g trus(2-aminoetylo)aminy. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Do miesza
181 064 niny reakcyjnej dodawano w razie potrzeby wodę, aby utrzymać jednorodny roztwór. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując PEI-metanosulfonamid Starburst™ drugiej generacji w postaci żółtego szkliwa (161 g).
Przykład X: Rozszczepianie metanosulfonamidów prowadzące do polietylenoiminy Starburst™ drugiej generacji (G2, 0)
Roztwór 5,0 g PEI-metanosulfonamidu Starburst™ drugiej generacji z przykładu w 20 ml 38% HC1 zatopiono w szklanej ampułce. Ampułkę ogrzewano w 160°C przez 16 godzin, po czym schłodzono w łaźni z lodem i otwarto. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w wodzie. Po doprowadzeniu pH do > 10 za pomocą 50% HaOH rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano toluen (150 ml) i mieszaninę ogrzewano we wrzeniu z nasadką Deana-Starka aż do usunięcia całej wody. Roztwór przesączono w celu usunięcia soli, po czym przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 1,9 g PEI Starburst™ drugiej generacji w postaci żółtego oleju.
Przykład Y: Wytwarzanie polietylenoimino-metanosulfonamidu Starburst™ trzeciej generacji (G3, 0)
Do roztworu 10,1 g PEI Starburst™ drugiej generacji z przykładu X w 100 ml etanolu dodano 36,6 g N-metanosulfonyloazirydyny. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano w razie potrzeby wodę, aby utrzymać jednorodny roztwór. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując PEI-metanosulfonamid Starburst™ trzeciej generacji w postaci żółtego szkliwa (45,3 g).
Przykład Z: Rozszczepianie metanosulfonamidów prowadzące do polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3, 0)
Grupy metanosulfonamidowe z PEI-metanosulfonamidu Starburst™ trzeciej generacji (5,0 g) z przykładu Y usunięto w taki sam sposób jak w przypadku materiału drugiej generacji w przykładzie X, otrzymując 2,3 g PEI Starburst™ trzeciej generacji w postaci żółtego oleju.
Przykład AA: Reakcja polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3,0) z (4-fluoro)nitrobenzenem
Polietylenoiminę Starburst™ trzeciej generacji (przykład Z) (1,06 g, 1,2 mmola) rozpuszczono w 12 ml absolutnego etanolu. Dodano (4-fluoro)mtrobenzen (120 μΐ, 1,2 mmola) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez noc. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, po czym jasno żółty olej rozpuszczono w wodzie. Wodny roztwór przemyto chloroformem w celu usunięcia nieprzereagowanego (4-fluoro)nitrobenzenu. Po usunięciu wody otrzymano produkt w postaci ciemno żółtego oleju (0,80 g). Widmo 13C NMR odpowiadało strukturze tytułowego związku. (Nie przeprowadzono badań w celu określenia charakteru rozrzutu statystycznego). Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład BB: Reakcjanitrofenylowejpochodnejpolitylenoiminy Starburst™trzeciej generacji (G3, 0) z glikolonitrylem
Nitrofenylową pochodną polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (przykład AA) (0,80 g) rozpuszczono w 20 ml dejonizowanej wody. Do mieszanego roztworu dodano wodorotlenek sodowy (2,80 g, 50% wagowych) i roztwór przedmuchano azotem z odpowietrzeniem przez płuczkę z wodorotlenkiem sodowym. Dodano glikolonitryl (2,85 ml 70% wodnego roztworu) w temperaturze otoczenia. Po kilku minutach zaobserwowano wytrącenie się żółtego osadu. Po 2 godzinach temperaturę powoli podwyższono do wrzenia i mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny z przedmuchiwaniem azotem. Po usunięciu wody otrzymano produkt w postaci żółtej substancji stałej zanieczyszczonej kwasem glikolowym i wodorotlenkiem sodowym. Widmo 13C NMR odpowiadało strukturze tytułowego związku. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład CC: Uwodornienie pochodnej nitrofenylowej do polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3, 0) zakończonej aminofenylo-metylenokarboksylanem
Żółtą substancję stałąz przykładu BB (1,70 g) rozpuszczono w 10 ml dejonizowanej wody uzyskując roztwór o pH około 11. Do mieszaniny reakcyjnej w szklanej kolbie wytrząsarki Parra
181 064 dodano pallad na węglu drzewnym (200 mg 5% Pd/C). Mieszaninę reakcyjną umieszczono pod ciśnieniem wodoru 40 funtów/cal2 (275 kPa) i wytrząsano w temperaturze otoczenia w aparacie Parra do uwodorniania przez 6 godzin. Następnie mieszaninę przesączono przez filtr 0,5 pm Millipore™ w celu usunięcia Pd/C i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość przełączono przez żel stosując 25 g żywicy Biogel P2 spęcznionej wodą. Po zakwaszeniu HC1 otrzymano pomarańczowo-brunatny roztwór, który przedmuchiwano przez noc azotem. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy produkt jako chlorowodorek w postaci blado brunatnej substancji stałej (3,98 g) zanieczyszczonej NaCl i kwasem glikolowym, maksymalna wydajność teoretyczna 1,15 g. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład DD: Wytwarzaniepolietylenoiminy Starburst™trzeciej generacji(G3,0)zakończonej 4-izotiocyjanianofenylo-metylenokarboksylanem
Produkt z przykładu CC (3,98 g) rozpuszczono w 15 ml dejonizowanej wody i porcję tego roztworu (2,5 ml) rozcieńczono 10 ml wody. pH roztworu doprowadzono do 7 wodorotlenkiem sodowym. pH-stat (miareczkowanie IN NaOH) zastosowano do utrzymywania pH i dodano 200 pl tiofosgenu. Po 10 minutach pH mieszaniny doprowadzono do 4 kwasem solnym. Wodę usunięto w wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem (dodając niewielką ilość n-butanolu, aby zapobiec pienieniu). Pozostałość przemyto chlorkiem metylenu i wysuszono. Surowy tytułowy produkt (0,95 g) w postaci mieszaniny izotiocyjanianu (0,14 g) i soli zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład EE: Wytwarzanie poliamidoaminy Starburst™ drugiej generacji (G2,0) (inicjowanej amoniakiem) zakończonej metylenokarboksylanem
Poliamidoaminę Starburst™ drugiej generacji (2,71 g, 2,6 mola) i kwas bromooctowy (4,39 g, 31,6 mmola) rozpuszczono w 30 ml dejonizowanej wody i pH doprowadzono do 9,7 stosując 5N NaOH, z wykorzystaniem pH-statu. Mieszaninę utrzymywano przy tym pH przez 0,5 godziny, po czym temperaturę powoli podwyższono do 60°C i mieszaninę utrzymywano w 60°C przy stałym pH przez 3 godziny. pH podwyższono do 10,3 i mieszaninę reakcyjną utrzymywano pod kontroląpH-statu w temperaturze otoczenia przez noc. Następnie przed obróbką mieszaninę ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika i azeotropowym oddestylowaniu śladów wody z metanolem uzyskano tytułowy produkt w postaci blado żółtego proszku (8,7 g, zanieczyszczenie bromkiem sodowym). Widmo l3C NMR odpowiadało budowie tytułowego produktu (z pewnym zanieczyszczeniem spowodowanym niewielką ilością materiału zdefektowanego w wyniku nieznacznego monoalkilowania).
Przykład FF: WytwarzaniepolietylenoiminyStarburst™drugiejgeneracji(G2,0)(inicjowane amoniakiem) zakończonej metylenokarboksylanem
Polietylenoiminę Starburst™ drugiej generacji (2,73 g, 6,7 mmola) z przykładu X i kwas bromooctowy (11,29 g, 81 mmoli) rozpuszczono w 30 ml dejonizowanej wody. pH powoli podwyższono do 9,5 utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Temperaturę powoli podwyższono do 55°C i pH 9,5 mieszaniny utrzymywano przez 6 godzin zapomocąpH-statu (miareczkowanie 5N NaOH). pH podwyższono do 10,2 i utrzymywano je przez noc. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej i azeotropowym oddestylowaniu śladów wody z metanolem uzyskano tytułowy produkt w postaci blado żółtego proszku (17,9 g, zanieczyszczenie bromkiem sodowym). Widmo l3C NMR było odpowiadało budowie tytułowego produktu (z pewnym zanieczyszczeniem spowodowanym niewielką ilością materiału zdefektowanego w wyniku nieznacznego monoalkilowania).
Przykład GG: Wytwarzanie 3,5, 4,5, 5,5 i 6,5 generacji PAMAM Starburst™
Do 10% wagowo metanolowego roztworu 2,46 g trzeciej generacji PAMAM Starburst™ dodano 2,32 g akrylanu metylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 64 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika i nadmiaru akrylanu metylu uzyskano 4,82 g tytułowego produktu (G3, 5) (105% wydajności teoretycznej).
Generacje 4,5,5,5 i 6,5 otrzymano w sposób opisany powyżej bez znaczących różnic w stężeniach reagentów, stosunkach molowych reagentów i czasach reakcji.
181 064
Przykład HH: Wytwarzanie 4, 5 i 6 generacji PAMAM Starburst™
Do 2000 g wstępnie przedestylowanej etylenodiaminy dodano 5,4 g PAMAM Starburst™ generacji 4,5 w postaci 15% wagowo roztworu w metanolu. Mieszaninę podstawiono w temperaturze pokojowej na 48 godzin. Metanol i większość nadmiaru etylenodiaminy usunięto w wyparce rotacyjnej stosując pompkę wodną w temperaturze poniżej 60°C. Całkowita waga odzyskanego produktu wyniosła 8,07 g. W tym stadium GC wykazała, że produkt zawiera w dalszym ciągu 34% etylenodiaminy. Porcję 55,94 g produktu rozpuszczono w 100 ml metanolu i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia resztek etylenodiaminy. Ultrafiltrację prowadzono stosując cienki kanałowy separator cyrkulacyjny Amicon™ TC IR wyposażony w membranę Amicon™ YM2. W linii zastosowano zawór bezpieczeństwa, aby utrzymać na membranie nadciśnienie 55 funtów/cal2 (380 kPa). 100 ml najpierw zatężono do 15 ml wymuszając przepływ płynu tylko przez membranę. Po wstępnym zatężeniu przepływ zmieniono i zastosowano układ z zawracaniem stałej objętości retentatu przez 19 godzin. Następnie 60 ml metanolu przepuszczono przez membranę, aby odzyskać produkt w dalszym ciągu znajdujący się w module i połączonym z nim orurowaniu. Z produktu odprowadzono rozpuszczalnik odzyskując 2,53 g PAMAM Starburst™ piątej generacji (G5,0). Analiza metodąGC wykazała, że produkt zawiera 0,3% resztkowej etylenodiaminy.
Generacje 4 i 6 wytwarza się w sposób opisany powyżej, z tym że zmienia się stosunek Wagowy etylenodiaminy do materiału wyj ściowego. Przy wytwarzaniu generacji 4 stosunek ten wynosił 200:1, a w przypadku generacji 6 730:1.
Przykład II. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych poprzez reakcję z epoksydem
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 5 ml metanolu dodano 0,56 g epoksyoktanu. Po 6 dniach w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 0,80 g bezbarwnego oleju. Materiał ten rozpuszczała się w chloroformie, toluenie i metanolu, ale nie rozpuszczał się w wodzie. Widmo 13C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami C-8 alkilowymi przyłączonymi do końcowych amin.
Przykład JJ. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych przez reakcję z eterem tert-butyloglicydylowym
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 5 ml metanolu dodano 0,57 g eteru tert-butyloglicydylowego. Po 6 dniach w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 1,0 g bezbarwnego oleju. Materiał ten rozupszczał się w chloroformie, toluenie i metanolu, ale nie rozpuszczał się w wodzie. Widmo 13C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami 3-(tert-butoksy)-l-propan-2-olowymi przyłączonymi do końcowych amin.
Przykład KK. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych przez reakcję z epoksyoktadekanem
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 25 ml metanolu dodano 1,1 g epoksyoktadekanu. Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 5 dni. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 1,6 g białej pianki. Materiał ten rozpuszczał się w chloroformie i toluenie, ale me rozpuszczał się w wodzie i metanolu. Widmo ,3C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami C-18 alkilowymi przyłączonymi do jego końcowych amin.
Przykład LL. Reakcja PEI Starburst™ z hydrofobowym epoksydem
Do kolby wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodano 0,397 g (2 x 10^4 mola) (G4, 0) PEI (rdzeń NH3,MW 1 955) i 2,1 g (9,6 x 10’3 mola) 10,11-oksoundekanianu metylu (MW 214,3) w 5 ml metanolu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 dzień, po czym ogrzewano ją w 80°C przez 8 godziny otrzymując brunatny lepki syrop. Zajście do końca reakcji otwarcia pierścienia prowadzącej do hydrofobowego dendrymeru zakończonego grupami karbometoksylowymi potwierdziła analiza NMR i porównanie z układami modelowymi.
Powyższy hydrofobowy dendrymer przekształcono w rozpuszczalny w wodzie w wyniku prostego połączenia równoważnych ilości tego produktu i wodorotlenku sodowego w wodzie i ogrzewania przez 30-60 minut. Uzyskano jednorodny roztwór nie zawierający śladów grup
181 064 karbometoksylowych. Dodatek nadmiaru NaOH lub NaCl powoduje, że roztwór soli, karboksylanu staje się mętny i następuje rozdział faz z wydzieleniem oleju.
Przykład MM. Modyfikacja dendrymerów PAMAM kwasem akrylowym
2:1 akrylan:amina (Reakcja A)
3,84 g kwasu akrylowego wymieszano z 3,84 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
1:1 akrylan:amina (Reakcja B)
1,6 g kwasu akrylowego wymieszano z 1,6 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akiylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokoj owej. 0,5:1 akrylan:amina (Reakcja C)
0,8 g kwasu akrylowego wymieszano z 0,8 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej. 0,25:1 akrylamamina (Reakcja D)
0,40 g kwasu akrylowego wymieszano z 0,40 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
Ultrafiltracja i suszenie
Rozpuszczalnik z mieszanin reakcyjnych odpędzono w wyparce rotacyjnej i uzyskaną substancję stałąponownie rozpuszczono w około 150 ml wody. 150 ml roztworu poddano ultrafiltracji z wodąprzez płaską membranę YMC (odcinany MW 3000) aż do zebrania 4 litrów permeatu. Z retentatu odpędzono wodę w wyparce rotacyjnej aż do uzyskania pozostałości w postaci substancji stałej lub lepkiej cieczy. Półsuchą substancję stałą umieszczono na noc pod wysoką próżnią w celu usunięcia resztek wody.
Wniosek
W reakcjach dendrymeru G6 (NH3) PAMAM z rdzeniem amoniakalnym z kwasem akrylowym w różnych stosunkach otrzymano oczekiwane produkty. Produkty wykazują rozkład ładunków odpowiadający ilości dodanego kwasu akiylowego. Przy dodaniu nadmiaru kwasu akrylowego uzyskuje się produkt zbliżony do otrzymywanego w zwykłej syntezie karboksylanowych soli PAMAM połówkowej generacji. W miarę jak ilość dodawanego kwasu akiylowego zmniejsza się, analizowany materiał odpowiada dodatnio naładowanemu dendrymerowi z pewną ilością ujemnie naładowanych grup powierzchniowych lub z amfoteiyczną powierzchnią.
Przykład NN. Koniugaty dendrymerów typu gęstej gwiazdy z prowadnikami docelowymi takimi jak biotyna, insulina i awidyna, zawierające ponadto przenoszony materiał (fluoresceinę)
Materiały
Otrzymano dendrymer G4 (NH3) PAMAM Starburst™ i dendrymer Starburst™ generacji 6,0. 5-izotiocyjanian fluoresceiny (izomer I) (FITC) otrzymano z Molecular Probes. Chlorek dansylu otrzymano z Aldrich Chemical Co. NHS-LC-biotynę i awidynę otrzymano z Pierce. Dichlorotriazynylofluoresceinę (I) i insulinę otrzymano z Sigma Chemical. Wszystkie reagenty stosowano bez dokładniejszego oczyszczania.
I. Sprzęganie koniugacji biotyna/dendrymer
A. Wytwarzanie koniugatów biotyna/dendrymer
Przygotowano bazowy roztwór dendrymeru G6 (NH3) PAMAM o stężeniu 1,8 mg/ml w 100 mM buforze fosforanowym o pH 7,0. Przygotowano również inny bazowy roztwór G6 (NH3) o stężeniu 1,9 mg/ml w wodzie. Z każdego z tych roztworów pobrano próbkę 1 ml i do każ
181 064 dego z roztworów dodano 5 mg stałej NHS-LC-biotyny. Fiolki intensywnie wytrząsano przez 5 minut w celu rozpuszczenia biotyny. Inkubowanie w temperaturze pokojowej prowadzono przez 18 godzin. Podobne reakcje przeprowadzono dla roztworów G4 (NH3) zarówno w buforze fosforanowym jak i w wodzie. Stężenie bazowych roztworów G4 (NH3) wynosiło 2,0 mg/ml; do 1 ml każdego z roztworów dodano po 5 mg NHS-LC-biotyny.
Wykonano inne koniugaty przy niższym stosunku ligandu do aminy. Tak np. w celu skoniugowania 20 cząsteczek biotyny z dendrymerem G7 (NH3) PAMAM porcję 844 μΐ 11,85% dendrymeru G7 dodano do 0,0244 g NHS-LC-biotyny w 5 ml buforu boranowego o pH 9. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną poddano dializie względem dejonizowanej wody w celu usunięcia nieprzereagowanej biotyny.
Elektroforeza
Po 18 godzinach pobrano po 100 μΐ każdej z mieszanin reakcyjnych, a także każdego z bazowych roztworów dendrymerów pełnych generacji do wykonania analizy metodą elektroforezy. Do każdego roztworu dodano 0,1% MB+ z 50% sacharozą i próbki poddawano elektroforezie na 5-50% żelu gradientowym Hylinx™ T (otrzymanym z Gradipore). Jako bufor zastosowano 90 mM Tris, 80 mM kwas borowy i 2,5 mM EDTA, pH 8,3. Na żel wprowadzano po 10 μΐ każdej próbki. Elektroforezę wykonywano przez 30 minut przy 200 V (prąd stały).
Oznaczenie pasów podano poniżej:
1. G7 (NH3)
2. G6 i P„ (NH3)
3. G6 (NH3) z biotyną w P(
4. G4 w P„ (NH3)
5. G4 z biotyną w P„ (NH3)
6. G6 w wodzie, (NH3)
7. G6 (NH3) z biotyną w wodzie
8. G4 w wodzie, (NH3)
9. G4 (NH3) z biotyną w wodzie
10. G4 (NH3)
11. Cyt c/G3,5 (NH3)
12. G5 (NH3)
Wyniki i dyskusja
Elektroforeza wyraźnie wykazała zahamowaną ruchliwość dendrymerów poddanych obróbce biotyną w porównaniu z drogą migracji niemodyfikowanych dendrymerów. Ciężar cząsteczkowy zwiększył się na skutek kowalencyjnego przyłączenia cząsteczek biotyny do powierzchni dendrymeru. Powoduje to skrócenie drogi migracji dendrymer na skutek przesiewającego działania GGE, który hamuje cząsteczki o wyższym ciężarze cząsteczkowym.
Liczba przyłączonych cząsteczek biotyny przypadających na dendrymer nie jest obecnie znana. Rozrzut cząsteczek biotyny na dendrymerze jest statystyczny, tak że z testu wynika, że próbki nie są jednorodne.
Pewne reakcje przeprowadzono tak, aby teoretycznie wszystkie powierzchniowe grupy dendrymeru (Z na fig. 1; Z' na fig. 2) mogły ulec biotynylowaniu. W czasie takich reakcji nie zaobserwowano powstawania nierozpuszczalnego materiału.
B. Wytwarzanie koniugatów dendrymer-fluoresceina (FITC) ml 12,7% (wagowo) metanolowego roztworu dendrymeru PAMAM G4 rdzeń (NH3) wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Wydzielono około 40 mg (7,4 pmola) wysuszonego dendrymeru, który rozpuszczono w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0.
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC I) (14,5 mg, 37 pmoli) rozpuszczono w 2 ml DMSO w ciemności. Roztwór FITC I wkroplono do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1-2 minut.
181 064
Mieszaninę reakcyjną chroniono przed dostępem światła i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15-20 godzin. Uzyskano roztwór o barwie kasztanowej.
Po wymieszaniu mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanego FITCI. W czasie ultrafiltracji trzykrotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0. Koniugat dendiymeru czwartej generacji (rdzeń amoniakalny) z FITC I wydzielono z retentatu po ultrafiltracji.
C. Wytwarzanie biotynylowanych koniugatów dendrymer-FITC I
Z bazowego roztworu zawierającego 20 mg/ml koniugatu G4 (NH3) PAMAM Starburst™ z FITC I (otrzymanego w poprzedniej części) pobrano 1 ml i dodano do 3 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0.
Do 0,5 ml DMSO dodano 10,0 mg (18 mmoli) NHS-LC-biotyny i mieszaninę wytrząsano w celu rozpuszczenia biotyny.
Roztwór NHS-LC-biotyny dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę usunięto z płytki do mieszania, przeniesiono do dwóch rurek mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia niezwiązanej biotyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,1 M bufom fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie.
D. Wytwarzanie kompleksu biotynylowanego koniugatu dendrymer-FITC I z awidyną 3,0 mg (45 mmoli) awidyny rozpuszczono w 1 ml 10 mM bufom fosforanowego o pH 7,1. 300 μΐ (10 mg/ml, 450 pmoli) biotynylowanego koniugatu dendrymer-FITC I (otrzymanego uprzednio) dodano do roztworu awidyny i całość łagodnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch mrkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nadmiaru biotynylowanego dendrymeru. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 10 mM bufom fosforanowego o pH 7,1, aby ułatwić oczyszczanie. Uzyskany kompleks biotyna-dendrymer/awidyna usunięto z mrek mikrokoncentratora i przechowywano w -1Ó°C.
E. Wytwarzanie koniugatu dendrymer/dichlorotriazynylofluoresceina (I)
Około 330 pl dendiymeru G6 (DEA) PAMAM Starburst™ (21,5% części stałych) dodano do 700 pl dejonizowanej wody i zdyspergowano (645 mg, 2,24 pmola). Dodano jeszcze 4 ml dejonizowanej wody, aby rozcieńczyć dendrymer do stężenia 12,9 mg/ml.
Chlorowodorek dichlorotriazynylofluoresceiny (izomer I) [DTAF (I)] (6,0 mg, 11,3 pmola) rozpuszczono w ciemności w 0,5 ml metanolu i dodano dwie krople trietyloaminy. Roztwór DTAF (I) wkroplono do mieszanego roztworu dendiymeru w ciągu 30 s. Mieszaninę reakcyjną chroniono przed dostępem światła i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15-20 godzin. Przez cały czas reakcji roztwór o barwie pomarańczowej był klarowny.
Po wymieszaniu mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch mrkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanej DTAF (I). W czasie ultrafiltracji 15-krotnie dodawano po 2 ml 0,1 M bufom fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie. Z oczyszczania odzyskano około 3 ml koniugatu G6 (rdzeń EDA) dendrymem-DTAF (I).
F. Wytwarzanie multibiotynylowanych koniugatów dendrymer-DTAF (I)
Z bazowego roztworu zawierającego 20 mg/ml koniugatu G6 (EDA) PAMAM Starburst™ z DTAF (I) otrzymanego w poprzedniej części) pobrano 0,425 ml (8,5 mg, 0,0003 mmola) i dodano do 0,575 ml 0,1 M bufom fosforanowego o pH 9,0.
181 064
8,1 mg (0,029 mmola) NHS-LC-biotyny dodano do 0,3 ml DMSO i mieszaninę wytrząsano w celu rozpuszczenia biotyny.
Roztwór NHS-LC-biotyny dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
Po 4 godzinach usunięto z płytki do mieszania, przeniesiono do dwóch rurek mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 10 000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia niezwiązanej biotyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie.
II. Sprzęganie koniugacyjne insuliny z dendrymerem
A. Wytwarzanie koniugatu dansylowanego dendrymeru ml 12,7% (wagowo) metanolowego roztworu dendrymeru PAMAM G4 (NH3) wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Wydzielono około 40 mg (7,4 pmola) wysuszonego dendrymeru, który rozpuszczono w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0.
mg (0,03 7 mmola) chlorku dansylu dodano do 5 ml acetonu i wytrząsano przez 5-10 minut. (Uzyskano roztwór o barwie ciemno żółtej ze śladami osadu).
Roztwór chlorku dansylu dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s, po czym kolbę reakcyjną umieszczono w łaźni wodnej w 40°C na 90 minut. W czasie ogrzewania mieszaninę wytrząsano od czasu do czasu. (Stwierdzono, że barwa roztworu zmieniła się z wyraźnie żółtej w blado żółtą).
Po 90 minutach kolbę reakcyjną wyjęto z łaźni i pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej (Mieszanina reakcyjna była nieznacznie mętna). Znakowany dendrymer oczyszczano utrzymując go w roztworze. Mieszaninę umieszczono w wyparce rotacyjnej i aceton odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w 30-35°C. Spowodowało to zasadniczo wyklarowanie roztworu. Mieszaninę reakcyjnąprzeniesiono następnie do dwóch probówek wirówki i wirowano z szybkością 5000 obrotów/minutę przez 30 minut. Po wirowaniu nie zaobserwowano dodatkowego osadu.
Roztwór dansylowanego dendrymeru czwartej generacji umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia niezwiązanego chlorku dansylu. Przebieg ultrafiltracji śledzono również metodą chromatografii cienkowarstwowej sprawdzając czystość, aby zapewnić całkowite usunięcie jakiegokolwiek meprzereagowanego chlorku dansylu. Przesącz zachowywano i badano metodą TLC w sposób następujący: stosowano płytki z żelu krzemionkowego 60 (Merck) oraz 100% octan etylu jako układ rozpuszczalników (obrazowanie promieniami UV). Podczas gdy znakowany dendrymer pozostawał na starcie, resztkowy chlorek dansylu eluował się z Rf około 0,3. Odzyskano około 1-2 ml przewidywanego roztworu dansylowanego dendrymeru.
B. Wytwarzanie koniugatu insuliny z dansylowanym dendrymerem
Do 1,5 ml dejonizowanej wody w fiolce dodano 0,5 ml dansylowanego dendrymeru (otrzymanego uprzednio) dodano do uzyskania roztworu 10 mg/ml. Pobrano porcję 1 ml (10,0 mg, 0,0019 mmola) i zastosowano do sprzęgania insuliny.
W drugiej fiolce 12,3 mg (0,0020 mmola) insuliny (z trzustki bydlęcej) rozpuszczono w 2 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór był mętny, w związku z czym jego pH obniżono do 4 dodając 1 kroplę IN kwasu solnego w celu rozpuszczenia osadu.
W trzeciej fiolce 88,7 mg (0,46 mmola) EDAC rozpuszczono w 1 ml dejonizowanej wody.
Roztwór insuliny dodano do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1-2 minut, co spowodowało natychmiastowe zmętnienie. pH doprowadzono z 7,0 do 4,0 IN kwasem solnym (Roztwór wyklarował się przy pH około 4,2). Kontynuując mieszanie dodano roztwór EDAC porcjami po 200-300 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 3,9-4,2 dodając IN kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc (15-20 godzin).
181 064
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji dejonizowanąwodą(co powodowało wytrącanie się osadu, który następnie zawieszano dodając 1 kroplę IN kwasu solnego. Proces ten powtarzano 2-3 razy i koniugat dansylowanego dendrymeru z insuliną ponownie rozpuszczano. Z procesu ultrafiltracji otrzymano około 1 ml koniugatu dansylowanego dendrymeru z insuliną.
C. Wytwarzanie insuliny/dichlorotriazynylofluoresceiny
9,3 mg (0,002 mmola) insuliny (z trzustki bydlęcej) rozpuszczono w 2 ml 0,1 M roztworu buforu fosforanowego o pH 9,0 w fiolce. Chlorowodorek dichlorotriazynylofluoresceiny (izomer 1) [DTAF (I)] (4,1 mg, 0,008 mmola) rozpuszczono w ciemności w 0,5 ml metanolu, po czym dodano 2 krople trietyloammy.
Roztwór DTAF (I) wkroplono w ciągu 2 minut do mieszanego roztworu insuliny. Mieszaninę reakcyjną chroniono przed światłem i mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym umieszczono na noc w 2-8°C. (W czasie reakcji pomarańczowy roztwór pozostawał klarowny).
Następnego ranka mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncem tratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanej DTAF (I). W czasie ultrafiltracji 10-krotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie Z oczyszczania wydzielono około 2 ml insuhny-DTAF (I).
D. Wytwarzanie koniugatu msulina-DTAF (I)/dendrymer
Do fiolki dodano 1 ml (7,05 mg, 0,0014 mmola) dendrymeru G4 (NH3) i pH doprowadzono do4,5 stosując INkwas solny. Do mieszanego dendrymeru dodano 1 ml(10,l mg, 0,0020mmola) insuliny-DTAF (I) (otrzymanej uprzednio) i pH ponownie doprowadzono do 4,0 stosując IN kwas solny.
W drugiej fiolce 54,3 mg (0,28 mmola) EDAC rozpuszczono w 0,5 ml dejonizowanej wody.
Roztwór EDAC dodano do mieszaniny reakcyjnej w porcjach po 100 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 3,9-4,2 dodając IN kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym umieszczono na noc w 2-8°C.
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 5000 daltonów) i poddano ultrafiltracji dejonizowaną wodą utrzymując pH w zakresie 4-5 za pomocą IN kwasu solnego.
Proces ten powtórzono 2-3 razy; koniugat insulina-DTAF (I)/dendrymer wydzielono w postaci klarownej pomarańczowej cieczy.
III Sprzęganie koniugacyjne dendrymeru z awidyną
A. Wytwarzanie koniugatów dendrymer/awidyna
W fiolce 120 μΐ dendrymeru G7 (EDA) (21,9% części stałych) dodano do 0,8 ml dejonizowanej wody. Pobrano 0,5 ml rozcieńczonego dendrymeru i dodano do 4,5 ml dejonizowane wody uzyskując roztwór o stężeniu 2,6 mg/ml.
W drugiej fiolce 3,0 mg (0,045 mmola) EDAC rozpuszczono w0,5 ml wody dejonizowanej.
Roztwór awidyny dodano do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1-2 minut; mieszanina pozostała klarowna. pH doprowadzono następnie do 4,0 stosując IN kwas solny. Kontynuując mieszanie dodano roztwór EDAC porcjami po 100 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 4,5-5,5 stosując IN kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc (10-15 godzin).
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 100 000 daltonów) i poddano ultrafiltracji 10 mM buforem fosforanowym w celu usunięcia niezwiązanego dendrymeru lub awidyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,1, aby ułatwić oczyszczanie.
181 064
Przykład 00. Ukierunkowywanie dendrymerów typu gęstej gwiazdy solą sodową kwasu pirogronowego
0,5 g EDC wymieszano z 0,0065 g soli sodowej kwasu pirogronowego w 2 ml wody. pH roztworu doprowadzono do 5,0 (na podstawie papierka wskaźnikowego) i roztwór mieszano przez 5 minut Następnie dodano 62 μΐ (20 mg) dendrymeru G6 (NH3) (32,45% części stałych) do mieszaniny reakcyjnej i roztwór wytrząsano przez 21 godzin. Oczyszczanie w celu uwolnienia roztworu od nadmiaru EDC przeprowadzono w koncentratorze Amicon™ Microcon-10. Wskaźnik rozcieńczania wynosił 57 x 106. Zaobserwowano niewielki rezonans w widmie 13C NMR odpowiadający grupie metylowej pirogronianu skoniugowanego z dendrymerem G6, dla koniugatu zaobserwowano także unikatowy pik w elektroforezie kapilarnej.
Przy wytwarzaniu koniugatów według wynalazku wykorzystuje się materiały wyjściowe opisane powyżej, materiały wyjściowe wytwarzane w analogiczny sposób, materiały wyjściowe opisane lub materiały wyjściowe dostępne.
Przykłady kompleksowania DNA/dendrymer: DNA RSV-luc i dendrymer G10 (EDA)
DNA plazmidu RSV-luc o 7,2 kb zawiera 1,71 χ 1015 (-) ładunków powierzchniowych/pg. Dendrymer G10 (EDA) zawiera 2,64 x 10'5 (+) ładunków/pg. W związku z tym przy stosunku ładunków 1:10 należy dodać 1 pg DNA do 6,5 pg dendrymeru. Stężenie bazowego roztworu G10 (EDA) wynosiło 236,4 pg/ml. Po rozcieńczeniu buforem rozcieńczania w stosunku 1:364 uzyskano stężenie 0,65 pg/ml. Aby otrzymać 20 pl kompleksów (ilość wystarczająca do transfekcji 1 pg DNA w każdej studzience z komórkami na płytce z 6 studzienkami) połączono 2 pl buforu wiązania 10X, 7 pl wyjałowionej wody, 10 pl rozcieńczonego dendrymeru i 1 pl DNA (o stężeniu 1 pg/pl). Jeśli przewiduje się transfekcję w więcej niż jednej studzience, albo zamierza się zastosować większe ilości DNA, należy po prostu przygotować większą objętość kompleksu przy takich samych proporcjach buforu wiązania, dendrymeru i DNA.
Etap 3: Przemyć komórki 2X 2 ml ośrodka pozbawionego surowicy
Etap 4: Dodać po 1 ml roztworu 1 do każdej studzienki
Etap 5: Dodać 20 pl kompleksów DNA/dendrymer do każdej studzienki. Wymieszać przez łagodne potrząsanie płytki.
Etap 6: Inkubować przez 3 godziny w 37°C
Etap 7: Przemyć IX 2 ml DMEM pozbawionego surowicy
Etap 8: Poddać komórki szokowi dodając 2 ml roztworu 2 do każdej studzienki, na 2 minuty
Etap 9: Przemyć 2X 2 ml DMEM pozbawionego surowicy
Etap 10: Zastąpić ośrodek przez DMEM z 5% surowicy. Inkubować przez noc w 37°C.
Dzień 3: Przygotować następujące roztwory:
Roztwór 4. Odczynnik do lizy hodowli komórek IX mM TRIS-fosforan, pH 7,8 ml DTT mM kwas l,2-diaminocykloheksano-N,N,N',N'-tetraoctowy
10% gliceryny
1% Triton Χ-100
Roztwór 5 Odczynnik do testu lucyferazowego mM TRIS glicyna
1,07 mM (MgCO3)Mg(OH)2-5H2O
2,67 mM MgSO4
0,1 mMEDTA
33,3 mM DTT
270 pM koenzym A pM Luciferin™
530 pM ATP; nastawić na ostateczne pH 7,8
181 064
Etap 1: Przemyć komórki 2 x 2 ml lx PBS o pH 7,4 (bez Mg++ i Za^+)
Etap 2: Dodać 200 μΐ roztworu 4 do każdej studzienki i odstawić na 15 minut w 27°C.
Etap 3: Zdrapać komórki i zebrać je w probówkach Eppendorfa™
Etap 4: Oznaczyć stężenie białka w każdym lizacie komórkowym
Etap 5: Zebrać nie więcej niż 20 μΐ każdego z lizatów komórkowych w probówkach Eppendorfa™
Etap 6: Dodać 80 μΐ roztworu 5 i natychmiast zmierzyć chemiluminescencję
W przykładach zastosowano wiele różnych rodzajów materiału genetycznego. O ile nie zaznaczono tego inaczej, stosowanym DNA był bakteryjny plazmid ekspresji (RSV-luc), który zawiera gen enzymu lucyferazy wytwarzany w wyniku ekspresji przez promotor z wirusa oskrzelowego (RSV). Stężenie materiału genetycznego względem dendrymeru określano na podstawie wymaganego stosunku ładunków DNA: dendrymer lub stosunku molowego, jak to podano w konkretnym przykładzie. W przykładach transfekcji dodawano kompleks DNA: dendrymer w ilości wystarczającej do wprowadzenia 1 pg DNA do każdej ze studzienek (około 200 000 komórek), o ile nie podano inaczej.
W większości przykładów stosowano dendrymery PAMAM typu gęstej gwiazdy. Zmieniano generację, a więc i średnicę dendrymeru, a także rdzenie; w pewnych przypadkach zmieniano także funkcyjność powierzchni.
Przeprowadzono z powodzeniem transfekcję wielu linii komórek. O ile w przykładach nie zaznaczono inaczej, transfekowano komórki RAT2.
Gdy w przykładach stosowano DEAE-dekstran, jego stężenie było 0,5 μΜ, o ile nie zaznaczono tego inaczej. O ile nie zaznaczono inaczej, ilość DNA w kompleksie DNA:dendrymer wynosiła 1,0 pg/studzienkę.
Elektroforeza
Żele agarozowe stosowane w elektroforezie umieszczano w polu elektrycznym z katodą na górze żelu (jak to pokazano na rysunkach) oraz anodą na dole żelu 0ak to pokazano na rysunkach). Żele barwiono bromkiem etydiowym, który wiąże DNA i powoduje fluorescencję wskazując w ten sposób zakres migracji DNA w żelu. W pewnych przykładach pasy zaczynały się zarówno w szczycie płytki z żelem jak i w jej środku, przy czym w każdym przypadku migracja była skierowana do dołu. Zakłada się, że kompleksowanie i zobojętnianie ładunku DNA występuje wtedy, gdy migracja w kierunku anody ulega spowolnieniu.
W zakresie nie opisanym powyżej w przykładach Wykorzystane techniki doświadczalne znane specjalistom i dostępne z literatury, tak że dokładny ich opis nie był konieczny.
Przykład 1. Wytwarzanie koniugatów dendrymeru z materiałem genetycznym i doświadczenia (fig. 17-19)
W tej serii doświadczeń różne polimery dendrytowe skompleksowano z DNA i użyto w transfekcji w różnych warunkach. W kompleksowaniu z dendrymeremjako DNA zastosowano plazmid RSV-luc oczyszczany w podwójnej kolumnie z gradientem cezowym. W wyniku transfekcji plazmidu ekspresji DNA następuje transkrypcja i translacja genu lucyferazy. Uzyskuje się białko lucyferazę, enzym który katalizuje rozpad Luciferin™, a w efekcie następuje mierzalna emisja światła. Ilość emitowanego światła jest miarą stopnia powodzenia transfekcji tym genem.
Zbadano następujące dendrymery:
A. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G8 (NH3) o ciężarze cząsteczkowym (MW) około 87 342 i średnicy około 76 A.
B. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G6 (NH3) o MW około 21 591 i średnicy około 53 A.
181 064
C. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G5 (NH3) o MW około 10 663 i średnicy około 40 A.
D. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G7 (NH3) o MW około 43 508 i średnicy około 67 A.
E. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G3 (NH3) o MW około 2 414 i średnicy około 22 A.
F. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G4 (NH4) o MW około 5 154 i średnicy około 31 A.
G. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G2 (NH3) o MW około 1044 i średnicy około 15,8 A.
H. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G1 (NH3) o MW około 359 i średnicy około 10,4 A.
I. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G1 (EDA) o MW około 517 i średnicy około 14 A.
J. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G2 (EDA) o MW około 1 430 i średnicy około 19 A.
K. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G3 (EDA) o MW około 3 256 i średnicy około 26 A.
L. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G4 (EDA) o MW około 6 909 i średnicy około 36 A.
M. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G5 (EDA) o MW około 14 215 i średnicy około 44 A.
N. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G6 (EDA) o MW około 28 826 i średnicy około 57 A.
O. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G7 (EDA) o MW około 58 048 i średnicy około 72 A.
P. Mieszanka dendrymerów typu gęstej gwiazdy o następującym składzie procentowym: 1.G6 (NH3) 58,8%
2. G5 (NH3) 30,5%
3. G2 (EDA) 1,86%
4. G2 (NH3) 1,10%
5. G1 (EDA) 3,37%
6. G1 (NH3) 4,41%
Q. Mieszanka dendrymerów typu gęstej gwiazdy o następującym składzie procentowym:
1, G6 (NH3) 60,0%
2. G5(NH3)31,1%
3. G2 (EDA) 1,90%
4. G2 (NH3) 1,12%
5. G1 (EDA) 1,30%
6. G1 (NH3) 4,50%
R. Częściowo zdegradowany dendrymer G6 (NH3) typu gęstej gwiazdy.
S. Częściowo zdegradowany dendrymer G7 (NH3) typu gęstej gwiazdy.
Podstawowe dane dotyczące tych dendrymerów zamieszczono powyżej w tabeli XII.
T a b e I a XII
Dendrymer MW Powierzchniowe grupy NH2 Minimalna ilość dendrymeru8
0,5 pgc DNA 1 pgc DNA
1 2 3 4 5
A 87 342 384 OJ Pg NO
B 21 591 96 0,1 pg NO
C 10 663 48 0,1 pg NO
D 43 508 192 0,1 pg NO
E 2414 12 * 0,5 pg
F 5 154 24 * 0,1 pg
G 1 044 6 * ♦
H 359 3 * ♦
I 517 4 * ♦
181 064 cd. tabeli XII
1 2 3 4 5
J 1 430 8 0.5 pg NO
K 3 256 16 0,1 Mg NO
L 6 909 32 0,1 Mg NO
M 14215 64 0,1 Mg NO
N 28 826 128 0,1 Mg NO
0 58 048 256 0,1 Mg NO
P 25 951 96 * 0,1 Mg
Q 25 951 96 * 0,1 Mg
R b b 0,001 Mg NO
S b b 0,001 Mg NO
* nie zaobserwowano wiązania a = minimalna ilość dendrymeru niezbędna do całkowitego skompleksowama DNA (całkowite zahamowanie jakiejkolwiek migracji DNA w żelu w kierunku anody b = mieszaniny, różne wielkości; wyjaśnienie - patrz poprzednie strony tego przykładu c = minimalna ilość dendrymeru niezbędna do całkowitego skompleksowania DNA
NO = nie oznaczano
Z tabeli XII wynika, że wszystkie dendrymery z wyjątkiem dendrymerów z rdzeniem NH3 generacji poniżej G4 (G, Η, I) mogą wiązać i kompleksować/zobojętniać ładunek DNA.
W celu sprawdzenia, czy dendrymery skompleksowane z DNA mogą być przydatne w transfekcji, przeprowadzono doświadczenia w różnych warunkach.
Na figurze 17 przedstawiono wyniki transfekcj i próbek w komórkach RAT2, przy czym dla każdego z różnych warunków oznaczonych liczbami od 1 do 18, patrz tabela XIII, podano jednostki światła na 1 pg białka komórkowego.
Tabela XIII
Próbka nr Dendrymer lub kontrolna Stosunek obciążenia DNA.dendrymer Warunki
1 2 3 4
1 D 1:0,7 a
2 S 1:0,7 a
3 Q 1:0,8 a
4 D 1:3,3 a
5 S 1:3,3 a
6* RAT2 nietransfekowany ND a
7 D 1.0,7 b
8 S 1.0,7 b
9 Q 1:0,8 b
10 D 1.3,3 b
11 S 1:3,3 b
181 064 cd. tabeli XIII
1 2 3 4
12* Sam Dex ND b
13 D 1:0,7 c
14 S 1:0,7 c
15 Q 1:0,8 c
16 D 1.3,3 c
17 S 1:3,3 c
18* RSV + hsDNA-Dex ND c
* = kontrolne
Dex = dekstran
ND = nie dotyczy a = DNA i dendrymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DMEM b = DNA i dendrymer skompleksowano w HBS i transfekowano w DMEM c = DNA i dendrymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DEAE-dekstranie
Próbki 6,12 i 18 stanowiąpróbki kontrolne. Próbkę 6 stanowią nietransfekowane komórki RAT2. Próbka 12 jest podobna do próbki 6, z tym że dodano DEAE-dekstran. W próbce 18 usiłowano wykonać transfekcję stosując wektor i DNA plemników śledzia w obecności DEAE-dekstranu. Wyniki w tabeli XIII wskazują, że dendrymery generacji niższej niż 8 nie uczestniczą w transfekcj i, chyba że kompleksy DNA:dendrymer umieści się w DEAE-dekstranie.
Aby potwierdzić te wyniki z wykorzystaniem szerszego zakresu stosunków ładunków DNA:dendrymer, przeprowadzono badania zilustrowane na fig. 18. Parametry doświadczeń podano poniżej w tabeli XIV.
Tabela XIV
Próbka nr Dendrymer lub kontrolna Stosunek obciążenia DNA:dendrymer Warunki
1 2 3 4
1 D 1:14,6 c
2 D 1:3,3 c
3 D 1:1,2 c
4 D 1.0,6 c
5 D 1:0,3 c
6 D 1:0,15 c
7 S 1:14,6 c
8 S 1:3,3 c
9 s 1:1,2 c
10 s 10,6 c
11 s 10,3 c
12 s 1:0,15 c
13 D 1:14,6 b
181 064 cd. tabeli XIV
1 2 3 4
14 D 1-3,3 b
15 D 1:0,6 b
16 S 1.14,6 b
17 S 1:3,3 b
18 S 10,6 b
19 d 1:0,03 c
20 S 1:0,03 c
21 RSV Dex* ND ND
22 RSV + hsDNA Dex* ND ND
23 sam Dex* ND ND
24 sam HSB ND ND
* = kontrolne
Dex = dekstran
ND = nie dotyczy b = DNA i dendrymer skompleksowano w HBS i transfekowano w DMEM c = DNA i dendrymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DEAE-dekstranie
Próbki kontrolne 21-24 zawierały odpowiednio wektor w DEAE-dekstranie, wektor i DNA plemników śledzia w DEAE-dekstran, DEAE-dekstran i HBS.
Wyniki te wskazują, że kompleksy DNA:dendrymer wykazują nieoczekiwanie większą skuteczność transfekcji komórek w obecności DEAE-dekstranu. Sugerują one również, że dla czystych dendrymerów zawierających na powierzchni funkcyjne grupy aminowe (o ładunku dodatnim) tylko kompleksy z nadmiarem dendrymerowych ładunków dodatnich są zdolne do skutecznej transfekcji (patrz pas 4, fig. 18).
Zdolność do transfekcji szerokiego zakresu różnych dendrymerów przedstawiono (A-S) na fig. 19. Przedstawiono wykres słupkowy względnych jednostek światła na 1 pg białka z komórek transfekowanych DNA skompleksowanym z różnymi dendrymerami (A-S) w obecności DEAE-dekstranu. Wykonywano podwójne pomiary dla trzech różnych stosunków ładunków DNA:dendrymer, 1:2, 1:10 i 1:20. Na fig. 19 spośród 6 słupków dla każdego z dendraymerów A-S pierwsze dwa przedstawiajątransfekcjęprzy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:2, druga para przy 1:10, a trzecia para przy 1:20. Próba kontrolna (RS Va) obejmuje transfekcję plazmidowego DNA wykonaną w obecności DEAE-dekstranu. Można stwierdzić, że dla różnych stosunków DNA:dendrymer powodzenie w transfekcji, transkrypcji i translacji zależy od typu stosowanego dendrymeru.
Przykład 2. Mikroskopia elektronowa kompleksów DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstranu (fig. 60, zdjęcia 3, 4 i 5)
Stwierdzono, że dodatek DEAE-dekstranu lub innych środków do kompleksu DNA:dendrymer po jego utworzeniu skutecznie wzmaga transfekcję w unikatowy sposób. Aby dokładniej zrozumieć rolę tych środków we wpływie na niespecyficznątransfekcję, wykonano mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstranu. W przykładzie tym DNA skompleksowano z dendrymerami, jak to zaznaczono poniżej i na fig. 60.
Zdjęcie 3: DNA:dendrymer Gil (EDA) przy stosunku ładunków 1:10
Zdjęcie 4: DNA:dendrymer G11 (EDA) w 0,5 μΜ DEAE-dekstranie
181 064
Zdjęcie 5: DNA skompleksowany z polidyspersyjną mieszaniną dendrymerów (związek B) przy stosunku ładunków 1:1.
Na figurze 60 zdjęcia 3, 4 i 5 przedstawiają mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA: dendrymer. DNA skompleksowano z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10, w 1 mM TRIS, pH 7,8. Dla takich warunków mikroskopia elektronowa wykazuje, że kompleksy DNA:dendrymer tworzą duże nieregularne agregaty nie obserwowane dla samego dendrymeru (fig. 60, zdjęcie 3). Dodatek DEAE-dekstranu do uzyskania jego ostatecznego stężenia 0,5 μΜ powoduje zdecydowane zmniejszenie wielkości kompleksów DNA:dendrymer (fig. 60, zdjęcie 4). Mniejsze kompleksy (i całkowity brak dużych agregatów) zaobserwowano także w przypadku kompleksowania DNA z polidyspersyjną mieszaniną dendrymerów (np. określonąjako związek B) przy stosunku ładunków 1:10. Wyniki te dostarczają wyjaśnienia, dlaczego środki takie mogą wzmagać transfekcję. Nie wiążąc się żadną teorią można z pewnym prawdopodobieństwem przyjąć, że kompleksy o mniejszych wymiarach uzyskiwane przy zastosowaniu takich środków będą miały łatwiejszy dostęp do komórek w celu osiągnięcia transfekcji.
Przykład 3. Porównanie wiązania DNA i zdolności do transfekcji dla dendrymerów z lub bez podstawienia powierzchni przy różnych stosunkach ładunków DNA.dendrymer (fig. 12 i 13)
W celu określenia wpływu zmniejszenia powierzchniowego ładunku w dendrymerze na skuteczność transfekcji przeprowadzono następujące doświadczenie. Wytworzono kompleksy DNA-dendrymer o podanych stosunkach ładunków, stosując różne dendrymery zestawione poniżej w tabeli XV. Jak poprzednio Liczba „G” oznacza generację dendrymeru; a „NH3” lub „EDA” oznacza rdzeń dendrymeru. Podstawione dendrymery przedstawiono jako próbki 26-31 na fig. 12 oraz pasy 26-31 na fig. 13. W podstawionych dendrymerach dodatnio naładowane powierzchniowe grupy aminowe zmodyfikowano poprzez reakcję z kwasem akrylowym. W związku z tym w takich podstawionych dendrymerach liczba powierzchniowych grup aminowych została zmniejszona. Tak np. w dendrymerze G6 (NH3) podstawionym w 25% teoretycznie 25% powierzchniowych grup aminowych przereagowała z grupami karboksylowymi kwasu akrylowego. W dendrymerze G6 podstawionym w 100% każda powierzchniowa grupa aminowa przereagowała z grupą karboksylową. Z tego względu zmniejszeniu ulega dodatni ładunek grup funkcyjnych na dendrymerach, dostępny do oddziaływania z ujemnie naładowanym DNA. Próbki 1 i 32 w tabeli XV stanowią „plazmidy kontrolne”, czyli sam DNA.
Tabela XV
Ścieżka nr Generacja i rdzeń Stosunek obciążenia DNA:dendrymer
1 2 3
1 Sam plazmid kontrolna
2 G5 (NH3) 1:1
3 G5 (NHj) 1:5
4 G5 (NHj) 1.10
5 G5 (EDA) 1:1
6 G5 (EDA) 1:5
7 G5 (EDA) 1:10
8 G6 (NH3) 1:1
9 G6 (NH3) 1.5
10 G6 (NH3) 110
181 064 cd. tabeli XV
1 2 3
11 G6 (EDA) 1:1
12 G6 (EDA) 1:5
13 G6 (EDA) 110
14 G7 (NH3) 1-1
15 G7 (NH3) 1.5
16 G7 (NHj) 1-10
17 G7 (EDA) 1:1
18 G7 (EDA) 1 5
19 G7 (EDA) 1.10
20 G4 (NH3) 1.1
21 G4 (NH3) 1:5
22 G4 (NH3) 110
23 G4 (EDA) 1:1
24 G4 (EDA) 1:5
25 G4 (EDA) 1 10
26 G6 (NH3)a 1:1
27 G6 (NH3)a 1:5
28 G6 (NH3)a 110
29 G6 (NH3)b ND
30 G6 (NH3)b ND
31 G6 (NH3)b ND
32 Sam plazmid kontrolna
a = 25% podstawienia b = 100% podstawienia
ND = nie dotyczy; dendrymery podstawione w 100% wymieszano w takich samych ilościach jak dendrymery podstawione w 25%
Próbki kompleksów DNA:dendrymer w roztworze dodano do komórek w celu wykonania transfekcji, zgodnie z opisanąpowyżej metodyką transfekcji z udziałem dendrymerów, w obecności DEAE-dekstranu w stężeniu 0,5 μΜ. Jak można stwierdzić na podstawie fig. 12, także w tym przypadku widoczne jest, że dendrymery G6 sąbardziej skuteczne (porównaj kolumny 8-19 z kolumnami 2-7 i kolumnami 20-25). Gdy powierzchnia dendrymeru została w 25% podstawiona ujemnymi grupami funkcyjnymi, niewątpliwie stosunek ładunków DNA:dendrymer uległ obniżeniu.
Kompleksy dendrymerów i próbki kontrolne 1 -32, zestawione w tabeli XV, umieszczono na żelu agarozowym do elektroforezy (patrz fig. 13). Pasy 1 i 32 wskazują zakres, w jakim sam DNA migruje przez żel (fig. 13). Pasy 2-28 nie wykazują migracji, co świadczy o tym, że DNA został skompleksowany z dendrymerem i w związku z tym migracja przez żel jest zahamowana. Migrację można natomiast zaobserwować dla pasów 29-31, gdy polimery dendrytowe zawierają zmniejszoną ilość grup funkcyjnych o ładunku dodatnim. Pewien resztkowy ładunek dodatni można jednak stwierdzić nawet w dendrymerach podstawionych w 100%, gdyż przy niższych
181 064 stosunkach DNA:dendrymer obserwuje się zahamowanie (pasy 30-31). Wyniki przedstawione na fig. 12113 wskazują, że gęstość powierzchniowych ładunków dodatnich odgrywa istotną rolę w wiązaniu, kompleksowaniu i transfekcji DNA.
Przykład 4. Wzrost skuteczności transfekcji DNA w funkcji generacji dendrymeru w porównaniu z próbą kontrolną z DEAE-dekstranem (fig. 14)
W przykładzie tym wytworzono z zastosowaniem dendrymerów G2-G8 (NH3) i G3-G11 (EDA). Ich zdolność do transfekcji DNA w komórkach RAT2 w obecności DEAE-dekstranu porównano ze stopniem transfekcji osiąganym przy stosowaniu jedynie DNA i DEAE-dekstranu. Procent wzrostu transfekcji dla każdego dendrymeru w porównaniu z próbą kontrolną DNA/DEAE-dekstran przedstawiono na fig. 14. Z rysunku tego wynika, że skuteczność transfekcji wzrasta wykładniczo przy zwiększaniu się generacji dendrymeru, od generacji 5 do 10. Sugeruje to, że wzrostu powierzchni i ładunku dendrymerów powoduje wzrost skuteczności transfekcji.
Przykład 5. Badanie wpływu kolejnego dodawania dendrymerów G9 i G5 na skuteczność transfekcji w komórkach RAT2 bez stosowania DEAE-dekstranu (fig. 15 i 16)
W przykładzie tym
1. DNA najpierw skompleksowano z dendrymerem G9, po czym dodano roztwór zawierający dendrymer G5; albo
2. DNA najpierw skompleksowano z dendrymerem G5, po czym dodano roztwór zawierający dendrymer G9.
Wyniki uzyskane dla dendrymerów z rdzeniem EDA przedstawiono na fig. 15, a wyniki dla dendrymerów z rdzeniem amoniakalnym przedstawiono na fig. 16. Na fig. 15 i 16 stężenie drugiego dendrymeru dodawanego do kompleksu podano na osi odciętych wykresu słupkowego. W pierwszej kolumnie stężenie „zero” dotyczy próby kontrolnej, w której nie zastosowano drugiego dendrymeru.
W obydwu przypadkach wyjściowe dendrymery G9 i G5, dodawano do uzyskania ich stężenia odpowiednio 0,5 μΜ i 20,0 μΜ. W każdym przypadku średnica dendrymeru G5 wynosiła około 40 A, a średnica dendrymeru G9 około 88 A. W obydwu przypadkach zastosowano kuliste dendrymery typu gęstej gwiazdy. Gdy dendrymer G9 dodawano do kompleksu DNA:dendrymer G5, zazwyczaj uzyskiwano lepsze wyniki niż przy dodawaniu dendrymeru G5 do uprzednio kosmpelskowanego dendrymeru G9. Oznacza to, że powstawanie kompleksu DNA:dendrymer może obejmować 2 etapy, a mianowicie kompleksowanie i kurczenie DNA, a następnie „pokrywanie” kompleksu dodatnim ładunkiem zapewniającym przyczepność do komórek. Okazało się, że w tym drugim etapie korzystniejszy jest dendrymer o większej średnicy, z większą gęstością ładunków powierzchniowych.
Przykład 6. Porównanie właściwości kompleksujących i zdolności do transfekcji szeregu dendrymerów (NH3) z fragmentami DNA (fig. 20 i 21).
W przykładzie tym stosunkowo niewielkie fragmenty DNA kompleksowano z różnymi dendrymerami. Na fig. 20 przedstawiono dane dla syntetycznego jednoniciowego DNA o 15 nukleotydach, skompleksowanego z dendrymerami G2-G7 (NH3) przy stosunkach DNA:dendrymer podanych poniżej w tabeli XVI.
T a b e 1 a XVI
Ścieżka Stosunek obciążenia DNA.dendrymer Dendrymer
1 2 3
1 61 G6 (NH3)
2 1:1 G6 (NHj)
3 1:1,5 G6 (NH3)
4 6Ί G7(NH3)
181 064 cd tabeli XVI
1 2 3
5 1.1 G7(NH3)
6 1 1,5 G7 (NH3)
7 61 G3 (NH3)
8 1.1 G3 (NH3)
9 1.1,5 G3 (NHj)
10 6 1 G4(NHj)
11 1.1 G4 (NHj)
12 1 1,5 G4(NH3)
13 5-1 G2 (NH3)
14 1:1 G2(NH3)
15 1:2 G2 (NH3)
16 - *
* Marker wielkości DNA
Na figurze 20 pokazano wyniki elektroforezy na żelu agarozowym różnych kompleksów. Jak można stwierdzić, w kolumnach 1,4, 7 i 10 nastąpiła znaczna migracja oligonukleoetydów. Oznacza to, że przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 6:1 nie tworzą się trwałe kompleksy. Natomiast brak migracji oligonukleotydów w kolumnach 2,3, 5,6, 8, 9, lii 12 jest oznaką tego, że syntetyczny oligonukleotydowy DNA tworzy trwałe kompleksy z dendrymerami G3-G7 (NH3) przy stosunkach ładunków 1:1 i 1:1,5. Kolumny 13-15 wskazują że oligonukleotyd nie tworzy trwałych kompleksów z dendrymerami G2 (NH3) przy żadnym z podanych stosunków ładunków.
Powodzenie w przenoszeniu radioznaczonego dwuniciowego oligonukleotydu o 23 parach zasad (bp) skompleksowanego z dendrymerem G8 (NH3) (przy stosunku ładunków 1:10) przedstawiono na fig. 21. W związku z tym, że oligomer nie stanowił funkcyjnego genu reporterowego, zajście przenoszenia określono na podstawie pomiaru przenikania radioznaczonego DN A. Radioaktywność w komórkach po przenikaniu przedstawiono na osi rzędnych na fig. 21 w funkcji czasu po zainicjowaniu przenoszenia przedstawionego na osi odciętych.
Zależność wnikania DNA-dendrymeru do komórek od energii potwierdzają wyniki wykazujące, że dodatek azydku sodowego do kompleksu znacznie obniża przenikanie, prawie do poziomu uzyskanego dla samego oligonukleotydu. Oznacza to, że dendrymery mogą ułatwiać wnikanie do komórek kwasów nukleinowych o niskim ciężarze cząsteczkowym.
Przykład 7. Transfekcjakolistego (superskłębionego) i linearyzowanegoRSV-luc w komórkach RAT2 z wkyorzystaniem dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów G11 (EDA), z dodatkiem i bez DEAE-dekstranu (fig. 22)
W przykładzie tym skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) gen RSV-luc zarówno w formie kolistej (superskłębionej) jak i liniowej. Linearyzacjąosiąnięto stosując specyficzną względem jednego miejsca endonukleazę restrykcyjną. Na fig. 22 na osi pionowej słupki nr 1,3,517 dotyczą plazmidu w postaci liniowej, a słupki nr 2,4,6 i 8 dotycząplazmidu w kolistej formie DNA. Fig. 22 ilustruje, że transfekcję zarówno liniowej jak i kolistej formy DNA osiąnięto stosując dendrymer G8 (NH3) lub Gil (EDA), oraz że we wszystkich przypadkach transfekcja zostaje wzmocniona, jeśli zastosuje się DEAE-dekstran.
Przykład 8. Wyjątkowa zdolność dendrymerów do wiązania DNA (fig. 23)
W przykładzie tym określono korzystne stosunki ładunków DNA:dendrymer oraz warunki wiązania przy skutecznym powstawaniu trwałych kompleksów DNA:dendrymer. Wytwarzano kompleksy DNA:dendrymer o stosunku ładunków od około 40:1 do l:50(fig. 23 i tabela XVII).
181 064
Tabela XVII
Ścieżka Stosunek obciążenia DNArdendrymer
1 a
2 b
3 40:1
4 20:1
5 10:1
6 2 1
7 11
8 1:5
9 1 10
10 1.20
11 1.25
12 1 50
a = marker wielkości DNA b = kontrolna - DNA bez dendrymeru
Wyniki elektroforezy kompleksów na żelach pokazano na fig. 23 (a-d). Ścieżka 1 dla każdego z żeli do elektroforezy dotyczy markera wielkości DNA, a ścieżka 2 kontrolnego DNA, to znaczy bez dendrymeru. W żelach A i B na fig. 23 do kompleksowania DNA zastosowano dendrymer G8 (NH3). W żelach C i D na fig. 23 do kompleksowania DNA zastosowano dendrymer G8 (EDA). Górne plansze (23 a i c) dotyczą kompleksów wytwarzanych w obecności ditiotreitolu (DTT), który eliminuje (poprzez redukcję wiązań disulfidowych) zanieczyszczenia białkowe, oraz eksponowanych na działanie EDTA, który mógłby skompleksować ewentualnie występujące kationy, które z kolei mogłyby wytrącać DNA. W tych dwóch etapach usuwane są zanieczyszczenia, które mogłyby zafałszować wyniki dotyczące kompleksów DNArdendrymer. Uzyskane wyniki wskazują ponadto, że tworzenie się kompleksu nie wymaga warunków redukujących lub obecności jonów metali.
Wyniki na planszach A i C są porównywalne z wynikami na planszach B i D. DNA kompleksowany z dendrymerami przy stosunku ładunków 20:1 lub powyżej nie tworzy trwałych kompleksów (patrz ścieżki 2-5 na planszach A-D fig. 23). Zahamowanie migracji kompleksów DNA:dendrymer zaczyna się od stosunku ładunków DNA:dendrymer 2:1 i postępuje do stosunku ładunków 1:50 (patrz pasy 6-12 na każdej z planszy A-D na fig. 23). Oznacza to, że DNA jest w dalszym ciągu kompleksowany z dendrymerem nawet przy niskich stosunkach ładunków DNA :dendrymer.
Przykład9. Zdolność dendrymerów do wiązania DNA jest przede wszystkim zależna od stosunku ładunków (fig. 24)
W tym przykładzie 0,2 pg plazmidowego DNA (2,9 kb) skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) w stosunkach molowych podanych w tabeli XVIII, przy czym pas 1 dotyczy niekompleksowanego markera wielkości DNA.
181 064
Tabela XVIII
Ścieżka Stosunek obciążenia DNA.dendrymer
1 a
2 1.0,32b
3 1 3,2b
4 116b
5 l:32b
6 1.64b
7 1 128b
8 l:0,32c
9 1:3,2C
10 l:16c
11 l:32c
12 1:64c
13 1 128c
a = marker wielkości DNA b = DNA G8 NH3 c = DNAG11 EDA
Wyniki elektroforezy tych kompleksów na żelu agarozowym przedstawiono na fig. 24. Można stwierdzić, że przy stosunkach molowych 1.0,32, 1:3,2 i 1:16 (patrz pasy 2-4 na fig. 24) DNA nie tworzy kompleksu z dendrymerem G8 (NH3). Natomiast tylko przy stosunkach 1:0,32 i 1:3,2 (pasy 8 i 9) DNA nie tworzy kompleksów z dendrymerem G11 8EDA). Oznacza to, że większy dendrymer Gil (EDA), o znacznie większej gęstości ładunków powierzchniowych niż dendrymer G8 (NH3), jest zdolny do kompleksowania przy niższych stosunkach molowych DNA:dendrymer, co oznacza, że ważniejszym parametrem w kompleksowaniu DNA przez dendrymer jest stosunek ładunków.
Wszystkie trwałe kompleksy, dla których wyniki elektroforezy pokazano na ścieżkach 5-7 i 11-13, fig 24, charakteryzują się stosunkiem ładunków DNA:dendrymer poniżej 5:1.
Przykład 10. Stabilność kompleksu DNA: dendrymer w szerokim zakresie pH (fig. 25)
W przykładzie tym wytworzono kompleksy DNA z dendrymerami G8 (NH3) i G8 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 10:1 i 1:5 w buforze zawierającym 100 mM chlorek sodowy i 10 mM TRIS, przy zmiennym pH, jak to podano poniżej w tabeli XIX.
Tabela XIX
Ścieżka pH Stosunek obciążenia DN A dendrymer*
1 2 3
1 7,4 10:1 (NHj)
2 7,4 1:5 (NHj)
3 7,4 10:1 (EDA)
4 7,4 T5 (EDA)
181 064 cd. tabeli XIX
1 2 3
5 7,4 sam DNA
6 5,2 10:1 (NHj)
7 7,0 10:1 (NH3)
8 9,8 10:1 (NH3)
9 5,2 l'5(NHj)
10 7,0 1-5 (NH,)
11 9,8 1 5 (NH3)
12 5,2 101 (EDA)
13 7,0 10:1 (EDA)
14 9,8 101 (EDA)
15 5,2 1:5 (EDA)
16 7,0 1:5 (EDA)
17 9,8 1:5 (EDA)
18 5,2 sam DNA
19 7,0 sam DNA
20 9,8 sam DNA
* G8
Wyniki elektroforezy uzyskanych kompleksów na żelu agarozowym pokazano na fig. 25.
Ścieżki 1-5 dotyczą kompleksowania prowadzonego w standardowych warunkach (pH 7,4). Zgodnie z oczekiwaniami DNA nie tworzy kompleksów z dendrymerem przy stosunkach ładunków 10:1 (pasy 1,3,6-8 i 12-14) i podobnie jak kontrolny DNA, który poddano elektroforezie bez dendrymeru (ścieżki 5 i 18-20), migruje przez żel. Na częściowe skompleksowanie DNA przy stosunku ładunków 10:1 (o czym świadczy rozmazanie obserwowane na ścieżkach 1,3,6-8 i 12-14) nie wpływa również zmiana pH. Natomiast kompleks DNA utworzony przy stosunku ładunków 1:5 wykazuje stabilność przy pH w zakresie 5,2-9,8 i nie migruje przez żel (ścieżki 9-11 i 15-17). Ścieżki 9 i 15 wykazują, że kompleks tworzy się przy pH 5,2, natomiast ścieżka 17 obrazuje dysocjację kompleksu przy pH 9,8. W związku z tym kompleksy utworzone z dendrymerem G8 (NH3) wykazywały stabilność przy pH 9,8, natomiast kompozycje z dendrymerami G8 (EDA) były w tych warunkach nietrwałe. Sugeruje to różną charakterystykę ładunków dla tych dwóch dendrymerów, co może wpływać na ich zdolność do wiązania DNA w pewnych warunkach.
Przykład 11. Wiązanie DNA z dendrymerem przy wzrastaj ących stężeniach chlorku sodowego (fig. 26 a i b)
W przykładzie 52 DNA kompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G8 (EDA) przy stosunku ładunków 5:1 i 1:5, w środowisku o wzrastających stężeniach chlorku sodowego, co podano poniżej w tabeli XX.
Tabela XX
Ścieżka Stężenie NaCl
1 2
1 *
2a& 10b 0
3a& 1 lb 50 μΜ
4a& 12b 100 μΜ
181 064 cd. tabeli XX
l 2
5’& 13b 200 μΜ
6’& 14b 500 μΜ
7’& 15b 750 μΜ
8a& 16b 1,0 μΜ
9a& 17b 1,5 μΜ
* Marker wielkości DNA a = stosunek obciążenia 5' 1 b = stosunek obciążenia 1.5
Wyniki elektroforezy tych kompleksów przedstawiono na fig. 26a i 26b; fig. 26a dotyczy kompleksów DNA z dendrymerem G8 (NH3), a fig. 26b kompleksów DNA z dendrymerem G8 (EDA). Pełne kompleksy DNA:dendrymer nie tworząsię przy stosunku ładunków 5:1 w żadnych z przebadanych warunków, o czym świadczy migracja DNA w żelu (ścieżki 2-9 na fig. 26a i 26b). Natomiast pełne kompleksy DNA:dendrymer tworzą się i zachowuj ą trwałość przy stosunku ładunków 1:5 w zakresie stężeń chlorku sodowego od 0 (ścieżki 2 i 10) do 1,5 M (ścieżki 9 i 17). W związku z tym tworzenie się kompleksu DNA:dendrymer zachodzi niezależnie od siły jonowej bufom.
Przykład 12. Stabilność DNA skompleksowanego z dendrymerem w obecności endonukleaz restrykcyjnych (fig. 27)
W przykładzie tym 0,2 pg DNA plazmidu pRSV-lac skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) przy stosunku ładunków 1:10, a następnie inkubowano z enzymami, endonukleazami restrykcyjnymi Hindlll lub EcoRl przez 1 godzinę w 37°C. Próbki poddano następnie obróbce SDS w celu oddzielenia DNA od dendrymeru i przeprowadzono elektroforezę na żelu agarozowym (fig. 27, oznaczenie ścieżek wyjaśniono poniżej w tabeli XXI)
Tabela XXI
Ścieżka Kompleks plazmidu
1 Marker wielkości DNA
2 Niestrawiony plazmidowy DNA
3 Plazmidowy DNA strawiony Hind III
4 Plazmidowy DNA skompleksowany z G8 ΝΉ3, strawiony Hind III
5 Plazmidowy DNA skompleksowany z G11 EDA, strawiony Hind ΠΙ
6 Plazmidowy DNA strawiony EcoRl
7 Plazmidowy DNA skompleksowany z G8 NH3, strawiony EcoRl
8 Plazmidowy DNA skompleksowany z G11 EDA, strawiony EcoRl
Niekompleksowany plazmidowy DNA strawiony Hindlll lub EcoRl migrował we fragmentach odpowiadających liczbie miejsc restrykcji w plazmidzie (porównaj ścieżki 3 i 6 ze strawionym DNA na ścieżce 2, fig. 27). Natomiast skompleksowany DNA zasadniczo nie został strawiony (ścieżki 4, 5, 7 i 8), co oznacza że kompleksowanie przez dendrymer chroni DNA przed trawieniem przez endonukleazy.
Przykład 13. Stabilność kompleksów DNA:dendrymer w obecności nukleaz komórkowych (fig. 28)
Przykład 13 jest podobny do przykładu 12, z tym że zastosowano nukleazy komórkowe otrzymane z komórek cytoplazmatycznych U937 do niespecyficznego trawienia DNA. Plazmi
181 064 dowy DNA (2,9 kb) skompleksowano z dendrymerem G8 (EDA) przy stosunkach ładunków zapewniających pełne (1:5) lub niepełne (5:1) kompleksowanie DNA. Kompleksy DNA:dendrymer inkubowano następnie z ekstraktem komórkowym przez 4 godziny w 47°C. Z kolei dodano SDS w celu oddzielenia DNA od dendrymeru i próbki poddano elektroforezie na żelu agarozowym (fig. 28); identyfikację ścieżek podano poniżej w tabeli XXII.
Tabela XXII
Ścieżka Próbki
1 Markter wielkości DNA
2 Plazmid kontrolny, bez ekstraktu komórkowego, bez dendrymeru
3 Strawiony plazmid kontrolny; 5 pg ekstraktu komórkowego, bez dendrymeru, bez SDS
4 Plazmidowy DNA G8 (EDA) (1 5), bez ekstraktu komórkowego
5 Plazmidowy DNA.G8 (EDA) (1:5), 5 pG ekstraktu komórkowego
6 Plazmidowy DNA.G8 (EDA) (5:1), bez ekstraktu komórkowego
7 Plazmidowy DNA G8 (EDA) (5:1), 5 pG ekstraktu komórkowego
Migrację nienaruszonego plazmidu przedstawiono na ścieżce 2, natomiast migrację plazmidu strawionego nukleazami komórkowymi pokazano na ścieżce 3. Z porównania ścieżek 2 i 3 wynika, że ekspozycja DNA na działanie nukleaz komórkowych powoduje jego strawienie na małe fragmenty o różnej wielkości (o czym świadczy rozmazanie na ścieżce 3).
Ścieżka 4 dotyczy kompleksu DNA:dendrymer przy stosunku ładunków 1:5, którego nie eksponowano na działanie ekstraktu komórkowego ani na SDS, a następnie poddano elektroforezie. Nie zaobserwowano migracji, czego można było oczekiwać w przypadku trwałego kompleksu DNA: dendrymer.
Na ścieżce 5 ten sam kompleks 1:5 poddano działaniu ekstraktu komórkowego (5 pg), a następnie zdysocj owano za pomocą SDS i poddano elektroforezie. Plazmid pozostał praktycznie nienaruszony, co wynika z porównania ścieżki 5 ze ścieżkami 3 i 4. Oznacza to, że trawienie DNA zachodzi w niewielkim stopniu lub nie zachodzi wcale, gdy jest on skompleksowany z dendrymerem.
Ścieżka 6 dotyczy kompleksu DNA:dendrymer 5:1 nie poddanego działaniu ekstraktu komórkowego, a następnie poddanego elektroforezie. Zgodnie z oczekiwaniami kompleks nie jest trwały i DNA migruje w żelu. Ścieżka 7 dotyczy tego samego kompleksu eksponowanego na 5 pg ekstraktu komórkowego, a następnie poddanego obróbce SDS w celu uwolnienia DNA od dendrymeru i poddanego elektroforezie. W związku z tym, że kompleks nie był stabilny, DNA został prawie całkowicie strawiony, tak że na ścieżce 7 fig. 28 widoczna jest zróżnicowana migracja różnych strawionych fragmentów. Uzyskane wyniki świadczą o tym, że pełne kompleksowanie DNA przez dendrymer chroni DNA przed strawieniem przez nukleazy.
Przykład 14. Transfekcja DNA skompleksowanego z dendrymeramiG8 (NH3) z udziałem lub bez DEAE-dekstranu, w porównaniu z transfekcjąz wykorzystaniem środka Lipofectin™ (fig. 29)
W tym przykładzie DNA skompeksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer (od 1:100 do 1:1). Następnie przeprowadzono transfekcję różnych ilości DNA (1,5 i 10 pg) w obecności lub bez DEAE-dekstranu. Powyższe ilości DNA transfekowano także z 20 pg środka Lipofectin™.
Wyniki tych transfekcji, których miarą jest luminescencja (w jednostkach światła/pg białka) przedstawiono na fig. 29. Bardzo małą transfekcję zaobserwowano dla próbek kontrolnych, to znaczy dla DNA w obecności dendrymeru lub samego DNA. Znaczną transfekcję osiągnięto w przypadku kompleksów DNA:dendrymer przy dodawaniu 10 pg, 5 pg i 1 pg DNA/studzienkę, przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer od 1:100 do 1:1 w obecności de
181 064 ndrymeru. Znaczną transfekcję osiągnięto również dla kompleksów DNA:dendrymer nawet w nieobecności dendrymeru, gdy większe ilości DNA skompleksowano przy niższych stosunkach ładunków. W nieobecności dendrymeru transfekcja kompleksami DNA:dendrymer zachodzi tylko w przypadku dendrymerów wyższych generacji (>G7).
W tych przypadkach, gdy transfekcj a jest znacząca, użyskane wyniki wypadają korzystnie w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy stosowaniu środka transfekcyjnego opartego na lipidach, Lipofectin™.
Przykład 15. Transfekcja DNA skompleksowanego z różnymi dendrymerami w obecności lub bez DEAE-dekstranu (fig. 30 i 31)
W tym przykładzie przedstawiono wyniki transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami G9 (EDA), G9 (NH3) (fig. 30) oraz G8 (NH3) i G11 (EDA) (fig. 31) przy różnych stosunkach ładunków. Transfekcja DNA w obecności DEAE-dekstranu jest zdecydowanie wzmocniona, gdy stosunek ładunków DNA.dendrymer waha się w granicach od 1:5 (0,2) do 1:100 (0,01) (fig. 30 i 31). Nawet przy wysokich stosunkach ładunków około 4:1 (4,0) lub bardzo niskich, około 1:10 000 (0,0001) zaobserwowano pewną transfekcję. Znaczącą transfekcję w nieobecności DEAE-dekstranu obserwuje się tylko wtedy, gdy stosunek ładunków DNA:dendrymerujest niższy od 1:5, przy czym obserwuje się tendencję wzrostowąprzy spadku stosunku ładunków do 1:1 000, a nawet do 1:10 000 dla G9 (NH3) (fig. 30). Sugeruje to, że niższe stosunki ładunków materiału genetycznego do dendrymeru mogą ewentualnie zastępować wzmacniające działanie DEAE-dekstranu.
Przykład 16. Transfekcja DNA skompleksowanego z dendrymerem G7 (NH3) w obecności DEAE-dekstranu lub HBS (fig. 32)
W tym przykładzie kompleksy DNA:dendrymer o stosunkach ładunków podanych na osi odciętych na fig. 32 transfekowano do komórek RAT2 w obecności DEAE-dekstranu lub HBS. Wyniki transfekcji, których miarąjest luminescencja we względnych jednostkach światła/pg białka komórkowego, przedstawiono na fig. 32. Jak można stwierdzić, DEAE-dekstran zasadniczo wzmaga transfekcję kompleksów, w których stosunek ładunków wynosi od około 1:15 do około 1:1, a nawet do 1:0,6. Praktycznie nie zaobserwowano transfekcji w obecności HBS, co potwierdza, że transfekcja dendrymerami generacji 7 lub niższej wymaga dodawania DEAE-dekstranu.
Przykład 17. Wpływ generacji dendrymeru i stosunku ładunków DNA/dendrymer na wydajność transfekcji (fig. 33)
W tym przykładzie kompleksy DNA z dendrymerami typu gęstej gwiazdy G4-G8 (NH3) przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer 1:1,1:5 i 1:10 transfekowano w komórkach RAT2 w obecności dendrymeru. Procent wzrostu transfekcji w odniesieniu do mieszaniny kontrolnej DEAE-dekstranu z DNA przedstawiono dla każdego z uzyskanych kompleksów na fig. 33. Bardzo znaczący wzrost w stosunku do próby kontrolnej zaobserwowano przy wszystkich stosunkach ładunków dla dendrymerów G6, G7 i G8, których średnica wynosi ponad około 50 A, a niewielką poprawę stwierdzono dla dendrymerów G4 i G5. Ponadto w przypadku, gdy stosunek ładunków wynosił 1:5 lub 1:10, transfekcja była zdecydowanie wydajniejsza niż w przypadku kompleksów, w których stosunek ładunków wynosił 1:1. W związku z tym wzrost generacji dendrymeru i stosunku ładunków synergistycznie poprawia skuteczność transfekcji.
Przykład 18. Wpływ DEAE-dekstranu na transfekcję w szerokim zakresie stosunków ładunków (fig. 34)
W tym przykładzie DNA skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy stosunku ładunków od 1:1 do 1:3 805. Wyniki transfekcji z udziałem i bez DEAE-dekstranu przedstawiono na fig. 34 podając stopień luminescencji we względnych jednostkach światła/pg białka. Przy stosunkach 1:1 i 1:100 osiągnięto minimalną transfekcję zarówno w obecności jak i bez DEAE-dekstranu. Natomiast dla stosunków 1:5 i 1:10 ponownie zaobserwowano synergistyczny wpływ zastosowania DEAE-dekstranu na wzrost transfekcji. W związku z tym okazało się, że DEAEdekstran może zmagać transfekcję kompleksów DNA:dendrymer tylko przy pewnych stosunkach ładunków.
Przykład 19. Wpływ zmiany stężenia DEAE-dekstranu na skuteczność transfekcji (fig. 35)
181 064
W przykładzie tym kompleksy DNA:dendrymer G11 (EDA) wytworzone przy stosunkach DNA:dendrymer od 1:1 do 1:100 zastosowano do transfekowania komórek RAT2 w obecności DEAE-dekstranu o różnym stężeniu (0-2 pM). Wyniki transfekcji, których miarą jest luminescencja (w jednostkach światła/pg białka komórkowego) przedstawiono na fig. 35. Pewne transfekcje zaobserwowano we wszystkich warunkach, przy czym DEAE-dekstran w stężeniach 0,1252 μΜ wydaje się wzmagać transfekcję. Jednakże wzrost ten jest najwyraźniejszy przy stężeniach DEAE-dekstranu 0,25-1 pM oraz dla stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5 lub 1:10. Oznacza to, że zarówno stosunek ładunków jak i stężenie DEAE-dekstranu należy optymalizować, aby osiągnąć synergistyczną poprawę transfekcji.
Przykład 20. Porównanie transfekcji DNA z wykorzystaniem dendrymerów i środka Lipofectin™ (fig. 36)
W przykładzie tym 5 pg DNA kompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy stosunku ładunków 1:5, po czym zastosowano do transfekcji różnych linii komórek. Transfekcję 5 linii komórek podanych na fig. 35 porównano z transfekcjąz udziałem środka Lipofectin™. Dodatkowo transfekcję kompleksu DNA:dendrymer wzmocnioną przez DEAE-dekstran porównano z transfekcjąprzy stosowaniu samego kompleksu. Na fig. 36 środki tmsfekcyjne oznaczono w sposób następujący: 1 dotyczy środka Lipofectin™ przy dwóch różnych stężeniach (20 pg i 2 pg); 2 dotyczy dendrymeru i DEAE-dekstranu; 3 dotyczy samego dendrymeru; 4 dotyczy samego DEAE-dekstranu i stanowi próbę kontrolną; 5 dotyczy plazmidu i stanowi próbę kontrolną.
Jak to wynika z fig. 36, transfekcja przy stosowaniu kompleksu DNA:dendiymer w obecności DEAE-dekstranu jest o wiele intensywniejsza niż przy stosowaniu środka Lipofectin™ przy 2 i 20 pg/studzienkę, w przypadku wszystkich komórek z wyjątkiem ludzkich komórek HMEC-1. Transfekcja kompleksów DNA:dendrymer w obecności DEAE-dekstranu również przebiegała korzystniej niż przy stosowaniu samego kompleksu DNA:dendrymer. W przypadku pewnych komórek, np szczura: Klon 9, myszy NIH3T3 i myszy 10-1 transfekcja przy zastosowaniu samych kompleksów DNA:dendrymer jest korzystniejsza niż przy zastosowaniu środka Lipofectin™ w ilości 2 lub 20 pg. Oznacza to, że kompleksy DNA:dendrymer mogą być stosowane do transfekowania szeregu różnych komórek; jednakże wyniki te sugerują, że skuteczność transfekcji może się zmieniać w zależności od typu komórki.
Przykład 21. Transfekcja dodatkowych linii komórek, trudnych do transfekowania za pomocą obecnie dostępnych środków transfekcyjnych (fig. 37)
Przeprowadzono próby transfekcji kompleksami DNA:dendrymer dodatkowych linii komórek, w przypadku których stwierdzono trudności w transfekcji z wykorzystaniem innych technik. DNA skomplekowano z dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1.5 i stopień, w jakim kompleksy DNA:dendrymer transfekują linie komórek NRK52E i YB2 porównano z transfekcjątych samych komórek dostępnym w handlu środkiem transfekcyjnym Lipofectin™ stosowanym w ilości 20 i 2 pg. Na fig. 37 środki oznaczono tymi samymi liczbami co na fig. 36.
Wyniki transfekcji, których miarąjest luminescencja we względnych jednostkach światła/pg białka komórkowego, przedstawiono na fig. 37. Najlepsze wyniki w przypadku wszystkich komórek uzyskuje się przy zastosowaniu kompleksu DNA:dendrymer w połączeniu z DEAE-dekstranem. Jakkolwiek środek Lipofectin™ zapewniał skuteczną transfekcję linii komórek NRK52E, to nie sprawdził się w przypadku linii komórek YB2, dla której skuteczność kompleksu DNA:dendrymer w DEAE-dekstranie była zdecydowanie wyższa. Ponownie należy podkreślić, że ogólna skuteczność transfekcji zmienia się w zależności od linii komórek.
Przykład 22. Porównanie transfekcji DNA z wykorzystaniem dendrymerów i dwóch różnych środków lipidowych, Lipofectin™ i Lipofectamine™ (fig. 38)
W przykładzie tym linie komórek RAT2 transfekowano DNA RSV-luc skomplekowanym z dendrymerem G8 (NH3) lub dendrymerem G11 (EDA). Zbadano stosunki ładunków DNA:dendrymer 1:1,1:5 i 1:10. W pewnych przypadkach zastosowano DEAE-dekstran w celu wzmocnienia transfekcji. Wyniki transfekcji porównano z transfekcjąz wykorzystaniem 2, 10 i 20 pl Lipofectin™ oraz 2, 12,5 i 25 pi Lipofectamine™.
181 064
Wyniki przedstawione na fig. 38 wykazują wyjątkowy stopień, w jakim DNA ulega transfekcji po skompleksowaniu z dendrymerami przy stosunku DNA:dendrymer 1:5 lub 1.10 w obecności DEAE-dekstranu. Lipofectamine™ zapewniał transfekcję, ale działał skutecznie tylko w wąskim zakresie stężeń. Lipofectin™ wykazywał minimalną aktywność w przypadku tej linii komórek.
Przykład 23. Porównanie wpływu zwiększania przepuszczalności błon komórkowych za pomocą DMSO na skuteczność transfekcji z działaniem DEAE-dekstranu (fig. 39)
Aby sprawdzić przypuszczenie, że DEAE-dekstran działa jedynie jako środek zakłócający lub zwiększający przepuszczalność, porównano transfekcję komórek RAT2 kompleksem DNA z dendrymerem G9 (NH3) przy zastosowaniu lub bez stosowania DMSO do obróbki komórek. Wyniki przedstawione na fig. 39 wykazują trzykrotny wzrost transfekcji przy zastosowaniu DEAEdekstranu w porównaniu z transfekcjąbez dekstranu. Natomiast DMSO nie wywiera wpływu na transfekcję w nieobecności DEAE-dekstranu. W związku z tym działanie wzmacniające DEAE-dekstranu nie jest po prostu wynikiem zakłócania lub zwiększania przepuszczalności komórek.
Należy podkreślić, że kombinacja DMSO i DEAE-dekstranu wywiera jeszcze silniejsze działanie syneigistyczne na transfekcję DNA skompleksowanego z dendrymerem, zwłaszcza przy stosunkach ładunków 1:5 i 1:10. Sugeruje to, że te dwa środki działają według różnych mechanizmów.
Przykład 24. Zastosowanie skompleksowanych dendrymerów do transfekcji komórek (fig. 40i41)
Koniugowanie prowadnika decelowego (trisacharydu galaktozowego) z dendrymerami nie zakłóca tworzenia trwałego kompleksu DNA:dendrymer (fig. 41), a może być wykorzystane do zwiększania skuteczności transfekcji (fig. 40). W tym przykładzie dendrymer Gil (EDA) skoniugowano z trisacharydem galaktozowym. Następnie DNA skompleksowano z ukierukowanym dendrymerem i kompleks zastosowano do transfekcji komórek RAT2, HepG2, NIH3T3 i AL. Niekoniugowane dendrymery także skompleksowano z DNA i zastosowano jako próbki kontrolne. Wyniki przedstawione na fig. 40 wykazują, że prowadnika docelowego wzmacnia transfekcję komórek HepG2 i AL wytwarzających w wyniku ekspresji receptor trisacharydu galaktozowego.
Przeprowadzono także elektroforezę kompleksów DNA:dendrymer. Na fig. 41 przedstawiono wyniki dla 1 pg DNA skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) z prowadnikami docelowymi lub bez nich, patrz tabela 15.
Tabela ΧΧΙΠ
Ścieżka Stężenie dendrymeru, μΜ
1 sam DNA
2 0,1’
3 0,05’
4 0,025*
5 0,lb
6 0,05b
7 0,025b
a = nie skoniugowany b = skoniugowany
Przy bardzo niskich stężeniach dendrymeru, czyli przy wysokim stosunku ładunków DNA:dendrymer nie tworzą się trwałe kompleksy (jak tego można było oczekiwać), zarówno z nieukierunkowanym, to znaczy nieskoniugowanym dendrymerem, jak i z dendrymerem skoniugowanymz tirsacharydem galaktozowym (patrz ścieżki 3,4,6 i 7). Trwałe kompleksy utworzyły natomiast nieskoniugowane i skoniugowane dendrymery przy odpowiednich stosunkach ładun
181 064 ków (patrz ścieżki 2 i 5, fig. 41). Potwierdza to potencjalną przydatność skoniugowanych dendrymerów w transfekcji ukierunkowanej.
Przykład 25. Wpływ surowicy na transfekcję nieukierunkowaną (fig. 42)
Konieczność stosowania polimerów dendrytowych in vivo zilustrowano w tym przykładzie, w którym usiłowano doprowadzić do transfekcji przy stosowaniu kompleksów DNA:dendrymer G8 (NH3) w surowicy o różnych stężeniach. Wyniki przedstawione na fig. 42 wykazują, że wzrost stężenia surowicy hamuje transfekcję komórek RAT2 kompleksami DNA:dendrymer, nawet w obecności DEAE-dekstranu. W związku z tym należy zastosować inny sposób, np. z wkyorzystaniem prowadnika docelowego, który pośredniczy w przyczepianiu się kompleksów DNA:dendrymer do komórek in vivo.
Przykład 26. Wpływ potencjalnych polimerów dendrytowych oraz innej modyfikacji powierzchni dendrymerów na skuteczność transfekcji (fig. 43)
W przykładzie tym dendrymery G5 i G6 (NH3) skoniugowano z 20 biotynami/dendrymer, 100 pirogronianami/dendrymer i 64 pirogronianami/dendrymer, albo, alternatywnie, zmodyfikowano powierzchnię tak, że 25% powierzchniowych grup aminowych poddano reakcji z kwasem akrylowym. Dendrymery zastosowano następnie do kompleksowania z DNA plazmidu RSV-luc i transfekcji komórek RAT2. Miarą zakresu transfekcji są względne jednostki światła/pg białka. Wszystkie próby transfekcji przeprowadzano w obecności DEAE-dekstranu. Stosunki ładunków dla podstawionych dendrymerów określano przy założeniu, że nie nastąpiło podstawienie ujemnych grup funkcyjnych. Wyniki transfekcji, patrz fig. 43, wskazują, że takie modyfikacje powierzchni nie wpływająniekorzystnie na transfekcję w porównaniu z transfekcją przy zastosowaniu niemodyfikowanego dendrymeru G6 (NH3).
Przykład 27. Trwałość aktywności środka Luciferase™ po transfekcji z udziałem dendrymeru (fig. 44)
W przykładzie tym zmiany w czasie aktywności środka Luciferase™ w komórkach RAT2 transfekowanych kompleksami DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstranu. Aktywność oznaczano po 21, 45, 69 i 141 godzinach. Wyniki przedstawiono na fig. 44.
Zarówno w obecności jak i bez DEAE-dekstranu zakres transfekcji jest zasadniczo zwiększony, zwłaszcza po 21 i 45 godzinach w przypadku DNA skompleksowanego z dendrymerem niż przy transfekcji samym DNA (plazmid kontrolny). Stosunek ładunków w każdym z kompleksów wynosił 1:10. Wyniki są szczególnie uderzające dla transfekcji kompleksem DNA:dendrymer w obecności DEAE-dekstranu po 21 i 45 godzinach. Sugeruje to, że geny są wytwarzane w wyniku ekspresji dłużej przy transfekcji z dendrymerami.
Przykład 28. Cytotoksyczność (fig. 45 i46)
W tym przykładzie przeprowadzono testy w celu określenia cytotoksyczności kompleksów DNA:dendrymer w obecności lub bez DEAE-dekstranu, w stosunku do szeregu różnych typów komórek: komórek RAT2 (fig. 45) oraz komórek Klon 9, NIH3T3,10-1 iCOS7 (fig.46). Na fig. 45 różne liczby przy słupkach oznaczają: 1 oznacza ośrodek kontrolny; 2 oznacza ośrodek kontrolny z DNA; 3 oznacza dendrymer; 4 oznacza dendrymer z DNA; 5 oznacza kontrolny DEAE-dekstran; 6 oznacza kontrolny DEAE-dekstran z DNA; 7 oznacza dendrymer z DEAE-dekstranem; a 8 oznacza dendrymer z DNA i DEAE-dekstranem. Zwykła przeżywalność w hodowli wynosi 90-95%. Kompleksy DNA:dendrymer wywierają nieznaczny wpływ lub nie wywierają wcale wpływu na przeżywalność komórek z wyjątkiem linii komórek. Klon 9, w przypadku której stopień zużywania się komórek w przybliżeniu podwoił się w obecności kompleksów DNA:dendrymer. Dodatek DEAE-dekstran zwiększa w pewnym stopniu cytotoksyczność, ale nie tak, aby powstrzymać się przed wyjątkowo korzystnym użyciem takiej kombinacji in vitro.
Przykład29. Wchłanianie i lokalizacja w komórce radioznaczonego DNA transfekowanego z dendrymerem (fig. 47)
W tym przykładzie radioznaczony DNA (2,9 kb) transfekowano w komórkach RAT2 i U937 z wykorzystaniem dendrymeru G8 (NH3). Ogólne przenoszenie przedstawiono na fig. 47 a-f wraz z określeniem lokalizacji uzyskanym przez frakcjonowanie komórek na części związane z błoną,
181 064 jądrem i cytoplazmą. W ten sposób oznaczono zawartości radioznaczonego DNA osobno w jądrze i w błonie.
Figura 47 a-c dotyczy komórek U937 transfekowanych samym DNA (47a), DNA z dendrymerem (47b) i DNA i dendrymerem i azydkiem sodowym (47c). Ta sama seria transfekcji dla komórek RAT2 przedstawiona jest odpowiednio na fig. 47 d, e oraz f.
Uzyskane wyniki wskazują nie tylko na znaczne przejmowanie przez komórki przy zastosowaniu DNA z dendrymerem, ale również na znaczące przejmowanie przez jądro (fig. 47b oraz e). Zależność modulowanej transfekcji DNA od energii wykazano dodając azydek sodowy (fig. 47 c oraz f), który zmniejsza stopień wchłaniania DNA w przybliżeniu do poziomu obserwowanego wtedy, gdy sam DNA inkubuje się z komórkami (fig. 47 a i d).
Przykład30. Mikrofotografie transfekowanych komórek (fig. 48a, 48b, 49,50a i 50b)
W przykładzie tym wykonano mikrofotografie komórek czerniaka myszy D5 i fibroblastu szczura RAT2 transfekowanych DNA plazmidu RSV-(3-gal z zastosowaniem odpowiednio dendrymerów G11 (EDA) typu gęstej gwiazdy i dendrymerów G8 (NH3) typu gęstej gwiazdy. Komórki, w których zaszła transfekcja, widoczne są jako ciemne (błękitne) komórki na fig. 48-50.
Na figurze 48a przedstawiono transfekcję komórek D5 przeprowadzoną z zastosowaniem kompleksów DNA-dendrymer w ilości 1 pg materiału genetycznego/studzienkę. Na fig. 48b widać więcej komórek transfekowanych, gdy ilość DNA zwiększono do 5 pg/studzienkę. Na fig. 49 pokazano w powiększeniu szereg transfekowanych komórek, w przypadku których zastosowano 3 pg materiału genetycznego/studzienkę.
Na figurze 50a pokazano mikrofotografię komórek fibroblastu szczura RAT2 transfekowanych 3 pg materiału genetycznego/studzienkę. Na fig. 50b pokazano kontrolne, nietransfekowane komórki. Badania wykazały, że znaczna większość komórek w hodowli (50-95%) ulega transfekcji przy stosowaniu kompleksów DNA:dendrymer.
Przykład31. Porównanie różnych sposobów otrzymywania trwale transfekowanych linii komórkowych D5, RAT2 i MSU 1.2 (fig. 52, 53, 54, 55 i 59)
W przykładzie tym przeprowadzono próby transfekcji linii komórkowych D5, RAT2 i MSU 1.2 przy zastosowaniu 5 lub 10 pg/hodowlę plazmidu zawierającego geny odporności na antybiotyk G418 (neomycynę) oraz oporności na β-galaktozydazę lub migromycynę B. Na fig. 52 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek D5 oraz podano ilości DNA plazmidu RSV-P-gal/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:13 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:7.
Na figurze 53 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek RAT2 oraz podano ilości plazmidowego DNA/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:6 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,2 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:3.
5. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:13 oraz
6. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:7.
0,5 pM DEAE-dekstran wprowadzano do ośrodka hodowli po skompleksowaniu materiału genetycznego z dendrymerem.
181 064
Komórki umieszczono w ośrodkach zawierających antybiotyk G418 lub hygromycynę B. komórki te wykazują 24-godzinny cykl podwajania (czyli replikacja następuje co 24 godziny). Po 4 tygodniach hodowle oceniono pod względem liczby klonów, w których następuje ekspresja oporności na G418 i oporności na β-galaktozydazę i/lub higromycynę.
Na figurze 54 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek MSU 1.2 oraz podano ilości DNA plazmidu EBV-A-hygromycyny/studzienkę.
1. 5 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
2. 5 pg w obecności 0,125 pM fosforanu wapniowego
3.5 pg skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:2
4.5 pg skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5
5.5 pg skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10
6.5 pg skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:20
7. 5 pg skompleksowanego z 10 pg środka Lipofectamine™.
Figura 59 ilustruje transfekcję przedatawionąna fig. 52. Porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek D5 oraz podano ilości DNA plazmidu RSV-p-gal/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125 M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:13 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:7
5. 5 pg skompleksowanego z 0,2 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:6.
Należy zwrócić uwagę na wzrost liczby klonów uzyskanych w wyniku transfekcji z dendrymerem.
Figura 55 ilustruje transfekcję linii komórek D5 z wykorzystaniem plazmidu ekspresji ICAM i dendrymeru Gil (DEA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Najpierw wyselekcjonowano klony, w których następuje ekspresja ICAM, wykazujące oporność na neomycynę. Klony oporne na neomycynę zanalizowano techniką sortowania komórek uaktywnionych fluoroscencyjnie (FACS) stosując przeciwciało anty-ICAM skoniugowane z fluoresceiną. Porównano następujące linie komórek i klony:
1. Linia komórek D5, ujemna (nie barwiąca się) względem przeciwciała anty-ICAM
2. Linia komórek IC-21 dodatnio barwiona przez przeciwciało anty-ICAM
3. Klon nr 23 po transfekcji 15 pg DNA z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA: dendrymer 1:10
4. Klon nr 27 otrzymany w sposób opisany powyżej
5. Klon nr 31 otrzymany w sposób opisany powyżej
6. Klon nr 9 otrzymany w sposób opisany powyżej.
Profile dodatnio barwiących się komórek (kropkowane) nałożono na profil ICAM-ujemnej kontrolnej linii komórek D5 (fig. 55a) stosowanej w transfekcji. Wyniki te wykazują, że przy transfekcji kompleksem DNA: dendrymer uzyskać można trwałe linie komórek, w których zachodzi wysoki poziom ekspresji ICAM od transfekowanego genu.
Jak to można zobaczyć na fig. 52,53,54,55 i 59, liczba klonów, w których kontynuowana jest ekspresja zarówno odporności na G418 jak i gen β-galaktozydazy, oporności na hygromycynę i gen dla ICAM po 4 tygodniach, jest znaczna, jeśli transfekcję przeprowadzi się sposobem według wynalazku, to znaczy kompleksując materiał genetyczny z polimerami dendrytowymi, w porównaniu z próbami transfekcji w obecności tylko fosforanu wapniowego, DEAE-dekstranu lub środka Lipofectamine™. Oznacza to, że transfekcja komórek kompleksem DNA: dendrymer j est o wiele bardziej skuteczna niż inne dostępne techniki wytwarzania trwale transfeko wanych linii komórek.
181 064
Przykład 32. Porównanie transfekcji komórek COS 1 i RAT2 z wykorzystaniem różnych dendrymerów i kombinacji dendrymerów przy różnych stosunkach ładunków oraz w trzech różnych warunkach (fig. 61A i 61B).
W tym przykładzie 1 pg RSV-luc/studzienkę skompleksowano z podanymi dendrymerami lub próbkami kontrolnymi w podanych stosunkach ładunków, przedstawionych poniżej w tabeli XXVI.
Tabela XXVI
Nr próbki Środek transfekujący Stosunek obciążenia materiał genetyczny: dendrymer
1 Agregat dendrymerów G8 (NH3) i G8, 5 (NH3) przy stosunku obciążenia G8:G8, 5 50 (próbka 13 z przykładu 23 poniżej) 1:10
2 jak próbka 1 1:20
3 jak próbka 1 1 50
4 Agregat dendrymerów G6 (NH3) i G6, 5 (NH3) przy stosunku obciążenia G6:G6, 5 100 (próbka 8 z przykładu 23 poniżej) 1:10
5 jak próbka 4 1.20
6 jak próbka 4 1:50
7 Próbka Q z przykładu 1, polidyspersyjna mieszanka dendrymerów 1:10
8 jak próbka 7 1:50
9 G10(NH3) 1:20
10 G10(NH3) 1:50
11 Lipofectamme™ Nie dotyczy: stosowany zgodnie z zaleceniami producenta
Powyższe kombinacje zastosowano do transfekcji komórek COSI (fig. 61 A) i RAT2 (fig. 6 IB) w trzech różnych warunkach. We wszystkich przypadkach jako podstawowy ośrodek zastosowano DMEM. W przykładach przedstawionych słupkami zakropkowanymi na fig. 61A i 61B stosowano same kompleksy materiał genetyczny:dendrymer. W przykładach przedstawionych słupkami zakreskowanymi ukośnie transfekcję przeprowadzono w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu. W przykładach przedstawionych słupkami pełnymi transfekcję przeprowadzono w obecności 25 pg/ml chlorochiny.
Wyniki tych doświadczeń wskazują, że skuteczność chlorochiny zależy od transfekowanej linii komórek (fig. 61B); oraz że w przypadku co najmniej pewnych komórek zastosowanie chlorochiny powoduje wyjątkowo wysoką skuteczność transfekcji (fig. 61 A).
Przykład 33. Wytwarzanie agregatów dendrymerów regulowanych zmianami pH oraz zastosowanie tych agregatów w badaniach transfekcji
Agregaty dendrymerów wytworzono z roztworów dendrymerów z końcowymi grupami aminowymi i dendrymerów z grupami karboksylanu sodu. Stosunek różnych dendrymerów stosowanych w tym przykładzie podano poniżej w tabeli XXIV.
Tabela XXIV
Próbka G n, 5 NH3 GnNHj Stosunek obciążenia Gn/Gn, 5
1 2 3 4
1 G6, 5 G6 0,5
2 G6, 5 G6 1
181 064 cd tabeli XXIV
1 2 3 4
3 G6, 5 G6 2,5
4 G6, 5 G6 5
5 G6, 5 G6 10
6 G6, 5 G6 25
7 G6, 5 G6 50
8 G6, 5 G6 100
9 G6, 5 G6 200
10 G6, 5 G8 25
11 G6, 5 G8 50
12 G6, 5 G8 100
13 G8, 5 G8 50
14 G8, 5 G8 100
15 * G6 *
16 * G8 *
* nie dotyczy
Liczba „5” w odniesieniu do generacji (np. G8,5 i G6,5) oznacza, że jest to połówkowa generacja dendrymeru (w tym przypadku połówkowa generacja dendrymerów PAMAM). W połówkowej kondygnacji dendrymery są zakończone karboksylanami, natomiast w pełnej kondygnacji generacji są one zakończone grupami aminowymi.
Typowe wytwarzanie agregatów dendrymerów opisano poniżej. Przygotowano roztwory bazowe dendrymeru G8, 5 (NH3) (2,34% wagowych) i dendrymeru G8 (NH3) (2,28% Wagowych) w buforze TRIS (pH 7,4). Aby uzyskać agregaty dendrymerów o stosunku ładunków 50:1 8,8 mg roztworu dendrymeru G8, 5 (NH3) wymieszano z 15,4 mg roztworu dendrymery G8 (NH3). Uzyskany roztwór rozcieńczono następnie buforem TRIS, tak aby uzyskać 2,0689 g roztworu. Całkowite stężenie roztworu wynosiło 0,74% wagowych. Na fig. 56 przedstawiono aktywność lucyferazy w komórkach RAT2 po transfekcji agregatami dendrymerów. Agregaty utworzone przez dendrymery G6, 5 (NH3) i G8 (NH3) oraz przez dendrymery G8, 5 (NH3) i G8 (NH3) zapewniają znaczny wzrost skuteczności transfekcji w porównaniu z macierzystymi dendrymerami pełnych generacji, jeśli przy wytwarzaniu agregatów zastosuje się w odpowiednim stosunku dendrymery zakończone aminą i dendrymery zakończone karboksylanem sodu.
Przykład 34. Wytwarzanie dendrymerów zmodyfikowanych lizyną i badania transfekcji z wykorzystaniem zmodyfikowanych wektorów dendrymerowych (fig. 57)
Do intensywnie mieszanego roztworu G7 (NH3) (0,50 g, 11 pmoli) w bezwodnym dimetyloformamidzie szybko dodano p-nitrofenylowy ester N,N'-di-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny. Po około 5 minutach pH mieszaniny doprowadzono do około 8,5 za pomocą trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny, po czym powoli dodano jądo intensywnie mieszanej wody. Następnie dodano trietyloaminę (0,6 ml) i nasycony roztwór NaCl (35 ml) do wodnej mieszaniny, którą mieszano przez kolejne 2 dni. Supematant zdekantowano i odzyskany surowy produkt wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 40°C przez 12 godzin. Wysuszony, surowy produkt intensywnie mieszano w eterze etylowym, przesączono i przemyto dodatkową porcjąeteru dietylowego. AnalizaNMR wysuszonego stałego produktu (0,96 g, 78% wydajności) potwierdziła przyłączenie grup N,N'-di-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny do powierzchni dendrymeru.
181 064
Następnie usunięto chroniące grupy tert-butoksykarbonylowe z reszt lizynowych rozpuszczając produkt (0,35 g, 3,3 pmola) w bezwodnym chlorku metylenu i powoli dodając do mieszaniny kwas trifluorooctowy (3 ml). Wydzielające się gazy usunięto z kolby w strumieniu azotu. Po 3 godzinach mieszaninę zatężono w strumieniu azotu (40°C) i próbkę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano na drodze dializy (membrana odcinająca ciężar cząsteczkowy 10 000) przez 24 godziny względem 1 litra wody. Po usunięciu stałych cząstek przez filtrację i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem oddzielono bezbarwną substancję stałą (0,26 g, 69% wydajności). Analiza produktu metodami spektroskopii Ή i 13C rezonansu magnetycznego jądrowego, chromatografii wykluczenia według wielkości, elektroforezy kapilarnej i elektroforezy na żelu poliakryloamidowym potwierdziły prawidłową strukturę.
Na figurze 56 względne jednostki światła/pg uzyskanego białka dla transfekcji w komórkach RAT2 z wykorzystaniem dendrymeru G7 (NH3) zmodyfkowanego lizyną z niemodyfikowanymi dendrymerami od G7 (NH3) do G10 (NH3) (we wszystkich przypadkach przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10 i w obecności DEAE-dekstranu). Dendrymer modyfikowany lizyną zapewnia nieoczekiwanie wysoką skuteczność transfekcji w porównaniu z niemodyfikowanym dendrymerem tej samej generacji, a w rzeczywistości skuteczność transfekcji jest zbliżona do transfekcji dla niemodyfikowanego dendrymeru G10 (NH3)
Przykład 35. Skuteczność transfekcji w liniach komórek COS 1 i RAT2 z wykorzystaniem polidyspersyjnych mieszanin dendrymerów (fig. 58).
W przykładzie tym DNA skompleksowano z dendrymerem Gil (EDA), mieszaninądendrymerów G11, G3, G2 i G1 (EDA) oraz polidyspersyjnąmieszaniną dendrymerów o składzie podanym poniżej w tabeli XXV.
Tabela XXV
Próbka Dendrymer lub kontrolna Stosunek obciążenia DNA.dendrymer
1 Gil (EDA) 1:10
1 Gil (EDA) 1:20
1 Gil (EDA) 1:100
2 Mieszanina 1 (EDA)” 1:10
2 Mieszanina 1 (EDA)’ 1:20
2 Mieszanina 1 (EDA)’ 1100
3 Mieszanina 2 (EDA)b 110
3 Mieszanina 2 (EDA)b 1:20
3 Mieszanina 2 (EDA)b 1.100
4 Qc 1:10
4 Qc 1:20
4 Qc 1:100
5 Lipofectamme™ 6 □ L
5 Lipofectamine™ 10 □ L
a = mieszanina dendrymerów G1 (EDA), G2 (EDA) i G3 (EDA) b = mieszanina 90% G11 (EDA) i 10% mieszaniny 1 c = mieszanina dendrymerów opisanych w przykładzie 42, polidyspersyjną mieszanka dendrymerów
Uzyskane wyniki transfekcji z wykorzystaniem tych kompleksów przedstawiono na fig. 58. W komórkach COS 1 skuteczność transfekcj i osiągnięta w przypadku polidyspersyjnej mieszani
181 064 ny była o wiele wyższa niż przy zastosowaniu Gil (EDA), mieszanki G11, G1, G2 i G3 (EDA) lub Lipofectamine™. Różnica jest szczególnie duża przy stosunkach ładunków 1:10 i 1:20. Jednakże porównanie wyników dla linii COSI i RAT2 wykazuje różnice w skuteczności transfekcji dla dwóch rodzajów komórek przy zastosowaniu preparatów dendrymerów tego samego typu. Tak np. okazało się, że polidyspersyjna mieszanka (dendrymer Q z przykładu 1 jest mniej skuteczny w transfekcj i komórek RAT2 niż COS 1. Właściwość ta może być przydatna w przenoszeniu genów.
Przykład 36 (fig. 60, zdjęcia 1 i 2)
W celu sprawdzenia, czy kompleksy DNA:dendrymer można zastosować do transfekcji komórek in vivo komórki czerniaka D5 zaszczepiono podskórnie jednorodnych myszy. Do nowotworów o średnicy około 0,5 cm, które rozwinęły się, wstrzyknięto bezpośrednio DNA RSV-p-gal, sam lub w postaci skompleksowanej z dendrymerem Gil (EDA), a także sam dendrymer w próbie kontrolnej. Po 24 godzinach zwierzęta uśmiercono i nowotwory utrwalono formaliną, wycięto i zabarwiono środkiem X-gal, aby wykryć ekspresję enzymu β-galaktozydazy. Na fig. 60, zdjęcie 1 zaobserwować można znaczne ilości komórek wykazujących zajście transfekcji (barwienie X-gal) w nowotworze, w który wstrzyknięto kompleks DNA:dendrymer w porównaniu z zabarwieniem tła (nowotwór z wstrzykniętym dendrymerem, zdjęcie 2). W przypadku żadnego z nowotworów nie zaobserwowano toksyczności lub uszkodzenia tkanki. Barwienie nowotworów, którym wstrzyknięto sam DNA, nie wykazało ekspresji, co wskazuje, że transfekcja in vivo ulega wzmocnieniu poprzez zastosowanie kompleksów DNA: dendrymer.
Przykład37. Porównanie aktywności środka Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji opartymi na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzionymi dendrymerami oraz dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) typu gęstej gwiazdy
W przykładzie tym porównano pod względem zdolności do transfekcji oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery z dendrymerami typu gęstej gwiazdy. Oparte na lizynie dendrymery wytworzono zasadniczo sposobami podanymi w patentach USA nr 4 289 872, 4 360 646 i 4 410 688. Przeprowadzono próby transfekcji w obecności i bez DEAE-dekstranu. Stosunek ładunków DNA:dendrymeru we wszystkich przypadkach wynosił 1:5. Zastosowano taką ilość kompleksu DNA:dendrymer, aby wprowadzić 1 pg DNA/studzienkę. W kolumnach 1-16 zastosowano następujące dendrymery.
1. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G1 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie
2. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G2 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie 3. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G3 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie 4. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G4 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie 5. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G5 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie 6. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G1 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
7. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G2 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
8. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G3 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
9. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G4 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
10. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G5 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
11. Sól trifluorooctanowa niesymetiycznie rozgałęzionego dendrymeru G6 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
12. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G7 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
13. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G8 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie
181 064
14. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G8 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie, nie będący w formie soli trifluorooctanowej;
15. Dendrymer G8 (NH3) typu gęstej gwiazdy; oraz
16. Dendrymer G11 (EDA) typu gęstej gwiazdy.
Jak można stwierdzić z fig. 62, oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery zapewniają znaczącą transfekcję przy generacjach G4 i G5, zwłaszcza przy rdzeniu TREN. Wydaje się, że sole trifluorooctanowe niesymetrycznie rozgałęzionych dendrymerów hamują transfekcję w przypadku dendrymerów z rdzeniem BHA. Okazało się, że dendrymer G8 z rdzeniem BHA w nieobecności soli trifluorooctanowej zapewnia dobrą transfekcję.
Podobnie jak w przypadku dendrymerów typu gęstej gwiazdy również oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery zapewniają doskonałą transfekcję przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5 w obecności DEAE-dekstranu.
Inne rozwiązania według wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z opisem lub realizacji ujawnionego wynalazku. Cele opisu i przykładów należy przyjmować jedynie przykładowo, a rzeczywisty zakres i istotę wynalazku podano w poniższych zastrzeżeniach.
FIG. 2 (A) (B)
. z' Z' \ X . < Ν’! 4
ZL 7 1 7. \ X ?
Z-X-Z-X '
Z1- x-ZX-z $ z^x-z,xY \ . x- Zz-X 2^χχχ-ζ'χ r τ 7· £ xz z' .
V Ź/ X'Z 7' *,χ/ /V * .-Z-X'z >
Z''
X » z ,ζχΖ (I)
Z' z1 z‘
ZĆ-χ-Ζ’ X- X 7' Z<y
X X-7x ।
X.Z/ ΔΧ-Ζ
Χ7-χ-ζΤχ-ζ' S x Z1 \-χ-ζ· 'X-Z'
181 064
181 064
CZAS(SEKUNDY)
FIG. 4
GENERACJA DODANEGO DENDRYMERU PAMAM STARBURST
181 064
OROWEJ
CZAS W GODZINACH
181 064 % LEKU W PRZEDZIALE RECEPTOROWYM
FIG.6
CZAS W GODZINACH
181 064
CZAS W GODZINACH
181 064 % LEKU W PRZEDZIALE RECEPTOROWYM
FIG.8
CZAS (GODZINY)
181 064 ιοοτ FIG. 9 donorowym
FIG JO
CZAS (GODZINY)
181 064
FIG. II
Czas (sekundy)
Generacja dodanego dendrymeru PAMAM Starburst
181 064
Numer próbki
Względne jednostki światła/pg białka
181 064
123456789 10 11 1213 141516
1718 19 20 21 22 23 2425 26 2728 29 30 31 32
FIG. lo
FIG.I4
Procent wzrostu transfekcji w stosunku do dekstranowej próby kontrolnej
45000
40000
35000
30000
25000
20000
I5000
I0000
5000
I 23 4 5 6789 ΙΟ II
Generacja dendrymeru •----« Rdzeń NH, ----- Rdzeń EDA
181 064
FIG.15
Względne jednostki światła/pg białka
DNA skompleksowany z dendrymerem G9 a następnie dodanym dendrymerem G5
DNA skompleksowany z dendrymerem G5a następnie dodanym dendrymerem G9
181 064
FIG.16
μΜ
Stężenie drugiego dendrymeru
DNA skompleksowany z dendrymerem G9 a następnie dodanym dendrymerem G5
DNA skompleksowany z dendrymerem G5 /// a następnie dodanym dendrymerem G9
FIG. 17
Względne jednostki światła (na pg białka)
6000000
5000000 40000003000000 20000001000000 1 I-1—— i— i— i — Γ I — r —π Ί — —L·TJ— —łT 1 i ‘—1
3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18
Numer próbki
181 064
FIG.I8
FIG.I9
Względne jednostki światła/ug biaŁka
IOOOOOO
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
JKLMNOPOR
S RSVa
O -........
abcdefgh
Typ dendrymeru i stos\inek DNA·dendrymer
181 064
2 34 5 678910111213141516
FIG. 20
FIG.2I λ: φ \Ο Ε Ο Λ!
900 7 800 ή
700 ή
600 ή 500400
300 4
HOURS GODZINY
200 Ι00
Ο 4 • 23 bp ss DNA —<— DNA/ Dendrymer G8 NH^ —DNA/Dendrymer G8 NH, plus NaN, 5
181 064
10000000 9000000 8000000 7000000 6000000
5000000 4000000 3000000 2000000 I000000 o
G8 G8 Git Gil G8 G8 Gil Gil
3 4 5 6 7 8
FIG.22
bez DEAE- dekstran
0.5μΜ DEAE- dekstran
FIG. 23A
FIG. 23B
181 064
FIG 24
181 064
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415161718 19 20
FIG. 25
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
FIG. 26A
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
FIG 26B
181 064
2 3 4 5 6 7
FIG. 28
FIG. 29
Q.Q σ» o cn n tn a o M.
<9
IJOO ijo 15'
1.100 i:io
IZ! 3
20pg Ξ i:ioo (Ί0 15 i:ioo no 115 i:i a
2Opg_IJOO no 15
III00 E i:io‘e 15 I
III Ί 20jjg :
^fojjgDNA] * 5^gDNA Q £ I JigDNA Ό ·“»
O s^OpgDNA <o c5 jjgDNA cajd | jjgDNA
3) <u a c OJ
1x1 <υ
O o o o CJ
O O O O o o o o o <o o o o 00
O O O o o o o o o o o <o
Względne jednostki światła na pg białka
181 064
18000000
FIG. 30
Względne jednostki światła na pg białka
16000000
14000000
12000000
10000000 θοοοοοσ
6000000
4000000
2000000
a o4 0.0001 0.001 001 0.1 μΠΧ! 11 f|I I inni 10 100 1000
Stosunek ładunków DNA:dendrymer
G9 EDA
O G9 EDA+DEAEDextran dekstran
O G9 NH3 + DEAEDextran dekstran
G9 NH3
30000000
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000 O
I 0.1 0.01
FIG.3I
Stosunek ładunków DNA:dendrymer
- ·- G8NH3
-A- Gil EDA
CD (0
Λ i ^2000000
CO w4 ^OOOOOOO
Λί «ΘΟΟΟΟΟΟ o c
Ό ^OOOCOO
Φ »4000000 rH
N *2000000
FIG. 32
O <0 K> <M to m jn i p. □ θ B p
Stosunek ładunków DNA:dendrymer —A— DEAE- dekstran
Roztwór soli z buforem Hanksa %o
FIG. 33 a o
stosunek ładunków I I
stosunek ładunków I 5 stosunek ładunków blO
181 064
Względne jednostki światła/pg białka
FIG. 34
1600000014000000ή 12000000-] 10000000ή 6000000ή 60000004 4000000-] 20000004 0-
to o to ±3 LU
Stosunek ładunków DNA/Dendrymer dekstran bez dekstranu
181 064
Plazmid
Ιθθ Plazmid 50
IO
I 10 IΊ 5 to OJ o
LOS ΓΟΟ to d
J- 100 Plazmid β I 50
I 10 <15 kontr.
kontr.
kontr.
Plazmid kontr 1 I -100 Plazmid kontr
Ó 50
Γ| 10
Ί 5
Stężenie DEAE-Dekstranu
CM
I 100 Plazmid kontr.
MM| 50 mm 110
1-5 o o o o o o to OJ
O O O O
CM o to
O O O o o o o o to
Względne jednostki światła na gg białka
FIG. 36
Względne jednostki światła na pg białka
181 064
1(20 pg)
1(2 pg)
FIG. 37 ////7////7/7///7/7777/77/777777/77777
7ZZZZZZZZZZZZ7 ////////7777/7777777777/77////////7/7777/
Numery próbek
7////////////7/7/Λ zŹ NRK52E
1(20 pg)
1(2 pg)
100000 200000 30000 40000 500000 600000 700000
Η Y82
Względne jednostki światła (na pg białka)
181 064 tn χ z co o
0) e
Ό C <D
O
1XXXXX>O<X>CKX><X^
ΓΟ
Ο
I 10
1-5
I I
25μΙ Ι2.5μΙ 2μΙ
CIO
I I
DEAE
20μΙ ΙΟμΙ
2μΙ ΙΊΟ
Γ5
I I
Dekstran kontrolny
Stosunek ładunków Iufc> dawka
O o O O o o q Plazmid
o o o O o o
o o o o o o
o o o o o o
o o o o o o
o o o o o o
o m o lO o 1O
m OJ CM ——
kontrolny
Względne jednostki światła (na gg białka)
181 064
względne jednostki światfe/ug białka
Mzględne Jednostki światła na με białka
FIG.40
Status receptora:
Skoniugowane dendrymery
Niekoniugowane dendrymery
181 064
3 4 5 67
FIG. 41
FIG.42
Względne Jednostki światła na gg białka
450000 -q—i i i ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι i r
400000 4;
350000 4I
3000004:
250000 4:
200000 4 ;;
1500004 Π ।:
1000004 t
50000 4 ί :a
Stężenie surowicy
05 pM G8NH3
5 pM G8NH3
Cg] 0.1 pM G8NH3 bez dendrymeru
FIG.43
Kwas akrylowy
Kwas akrylowy kwas akrylowy pirogronianów pirogronianów biotyn
O
O in in tn ro
ID
CM
O OJ % Wzrostu w stosunku do plazmidu kontrolnego
181 064
FIG. 44
Transfekcję bez DEAE-dekstranu
Transfekcję z EEAE-dekstranem
Czas od transfekcji do zbioru godzin ?\ 45 gpdzin godzin
141 godzin
FIG. 45
Dendrymer
Dendrymer-DEAE Dekstran
N ii <n
- ' PRÓBA KONTROLNA —— 16 75/jgG8EDA --- 335/jgG8 EDA ---j6 5/igG8NH3 ---33/jgG8 NH3 mm PRÓBA KONTROLNA — J6.75/jgG8 EDA mm 3.35jugG8 EDA — 16.5/jgGS NH3 — 33/jgG8 NH3 ---PRÓBA KONTROLNA = J675/igG8EDA ---_3 35/jg G8 EDA = ’l&5/igG8NH3 = ~33juqG8NH3
PRÓBA KONTROLNA «j675/jgG8EDA
- 3.35/jgG8EDA mi !65/jgG8NH3 — J3/jgG8NH3 ---próba kontrolna --- 1675/jgG8EDA --- 3.35jUgG8EDA = l65,ugG8NH3 --- 3.3/jgG8 NH3 MM próba kontrolna mm !675jugG8EDA mm 3.35pgG8EDA mm l6.5/jgG8NH3
-43-3/jgG8NH3 próba kontrolna
IG75jugEDA 335/jgG8EDA l6 5jugG8 NH3 _33ajqG8 NH3
PRÓBA KONTROLNA J675jug EDA
3.35/ig G8 EDA !6 5jugG8NH3 _3 3jugG8NH3
FIG. 46
% Obumarłych komórek
FIG. 47A FIG. 47B FIG. 47C
c •H N Ό
O U
Cpm/104 komórek
a fu KO
O ίέ
KO s o
10^ cpm/104 komórek
ΓΌ Z
10^ cpm/IO^ komórek
48Α
48Β
FIG 49
FIG 5OA
FIG 5OB
181 064
FIG. 5ΙΑ
F1G.5IC
181 064
Liczba Klonów
FIG.52
Klony oporne na g418
Klony wytwarzające Beta- galaktozydazy
FIG.53
901
Numer doświadczenia
Klony oporne na G418
Klony, w których zachodzi ekspresja Beta- galaktozydazy
181 064
FIG.54
Numery próbek
181 064
F I G.55A o
Ό S O
Φ .o e o Λί co x>
N O
FIG.55B
181 064
F I G.55C
G>
\O B O (O
N O
200η----------------------------160; Klon ICAM Nr 23
120
Klon ICAM Nr 23
F I G.55D
Ι60τ κίοη ICAM Nr 27
X ω to B O
120η
8040η ο+ ιο'
I01
ΙΟ2
ΙΟ3
ΙΟ4
181 064
OJ \O a o
G3
X) N ϋ
FIG.55E
F I G.55F
0) νθ s o
X) N O
181 064
Względne jednostki światła na gg białka
FIG.56
Próbki
181 064
Względne jednostki światła na ng białka
FIG.57
Próbki
181 064
FIG.58
Względne jednostki światła na 3 pg białka komórkowego
181 064
181 064
FIG 6OA
181 064
FIG 60B
181 064
FIG.6IA
O -Sam OMEM □ 0.5 μΜ DEAE-dekstran
Mg/ml chlorochiny
FIG.6IB
Względne jednostki światła na 3 Mg białka
Π Sam DMEM
S P-5 μΜ DEAE-dekstran ® 25 μβ/πΐ chlorochiny
181 064
Względne jednostki światła na gg białka z DEAE-dekstran
181 064
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 6,00 zł

Claims (76)

Zastrzeżenia patentowe
1. Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, zawierający polimer i modyfikator odpowiedzi biologicznej, znamienny tym, że jako polimer zawiera co najmniej jeden dendrymer zasocjowany z co najmniej jedną jednostką materiału genetycznego jako modyfikatorem odpowiedzi biologicznej, przy czym dendrymer stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącąz rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, przy czym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100.
181 064
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o
181 064 podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe.
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, przy czym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100, pod warunkiem, że materiał genetyczny zachowuje swą skuteczność.
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczko-
181 064 wy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, przy czym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100, pod warunkiem, że materiał biologiczny zachowuje swą skuteczność.
2. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dwa lub więcej materiałów genetycznych.
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, przy czym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100.
3. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał genetyczny rozciąga się między wieloma cząstkami polimeru typu gęstej gwiazdy i służy do ich łączenia.
4. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer typu gęstej gwiazdy zawiera w przewadze powierzchniowe aminowe grupy funkcyjne.
5. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer typu gęstej gwiazdy wykazuje w przekroju jeden wymiar wynoszący co najmniej około 5 nm, przy czym wymiar ten stanowi najwęższy wymiar polimeru typu gęstej gwiazdy.
6. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od 1:1 do 1:15.
7. Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy o wzorze (TMP)x*(M)y (II) w którym każdy z P oznacza polimer typu gęstej gwiazdy;
x oznacza liczbę całkowitą równą I lub większą każdy z M oznacza co najmniej jedną jednostkę materiału genetycznego, które mogą być takie same lub różne;
y oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub większą każdy z T oznacza jeden lub więcej prowadników docelowych;
e oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub większą a * oznacza, że materiał genetyczny jest zasocjowany z polimerem typu gęstej gwiazdy; przy czym polimer typu gęstej gwiazdy stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku promieniowo symetryczny polimer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która zawiera co najmniej jedną grupę końcową z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
8. Kompleks według zastrz. 7 o wzorze [(WmWm (III) gdzie każdy z C oznacza taką samą lub różną grupę łączącą każdy z C° oznacza taką samą lub różną grupę łączącą każdy z g oraz k niezależnie oznacza liczbę całkowitą 1 lub większą e oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub większą każdy z f oraz h niezależnie oznacza liczbę całkowitą 0 lub większą
- oznacza wiązanie kowalencyjne w przypadku, gdy grupa łącząca występuje;
każdy z P oznacza polimer typu gęstej gwiazdy;
x oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub większą
T oznacza prowadnik docelowy;
każdy z M oznacza co najmniej jednąjednostkę materiału genetycznego;
y oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub większą * oznacza, że materiał genetyczny jest zasocjowany z polimerem; przy czym polimer typu gęstej gwiazdy stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku promieniowo symetryczny polimer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
9. Kompleks według zastrz. 8, znamienny tym, że dendrymer stanowi poliamidoamina lub polialkilenoimina.
10. Kompleks według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że prowadnik docelowy T, stanowi poliklonalne lub monoklonalne przeciwciało lub jego fragment.
11. Kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego zasocjowanego z co najmniej jednąjednostkąmateriału genetycznego i dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik, przy czym polimer dendrytowy zawiera dodatnie powierzchniowe grupy funkcyjne na znacznej części powierzchni polimeru, a materiał genetyczny i polimer dendrytowy są skompleksowane w stosunku ładunków od 10:1 do 1:100, a ponadto polimer dendrytowy zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która zawiera co najmniej jedną grupę końcową z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że dodatnie powierzchniowe grupy funkcyjne utworzone są przez grupy aminowe na powierzchni polimeru dendrytowego.
13. Kompozycja według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że polimer dendrytowy stanowi dendrymer z dodatnimi grupami funkcyjnymi na co najmniej 75% powierzchni.
14. Kompozycja według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym w roztworze z DEAE-dekstranem lub gliceryną.
15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym stosunek ładunków materiału genetycznego i polimeru dendrytowego wynosi od 1:1 do 1:15.
16. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, ze stosunek ładunków materiału genetycznego i polimeru dendrytowego wynosi od 1:5 do 1:10.
17. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, ze kompleks jest w roztworze z dodatkiem DEAE-dekstranu w stężeniu od 0,125 do 2 μΜ.
18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że stężenie DEAE-dekstranu w kompozycji wynosi od 0,25 do 1 μΜ.
19. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że kompleks jest w roztworze z dodatkiem gliceryny w stężeniu od 2,0 do 10,0% objętościowych.
20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że kompleks jest w roztworze z dodatkiem gliceryny w stężeniu od 2,0 do 5,0% wagowych.
21. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera ponadto DMSO.
22. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera ponadto chlorochinę.
23. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że materiał genetyczny i polimer dendrytowy są skompleksowane w stosunku ładunków od 1:1 do 1:15.
24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że materiał genetyczny i polimer dendrytowy są skompleksowane w stosunku ładunków od 3:1 do 1:10.
25. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks, w któiym z polimerem dendiytowym jest połączony prowadnik docelowy.
26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym w postaci roztworu z dodatkiem DEAE-dekstranu lub gliceryny.
27. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym prowadnik docelowy stanowi poliklonalne lub monoklonalne przeciwciało lub jego fragment.
28. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym prowadnik docelowy stanowi trisacharyd galaktozowy, biotyna, kwas pirośluzowy, insulina lub awidyna.
29. Kompozycja według zastrz. 11 albo 25, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym polimer dendrytowy jest w postaci cząstek o wymiarach od 2 nm w najwęższym wymiarze do 100 nm w największym wymiarze.
30. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego, który stanowi dendrymer typu gęstej gwiazdy o zasadniczo sferycznej, elipsoidalnej lub prętowej konfiguracji.
31. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego, który jest w postaci agregatów dendrymerów o dodatnich powierzchniowych grupach funkcyjnych i dendrymerów o ujemnych powierzchniowych grupach funkcyjnych przy stosunku ładunków dodatnich do ujemnych od 25:1 do 100:1.
181 064
32. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym polimer dendrytowy stanowi polimer typu gęstej gwiazdy zawierający aminokwasy na znacznej części powierzchni oraz zasadniczo tylko na powierzchni.
33. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że aminokwas stanowi lizyna lub arginina.
34. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks, w którym polimer typu gęstej gwiazdy stanowi kolekcja dendrymerów typu gęstej gwiazdy z mostkami.
35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że materiał genetyczny rozciąga się między wieloma cząstkami polimeru typu gęstej gwiazdy i łączy cząsteczki polimeru.
36. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego, który stanowi dyspersję cząstek dendrymeru o różnych wielkościach w zakresie od cząstek o średnicy wynoszącej zaledwie 2 nm w najmniejszym wymiarze do cząstek o średnicy 11 nm, przy czym dyspersja zawiera inne cząstki o pośrednich średnicach.
37. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że materiał genetyczny jest skompleksowany z pierwszym polimerem dendrytowym, który został umieszczony w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, przy czym drugi polimer dendrytowy ma cząstki większe niż pierwszy polimer dendrytowy.
38. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że pierwszy i drugi polimer dendrytowy stanowi polimer typu gęstej gwiazdy.
39. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że pierwszy polimer dendrytowy ma cząstki o średnicy w najwęższym wymiarze od 2,2 do 5 nm, a drugi polimer dendrytowy zawiera cząstki o średnicy w najwęższym wymiarze od 5 nm do 100 nm.
40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że jeden lub obydwa spośród pierwszego i drugiego polimeru dendrytowego stanowią dendrymery o kształcie kulistym.
41. Kompozycja według zastrz. 40, znamienna tym, że zarówno pierwszy jak i drugi polimer dendrytowy stanowi dendrymer o kształcie kulistym.
42. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kompleks polimeru dendrytowego, który stanowi niesymetrycznie rozgałęziony polimer dendrytowy.
43. Kompozycja według zastrz. 42, znamienna tym, że monomeryczny blok konstrukcyjny niesymetrycznie rozgałęzionego polimeru dendrytowego stanowi aminokwas.
44. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że aminokwas stanowi lizyna lub arginina.
45. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera ponadto chlorochinę.
46. Sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym, znamienny tym, że:
poddaje się reakcji dendrymer z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku w temperaturze ułatwiającej kompleksowanie materiału genetycznego z polimerem dendrytowym, a ponadto ewentualnie umieszcza się kompleks w roztworze DEAE-dekstranu lub gliceryny, przy czym jako dendrymer stosuje się co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że przyłącza się prowadnik docelowy do polimeru dendrytowego przed jego kompleksowaniem z materiałem genetycznym.
48. Sposób według zastrz. 46 albo 47, znamienny tym, że polimer dendrytowy charakteryzuje się przeważające kationową powierzchnią, a materiał genetyczny przyłącza się elektrostatycznie do dendrymeru w celu wytworzenia kompleksu.
49. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że:
miesza się w wodzie materiał genetyczny w ilości wystarczającej do uzyskania jego końcowego stężenia od 1 do 10 pg/ml z wystarczającą ilością polimeru dendrytowego zawierającego dodatnie powierzchniowe grupy funkcyjne, tak aby uzyskać stosunek ładunków materiału genetycznego do polimeru dendrytowego od 1:1 do 1:100; przy czym mieszanie przeprowadza się przy pH od około 5 do około 10 w temperaturze od około 20 do około 40°C.
50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że do kompleksu po jego wytworzeniu dodaj e się DEAE-dekstran w takiej ilości, aby uzyskać stężenie DEAE-dekstranu od 0,125 do 2 μΜ.
51. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że stosunek ładunków wynosi od 1:1 do 1:15.
52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że stosunek ładunków wynosi od 1:5 do 1:10.
53. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że dodaje się DEAE-dekstran w takiej ilości, aby uzyskać stężenie DEAE-dekstranu od 0,25 do 1 μΜ.
54. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że polimer dendrytowy ma cząstki o średnicy od 5 nm w najwęższym wymiarze do co najwyżej 100 nm.
55. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że polimer dendrytowy stanowi dyspersję cząstek dendrymeru o różnych wielkościach w zakresie od cząstek o średnicy wynoszącej zaledwie 2 nm w najmniejszym wymiarze do cząstek o średnicy 11 nm, przy czym dyspersja zawiera inne cząstki o pośrednich średnicach.
56. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że polimer dendrytowy zawiera agregaty dendrymerów o dodatnich powierzchniowych grupach funkcyjnych i dendrymerów o ujemnych powierzchniowych grupach funkcyjnych przy stosunku ładunków dodatnich do ujemnych od 25:1 do 100:1, przy czym średnice agregatów wynoszą nie więcej niż około 100 nm.
57. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że polimer dendrytowy stanowi polimer typu gęstej gwiazdy zawierający aminokwasy na znacznej części powierzchni oraz zasadniczo tylko na powierzchni.
58. Sposób według zastrz. 57, znamienny tym, że aminokwas stanowi lizyna lub arginina.
59. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że polimer dendrytowy ma względnie małe cząstki dendrymeru o średnicy od 2,2 nm do 5 nm w najmniejszym wymiarze; a ponadto po wytworzeniu kompleksu dodaje się polimery dendrytowe, których cząstki mają średnicę od 5 nm do 11 nm w najmniejszym wymiarze.
60. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że do cząstek polimeru dendrytowego przyłącza się prowadnik docelowy.
61. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że do kompleksu po jego wytworzeniu dodaje się glicerynę w takiej ilości, aby uzyskać stężenie gliceryny od 2 do 10% wagowych.
62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że stężenie gliceryny wynosi od 2 do 5% wagowych.
63. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, ze polimer dendrytowy ma cząstki o średnicy od około 5 nm w najwęższym wymiarze do co najwyżej około 100 nm.
64. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że przy wytwarzaniu stężonego kompleksu materiału genetycznego z polimerem dendrytowym, który można rozcieńczać przy stosowaniu, miesza się w wodzie materiał genetyczny w ilości wystarczającej do uzyskania stężenia od 1 do 10 pg/20 μΐ z wystarczającą ilością polimeru dendrytowego zawierającego dodatnie powierzchniowe grupy funkcyjne, aby uzyskać stosunek ładunków materiału genetycznego do po limem dendrytowego od 1:1 do 1:100; przy czym mieszanie przeprowadza się przy pH od 5 do 10 w temperaturze od 20 do 40°C.
65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że stosunek ładunków wynosi od 1:1 do 1:15.
181 064
66. Sposób według zastrz. 65, znamienny tym, że stosunek ładunków wynosi od 1:5 do 1:10.
67. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że poiimer dendrytowy ma cząstki o średnicy od około 5 nm w najwęższym wymiarze do co najwyżej około 100 nm.
68. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że polimer dendrytowy stanowi dyspersję cząstek dendrymeru o różnych wielkościach w zakresie od cząstek o średnicy wynoszącej zaledwie około 2 nm w najmniejszym wymiarze do cząstek o średnicy około 11 nm, przy czym dyspersja zawiera inne cząstki o pośrednich średnicach.
69. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że polimer dendrytowy zawiera agregaty dendrymerów o dodatnich powierzchniowych grupach funkcyjnych i dendrymerów o ujemnych powierzchniowych grupach funkcyjnych, przy stosunku ładunków dodatnich do ujemnych od 25:1 do 100:1, przy czym średnice agregatów wynoszą nie więcej niż około 100 nm.
70. Sposób według zastrz. 68, znamienny tym, że polimer dendrytowy stanowi polimer typu gęstej gwiazdy zawierający aminokwasy na znacznej części powierzchni oraz zasadniczo tylko na powierzchni.
71. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że aminokwas stanowi lizyna lub arginina.
72. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że do cząstek polimeru dendrytowego przyłączony jest prowadnik docelowy.
73. Sposób według zastrz. 72, znamienny tym, że polimer dendrytowy zawiera stosunkowo małe cząstki dendrymeru o średnicy od 2,2 nm do 5 nm w najmniejszym wymiarze; a ponadto po wytworzeniu kompleksu dodaje się polimery dendrytowe zawierające cząstki o średnicy od 5 nm do 11 nm w najmniejszym wymiarze.
74. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że:
kompleksuje się materiał genetyczny z pierwszym polimerem dendryto wym poddając reakcji polimer z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku w temperaturze ułatwiającej asocjację materiału genetycznego z polimerem; oraz umieszcza się kompleks w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, który ma cząstki większe niż pierwszy polimer dendrytowy.
75. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że przyłącza się przewodnik docelowy do polimeru dendrytowego przed jego kompleksowaniem z materiałem genetycznym.
76. Sposób według zastrz. 74 albo 75, znamienny tym, że polimer dendrytowy charakteryzuje się przeważająco kationową powierzchnią a materiał genetyczny przyłącza się elektrostatycznie do polimeru dendrytowego w celu wytworzenia kompleksu.
* * *
PL95311633A 1994-03-07 1995-03-07 Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy PL181064B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20749494A 1994-03-07 1994-03-07
US31653694A 1994-09-30 1994-09-30
PCT/US1995/003045 WO1995024221A1 (en) 1986-08-18 1995-03-07 Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL311633A1 PL311633A1 (en) 1996-03-04
PL181064B1 true PL181064B1 (pl) 2001-05-31

Family

ID=26902287

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95311633A PL181064B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy
PL95335982A PL182237B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95335982A PL182237B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5714166A (pl)
EP (1) EP0699079B1 (pl)
JP (1) JPH08510761A (pl)
KR (1) KR100357839B1 (pl)
AT (1) ATE277640T1 (pl)
AU (1) AU2118195A (pl)
CA (1) CA2161684C (pl)
DE (2) DE69533569T2 (pl)
ES (1) ES2104518T1 (pl)
FI (1) FI955320A (pl)
GR (1) GR970300044T1 (pl)
IL (7) IL128773A (pl)
MX (1) MX9504664A (pl)
NO (1) NO317691B1 (pl)
PL (2) PL181064B1 (pl)
RU (1) RU2127125C1 (pl)
WO (1) WO1995024221A1 (pl)
ZA (1) ZA951877B (pl)

Families Citing this family (301)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3938992A1 (de) 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
US6113946A (en) * 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
JP4074658B2 (ja) * 1992-04-03 2008-04-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 自己構築ポリヌクレオチド送達システム
US6537579B1 (en) 1993-02-22 2003-03-25 American Bioscience, Inc. Compositions and methods for administration of pharmacologically active compounds
US20070117862A1 (en) * 1993-02-22 2007-05-24 Desai Neil P Novel formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
WO1996019240A1 (en) * 1994-12-21 1996-06-27 Novartis Ag Oligonucleotide-dendrimer conjugates
US6165988A (en) * 1995-02-10 2000-12-26 Christian Noe Medicament in particulate form
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US7141676B1 (en) * 1996-02-08 2006-11-28 University Of Washington Water soluble multi-biotin-containing compounds
JP2000508322A (ja) * 1996-04-15 2000-07-04 エヌワイエムオーエックス コーポレーション バクテリオファージを含有する組成物および感染症を治療するためのバクテリオファージの使用方法
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040171031A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US6893664B1 (en) * 1996-06-17 2005-05-17 Powderject Research Limited Particle delivery techniques
DE19726340C2 (de) * 1996-08-16 1999-05-06 Schering Ag Zinndendrimere, ihre Verwendung als Röntgenkontrastmittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US20050003431A1 (en) * 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
GB9623051D0 (en) * 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
WO1998037902A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 The Regents Of The University Of California Inhibition of cell-cell binding by lipid assemblies
ATE484541T1 (de) * 1997-04-21 2010-10-15 California Inst Of Techn Multifunctionelle polymer-beschichtung
HU230338B1 (hu) * 1997-06-27 2016-02-29 Abraxis Bioscience Llc Gyógyászati hatóanyagokat tartalmazó új készítmények, eljárás ilyen készítmények előállítására és alkalmazására
DE19728954C1 (de) * 1997-06-30 1999-04-22 Schering Ag Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
CA2242035C (en) * 1997-07-01 2004-11-23 Transgene S.A. Compositions useful for transferring therapeutically active substances into a target cell, and their use in gene therapy
US5929049A (en) * 1997-08-08 1999-07-27 Dade Behring Marburg Gmbh Polysaccharide conjugates of biomolecules
US20040072937A1 (en) * 2001-02-10 2004-04-15 Tomalia Donald A. Nanocomposites of dendritic polymers
DE19743135A1 (de) * 1997-09-30 1999-04-01 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine
DE19758105A1 (de) * 1997-12-18 1999-06-24 Schering Ag Dendritische Polymer-Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US6475994B2 (en) * 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
AU2868099A (en) * 1998-02-13 1999-08-30 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
EP0996739A2 (en) * 1998-05-06 2000-05-03 Transgene S.A. Improvments in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor or interleukin-10
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
US20030215421A1 (en) * 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US7157418B1 (en) 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US5962423A (en) * 1998-08-07 1999-10-05 The Governors Of The University Of Alberta Treatment of bacterial dysentery
US6310043B1 (en) 1998-08-07 2001-10-30 Governors Of The University Of Alberta Treatment of bacterial infections
US6333051B1 (en) * 1998-09-03 2001-12-25 Supratek Pharma, Inc. Nanogel networks and biological agent compositions thereof
US6696089B2 (en) * 1998-09-03 2004-02-24 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Nanogel networks including polyion polymer fragments and biological agent compositions thereof
EP1829856A3 (en) * 1998-11-12 2009-02-25 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US6224935B1 (en) 1999-01-28 2001-05-01 Cornell Research Foundation, Inc. Ordered arrays via metal-initiated self-assembly of ligand containing dendrimers and bridging ligands
US6306662B1 (en) * 1999-02-04 2001-10-23 Texas Tech University Fingerprint development methods
US6635720B1 (en) * 1999-02-16 2003-10-21 Dendritech Inc. Core-shell tectodendrimers
US6251927B1 (en) 1999-04-20 2001-06-26 Medinox, Inc. Methods for treatment of sickle cell anemia
AU5312100A (en) * 1999-06-02 2000-12-18 University Of Washington Water soluble multi-biotin-containing compounds
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
GB9915231D0 (en) 1999-06-29 1999-09-01 Pfizer Ltd Pharmaceutical complex
DE19933024C2 (de) * 1999-07-15 2003-03-13 Medinnova Ges Med Innovationen Kationische Blockcopolymere
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
DE19936997B4 (de) * 1999-08-02 2007-06-14 Biolitec Ag Verfahren zur Applikation von Photosensibilisatoren (PS) mittels Multiplikatoren in der photodymamischen Therapie
US6548248B1 (en) * 1999-11-10 2003-04-15 Propper Manufacturing Co., Inc. DNA sterilization indicator
FR2801592B1 (fr) * 1999-11-25 2002-02-22 Centre Nat Rech Scient Dendrimeres phosphores et leurs applications comme agents de transfection
NL1013942C2 (nl) * 1999-12-23 2001-06-26 Dsm Nv Multifunctionele thermisch-oxidatieve stabilisator.
AU782912B2 (en) 1999-12-28 2005-09-08 Association Francaise Contre Les Myopathies Use of lithium (Li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
AU3366901A (en) * 1999-12-30 2001-07-16 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
EP1118333A1 (en) * 2000-01-18 2001-07-25 Eurand International S.P.A. Compositions with enhanced oral bioavailability
US20040146918A1 (en) * 2000-02-18 2004-07-29 Weiner Michael L. Hybrid nucleic acid assembly
DE10016881B4 (de) * 2000-04-05 2006-06-01 Qiagen Gmbh Gezielte Transfektion von Zellen mittels biotinyliertem Dendrimer
DE10019135A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6471968B1 (en) 2000-05-12 2002-10-29 Regents Of The University Of Michigan Multifunctional nanodevice platform
US6716450B1 (en) 2000-05-18 2004-04-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Enhancing protein activity through nanoencapsulation
US20040120979A1 (en) * 2000-06-02 2004-06-24 Roessler Blake J. Delivery systems comprising biocompatible and bioerodable membranes
US6410680B1 (en) * 2000-06-21 2002-06-25 Dendrimolecular, Inc. Dendrimer constructs and metal complexes thereof having superoxide dismutase activity
AU2001295073A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-08 The Regents Of The University Of California Dendrimeric support or carrier macromolecule
US6350819B1 (en) 2000-10-27 2002-02-26 Union Carbide Chemicals & Plastics Technology Corporation Dendritic macromolecules for metal-ligand catalyzed processes
JP3975167B2 (ja) * 2001-01-08 2007-09-12 アプレーラ コーポレイション 樹状化学発光基質
FR2820434A1 (fr) * 2001-02-05 2002-08-09 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'oligonucleotides pour ameliorer la transfection des plasmides dans les cellules, procede et kit de transfection
MXPA03007665A (es) * 2001-02-26 2004-03-16 Univ Duke Polimeros dendriticos novedosos y sus usos biomedicos.
US20020146684A1 (en) * 2001-04-09 2002-10-10 Meldal Morten Peter One dimensional unichemo protection (UCP) in organic synthesis
US6939564B2 (en) * 2001-06-08 2005-09-06 Labopharm, Inc. Water-soluble stabilized self-assembled polyelectrolytes
US6780428B2 (en) 2001-06-08 2004-08-24 Labopharm, Inc. Unimolecular polymeric micelles with an ionizable inner core
EP1420688A4 (en) * 2001-06-25 2005-08-31 Us Gov Health & Human Serv MACROMOLECULAR IMAGING AGENTS FOR LIVER VISUALIZATION
GB0119001D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Use of dendrimers and poly-branched molecules to enhance signal in fluorescent assay systems
US7314956B2 (en) 2001-08-08 2008-01-01 Vaxim, Inc. Multifunctional carrier for the delivery of a pharmacological agent or genetic material into a cell
US9201067B2 (en) * 2003-03-05 2015-12-01 Posco Size-controlled macromolecule
US20030054042A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Elaine Liversidge Stabilization of chemical compounds using nanoparticulate formulations
US6933126B2 (en) * 2001-09-19 2005-08-23 Applera Corporation Membrane transportable fluorescent substrates
US7906102B2 (en) 2001-10-03 2011-03-15 Vanderbilt University Ligands to radiation-induced molecules
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
GB0125216D0 (en) * 2001-10-19 2001-12-12 Univ Strathclyde Dendrimers for use in targeted delivery
AU2002348163A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-19 Intradigm Corporation Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
EP1527341B1 (en) * 2001-11-20 2009-06-17 Duke University Interfacial biomaterials
US7060498B1 (en) * 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US20040009495A1 (en) * 2001-12-07 2004-01-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products related to drug screening using gene expression patterns
WO2003068941A2 (en) 2002-02-13 2003-08-21 Duke University Modulation of immune response by non-peptide binding stress response polypeptides
US6984734B2 (en) 2002-02-26 2006-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Cyclo[n]pyrroles and methods thereto
US20040131582A1 (en) * 2002-02-26 2004-07-08 Grinstaff Mark W. Novel dendritic polymers and their biomedical uses
US20050260259A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-24 Bolotin Elijah M Compositions for treatment with glucagon-like peptide, and methods of making and using the same
US7635463B2 (en) * 2002-02-27 2009-12-22 Pharmain Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials
US7138105B2 (en) * 2002-02-27 2006-11-21 Pharmain Compositions for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same
US20080220075A1 (en) * 2002-03-20 2008-09-11 Elan Pharma International Ltd. Nanoparticulate compositions of angiogenesis inhibitors
EP1490030B2 (en) * 2002-03-20 2010-07-14 Elan Pharma International Limited Nanoparticulate compositions of angiogenesis inhibitors
US20030180250A1 (en) * 2002-03-22 2003-09-25 Council Of Scientific And Industrial Research Compositions and complexes containing a macromolecular compound as potential anti-inflammatory agents
GB0209022D0 (en) * 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
GB0220080D0 (en) * 2002-08-29 2002-10-09 Isis Innovation Blended dendrimers
WO2004019993A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
ATE533513T1 (de) 2002-09-06 2011-12-15 Cerulean Pharma Inc Polymere auf basis von cyclodextrin zur verabreichung von an diese kovalent gebundene arzneimittel
JP4430344B2 (ja) * 2002-09-09 2010-03-10 独立行政法人科学技術振興機構 多岐用途型リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法
JP3970811B2 (ja) * 2002-09-09 2007-09-05 独立行政法人科学技術振興機構 リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法
CA2500661A1 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Chiron Corporation Anti-cancer and anti-infectious disease compositions and methods for using same
WO2004044132A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
AU2002953073A0 (en) * 2002-11-21 2003-01-16 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of biotin-mediated targeting
US20060127350A1 (en) * 2002-11-26 2006-06-15 Danmarks Fodevareforskning Dendrimer conjugates for selective of protein aggregates
JP2006517790A (ja) * 2003-01-09 2006-08-03 インヴィトロジェン コーポレーション ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化
US20090186343A1 (en) * 2003-01-28 2009-07-23 Visigen Biotechnologies, Inc. Methods for preparing modified biomolecules, modified biomolecules and methods for using same
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
PL1603541T5 (pl) 2003-03-05 2013-06-28 Halozyme Inc Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronidazy (sHASEGP), sposób jej wytwarzania, zastosowanie i zawierające ją kompozycje farmaceutyczne
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
US8969543B2 (en) * 2003-04-03 2015-03-03 Bioneer Corporation SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
AU2003219576A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-25 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof
WO2004092388A1 (ja) 2003-04-18 2004-10-28 Japan As Represented By President Of National Cardiovascular Center ベクター
US20040258614A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 University Of Maryland, Baltimore Microparticles for microarterial imaging and radiotherapy
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
WO2005014035A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
EP1668424A4 (en) * 2003-09-12 2009-11-25 Onkor Pharmaceuticals Inc MAGNETICALLY DETERMINABLE PARTICLES WITH MAGNETIC COMPONENTS AND BIOCOMPATIBLE POLYMERS FOR THE LOCAL DELIVERY OF BIOLOGICALLY ACTIVE ACTIVE SUBSTANCES
EP1525890A1 (en) * 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
US20050085417A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-21 Thomas Jefferson University Compounds and methods for diagnostic imaging and therapy
CN1930304B (zh) 2003-11-21 2016-01-06 Anp技术公司 不对称支化的聚合物缀合物和微阵列检测
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
DE502004003914D1 (de) * 2003-12-19 2007-07-05 Basf Ag Quellbare hydrogelbildende polymere mit geringem feinstaubanteil
US20050171424A1 (en) * 2004-01-13 2005-08-04 The Gov. Of The Usa As Rep. By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services Methods for imaging the lymphatic system using dendrimer-based contrast agents
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
AU2005317193A1 (en) 2004-04-20 2006-06-22 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
JP2008501693A (ja) * 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
JP2008510829A (ja) * 2004-08-25 2008-04-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン デンドリマーに基づく組成物およびそれらの使用法
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
JP2006096870A (ja) * 2004-09-29 2006-04-13 Stella Chemifa Corp ホウ素含有化合物
US20060078535A1 (en) * 2004-10-13 2006-04-13 The Regents Of The University Of Michigan Anticancer compounds and methods
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7794699B2 (en) * 2005-01-05 2010-09-14 Michigan Molecular Institute Nano-structured blood substitutes
CA2593682C (en) * 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006086391A2 (en) * 2005-02-07 2006-08-17 Massachusetts Institute Of Technology Electrochemically-degradable layer-by-layer thin films
MX2007010168A (es) * 2005-02-21 2007-09-18 Basf Ag Composicion de principios activos.
US20060204443A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Methods for tumor treatment using dendrimer conjugates
WO2006102484A2 (en) * 2005-03-21 2006-09-28 Anp Technologies, Inc. Symmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US9187546B2 (en) * 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP2008545621A (ja) 2005-04-20 2008-12-18 デンドリティック ナノテクノロジーズ，インコーポレイテッド 強化された拡大性と内部官能基性をもった樹枝状ポリマー
EP2208998A3 (en) 2005-05-02 2011-03-16 ANP Technologies, Inc. Polymer conjugate enhanced bioassays
KR100667171B1 (ko) * 2005-05-10 2007-01-12 서애희 세포내 물질전달용 ｐａｍａｍ 유도체 및 이를 이용한세포내 원하는 물질의 전달방법
US20060269480A1 (en) * 2005-05-31 2006-11-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Multi-triggered self-immolative dendritic compounds
EA014327B1 (ru) * 2005-07-08 2010-10-29 Янссен Фармацевтика Н.В. Модифицированные полипропилениминовые дендримеры, содержащая их фармацевтическая композиция и их применение для лечения злокачественных опухолей
US20070041934A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8114393B2 (en) * 2005-09-14 2012-02-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and compositions for phosphate binding
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
JP5401095B2 (ja) 2005-11-17 2014-01-29 ゾゲニクス インコーポレーティッド 無針注射による粘性製剤の送達方法
KR20150125732A (ko) 2005-12-19 2015-11-09 파마인 코포레이션 치료제를 전달하기 위한 소수성 코어 담체 조성물, 이 조성물의 제조 방법 및 그 조성물의 이용 방법
TWI311486B (en) * 2005-12-30 2009-07-01 Ind Tech Res Inst Nuclear molecular imaging contrast agent
US9603941B2 (en) * 2006-01-24 2017-03-28 Minghui Chai Method of preparing dendritic drugs
US8263103B2 (en) * 2006-01-31 2012-09-11 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical articles containing biodegradable polymers and acid-neutralizing cationic species
WO2007149500A2 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Formulations containing hybrid dendrimers
US20080020043A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Marc Gingras Dendrimer-Drug Conjugates
JP2009544327A (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
JP2010504318A (ja) * 2006-09-22 2010-02-12 ラボファーム インコーポレイテッド ｐＨ標的化薬剤送達のための組成物及び方法
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
AU2007319657B9 (en) * 2006-10-04 2019-10-31 Novo Nordisk A/S Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
WO2008094222A2 (en) * 2006-10-06 2008-08-07 Trustees Of Princeton Porphyrin catalysts and methods of use thereof
IL178645A0 (en) * 2006-10-16 2007-02-11 Ariel University Res And Dev C Dendrimeric platform for controlled release of drugs
US8268347B1 (en) 2006-10-24 2012-09-18 Aradigm Corporation Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile
US9239329B2 (en) * 2006-12-18 2016-01-19 Japan Science And Technology Agency Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods
WO2008082627A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Divergent synthesis of looped poly (ester)-and poly (ether)- substituted dendrons and dendrimers
DE102007002726A1 (de) * 2007-01-18 2008-07-31 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neue Kaskaden-Polymer-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US20080207822A1 (en) * 2007-02-22 2008-08-28 General Electric Company Composition and associated method
KR20150064246A (ko) * 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
US20090088376A1 (en) * 2007-04-19 2009-04-02 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
WO2008134289A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Mallinckrodt Inc. High relaxivity coordinatively unsaturated lanthanide complexes
US20080294089A1 (en) * 2007-06-06 2008-11-27 Biovaluation & Analysis, Inc. Dendritic Polymers for Use in Acoustically Mediated Intracellular Drug Delivery in vivo
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
US20080311177A1 (en) 2007-06-14 2008-12-18 Massachusetts Institute Of Technology Self Assembled Films for Protein and Drug Delivery Applications
US8658148B2 (en) 2007-06-22 2014-02-25 Genzyme Corporation Chemically modified dendrimers
US7960336B2 (en) * 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
US8563527B2 (en) * 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
US10463609B2 (en) 2007-10-05 2019-11-05 Wayne State University Dendrimers for sustained release of compounds
WO2009045536A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Receptor targeted oligonucleotides
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
US20100286067A1 (en) * 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
US20090176892A1 (en) * 2008-01-09 2009-07-09 Pharmain Corporation Soluble Hydrophobic Core Carrier Compositions for Delivery of Therapeutic Agents, Methods of Making and Using the Same
WO2009108760A2 (en) 2008-02-26 2009-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic macroporous hydrogels prepared by crystal templating
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
US8252834B2 (en) 2008-03-12 2012-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
JP5788312B2 (ja) 2008-04-11 2015-09-30 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達
EP2756756B1 (en) 2008-04-28 2016-01-06 Zogenix, Inc. Novel formulations for treatment of migraine
WO2010021973A2 (en) * 2008-08-17 2010-02-25 Massachusetts Institute Of Technology Controlled delivery of bioactive agents from decomposable films
JP2012513953A (ja) 2008-09-23 2012-06-21 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 付加環化を用いたモノマーおよびオリゴヌクレオチドの化学修飾
US8889635B2 (en) 2008-09-30 2014-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
US20110200525A1 (en) * 2008-10-09 2011-08-18 Patz Jr Edward F Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
US9017644B2 (en) 2008-11-07 2015-04-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
KR102264822B1 (ko) 2008-11-10 2021-06-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
EP2403863B1 (en) 2009-03-02 2013-08-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid chemical modifications
US8263639B2 (en) * 2009-04-21 2012-09-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Multifunctional metal-chelating ligands
EA028860B1 (ru) 2009-06-10 2018-01-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
US20120220051A1 (en) 2009-07-08 2012-08-30 Anp Technologies, Inc. Immunogenicity Assay
US8518405B2 (en) 2009-10-08 2013-08-27 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibodies and uses therefor
US9856456B2 (en) 2009-10-12 2018-01-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Delivery agent
CN102917699A (zh) 2009-10-13 2013-02-06 密执安大学评议会 树枝状聚合物组合物和合成方法
JP2013507919A (ja) * 2009-10-16 2013-03-07 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 植物細胞に生体分子を送達するためのデンドリマーナノテクノロジーの使用
WO2011059586A2 (en) 2009-10-30 2011-05-19 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
WO2011117352A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Primate model from the family cercopithecidae infected by a hbv strain of human genotype
CA2830052C (en) 2010-03-31 2018-10-09 Wayne State University Injectable dendrimer hydrogel nanoparticles
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
CA2803646A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Angiochem Inc. Short and d-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012048283A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Board Of Regents, The University Of Texas System One-step processing of hydrogels for mechanically robust and chemically desired features
JP6042815B2 (ja) 2010-10-08 2016-12-14 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 生物医学的応用のためのアルギン酸塩及びヒアルロン酸を用いる抗癒着性バリア膜
CA2821268C (en) 2010-12-14 2021-06-15 National University Of Singapore Human monoclonal antibody with specificity for dengue virus serotype 1 e protein and uses thereof
WO2012094620A2 (en) 2011-01-09 2012-07-12 Anp Technologies, Inc. Hydrophobic molecule-induced branched polymer aggregates and their use
AU2012207606B2 (en) 2011-01-11 2017-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
WO2012153297A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Targeted polymeric conjugates and uses thereof
EP3456317A1 (en) 2011-09-27 2019-03-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
CN102382856B (zh) * 2011-10-25 2013-06-19 上海交通大学 含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物
US9402911B2 (en) 2011-12-08 2016-08-02 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
US20130149381A1 (en) * 2011-12-08 2013-06-13 Centro De Investigacion En Quimica Aplicada Absorption method for entrapment of drugs in polymeric nanoparticles
WO2013163234A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Stable layer-by-layer coated particles
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013346767B2 (en) 2012-11-15 2019-04-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
US11565027B2 (en) 2012-12-11 2023-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydrogel membrane for adhesion prevention
WO2014123791A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Anp Technologies, Inc. Nanoparticles containing a taxane and their use
WO2014134029A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid particles, methods and use thereof
US9463244B2 (en) 2013-03-15 2016-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for nucleic acid delivery
WO2014160871A2 (en) 2013-03-27 2014-10-02 The General Hospital Corporation Methods and agents for treating alzheimer's disease
US20150148415A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Fundacion Fraunhofer Chile Research Derivatized dendrimer with low citotoxicity for in vivo, ex vivo, in vitro or in situ chelation of heavy metals or actinides
US11135316B2 (en) 2014-01-31 2021-10-05 Washington University Imaging and treatment of pathophysiologic conditions by Cerenkov radiation
ES2861594T3 (es) 2014-04-30 2021-10-06 Univ Johns Hopkins Composiciones de dendrímeros y su uso en el tratamiento de enfermedades del ojo
US9974870B2 (en) 2014-06-09 2018-05-22 Washington University Compositions and methods for treatment and imaging using nanoparticles
CA2952026A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Tenboron Oy Conjugates comprising an anti-egfr1 antibody
EP3169310A1 (en) 2014-07-15 2017-05-24 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
US10487151B2 (en) 2014-07-23 2019-11-26 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to antibody fragments that bind to tumor-associated glycoprotein 72 (TAG-72)
EP3172222A4 (en) 2014-07-24 2018-03-21 Washington University Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof
CN115350285A (zh) 2014-08-13 2022-11-18 约翰霍普金斯大学 树枝状聚合物到脑肿瘤的选择性传递
TR201907471T4 (tr) 2014-08-28 2019-06-21 Halozyme Inc Bir hiyalüronan ayrıştırıcı enzim ve bir bağışıklık kontrol noktası inhibitörüyle kombinasyon terapisi.
AR100763A1 (es) * 2014-09-09 2016-11-02 Univ Ramot SISTEMA DE LIBERACIÓN DE AGROQUÍMICOS A BASE DE HÍBRIDOS DE PEG-DENDRÓN ANFIFÍLICO QUE RESPONDE A ENZIMAS O AL pH
AU2015364508A1 (en) 2014-12-18 2017-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ReversirTM compounds
CA2989970A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10869939B2 (en) 2015-08-03 2020-12-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Delivery system in micellar form having modular spectral response based on enzyme-responsive amphiphilic PEG-dendron hybrid polymers
US10548959B2 (en) 2015-09-23 2020-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for modified dendrimer nanoparticle delivery
KR20180063885A (ko) 2015-09-24 2018-06-12 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 전이 감소를 위한 방법 및 조성물
JP2019501864A (ja) 2015-10-07 2019-01-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療剤−ポリマーコンジュゲートの硝子体内半減期を予測するシステム及び方法
RU2611399C1 (ru) * 2016-01-19 2017-02-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Меченые дендримерные пептиды
US20210162064A1 (en) * 2016-02-19 2021-06-03 Genisphere Llc Nucleic Acid Carriers And Therapeutic Methods Of Use
PL417159A1 (pl) 2016-05-11 2017-11-20 Instytut Biologii Doświadczalnej Im. Marcelego Nenckiego Koniugaty białka prionowego z dendrymerami do zastosowania w leczeniu choroby Alzheimera
US10183058B2 (en) 2016-06-17 2019-01-22 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the progression of prostate cancer
US10172910B2 (en) 2016-07-28 2019-01-08 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the incidence of acute urinary retention
US10532081B2 (en) 2016-09-07 2020-01-14 Nymox Corporation Method of ameliorating or preventing the worsening or the progression of symptoms of BPH
WO2018093932A2 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Immunomic Therapeutics, Inc. Nucleic acids for treatment of allergies
US10335453B2 (en) 2017-03-01 2019-07-02 Nymox Corporation Compositions and methods for improving sexual function
WO2018165327A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Alafair Biosciences, Inc. Hydrogel medium for the storage and preservation of tissue
CA3061206A1 (en) 2017-04-22 2018-10-25 Immunomic Therapeutics, Inc. Improved lamp constructs
KR20240027895A (ko) 2017-05-02 2024-03-04 이뮤노믹 쎄라퓨틱스, 인크. 암 항원을 포함하는 lamp (리소솜 연관 막 단백질) 구축물
US20190001001A1 (en) * 2017-07-03 2019-01-03 General Electric Company Drug design for application-dependent payload, controlled pharmacokinetic distribution, and renal clearance
CN111278894A (zh) * 2017-07-06 2020-06-12 学校法人京都药科大学 肾脏靶向药物递送载体
WO2019089567A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
CN108299562B (zh) * 2018-02-09 2021-05-28 中国人民解放军陆军军医大学 一种超支化聚合多肽及其制备方法和应用
JP7353301B2 (ja) 2018-05-07 2023-09-29 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 肝臓外送達
JP2021523185A (ja) 2018-05-15 2021-09-02 イミュノミック セラピューティックス， インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． アレルゲンを含む改善されたｌａｍｐ構築物
EP3856907A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
EP3906414A1 (en) 2019-01-03 2021-11-10 Ionpath, Inc. Compositions and reagents for ion beam imaging
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
US20220211743A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oral delivery of oligonucleotides
US11788091B2 (en) 2019-08-21 2023-10-17 University Of Virginia Patent Foundation Methods and compositions for diagnosing and treating prostate cancer based on long noncoding RNA overlapping the LCK gene that regulates prostate cancer cell growth
CA3153850A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Teri Heiland Improved lamp constructs comprising cancer antigens
EP4055165A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
BR112022007795A2 (pt) 2019-11-06 2022-07-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Administração extra-hepática
CN114980920A (zh) 2019-11-18 2022-08-30 詹森生物科技公司 基于突变体calr和jak2的疫苗及其用途
EP4069308A2 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Ashvattha Therapeutics, Inc. Dendrimer compositions and methods for drug delivery to the eye
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022009051A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment
WO2022009049A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230257745A1 (en) 2020-07-10 2023-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular siRNAs
JP2024501857A (ja) 2020-12-31 2024-01-16 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 環状ジスルフィド修飾リン酸ベースのオリゴヌクレオチドプロドラッグ
EP4271695A2 (en) 2020-12-31 2023-11-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs
WO2023283403A2 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
CA3226887A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof
CA3234887A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof
WO2023201201A1 (en) 2022-04-10 2023-10-19 Immunomic Therapeutics, Inc. Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof
WO2023220744A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
WO2024006999A2 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs
WO2024073732A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double-stranded rna agents

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3200106A (en) * 1960-08-04 1965-08-10 Petrolite Corp Derivatives of branched polyalkylene-polyamines
US3445441A (en) * 1965-03-25 1969-05-20 Petrolite Corp Amino-amido polymers
US3514250A (en) * 1965-03-25 1970-05-26 Petrolite Corp Process of inhibiting corrosion
US3580891A (en) * 1968-04-16 1971-05-25 Seekay Chemical Co Water-insoluble,cross-linked polymeric reaction product of ethylene diamine and nitrilotriacetic acid or derivative
US3528928A (en) * 1969-01-13 1970-09-15 Petrolite Corp Process of breaking oil-in-water emulsions
US3578643A (en) * 1969-06-06 1971-05-11 Grace W R & Co New polymers from nitrilotriacetonitrile and iminodiacetonitrile
BE756896A (fr) * 1969-10-01 1971-03-30 Montedison Spa Polyamides basiques, leurs procedes de preparation et leurs applications
US4036808A (en) * 1972-08-14 1977-07-19 California Institute Of Technology Conductive hydrogel containing 3-ionene
US4102827A (en) * 1973-12-26 1978-07-25 California Institute Of Technology Novel polyelectrolytes
US4315087A (en) * 1975-04-28 1982-02-09 Petrolite Corporation Quaternary polyaminoamides
US4141847A (en) * 1977-05-11 1979-02-27 Shell Oil Company Star-shaped polymer reacted with dicarboxylic acid and amine as dispersant viscosity index improver
US4360646A (en) * 1979-04-06 1982-11-23 Allied Corporation Preparation of lysine based macromolecular highly branched homogeneous compound
US4289872A (en) * 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
US4581337A (en) * 1983-07-07 1986-04-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyether polyamines as linking agents for particle reagents useful in immunoassays
JPS5719660A (en) * 1980-07-09 1982-02-01 Fuji Photo Film Co Ltd Microcapsule for immune reaction
US4435548A (en) * 1981-04-27 1984-03-06 The Dow Chemical Company Branched polyamidoamines
US4410688A (en) * 1981-04-29 1983-10-18 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound
US4957939A (en) * 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4507466A (en) * 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4737550A (en) * 1983-01-07 1988-04-12 The Dow Chemical Company Bridged dense star polymers
US4558120A (en) * 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4631337A (en) * 1983-01-07 1986-12-23 The Dow Chemical Company Hydrolytically-stable dense star polyamine
US4568737A (en) * 1983-01-07 1986-02-04 The Dow Chemical Company Dense star polymers and dendrimers
US4855403A (en) * 1983-02-22 1989-08-08 Union Carbide Corporation Connected branch copolymers, methods for their production, and copying materials including same
US4946824A (en) * 1983-02-22 1990-08-07 Union Carbide Chemicals And Plastics Company Inc. Connected branch copolymers, methods for their production, and copying materials including same
US4634586A (en) * 1984-05-21 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Reagent and method for radioimaging leukocytes
US4606907A (en) * 1984-07-02 1986-08-19 The Dow Chemical Company Bone seeking Tc-99m complexes of phosphonate derivatives of polyamidoamines
US4587329A (en) * 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US4857218A (en) * 1984-08-17 1989-08-15 Union Carbide Corporation Lubrication method and compositions for use therein
US4980148A (en) * 1985-02-06 1990-12-25 Mallinckrodt, Inc. Methods for enhancing magnetic resonance imaging
US4703018A (en) * 1985-02-20 1987-10-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company High refractive index haloalkyl-functional shell-core polymers and their use in light scattering immunoassays
US4675173A (en) * 1985-05-08 1987-06-23 Molecular Biosystems, Inc. Method of magnetic resonance imaging of the liver and spleen
US4824659A (en) * 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US4871779A (en) * 1985-12-23 1989-10-03 The Dow Chemical Company Ion exchange/chelation resins containing dense star polymers having ion exchange or chelate capabilities
IT1213029B (it) * 1986-01-30 1989-12-07 Bracco Ind Chimica Spa Chelati di ioni metallici paramagnetici.
US4694064A (en) * 1986-02-28 1987-09-15 The Dow Chemical Company Rod-shaped dendrimer
US4713975A (en) * 1986-05-30 1987-12-22 The Dow Chemical Company Dense star polymers for calibrating/characterizing sub-micron apertures
US5039512A (en) * 1986-08-04 1991-08-13 Salutar, Inc. NMR imaging with paramagnetic polyvalent metal salts of poly-(acid-alkylene-amino)-alkanes
ES2054678T5 (es) * 1986-08-18 1997-09-16 Dow Chemical Co Conjugados estrella.
US5527524A (en) * 1986-08-18 1996-06-18 The Dow Chemical Company Dense star polymer conjugates
US5338532A (en) * 1986-08-18 1994-08-16 The Dow Chemical Company Starburst conjugates
US5175270A (en) * 1986-09-10 1992-12-29 Polyprobe, Inc. Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences
US4863717A (en) * 1986-11-10 1989-09-05 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Methods for circumventing the problem of free radial reduction associated with the use of stable nitroxide free radicals as contrast agents for magnetic reasonance imaging
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US4857599A (en) * 1988-02-08 1989-08-15 The Dow Chemical Company Modified dense star polymers
US4931553A (en) * 1988-05-11 1990-06-05 Gill Devinder S Platinum-polymer complexes and their use as antitumor agents
JPH0750111B2 (ja) * 1988-12-22 1995-05-31 積水化学工業株式会社 疎水性物質の固定化用担体およびそれを用いた疎水性物質の固定化方法
DE3910901A1 (de) * 1989-04-04 1990-10-11 Ppg Ind Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung einer waesserigen feinteiligen dispersion eines chlorierten polyolefins und verwendung derselben in waesserigen beschichtungszusammenetzungen
US5364613A (en) * 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
AU5649290A (en) * 1989-04-12 1990-11-05 New York University Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine
US5041516A (en) * 1989-06-21 1991-08-20 Cornell Research Foundation, Inc. Dendritic molecules and method of production
US4938885A (en) * 1989-09-28 1990-07-03 Texaco Inc. Antioxidant dispersant polymer dendrimer
DE3938992A1 (de) * 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
MY108621A (en) * 1990-08-01 1996-10-31 Novartis Ag Polylactide preparation and purification
IL99234A (en) * 1990-08-27 1994-05-30 Michigan Molecular Inst Non-cross-linked multi-branch polymers and their preparation
US5098475A (en) * 1991-01-28 1992-03-24 Xerox Corporation Inks with dendrimer colorants
US5154853A (en) * 1991-02-19 1992-10-13 University Of South Florida Unimolecular micelles and method of making the same
US5120361A (en) * 1991-06-27 1992-06-09 Xerox Corporation Ink compositions
WO1993003406A1 (en) * 1991-08-09 1993-02-18 Australian And Overseas Telecommunications Corporation Limited Sagnac loop gates
WO1993021259A1 (en) * 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
AU681735C (en) * 1993-07-14 2002-02-21 Regents Of The University Of California, The Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US5362843A (en) * 1993-09-22 1994-11-08 Hoechst Celanese Corporation Process for preparing highly branched macromolecule polymers

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995024221A1 (en) 1995-09-14
IL128775A (en) 2001-05-20
IL112920A (en) 2003-04-10
IL128774A (en) 2001-05-20
NO954434L (no) 1996-01-05
MX9504664A (es) 1997-05-31
FI955320A0 (fi) 1995-11-06
RU2127125C1 (ru) 1999-03-10
DE69533569D1 (de) 2004-11-04
EP0699079A1 (en) 1996-03-06
JPH08510761A (ja) 1996-11-12
IL128773A (en) 2001-05-20
ES2104518T1 (es) 1997-10-16
EP0699079B1 (en) 2004-09-29
ZA951877B (en) 1996-09-09
US5714166A (en) 1998-02-03
KR960703342A (ko) 1996-08-17
DE699079T1 (de) 1997-09-25
IL128775A0 (en) 2000-01-31
IL128774A0 (en) 2000-01-31
DE69533569T2 (de) 2006-01-05
FI955320A (fi) 1995-11-24
NO954434D0 (no) 1995-11-06
CA2161684C (en) 2010-11-09
KR100357839B1 (ko) 2003-08-02
PL182237B1 (pl) 2001-11-30
GR970300044T1 (en) 1997-11-28
IL128773A0 (en) 2000-01-31
PL311633A1 (en) 1996-03-04
IL112920A0 (en) 1995-12-08
CA2161684A1 (en) 1995-09-14
NO317691B1 (no) 2004-12-06
ATE277640T1 (de) 2004-10-15
AU2118195A (en) 1995-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL181064B1 (pl) Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy
DK174053B1 (da) Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer
Yue et al. Progress and perspectives in developing polymeric vectors for in vitro gene delivery
US7060498B1 (en) Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
Neu et al. Bioreversibly crosslinked polyplexes of PEI and high molecular weight PEG show extended circulation times in vivo
AU682308B2 (en) Self-assembling polynucleotide delivery system
TWI459968B (zh) 含有非電荷性親水性嵌段及側鏈之一部分導入疏水性基之陽離子性聚胺基酸嵌段所組成之共聚物及其使用
US8877171B2 (en) Polyanionic multivalent macromolecules for intracellular targeting of proliferation and protein synthesis
JP2009532564A (ja) 生分解性のカチオン性ポリマー
EP0844891A1 (en) Hyper comb-branched polymer conjugates
WO2007099660A1 (ja) 核酸内包高分子ミセル複合体
Su et al. Cationic dynamic covalent polymers for gene transfection
Huang et al. Polypeptide–poly (ethylene glycol) miktoarm star copolymers with a fluorescently labeled core: Synthesis, delivery and imaging of siRNA
JP4614198B2 (ja) カチオン性ブロックコポリマー
Klein et al. Click-shielded and targeted lipopolyplexes
AU768662B2 (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
Li et al. Cyclen‐Based Side‐Chain Homopolymer Self‐Assembly with Plasmid DNA: Protection of DNA from Enzymatic Degradation
US20060128814A1 (en) Photolytic cross-linkable monomers
Jalal Gene delivery studies using PAMAM dendrimers in cellular models

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120307