PL182237B1 - Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL - Google Patents

Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL

Info

Publication number
PL182237B1
PL182237B1 PL95335982A PL33598295A PL182237B1 PL 182237 B1 PL182237 B1 PL 182237B1 PL 95335982 A PL95335982 A PL 95335982A PL 33598295 A PL33598295 A PL 33598295A PL 182237 B1 PL182237 B1 PL 182237B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dendrimer
polymer
dna
dendrimers
genetic material
Prior art date
Application number
PL95335982A
Other languages
English (en)
Inventor
Donald A Tomalia
James R Baker
Anna Bielinska
Herbert M Brothers
Roberta C Cheng
Michael J Fazio
David M Hedstrand
Jennifer A Johnson
Donald A Kaplan
Scott L Klakamp
William J Kruper Jr
Jolanta Kukowska-Latallo
Bartley D Maxon
Lars T Piehler
Ian A Tomlinson
Larry R Wilson
Rui Yin
Original Assignee
Dow Chemical Co
Univ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Chemical Co, Univ filed Critical Dow Chemical Co
Publication of PL182237B1 publication Critical patent/PL182237B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/085—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier conjugated systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/124—Macromolecular compounds dendrimers, dendrons, hyperbranched compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/01—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C211/26—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring
    • C07C211/29—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing at least one six-membered aromatic ring the carbon skeleton being further substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/11—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/005—Dendritic macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/16—Dendrimers and dendritic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

1. Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo, znam ienny tym , ze komórki, które maja byc transfekowane, kontaktuje sie z kompleksem polimeru dendrytowego z materialem genetycznym, w którym stosunek ladunków materialu gen etycz- nego do dendrymeru w ynosi od ok olo 1:1 do okolo 1·100, w roztworze DEAE -dekstranu lub gliceryny, przy czym polimer dendrytowy stanowi co najmniej je - den rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny deadrymetr, który zawiera co najmniej jedna galaz wychodzaca z rdzenia, która to galaz zawiera co najmniej jedna grupe koncowa, z tym ze (1) stosunek grup koncowych do galezi rdzenia w ynosi dwa lub wiecej; (2) gestosc grup koncowych w przeliczeniu na jednostke objetosci polimeru jest co najmniej 1,5 razy w ieksza od gestosci w ydluzonego konw encjonalne- go polimeru gw iazdzistego o podobnym rdzeniu i skladnikach monomerycznych majacego porównywalny ciezar czasteczkowy 1 liczbe galezi, przy czym kaz- da z galezi wydluzonego konwencjonalnego polimeru gwiazdzistego zawiera tylko jedna grupe koncowa; oraz (3) objetosc czasteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli czasteczkowych Corey'a - Paulinga stanowi nie wiecej niz okolo 80% objetosci czasteczki wydluzonego konwencjonalnego polimeru gwiazdzistego, a polimer zawiera regularne rozgalezienia dendrytowe 3. Sposób przeprowadzania transfekcji komórek 1 osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo, znam ienny tym , ze wytwarza sie kompleks materialu genetycznego z pierwszym polimerem dendrytowym, który stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedna galaz wychodzaca z rdzenia, która to galaz zawiera co najmniej jedna grupe koncowa, z tym ze (1) stosunek grup koncowych do galezi rdzenia w ynosi dwa lub wiecej; (2) gestosc grup koncowych w przeliczeniu na jednostke objetosci polimeru jest co najmniej 1,5 razy w ieksza od gestosci w ydluzonego konw encjonalne- go polimeru gwiazdzistego o podobnym rdzeniu i skladnikach monomerycznych majacego porównywalny ciezar czasteczkowy i liczbe galezi, przy czym kaz- da z galezi wydluzonego konwencjonalnego polimeru gwiazdzistego zawiera tylko jedna grupe koncowa; oraz (3) objetosc czasteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli czasteczkowych Corey'a-Paulinga stanowi nie wiecej niz okolo 80% objetosci czasteczki wydluzonego konwencjonalnego polimeru gwiazdzistego, a polimer zawiera regularne rozgalezienia dendrytowe, po czym kompleks ten um ieszcza sie w roztworze zawierajacym drugi polimer dendrytowy, okreslony jak w yzej, ale którego czastki sa w ieksze niz pier w szego polimeru dendrytowego; oraz kontaktuje sie wytworzony kompleks i drugi polimer dendrytowy z komórkami, które maja byc transfekowane PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przeprowadzania transfekcji i osiągnięcia biodostępności materiału genetycznego in vitro i ex vivo. W sposobie tym wykorzystuje się polimery dendrytowe jako nośniki materiału genetycznego.
W ostatnich latach nastąpił rozwój polimerów określanych jako polimery typu gęstej gwiazdy lub polimery Starburst™ (znak towarowy Dendritech Inc.). Stwierdzono, że wielkość, kształt i właściwości takich polimerów typu gęstej gwiazdy można dopasowywać na poziomie molekularnym do specjalnych zastosowań. Polimerazy typu gęstej gwiazdy wykazują znaczące zalety, tak że mogą stanowić środki doprowadzania przenoszonego materiału w wysokim stężeniu w odniesieniu do jednostki polimeru, doprowadzania kontrolowanego, doprowadzania ukierunkowanego i/lub doprowadzania lub zastosowania wielu składników.
Polimery typu gęstej gwiazdy zasocjowane z przenoszonymi materiałami genetycznymi tworzą kompleksy polimerowe, które poniżej będą często określane jako „kompleksy polimerów typu gestej gwiazdy”, „kompleksy typu gęstej gwiazdy” lub „kompleksy”.
Wynalazek obejmuje sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiągnięcia biodostępności materiału genetycznego in vitro i ex vivo.
Sposób według wynalazku polega na tym, że komórki, które mająbyć transfekowane, kontaktuje się z kompleksem polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym, w którym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100, w roztworze DEAE-dekstranu lub gliceryny, przy czym polimer dendrytowy stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
(2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe.
Wynalazek obejmuje też sposób, w którym stosuje się dwa polimery dendrytowe. Zgodnie z tym sposobem wytwarza się kompleks materiału genetycznego z pierwszym polimerem dendrytowym, określonym jak powyżej, po czym kompleks ten umieszcza się w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, określony jak wyżej, ale którego cząstki są większe niż pierwszego polimeru dendrytowego; oraz kontaktuje się wytworzony kompleks i drugi polimer dendrytowy z komórkami, które mająbyć transfekowane. Korzystnie do polimeru dendrytowego przyłączony jest prowadnik docelowy, przy czym w przypadku stosowania dwóch polimerów, prowadnik docelowy przyłączony jest do co najmniej jednego polimeru.
W jednym wykonaniu wynalazku stosuje się kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy zawierający co najmniej jeden polimer typu gęstej gwiazdy zasocjowany z co najmniej jedną jednostką materiału genetycznego, przy czym polimer zawiera (a) rdzeń inicjujący, (b) co najmniej dwie koncentryczne warstwy dendrytowe („generacje”) z symetrycznymi połączeniami gałęziowymi, przy czym warstwy te rozchodzą się promieniowo w postępie geometrycznym od gałęzi rdzeniowej, tak że stosunek grup końcowych do gałęzi rdzeniowej (rdzeniowych) wynosi co najmniej 4:1, oraz (c) powierzchnię zewnętrzną o końcowej funkcyjności. Takie kompleksy polimerów typu gęstej gwiazdy można także określić jako kompleks polimeru dendrytowego zawierający:
182 237 (i) polimer dendrytowy obejmujący
a) rdzeń wyjściowy,
b) warstwę wewnętrzną o co najmniej trzech (3) generacjach, składającą się z promieniowo rozchodzących się, symetrycznych, powtarzających się jednostek połączonych z rdzeniem wyjściowym, oraz
c) powierzchnię zewnętrzną złożoną z końcowych funkcyjnych atomów lub grup atomów (końcowych grup funkcyjnych) połączonych z najbardziej zewnętrzną generacją i (ii) co najmniej jeden przenoszony materiał genetycznie dokładnie zasocjowany z polimerem dendrytowym.
W jeszcze inny sposób takie polimery typu gęstej gwiazdy można określić jako klasę polimerów dendrytowych, w której polimer dendrytowy (i) charakteryzuje się regularnie rozgałęzioną strukturą zasadniczo przedstawioną poniższym wzorem (1), zawierającą rdzeń (C) o liczbie (s) wartościowości lub miejsc funkcyjnych wynoszącej jeden lub więcej, przy czym co najmniej jedna z wartościowości rdzenia (C) połączona jest z grupą(B) poprzez grupę (A), grupa (B) zawiera co najmniej dwa miejsca funkcyjne (r i, r2...) po połączeniu z grupą (A), zespół (AB) utworzony przez połączenie grupy (A) z grupą (B) stanowi gałąź, gałęzie (AB) powtarzają się w pożądanej liczbie generacji (G) wynoszącej co najmniej 3, a miejsca funkcyjne grupy (B) w każdej z ostatnich gałęzi (AB) są zablokowane co najmniej dwoma atomami (rG) lub grupami atomów (X):
Wzór 1:
C[AB(AB(AB....(AB(ABXrG)rG.i)rG-2....)r2)ri]s (1) gdzie każda z liczb indeksowych 1,2....G-1 iGwrb r2....rG-i i rG oznacza numer każdej generacji zwiększającej się gałęzi (AB), licząc pierwszą gałąź lub gałęzie (AB) połączone z rdzeniem (C) jako pierwszą generację, czyli G = 1, każdy z rb r2.... i rG oznacza liczbę miejsc funkcyjnych w grupie (B) gałęzi (AB) odpowiedniej generacji, przy czym takie miejsce funkcyjne jest zdolne do połączenia się z grupą (A) innej gałęzi (AB) następnej generacji, s oznacza liczbę całkowitą równą co najmniej 1, ale nie większą niż liczba wartościowości lub miejsc funkcyjnych w rdzeniu (C), każda z grup (A) i (B) może być taka sama lub różna w każdej generacji, a X oznacza atomy lub grupy atomów blokujące miejsca funkcyjne grup funkcyjnych (B) ostatnich gałęzi (AB), przy czym mogą być one takie same lub różne.
W użytym znaczeniu określenie „materiał genetyczny” odnosi się do materiałów opartych na nukleotydach i obejmuje, ale nie wyłącznie, wirusy i fragmenty wirusów, plazmidy, fagi, kosmidy, geny i fragmenty genów (np. egzony, introny), kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), zarówno jedno jak i dwuniciowy, kwas rybonukleinowy (RNA), rybosomowy RNA (rRNA), katalityczny RNA (cRNA), mały jądrowy RNA (snRNA), informacyjny RNA (mRNA), przenośnikowy RNA (tRNA), oligonukleotydowy DNA i RNA (zarówno jedno-jak i dwuniciowe) albo oligomery i (antysensowne) oligonukleotydy, białkowe kwasy nukleinowe (PNA) i podstawione oligonukleotydy kwasów nukleinowych. Materiał genetyczny, zwłaszcza w postaci wirusów i fragmentów wirusów, może być skompleksowany lub sprzężony z pewną ilością białka. Określenie „materiał genetyczny” obejmuje także „modyfikowane oligonukleotydy” opisane dokładniej poniżej.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy zapewniają liczne korzyści w porównaniu z innymi znanymi nośnikami z uwagi na korzystne właściwości polimerów typu gęstej gwiazdy. Polimery typu gestej gwiazdy stanowią określony typ polimerów dendrytowych. Jednak do przenoszenia materiału genetycznego zastosować można inne typy polimerów dendrytowych.
„Polimer dendrytowy” stanowi polimer z regularnymi rozgałęzieniami dendrytowymi, wytworzony w wyniku sekwencyjnej lub generacyjnej addycji rozgałęzionych warstw do lub od rdzenia. Określenie polimer dendrytowy obejmuje „dendrymery”, które zawierają rdzeń, co najmniej jedną wewnętrzną rozgałęzioną warstwę i powierzchniową rozgałęzioną warstwę (patrz Petar R. Dvomic i Dionald A. Tomalia, Chem. in Britain, 641-645, sierpień 1994). „Dendron”
182 237 stanowi fragment dendrymeru zawierający gałęzie rozchodzące się z punktu ogniskowego, który jest lub może być połączony z rdzeniem, bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą, tworząc dendrymer. Wiele dendrymerów zawiera dwa lub więcej dendronów połączonych ze wspólnym rdzeniem. Jednakże określenie dendrymer jest używane w szerokim zakresie, tak że obejmuje również pojedynczy dendron.
Do polimerów dendrytowych należą, ale nie wyłącznie, symetrycznie i niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery, cząsteczki kaskadowe, arborole itp., z tym że najkorzystniejszymi polimerami dendrytowymi sąpolimery typu gestej gwiazdy. Ujawnione polimery typu gęstej gwiazdy PAMAM są symetryczne, co oznacza, że zawierają ramiona gałęzi o równej długości. Rozgałęzienie występuje przy atomach wodoru końcowej grupy - NH2 gałęzi poprzedniej generacji. Dendrymery oparte na lizynie są niesymetryczne, gdyż zawierają ramiona gałęzi o różnej długości. Jedna gałąź występuje przy ε-azocie cząsteczki lizyny, a dniga gałąź występuje przy α-azocie w sąsiedztwie reaktywnej grupy karboksylowej, która przyłącza gałąź do gałęzi poprzedniej generacji.
Hiperrozgałęzione polimery, np. hiperrozgałęzione poliole, mimo iż nie zostały wytworzone przez regularną kolejną addycję rozgałęzionych warstw, mogą być równoważne polimerowi dendrytowemu, gdy charakter rozgałęzień wykazuje stopień regularności zbliżony do występującego w dendrymerze.
Polimery typu gestej gwiazdy wykazują architekturę cząsteczkową charakteryzującą się regularnymi rozgałęzieniami dendrytowymi z symetrią promieniową, to znaczy w punkcie rozgałęzienia. Takie promieniowo symetryczne cząsteczki określa się jako cząsteczki o „topologii gestej gwiazdy”. Polimery takie wytwarza się w sposób umożliwiający powstanie koncentrycznych dendrytowych kondygnacji wokół rdzenia inicjatora. Topologię gęstej gwiazdy uzyskuje się przez uporządkowane zestawianie organicznych merów w koncentrycznych, dendrytowych kondygnacjach wokół rdzenia inicjatora; osiąga się to wprowadzając wielokrotność i samopowielanie (w każdej kondygnacji) w postępie geometrycznym, poprzez szereg generacji cząsteczek. Uzyskane silnie funkcjonalizowane cząsteczki określono jako „dendrymery”, aby podkreślić ich rozgałęzioną (drzewopodobną) strukturę i oligomeryczny charakter. I tak określenia „oligomer typu gęstej gwiazdy” i „dendrymer typu gestej gwiazdy” oraz „dendrymer Starburst™” objęte są określeniami „polimer typu gęstej gwiazdy” lub „polimer Starburst™”.
Polimery topologiczne z domenami o kontrolowanej wielkości i kształcie, stanowią dendrymery zasocjowane ze sobą (np. kowalencyjnie poprzez mostki lub w inny sposób, jak to opisano poniżej) poprzez ich reaktywne grupy końcowe i określane jako „dendiymery mostkowe” typu gęstej gwiazdy. Określenie dendrymer mostkowy również wchodzi w zakres określenia „polimer typu gestej gwiazdy” lub polimer Starburst™. Gdy więcej niż dwa dendrymery typu gestej gwiazdy są ze sobązasocjowane, to określane są one jako „agregaty typu gęstej gwiazdy” lub „agregaty Starburst™, przy czym określenia te również wchodzą w zakres określenia „polimer typu gęstej gwiazdy” lub polimer Starburst™.
W związku z tym do polimerów dendrytowych należą zarówno dendrymery mostkowe jak i agregaty dendrymerów. Polimery dendrytowe obejmujągeneracyjnie zarówno monodyspersyjne jak i polidyspersyjne roztwory dendrymerów. W roztworze monodyspersyjnym zasadniczo wszystkie dendrymery sątej samej generacji i w związku z tym mająrównomiemy kształt i wygląd. Roztwory polidyspersyjne charakteryzują się rozrzutem różnych generacji dendrymerów.
Do polimerów dendrytowych należą również dendrymery modyfikowane powierzchniowo. Taknp. powierzchnia dendrymeru PAMAM może zostać zmodyfikowana w wyniku addycji aminokwasu, np. lizyny lub argininy.
Należy zdawać sobie sprawę, że odniesienie do dowolnego określonego typu polimeru dendrytowego takiego jak „polimer”, np. „polimer typu gestej gwiazdy”, „niesymetryczny polimer dendrytowy” lub „polimer kaskadowy”, obejmuje również dendrymery mostkowe tego typu, agregaty dendrymerów tego typu, polidyspersyjne dendrymery tego typu i powierzchniowo modyfikowane dendrymery tego typu.
182 237
Kompleksy polimeru dendrytowego z materiałami genetycznymi znajdują szerokie zastosowanie w analizie, modyfikacji, aktywacji, w zastosowaniach antysensów itp.
Kompleksy takie wytwarza się przez (1) reakcję polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku i w temperaturze ułatwiającej skompleksowanie materiału genetycznego z polimerem dendrytowym, przy czym sposób ten ewentualnie obejmuje umieszczenie kompleksu w roztworze z DEAE-dekstranem; albo (2) kompleksowanie materiału genetycznego z pierwszym polimerem dendrytowym na drodze reakcji polimeru z materiałem genetycznym w odpowiednim rozpuszczalniku i w temperaturze ułatwiającej zasocjowanie materiału genetycznego z polimerem, umieszczenie tego kompleksu w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, przy czym ten drugi polimer dendrytowy jest większy niż pierwszy polimer dendrytowy. W szczególności w powyższym procesie (1) l-10pg materiału genetycznego /ml lub na 20 ml, zależnie od pożądanego stężenia, poddaje się reakcji z wystarczającą ilością polimeru dendrytowego przy pH około 5-10, w temperaturze około 20-40°C, uzyskując kompleks materiału genetycznego z polimerem o składzie od około 3:1 do 1:10 000. Dokładniejsze omówienie sposobów przedstawiono poniżej.
Kompleksowanie materiału genetycznego z polimerem stabilizuje i pozwala na ścisłe upakowanie materiału genetycznego, chroni materiał genetyczny przed trawieniem w czasie dochodzenia do komórki i transfekcji w komórce, a także ułatwia przenoszenie materiału genetycznego przez błonę komórkową i do komórki, w tym do jądra komórkowego.
Krótki opis rysunków
Poniższy opis rysunków ułatwi zrozumienie wynalazku.
Na fig. 1 pokazano różne generacje dendrymerów typu gęstej gwiazdy.
Na fig. 2 (A) pokazano dendrymer z niesymetrycznymi (nierównymi) połączeniami gałęziowymi.
Na fig. 2 (B) pokazano dendrymer z symetrycznymi (równymi) połączeniami gałęziowymi.
Na fig. 3 pokazano rodzinę dendrymerów o różnych wielkościach [I, II, III, z (B)] w porównaniu z wymiarami przeciwciała (A).
Na fig. 12 przedstawiono wykres słupkowy porównujący zdolność DNA do transfekcji dla dendrymerów o różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer, poprzez badanie aktywności lucyferazy po transfekcji, patrz przykład 5. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/ pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek (podane w przykładzie 5) dla próbki kontrolnej oraz różnych dendrymerów i kompleksów DNA przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer, zestawionych w tabeli VI.
Na fig. 13 porównano zdolność wiązania DNA przez dendrymery przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer, z wykorzystaniem tych samych kompleksów DNA:dendrymer, które pokazano na fig. 12, z przykładu 5, z wykorzystaniem żelu do elektroforezy.
Na fig. 14 pokazano wykres procentowego wzrostu transfekcji w stosunku do próbki kontrolnej, w funkcji generacji dendrymeru stosowanego w kompleksie DNA:dendrymer z przykładu 6. Na osi pionowej podano procent wzrostu transfekcji w stosunku do kontrolnego dekstranu, a na osi poziomej generację dendrymeru. Pełnymi kółkami zaznaczono dendrymery z rdzeniem z amoniaku (NH3), a pełnymi kwadratami dendrymery z rdzeniem z etylenodiaminy (EDA).
Na fig. 15 przedstawiono wykres słupkowy porównujący wpływ kolejności dodawania różnych dendrymerów do kompleksu DNA:dendrymer na wydajność transfekcji komórek RAT2, dla dendrymerów z rdzeniem z etylenodiaminy (EDA), przykład 7. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stężenie (pM) drugiego dendrymeru. Puste słupki przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymeremn G9, do którego dodano dendrymer G5. Słupki zakreskowane ukośnie przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G5, do którego dodano dendrymer G9.
Na fig. 16 przedstawiono te same informacje, co na fig. 15, ale dla dendrymerów z rdzeniem z amoniaku (NH3). Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stężenie (pM) drugiego dendrymeru. Puste słupki przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G9, do którego dodano dendrymer G5. Słupki zakreskowa
182 237 ne ukośnie przedstawiają wyniki dla DNA skompleksowanego z dendrymerem G5, do którego dodano dendrymer G9.
Na fig. 17 przedstawiono jednostki światła/ pg białka po transfekcji przeprowadzonej z wykorzystaniem różnych kompleksów DNA-dendrymer i próbek kontrolnych, w różnych warunkach, przykład 3. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek dla próbek kontrolnych oraz różnych dendrymerów i różnych kompleksów DNA:dendrymer przy różnych stosunkach DNA:dendrymer zestawionych w tabeli VI.
Figura 18 jest podobna do fig. 17, ale przedstawia dane dla stosunków dendrymer: DNA w szerszym zakresie. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek dla próbek kontrolnych oraz różnych dendrymerów i różnych kompleksów DNA:dendrymer przy różnych stosunkach DNA:dendrymer, zestawionych w tabeli V.
Na fig. 19 przedstawiono wykres słupkowy względnych jednostek światła/pg białka dla transfekcji kompleksu dendrymer: DNA w odniesieniu do dendrymerów A-S, przykład 3. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosowany dendrymer, przy czy w każdym segmencie osi wyniki podano dla stosunku DNA:dendrymer 1:2, 1:2, 1:10, 1:10, 1:20 i 1:20.
Na fig. 20 pokazano porównanie właściwości kompleksujących szeregu dendrymerów z rdzeniem z amoniaku (NH3) z 15-nukleotydowym, syntetycznym, jednoniciowym DNA, przykład 8, na żelu do elektroforezy.
Na fig. 21 przedstawiono wchłanianie radioznaczonego 23-nukleotydowego, syntetycznego dwuniciowego oligomeru przez linię komórek monocytowych w czasie, porównując transfekcję samego DNA, transfekcję DNA skompleksowanego z dendrymerem 8 generacji (G8) z rdzeniem z amoniaku (NH3) [czyli dendrymerem G8 (NH3)] oraz transfekcję kompleksów DNA-dendrymer w obecności azydku sodowego, przykład 8. Na osi pionowej podano wchłanianie w 102 impulsów/104 komórek, a na osi poziomej czas (w godzinach). Pełne kwadraty dotyczą 23-nukleotydowego, syntetycznego oligomeru jednoniciowego; pełne kółka dotyczą kompleksu DNA/dendrymetr G8 (NH3); a pełne trójkąty dotyczą kompleksu DNA/dendrymer G8(NH3) z dodatkiem azydku sodowego.
Na fig. 22 przedstawiono wykres słupkowy transfekcji w zależności od kompleksu dendrymer-DNA, w którym DNA jest w części liniowy, w części kolisty, a w części super zwinięty, przykład 9. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej kompleks dendrymer-DNA. Pustymi słupkami przedstawiono wyniki uzyskane bez stosowania DEAE-dekstranu. Pełnymi słupkami przedstawiono wyniki uzyskane w 0,5 μΜ DEAE w dekstranie.
Na fig. 23 (A) - (D) przedstawiono zdjęcia 4 żeli do elektroforezy pokazując zdolność do kompleksowania DNA przez dendrymer G8 (NH3) i dendrymer G8 (EDA) przy różnych stosunkach ładunków i w różnych warunkach, przykład 10.
Na fig. 24 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy porównujące zdolność do wiązania DNA przez dendiymery G8 (NH3) i G11 (EDA) przy różnych stosunkach molowych, przykład 11.
Na fig. 25 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy porównujące zdolność do wiązania DNA przez dendrymery G8 (NH3) i G8 (EDA) w szerokim zakresie pH, przykład 12.
Na fig. 26 (A) i (B) przedstawiono zdjęcia żeli do elektroforezy ilustrujące stabilność wiązania DNA-dendrymer w roztworach soli o wzrastającym stężeniu chlorku sodowego, przykład 13.
Na fig. 27 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące stabilność i ochronę DNA skompleksowanego z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) w obecności różnych enzymów restrykcyjnych, przykład 14.
Na fig. 28 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące stabilność i ochronę DNA skompleksowanego z dendrymerami G8 (EDA) w obecności nukleaz komórkowych, przykład 15.
Na fig. 29 porównano zakres transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer i przy różnych stężeniach DNA w odniesieniu
182 237 do tej samej kombinacji w obecności dietyloaminoetylowego eteru dekstranu (DEAE-dekstran). Są to przykłady transfekcji lipidami, z zastosowaniem środka Lipofectin™ zamiast dendrymeru oraz bez stosowania DEAE-dekstranu, przykład 16. Na osi pionowej umieszczono plazmid kontrolny, dekstran kontrolny i różne plazmidowe kompleksy z 1 pg, 5 pg i 10 pg DNA, a na osi poziomej względne jednostki światła/pg białka. Słupki ukośnie zakreskowane reprezentują wyniki dla układu dendrymer/DEAE-dekstran. Słupki zakreskowane krzyżykami reprezentują wyniki dla samego dendrymeru. Słupki zakropkowane reprezentują wyniki dla środka Lipofectin™
Na fig. 30 przedstawiono stopień transfekcji dla dendrymerów (NH3) i dendrymerów (EDA) przy różnych stosunkach ładunków DNA-dendrymer, w pewnych przypadkach w obecności DEAE-dekstamu, a w innych bez DEAE-dekstranu, przykład 17. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer. Pełne kwadraty i ciągła linia odnoszą się do dendrymeru G9 (EDA); puste kwadraty i linia kreskowana odnoszą się do dendrymerów G9 (EDA) z DEAE-dekstranem; pełne kwadraty i ciągła linia odnoszą się do dendrymeru G9 (NH3); puste kwadraty i linia kreskowana odnoszą się do dendrymerów G9 (NH3) z DEAE-dekstranem.
Figura 31 jest podobna do fig. 30, lecz dotyczy dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów Gil (EDA), zawsze w obecności DEAE-dekstranu, przykład 17. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer. Pełne kółka odnoszą się do dendrymeru G8 (NH3), a pełne trójkąty odnoszą się do dendrymeru Gil (EDA).
Na fig. 32 przedstawiono wykres skuteczności transfekcji kompleksów DNA:dendrymer G7 (NH3), w obecności DEAE-dekstranu lub roztworu soli z dodatkiem buforu Hanksa (HBS), przykład 18. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer. Pełne kółka odnoszą się do roztworu soli z buforem Hanksa, a pełne trójkąty odnoszą się do DEAE-dekstranu.
Na fig. 33 przedstawiono wykres procentowego wzrostu transfekcji kompleksów dendrymer (NH3)-DNA w DEAE- dekstranie przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer, przykład 19. Na osi pionowej podano procentowy wzrost transfekcji (w stosunku do kontrolnego DEAE-dekstranu), a na osi poziomej generację dendrymeru. Słupki zakreskowane ukośnie odnosząsię do stosunku ładunków 1:1, słupki puste dotyczą stosunku ładunków 1:5, a słupki zakreskowane krzyżykami dotyczą stosunku ładunków 1:10.
Na fig. 34 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o różnym stosunku ładunków, w obecności DEAE-dekstranu i bez DEAE-dekstranu, przykład 20. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej podano stosunek ładunków DNA:dendrymer (na końcu z prawej strony umieszczono próbkę kontrolną, plazmid/DEAE-dekstran). Słupki puste dotyczą DEAE-dekstranu; słupki pełne dotyczą układu bez DEAE-dekstranu.
Na fig. 35 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o różnym stosunku ładunków i przy różnych w stężeniach DEAE-dekstranu, przykład 21. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na górnej osi poziomej podano stężenie DEAE-dekstamu (pM); na dolnej osi poziomej podano różne stosunki ładunków DNA:dendrymer dla każdego segmentu, w tym dla plazmidu kontrolnego.
Na fig. 36 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o stosunku ładunków 1:5 w porównaniu z transfekcjami z udziałem Lipofectin™ w różnych liniach komórkowych, przykład 22. Liczby na osi pionowej oznaczają numery próbek identyfikujące stosowane środki transfekcyjne (podane w przykładzie 22); a na osi poziomej względne jednostki światła/pg białka. Kolejne segmenty (w dół wykresu) badanych linii komórkowych są następujące: małpa: COS 7; ludzka: HMEC-1; mysz: 10-1; mysz: NIH 3T3 i szczur: Klon 9.
Na fig. 37 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o stosunku ładunków 1:5 w dwóch trudnych do transfekowania liniach komórkowych w porównaniu z transfekcjami przeprowadzanymi w tych komórkach z udziałem Lipofectin™, przykład 23. Liczby na osi pionowej oznaczają numery próbek, a na osi poziomej podano względne jednostki
182 237 światła/jig białka. Słupki zakreskowane ukośnie dotyczą linii komórkowych NRK52E, a słupki pełne linii YB2.
Na fig. 38 przedstawiono skuteczność transfekcji różnych kompleksów DNA:dendrymer z udziałem lub bez DEAE-dekstranu w porównaniu z transfekcjami z udziałem Lipofectin™ i Lipofectamine™, przykład 24. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stosunek ładunków lub dawkę, w tym dla próbki kontrolnej. Puste słupki dotyczą dendrymeru G8 fNH3); pionowo pokratkowane słupki dotyczą Lipofectin™; ukośnie zakreskowane słupki dotyczą dendrymeru G8 (NH3) z DEAE-dekstranem; słupki zakropkowane dotyczą Lipofectamine™, a słupki pokratkowane ukośnie dotyczą dendrymeru G11 (EDA) z DEAEdekstranem.
Na fig. 39 przedstawiono skuteczność transfekcji kompleksów DNA:dendrymer o różnych stosunkach ładunków, w obecności DEAE-dekstranu, dimetylosulfotlenku (DMSO), mieszanin tych składników lub bez ich dodatku, przykład 25. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej stosunek ładunków, w tym dla próbki kontrolnej. Słupki zakropkowane dotyczą etapu z DEAE-dekstranem i DMSO; słupki zakreskowane ukośnie dotyczą etapu z DEAE-dekstamem bez DMSO; słupki zakratkowane ukośnie dotyczą etapu bez DEAEdekstranu, z DMSO, a słupki zakratkowane pionowo dotyczą etapu bez DEAE-dekstranu, bez DMSO.
Na fig. 40 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA ukierunkowanego ASGPR, skompleksowanego z dendrymerem skoniugowanym z triglicerydem galaktozy, przykład 26. Na osi pionowej podano względne jednostki światła/pg białka, a na osi poziomej linie komórkowe i status receptora. Słupki puste dotyczą skoniugowanych dendrymerów, a słupki zakreskowane ukośnie dotyczą dendrymerów nieskoniugowanych.
Na fig. 41 przedstawiono zdjęcie żelu do elektroforezy ilustrujące zdolność do wiązania DNA przez Gil (EDA) ze skoniugowanym trisacharydem galaktozowym lub bez niego, przykład 26.
Na fig. 43 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA skompleksowanego z różnymi ukierunkowanymi, nieukierunkowanymi i powierzchniowo zmodyfikowanymi dendrymerami, przykład 27. Na osi pionowej podano procentowy wzrost w stosunku do plazmidu kontrolnego, a na osi poziomej plazmidu kontrolnego, a na osi poziomej różne kompleksy DNA-dendymer. Słupki puste dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:1, słupki pełne dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5, a słupki ukośnie zakreskowane dotyczą stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10.
Na fig. 44 przedstawiono skuteczność transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami, w przypadku których oznaczano ekspresję transfekowanego DNA, przykład 28. Na osi pionowej podano procentowy wzrost w stosunku do plazmidu kontrolnego, a na osi poziomej różne kompleksy DNA-dendrymer. Słupki reprezentują okres czasu (w godzinach) między transfekcją i zbiorem. Słupki puste dotyczą 21 godzin; słupki zakreskowane ukośnie z góry do dołu od lewej do prawej dotyczą45 godzin; słupki zakreskowane ukośnie z góry do dołu od prawej do lewej dotyczą 69 godzin; a słupki pełne dotyczą 141 godzin.
Na fig. 45 przedstawiono wykres cytotoksyczności w linii komórek RAT2 dendrymerów G8 (NH3) i G 8 (EDA) z i bez DNA oraz w obecności lub bez DEAE-dekstranu, przykład 29. Na osi pionowej podano % obumarłych komórek; a na osi poziomej stężenie dendrymeru w lewej części i stężenie dendrymeru-DEAE-dekstranu w prawej części. Słupki puste dotycządendrymeru G8 (EDA); słupki ukośnie zakreskowane dotyczą dendrymeru G8(NH3).
Na fig. 46 przedstawiono podobny wykres cytotoksyczności dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów G8 (EDA) w różnych liniach komórek, przykład 29. Na osi pionowej podano % obumarłych komórek; a na osi poziomej stężenie różnych badanych dendrymerów. Słupki puste dotyczą układu bez DEAE-dekstranu; a słupki pełne dotyczą układu z 0,5 μΜ DEAE-dekstranu. Zastosowano następujące linie komórek (od lewej do prawej: Klon 9, NIH 3T3, 10-1 i COS7.
Na fig. 47 (a) -(f) przedstawiono wykres wchłaniania przez komórki i umejscowienie DNA w dwóch różnych liniach komórek, z których pewne transfekowano bez dendrymerów, pewne
182 237 z dendrymerami i pewne z dendrymerami w obecności azydku sodowego, przykład 30. Na osi pionowej wszystkich wykresów podano wchłanianie w 102 impulsów/104 komórek, a na dolnej osi poziomej czas w godzinach. Figury (A)-(C) dotyczą komórek U937, a fig. (D)-(F) komórek Rat 2. Górne osi poziome dla fig. (A) i (D) dotyczą samego DNA, dla fig. (B) i (E) DNA z dendrymerem, a dla fig. (C) i (F) DNA z dendrymerem i azydkiem sodowym. Na wszystkich wykresach pełne kwadraty dotycząjądra, pełne kółka dotycząbłony, a pełne trójkąty dotyczą części komórki.
Na fig. 48 (a) i (b) przedstawiono fotografie komórek, z których część została z powodzeniem transfekowana za pomocą RSV-lacZ DNA, który w wyniku ekspresji wytwarza enzym β-galaktozydazę, przykład 31.
Figura 49 jest podobna do figury 48, z tym że przedstawia fotografię w powiększeniu, a plazmid RSV-lacZ zastosowano w ilości 3 pg/studzienkę, przykład 31.
Figury 50 (a) i (b) sąpodobne do fig. 48, z tym że dotyczą komórek fibroblastu szczura RAT 2; porównano komórki transfekowane (A) i nietransfekowane (B), przykład 71.
Na fig. 51 (a) - (c) zilustrowano proces transfekcji materiału genetycznego.
Na fig. 52 przedstawiono na wykresie liczbę klonów uzyskanych z komórek D5 transfekowanych plazmidem RSV-p-gal-NEO. Oporne klony komórek wyselekcjonowano antybiotykiem, genetycyną (G418) (Gibco/BRL), po czym przeprowadzono transfekcję w komórkach macierzystych z wykorzystaniem szeregu różnych technik, w tym według wynalazku, przykład 32. Na osi pionowej podano liczbę klonów, a liczby na osi poziomej oznaczają podane w przykładzie 32 numery identyfikujące ilości DNA i warunki transfekcji w próbach. Słupki puste dotyczą klonów opornych na G418, a słupki pokratkowane pionowo dotyczą klonów wytwarzających enzym β-galaktozydazę.
Na fig. 53 przedstawiono wykres porównujący liczbę klonów uzyskanych z komórek RAT2 transfekowanych plazmidem RSV-p-gal-NEO z wykorzystaniem różnych technik, w tym według wynalazku, przykład 32. Klony wyselekcjonowano genetycyną (G418) pod względem oporności na neomycynę, a następnie oceniano ich aktywność β-galaktozydazową. Na osi pionowej podano liczbę klonów, a liczby na osi poziomej oznaczają podane w przykładzie 32 numery identyfikujące ilości DNA i warunki transfekcji w próbach. Słupki puste dotyczą klonów opornych na G418, a słupki zakreskowane ukośnie dotyczą klonów wytwarzających enzym β-galaktozydazę.
Na fig. 54 przedstawiono wykres ilustrujący powstawanie komórek MSU 1.2 trwale transfekowanych plazmidem EBV-A DNA. Na osi pionowej podano liczbę kolonii na 1 χ106 komórek, a na osi poziomej numery próbek (określone w przykładzie 32).
Na fig. 55 przedstawiono wyniki analizy śledzącej FACS (fluoroscencja) różnych klonów komórkowych transfekowanych plazmidem ekspersji ICAM. Na wszystkich rysunkach na osi pionowej podano liczbę komórek, a na osi poziomej liczbę komórek z ekspresją ICAM (fluorescencja), przykład 32.
Na fig. 56 przedstawiono aktywność Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji kontrolowanym przez pH agregatem dendrymerowym przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Na osi pionowej względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek zastosowanych w teście, przykład 34.
Na fig. 57 przedstawiono aktywność Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji z wykorzystaniem dendrymerów zmodyfikowanych lizyną i dendrymerów niemodyfikowanych, w obecności DEAE-dekstamu, przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Na osi pionowej względne jednostki światła/pg białka, a liczby na osi poziomej stanowią numery próbek zastosowanych w teście, przykład 35.
Na fig. 58 pokazano wyniki transfekcji dwóch linii komórek (COS 1 i RAT2), transfekowanych różnymi dendrymerami, dendrymerami polidyspersyjnymi i innymi środkami transfekującymi. Na osi pionowej względne jednostki światła/3 pg białka, a liczby na osi poziomej oznaczają numery próbek i stosunki ładunków różnych stosowanych środków transfekujących, przykład 36.
182 237
Na fig. 59 pokazano fotografie zabarwionych hodowli komórek czerniaka melanomy myszy D5, których komórki macierzyste zostały poddane transfekcji plazmidowym DNA RS Υ-β-gal. Trwałe transformanty (kolonie) wyselekcjonowano za pomocą G418 (przykład 32). Jako nośniki transfekcji w komórkach macierzystych każdej z ponumerowanych hodowli zastosowano:
1. 10 pg DNA z fosforanem wapnia
2. 10 pg DNA z DEAE-dekstranem
3. 5 pg DNA z 0,5 pM G8 (NH3)
4. 10 pg DNA z 0,5 pM G8 (NH3)
5. 5 pg DNA z 0,2 pM G8 (NH3)
Figura 60 składa się z różnych ponumerowanych zdjęć.
Zdjęcie 1 stanowi mikrofotografię sekcji tkanki nowotworu czerniaka myszy D5, do którego wstrzyknięto in vivo 10 pg DNA plazmidu RS Υ-β-gal skompleksowanego z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Zajście transfekcji komórek nowotworowych potwierdziła obecność komórek D-5 wytwarzających w wyniku ekspresji β-gal, o czym świadczy ciemne (błękitne) zabarwienie widzialne na zdjęciu 1, przykład 37.
Zdjęcie 2 stanowi mikrofotografię próbki kontrolnej tkanki ze zdjęcia 1, nowotworu czerniaka myszy D5, do którego wstrzyknięto tylko dendrymer G11 (EDA), przykład 37.
Na zdjęciach 3, 4 i 5 przedstawiono mikrofotografie elektronowe następujących kompleksów DNA:dendrymer, przykład 43.
Zdjęcie 3 - DNA z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10;
Zdjęcie 4 - jak zdjęcie 3, ale po dodaniu DEAE-dekstranu; oraz
Zdjęcie 5 - DNA z mieszaniną dendrymerów o polidyspersyjnej wielkości, przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10.
Na fig. 61A i 61B przedstawiono wykresy porównujące transfekcję z wykorzystaniem różnych dendrymerów typu gęstej gwiazdy lub ich kombinacji przy różnych stosunkach ładunków oraz w trzech różnych warunkach: transfekcja z wykorzystaniem samego kompleksu materiału genetycznego z dendrymerem (słupki kropkowane); te same kompleksy materiału genetycznego z dendrymerem, w obecności DEAE-dekstranu (słupki kreskowane ukośnie); oraz te same kompleksy materiału genetycznego z dendrymerem, w obecności chlorochiny (pełne słupki). Uzyskane wyniki przedstawione graficznie na fig. 61A wykazują, że wystąpiła transfekcja komórek COSI, a wyniki na fig. 6IB wskazują, że nastąpiła transfekcja komórek RAT2, Na osi pionowej względne jednostki światła/3 pg białka, a liczby na osi poziomej oznaczają numery próbek kompleksu materiał genetyczny:dendrymer z przykładu 33.
Na fig. 62 przedstawiono wykres porównujący transfekcję z zastosowaniem opartych na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzionych dendrymerów, w transfekcji przy wykorzystaniu dendrymerów typu gęstej gwiazdy, przykład 38. Na osi względne jednostki światła/3 pg białka, a na osi poziomej podano zastosowany dendrymer. Słupki puste dotyczą układu bez DEAE-dekstranu, a słupki pełne układu z DEAE-dekstranem.
Polimery typu gęstej gwiazdy zilustrowane sąna fig. 1, na której I w kółku [„rdzeń (I)”] oznacza rdzeń inicjatora (na tym rysunku trójfunkcyjny rdzeń inicjatora pokazano z lewej strony rysunku); Z oznacza grupę końcową, pokazaną po raź pierwszy na drugim rysunku od lewej strony przedstawiającym rozgałęziony oligomer gwiaździsty; A, B, C, D i E reprezentują określone generacje cząsteczkowe dendrymerów typu gęstej gwiazdy; a (A)n, (B)n, (C)n, (D)n i (E)n oznaczają rozgałęzione dendrymery typu gęstej gwiazdy.
Dendrymery typu gestej gwiazdy stanowią zestawy jednakowych cząsteczek wykazujące trzy wyróżniające cechy strukturalne, a mianowicie (a) rdzeń inicjatora, (b) warstwy wewnętrzne (generacje, G lub Gen) składające się z powtarzalnych jednostek promieniowo przyłączonych do rdzenia inicjatora, oraz (c) powierzchnię zewnętrzną o końcowej funkcyjności (to znaczy z końcowymi grupami funkcyjnymi) przyłączonymi do zewnętrznej generacji. Wielkość i kształt cząsteczki dendrymeru typu gestej gwiazdy oraz grupy funkcyjne występujące w cząsteczce dendrymeru można regulować dobierając rdzeń inicjatora, liczbę generacji (czyli strukturę wiążącą, która tworzona jest przez każdą generację, gdy przechodzi ona w następną generację) stosowanych
182 237 przy wytwarzaniu dendrymeru, a także dobierając powtarzalne jednostki stosowane w każdej generacji. W związku z tym, że dendrymery można wydzielić na poziomie dowolnej wybranej generacji, umożliwia to uzyskanie dendrymerów o wymaganych właściwościach. Właściwości dendrymerów typu gestej gwiazdy ujawniają się wtedy, gdy występują wszystkie powyższe trzy cechy strukturalne. Cechy te zostały dokładniej przedstawione przez Petara R. Dvomica i Donalda A. Tomalię w Chem. in Britain, 641-645, sierpień 1994. W opisie dendrymery określa się podając liczbę generacji i stosowany rdzeń inicjatora, np. dendrymer G7 (EDA).
Dobór składników dendrymeru typu gestej gwiazdy wpływa na właściwości dendrymerów. Rodzaj rdzenia inicjatora może wpływać na kształt dendrymeru, tak że (w zależności od wybranego rdzenia inicjatora) uzyskuje się np. dendrymery o kształcie sferoidalnym, dendrymery o kształcie cylindrycznym lub prętowym, dendrymery o kształcie elipsoidalnym lub dendrymery w kształcie grzyba. Budowanie kolejnych generacji (czyli liczba generacji oraz wielkość i charakter powtarzalnych jednostek) decyduje o wymiarach dendrymerów i charakterze ich wnętrza.
Z uwagi na to, że dendrymery typu gestej gwiazdy sąrozgałęzionymi polimerami z dendrytowymi gałęziami zawierającymi grupy funkcyjne rozmieszczone na końcach rozgałęzień, mogą one znacznie różnić się właściwościami. Tak np. makrocząsteczki przedstawione na fig. 2A (np. patent USA nr 4 289 872, Denkelwalter) oraz dendrymery typu gęstej gwiazdy według wynalazku znacznie różnią się właściwościami na skutek różnych długości gałęzi. Dendrymery typu przedstawionego na fig. 2A zawierająniesymetryczne połączenia gałęziowe (o nierównych segmentach), zewnętrzne (czyli powierzchniowe) grupy (zaznaczone jak Z) i grupy wewnętrzne (zaznaczone jako Z) oraz bardzo mało pustej przestrzeni wewnętrznej. Korzystny typ dendrymeru przedstawiony na fig. 2B zawiera symetryczne połączenia gałęziowe (o równych segmentach) z grupami powierzchniowymi (zaznaczonymi jako Z), dwie różne grupy wewnętrzne (zaznaczone jako X i Z) i wewnętrznąpustąprzestrzeń, której wielkość zmienia się w zależności od generacji (G). Dendrymery typu przedstawionego na fig. 2B można rozwijać do osiągnięcia takiej liczby generacji, aby były one całkowicie zamknięte i zawierały pustąprzestrzeń, tak że uzyskuje się element o zasadniczo pustym wnętrzu i bardzo zagęszczonej powierzchni.
Dla dendrymerów typu gestej gwiazdy decydujące znaczenie ma przede wszystkim struktura wiążąca, a nie skład elementarny. Z tego względu powtarzalne jednostki mogą zawierać kombinację dowolnych pierwiastków, pod warunkiem, że istnieje możliwość ich powtarzania się i można z nich stworzyć strukturę kondygnacyjną, jak to przedstawiono w opisie. Takie powtarzalne jednostki mogą składać się w całości z pierwiastków powszechnie występujących w strukturach polimerowych, takich jak węgiel, wodór, tlen siarka, azot i krzem, albo też mogą składać się z pierwiastków mniej tradycyjnych, pod warunkiem że taka powtarzalna jednostka umożliwia utworzenie stabilnej rozgałęzionej struktury. Tak np. wiadomo, że metaloidy i metale przejściowe tworzą trwałe związki kowalencyjne i kompleksy z grupami organicznymi. Takie trwałe związki kowalencyjne i kompleksy z grupami organicznymi mogą występować jako materiały rozgałęzione, np. borowodoty, borany oraz związki germanu, cyny i ołowiu, albo jako nierozgałęzione łączniki, np. dialkilocynk lub związki rtęci. Zastosowanie odpowiednich ligandów może spowodować, że metal przejściowy taki jak kobalt, będzie działać jako element rozgałęziający (w wyniku połączenia z trzema oddzielnymi ligandami) lub połączenie nierozgałęzione (w wyniku połączenia z dwoma odrębnymi ligandami). Z tego względu rozgałęzione struktury pasujące do opisanych modeli i zawierające dowolny pierwiastek, objęte są zakresem wynalazku.
Ponadto dendrymery typu gęstej gwiazdy, gdy dojdą do odpowiedniej generacji, będą wykazywać „gęste upakowanie gęstej gwiazdy”, gdy powierzchnia dendrymeru zawierać będzie taką ilość grup końcowych, że powierzchnia dendrymeru staje się zagęszczona i zamyka puste przestrzenie we wnętrzu dendrymeru. Zagęszczenie może stanowić barierę na poziomie molekularnym, którą można wykorzystać do regulowanej dyfuzji materiałów do wnętrza lub na zewnątrz dendrymerów.
Chemizm powierzchni dendrymerów można regulować przede wszystkim poprzez dobór powtarzalnych jednostek zawierających pożądane chemiczne grupy funkcyjne, albo poprzez
182 237 chemiczną modyfikację całości lub części funkcyjnych grup powierzchniowych, tak aby utworzyć nowe funkcyjne grupy powierzchniowe. Tak np. powierzchnie można ukierunkować na określone miejsca docelowe albo też spowodować, że będą one odporne na wchłanianie przez określone organy lub komórki, np. przez komórki układu siateczkowo-środbłonkowego.
W wariantowym stosowaniu dendrymerów typu gęstej gwiazdy same dendrymery mogą być połączone w różny sposób („zasocjowane”) tworząc grupy polidendrytowe (mostkowe dendrymery typu gęstej gwiazdy lub agregaty dendrymerów) bądź też agregaty dendrymerów typu gęstej gwiazdy, które są również przydatne jako nośniki w kompleksach.
Na dodatek wytwarzać można dendrymery tak, żeby wykazywały one odchylenia od równomiernego rozgałęzienia w określonych generacjach, powodując w ten sposób powstanie nieciągłości (czyli odchylenia od równomiernego rozgałęzienia w określonych miejscach dendrymeru) oraz odmienne właściwości dendrymeru.
Polimery typu gęstej gwiazdy stosowane w kompleksach typu gęstej gwiazdy wytwarzać można znanymi sposobami, np. według patentu USA nr 4 587 329, którego ujawnienie wprowadza się jako źródło literaturowe. Dendrymery poliaminowe wytwarzać można w reakcji amoniaku lub aminy zawierającej szereg pierwszorzędowych grup aminowych lub drugorzędowe grupy aminowe z N-podstawioną azyrydyną taką jak N-tosylo- lub N-mesyloazyrydyna, uzyskując chroniony polisulfonamid pierwszej generacji. Polisulfonamid pierwszej generacji aktywuje się następnie kwasem takim jak kwas siarkowy, solny, trifluorooctowy, fluorosulfonowy lub chlorosulfonowy, uzyskując sól poliaminy pierwszej generacji. Odsulfonylowanie korzystnie przeprowadza się stosując mocny kwas, który jest na tyle lotny, że można go usunąć na drodze destylacji, taki jak kwas solny. Sól poliaminy pierwszej generacji można następnie poddać dalszej reakcji zN-chronionąazyrydynąuzykując chroniony polisulfonamid drugiej generacji. Sekwencję tą można powtarzać w celu wytworzenia poliamin wyższej generacji.
Poliamidoaminy wytwarzać można poddając najpierw amoniak (albo aminę zawierającą szereg pierwszo- i/lub drugorzędowych grup aminowych) z akrylanem metylu w warunkach umożliwiających zajście addycji Michaela jednej cząsteczki amoniaku z trzema cząsteczkami akrylanu metylu z wytworzeniem adduktu. Po usunięciu nieprzereagowanego akrylanu metylu związek poddaje się reakcji z nadmiarem etylenodiaminy w takich warunkach, że jedna grupa aminowa w cząsteczce etylenodiaminy przereagowuje z grupą metylokarboksylanową adduktu rdzenia z wytworzeniem adduktu pierwszej generacji z trzema grupami amidoaminowymi. Po usunięciu nieprzereagowanej etylenodiaminy addukt pierwszej generacji poddaje się reakcji z nadmiarem akrylanu metylu w warunkach addycji Michaela, uzyskując addukt drugiej generacji zawierający końcowe grupy estru metylowego. Addukt drugiej generacji poddaje się następnie reakcji z nadmiarem etylenodiaminy w warunkach, w których powstaje amid, uzyskując pożądany poliamidoaminowy dendrymer zawierający uporządkowane dendrytowe rozgałęzienia drugiej generacji z końcowymi grupami aminowymi. Podobne dendrymery zawierające grupy amidoaminowe wytwarzać można stosując aminy organiczne jako związek rdzeniowy, np. etylenodiaminę, z której otrzymuje się cztero-rozgałęziony dendrymer, albo dietylenotriaminę, z której otrzymuje się pięcio-rozgałęziony dendrymer.
W celu uzyskania bezwodnych polietylenoimin typu gęstej gwiazdy po rozszczepieniu wiązania sulfonamidowego kwasem dodać można rozpuszczalnik, który tworzy azeotrop z wodą, taki jak benzen, toluen, ksylen lub mezytylen, korzystnie toluen, po czym uzyskany azeotrop woda/rozpuszczalnik usuwa się na drodze destylacji azeotropowej, np. ogrzewając mieszaninę do wrzenia i usuwając wodę za pomocą nasadki Deana -Starka. W etapie osuszania można także wykorzystać chlorowane rozpuszczalniki, w których rozpuszcza się bezwodna polietylenoimina, takie jak chloroform. Poprzez dodanie chlorowanego rozpuszczalnika lub rozpuszczalnika tworzącego azeotrop z wodą unika się konieczności ogrzewania polimeru w temperaturach, w których następuje zwęglenie lub degradacja polimeru. Bezwodne polietylenoiminy są szczególnie przydatne jako nośniki materiałów antygenowych (przeciwciał lub fragmentów przeciwciał).
Wytwarzać można dendrymery o bardzo równomiernej wielkości i kształcie, przy czym najważniejsze jest doprowadzenie do uzyskania zwiększonej ilości grup funkcyjnych na jedno
182 237 stkę powierzchni dendrymeru, a ponadto mogą one zawierać więcej grup funkcyjnych w przeliczeniu na jednostkę objętości cząsteczki w porównaniu z innymi polimerami o takim samym ciężarze cząsteczkowym, o takim samym rdzeniu i takich samych składnikach monomerycznych oraz o takiej samej liczbie rozgałęzień od rdzenia jak polimery typu gęstej gwiazdy. Zwiększona gęstość grup funkcyjnych w gęstych polimerach typu gęstej gwiazdy umożliwić może przenoszenie większej ilości materiału przez dendrymer. W związku z tym, że liczbę grup funkcyjnych regulować można zarówno na powierzchni jak i we wnętrzu dendrymerów, umożliwia to regulację np. ilości środka biologicznie czynnego dostarczanego przez dendrymer.
Stwierdzić można analogię między dendrymerami typu gęstej gwiazdy wczesnych generacji (np. generacji 1-7) i klasycznymi kulistymi micelami. Analogię między dendrymerem i micelą wyciągnięto porównując wspólne cechy takie jak kształt, wielkość i charakterystyka powierzchni.
Tabela I
Parametr Regularne klasyczne micele Dendrymery typu gęstej gwiazdy
Kształt kuliste kuliste
Wielkość (średnica) 20-60 A 17-67 A
Liczba agregacji powierzchniowych 4-202 Z = 6-192 (Z oznacza liczbę grup powierzchniowych) (generacja 2-7)
. . - 2 Powierzchnia/grupę powierzchniową (A ) 130-80 A2 127-75 A2
(A = 10’1 nm; A2 = 10‘2 nm2
W tabeli I kształt zweryfikowano metodą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Wielkość zweryfikowano na podstawie lepkości istotnej [η] i chromatografii wykluczenia według wielkości (SEC). Liczby agregacji powierzchniowych zweryfikowano na podstawie miareczkowania i NMR. w wysokim polu. Wielkość powierzchni/grupę funkcyjną wyliczono na podstawie pomiarów hydrodynamicznych SEC.
Poliamidoaminowe (PAMAM) dendrymery pierwszych generacji stanowią mikrodomeny, które ściśle imitują klasyczne kuliste micele prawie pod każdym względem (to znaczy w aspekcie kształtu, wielkości, liczby grup powierzchniowych i stosunku grup do powierzchni). Jednakże występuje podstawowa różnica związana z tym, że są one związane kowalencyjnie i trwałe przeciwieństwie do stanu dynamicznej równowagi występującego w micelach. Różnica ta stanowi ważną zaletę gdy takie mikrodomeny zastosuje się jako elementy kapsułkujące.
Gdy wprowadzi się kolejne koncentryczne generacje powyżej piątej, wystąpi zagęszczenie powierzchni. Zagęszczenie to może doprowadzić do wzrostu właściwości barierowych powierzchni, co objawia się zmniejszeniem powierzchni przypadającej na grupę czołową (powierzchniową), jak to pokazano w tabeli II.
Tabela II
Zależność cech dendrymeru PAMAM od generacji
Generacje 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Liczba grup powierzchniowych Z 3 6 12 24 48 96 192 384 768
Ciężar cząsteczkowy 275 875 2411 5147 10 619 21 563 43 541 87 227 174 779
Średnica oznaczona metodą SEC* 10,4 A 15,8 A 22 A 31 A 40 A 53 A 67 A 76 A 88 A
182 237 cd. tabeli II
Generacje 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Powierzchnia na dendrymer 366 A2 783 A2 1519 A2 3018 A2 5024 A2 8820 A2 14096 A2 18136 A2 24328 A2
Powierzchnia na grupę Z 122 A2 131 A2 127 A2 126 A2 104 A2 92 A2 73 A2 47 A2 32 A2
Odległość miedzy grupami Z 12,4 A 12,8 A 12,7 A 12,6 □ 11,5 A 10,8 A 9,8 A 7,75 A 6,28 A
Objętość porów 311,6 A3 1 470 A3 4 737 A3 11427 A3 - - - - -
* średnice hydrodynamiczne wyznaczono metodą chromatografii z wykluczeniem wymiarowym z zastosowaniem do kalibracji jako wzorców monodyspersyjnego (Mw/Mn = 1,02) politlenku etylenu
A = 10'1 nm; 1 A2 = 10'2 nm2; 1 A3 = 10’3 nm3
Tak np. w przypadku zakończonych aminą generacji 5,0,6,0,7,0,8,0 i 9,0 powierzchnia na grupę Z maleje z 104 odpowiednio do 92,73,47 i 32 A2. Taka cecha odpowiada przemianie z mniej zagęszczonej powierzchni do bardziej zagęszczonej powierzchni micelopodobnej z powstawaniem dwuwarstwowej/monowarstwowej powierzchni typu barierowego występującej w pęcherzykach (liposomach) lub błonach typu Langmuira-Blodgetta.
Gdy wystąpi zagęszczenie powierzchni, zaobserwować można zmianę charakterystyk fizycznych i morfologii w miarę zwiększania się generacji od generacji pośrednich (G6-G8) do generacji bardziej zaawansowanych (G9 i G10). Skaningowe transmisyjne mikrofotografie elektronowe (STEM) dla generacji (G) = 7,0 8,0 i 9,0 po usunięciu metanolu jako rozpuszczalnika z każdej z próbek i uzyskaniu bezbarwnych, jasno żółtych stałych błon, które następnie zabarwiono tetratlenkiem osmu. W stadium generacji (G) = 9,0 wystąpiła przewidywana zmiana morfologiczna. Dla G = 9 stwierdzono występowanie pustego wnętrza o średnicy około 63 A otoczonego zaciemnionym obrzeżem o grubości około 22 A. Prawdopodobnie metanolowy rozpuszczalnik został uwięziony wewnątrz 22 A zewnętrznej błonopodobnej bariery tworząc bezbarwne wnętrze. W związku z tym przy G = 9,0 PAMAM typu gęstej gwiazdy zachowuje się topologicznie jak pęcherzyk (liposom). Jednakże taka gęsta gwiazda jest o rząd wielkości mniejsza i bardziej monodyspersyjna niż liposom, a ponadto jest fizycznie trwalsza niż liposom. W związku z tym dendrymery stosowane w sposobie według wynalazku zawierająna tyle duże puste wnętrze, aby molekularnie kapsułkować wypełnione rozpuszczalnikiem puste przestrzenie o średnicy dochodzącej do 63 A (objętość około 131 000 A3). Okazuje się, że przy takim stadium zaawansowanej generacji takie prototypy o wielkości miceli zachowują się jak kowalencyjnie związane liposomy.
W związku z tym, że liczbę grup funkcyjnych w dendrymerze można regulować zarówno na jego powierzchni jak i we wnętrzu, stwarza to możliwość regulowania ilości przenoszonego materiału, który ma być dostarczany przez dendrymer. Dendrymery stanowią ukierunkowane nośniki środków, umożliwiające doprowadzenie przenoszonego materiału do określonego determinantu lub miejsca docelowego w komórce.
Do dendrymerów nadających się do stosowania w takich kompleksach należą polimery typu gęstej gwiazdy ujawnione w patentach USA nr 4 507 466,4 558 120,4 568 737 i 4 587 329, które wprowadza się jako źródła literaturowe.
Do kompleksów typu gestej gwiazdy należą kompleksy określone wzorem (Ρ)χ * (M)y (I) w którym każdy z P oznacza dendrymer x oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej;
182 237 każdy z M oznacza jednostkę (np. cząsteczkę, atom, jon i/lub innąjednostkę podstawową) przenoszonego materiału, przy czym przenoszonym materiałem może być ten sam przenoszony materiał lub różny przenoszony materiał;
y oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej; a * oznacza, że przenoszony materiał jest zasocjowany z dendrymerem; oraz pod warunkiem, że przenoszony materiał zachowuje swą skuteczność.
Gdy przenoszonym materiałem jest materiał genetyczny, w powyższym wzorze (I) P może stanowić polimer typu gęstej gwiazdy lub polimer dendrytowy.
W koniugatach typu gwiazdy o wzorze (I), dendrymery typu gęstej gwiazdy mogą być połączone ze sobą kowalencyjnie, mogą to być dendrymery typu gęstej gwiazdy mostkowe, ewentualnie połączone grupami łączącymi tak, że tworzą zestawy polidendrytowe (czyli x> 1).
W użytym znaczeniu określenie „zasocjowany” oznacza że jeden lub więcej przenoszonych materiałów może być fizycznie kapsułkowany lub uwięziony w rdzeniu dendrymeru, częściowo lub całkowicie zdyspergowany w dendrymerze, przytwierdzony lub przyłączony do dendrymeru, albo dowolną kombinację powyższych rozwiązań, przy czym przytwierdzenie lub przyłączenie może wystąpić w wyniku wiązania kowalencyjnego, wiązania wodorowego, adsorpcji, absorpcji, wiązania metalicznego, sił van der Waalsa lub wiązania jonowego, albo dowolnej ich kombinacji. Przy zasocjowaniu jednego lub więcej przenoszonych materiałów z dendrymerem (dendrymerami) można ewentualnie wykorzystać łączniki i/lub odstępniki dla ułatwienia wytwarzania lub stosowania koniugatów typu gęstej gwiazdy. Do odpowiednich grup łączących należą grupy, które łącząprowadnik docelowy (czyli T) z dendrymerem (czyli P), nie wpływając w znaczącym stopniu na skuteczność prowadnika lub skuteczność dowolnego z innych przenoszonych materiałów (czyli M) obecnych w koniugacie typu gestej gwiazdy. Takie grupy łączące mogą być odszczepialne lub nieodszczepialne i są zazwyczaj stosowane, aby wyeliminować zawadę przestrzenną miedzy prowadnikiem docelowym i dendrymerem, przy czym korzystnie grupy łączące są stabilne (czyli nieodszczepialne). W związku z tym, że wielkość, kształt i gęstość grup funkcyjnych w dendrymerach typu gęstej gwiazdy można bardzo dokładnie regulować, istnieje wiele sposobów, jakimi przenoszony materiał można zasocjować z dendrymerem. Tak np. (a) występować może asocjacja typu kowalencyjnego, kolumbowskiego, hydrofobowego lub chelatującego między jednym lub więcej przenoszonymi materiałami i elementami, zazwyczaj grupami funkcyjnymi usytuowanymi na lub w sąsiedztwie powierzchni dendrymeru; (b) występować może asocjacja typu kowalencyjnego, kolumbowskiego, hydrofobowego lub chelatującego między jednym lub więcej przenoszonymi materiałami i grupami znajdującymi się we wnętrzu dendrymeru; (c) wytworzyć można taki dendrymer, w którym przeważająca część wnętrza jest pusta, co umożliwi uwięzienie (np. fizycznie lub poprzez zasocjowanie z wewnętrznymi grupami dendrymeru typu gęstej gwiazdy) przenoszonych materiałów we wnętrzu (w objętości utworzonej przez pory) (np. magnetyczne lub paramagnetyczne rdzenie lub domeny utworzone przez chelatowanie i redukcję jonów metalu do stanu wartościowości 0 w dendrymerze), przy czym dendrymery zawierające wnętrze magnetyczne wykorzystać można do zbierania różnych elementów biologicznie czynnych, które mogą być skompleksowane z powierzchniami różnych dendrymerów poprzez zastosowanie magnesów itp., a uwalnianie przenoszonego materiału można ewentualnie regulować zagęszczając powierzchnię dendrymeru grupami regulującymi dyfuzję; albo (d) stosując różne kombinacje wyżej wspomnianych zjawisk.
Do dendrymerów oznaczanych symbolem „P” należą polimery typu gęstej gwiazdy opisane w patentach USA nr 4 507 466,4 558 120,4 568 737 lub 4 587 329.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy o wzorze (I) wytwarza się w reakcji P z M, zazwyczaj w odpowiednim rozpuszczalniku, w temperaturze ułatwiającej połączenie przenoszonego materiału (M) z dendrymerem typu gęstej gwiazdy (P).
Do odpowiednich rozpuszczalników należą te rozpuszczalniki, w których P i M co najmniej częściowo mieszają się ze sobą, przy czym rozpuszczalniki te są obojętne w stosunku do tworzenia się koniugatu. Jeśli P i M co najmniej częściowo mieszają się ze sobą, rozpuszczalnik może nie być konieczny (tak że reakcja może przebiegać bez rozpuszczalnika). W razie potrzeby sto
182 237 sować można mieszaniny odpowiednich rozpuszczalników. Do przykładowych odpowiednich rozpuszczalników należy woda, metanol, etanol, chloroform, acetonitryl, toluen, dimetylosulfotlenek i dimetyloformamid.
Warunki reakcji wytwarzania kompleksu typu gęstej gwiazdy o wzorze (I) zależą od konkretnego dendrymeru (P), przenoszonego materiału (M) oraz od charakteru powstającego wiązania (*). Zazwyczaj temperatura może wahać się od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia. Dobór określonego rozpuszczalnika i temperatury jest oczywisty dla specjalisty.
Stosunek M:P zależeć będzie od wielkości dendrymeru i ilości przenoszonego materiału. Tak np. stosunek molowy (stosunek moli) dowolnego jonowego M do P wynosi zazwyczaj 0,1-1 000:1, korzystnie 1-50:1, a jeszcze korzystniej 2-6:1.
Inne kompleksy typu gęstej gwiazdy stanowią kompleksy zawierające prowadnik docelowy (oznaczony symbolem „T”), które można przedstawić wzorem (T)e * (P)x * (M)y (II) w którym każdy z T oznacza prowadnik docelowy;
e oznacza liczbę całkowitą równą 1 lub powyżej;
P, x, *, M oraz y mają znaczenie podane wyżej;
przy czym M zachowuje swą skuteczność.
Korzystne są również te kompleksy, w których e = 1 lub 2; oraz te, w których x = 1, a y = 2 lub powyżej. Szczególnie korzystne sąte koniugaty, w których x = 1, e = 1, y = 2 lub powyżej, a M i T są zasocjowane z polimerem poprzez takie same lub różne łączniki.
Dodatkowo T i/lub M w koniugacie o wzorze (Π) mogą być powlekane lub ekranowane, aby zapobiec immunogenności lub reakcji RSE, np. w wątrobie. Do środków, które można zastosować w tym celu, należy glikol polietylenowy (PEG) lub inne znane środki.
Kompleksy typu gęstej gwiazdy o wzorze (Π) otrzymywać można wytwarzając T*P, a następnie dodając M, albo wytwarzając P*M, a następnie dodając T. Reakcje według obydwu schematów przeprowadza się w warunkach nie wpływających niekorzystnie na określony składnik kompleksu (takie jak określone pH, temperatura lub stężenie soli), oraz w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika, gdy jest to konieczne. W celu regulowania pH stosuje się bufor lub dodaje się odpowiedni kwas lub zasadę. Warunki reakcji zależą od rodzaju powstającego zasocjowania (*), stosowanego dendrymeru typu gęstej gwiazdy (P), przenoszonego materiału (M) i prowadnika docelowego (T).
Stosunek molowy T:P wynosi korzystnie 1:1, zwłaszcza wtedy, gdy T stanowi przeciwciało lub fragment przeciwciała. Stosunek molowy M:P może być taki jak poprzednio.
Do prowadników docelowych zdolnych do kierowania do celu kompleksów typu gęstej gwiazdy należą elementy, które zastosowane w kompleksach typu gęstej gwiazdy spowodują, że co najmniej część tych kompleksów będzie dostarczonych do docelowej komórki, takie jak przeciwciała, korzystnie monoklonalne przeciwciała, fragmenty przeciwciał takie jak fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 lub dowolne inne fragmenty przeciwciał wykazujące wymaganą docelową specyficzność, hormony, modyfikatory odpowiedzi biologicznej; epitopy; grupy funkcyjne wykazujące docelową specyficzność itp.
Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które można zastosować w korzystnych kompleksach typu gęstej gwiazdy opisanych powyżej, wytwarzać można znanymi technikami. Do przykładowych odpowiednich przeciwciał należą immunoglobuliny takie jak IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Monoklonalne przeciwciała o wysokiej specyficzności wytwarzać można dobrze znanymi technikami hybrydyzacji, patrz np. Kohler i Milstein (1975, Naturę 256:495-497; oraz 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519). Takie przeciwciała zazwyczaj wykazują wysoce specyficzną reaktywność.
W kompleksach typu gęstej gwiazdy ukierunkowanych przeciwciałami zastosować można przeciwciała kierujące do dowolnego antygenu lub haptenu. Jakkolwiek stosować można zwykłe
182 237 przeciwciała poliklonalne, to przeciwciała monoklonalne zapewniają wiele korzyści. Wybrane monoklonalne przeciwciała są wysoce specyficzne w stosunku do pojedynczego epitopu. Na dodatek duże ilości każdego monoklonalnego przeciwciała wytworzyć można w hodowli tkankowej (np. linii komórek hybrydomy). Przeciwciała w kompleksach stosowanych w sposobie według wynalazku mogą być ukierunkowane np. na nowotwory, bakterie, grzyby, wirusy, pasożyty, mikoplazmę, antygeny różnicowania i inne antygeny błony komórkowej, kwasy polinukleinowe takie jak DNA lub RNA, antygeny powierzchni patogenu, toksyny, enzymy, alergeny, leki i dowolne cząsteczki biologiczne czynne. Pełniejszą listę antygenów podano w patencie USA nr 4 193 983.
Pożądane może być koniugowanie większej ilości przeciwciał lub fragmentów z dendrymerem, a w określonych przypadkach zastosowanie przeciwciał o różnych specyficznościach. Tak np. skonstruować można dwufiinkcyjny kompleks wykazujący zdolność lokalizowania nowotworu i wiązania się z nim, a następnie oczyszczać krążenie ze związków cytotoksycznych, diagnostycznych lub biostatycznych.
W nieobecności prowadnika docelowego (lub w obecności prowadnika docelowego, gdy jest to pożądane), z uwagi na liczbę grup funkcyjnych, które mogą być zlokalizowane na powierzchni dendrymeru lub blisko niej, wszystkim grupom funkcyjnym (lub zasadniczej ich części) można nadać charakter anionowy, kationowy, hydrofobowy lub hydrofitowy, tak aby skutecznie ułatwić doprowadzanie kompleksu typu gęstej gwiazdy do pożądanego celu o przeciwnym ładunku, albo do hydrofobowego lub hydrofitowego kompatybilnego celu.
Wytwarzanie kompleksów o wzorze (U) przy wykorzystaniu P z chronionym uchwytem (S) uważa się również za sposób wytwarzania kompleksów o wzorze (II). Poniżej przedstawiono schemat reakcji:
obciążanie
S*P ----------► S*P*M odblokowanie ----------------► P*M łączenie T*P*M <---------gdzie
S*P oznacza chroniony dendrymer;
S*P*M oznacza chroniony dendrymer skoniugowany z M;
P*M oznacza odblokowany dendrymer skoniugowany z M (kompleks typu gęstej gwiazdy);
T*P*M oznacza kompleks typu gęstej gwiazdy połączony z prowadnikiem docelowym.
Zastosować można odpowiednie rozpuszczalniki nie wpływające niekorzystnie na P*M. Tak np. jeśli S oznacza tert-butoksykarbonyl, a P*M jest stabilny w rozpuszczalniku wodnym, to S można usunąć wodnym roztworem kwasu.
Gdy przenoszone materiały stanowią materiały farmaceutyczne, korzystne są te kompleksy typu gęstej gwiazdy, w których polimer jest zasocjowany bezpośrednio lub poprzez łączniki; takie kompleksy typu gęstej gwiazdy można przedstawić wzorem (ni) gdzie każdy z C' oznacza taką samą lub różną grupę łączącą;
każdy z C oznacza taką samą lub różną grupę łączącą;
każdy z g oraz k niezależnie oznacza liczbę całkowitą 1 lub powyżej;
każdy z f oraz h niezależnie oznacza liczbę całkowitą 0 lub powyżej;
182 237
- oznacza wiązanie kowalencyjne w przypadku, gdy grupa łącząca występuje; a
P, x, *, M, y, T oraz e mają znaczenie podane wyżej; pod warunkiem, że
M zachowuje swą skuteczność
Korzystne są te kompleksy, w których x = 1. Do szczególnie korzystnych należą te kompleksy, w których każdy spośród x, e, f, h oraz y równy jest 1, g wynosi 1 lub powyżej, a k wynosi 2 lub powyżej. Najkorzystniejsze są te kompleksy, w których każdy spośród, x, e, f, h, y oraz g równy jest 1, a k wynosi 2 lub powyżej.
Do odpowiednich grup łączących reprezentowanych przez C” należą grupy, które łączą przenoszony materiał z dendrymerem nie wpływając znacząco na skuteczność przenoszonego materiału ani na skuteczność jednego lub więcej prowadników docelowych obecnych w kompleksie typu gęstej gwiazdy. Takie łączniki muszą być stabilne (to znaczy nie ulegające rozszczepieniu) lub ulegać rozszczepieniu, w zależności od typu aktywności przenoszonego materiału, a zazwyczaj stosowane są w tym celu, aby uniknąć zawady przestrzennej między przenoszonym materiałem i polimerem.
Najkorzystniejsze są kompleksy, w których dendrymer jest zasocjowany bezpośrednio lub poprzez jedną albo więcej grup łączących z jednym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Polimer w takich korzystnych kompleksach może być ewentualnie dodatkowo zasocjowany, bezpośrednio lub poprzez jedną albo więcej grup łączących) z jednym lub więcej innymi przenoszonymi materiałami, korzystnie z radioizotopem. Takie kompleksy typu gęstej gwiazdy można przedstawić wzorem:
[(Przeciwciało)e- (C')f]g*(P)x*[(Cr)h-(M)yk (IV) w którym:
każde z przeciwciał oznacza przeciwciało lub fragment przeciwciała zdolny do oddziaływania z pożądanym epitopem;
- oznacza wiązanie kowalencyjne lub kulombowskie w przypadkach, gdy występuje grupa łącząca; a
P, x, *, Μ, T, e, y, C', C, g, k, f oraz h mają znaczenie podane wyżej; z tym, że
M zachowuje swą skuteczność.
W powyższej syntezie dendrymerów typu gęstej gwiazdy (P), które zawierają grupę funkcyjnąumożliwiającąłączenie (C lub C) z prowadnikiem docelowym (T), w korzystnym sposobie wymagane jest chronienie reaktywnych grup funkcyjnych w postaci syntetycznego prekursora. Chronienie takie jest korzystne, gdyż umożliwia to syntezę dendrymeru lub kompleksów o bardzo wysokiej jakości. Sposób taki umożliwia chemiczne wiązanie jednostki przenoszonego materiału farmaceutycznego (M) z końcowymi grupami funkcyjnymi dendrymeru typu gęstej gwiazdy (P) w sposób, który w innym przypadku mógłby spowodować reakcję z łączącą grupą funkcyjną, co uniemożliwiałoby przyłączenie prowadnika docelowego (T). Przeprowadzenie następnie odblokowania lub syntetyczna konwersja do łączącej grupy frinkcyjnej umożliwia w ten sposób połączenie koniugatu typu gęstej gwiazdy z prowadnikiem docelowym.
Jedną z korzystnych „funkcyjnych grup łączących” (poniżej określonych jako „uchwyt”) jest grupa anilinowa. Grupa ta jest korzystna, gdyż można jąłatwo zmodyfikować uzyskując inne grupy funkcyjne odpowiednie w reakcji z prowadnikiem docelowym, takie jak izotiocyjanian, izocyjanian, semitiokarbazyd, semikarbazyd, bromoacetamid, jodoacetamid i maleimid. Grupa anilinowa stanowi również korzystny uchwyt w łączeniu z prowadnikami docelowymi z uwagi na to, że można jąłatwo zablokować przy stosowaniu w syntezie dendrymeru typu gęstej gwiazdy, albo też można jako prekursor zastosować grupę nitrową, którą można przekształcić w pożądaną grupę aminową po zakończeniu syntezy.
Istnieje szereg grup chroniących przydatnych do chronienia anilinowej grupy funkcyjnej w czasie syntezy dendrymeru typu gęstej gwiazdy. (Patrz Theodora W. Green, Protective Groups in
182 237
Organie Synthesis, Pub. John Wiley & Son, New York, 1981). Korzystną klasę stanowią karbaminiany przedstawione poniżej, przy czym R' oznacza dendrymer.
Do chronienia amin zastosować można wiele karbaminianów. Do najkorzystniejszych karbaminianów w syntezie dendrymerów Starburst™ należy tert-butoksykarbaminian, R = -Ć(CH3)3. Odblokowanie osiąga się na drodze łagodnej kwaśnej hydrolizy. Korzystna jest także benzylokarbaminianowa grupa chroniąca
korzystna w przypadku dendrymerów podatnych na kwaśną hydrolizę. Odblokowanie osiąga się na drodze katalitycznego uwodornienia.
Inną grupę chroniącą, którą można zastosować do ochrony reaktywnych grup na poziomie pożądanej generacji, stanowi 9-fIuorenylometylokarbaminian
-CH2
oraz ftalimidowa grupa chroniąca
Zgodnie z podanym schematem syntezy zastosować można również inne grupy chroniące aminy, znane z literatury. Powyższe korzystne grupy stanowią jedynie przykłady, a nie jedyne grupy chroniące, które można zastosować. Zastosować można dowolną grupę chroniącą stabilną
182 237 w warunkach reakcji, którą można usunąć bez naruszenia integralności dendrymeru typu gęstej gwiazdy.
Wariantowo można przeprowadzić reakcję uaktywnionego halogenku arylu takiego jak nitrofluorobenzen lub 2,4-dinitrofluorobenzen, z aminową grupą funkcyjną w środku do koniugowania, np. w polietylenoiminach (PEI) typu gęstej gwiazdy, a następnie katalitycznie uwodornić grupę nitrową do funkcyjnej grupy anilinowej w celu przeprowadzenia koniugowania. Jest to szczególnie korzystne w przypadku takich środków jak poliaminy, które wymagają przed zastosowaniem dalszej modyfikacji, z uwagi na stosunkową objętość chemiczną grupy nitro fenylowej w warunkach wszystkich reakcji, w których nie zachodzi redukcja. Dobrze znane są różne odczynniki sprzęgające przydatne w reakcji koniugowania, takie jak środki opisane w zgłoszeniu patentowym europejskim nr 0430863 opublikowanym 5 czerwca 1991. Do często stosowanych dwufunkcyjnych środków łączących, np. aktywnych estrów lub diizocyjanianów, reagujących w bardzo różnych warunkach reakcji, co mogłoby zapewnić ich przydatność w reakcji koniugowania, należą:
Można także zastosować halogenki nitro-podstawionego arylosulfonylu uzyskując sulfonamidy, np.
O2N
SO2X
Zaletą takiego sposobu w porównaniu ze znanymi sposobami jest wprowadzenie grupy aminofenylowej przydatnej w koniugowaniu, jest to, że osiąga się to w ostatnim stadium syntezy. W procesie Ganslowa i innych, patent USA nr 4 472 509 grupę nitrofeny Iową wprowadza się w pierwszym etapie długiej syntezy, co narzuca ograniczenia w dostępnych reakcjach chemicznych.
Wprowadza się uchwyt, który daje się łatwo odróżnić od reszty cząsteczki. Manabe i inni ujawnili, że otwarcie pierścienia bezwodnika bursztynowego przez resztkowe aminy dostarcza
182 237 grupy sprzęgającej umożliwiającej koniugowanie z przeciwciałem. Sposób taki nie stwarzał jednak możliwości rozróżnienia niechelatowanych miejsc w polimerze, gdyż grupy chelatujące były takie same jak grupa łącząca.
Powyższym sposobem wprowadzić można grupę aminofenylową do dowolnego środka zawierającego grupę aminową który następnie koniuguje się z pewnym środkiem biologicznie czynnym, np. z monoklonalnym przeciwciałem lub z enzymem. Środek można koniugować na drodze sprzęgania utleniającego z węglowodanami zawartymi w środku biologicznie czynnym, np. w przeciwciele. Grupę aminofenylową można ponadto przekształcić w izotiocyjanian lub izocyjanian, tak aby przeprowadzić następnie reakcję z bocznymi grupami aminowymi w resztach lizyny występujących w środku biologicznie czynnym.
Do szczególnie korzystnych kompleksów należą te, w których T oznacza monoklonalne pzreciwciało lub jego fragment wiążący epitop; a wyjątkowo korzystne są te, w których T oznacza prowadnik docelowy taki jak przeciwciało, monoklonalne przeciwciało lub fragment przeciwciała, fragment wirusa, jednoniciowy DNA, kwas polinukleinowy lub fragment genu, albo też T nie występuje.
Stosowane tu określenie „gęsty” w odniesieniu do „polimeru gwiaździstego” lub „dendrymeru” oznacza, że charakteryzują się one mniejszą objętością cząsteczkową niż wydłużony, konwencjonalny polimer gwiaździsty o takim samym ciężarze cząsteczkowym. Wydłużony konwencjonalny polimer gwiaździsty użyty jako podstawa do porównania z polimerem typu gęstej gwiazdy, stanowi polimer o takim samym ciężarze cząsteczkowym, tym samym rdzeniu i składnikach monomerycznych oraz o takiej samej liczbie rozgałęzień rdzeniowych jak polimer typu gęstej gwiazdy. Określenie „wydłużony” oznacza, że poszczególne gałęzie konwencjonalnego polimeru gwiaździstego są wydłużone lub rozciągnięte do maksymalnej długości. Na dodatek, mimo iż liczba grup końcowych jest w polimerze typu gęstej gwiazdy większa niż w konwencjonalnym polimerze gwiaździstym, to budowa chemiczna grup końcowych jest taka sama.
Dendrymery wytwarzać można znanymi sposobami. Powyższe dendrymery, różne współreagenty i związki rdzeniowe, a także sposób ich wytwarzania, znaleźć można w opisie patentowym USA nr 4 587 329. Tak np. związki rdzeniowe mogą stanowić dowolne elementy, do których przyłączyć można kolejne grupy [patrz fig. 1 i 2(B)].
Dendrymery do stosowania w kompleksach mogą zawierać grupy końcowe, które są wystarczająco reaktywne, aby ulegać reakcji przyłączenia lub podstawienia. Do przykładowych grup końcowych należy grupa aminowa, hydroksylowa, merkaptanowa, karboksylowa, alkenylowa, nitrylowa, allilowa, winylowa, amidowa, chlorowcowa, mocznikowa, oksiranylowa, azyrydynylowa, oksazolinylowa, imidazolinylowa, sulfonianowa, silanylowa, fosfonianowa, eter koronowy, bipirydyny, chlorometylofenylowa, izocyjanianowai izotiocyjanianowa. Grupy końcowe można modyfikować tak, aby stały się one biologicznie obojętne, np. aby nadać im immunogeniczność, np. w wyniku zastosowania grup glikolu polietylenowego (PEG) lub poliacylopolialkilenoiminy (np. poliacylopolietylenoiminy) o różnych długościach, przyłączonych do powierzchni dendtymeru. Dendrymery różnią się od konwencjonalnych polimerów gwiaździstych lub gwiaździsto-rozgałęzionych tym, że zawierają wyższe stężenie grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości cząsteczkowej niż konwencjonalne wydłużone polimery gwiaździste o równoważnej liczbie gałęzi rdzeniowych i równoważnej długości gałęzi rdzeniowych. I tak gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości jest w dendrymerze zwykle co najmniej 1,5 razy większa od gęstości grup końcowych w konwencjonalnym wydłużonym polimerze gwiaździstym, korzystnie co najmniej 5 razy, jeszcze korzystniej co najmniej 10 razy, a najkorzystniej 15-50 razy większa. Stosunek grup końcowych do gałęzi rdzeniowych w gęstym polimerze wynosi korzystnie co najmniej 2, jeszcze korzystniej co najmniej 3, a najkorzystniej od 4 do 1024. Korzystnie dla danego ciężaru cząsteczkowego polimeru objętość cząsteczkowa polimeru typu gęstej gwiazdy stanowi mniej niż 70%, jeszcze korzystniej 16-60%, a najkorzystniej 7-50% objętości cząsteczkowej konwencjonalnego wydłużonego polimeru gwiaździstego.
Korzystne dendrymery do stosowania w kompleksach charakteryzują się tym, że równocennie wartościowy lub poliwartościowy rdzeń, który jest kowalencyjnie związany z gałęziami
182 237 dendrytowymi. Takie uporządkowane rozgałęzienie można zilustrować następującą sekwencją, przy czym G oznacza liczbę generacji:
G = 1 G = 2
A/VvVvN ΑΛΑΛΑ
G = 3
ΛΛΛΛΛ/Ν ΆΛΑΛΑ
Matematycznie dokładne sekwencjonowanie uwzględniane przy wytwarzaniu dendrymerów prowadzi do dokładnych, przewidywalnych stechiometrii dla każdej cząsteczki dendrymeru. Tak np. liczba powtarzalnych jednostek w dendrymerze zależy od liczby generacji (G), krotności jednostki powtarzalnej (N,) i krotności cząsteczki rdzeniowej lub atomu rdzeniowego (Nc). W homopolimerycznych dendrymerach, gdy tą samą jednostkę powtarzalną wykorzystuje się w całej cząsteczce, całkowita liczba powtarzalnych jednostek w dendrymerze, jego stopień polimeryzacji (DP) określony jest wzorem
DP = c N -1
Całkowita walencyjność lub liczba grup końcowych w dendrymerze (Y) określona jest wzorem:
Y = NcNrG
Często wygodniejsze jest lub bardziej zrozumiałe rozważenie liczby grup końcowych w dendrymerze (Z), gdyż każda grupa może być wielowartościowa, albo też wartościowość może zmieniać się na skutek modyfikacji chemicznych. Dlatego też liczba grup końcowych określona jest wzorem:
N N G
Liczba grup końcowych w dendrymerze (Z) =----------—---------krotność grup końcowych
Można to zilustrować na przykładzie aminowych grup końcowych, których krotność w syntezie poliaminy wynosi 2. W takim przypadku:
, N N G
Liczba grup końcowych w dendrymerze (Z) = ——
W przypadku prowadzonych następnie modyfikacji dendrymerów liczba ta jest wygodniejsza, gdyż wartościowość grupy aminowej zależy od chemizmu reakcji. Tak np. pierwszorzędowa końcowa grupa aminowa będzie łatwo reagować tylko z jedną cząsteczką estru z wytworzeniem,
182 237 amidu, z dwoma cząsteczkami środka alkilującego (w łagodnych warunkach, np. w reakcji Escheweilera-Clarke’a) z wytworzeniem aminy trzeciorzędowej, albo z trzema cząsteczkami środka alkilującego (w ostrzejszych warunkach, np. w reakcji z sulfonianami alkilu) z wytworzeniem czwartorzędowych soli amonowych.
W związku z tym dendrymery można przedstawić w części składowej następująco:
(Rdzeń) (jednostka powtarzalna)
gdzie
Rdzeń (I) stanowi cząsteczka lub atom inicjujący; grupę końcową stanowi atom, cząsteczka lub grupa funkcyjna, która zajmuje miejsca wiązania w jednostce powtarzalnej, np. atom wodoru lub grupę metoksylowąw estrze; G i Nc mają znaczenie podane wyżej; a wartościowość jednostki powtarzalnej wynosi Nr+1, gdzie Nr ma znaczenie podane wyżej.
Kopolimeryczny dendrymer stanowiący korzystny dendrymer do stosowania zgodnie z wynalazkiem, stanowi unikatowy związek wytworzony z wielofunkcyjnych jednostek monomerycznych, o układzie silnie rozgałęzionym (dendrytowym). Cząsteczkę dendrymeru wytwarza się z jednostki wielofunkcyjnego inicjatora [związku rdzeniowego, rdzenia (I)], wielofunkcyjnych jednostek powtarzalnych i jednostek końcowych, które mogą być takie same lub inne niż jednostki powtarzalne. Związek rdzeniowy można przedstawić wzorem (I) (Zc)Nc, gdzie rdzeń (I) oznacza rdzeń, Zc oznacza miejsca wiązania dostępne na rdzeniu (I), a Nc oznacza funkcyjność rdzenia lub liczbę miejsc wiązania, która wynosi korzystnie 2 lub powyżej, a najkorzystniej 3 lub powyżej. W związku z tym cząsteczka dendrymeru zawiera wielofunkcyjny rdzeń (I) połączony z szeregiem (Nc) grup funkcyjnych, Zc, z których każda połączonajest z monofunkcyjnym ogonem jednostki powtarzalnej X1 ¥*(2%* pierwszej generacji, a każda z grup Z jednostki powtarzalnej jednej generacji jest połączona z mono funkcyjnym ogonem jednostki powtarzalnej następnej generacji, aż do osiągnięcia końcowej kondygnacji lub warstwy.
W cząsteczce dendrymeru powtarzalne jednostki w danej generacji są takie same, ale mogą różnic się pomiędzy poszczególnymi generacjami. W jednostce powtarzalnej Χ'Υ^Ζ1^1 X1 oznacza jednofunkcyjny ogon jednostki powtarzalnej pierwszej generacji, Y1 oznacza grupę wchodzącą w skład pierwszej generacji, Z1 oznacza miejsce wiązania wielofunkcyjnej głowy jednostki powtarzalnej pierwszej generacji i może być takie same lub inne niż miejsca wiązania związku rdzeniowego (I) (Zc)Nc lub innej generacji; a Nl oznacza liczbę równą2 lub powyżej, najkorzystniej 2,3 lub 4, reprezentującą krotność wielofunkcyjnej głowy jednostki powtarzalnej w pierwszej generacji. Generycznie jednostka powtarzalna określona jest wzorem ΧΎ^Ζ'^ϊ, gdzie „i” oznacza określoną generacje od generacji pierwszej do t-1. I tak w cząsteczce korzystnego dendrymeru każdy z Z1 jednostki powtarzalnej pierwszej generacji połączony jest z X2 jednostki powtarzalnej drugiej generacji itd. poprzez generacje, tak że każda z grup Z1 jednostki powtarzalnej ΧΎ^Ζ'^ί w generacji o numerze „i” jest połączona z ogonem (X,+1) jednostki powtarzalnej generacji o numerze „i+1”. Ostateczna lub końcowa kondygnacja korzystnej cząsteczki dendrymeru zawiera jednostki końcowe, X¥(Z'y, gdzie t dotyczy jednostki końcowej, a X*, Y’, Z1 i N* mogą być takie same lub różne niż X1, Y1, Z* i N1, z tym że z grupami Z‘ nie jest już połączona kolejna generacja, a Ν' może być mniejsze od 2 i wynosić np. 0 lub 1, a ponadto wszystkie takie jednostki końcowe X¥(Z')xt nie muszą być identy182 237 czne. Z tego względu korzystny dendrymer określony jest wzorem cząsteczkowym, który można przedstawić następująco:
xtyt i-1
NcHNn η = 1 t-1 gdzie i wynosi od 1 do t-1; symbole mają znaczenie podane wyżej. Funkcja Π stanowi iloczyn wszystkich wielkości w podanych granicach. I tak i- 1
Πν n = (Ν') (N2) (N3) ...(N^2) (N1 · 1) η = 1 stanowi liczbę jednostek powtarzalnych ΧΎ^Ζ’^ί stanowiących i-tą generacje jednej gałęzi dendrytowej, a jeśli i równe jest 1, to PJn ” = η = 1
W kopolimerycznych dendrymerach jednostka powtarzalna dla jednej generacji różni się od jednostki powtarzalnej co najmniej jednej innej generacji. Korzystne dendrymery są bardzo symetryczne, co ilustrują wzory strukturalne opisane poniżej. Korzystne dendrymery można przekształcić w dendrymery funkcjonalizowane kontaktując je z innym reagentem. Tak np. w wyniku konwersji grupy hydroksylowej w końcowej warstwie lub kondygnacji do estru w reakcji z chlorkiem kwasowym uzyskuje się funkcjonalizowany dendrymer z końcowymi grupami estrowymi. Takie funkcjonalizowanie nie musi być wykonane z teoretycznie maksymalną wydajnością określoną przez liczbę dostępnych grup funkcyjnych, w związku z czym funkcjonalizowany dendrymer może nie wykazywać wysokiej symetrii lub może nie dać się dokładnie przedstawić wzorem cząsteczkowym, jak to jest w przypadku korzystnego dendrymeru.
W homopolimerycznym dendrymerze wszystkie jednostki powtarzalne ΧΎ^Ζ'^ί są identyczne. W związku z tym, że wielkości wszystkich N1 są takie same jokreślone jako Nr), fiinkcja iloczynowa przedstawiająca liczbę jednostek powtarzalnych redukuje się do prostej formy wykładniczej. W związku z tym wzór cząsteczkowy można wyrazić w prostszy sposób:
gdzie i = 1 do t-1 χ^-γ1 (Z1)Ni
N N i-1 c r NcNr (t-1)
182 237
Forma taka w dalszym ciągu eksponuje różnice pomiędzy odrębnymi generacjami i, z których każda zawiera jednostek powtarzalnych ΧΎ^Ζ'^ΐ. Łącząc generacje w jedną grupę uzyskuje się
(ZC)
N
XtYt(Zt)Nt
N -1 albo
Rdzeń Jednostka
Jednostka końcowa powtarzalna gdzie ΧΎγ(Ζγ)Νγ oznacza jednostkę powtarzalną zastosowaną we wszystkich generacjach i. Jest to zasadniczo taki sam wzór, jak wzór na str. 74, wiersz 1, w którym G = t-1.
W związku z tym, jeśli związek polimerowy będzie pasował do powyższych wzorów, to polimer będzie polimerem typu gęstej gwiazdy. I odwrotnie, jeśli związek polimerowy nie będzie pasował do powyższych wzorów, to polimer nie będzie polimerem typu gęstej gwiazdy. Ponadto w celu stwierdzenia czy polimer jest polimerem typu gęstej gwiazdy, nie ma potrzeby znać sposobu jego wytwarzania, ale jedynie trzeba sprawdzić, czy pasuje do powyższych wzorów. Wzory te przedstawiają również generacje (G) lub kondygnacje dendrymerów.
Powyższe wzory matematyczne oparte są na odniesieniu się do pierwszej iteracji reakcji wokół reagentu rdzeniowego jako do generacji 1. W związku z tym dla poliamidoaminowego dendrymeru typu gęstej gwiazdy produkt reakcji akrylanu metylu z rdzeniem w postaci amoniaku będzie się określać jako generację 0,5, a produkt uzyskany w wyniku przeprowadzonej następnie reakcji EDA z akrylanem metylu będzie się określać jako generację 1,0.
W wariancie takiej nomenklatury pierwszą iterację odnosi się do generacji 0, a nie do generacji 1. Produkt reakcji akrylanu metylu z rdzeniem w postaci amoniaku będzie się określać jako generację -0,5, a produkt uzyskany w wyniku przeprowadzonej następnie reakcji EDA z akrylanem metylu będzie się określać jako generację 0. Zgodnie z tą wariantową nomenklaturą wszystkie numery generacji podane w opisie należy zmniejszyć o 1.
W przypadku tej skorygowanej nomenklatury wzór na stopień polimeryzacji (DP) przyjmuje postać:
DP= N
Νθ+Ι- 1
Nr-1
182 237
Wzór na liczbę ugrupowań końcowych w dendrymerze (Y) przyjmuje postać:
Y = NcNrG przy czym Y można przekształcić w Z (liczbę grup końcowych/dendrymer) dzieląc przez krotność grup końcowych, jak to opisano powyżej.
Liczba komórek gałęzi dendrymeru (NBC) określona jest następująco
Teoretyczną masę cząsteczkową (M) można wyrazić następująco:
gdzie Mc oznacza masę molową inicjatora rdzeniowego, MRU oznacza masę molowąjednostek powtarzalnych, MBC oznacza masę molową komórek gałęziowych, a Mt oznacza masę molową jednostek końcowych.
Wyraźnie istnieje wiele sposobów wyznaczania stosunku środka (M) do dendrymeru (P), zależnego od tego w jaki sposób i gdzie nastąpiła asocjacja P*M. Gdy występuje wewnętrzne kapsułkowanie, stosunek wagowy M:P wynosi zwykle 10:1, korzystnie 8:1, jeszcze korzystniej 5:1, a najkorzystniej 3:1. Stosunek ten może wynosić zaledwie 0,5:1, lub nawet 0,1:1. W odniesieniu do stereochemii wnętrza stosunek wagowy M:P jest taki sam jak dla kapsułkowania wnętrza. W odniesieniu do stechiometrii części zewnętrznej stosunek M:P mol/mol podany jest w poniższej tabeli
M P
(A) 5 NcN,Nr'·' 1
(B) 3 NcN(Nr'·' 1
(C) 1 NcNtNr”' 1
gdzie Nc oznacza krotność rdzenia, Nt oznacza średnią krotność grup końcowych, a Nr oznacza krotność połączeń gałęziowych. Wyrażenie Ν^Ν/'1 podawać będzie liczbę ugrupowań końcowych. Tak np. (A) dotyczy przypadku, gdy na powierzchni znajdują się białka, enzymy lub silnie naładowane cząsteczki; (B) dotyczy obecności aspiryny, 2,4-D lub kwasu oktanowe
182 237 go; a (C) dotyczy przypadku przekształcania powierzchniowych grup estrowych w jony karboksylanowe.
Oczywiście spacjalista łatwo może wytworzyć inne struktury o różnych wymiarach odpowiednio zmieniając składniki dendrymeru i liczbę stosowanych generacji. Trzy różne serie dendrymerów w porównaniu z przeciwciałem IgG w przybliżeniu w podobnej skali pokazano na fig. 3. Seria rysunków oznaczona jako fig. 3(B)I przedstawia poliamidoaminy (PAMAM) typu gęstej gwiazdy; seria II przedstawia polietery (PE) typu gęstej gwiazdy; a seria ΙΠ przedstawia polietylenoiminy (PEI) typu gęstej gwiazdy. W podobny sposób jak na fig. 1, we wszystkich 3 seriach (I, II i ΠΙ) na lewym końcu pokazano rdzeń inicjujący, na kolejnym rysunku od lewej strony pokazano gwiaździście rozgałęziony oligomer, a na pozostałych rysunkach pokazano oligomery typu gęstej gwiazdy oraz odpowiednie mostkowe dendrymery typu gęstej gwiazdy. Można stwierdzić, że w tych seriach rysunków w podanej skali pod względem wymiarów dendrymery są porównywalne, a nawet mniejsze od wymiarów pełnego przeciwciała IgG pokazanego na fig. 3(A). Pizeciwciało IgG pokazano na końcu z lewej strony fig. 3. W przedstawionej skali 1 mm=3,5 Ά. Na fig. 3(A) obszar zmienny przedstawiono jako (A), obszar stały jako (B), a miejsca przyłączenia węglowodanów jako (C). Przybliżone wymiary pokazane na fig. 3 sąnastępujące: (1) wynosi 35-40 A; (2) wynosi 70 A, a (3) wynosi 60 A. takie cechy wymiarowe są korzystne np. wtedy, gdy ukierunkowywanie obejmuje opuszczanie układu naczyniowego. Z tego względu średnice dendrymerów wynoszące 125 A lub poniżej są szczególnie korzystne, gdyż mogą one opuszczać układ naczyniowy przechodząc do docelowych organów zasilanych przez włośniczki nieporowate lub włośniczki okienkowate. Wymiary te są znaczące, gdyż dendrymery są mniejsze w porównaniu z potencjalnym docelowym składnikiem takim jak przeciwciało (patrz fig. 3). Liniowy polimer o porównywalnym ciężarze cząsteczkowym charakteryzowałby się promieniem bezwładności (w formie całkowicie rozciągniętej) znacznie większym niż dendrymer o takim samym ciężarze cząsteczkowym. Należy oczekiwać, że liniowy polimer tego typu będzie niekorzystnie wpływać na zdolność do rozpoznawania cząsteczkowego wielu zaakceptowanych składników docelowych. Pożądane jest również, aby koniugaty wykazywały jak najmniejszą objętość cząsteczkową, tak aby nie hamowały dodatkowego unaczynienia, np. w wyniku sprzęgania Fab, Fab', Fab'2 albo pojedynczych łańcuchów lub ich części, bądź też innego odpowiedniego fragmentu przeciwciała z dendrymerami o niskiej objętości cząsteczkowej.
W korzystnych wykonaniach według wynalazku, zwłaszcza wtedy, gdy pożądane jest zastosowanie przeciwciała jako prowadnika docelowego, na dendrymerze zastosować można reaktywne grupy funkcyjne, takie jak grupa karboksylowa, sulfhydrylowa, reaktywny aldehyd, reaktywna pochodna olefinowa, grupa izotiocyjanianowa, izocyjanianowa, aminowa, reaktywny halogenek arylu lub reaktywny halogenek alkilu. Reaktywne grupy funkcyjne wprowadzić można do dendrymeru znanymi sposobami takimi jak:
(1) Zastosowanie heterofunkcyjnego inicjatora (jako materiału wyjściowego do syntezy dendrymeru), który zawiera wbudowane grupy funkcyjne o różnych reaktywnościach. W takim heterofunkcyjnym inicjatorze co najmniej jedna z grup funkcyjnych będzie służyć jako miejsce inicjujące powstawanie dendrymeru, a co najmniej jedna z innych grup funkcyjnych będzie dostępna do połączenia się z prowadnikiem docelowym, ale nie będzie zdolna do zainicjowania syntezy dendrymeru. Tak np. zastosowanie chronionej aniliny umożliwia dalszą modyfikację grup NH2 w cząsteczce bez reagowania anilinowej grupy NH2.
Grupa funkcyjna, która będzie dostępna do połączenia się z prowadnikiem docelowym, może stanowić część cząsteczki inicjatora w jednej z trzech form, a mianowicie:
(a) W postaci, która będzie wykorzystywana do łączenia z prowadnikiem docelowym. Jest to możliwe, gdy w żadnym z etapów syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru nie nastąpi reakcja w tym centrum.
(b) Gdy grupa funkcyjna stosowana do łączenia z prowadnikiem docelowym wykazuje reaktywność w etapach syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru, można ją zablokować stosując grupę chroniącą, która nada tej grupie niereaktywność w czasie syntezy, ale którąmożna łatwo usunąć w taki sposób, aby nie naruszyć integralności reszty makrocząsteczki.
182 237 (c) W przypadku, gdy nie można prowadzić prostej grupy chroniącej reaktywną grupę funkcyjną wykorzystywaną do łączenia z prowadnikiem docelowym, zastosować można syntetyczny prekursor nie reagujący we wszystkich etapach syntezy przeprowadzanych przy wytwarzaniu dendrymeru. Po zakończeniu syntezy taka grupa funkcyjna musi dać się łatwo przekształcić w pożądanągrupę łączącą, w taki sposób, aby nie naruszyć integralności reszty makrocząsteczki.
(2) Przy sprzęganiu (kowalencyjnym) pożądanej reaktywnej grupy funkcyjnej na wstępnie uformowanym dendrymerze, stosowany reagent musi zawierać grupę fiinkcyjną łatwo reagującą z końcowymi grupami funkcyjnymi dendrymeru. Grupa funkcyjna wykorzystywana ostatecznie do przyłączania prowadnika docelowego może być w formie ostatecznej, jako chroniona grupa funkcyjna lub jako syntetyczny prekursor. Postać, w jakiej tą łączącą grupę funkcyjna wykorzystuje się, zależy od zachowania jej intergalności w czasie przeprowadzanych syntez oraz od zdolności ostatecznej makrocząsteczki do przetrwania w warunkach niezbędnych do nadania tej grupie zdolności przyłączania. Przykłady odpowiednich środków łączących znaleźć można w literaturze, np. w publikowanym zgłoszeniu europejskim 0430683, opublikowanym 5 czerwca 1992. Tak np. w przypadku PEI korzystnie stosuje się
Do hetero funkcyjnych inicjatorów stosowanych zgodnie z powyższym sposobem (1) przykładowo należą:
Η N 2
H cnhch2ch2nh2 cnhch7ch?nh,
II i
NH
ch2nh2 .
182 237
(CH3) 3COCNH CH2C^ o /—Λ (CH3) 3cocnh —CH2CH H2N Y)—ch2ch2nh2 0 II cnhch2ch2nh2 (1NHCH2CH2NH2 0 ch2nh2 xch2nh2 .
Η N— 2 2 \ °2N”^^—ch2ch2nh °2N^^-ch2Ch clli X / zch2nh2 ch2nh2 . 2 t zch2nh, CH2^^2 ; oraz (j:h2ch2nh2 /ch2nch2ch2nh2 'CH2tjlCH2CH2NH2 ch2ch2nh2
182 237
Szczególnie istotne są następujące chemizmy:
1) chemizm gęstej gwiazdy lub poliamidoaminy („PAMAM”) Starburst™;
2) chemizm gęstej gwiazdy lub polietylenoimin („PET”) Starburst™;
3) chemizm gęstej gwiazdy lub związku Starburst™ PEI z powierzchnią PAMAM;
4) chemizm gęstej gwiazdy lub polieteru („PE”) Starburst.
Modyfikację powierzchniowej fiinkcyjności dendrymeru mogą zapewnić inne przydatne grupy funkcyjne takie jak:
-opo3h2, -po3h2, -ρο3η(-1\ -ρο/Λ -co2(-'\ -so2h, -so/-’), -SO3H, -SO3(,\ -NR'R2, -R5, -OH, -OR1, -NH2, polietery, -CNHR1, -COH, octan (-OCCH3), perfluorowany alkil, II II II
0 o
-N=CH-
R
gdzie
R oznacza alkil, aryl lub atom wodoru;
R1 oznacza alkil, aryl, atom wodoru lub grupę (CH2)
R2 oznacza alkil, aryl lub grupę
(CH2)
(CH2)
n
R3 oznacza -OH, -SH, -CO2H, -SO2H lub -SO3H;
R4 oznacza alkil, aryl, alkoksyl, hydroksyl, grupę merkaptanową, karboksyl, grupę nitrową, atom wodoru, atom bromu, chloru, jodu lub fluoru;
R5 oznacza alkil;
X oznacza NR, O lub S; a n oznacza liczbę całkowitą równą 1, 2 lub 3;
182 237 polietery; albo inne immunologiczne niewrażliwe grupy przy czym we wszystkich powyższych przypadkach alkil oznacza liniowy lub rozgałęziony ĆrC18 węglowodór, a aryl oznacza benzyl lub naftyl, który może być podstawiony jedną lub więcej grupami CrC4 alkilowymi, bromowymi, chlorowymi, jodowymi, fluorowymi lub trifluorometylowymi.
Takie funkcjonalizowane dendrymery wytwarza się np. w reakcji fhnkcjonalizowanej grupy takiej jak ester metylowy DO3 A z epoksydem lub epoksydem podstawionym grupąCrC18 alkilową, uzyskując produkt hydroksyetylowany. Produkt hydroksyetylowany poddaje się reakcji ze środkiem sprzęgającym takim jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC), a następnie z polimerem PAMAM typu gęstej gwiazdy.
Gdy jako prowadnik docelowy stosuje się przeciwciało lub fragment przeciwciała, łączy się je z dendrymerem znanymi sposobami, takimi jak połączenie miedzy grupą funkcyjną na dendrymerze i grupami funkcyjnymi występującymi w przeciwciele lub fragmencie przeciwciała, takimi jak węglowodan, grupa aminowa, karboksylowa lub sulfhydrylowa. W pewnych przypadkach grupy łączące zastosować można jako łączniki lub odstępniki między dendrymerem i przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Przyłączanie dendrymeru do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała należy przeprowadzić w taki sposób, aby nie zakłócić w znaczący sposób immunoreaktywności przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, to znaczy wiążąc przeciwciało lub fragment przeciwciała poprzez takągrupę funkcyjną w przeciwciele lub fragmencie przeciwciała, która nie stanowi części miejsca rozpoznawania i wiązania antygenu.
Przenoszenie materiału genetycznego i transfekcja
A. Wprowadzenie
Przenoszenie materiałów genetycznych do komórek stwarza potencjalnie szerokie ich zastosowanie jako środków diagnostycznych.
Przenoszenie materiału genetycznego do komórki jest skomplikowanym procesem obejmującym szereg odrębnych etapów. Pierwszą funkcją nośnika jest związanie i ochrona DNA przed hydrolizą i strawieniem enzymatycznym. Nośnik musi ułatwiać przenoszenie materiału genetycznego do komórki. Już w komórce nośnik powinien chronić DNA przed degradacjąw endosomach i kierować materiał do określonych przedziałów w komórce.
Przedziały te mogą obejmować jądro, tak aby wprowadzić materiał genetyczny do chromosomów lub wywołać przejściową ekspresję przeniesionego materiału genetycznego poprzez transkrypcję i translację. I odwrotnie, wymagane być może przenoszenie do cytoplazmatycznej siateczki śródcytoplazmatycznej, gdzie materiał będzie działać jako rybosom edytujący lub przerywający wytwarzanie białka poprzez antysensowne inhibitowanie. Po dojściu do odpowiedniego przedziału materiał genetyczny musi zostać uwolniony od nośnika, tak aby mógł funkcjonować. W związku z tym zdolność do ochrony, przenoszenia i umożliwienia działania materiału genetycznego, stanowią decydujące cechy odpowiedniego nośnika.
Poza wieloma funkcjami, które musi spełniać nośnik materiału genetycznego, istniejąpewne ważne elementy, których należy unikać w nośniku. Nośnik nie powinien tworzyć nierozpuszczalnych kompleksów z DNA, co uniemożliwiałoby jego podawanie lub osłabiło zdolność do skutecznego dojścia do celu w komórce, bez względu na to, czy jest on w hodowli tkankowej czy stanowi indywiduum. Ważne jest również, aby nośnik nie był toksyczny w stosunku do komórek in vitro, gdyż mogłoby to znaczenie zmniejszyć ilość materiału, jaki można podawać oraz mogłoby stworzyć potencjalne zagrożenie
Istnieją dwa ogólne sposoby przenoszenia materiału genetycznego. Obydwa wymagają wiązania i ochrony materiału genetycznego, przenoszenia materiału genetycznego do komórki i uwalniania materiału dla ujawnienia jego aktywności. Jednakże występuje zasadnicza różnica między dwoma formami przenoszenia. W jednej formie wykorzystuje się nośnik, który wiąże się niespecyficznie z komórkami za pomocą ładunków lub innych oddziaływań i przenosi DNA zasadniczo do wszystkich komórek, z którymi styka się. Może to wystąpić in vitro lub ex vivo w zamkniętej przestrzeni takiej jak połączenie. Nośnik tego typu jest szczególnie ważny w terapiach, w których przeprowadza się transfekcję komórek w hodowli tkankowej, a następnie komórki te ponownie wprowadza się do osobnika. Taka terapia ex vivo jest bardzo przydatna w wielu róż182 237 nych stanach chorobowych i wymaga, aby nośnik był bardzo skuteczny w wiązaniu i przenoszeniu materiału genetycznego do prawie wszystkich komórek, z którymi oddziaływuje. Drugi typ nośnika specyficznie kieruje się tylko do pewnych typów komórek. Prowadnik docelowy sprężony z takim nośnikiem ułatwia specyficzne oddziaływanie między celem na komórce i kompleksem DNA z nośnikiem, co ułatwia wchłanianie przez komórki docelowe. Przy stosowaniu takiego nośnika niespecyficzna transfekcja komórek nie jest pożądana, gdyż ekspresja lub działanie transfekowanego materiału genetycznego w komórkach nie będących celem może być niepożądana. Prowadniki docelowe mogą również zwiększyć transfekcję komórek w diagnostyce ex vivo, poprzez zwiększone wiązanie i przenoszenie do komórek. W takim przypadku niekorzystny wpływ niespecyficznej transfekcji nie stanowi problemu, gdyż wszystkie komórki w hodowli stanowią cel.
Jak to opisano powyżej, materiał genetyczny może być transfekowany do komórek z wielu różnych względów, takich jak wytwarzanie białek w komórkach, zmiana funkcji komórek, korygowanie defektów genetycznych, itp. W związku z tym stosując kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym według wynalazku można w szczególności zapobiegać chorobom lub zaburzeniom genetycznym albo leczyć takie choroby i stany.
Ilość materiału genetycznego stosowanego w roztworze kompleksu materiału genetycznego z dendrymerem powinna wystarczać do osiągnięcia pożądanego działania profilaktycznego, terapeutycznego lub diagnostycznego. Ilość ta zmienia się w zależności od oczekiwanego efektu, łatwości, z jaką osiąga się powodzenie w transfekcji docelowych komórek, skuteczności prowadnika docelowego przyłączonego do dendrymeru oraz sposobu podawania kompleksu, to znaczy in vitro i ex vivo.
Po ustaleniu ilości materiału genetycznego i jego ładunków określa się ilość stosowanego dendrymeru na podstawie stosunku ładunków materiał genetyczny:dendrymer. Stosuje się taką ilość dendrymeru w roztworze, aby uzyskać pożądany stosunek ładunków. Wybrany stosunek ładunków będzie zmieniać się w zależności od tych samych zmiennych, które wpływająna stężenie roztworu materiału genetycznego, a także od tego, czy stosuje się lub nie stosuje się DEAEdekstranu lub gliceryny w celu synergistycznego wzmocnienia transfekcji. W szerokim zakresie stosunek ładunków materiał genetyczny:dendrymer może wynosić od około 10:1 do około 1:10 000 (a nawet może być jeszcze niższy), z tym że korzystnie wynosi od około 3:1 do 1:1 000, od 1:1 do 1:100, od 1:1 do 1:15 lub od 1:5 do 1:10, w zależności od powyższych zmiennych.
Aby uniknąć zasadniczego przegrupowania genowego lub innych zmian, które mogłyby wpłynąć na ekspresje genów, ludzkie geny można wprowadzić do komórek ssaków na drodze transfekcji komórki ssaka jednym lub więcej polimerami dendrytowymi, korzystnie dendrymerem typu gęstej gwiazdy, skompleksowanym z materiałem genetycznym.
Przenoszenie genu osiągnąć można na drodze transfekcji różnych typów komórek takich jak komórki homopoetyczne, fibroblasty skóry, hepatocyty itp. W związku z tym sposób zapobiegania lub leczenia choroby genetycznej może obejmować transfekcję polimeru typu gęstej gwiazdy skompleksowanego z materiałem genetycznym do macierzystej komórki hematopoetycznej komórki fibroblastu skóry hematocytu itp., wprowadzenie transfekowanej komórki do organizmu ssaka i ekspresję tej komórki w celu osiągnięcia efektu profilaktycznego lub terapeutycznego.
Transfekcję w sposób przedstawiony w opisie wykorzystać można w wielu celach obejmujących stosowanie in vitro i ex vivo. Ponadto przy zastosowaniu in vitro kompleks polimerów typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym może być przydatny w wykrywaniu lub diagnozowaniu różnych stanów. Sposób diagnozowania choroby w organizmie ssaka może obejmować wykrywanie lub diagnozowanie z wykorzystaniem kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy z materiałem genetycznym.
Działanie dendrymerów jako nośników przenoszących materiał genetyczny jest opisane poniżej. Podane zostanąprzykłady zarówno niespecyficznej transfekcji komórek jak i transfekcji specyficznie ukierunkowanej. W obydwu zastosowaniach zaobserwowano niską toksyczność lub immunogenność.
Sposobem według wynalazku można również przenosić geny do komórek roślinnych.
182 237
Znanych jest szereg sposobów transfekcji materiału genetycznego do komórek roślinnych. Jeden ze sposobów obejmuje wykorzystanie Agrobacterium sp. W typowej procedurze gen wprowadza się do komórek roślinnych wykonując najpierw jego insercję w miejscu kolonowania plazmidu, który może ulegać replikacji w E. coli i zawiera segment T-DNA (DNA stwierdzonego w plazmidach Ti naturalnie występujących w agrobacteria). Uzyskany pośredni wektor wrzecionowy wprowadza się następnie do komórekE. coli i przeprowadza się selekcję transformantów pod względem oporności na ampicylinę, kodowanąw sekwencjach pBR 322. Następnie plazmid przenosi się przez kojarzenie z komórki E. coli do komórki Agrobacterium. Po znalezieniu się we wnętrzu Agrobacterium plazmid integruje się w plazmidzie Ti w wyniku homologicznej rekombinacji sekwencji T-DNA na dwóch plazmidach. W taki sposób cały zintegrowany plazmid (plazmid zintegrowany w plazmidzie Ti) pomiędzy lewą i prawą granicą T-DNA. Plazmid, który nie został zintegrowany, nie nagromadza się z uwagi na brak ośrodka replikacji dla Agrobacterium. Agrobacteria zawierające zrekombinowany plazmid Ti wybiera się i stosuje do zainfekowania komórek roślinnych. Komórki roślinne, które przyjęły T-DNA identyfikuje się markerem ΝΡΤΠ selekcjonującym rośliny, który nadaje odporność na kanamycynę. Komórki te zawierają również odpowiedni klonowany gen.
Materiał genetyczny transfekuje się do komórek roślinnych z wykorzystaniem wektorów wirusowych. Wektory wirusowe stanowią wirusy, które zostały ewolucyjnie zaadoptowane tak, że rozprowadzają geny w całej zainfekowanej roślinie. Gdy genom wirusowy zawiera obcy gen, będzie on również systemowo rozprzestrzeniać się w roślinie. Wektory wirusowe mogą rozwiązać problem doprowadzania genów do roślin jednoliściennych, które są mniej podatne na agrobacteria. Materiał genetyczny może zastąpić region kodujący białko powłokowe w składniku A genomu geminowirusa (np. wirusa złotej mozaiki pomidorów). Istnieją wirusy DNA z genomami utworzonymi przez dwie jednoniciowe cząsteczki DNA, z których każda przechodzi przez postać dwuniciowąnadającąsię do replikacji. Cząsteczka A może sama ulegać replikacji w komórkach roślinnych, natomiast cząsteczka B jest wymagana do zainfekowania. Aby w komórce zaszła z powodzeniem infekcja wirusowa, muszą być w niej obecne zarówno geny A jak i B.
Inny sposób transfekcji materiału genetycznego w komórkach roślinnych obejmuje bezpośrednie wprowadzanie materiału genetycznego na drodze fizycznej. Jedną z fizycznych metod wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych jest elektroporacja. Zazwyczaj materiał genetyczny zawierający w wysokim stężeniu plazmidowy DNA dodaje się do zawiesiny protoplastów i mieszaninę poddaje się szokowi elektrycznemu w polu od 200 do 600 V/cm. Po elektroporacji przeprowadza się hodowlę protoplastów przez 1 -2 tygodnie, po czym dokonuje się selekcji komórek, które przyjęły DNA. Zazwyczaj wydajność takiego procesu wynosi 0,1-1 %.
Jeszcze inny sposób fizycznego wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślin obejmuje zastosowanie drobnych perełek metalu (np. wolframu) powleczonych odpowiednim DNA. Perełki te czyli mikrokulki o średnicy 1 μτη wstrzeliwuje się bezpośrednio do komórek. DNA po prostu wytrąca się na powierzchni perełek, które wystrzeliwuje się z „pistoletu” z szybkością około 430 m/s. Cel może stanowić zawiesina hodowli komórek embronalnych posianych na filtrach, a także pełne Uście lub nasiona. Komórki na linii strzału są uśmiercane, ale występuje koncentryczna strefa komórek, w której odłamki penetrują do komórek bez zabijania ich. Analiza morfologiczna liści bombardowanych wektorem genu reporterowego β-glukuronidazy (GUS) wykazała, że cząstki wolframu mogąpenetrować przez co najmniej jedną warstwę tkanki, naskórek liścia i dochodzą do mezofilu. Mikrokuleczki powleczone DNA zastosowane także do wprowadzania materiału genetycznego do chloroplastów.
Polimery dendrytowe, a zwłaszcza polimery typu gęstej gwiazdy, zapewniają znaczne korzyści przy zastosowaniu do transfekcji materiału genetycznego do komórek roślinnych. Można np. zmodyfikować znane techniki, aby umożliwić transfekcję komórek polimerem typu gęstej gwiazdy (np. dendrymerem typu gęstej gwiazdy) wraz z materiałem genetycznym, osiągając wyżej wspomniane korzyści. W szczególności elektroporację lub drobne perełki metalu wykorzystać można do transfekcji polimeru typu gęstej gwiazdy i materiału genetycznego do komórek roślinnych.
182 237
W szerszym znaczeniu określenie „polimer dendrytowy” użyte w opisie nie ogranicza się do polimerów typu gęstej gwiazdy, choć obejmuje takie polimery typu gęstej gwiazdy. „Polimer dendrytowy” stanowi polimer zawierający regularne rozgałęzienia dendrytowe, wytworzony w wyniku sekwencyjnej lub generacyjnej addycji rozgałęzionych warstw do lub od rdzenia. Określenie „polimer dendrytowy” obejmuje „dendrymery”, które zawierają rdzeń, co najmniej jedną wewnętrzną rozgałęzioną warstwę i powierzchniowąrozgałęzioną warstwę (patrz PetarR. Dvornic i Donald A. Tomalia, Chem. in Brotain, 641-645, sierpień 1994). „Dendron” stanowi fragment dendrymeru zawierający gałęzie rozchodzące się z punktu ogniskowego, który jest lub może być połączony z rdzeniem, bezpośrednio lub poprzez grupę łączącą, tworząc dendrymer. Wiele dendrymerów zawiera dwa lub więcej dendrymerów połączonych ze wspólnym rdzeniem. Jednakże określenie dendrymer jest używane w szerokim zakresie, tak że obejmuje również pojedynczy dendron.
Do polimerów dendrytowych należą, ale nie wyłącznie, symetrycznie i niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery, cząsteczki kaskadowe, arborole itp., z tym że najkorzystniejszymi polimerami dendrytowymi sąpolimery typu gęstej gwiazdy. Ujawnione polimery typu gęstej gwiazdy PAMAM są symetryczne, co oznacza, że zawierają ramiona gałęzi o równej długości. Rozgałęzienie występuje przy atomach wodoru końcowej grupy NH2 gałęzi poprzedniej generacji. Dendrymery oparte na lizynie z przykładu 78 są niesymetryczne, gdyż zawierają ramiona gałęzi o różnej długości. Jedna gałąź występuje przy ε-azocie cząsteczki lizyny, a druga gałąź występuje przy α-azocie w sąsiedztwie reaktywnej grupy karboksylowej, która przyłącza gałąź do gałęzi poprzedniej generacji.
Hiperrozgałęzione polimery, np. hiperrozgałęzione poliole, mimo iż nie zostały wytworzone przez regularną kolejną addycję rozgałęzionych warstw, mogą być równoważne polimerowi dendrytowemu, gdy charakter rozgałęzień wykazuje stopień regularności zbliżony do występującego w dendrymerze.
Do polimerów dendrytowych należą zarówno dendrymery mostkowe jak i agregaty dendrymerów. Polimery dendrytowe obejmują generacyjnie zarówno monodyspersyjne jak i polidyspersyjne roztwory dendrymerów. W roztworze monodyspersyjnym zasadniczo wszystkie dendrymery są tej samej generacji i w związku z tym mają równomierny kształt i wygląd. Roztwory połidyspersyjne charakteryzują się rozrzutem różnych generacji dendrymerów. W korzystnym wykonaniu połidyspersyjne polimery dendrytowe zawierają dendrymery co najmniej trzech różnych generacji o wielkości w zakresie od około 22 do około 110 A. Próbki P i Q z przykładu 42 stanowią przykłady takich polidyspersyjnych polimerów dendrytowych.
Do polimerów dendrytowych należą również dendrymery modyfikowane powierzchniowo. Tak np. powierzchnia dendrymeru PAMAM może zostać zmodyfikowana w wyniku addycji aminokwasu, np. lizyny lub argininy.
Należy zdawać sobie sprawę, że odniesienie do dowolnego określonego typu polimeru dendrytowego takiego jak „polimer”, np. „polimer typu gęstej gwiazdy”, „niesymetryczny polimer dendrytowy” lub „polimer kaskadowy”, obejmuje również dendrymery mostkowe tego typu, agregaty dendrymerów tego typu, połidyspersyjne dendrymery tego typu i powierzchniowo modyfikowane dendrymery tego typu.
Na powierzchni dendrymeru stosowanego do przenoszenia materiału genetycznego korzystnie znajdują się w przeważającej części dodatnio naładowane grupy funkcyjne. Jeszcze korzystniej taką dodatnią funkcyjność uzyskuje się dzięki aminowym grupom końcowym na powierzchni dendrymeru. Dodatnio naładowane grupy funkcyjne można również wprowadzić na powierzchnię na drodze chemicznej (np. jako czwartorzędowe aminy). Taką funkcyjność aminową może zapewnić poliaminowe, poliamidoaminowe lub polialkilenoiminowe (np. polietylenoiminowe i polipropylenoiminowe) dendrymery opisane powyżej, choć można to osiągnąć również w inny sposób.
Ogólnie dendrymery stosowane do przenoszenia materiałów genetycznych mają kształt kulisty, elipsoidalny i prętopodobny. Średnica (średnice) najwęższego przekroju wynoszą korzystnie co najmniej 50 A. Wymiar ten odpowiada w przybliżeniu średnicy dendrymeru PAMAM 6
182 237 generacji z rdzeniem z amoniaku [G6 (NH3)] lub dendrymeru 6 generacji z rdzeniem z etylenodiaminy [G6 (EDA)] (który jest nieco większy niż w przypadku rdzenia a amoniaku). (Patrz przykład 5, fig. 12 i 13; przykład 6, fig. 15 oraz przykład 3, fig. 19). Górna granica wymiaru nie została określona, choć wiadomo, że dendrymery G11 (EDA) PAMAM o średnicy około 110 Ά zapewniają doskonałą transfekcję. W oparciu o dane wskazujące, że agregaty dendrymerów o średnicy do około 1 000 A wystarczająco ulęgają transfekcji, a agregaty 2 000-5 000 A nie ulegają uważa się, że cząstki dendrymeru mogą mieć średnicę nawet około 1 000 A, oraz że mniejsze cząstki mogą tworzyć agregaty o średnicy nawet około 1 000 A, korzystnie 50-110 A. Średnice takie zazwyczaj uważa się za wymiary makrocząsteczek, w związku z czym, dendrymery określa się jako makrocząsteczki dendtrytowe.
Dendrymery o mniejszej średnicy można także stosować do transfekcji komórek materiałem genetycznym, z tym że najlepsze wyniki uzyskuje się jeśli kompleks DNA: dendrymer w postaci mniejszych cząstek zasocjuje się następnie z dendrymerami o większych cząstkach, o średnicy około 50 A w najwęższym wymiarze (patrz przykład 7, fig. 15 i 16). W przykładzie 7 (fig. 15 i 16) doskonałątransfekcję uzyskano kompleksując DNA z dendrymerem G5 (EDA) lub dendrymerem G5 (NH3) (o średnicy około 40 A), a następnie dodając do kompleksu dendrymer G9 (EDA) lub dendrymer G9 (NH3) (o średnicy około 90 A). Należy zaznaczyć, że odwrotna kolejność okazała się nie tak skuteczna.
Uważa się, że przy zastosowaniu takiego sekwencyjnego sposobu drobniejsze dendrymery mogą zawierać cząstki o najmniejszej średnicy wynoszącej zaledwie około 22 A, co odpowiada dendrymerowi G3 (NH3) PAMAM. Dendrymery poniżej generacji około 3 (G3) nie kompleksują niezależnie DNA. Najmniejsza średnica większych dendrymerów może wynosić zaledwie około 50 A aż do około 1 000 A.
Kombinacj e dendrymerów o dwóch różnych wymiarach skompleksowanych z DNA mogą również wzmagać transfekcję. Jest to słuszne zwłaszcza wtedy, gdy mieszanka dendrymerów jest polidyspersyjna pod względem wielkości, np. zawiera cząstki o wielkości w zakresie od około 22 do około 110 A. Próbki P i Q z przykładu 3 stanowią przykłady takich polidyspersyjnych kompozycji.
Sferoidalny dendrymer wytworzyć można rozpoczynając sekwencję reakcji tworzenia generacji od zasadniczo kulistego inicjatora lub materiału rdzenia, najkorzystniej zawierającego trzy miejsca reaktywne wystające z rdzenia, zazwyczaj w równiej odległości od siebie, takiego jak amoniak. (Patrz np. publikacja patentowa europejska 0115771 i patenty USA nr 4 507 466, 4 558 120,4 568 737,4 587 329 i 4 737 550). Dendrymer może mieć także kształt wydłużonej elipsoidy lub być pręto-podobny, jeśli wychodzi się z wydłużonego, polimerycznego rdzenia zawierającego szereg miejsc reaktywnych wystających promieniowo od rdzenia w różnych punktach na całej długości, takiego jak polietylenoimina. (Patrz np. publikacja patentowa europejska nr 0234 408 i patent USA nr 4 694 064). Dendrymery elipsoidalne uzyskuje się wychodząc z krótszego materiału rdzeniowego niż rdzeń stosowany przy dendrymerach prętowych, takiego jak np. etylenodiamina (EDA).
W dendrymerze kulistym średnica kuli korzystnie przypada w zakresie korzystnych średnic podanych powyżej. W dendrymerze elipsoidalnym lub w dendrymerze pręto-podobnym średnica prostego przekroju elipsoidy lub pręta powinna korzystnie przypadać w zakresie korzystnych średnic podanym powyżej. Prosty przekrój nie musi stanowić idealnego kołą w związku z tym może wykazywać średnice o różnych długościach, zależnie od tego, gdzie przetnie się przekrój. Uważa się, że długości dendrymerów mogą wynosić do 1 000 A.
Do przenoszenia materiału genetycznego wykorzystać można również dendrymery mostkowe. Struktury takie mogą znacznie różnić się kształtem, z tym że zasadniczo utworzone są przez zasocjowanie ze sobą sąsiednich dendrymerów typu gęstej gwiazdy, zwłaszcza poprzez wiązanie kowalencyjne, z tym że możliwe są także oddziaływania niekonwalencyjne. 4 lub 5 mniejszych, kulistych, elipsoidalnych lub pręto-podobnych dendrymerów może zostać połączona mostkami tworząc agregatową strukturę unimolekulamą, wykazującą skuteczność trasfekcji dendrymeru wyższej generacji.
182 237
Interesujący wariant koncepcji dendrymeru mostkowego obejmuje tworzenie makrocząsteczkowych klastrów, w których materiał DNA lub RNA służy jako niekonwalencyjna siatka pomiędzy odrębnymi dendrymerami, przy czym siatka taka utworzona jest np. w oparciu o oddziaływania elektrostatyczne. Wydaje się, że przybliżenie takiego modelu stanowi kompleks z przykładu 46, wspomniany powyżej, w którym DNA najpierw kompleksuje się z dendrymerem o mniejszych cząstkach (np. G5), po czym kompleksy DNA: dendrymer miesza się z dendrymerem o większej średnicy (np. G9), co pokazano na fig. 15 i 16.
Agregaty dendrymerów o większej średnicy tworzą się w wyniku przyciągania dendrymerów zakończonych grupami aminowymi przez rdzeń z dendrymerów zakończonych grupami karboksylanowymi. W zależności od stopnia ładunków dwóch klas dendrymerów stosowanych w takiej kompozycji, a także od ich stężenia przy wytwarzaniu kompozycji, powstająróżne typy agregatów dendrymerów. Wydaje się, że skuteczność transfekcji jest wyższa, gdy w mieszaninie dendrymeru z końcowymi grupami aminowymi i dendrymeru z końcowymi grupami karboksylanowymi stosunek ładunku dodatniego do ładunku ujemnego wynosi korzystnie od około 25:1 do około 100:1, co powoduje powstanie agregatów zawierających sumarycznie ładunek dodatni (przykład 34). Przy odpowiednich stosunkach skuteczność transfekcji może być wyższa od obserwowanej dla macierzystego dendrymeru z końcowymi grupami aminowymi stosowanego przy takim samym stosunku ładunków i w obecności DEAE-dekstranu (który także zwiększa skuteczność transfekcji).
Dendrymery pełnej generacji (z końcowymi grupami aminowymi) i generacji połówkowej (z końcowymi grupami karboksylanowymi) tworzą agregaty dendrymerów przy pH około 6-9, w zależności od stosunku dendrymerów z końcowymi grupami aminowymi do dendrymerów z końcowymi grupami karboksylanowymi, a także od stężeń próbki. Przy pH> 9 protonowane aminy pierwszorzędowe dendrymerów pełnej generacji zaczynają ulegać odprotonowaniu, co powoduje rozpad agregatu. Przy pH < 6 karboksylany i aminy trzeciorzędowe we wnętrzu dendrymerów połówkowej generacji zaczynają ulegać protonowaniu, co powoduje powstanie jonów dwubiegunowych w dendrymerach połówkowej generacji, a w efekcie również rozpad agregatu. Wydaje się, że agregat dendrymeru PAMAM jest jedynym materiałem o takiej unikatowej właściwości. .
Wiadomo że pH poza komórką wynosi 7,2, a we wnętrzu komórki około 5,0. Z tego względu celowe jest zaprojektowanie i wytworzenie agregatów dendrymerów o wyższym ciężarze cząsteczkowym z dendrymerów niższej generacji przy pH 7,4 uzyskując agregat dendrymerów tak duży, że skutecznie kompleksuje cząsteczki DNA. Jednakże aby związać DNA, takie agregaty dendrymerów powinny przenosić sumarycznie ładunek dodatni, co oznacza, że powinien istnieć znaczny nadmiar dendrymerów pełnej generacji nad dendrymerami połówkowej generacji. Jedną z interesujących właściwości takiego układu dozowania jest to, że po przedostaniu się kompleksu do komórki agregaty dendrymerów ulegają rozpadowi w wyniku niższego pH we wnętrzu komórki. Taka dysocjacja również może zwiększyć skuteczność transfekcji.
Kowalencyjna modyfikacja powierzchni dendrymerów PAMAM z grupami aminowymi za pomocą aminokwasu, lizyny, spowodowała nieoczekiwany i unikatowy wzrost skuteczności transfekcji (przykład 35, fig. 57). Stosując zmodyfikowany lizyną dendrymer G7 (NH3) skompleksowany z plazmidem uzyskuje się znacznie zwiększoną ekspresję genu lucyferazy w porównaniu z niemodyfikowanym dendrymerem G7 (NH3), a ponadto kompleksy utworzone z modyfikowanym lizyną dendrymerem G7 (NH3) zapewniają transfekcję zbliżoną do osiąganej w przypadku dendrymeru G10 (NH3) (wszystkie eksperymenty prowadzono przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10 i w obecności DEAE-dekstranu). Doświadczenie to sugeruje, że zwiększenie gęstości ładunku w dendrymerach wpływa na proces transfekcji, gdyż pKa grupy ε-aminowej wynosi 10,53 w porównaniu z pKa około 9 dla końcowych grup aminowych w dendrymerze PAMAM. Można oczekiwać, że również inne modyfikacje powierzchni zwiększą transfekcję w podobny lub nawet w większy sposób.
182 237
C. Opis aktywności dendrymerów w niespecyficznej transfekcji
Dokładny mechanizm niespecyficznej (to znaczy nieukierukowanej docelowo) transfekcji komórek przez kompleksy DNA:dendrymer nie jest znany, z tym że pewne sprawy są oczywiste. Nie mając zamiaru wiązać się jakąkolwiek teorią wynalazcy uważają, że DNA wiąże się z dendrymerem w wyniku oddziaływania ładunków, oraz że najwydajniejsza transfekcja występuje wtedy, gdy wytwarza się kompleks przy nadmiarze ładunków dodatnich. Oddziaływanie między kompleksem DNA:dendrymer i komórkąjest prawdopodobnie spowodowane wiązaniem się dodatnio naładowanego kompleksu z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórek. Okazało się, że prowadzenie transfekcji w obecności surowicy lub niemożność wymycia surowicy z powierzchni komórek uniemożliwia transfekcję w wyniku zobojętnienia ładunków na powierzchni komórki, co uniemożliwia przyklejenie się kompleksów do komórki. Należy zwrócić uwagę, że pewne typy kompleksów DNA:dendrymer działają lepiej w przypadku niespecyficznej transfekcji określonych komórek. To odkrycie sugeruje, że istnieją różnice w powierzchni komórek, które ułatwiają oddziaływania z pewnymi typami kompleksów DNA:dendrymer. Potencjalnie odmienne dendrymery mogą być stosowane lub opracowane w celu zapewnienia najwydajniejszej transfekcji w przypadku różnych typów komórek.
Możliwe jest również, że z uwagi na znaczne różnicie w wielkości różnych form materiału genetycznego stosowanych w terapii z przenoszeniem genu, konieczne mogą się okazać dendrymery o różnych wielkościach i gęstościach ładunku dla zapewnienia skutecznej, niespecyficznej transfekcji różnych form materiału genetycznego. Teoretycznie kompleks materiału genetycznego z dendrymerem, który skutecznie wiąże się z komórkami w wyniku oddziaływania ładunków, może bardzo różnić się w przypadku małych fragmentów materiału genetycznego takich jak oligonukloeotydy złożone jedynie z kilku zasad, oraz wielkich fragmentów materiału genetycznego takich jak duże plazmidy DNA. Możnaby zasadniczo oczekiwać, że materiał genetyczny tworzy niewielki kompleks, który wykazuje wysoką gęstość ładunku dodatniego na powierzchni, aby zaszła transfekcja oparta na oddziaływaniu ładunków. W związku z tym stosowanie mniejszych dendrymerów, a następnie większych dendrymerów, albo stosowanie dendrymerów polidyspersyjnych może mieć istotne znaczenie dla tworzenia unikatowych kompleksów naj skuteczniej przenoszących DNA. Również dodatek DEAE-dekstranu lub gliceryny do buforu transfekcji po wytworzeniu kompleksu DNA: dendrymer powoduje zaskakujące i nieoczekiwane zwiększenie transfekcji komórek. Dodatek innych środków do buforów transfekcji takich jak chlorochina, która może ułatwić uwalnianie DNA z endosomów lub zapobiec jego degradacji w endosomach, może także odgrywać istotą rolę w zwiększaniu transfekcji z wykorzystaniem kompleksów dendrymerów. Jednakże takie zjawiska mogą dotyczyć jedynie niespecyficznej transfekcji in vitro a różne kombinacje warunków lub kombinacje materiałów takich jak fuzogeniczne peptydy skuteczniej zwiększajątransfekcję in vivo lub z docelowo ukierunkowanymi nośnikami dendrymerów.
D. Materiał genetyczny i jego kompleksowanie z dendrymerem z wytworzeniem kompleksu
Materiały genetyczne stanowią materiały oparte na nukleotydach obejmują, ale nie wyłącznie, wirusy i fragmenty wirusów, plazmidy, fagi, kosmidy, geny i fragmenty genów (np. egzony, introny) kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) zarówno jedno jak i dwuniciowy, kwas rybonukleinowy(RNA), rybosomowy RNA (rRNA), katalityczny RNA (cRNA), mały jądrowy RNA (snRNA), informacyjny RNA (mRNA), przenośnikowy RNA (tRNA), oligonukleotydy DNA i RNA (zarówno jedno- jak i dwuniciowe) albo oligomery i (antysensowne) oligonukleotydy, białkowe kwasy nukleinowe (PNA) podstawione oligonukleotydy kwasów nukleinowych. Materiał genetyczny, zwłaszcza w postaci wirusów i fragmentów wirusów, może być skompleksowany lub sprzężony z pewną ilością białka. Określenie materiał genetyczny obejmuje także „modyfikowanie olignukleotydy” opisane dokładniej poniżej. Nukleotydy mogą być modyfikowane, tak, aby nadać im większą odporność na degradację enzymatyczną zwiększyć wchłanianie przez komórki lub w innych celach. W celu zwiększenia wchłaniania przez komórki i/lub odporności na degradację enzymatyczną, naukowcy zastępują ujemny tlen w szkielecie fosfodiestrowym grupą metylową lub siarką, tworząc metylofosfoniany lub fosforylotiany. W wyniku tego
182 237 uzyskuje się odporną na enzymy nić pochodnej syntetycznego oligonukleotydu, zachowującą trwale integralność po wymieszaniu z komórkowym materiałem biologicznym. Nici odporne na nukleazę można także uzyskać wprowadzając grupy2'-O-allilowe do syntetycznych oligonici. Wytworzono także fosforyloditiany. Przeprowadzono także modyfikację poprzez wytworzenie estrów fosforanowych i fosforyloamidanów.
Inny typ zbadanej modyfikacji stanowi zastępowanie mostka fosfodiestrowego między nukleoty darni całkowicie inną grupą takąjak mostek siloksanowy, mostek węglanowy, mostek z estru karboksymetylowego, mostek acetamidowy, mostek karbaminianowy, mostek tioeterowy i mostek peptydowy. Poza zastąpieniem mostka fosforanowego można także zastąpić reszty cukrowe i fosforanowe syntetycznym polimerem, uzyskując tworzywo wy DNA. Można również modyfikować same jednostki nukleozydowe. Określenie „materiał genetyczny” użyte w opisie obejmuje również segmenty nukleotydowe zmodyfikowane dowolnym z wyżej podanych sposobów, albo w inny sposób. Zasadniczo w znaczeniu użytym w opisie określenie „oligonukleotyd” odnosić się będzie do wszystkich krótkich form materiału genetycznego.
Materiały genetyczne (np. kwasy nukleinowe) mogą zdecydowanie różnić się długością, począwszy od 3 zasad (około 10 A) w przypadku kodonu do 10 miliardów Ά czyli 1 metra w przypadku ludzkiego DNA. Wiele różnych form materiałów genetycznych może być wykorzystywana w terapii genetycznej. [Jako przykłady takich zakresów można podać: długość typowego ludzkiego genu wynosi około 34 μ(340000 A); średnia długość mRNA E. coli wynosi około 0,5 A; a długość tRNA uważanego za najmniejsząz cząsteczekRNA wynosi zazwyczaj około 0,003 μ].Potencjalnie dowolny materiał genetyczny wykorzystać można w wynalazku.
Kompleksy materiału genetycznego z dendrymerem określa się jako kompleksy. W użytym znaczeniu określenie „kompleks” dotyczy takiego typu koniugatu dendrymeru z przenoszonym materiałem w którym asocjacja przenoszonego materiału z dendrymerem tworzy się w wyniku wiązania jonowego, sił van der Waalsa, wiązania wodorowego, wiązania metalicznego lub dowolnej ich kombinacji. W kompleksie przenoszony materiał nie jest zasocjowany z dendrymerem poprzez wiązanie kowalencyjne.
Wchłanianie kompleksów DNA: dendrymer przez komórki wykazano w przypadku nukleoty dów jednoniciowego DNA o stosunkowo niskim ciężarze cząsteczkowym (przykład 8, fig. 20 i 21), a także w przypadku DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Na fig. 22 przedstawiono także przenoszenie i ekspresję genu dla kolistego lub superzwiniętego DNA i liniowego DNA (przykład 9, fig. 22), a w innych doświadczeniach i na innych rysunkach przedstawiono to dla całych genów i długich segmentów DNA (np. 6,5 kb). Wchłanianie obserwowane dla kompleksu DNA: dendrymer, jest ułatwione w porównaniu z wchodzeniem do komórki występującym w przypadku samego DNA oraz stanowi aktywny, zależny od energii proces komórki docelowej (przykład 8).
Aby przyłączyć materiał genetyczny do dendrymeru, dendrymer, korzystnie już ukierunkowany do zastosowania in vivo w sposób opisany poniżej, miesza się z materiałem genetycznym w roztworze wodnym w temperaturze pokojowej (20-40°C) przy pH od około 5 do około 10. Ujemnie naładowane kompleksy kwasu nukleinowego z dodatnio naładowanymi powierzchniami cząsteczek dendrymeru tworzą strukturę sieciową.
Materiał genetyczny, taki jak DNA, tworzy trwałe kompleksy z dendrymerami przy stosunkach ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynoszących nawet około 10:1, z tym że większe kompleksowanie występuje przy stosunkach ładunków około 2:1 lub poniżej. (W przykładzie 3 skuteczną transfekcję zaobserwowano dla próbki 4 o stosunku ładunków 1:0,6, patrz tabela V, fig. 18 i 32. Taki stosunek ładunków umożliwia również pełne kompleksowanie DNA, na co wskazuje analiza na żelu agarozowym). Przy niższych stosunkach ładunków np. 1:10 lub 1:100, kompleksy są w dalszym ciągu bardzo trwałe (patrz przykład 10, fig. 23), a transfekcję obserwuje się nawet w nieobecności DEAE-dekstranu (przykład 17 i fig. 30). Kompleksowanie osiąga minimum przy stosunkach ładunków DNA: dendrymer powyżej około 40:1, jak to wynika z przykładu 10, fig. 23 (A) - (D). Na drugim końcu zakresu stosunków ładunków dobre wyniki transfekcji zaobserwować można dla pewnych dendrymerów przy stosunkach
182 237 ładunków DNA: dendrymer około 1:1 000 a nawet tak niskich j ak około 1:10 000 (przykład 17, fig. 30). Jest możliwe, że w przypadku innych układów dendrymerów stosunki ładunków wynoszące zaledwie 1:1 000 000 mogą zapewnić skuteczne uczestniczenie w transfekcji.
Okazało się, że stosunek ładunków stanowi decydujący parametr wpływający na tworzenie się kompleksów DNA:dendrymer, na co wskazuje przykład 11 (fig. 24), gdzie przy takim samym stosunku molowym 1:16 dendrymer G11 (EDA) o większym ładunku powierzchniowym niż dendrymer G8 (NH3) tworzy trwały kompleks z DNA, podczas gdy dendrymer G8 (NH3) po wymieszaniu z DNA w tym samym stosunku molowym nie tworzy go. Oznacza to, że tworzenie kompleksu bardziej zależy od stosunku ładunków niż od stosunku molowego.
Kompleks DNA:dendrymer są znacząco stabilne i rozpuszczalne w wodzie we względnie szerokim zakresie pH, np. 5,2-9,8 (przykład 12, fig. 25) i w szerokim zakresie stężeń soli, np. 0-1,5 M (przykład 13, fig. 26). Kompleksowanie materiału genetycznego z dendrymerem chroni ten materiał przed strawieniem w obecności enzymów typu endonukleaz restrykcyjnych lub nukleaz komórkowych (przykład 14 fig. 27 i przykład 15, fig. 28). Powoduje to, że kompleksy takie nadają się do transfekcji invivo.
Ilość materiału genetycznego w przeliczeniu na komórkę, którą można transfekować przy wykorzystaniu kompleksów DNA:dendrymer, może zmieniać się i w tym zakresie zwiększenie stężenia materiału genetycznego powoduje wzrost stopnia transfekcji (przykład 16, fig. 29). Przy danym stosunku ładunków transfekcja jest większa przy 5 pg plazmidowego DNA/studzienkę hodowli (około 200 000 komórek) niż przy 1 pg plazmidowego DNA, choć zależność ta osiąga plateau przy 10 pg plazmidowego DNA/studzienkę.
Uważa się, że roztwory materiału genetycznego/dendrymeru, w których stężenie materiału genetycznego wynosi od około 1,0 do około 10,0 pg/ml, są przydatne in vitro.
Tak więc materiał genetyczny w ilości wystarczającej do uzyskania ostatecznego stężenia od około 1,0 do około 10,0 pg/ml miesza się w wodzie z odpowiednią ilością polimeru dendrytowego z zasadniczo dodatnimi powierzchniowymi grupami funkcyjnymi do uzyskania stosunku ładunków materiału genetycznego do polimeru dendrytowego od około 10:1 do około 1:10 000, jeszcze korzystniej od około 3:1 do około 1:1 000, a szczególnie korzystnie od około 1,5:1 do około 1:100 albo od około 1:1 do około 1:15 lub do około 1:5 do około 1:10, w zależności od zmiennych opisanych powyżej. Mieszanie przeprowadza się przy pH od około 5 do około 10 w temperaturze od około 20 do około 40°C.
Ogólnie stosunek ładunków materiału genetycznego:dendrymeru może wynosić od około 10:1 do około 1:10 000 (a ewentualnie może być nawet niższy), ale korzystnie wynosi około 5:1 lub nawet od 3:1 do 1:10 000. Stosunek wybrany w tym zakresie może zmieniać się w zależności od tego, czy stosuje się środek wzmacniający taki jak DEAE-dekstran, glicerynę lub chlorochinę, albo w zależności od tego, czy stosuje się prowadnik docelowy. Jalckolwiek powyższe szerokie zakresy mogą być wykorzystywane, to korzystny zakres stosunku ładunków bez stosowania środka wzmacniającego wynosi od około 1:5 do około 1:10 000, a jeszcze korzystniej od około 1:10 do około 1:10 000. Natomiast przy stosowaniu środka wzmacniającego korzystny zakres stosunku ładunków wynosi od około 5:Ido około 1:10 000, jeszcze korzystniej od około 1:1 do około 1:100 szczególnie korzystnie od około 1:1 do około 1:15, a najkorzystniej od około 1:5 do około 1:10. Natomiast przy stosowaniu prowadnika docelowego uważa się, że można zastosować wyższy stosunek ładunków z lepszym rezultatem niż przy transfekcji nieukierunkowanej. W związku z tym uważa się, że korzystny zakres wynosi od około 10:1 do około 1:10, jeszcze korzystniej od około 3:1 do około 1:10, szczególnie korzystnie od około 1:1 do około 1:10, a w pewnych przypadkach stosunek ten najkorzystniej wynosi około 1:1. Zakresy te dokładnej przedstawiono poniżej.
Zazwyczaj kompleksy wstępnie miesza się tak, aby stężenie materiału genetycznego wynosiło od około 1,0 do około 10 pg/20 pl, po czym rozcieńcza się je 50-krotnie do uzyskania ostatecznego stężenia 1,0-10,0 pg materiału genetycznego/ml. Zarówno wyjściowe, bardziej stężone roztwory lub ostateczne roztwory zawierające materiał genetyczny i polimer dendrytowy można pakować jako odpowiednie kompozycje diagnostyczne lub farmaceutyczne.
182 237
E. wzmacnianie transfekcji
Można przeprowadzić transfekcję komórek materiałem genetycznym z zastosowaniem tylko polimerów dendrytowych, z tym że stosując większe dendrymery (>G8) przy niższym stosunku ładunków materiału genetycznego do dendrymeru, np. około 1:5 lub poniżej, a korzystnie poniżej około 1:10 (przykład 17, fig. 30 i 31). Transfekcję przy zastosowaniu tylko dendrymeru i materiału genetycznego można wzmocnić kompleksując najpierw materiał genetyczny z dendrymerem niższej generacji, np. G5, a następnie dodając większy dendrymer, np. G9, jak to podano powyżej (patrz przykład 7 fig. 15 i 16). Najlepsze wyniki uzyskuje się przy stosowaniu drugiego dendrymeru w stężeniu około 0,1-10 pmolowym, choć konkretne stężenie może zmieniać się w zależności od rodzaju dendrymeru (porównaj fig. 15 i 16). Pierwszy dendrymer i kompleksowany z nim materiał genetyczny stosuje się w stężeniach wystarczających do skompleksowania około 1 pg materiału genetycznego na studzienkę.
Kompleksy transfekujące komórki niespecyficznie powinny spełniać dwa sprzeczne cele: po pierwsze wskazane jest możliwie jak największe zagęszczenie DNA przy równoczesnym uzyskaniu dużej gęstości ładunków dodatnich na powierzchni kompleksu, które uczestniczą w wiązaniu z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na błonach komórkowych. Takie wymaganie odnośnie podwójnej aktywności sugeruje, że mieszanka dendrymerów o polidyspersyjnych wielkościach może być bardzo cenna przy niespecyficznej transfekcji, przy czym mniejsze dendrymery ułatwiają zagęszczenie DNA, a większe uczestniczą w wiązaniu z komórkami. Może to także ułatwić tworzenie kompleksów DNA:dendrymer o mniejszych wymiarach, gdyż dendrymery niższych generacji mogą niszczyć regularną siatkę utworzoną przez większe dendrymery i DNA. Tego typu koncepcje potwierdzają dane przedstawione na mikrofotografiach elektronowych (np. fig. 60, zdjęcia 3,4 i 5), że przy stosowaniu dendrymerów o polidyspersyjnych wielkościach uzyskuje się małe, zagęszczone kompleksy DNA w porównaniu z masywnymi kompleksami DNA:dendrymer powstającymi przy zastosowaniu tylko dużych dendrymerów.
Transfekcję można także wzmocnić dodając różne środki do bufora transfekcji. Nieoczekiwanie uzyskuje się synergistyczną transfekcję, gdy bufor transfekcji zawiera DEAE-dekstran wraz z kompleksem materiału genetycznego i dendrymeru. Stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 5:1 do około 1:10 000, korzystnie od około 1:1 do około 1:100, jeszcze korzystniej od około 1:1 do około 1:15, a najkorzystniej od około 1:5 do około 1:10 (przykład 17, fig. 30; przykład 18, fig. 32; przykład 19, fig. 33; przykład 20, fig. 34; przykład 3, fig. 17). Stężenie DEAE-dekstranu powinno korzystnie przypadać w stosunkowo wąskim zakresie około 0,125-2 μΜ a jeszcze korzystniej około 0,25-ΙμΜ (przykład 21, fig. 35). Materiał genetyczny musi być skompleksowany z dendrymerem przed umieszczeniem go w roztworze DEAE-dekstranu, aby wzmocnić zachodzącą transfekcję. Po zastosowaniu tego transfekcja w obecności DEAE-dekstranu dla kompleksów DNA:dendrymer przy stosunku ładunków od około 1:1 do około 1:100, a jeszcze korzystniej od około 1:5 do około 1:10 jest skuteczniejsza o rzędy wielkości niż transfekcja samymi kompleksami DNA:dendrymer w szerokim zakresie różnych typów komórek (przykład 22, fig. 37). Jest ona również skuteczniejsza niż transfekcja z wykorzystaniem innych środków takich jak Lipofectin™ i Lipofectamine™ (przykłady 22-24, fig. 36-38).
Zazwyczaj kompleks materiał genetyczny-.dendrymer odstawia się na 3-5 minut po wytworzeniu, a przed połączeniem z roztworem DEAE-dekstranu. Jakkolwiek DEAE-dekstran można dodać albo do bardziej stężonego roztworu kompleksu (np. zawierającego 1 -10 pg materiału genetycznego/20 μΐ roztworu) albo do buforu transfekcji, to korzystne jest dodanie go do buforu, którym następnie rozcieńcza się bardziej stężony roztwór kompleksu materiału genetycznego: dendrymeru.
Wiadomo, że transfekcja in vitro wzmacniana jest przez zastosowanie konwencjonalnego składnika zakłócającego działanie komórki. Z wynalazku wynika, że DEAE-dekstran działa silniej niż środek zakłócający komórkę, co można stwierdzić z przykładu 25, fig. 39, gdzie porównano wpływ DEAE-dekstranu i środka zakłócającego komórkę, DMSO. Okazuje się, że sam DMSO wywiera niewielki wpływ na transfekcję kompleksami DNA:dendrymer w porównaniu z DEAE-dekstranem. Należy zauważyć, że DMSO wydaje się synergistycznie wzmacniać działanie
182 237
DEAE-dekstranu, gdy zastosuje się razem obydwa te środki, co sugeruje iż wpływ DEAE-dekstranu obejmuje działanie inne niż zakłócanie komórki.
W związku z tym, że wykazano iż dodatek DEAE-dekstranu lub innych środków do kompleksu DNA:dendrymer (po jego wytworzeniu) skutecznie wzmacnia transfekcję w unikatowy sposób, przeprowadzono innego rodzaju doświadczenie, aby lepiej zrozumieć rolę tego środka we wzmacnianiu niespecyficznej transfekcji. Wykonano mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA:dendrymer z dodatkiem i bez DEAE-dekstranu. Dodatek DEAE-dekstranu lub zastosowanie polidyspersyjnych mieszanek dendrymerów powoduje zdecydowane zmniejszenie wielkości kompleksów DNA: dendrymer (np. fig. 60, zdjęcia 3,4 i 5). Tłumaczy to, w jaki sposób środki takie mogą wzmacniać transfekcję, gdyż istnieje większe prawdopodobieństwo, że kompleksy o mniejszych wymiarach uzyskiwane przy zastosowaniu takich środków będą miały łatwiejszy dostęp do komórek w celu osiągnięcia transfekcji.
Kompleksy DNA:dendrymer muszą zawierać gęsto dodatnio naładowany materiał, aby działać jako punkt ogniskujący wiązanie z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórki. Najlepiej można to osiągnąć stosując dendrymery wyższej generacji, o większej gęstości ładunku powierzchniowego. Niestety dendrymery takie wykazują skłonność do kompleksowania DNA w postaci dużych agregatów lub makrosiatek o wielkości około 2 000-5 000 A, których pinocytoza przez komórki jest utrudniona.
DEAE-dekstran działa jako dyspergator i rozbija duże agregaty na mniejsze kompleksy, co zachowuje w dalszym ciągu gęsty ładunek na powierzchni dendrymeru zapewniający wiązanie z komórkami. Polidyspersyjne polimery dendrytowe, czyli mieszaniny cząstek o różnych wymiarach od około 22 do około 110 Ά (patrz np. próbki P i Q z przykładu 3) nie wykazują skłonności do tworzenia agregatów 2 000-5 000 A. Wydaje się natomiast, że tworzą one agregaty nie większe niż około 1 000 Ά, co ułatwia skuteczną transfekcję materiału genetycznego bez stosowania DEAE-dekstranu. Porównanie mikrofotografii elektronowych kompleksów materiału genetycznego z dendrymerem G10 (EDA) o równomiernej wielkości, z dodatkiem (fig., 60, zdjęcie 4) i bez (fig. 60, zdjęcie 3) DEAE-dekstranu, wykazuje znaczną różnicą w wielkości agregatów. Na mikrofotografii elektronowej materiału genetycznego skompleksowanego z polidyspersyjnym dendrymerem (fig. 60, zdjęcie 5) widoczne są agregaty bardziej porównywalne do agregatów na fig. 60, zdjęcie 4.
Nieoczekiwanie okazało się, że gliceryna, podobnie jak DEAE-dekstran również synergistycznie wzmacnia transfekcję materiału genetycznego w kompleksach materiał genetyczny polimer dendrytowy. Stężenie gliceryny w roztworze transfekcyjnym wynosi korzystnie około 2-10% wagowych, a jeszcze korzystniej od około 2 do około 5%. Okazuje się, że spełnia ona działanie dyspergujące podobnie jak DEAE-dekstran.
Chlorochina także wzmacnia transfekcję i zapewnia to z nieoczekiwanym synergizmem, bez względu na to, czy stosowana jest sama jako środek wzmacniający, czy też w połączeniu z DEAE-dekstranem. Nie wiążąc się jakąkolwiek teorią uważa się , że chlorochina działa w zupełnie inny sposób niż DEAE-dekstran. Sądzi się, że chlorochina zobojętnia endosomy zapobiegając w ten sposób kompleksowaniu i szybkiej degradacji kompleksów materiał genetyczny:dendrymer. Umożliwia to osiągnięcie w większym stopniu transkrypcji i translacji materiału genetycznego, niż przy transfekcji samym kompleksem w obecności DEAE-dekstranu, ale bez dodawania chlorochiny (patrz fig. 61A i 6IB oraz przykład 33). Z uwagi na różnice między komórkami w zdolności do wiązania kompleksów w endosomach działanie wzmacniające chlorochiny znacznie różni się dla różnych linii komórkowych, co ilustrują różnice w wynikach transfekcji komórek COSI (fig. 61 A) i komórek RAT2 (fig. 6IB).
Przypadkowe wprowadzenie ujemnych grup funkcyjnych na powierzchnię polimeru typu gęstej gwiazdy również wpływa na transfekcję (przykład 27, fig. 43). Taką ujemną funkcyjność uzyskuje się rozrzucając przypadkowo grupy karboksylowe na przeważające dodatnio nałado
182 237 wanej powierzchni (np. zawierającej powierzchniowe aminowe grupy funkcyjne). Dendrymery zawierające zarówno dodatnie (kationowe) i ujemne (anionowe) grupy funkcyjne określa się czasami w opisie jako dendrymery z powierzchnią dwubiegunową. Zmniejszenie ogólnego dodatniego ładunku na powierzchni z reguły wydaje się obniżać skuteczność transfekcji, być może z wyjątkiem niższych stosunków ładunków, np. 1:10 w porównaniu z l:51ub 1:1 (fig.43).
F. Transfekcja docelowo ukierunkowana
Wprowadzenie prowadników docelowych do kompleksu dendrymer-materiał genetyczny nie tylko kieruje kompleks do pożądanych komórek, ale może także wzmocnić transfekcję komórek grupą docelową (przykład 26, fig. 40). Do makrocząsteczki przyłącza się taką ilość prowadnika docelowego, aby został on przyciągnięty i związał się z miejscami receptorowymi na materiale komórkowym, w którym ma zajść transfekcja, ale aby nie nastąpiło zmniejszenie ładunku powierzchniowego w takim stopniu, że nie mogło będzie wystąpić kompleksowanie DNA. W związku z tym przyłączanie prowadnika docelowego przeprowadza się w taki sposób, lub w tak proporcjonalnie małych ilościach w stosunku do grup funkcyjnych na powierzchni makrocząsteczki, aby prowadnik docelowy nie zakłócał w znacznym stopniu kationowego charakteru powierzchni polimeru dendrytowego. W związku z tym zachowana zostanie zdolność dendrymeru do tworzenia trwałych kompleksów z DNA (przy wcześniej wspomnianych stosunkach ładunków) i nie zmniejsza się w wyniku obecności prowadnika docelowego (przykład 26, fig. 41).
Zastosowanie prowadników docelowych w połączeniu z koniugatem dendrymer-materiał genetyczny stanowi jedno z najważniejszych korzystnych rozwiązań według wynalazku. Fakt, że nieukierunkowana transfekcja nie zachodzi tak skutecznie przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer powyżej około 1:10 lub 1:5 bez wzmacniania, może wynikać z tego, że kompleksy takie nie zawierają wystarczającego ładunku dodatniego, aby związać się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami na powierzchni komórek. Należy podkreślić, że kompleks wytworzony przy tych wyższych stosunkach ładunku materiału gentycznego: dendrymeru (czyli 1:10 do 1:1 lub ewentualnie nawet 3:1 lub nawet 10:1) może być w dalszym ciągu kierowany przez prowadnik docelowy, tak aby zaszła transfekcja określonych komórek. Nieprzewidzianej transfekcji przypadkowo napotkanych komórek (co mogłoby być niepożądane w wielu przypadkach) unika się, gdy kompleksy DNA:dendrymer wytwarza się w taki sposób przy tych wyższych stosunkach ładunków. Gdy stosuje się prowadnik docelowy, w wielu zastosowaniach korzystny może być stosunek ładunków 1:1.
Prowadniki docelowe lub zmodyfikowane powierzchnie dendrymeru można zastosować w kompleksie dendrymer-materiał genetyczny w obecności DEAE-dekstranu in vitro, aby zintensyfikować transfekcję. Okazuje się, że obecność prowadników docelowych takich jak trisacharyd galaktozowy, na dendrymerach, znacznie wzmacnia transfekcję materiału genetycznego w komórkach wytwarzających w wyniku ekspresji receptor dla tego cukru. Porównano to z transfekcją uzyskiwaną przy stosowaniu nieskoniugowanego dendrymeru Gil (EDA) PAMAM (patrz fig. 40).
Do odpowiednich prowadników docelowych należą dowolne materiały, które wiążą się specyficznie i z wysokim powinowactwem, takie jak przeciwciała, fragmenty przeciwciał takie jak fragmenty Fab, Fab' i F^b^, przeciwciała jednołańcuchowe lub dowolne inne fragmenty przeciwciał wykazujące wymaganą docelową specyficzność, glikoproteiny, białka, glikolipidy, hormony, dodatkowe modyfikatory odpowiedzi biologicznej, epitopy, odżywki komórkowe, chemiczne grupy funkcyjne wykazujące specyficzność względem komórek docelowych itp. Dla specjalistów oczywiste są liczne rozwiązania dotyczące łączenia prowadnika docelowego z dendrymerem.
182 237
Jeden ze sposobów przyłączania korzystnego prowadnika docelowego, biotyny, do dendrymeru zawierającego aminowe grupy funkcyjne na powierzchni, zilustrowano schematycznie poniżej:
Przyłączanie kwasu pirośluzowego, innego potencjalnego prowadnika docelowego, zawierającego aminowe grupy funkcyjne na powierzchni, przebiega zgodnie z następującym schematem reakcji, na którym pokazano sprzęganie 64 pirośluzanów z dendrymerami G5:
godzin @ temperatura pokojowa pH = 5
O II II H3c - C - C - ONa
N=C=N-/^X-''—CH
I3 (EDC)
182 237
Stopień funkcjonalizowania dendrymeru prowadnikiem docelowym jest minimalny, tak aby ograniczyć do minimum zakłócający wpływ prowadnika docelowego na ogólny kationowy charakter powierzchni dendrymeru. W związku z tym stosunek stechiometryczny prowadnika docelowego do makrocząsteczki dendrymeru wynosi od około 1:1 do około NcNb G·': 1 (gdzie Nc i G mają znaczenie podane wyżej, a Nb oznacza krotność rozgałęzień). W dendrymerze, w którym Nc = 3, a Nb = 2, wymaga to jedynie wykorzystania od jednej do NcNbG1 grup końcowych, tak że pozostawia się od NcNb GU do jednej grupy końcowej stanowiącej dodatnio naładowaną (np. aminową) grupę funkcyjną oraz, w pewnych przypadkach, rozproszoną ujemną karboksylową grupę funkcyjną. Logiczna struktura dendrymeru, zwłaszcza w przypadku polimerów lub dendrymerów typu gęstej gwiazdy, umożliwia wyjątkowo precyzyjne koniugowanie, niemożliwe do osiągnięcia w przypadku materiałów innego typu. Taka precyzja umożliwia wytwarzanie ukierunkowanych dendrymerów, które zachowują zdolność wiązania przenoszonego materiału genetycznego.
Podobnie jak można różnicować poszczególne cząsteczki dendrymerów przyłączając do nich grupę ukierunkowującą można także różnicować agregaty. Można np. przyłączyć grupę ukierunkowującą do wszystkich dendrymerów w agregacie, albo tylko do jednego lub do części denrymerów, które można następnie agregować z innymi, nieróżnicowanymi dendrymerami. Po wymieszaniu dwóch typów w fizjologicznie łagodnych warunkach (np. przy pH 7,4), nastąpi ich asocjacja dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym. Taki nowy sposób stanowi nie tylko nową metodę syntezy zróżnicowanych agregatów dendrymerów, ale również dostarcza układu, który może dostarczać grup ukierunkowujących w warunkach fizjologicznych.
G. Zastosowanie kompleksów materiał genetyczny-dendrymer
Kompleksy materiał genetyczny-dendrymer według wynalazku można stosować do przenoszenia DNA in vitro i ex vivo.
Prowadnik docelowy na dendrymerze ułatwia kierowanie i wiązanie koniugatu z receptorami na powierzchni komórek, a następnie ich transfekcję na drodze endocytozy. Na fig. 51 zilustrowano hipotetyczny proces transfekcji komórek ukierunkowanym kompleksem DNA:dendrymer. W „A” DNA (10) zostaje skompleksowany i zagęszczony na szeregu dendrymerach typu gęstej gwiazdy (20) z dołączonym prowadnikiem docelowym (30). W „B” koniugat (10-20-30) przyłącza się do komórki (40) przy receptorach (50) poprzez prowadnik docelowy (30). W „C” zachodzi transfekcja, co przedstawiono jako odszczepienie DNA *(10) od dendrymeru (20), co ułatwia zajście transkrypcji i translacji.
Badania z radionuklidami wykazały, że znaczna część transfekowanego materiału genetycznego wchodzi do jąder komórek eukariotycznych (przykład 30, fig. 47, A-F). Produkt /transfekcji materiałem genetycznym z udziałem dendrymeru wykazuje doskonałą substantywność (przykład 28, fig. 44). Aktywność enzymatyczna Luciferase™ jest znacząca po 21 godzinach, jest w dalszym ciągu znacząca po 45 godzinach od transfekcji, a pewna aktywność występuje nawet po 69 godzinach. Ekspresję genu lacZ wprowadzonego do komórek z plazmidem RŚV-P~gal i dendrymerem przedstawiono na zdjęciach 48 i 49 (patrz również przykład 31). Na zdjęciach komórki wytwarzające w wyniku ekspresji gen lacZ stanowią komórki zaciemnione. W odpowiednich warunkach zabarwiona zostaje prawie każda komórka, co świadczy o tym, iż transfekcja zaszła prawie we wszystkich komórkach w hodowli.
Kompleksy DNA:dendrymer jako takie wykazująbardzo małącytotoksyczność (przykład 29, fig. 45 i 46). Normalna obumieralność komórek w hodowli stanowi około 5-10%. Dodanie kompleksów DNA:dendrymer do hodowli komórek nie powoduje w znacznym stopniu wzrostu szybkości zużycia się hodowli. Wprowadzanie DEAE-dekstranu wraz z kompleksem DNA:dendrymer powoduje wzrost toksyczności, ale w niewielkim stopniu (fig. 45 i 46). Powyższe zjawiska zaobserwowano dla szeregu różnych komórek (ibid).
Materiał genetyczny transfekowany sposobem według wynalazku może być trwale wprowadzony do chromosomowego DNA w komórkach, tak że z powodzeniem ulega reprodukcji i jest zawarty w klonach kolejnych generacji (przykład 32, fig. 52 i 53). Z powodzeniem przeprowadzono transfekcję genów wytwarzających w wyniku ekspresji oporność na G418 (neomycy
182 237 nę) oraz β-galaktozydazę w liniach komórek D5 i RAT2 z wykorzystaniem technik według wynalazku. Obydwa geny doprowadzono na jednym plazmidzie RSV^gal-NEO. Linie komórek ulegają replikacji co 24 godziny. W 4 tygodnie po transfekcji nowo powstałe klony w dalszym ciągu wytwarzały w wyniku ekspresji oporność na neomycynę i β-galaktozydazę. Wyniki uzyskane z wykorzystaniem sposobów według wynalazku są zdumiewająco korzystne w porównaniu ze znanymi sposobami takimi jak prowadzenie transfekcji z udziałem fosforanu wapnia lub samego DEAE-dekstranu. Podobne wyniki uzyskuje się przy współtransfekcji genów reporterowych z innych plazmidów ekspresji (np. neomycyny lub β-galaktozydazy).
Transfekcję materiału genetycznego można także przeprowadzić stosując inne typy polimerów dendrytowych, inne niż polimery typu gęstej gwiazdy, takie jak oparty na lizynie niesymetryczny dendrymer, co wykazano w przykładzie 33 (fig. 54). Wszystkie warunki transfekcji z wykorzystaniem polimerów typu gęstej gwiazdy odnoszą się również do transfekcji z wykorzystaniem innych typów polimerów dendrytowych. Tak np. DEAE-dekstran również synergistycznie wzmacnia także transfekcję z asymetrycznym dendrymerem lizynowym przy stosunku ładunków DNA:dendrymer od 1:5 do 1:10.
Przykłady
Poniższe przykłady dokładniej ilustrująwynalazek, z tym że nie ograniczają jego zakresu. Przykłady oznaczone literami dotyczą wytwarzania materiałów wyjściowych; przykłady oznaczone liczbami dotyczą wytwarzania produktów według wynalazku.
W poniższych przykładach zastosowano następujące określenia i warunki, o ile nie zaznaczono tego inaczej.
Słownik
Temperatura otoczenia oznacza temperaturę pokojową od około 20 do około 25°C.
ASGPR BHA β-gal Bufor wiązania oznacza receptor asialoglikoproteiny. oznacza benzhydryloaminę. oznacza RSV-lacZ. stanowi określony roztwór buforowy opisany poniżej w procedurze transfekcji dendrymeru-dekstranu, dzień 2, etap 1, omówienie wytwarzania roztworu.
BOC St. Cyt c DCC DEAE-dekstran oznacza tert-butoksykarbonyl. oznacza stężony. oznacza białko, cytochrom c. oznacza dicykloheksylokarbodiimid. oznacza eter dietyloaminoetylowy dekstranu, elektrododatnio naładowany polimer.
DMEM DMF DMSO DO3A DOTA DTAF DTPA DTPMP DTT EBV EBV-A oznacza ośrodek Dulbecco's Modified Eagles Medium. oznacza dimetyloformamid. oznacza dimetylosulfotlenek. oznacza kwas l,4,7,10-tetraazacyklododekano-l,4,7-trioctowy. oznacza kwas l,4,7,10-tetraazacyklododekano-l,4,7,10-tetraoctowy. oznacza fluoresceinę dichlorotriazynylową. oznacza dietylenotriaminopentaoctowy. oznacza kwas dietylenotriaminopentametylenofosfonowy. oznacza 1,4-ditiotreitol. oznacza wirus Epsteina-Barra. oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko B fosfotransferazę higromycynową, które dezaktywuje antybiotyk Hygromycine™ z genu kinezowego pod kontrolą promotora EB V.
EDA EDAC EDC oznacza etylenodiaminę. oznacza 1 -ety lo-3 -(3 -dimetyloaminopropylo)karbodiimid. oznacza 1 -(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimid.
182 237
EDTA Analiza FACS FITC G lub Gen GC GGE HBS HEPES HOBT HPLC HRP HyrgomycinB™ oznacza kwas etylenodiaminotetraoctowy. oznacza sortowanie komórek uaktywnionych fluorescencyjnie. oznacza izotiocyjanian fluoresceiny. oznacza generację dendrymeru. oznacza chromatografię gazową. oznacza gradientową elektroforezę żelową. oznacza roztwór soli z buforem Hanksa. oznacza kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy. oznacza N-hydroksybenzotriazol. oznacza wysokosprawną chromatografię cieczową. oznacza peroksydazę chrzanową. oznacza aminoglikozydowy antybiotyk wytwarzany przez Streptomyces hygroscopicus.
ICAM Immunoglobuliny oznacza międzykomórkową cząsteczkę adhezyjną. oznaczają IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, w tym również Fab, Ffab^ i inne fragmenty.
LC Luciferase™ oznacza chromatografię cieczową. oznacza enzym uzyskany z genu luciferazy świetlika, dostępny z Promega, Madison WI, USA.
Luciferin™ MB+ NHS-LC-biotyna NMP „Przez noc” PAMAM PBS oznacza substrat do pomiaru aktywności enzymatycznej Luciferase™. oznacza kationową postać barwnika, błękitu metylenowego. oznacza standardowy odstępnik z łącznikiem stosowanym z biotyną. oznacza N-metylopirolidynon. oznacza od około 9 do 18 godzin. oznacza poliamidoaminę. oznacza roztwór soli buforowany fosforanem (dostępny z Sigma Chemical), zawierający 120 mM NaCl, 2,7mM KC1 i 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4.
PEI P. PTFE RSV-p-gal-NEO oznacza polietylenoiminę. oznacza nieorganiczny fosforan (stosowany jako bufor). oznacza politetrafluoroetylen. oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko β-galaktozydazę z genu lacZ i białko fosfotransferazę aminoglikozydową z genu ΑΡΗ (NEO) pod kontrolą promotora RSV.
RSV-lac oznacza plazmid ekspresji wytwarzający białko β-galaktozydazę z genu lacZ pod kontrolą promotora RS V.
RSV-luc oznacza plazmid reportera wy wytwarzający w wyniku ekspresji gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora RSV.
SDS Żywica SP-Sephadex™ C-25 oznacza decylosulfonian sodowy. stanowi żywica kationowymienna zawierająca grupy funkcyjne kwasu sulfonowego, dostępna z Pharmacia, Inc.
TREN THF TLC TMB Tris-glicyna TRIS Triton X-100 oznacza tris (2-aminoetylo)aminę. oznacza tetrahydrofuran. oznacza chromatografię cienkowarstwową. oznacza 3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydynę. oznacza N-[2-hydroksy-l,l-bis(hydroksymetylo)etylo]glicerynę. oznacza bufor tris-aminowy, np. tris(hydroksymetylo)aminometan. oznacza oktoksynol-9 czyli etoksylowany alkilofenol odpowiadający ogólnemu wzorowi CgH]7C6H4(OCH2CH2)nOH, w którym n wynosi średnio 9, środek powierzchniowo czynny dostępny z Rohm and Haas.
X-gal oznacza 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-P-D-galaktozyd.
182 237
Ogólna część doświadczalna
Widma masowe otrzymywano w spektrometrze masowym Finnigan TSQ (układ Q*MS) lub w spektrometrze masowym wysokiej rozdzielczości VG ZAB-MS (bombardowanie szybkimi atomami ksenonu, z zastosowaniem mieszanki 3:1 ditiotreitokditioerytrytol).
Widma *H i l3C NMR wykonywano w spektrometrach Varian VXR-300, Bruker APC 300, IBM/Bruker NR-80 lub Jeol FX400. Wszystkie widma wykonywano w 30°C, o ile nie zaznaczono inaczej. Widma Ή NMR wykonywano w podanych urządzeniach odpowiednio przy 300 MHz, 80 MHz lub 400 MHz; widma13C NMR wykonywano w podanych urządzeniach odpowiednio przy 75 MHz, 20 MHz lub 100 MHz. Wielkości NMR stanowią wielkości δ względem TMS (tetrametylosilanu), albo, w przypadku stosowania D2O, względem DSS (soli sodowej kwasu 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonowego).
Widma w podczerwieni (IR) rejestrowano w aparacie Nicolet 5SX FT/IR.
W analizach chromatograficznych większość rozpuszczalników stanowiły materiały Fisher do HPLC. Octan amonowy uzyskano z Aldrich. Wodę oczyszczano stosując układ filtracji wody Bamstead NANOpure™. Preparatywną chromatografię związków organicznych wykonywano przeprowadzając zwykłą chromatografię grawitacyjną z wykorzystaniem standardowych technik lub chromatografię rzutową w sposób opisany przez C.W. Stilla i innych, J. Org. Chem. 43, 2923-24 (1978).
TLC oraz wielkości Rf dotyczą podanych układów rozpuszczalników oraz dostępnych w handlu płytek do TLC z krzemionką [GHLF 250 μ, Analtech Inc. lub Merck Kieselgel 60F25$]. Preparatywną chromatografię kolumnową wykonywano na żelu krzemionkowym Merck 60,60 A.
Wszystkie procenty są wagowe, o ile nie zaznaczono tego inaczej.
pH-stat stanowi urządzenie mechaniczne, które mierzy i nastawia pH roztworu do ustalonej, pożądanej wielkości, poprzez dodanie odpowiedniej ilości wybranego kwasu i/lub zasady.
Pewne substancje stałe suszono w wyparce rotacyjnej (Buchi 461) i/lub w suszarce próżniowej w temperaturze około 55-60°C przez kilka godzin. Do usuwania rozpuszczalników wykorzystywano również automatyczną suszarkę sublimacyjną Virtis model 10-010 lub koncentrator SpeedVac™.
Stosowano następujące kolumny HPLC: ręcznie napełniana Q-Sepharose™ (Pharmacia), 1,5 x 25 cm lub 2,5 x 25 cm; Zorbax™ BIO Series GF-250 (9,4 mm x 25 cm) z DuPont Instruments; Vydac™ (znak towarowy Separations Group, Hesperia, CA) z białkiem C-4 (4,6 mm x 25 cm), z Separations Group (Hesperia, CA); Mono-Q™ i SP-Sephadex™ (znak towarowy Pharmacia Biotechnology Producs) z Pharmacia; Sep-Pak™ (znak towarowy Waters Associates), wkład C-18 dostępny z Waters Associates (Milford, MA); Sephadex™ G-25, kolumny jednorazowego użytku (2,2 ml) z Isolab Inc. (Akron, OH); Centricon™-30 (znak towarowy Amicon Division, W.R. Grace & Co., Danvers, MA), mikrokoncentratory z Amicon; oraz Spherisorb™ ODS-1 (znak towarowy Phase Separations, Ltd.).
Do wirowania i zatężania stosowano Sorvall RT 6000B (chłodzona wirówka z DuPont). Do usuwania lotnych rozpuszczalników stosowano koncentrator Speed Vac™ (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.).
Przykład A. Wytwarzanie2-karboksyamido-3-(4'-nitrofenylo)propanamidu p-nitrobenzylomalonian (2,4 g, 8,13 mmola) rozpuszczono w 35 ml metanolu. Roztwór ogrzano do 50-55°C z mieszaniem i przez roztwór barbotowano strumień suchego amoniaku w ciągu 64 godzin. Roztwór schłodzono i biały, kłaczkowaty produkt odsączono a następnie krystalizowano z 225 ml wrzącego metanolu otrzymując 1,85 g (7,80 mmola) bis-amidu z wydajnością 96% [temperatura topnienia 235,6°C (rozkład)]. Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia *H i 13C NMR.
Analiza: wyliczono dla C10HnO4N3:
Teoretycznie 50,63 4,69 stwierdzono 50,75 4,81
N 17,72 17,94
182 237
Przykład B: Wytwarzanie l-amino-2-(aminometylo)-3-(4'-nitrofenylo)propanu 2-karboksyamido-3-(4'-nitrofenylo)propanamid (2,0 g, 8,43 mmola) zawieszono w 35 ml suchego THF w atmosferze azotu, z mieszaniem. Do mieszaniny dodano ze strzykawki kompleks borowodoru z THF (106 ml, 106 mmoli). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 48 godzin; w tym czasie zawieszony amid rozpuścił się. Roztwór schłodzono i THF usunięto pod zmniej szonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Pozostałość zawierającą surowy produkt i borowodór rozpuszczono w 50 ml etanolu i roztwór przedmuchano bezwodnym gazowym chlorowodorem. Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy chlorowodorek rozpuszczono w 15 ml dejonizowanej wody i wyekstrahowano dwoma porcjami po 50 ml chlorku metylenu. Warstwę wodną schłodzono w łaźni z lodem w atmosferze argonu i powoli dodano 50% wodorotlenek sodowy do alkalicznego pH, 11,7. Zasadową warstwę wodną wyekstrahowano 4 porcjami po 25 ml chlorku metylenu i połączone ekstrakty odparowano w wyparce rotacyjnej uzyskując 1,45 g oleju o barwie bursztynowej. Olej ten ucierano z eterem dietylowym (50 ml) i przesączono pod ciśnieniem przez krótką kolumnę na żelu krzemionkowym (typ 62, Aldrich). Kolumnę przemyto 100 ml eteru i połączone przesącze odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 1,05 g (5,02 mmola) tytułowej diaminy w postaci klarownego oleju [bischlorowodorek - temperatura topnienia = 275-278°C (rozkład)].
Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia ’H i 13C NMR.
Analiza: wyliczono dla C10H17N3O2Cl2:
C ΗN teoretycznie 42,57 6,0714,89 stwierdzono 43,00 6,1415,31
Przykład C: Wytwarzanie I-amino-2-(aminometylo)-3-(4'-aminofenylo)propanu
Roztwór borowodór/THF (70 ml, 70 mmoli) dodano z mieszaniem, w atmosferze azotu przez cewnik z igłą do kolby zawierającej 4-aminobenzylomalonamid (1,5 g, 7,24 mmola). Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicązwrotnąprzez 40 godzin. Bezbarwny roztwór schłodzono i nadmiar THF usunięto w wyparce rotacyjnej otrzymując klarowny galaretowaty olej. Do oleju ostrożnie dodano metanol (50 ml), z zauważalnym wydzielaniem się gazu. Przez zawiesinę barbotowano suchy chlorowodór, co spowodowało rozpuszczenie, po czym roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 minutę. Roztwór metanol/HCl usunięto w wyparce rotacyjnej, a pozostałość w postaci chlorowodorku poddano ponownie obróbce w cyklu obejmującym rozpuszczanie/ogrzewanie we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną. Otrzymany chlorowodorek rozpuszczono w 10 ml wody i schłodzono w łaźni z lodem w atmosferze argonu. Do mieszanego roztworu powoli dodano stężony (50%) wodorotlenek sodowy do pH 11.Warstwę wodną wyekstrahowano 2 porcjami po 100 ml chloroformu, po czym warstwy organiczne połączono i przesączono przez krótki wkład z żelu krzemionkowego bez suszenia. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem (w wyparce rotacyjnej) uzyskując tytułowy związek (0,90 g, 5,02 mmola), z 70% wydajnością (Rf = 0,65; CHCl3/MeOH/stężony NH4OH 2/2/1). Strukturę potwierdziła MS oraz spektroskopia Ή i 13C NMR. Związek zastosowano bez dalszego oczyszczania.
PrzykładD: Wytwarzanie 6-(4-aminobenzylo)-l ,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu 4-aminobenzylomalonian dietylu (2,03 g, 8,43 mmola) rozpuszczono w 10 ml metanolu. Roztwór ten wkroplono do mieszanego roztworu świeżo destylowanej etylenodiaminy (6,00 g, 103,4 mmola) w 10 ml metanolu, w atmosferze azotu, w ciągu 2 godzin. Klarowny roztwór mieszano przez 4 dni, gdy analiza TLC wykazała całkowitą konwersję diestru (Rf = 0,91) do bisami du (Rf = 0,42 - 20% stężony NH4OH/80% etanolu). Uzyskany materiał był silnie dodatni w próbie ninhydrynowej. Metanol i nadmiar diaminy usunięto w wyparce rotacyjnej, po czym uzyskaną białą substancję stałą suszono pod zmniejszonym ciśnieniem (10'1 mm, 50°C) przez noc otrzymując surowy produkt (2,45 g, 8,36 mmola) z wydajnością 99%. Próbkę analityczną rekrystalizowano z mieszaniny chloroform/heksan - temperatura topnienia 160-161°C. Widmo masowe, Ή i l3C NMR odpowiadały strukturze tytułowego związku.
182 237
Przykład E: Reakcjamesylo-azyrydynyz l-amino-2-(aminometylo)-3-(4-nitrofenylo)propanem l-amino-2-(aminometylo)-3-(4-nitrofenylo)propan (400 mg, 1,91 mmola, czystość 96%) rozpuszczono w 10,5 ml absolutnego etanolu w atmosferze azotu. Do mieszanego roztworu diaminy dodano stałą mesy lo-azyrydynę (950 mg, 7,85 mmola). Reakcję prowadzono w 25°C przez 14 godzin stosując mieszadło magnetyczne; w tym czasie na ściankach kolby wytrąciła się biała, żywicowata pozostałość. Etanol zdekantowano, a pozostałość ucierano z kolejną porcją 15 ml etanolu w celu usunięcia nieprzereagowanej azyrydyny. Żywicowaty produkt wysuszono pod zmniej szonym ciśnieniem (10* mm, 25°C) otrzymując tetrakismetylosulfonamid (1,0 g, 1,44 mmola) z wydajnością75% (Rf = 0,74, NH4OH/etanol 20/80). Budowę tytułowego związku potwierdziła spektroskopia ’H i 13C NMR.
PrzykładF: Wytwarzanie 2-(4-nitrobenzylo)-1,3-(bis-N,N-2-aminoetylo)diaminopropanu
Surowy metylosulfonamid z przykładu E (650 mg, 0,94 mmola) rozpuszczono w 5 ml przedmuchanego azotem, stężonego (98%) kwasu siarkowego. Roztwór ten utrzymywano w atmosferze azotu i ogrzewano w 143-146°C przez 27 minut z intensywnym mieszaniem. Zaobserwowano nieznacznie ciemnienie, po czym roztwór schłodzono i wylano do mieszanego roztworu eteru (60 ml). Wytrącony biały placek soli odsączono i natychmiast rozpuszczono w 10 ml dejonizowanej wody. pH roztworu doprowadzono do 11 za pomocą 50% NaOH, w atmosferze argonu, z chłodzeniem. Uzyskany roztwór wymieszano z 90 ml etanolu i wytrąconą nieorganiczną sól odsączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując surową aminę w postaci jasno brunatnego oleju, do którego dodano 190 ml toluenu w atmosferze azotu. Mieszaninę reakcyjną intensywnie mieszano usuwając wodę przez destylację azeotropową(z nasadkąDeaba-Starka) aż roztwór toluenowy przybrał jasno żółtą barwę (w kolbie pozostało 30-40 ml roztworu). Mieszaninę schłodzono i toluen zdekantowano znad ciemnej , trudnej do obróbki pozostałości i soli. Z roztworu odpędzono rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymany jasno żółty olej wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem (0,2 mm, 35°C) przez noc otrzymując 210 mg tytułowego produktu (60%), który scharakteryzowano na podstawie spektroskopii masowej, *H i l3C NMR.
Przykład G: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) generacji 0,5 przedstawia następujący schemat:
Η N
-CH2CH (CNHCH2CH2NH2) 2 h2c=chcoch3
CH3OH
Związek nr 1 ΗΛ'Μ u-CH2CH (CNHCH2CH2N(CH2CH2COCH3) 2) 2
Związek nr 2
Akrylan metylu (2,09 g, 24 mmole) rozpuszczono w metanolu (15 ml). Związek nr 1 czyli 6-(4-aminobenzylo-l,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioksoundekan (1,1 g, 3,8 mmola) (otrzymywanie związku opisano w przykładzie D) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i roztwór dodano powoli, w ciągu 2 godzin, do intensywnie mieszanego roztworu akrylanu metylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 godzin w temperaturze otoczenia. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej utrzymując temperaturę poniżej 40°C. Ester (związek nr 2) otrzymano w postaci żółtego oleju (2,6 g). Nie zaobserwowano karboksylowania grupy anilinowej.
182 237
Przykład H: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) pierwszej generacji przedstawia następujący schemat:
h2nch2ch2nh2
Związek nr 2 + 1
CH3OH
Związek nr 3
Ester (związek nr 2) (2,6 g, 3,7 mmol) rozpuszczono w metanolu (100 ml). Uzyskany roztwór ostrożnie dodano do intensywnie mieszanego roztworu etylenodiaminy (250 g, 4,18 mola) w metanolu, z taką szybkością, aby temperatura nie wzrosła powyżej 40°C. Po zakończeniu dodawania estru mieszaninę reakcyjną mieszano przez 28 godzin w 35-40°C (płaszcz grzejny). Po 28 godzinach nie można było wykryć grup estrowych metodą spektroskopii IR. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce rotacyjnej w 60°C. Nadmiar etylenodiaminy usunięto wykorzystując potrójny azeotrop toluen-metanol-etylenodiamina. Na koniec cały pozostały toluen usunięto stosując azeotropowanie z metanolem. Po usunięciu całości metanolu otrzymano 3,01 g tytułowego produktu (związku nr 3) w postaci pomarańczowej szklistej substancji stałej.
Przykład I: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) genneracji 1,5 przedstawia ustępujący schemat:
Związek nr 3
O
II h2c=chcoch3 ch3oh
Η N 2
o o o II u u
CH2CH (CNHCH2CH2N(CH2CH2CNHCH2CH2N(CH2CH2COCH3) 2) 2)
Związek nr 4
Aminę (związek nr 3) (2,7 g, 3,6 mmola) rozpuszczono w metanolu (7 ml) i powoli dodano w ciągu 1 godziny do mieszanego roztworu akrylanu metylu (3,8 g, 44 mmole) w metanolu (15 ml) w temepraturze otoczenia. W czasie wkraplania zaobserwowano nieznaczne rozgrzewanie się roztworu. Roztwór mieszano w temepraturze otoczenia przez 16 godzin. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej w 40°C. Po usunięciu całości rozpuszczalnika i nadmiaru akrylanu metylu uzyskano ester (związek nr 4) z wydajnością 4,7 g, w postaci pomarańczowego oleju.
182 237
Przykład J: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) gen neracji 0,5 przedstawia następujący schemat:
Η N
ch2ch (CH2NH2) h2c=chcoch3 ch3oh
Związek nr 5
Związek nr 6
Triaminę (związek nr 5, którego wytwarzanie opisano w przykładzie C) (0,42 g, 2,3 mmola) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i wkroplono w ciągu 1 godziny do akrylanu metylu (1,98 g, 23 mmole) w metanolu (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temepraturze otoczenia przez 48 godzin. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej utrzymując temperaturę nie przekraczającą 40°C. Nadmiar akrylanu metylu usunięto na drodze powtarzanej destylacji azeotropowej z metanolem. Tytułowy ester (związek nr 6) wydzielono w postaci pomarańczowego oleju (1,24 g).
Przykład K: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) genneracji pierwszej przedstawia następujący schemat:
H2NCH2CH2NH2
Związek nr 6 ch3oh
Związek nr 7
Ester (związek nr 6) (1,24 g, 2,3 mmola) rozpuszczono w metanolu (50 ml) i wkroplono w ciągu 2 godzin do intensywnie mieszanej etylenodiaminy (73,4 g, 1,22 mola) w metanolu (100 ml). Zaobserwowano nieznaczną reakcję egzotermiczną. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 72 godziny. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej w 60°C. Nadmiar etylenodiaminy usunięto wykorzystując potrójny azeotrop toluen-metanol-etylenodiamina. Na koniec cały pozostały toluen usunięto z metanolem, i umieszczono pod pompą próżniową na 48 godzin, uzyskując tytułową aminę (związek nr 7) (1,86 g) w postaci żółto/pomarańczowego oleju.
Przykład L: Wytwarzanie polimeru Starburst™ (zawierającego pochodną aniliny) genneracji 1,5 przedstawia następujący schemat:
h2c=chcoch3
Związek nr 7 +
CH3OH
O
O
Związek nr 8
182 237
Aminę (związek nr 7) (1,45 g, ze śladową pozostałością metanolu) rozpuszczono w metanolu (100 ml) i powoli dodano w ciągu 1,5 godziny do mieszanego roztworu akrylanu metylu (5,80 g) w metanolu (20 ml). Roztwor mieszano przez 24 godziny w temepraturze pokojowej. Po usunięciu rozpuszczalnika, a następnie powtarzanej destylacji azeotropowej z metanolem usunięto całość nadmiaru akrylanu metylu. Po suszeniu pod pompą próżniową przez 48 godzin otrzymano tytułowy ester (związek nr 8) w postaci pomarańczowego oleju (2,50 g, 1,8 mmola).
Przykład M: Hydroliza dendrymeru (G4,5) i wytwarzanie soli wapniowej
PAMAM generacji 4,5 (z końcowymi grupami estrowymi, inicjowanieNH3) (2,11 g, 10,92 milirównoważnika) rozpuszczono w 25 ml metanolu i do roztworu dodano 10% NaOH (4,37 ml,
10,92 milirównoważnika) (pH 11,5-12). Po 24 godzinach w temepraturze pokojowej pH doszło do około 9,5. Po kolejnych 20 godzinach rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, dodano ml toluenu i mieszaninę odparowano ponownie.
Uzyskany olej rozpuszczono w 25 ml metanolu i wytrącono w postaci białej żywicy przez dodanie 75ml eteru dietylowego. Ciecz zdekantowano, a żywicę osuszono w wyparce rotacyjnej otrzymując bardzo drobny biały proszek, z którego w wyniku dalszego suszenia uzyskano 2,16 g produktu (98% wydajności). Metodami NMR i IR nie stwierdzono obecności grup estrowych.
Sól sodową PAMAM generacji 4,5 (z końcowymi grupami estrowymi, inicjowanie NH3) przekształcono w sól wapniową przeprowadzając dializę. Sól sodową (1,03 g) rozpuszczono w 100 ml wody i przepuszczono przez rurę do dializy z pustymi włóknami (odcinanie 5000) z szybkością3 ml/minutę. Rura zanurzona była w kąpieli z 5% roztworu CaCl2. Procedurę powtórzono.
Uzyskany roztwór poddano ponownie dializie, tym razem względem wody, powtarzając to jeszcze dwukrotnie.
Po odparowaniu otrzymano 0,6 g wilgotnej substancji stałej, którą wymieszano ż metanolem (nie wszystko rozpuściło się) i wysuszono uzyskując 0,45 g tytułowego produktu w postaci białawych kryształów.
C369H592O14IN91Ca24· ciężar cząsteczkowy = 9526,3 C ΗN teoretycznie 46,5 6,3213,38 stwierdzono 47,34 7,0013,55
Ca 10,10 8,83
Przykład N: Wytwarzanie dendrymerów z końcowymi grupami karboksylanowymi Poliamidoaminy Starburst™ generacji połówkowej hydrolizowano w celu przekształcenia końcowych grup w postaci estru metylowego w karboksylany. Uzyskano sferoidalne cząsteczki z ujemnymi ładunkami na obrzeżu. Hydrolizowano dendrymery od generacji 0,5 (3 grupy karboksylanowe) do generacji 6,5 (192 karboksylany).
Przykład O: N-tert-butoksykarbonylo-4-aminobenzylomaloniandimetylu
4-aminobenzylomalonian dimetylu (11,62 g, 49 mmoli) rozpuszczono z mieszaniem w 100 ml mieszaniny tert-butanol/woda (60:40 objętościowo). Dodano di-tert-butoksydiwęglan (19,79 g, 90 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Butanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółtą zawiesinę produktu w wodzie. Po ekstrakcji chlorkiem metylenu, wysuszeniu (MgSO4) i odparowaniu uzyskano żółty olej (21,05 g, zanieczyszczony di-tert-butoksydiwęglanem). Po rekrystalizacji z mieszaniny 2-propanol/woda (75:25) otrzymano blado żółte kryształy (11,1 g, 3 3 mmole, 67% wydajności) tytułowego produktu. Budowę potwierdziła spektroskopia ,3C NMR, a czystość określono metodąHPLC (Spherisorb™ ODS-1,0,05M H3PO4, pH 3 :CH3CN 55:45). Materiał ten zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład P: N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,1 l-tetraaza-5,7-dioksoundekan
N-tert-butoksykarbonylo-4-aminobenzylomalonian dimetylu (8,82 g, 26 mmoli) otrzymany w przykładzie O rozpuszczono w 50 ml metanolu. Roztwór ten wkroplono w ciągu 2 godzin do roztworu świeżo przedestylowanej etylenodiaminy (188 g, 3,13 mola) i 20 ml metanolu, w atmosferze azotu. Roztwór mieszano przez 24 godziny. Roztwór etylenodiamina/metanol usunięto w wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszczono w metanolu i dodano toluen. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej otrzymując surowy produkt w postaci białej substancji stałej
182 237 (10,70 g, zanieczyszczony etylenodiaminą). Próbkę do oczyszczania podzielono na dwie części. Przy azeotropowym usuwaniu etylenodiaminy z toluenem w ekstrakatorze Soxhleta z perełkami sulfonowanego jonitu w gilzie w celu wychwycenia etylenodiaminy nastąpił częściowy rozkład produktu, tak że uzyskano brunatny olej. Resztę produktu wydzielono w postaci białej substancji stałej przy chłodzeniu roztworu w toluenie (2,3 g, około 50%). Analiza 10% roztworu w metanolu metodą GC (kolumna Tenax 60/80) nie wykazała wykrywalnych śladów etylenodiaminy w próbce (<0,1 %). Drugą część rozpuszczono w metanolu uzyskując 10% (wagowo) roztwór, który oczyszczano od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy z zastosowaniem metanolu jako rozpuszczalnika (membrana Fihntec™ FT-30 oraz cienki kanałowy separator Amicon™ TC IR; EDA przechodzi przez membranę). Produkt wydzielono w postaci białej substancji stałej (2,7 g), w której metodą GC nie wykryto śladów etylenodiaminy. Wyniki analizy ,3C NMR i HPLC (Spherisorb™ ODS-1, 0,05M H3PO4, pH 3:CH3CN 55:45) potwierdziły zaproponowaną strukturę. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład Q: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ generacji 0,5 (GO,5) z N-tertbutoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-l,4,8,ll-tetraaza-5,7-dioksoundekan (5,0 g, 13 mmoli) otrzymany w przykładzie P rozpuszczono w 100 ml metanolu. Dodano akrylan metylu (6,12 g, 68 mmoli) i roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 72 godziny. Reakcję śledzono metodą HPLC (Spherisorb™ ODS1, acetonitryl: 0,04M octan amonu 40 : 60), aby zoptymalizować konwersję do pożądanego produktu. Roztwór zatężono do zawartości części stałych 30% i dodano akrylan metylu (3,0 g, 32 ramole). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia, aż metodą HPLC nie można było wykryć częściowo alkilowanych produktów (24 godziny). Po usunięciu rozpuszczalnika w 30°C w wyparce rotacyjnej i suszeniu pod pompąprzy 1 mm Hg przez 24 godziny otrzymano produkt w postaci lepkiego żółtego oleju, wydajność 7,81 g. Dane 13C NMR były zgodne z zaproponowaną strukturą. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład R: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ pierwszej pełnej generacji (Gl, 0) z N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt generacji 0,5 (przykład Q) (7,70 g, 10,45 ramola) rozpuszczono w 75 ml metanolu i wkroplono w ciągu 2 godzin do mieszanego roztworu etylenodiaminy (400 ml, 7,41 mola) w metanolu (50 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 48 godzin. Etylenodiaminę i metanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółty olej (11,8 g, zanieczyszczony etylenodiaminą). Produkt rozpuszczono w 90 ml metanolu i oczyszczono od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy (membrana Filmtec™ FT-30 oraz cienki kanałowy separator Amicon™ TC1R, metanol jako rozpuszczalnik). Po 48 godzinach metodą GC (kolumna Tenax™ 60/80) nie można było wykryć etylenodiaminy. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej, a następnie suszenia pod pompą na linii próżniowej przez 24 godziny otrzymano produkt w postaci żółtej, szklistej substancji stałej (6,72 g). Analiza metodą HPLC, kolumna PLRP-S, acetonitryl: 0,015M NaOH, 10-20% gradient w ciągu 20 minut) i 13C NMR potwierdziły zaproponowaną strukturę.
Przykład S: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ generacji 1 i 1,5 (G 1,5) z N-tertbutoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt pierwszej generacji (przykład R) (2,14 g, 25 mmoli) rozpuszczono w 12,5 ml metanolu i dodano akrylan metylu (3,5 g, 39 mmoli) w 5 ml metanolu. Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 48 godzin śledząc postęp reakcji metodą HPLC (Spherisorb™ OD SI, acetonitryl: 0,04M octan amonu 40 : 60). Dodano drugą porcję akrylanu metylu (3,5 g, 39 mmoli) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez kolejne 72 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej otrzymano tytułowy produkt w postaci żółtego oleju (3,9 g) po suszeniu przez noc pod pompą próżniową. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
182 237
Przykład T: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ pełnej drugiej generacji (G2,0) z N-tert-butoksykarbonylo-6-(4-aminobenzylo)-1,4,8,11 -tetraaza-5,7-dioksoundekanu
Produkt generacji 1,5 (przykład S) (3,9 g, 2,5 mmola) rozpuszczono w 50 ml metanolu i wkroplono w ciągu 2 godzin do mieszanego roztworu etylenodiaminy (600 g, 10 moli) i metanolu (50 ml). Roztwór mieszano w temperaturze otoczenia w atmosferze azotu przez 96 godzin. Etylenodiaminę i metanol usunięto w wyparce rotacyjnej uzyskując żółtą, szklistą substancję stałą (4,4 g, zanieczyszczona etylenodiaminą). Przygotowano 10% roztwór produktu w metanolu i oczyszczono od etylenodiaminy metodą odwrotnej osmozy (membrana Filmtec™ FT-30 oraz cienki kanałowy separator Amicon™TC 1R), aż metodą GC (kolumna Tenax™ 60/80) nie można było wykryć etylenodiaminy. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano produkt w postaci żółtej, szklistej substancji stałej (3,52 g). 13C NMR i HPLC, kolumna PLRP-S, acetonitryl : 0,015M NaOH, 10-20% gradient w ciągu 20 minut) potwierdziły zaproponowaną strukturę.
Przykład U: Reakcja polimeru Starburst™ drugiej generacji (G2,0) z kwasem bromooctowym prowadząca do dendrymeru Starburst™ z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi
Produkt drugiej generacji (przykład T) (0,22 g, 0,13 mmola) rozpuszczono w 15 ml wody dejonizowanej i temperaturę doprowadzono do 40,5°C. Kwas bromooctowy (0,48 g, 3,5 mmola) i wodorotlenek litu (0,13 g, 3,3 mmola) rozpuszczono w 5 ml dejonizowanej wody, po czym roztwór dodano do mieszaniny reakcyjnej. pH mieszaniny utrzymywano dokładnie na poziomie 9,0 stosując pH - stat (miareczkowanie 0, IN NaOH), w 40,5°C, przez noc. Reakcje śledzono metodą HPLC (Spherisorb™, kolumna ODS-l,eluowanie0,25MH3PO4,pH 3 [NaOH]: CH3CN 85:15), która potwierdziła, że w syntezie uzyskuje się przewagę jednego składnika.
Przykład V: Wytwarzanie dendrymeru Starburst™ drugiej generacji (G2,0) z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi, funkcjonalizowanego grupami izotiocyjanianowymi ml 2,8 mM roztworu dendrymeru Starburst™ drugiej generacji z końcowymi grupami metylenokarboksylanowymi (przykład U) rozcieńczono 20 ml wody i pH doprowadzono do 0,5 stężonym solnym. Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej mieszaninę zanalizowano metodą HPLC, aby potwierdzić usunięcie grupy butoksykarbonylowej, po czym dodano 50% wodorotlenek sodowy doprowadzając pH do 7. Zastosowano pH-stat (miareczkowanie 0,lN NaOH), aby utrzymywać pH 7 i dodano 225 μΐ tiofosgenu. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej pH mieszaniny doprowadzono do 5 za pomocą IN HC1. Mieszaninę przemyto chloroformem (2 x 20 ml), po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Odzyskana pozostałość, 0,91 g, stanowi mieszaninę izotiocyjanianu i soli.
Przykład W: Wytwarzaniepolietylenoimino-metanosulfon-amiduStarburst™drugiej generacji (G2, 0)
Do roztworu 125 g N-metanosulfonyloazyrydyny w 50 ml etanolu dodano 25,0 g tris(2-aminoetylo)aminy. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano w razie potrzeby wodę, aby utrzymywać jednorodny roztwór. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując PEI-metanosulfonamid Starburst™ drugiej generacji w postaci żółtego szkliwa (161 g).
Przykład X: Rozszczepianie metanosulfonamidów prowadzące do polietylenoiminy Starburst™ drugiej generacji (G2,0)
Roztwór 5,0 g PEI-metanosulfonamidu Starburst™ drugiej generacji z przykładu w 20 ml 38% HC1 zatopiono w szklanej ampułce. Ampułkę ogrzewano w 160°Ć przez 16 godzin, po czym schłodzono w łaźni z lodem i otwarto. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w wodzie. Po doprowadzeniu pH do > 10 za pomocą 50% NaOH rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano toluen (150 ml) i mieszaninę ogrzewano we wrzeniu z nasadką Deana-Starka aż do usunięcia całej wody. Roztwór przesączono w celu usunięcia soli, po czym przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 1,9 g PEI Starburst™ drugiej generacji w postaci żółtego oleju.
182 237
Przykład Y: Wytwarzaniepolietylenoimino-metanosulfon-amiduStarburst™trzeciej generacji (G3,0)
Do roztworu 10,1 g PEI Starburst™ drugiej generacji z przykładu X w 100 ml etanolu dodano 36,6 g N-metanosulfonyloazyrydyny. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano w razie potrzeby wodę, aby utrzymać jednorodny roztwór. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując PEI-metanosulfonamid Starburst™ trzeciej generacji w postaci żółtego szkliwa (45,3 g).
Przykład Z: Rozszczepianie metanosulfonamidów prowadzące do polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3,0)
Grupy metanosulfonamidowe z PEI-metanosulfonamidu Starburst™ trzeciej generacji (5,0 g) z przykładu Y usunięto w taki sam sposób jak w przypadku materiału drugiej generacji w przykładzie X, otrzymując 2,3 g PEI Starburst™ trzeciej generacji w postaci żółtego oleju.
Przykład AA: Reakcjapolietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3,0) z (4-fluoro)nitrobenzenem
Polietylenoiminę Starburst™ trzeciej generacji (przykład Z) (1,06 g, 1,2 mmola) rozpuszczono 12 ml absolutnego etanolu. Dodano (4-fluoro)nitrobenzen (120 μΐ, 1,2 mmola) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez noc. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, po czymjasno żółty olej rozpuszczono w wodzie. Wodny roztwór przemyto chloroformem w celu usunięcia nieprzereagowanego (4-fluoro)nitrobenzenu. Po usunięciu wody otrzymano produkt w postaci ciemno żółtego oleju (0,80 g). Widmo 13C NMR odpowiadało strukturze tytułowego związku. (Nie przeprowadzono badań w celu określenia charakteru rozrzutu statystycznego). Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład BB:Reakcjanitrofenylowejpochodnejpolietylenoiminy Starburst™trzeciej generacji (G3,0) z glikolonitrylem.
Nitrofenylową pochodną polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (przykład AA) (0,80 g) rozpuszczono w 20 ml dejonizowanej wody. Do mieszanego roztworu dodano wodorotlenek sodowy (2,80 g, 50% wagowych) i roztwór przedmuchano azotem z odpowietrzeniem przez płuczkę z wodorotlenkiem sodowym. Dodano glikolonitryl (2,85 ml 70% wodnego roztworu) w temperaturze otoczenia. Po kilku minutach zaobserwowano wytrącenie się żółtego osadu. Po 2 godzinach temperaturę powoli podwyższono do wrzenia i mieszaninę reakcyjną ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny z przedmuchiwaniem azotem. Po usunięciu wody otrzymano produkt w postaci żółtej substancji stałej zanieczyszczonej kwasem glikolowym i wodorotlenkiem sodowym. Widmo 13C NMR odpowiadało strukturze tytułowego związku. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład CC: Uwodornienie pochodnej nitrofenylowej do polietylenoiminy Starburst™ trzeciej generacji (G3,0) zakończonej aminofenylo-metylenokarboksylanem
Żółtą substancję stałą z przykładu BB (1,70 g) rozpuszczono w 10 ml dejonizowanej wody uzyskując roztwór o pH około 11. Do mieszaniny reakcyjnej w szklanej kolbie wytrząsarki Parra dodano pallad na węglu drzewnym (200 mg 5% Pd/C). Mieszaninę reakcyjną umieszczono pod ciśnieniem wodoru 40 funtów/cal2 (275 kPa) i wytrząsano w temperaturze otoczenia w aparacie Parra do uwodorniania przez 6 godzin. Następnie mieszaninę przesączono przez filtr 0,5 pm Millipore™ w celu usunięcia Pd/C i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość przesączono przez żel stosując 25 g żywicy Biogel P2 spęcznionej wodą. Po zakwaszeniu HC1 otrzymano pomarańczowo-brunatny roztwór, który przedmuchiwano przez noc azotem. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano tytułowy produkt jako chlorowodorek w postaci blado brunatnej substancji stałej (3,98 g) zanieczyszczonej NaCl i kwasem glikolowym, maksymalna wydajność teoretyczna 1,15 g. Produkt zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład DD: Wytwarzaniepolietylenoiminy Starburst™trzeciej generacji (G3,0) zakończonej 4-izotiocyjaninanofenylometylenokarboksylanem
Produkt z przykładu CC (3,98 g) rozpuszczono w 15 ml dejonizowanej wody i porcję tego roztworu (2,5 ml) rozcieńczono 10 ml wody. pH roztworu doprowadzono do 7 wodorotlenkiem
182 237 sodowym. pH-stat (miareczkowanie 1N NaOH) zastosowano do utrzymywania pH i dodano 200 μΐ tiofosgenu. Po 10 minutach pH mieszaniny doprowadzono do 4 kwasem solnym. Wodę usunięto w wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem (dodając niewielką ilość n-butanolu, aby zapobiec pienieniu). Pozostałość przemyto chlorkiem metylenu i wysuszono. Surowy tytułowy produkt (0,95 g) w postaci mieszaniny izotiocyjanianu (0,14 g) i soli zastosowano bez dalszego oczyszczania.
Przykład EE: Wytwarzaniepoliamidoaminy Starburst™drugiej generacji(G2,0)(inicjowanej amoniakiem) zakończonej metylenokarboksylanem
Poliamidoaminę Starburst™ drugiej generacji (2,71 g, 2,6 mmola) i kwas bromooctowy (4,39 g, 31,6 mmola) rozpuszczono w 30 ml dejonizowanej wody i pH doprowadzono do 9,7 stosując 5N NaOH, z wykorzystaniem pH-statu. Mieszaninę utrzymywano przy tym pH przez 0,5 godziny, po czym temperaturę powoli podwyższono do 60°C i mieszaninę utrzymywano w 60°C przy stałym pH przez 3 godziny. pH podwyższono do 10,3 i mieszaninę reakcyjną utrzymywano pod kontroląpH-statu w temperaturze otoczenia przez noc. Następnie przed obróbką mieszaninę ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika i azeotropowym oddestylowaniu śladów wody z metanolem uzyskano tytułowy produtk w postaci blado żółtego proszku (8,7 g, zanieczyszczenie bromkiem sodowym). Widmo l3CNMR odpowiadało budowie tytułowego produktu (z pewnym zanieczyszczeniem spowodowanym niewielką ilością materiału zdefektowanego w wyniku nieznacznego monoalkilowania).
Przykład FF: Wytwarzaniepolietylenoiminy Starburst™dnigiej generacji(G2,0)(inicjowanej amoniakiem) zakończonej metylenokarboksylanem
Polietylenoiminę Starburst™ drugiej generacji (2,73 g, 6,7 mmola) z przykładu X i kwas bromooctowy (11,29 g, 81 mmoli) rozpuszczono w 30 ml dejonizowanej wody. pH powoli podwyższono do 9,5 utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Temperaturę powoli podwyższono do 55°C i pH 9,5 mieszaniny utrzymywano przez 6 godzin za pomocąpH-statu (miareczkowanie 5N NaOH). pH podwyższono do 10,2 i utrzymywano je przez noc. Po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej i azeotropowym oddestylowaniu śladów wody z metanolem uzyskano tytułowy produkt w postaci blado żółtego proszku (17,g, zanieczyszczenie bromkiem sodowym). Widmo I3C NMR było odpowiadało budowie tytułowego produktu (z pewnym zanieczyszczeniem spowodowanym niewielką ilością materiału zdefektowanego w wyniku nieznacznego monoalkilowania).
Przykład GG: Wytwarzanie3,5,4,5,5,5 i 6,5 generacji PAMAM Starburst™
Do 10% wagowo metanolowego roztworu 2,46 g trzeciej generacji PAMAM Starburst™ dodano 2,32 akrylanu metylu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 64 godziny. Po usunięciu rozpuszczalnika i nadmiaru akrylanu metylu uzyskano 4,82 g tytułowego produktu (G3,5) (105% wydajności teoretycznej)
Generacje 4,5,5,5 i 6,5 otrzymano w sposób opisany powyżej bez znaczących różnic w stężeniach reagentów, stosunkach molowych reagentów i czasach reakcji.
Przykład HH: Wytwarzanie4, 5 i 6generacjiPAMAM Starburst™
Do 2000 g wstępnie przedestylowanej etylenodiaminy dodano 5,4 g PAMAM Starburst™ generacji 4,5 w postaci 15% wagowo roztworu w metanolu. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na 48 godzin. Metanol i większość nadmiaru etylenodiaminy usunięto w wyparce rotacyjnej stosując pompkę wodnąw temperaturze poniżej 60°C. Całkowita waga odzyskanego produktu wyniosła 8,07 g. W tym stadium GC wykazała, że produkt zawiera w dalszym ciągu 34% etylenodiaminy. Porcję 55,94 g produktu rozpuszczono w 100 ml metanolu i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia resztek etylenodiaminy. Ultrafiltrację prowadzono stosując cienki kanałowy separator cyrkulacyjny Amicon™ TC IR wyposażony w membranę Amicon™ YM2. W linii zastosowano zawór bezpieczeństwa, aby utrzymać na membranie nadciśnienie 55 funtów/cal2 (380 kPa). 100 ml najpierw zatężono do 15 ml wymuszając przepływ płynu tylko przez membranę. Po wstępnym zatężeniu przepływ zmieniono i zastosowano układ z zawracaniem stałej objętości retentatu przez 19 godzin. Następnie 60 ml metanolu przepuszczano przez membranę, aby odzyskać produkt w dalszym ciągu znajdujący się w module i połączonym z
182 237 nim orurowaniu. Z produktu odpędzono rozpuszczalnik odzyskując 2,53 g PAMAM Starburst™ piątej generacji (G5,0). Analiza metodąGC wykazała, że produkt zawiera 0,3% resztkowej etylenodiaminy.
Generacje 4 i 6 wytwarza się w sposób opisany powyżej, z tym że zmienia się stosunek wagowy etylenodiaminy do materiału wyjściowego. Przy wytwarzaniu generacji 4 stosunek ten wynosił 200:1, a w przypadku generacji 6 730:1.
Przykład II. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych poprzez reakcję z epoksydem
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 5 ml metanolu dodano 0,56 g epoksyoktanu. Po 6 dniach w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 0,80 g bezbarwnego oleju. Materiał ten rozpuszczał się w chloroformie, toluenie i metanolu, ale nie rozpuszczał się w wodzie. Widmo ,3C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami C-8 alkilowymi przyłączonymi do końcowych amin.
Przykład JJ. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych przez reakcję z eterem tert-butyloglicydylowym
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 5 ml metanolu dodano 0,57 g eteru tert-butyloglicydylowego. Po 6 dniach w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 1,0 g bezbarwnego oleju. Materiał ten rozpuszczał się w chloroformie, toluenie i metanolu, ale nie rozpuszczał się w wodzie. Widmo 13C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami 3- (tert-butyloksy)-l-propan- 2-olowymi przyłączonymi do końcowych amin.
Przykład KK. Modyfikacja dendrymerów poliamidoaminowych przez reakcję z epoksyoktadekanem
Do roztworu 0,50 g PAMAM 6 generacji w 25 ml metanolu dodano 1,1 g epoksyoktadekanu. Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 5 dni. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 1,6 g białej pianki. Materiał ten rozpuszczał się w chloroformie i toluenie, ale nie rozpuszczał się w wodzie i metanolu. Widmo I3C-NMR odpowiadało dendrymerowi z grupami C-18 alkilowymi przyłączonymi do jego końcowych amin.
Przykład LL. Reakcja PEI Starburst™ z hydrofobowym epoksydem
Do kolby wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodano 0,397 g (2 χ 10-4 mola) (G4,9) PEI (rdzeń NH3, MW 1 955) i 2,1 g(9,6x 10'3mola) 10,11 - oksoundekanianu metylu (MW 214,3) w 5 ml metanolu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 dzień, po czym ogrzewano ją w 80°C przez 8 godzin otrzymując brunatny lepki syrop. Zajście do końca reakcji otwarcia pierścienia prowadzącej do hydrofobowego dendrymeru zakończonego grupami karbometoksylowymi potwierdziła analiza NMR i porównanie z układami modelowymi.
Powyższy hydrofobowy dendrymer przekształcono w rozpuszczalny w wodzie w wyniku prostego połączenia równoważnych ilości tego produktu i wodorotlenku sodowego w wodzie i ogrzewania przez 30-60 minut. Uzyskano jednorodny roztwór nie zawierający śladów grup karbometoksylowych. Dodatek nadmiaru NaOH lub NaCL powoduje, że roztwór soli, karboksylanu staje się mętny i następuje rozdział faz z wydzieleniem oleju.
Przykład MM. Modyfikacja dendrymerów PAMAM kwasem akrylowym.
2:1 akrylan:amina (Reakcja A)
3,84 g kwasu akrylowego wymieszano z 3,84 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
1:1 akrylan:amina (Reakcja B)
1,6 g kwasu akrylowego wymieszano z 1,6 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
182 237
0,5:1 akrylan:amina (Reakcja C)
0,8 g kwasu akrylowego wymieszano z 0,8 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przeragowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
0,25:1 akrylan:amina (Reakcja D)
0,40 g kwasu akrylowego wymieszano z 0,40 g metanolu i schłodzono w łaźni z lodem przez 10 minut. Następnie do mieszanego roztworu kwasu akrylowego dodano 18,72 g 26,7% (wagowo) roztworu G6 (NH3) PAMAM. Mieszaninę utrzymywano w 4°C przez 15 minut, przedmuchano azotem, zamknięto i pozostawiono do przereagowania na 5 dni w temperaturze pokojowej.
Ultrafiltracja i suszenie
Rozpuszczalnik z mieszanin reakcyjnych odpędzono w wyparce rotacyjnej i uzyskaną substancję stałąponownie rozpuszczono w około 150 ml wody. 150 ml roztworu poddano ultrafiltracji z wodąprzez płaską membranę YMC (odcinany MW 3000) aż do zebrania 4 litrów permeatu. Z retentatu odpędzono wodę w wyparce rotacyjnej aż do uzyskania pozostałości w postaci substancji stałej lub lepkiej cieczy. Półsuchą substancję stałą umieszczono na noc pod wysokąpróżnią w celu usunięcia resztek wody.
Wniosek
W reakcjach dendrymeru G6 (NH3) PAMAM z rdzeniem amoniakalnym z kwasem akrylowym w różnych stosunkach otrzymano oczekiwane produkty. Produkty wykazują rozkład ładunków odpowiadający ilości dodanego kwasu akrylowego. Przy dodaniu nadmiaru kwasu akrylowego uzyskuje się produkt zbliżony do otrzymanego w zwykłej syntezie karboksylanowych soli PAMAM połówkowej generacji. W miarę jak ilość dodawanego kwasu akrylowego zmniejsza się, analizowany materiał odpowiada’dodatnio naładowanemu dendrymerowi z pewną ilością ujemnie naładowanych grup powierzchniowych lub z amfoteryczną powierzchnią.
Przykład NN. Koniugaty dendrymerów typu gęstej gwiazdy z prowadnikami docelowymi jak biotyna, insulina i awidyna, zawierające ponadto przenoszony materiał (fluorosceiny)
Materiały
Otrzymano dendrymer G4 (NH3) PAMAM Starburst™ i dendrymer Starburst™ generacji 6,0. 5-izotiocyjanian fluoresceiny (izomer I) (FITC) otrzymano z Molecular Probes. Chlorek dansylu otrzymano z Aldrich Chemical Co. NHS-LC-biotynę i awidynę otrzymano z Pierce. Dichlorotriazynylofluoresceinę (I) i insulinę otrzymano z Sigma Chemical. Wszystkie reagenty stosowano bez dokładniejszego oczyszczania.
I. Sprzęganie koniugacji biotyna/dendrymer
A. Wytwarzanie koniugatów biotyna/dendrymer
Przygotowano bazowy roztwór dendrymeru G6 (NH3) PAMAM o stężeniu 1,8 mg/ml w 100 mM buforze fosforanowym o pH 7,0. Przygotowano również inny bazowy roztwór G6 (NH3) o stężeniu 1,9 mg/ml w wodzie. Z każdego z tych roztworów pobrano próbkę 1 ml i do każdego z roztworów dodano 5 mg stałej NHS-LC-biotyny. Fiolki intensywnie wytrząsano przez 5 minut w celu rozpuszczenia biotyny. Inkubowanie w temperaturze pokojowej prowadzono przez 18 godzin. Podobne reakcje przeprowadzono dla roztworów G4 (NH3) zarówno w buforze fosforanowym jak i w wodzie. Stężenie bazowych roztworów G4 (NH3) wynosiło 2,0 mg/ml; do 1 ml każdego z roztworów dodano po 5 ng NHS-LC-biotyny.
Wykonano inne koniugaty przy niższym stosunku ligandu do aminy. Tak np. w celu skoniugowania 20 cząsteczek biotyny z dendrymerem G7 (NH3) PAMAM porcję 844 μΐ 11,85% dendrymeru G7 dodano do 0,0244 g NHS-LC-biotyny w 5 ml buforu boranowego o pH 9. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną poddano dializie względem dejonizowanej wody w celu usunięcia nieprzereagowanej biotyny.
Elektroforeza
Po 18 godzinach pobrano po 100 μΐ każdej z mieszanin reakcyjnych, a także każdego z bazowych roztworów dendrymerów pełnych generacji do wykonania analizy metodą elektroforę
182 237 zy. Do każdego roztworu dodano 0,1 % MB+ z 50% sacharozą i próbki poddawano elektroforezie na 5-50% żelu gradientowym Hylinx™ T (otrzymanym z Gradipore). Jako bufor zastosowano 90 mM Iris, 80 mM kwas borowy i 2,5 mM EDTA, pH 8,3. Na żel wprowadzano po 10 μΐ każdej próbki. Elektroforezę wykonywano przez 30 minut przy 200 V (prąd stały). Oznaczenie ścieżek podano poniżej:
l.G7(NH3)
2. G6 w P„ (NH3)
3. G6 (NH3) z biotynąw P,
4. G4 w P„ (NH3)
5. G4 z biotynąw Pj, (NH3)
6. G6 w wodzie, (NH3)
7. G6 (NH3) z biotynąw wodzie
8. G4 w wodzie, (NH3)
9. G4 (NH3) z biotyną w wodzie
10. G4 (NH3)
H.CytC/G3,5 (NH3)
12. G5 (NH3)
Wyniki i dyskusja
Elektroforeza wyraźnie wykazała zahamowaną ruchliwość dendrymerów poddanych obróbce biotynąw porównaniu z drogą migracji niemodyfikowanych dendrymerów. Ciężar cząsteczkowy zwiększył się na skutek kowalencyjnego przyłączenia cząsteczek biotyny do powierzchni dendrymeru. Powoduje to skrócenie drogi migracji dendrymer na skutek przesiewającego działania GGE, który hamuje cząsteczki o wyższym ciężarze cząsteczkowym.
Liczba przyłączonych cząsteczek biotyny przypadających na dendrymer nie jest znana. Rozrzut cząsteczek biotyny na dendrymerze jest statystyczny, tak że z testu wynika, że próbki nie sąjednorodne.
Pewne reakcje przeprowadzono tak, aby teoretycznie wszystkie powierzchniowe grupy dendrymeru (Z na fig. 1; Z' na fig. 2) mogły ulec biotynylowaniu. W czasie takich reakcji nie zaobserwowano powstawania nierozpuszczalnego materiału.
B. Wytwarzanie koniugatów dendrymer-fluoresceina (FITC) ml 12,7% (wagowo) metanolowego roztworu dendrymeru PAMAM G4 rdzeń (NH3) wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Wydzielono około 40 mg (7,4 pmola) wysuszonego dendrymeru, który rozpuszczono w 5 ml 0, IM buforu fosforanowego o pH 9,0.
Izotiocyjanian fluorosceiny (FITC I) (14,5 mg, 37 pmoli) rozpuszczono w 2 ml DMSO w ciemności. Roztwór FITC I wkroplono do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1-2 minut. Mieszaninę reakcyjną chroniono przed dostępem światła i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15-20 godzin. Uzyskano roztwór o barwie kasztanowej.
Po wymieszaniu mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanego FITC I. W czasie ultrafiltracji trzykrotnie dodawano po 2 ml 0,lM buforu fosforanowego o pH 9,0. Koniugat dendrymeru czwartej generacji (rdzeń amoniakalny) z FITC I wydzielono z retentatu po ultrafiltracji.
C. Wytwarzanie biotynylowanych koniugatów dendrymer-FITC I
Z bazowego roztworu zawierającego 20 mg/ml koniugatu G4 (NH3) PAMAM Starburst™ z FITC I (otrzymanego w poprzedniej części) pobranego 1 ml i dodano do 3 ml 0,IM buforu fosforanowego o pH 9,0.
Do 0,5 ml DMSO dodano 10,0 mg (18 mmoli) NHS-LC-biotyny i mieszaninę wytrząsano w celu rozpuszczenia biotyny.
Roztwór NHS-LC-biotyny dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę usunięto z płytki do mieszania, przeniesiono do dwóch rurek mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nie
182 237 związanej biotyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie.
D. Wytwarzanie biotynylowanego kompleksu dendrymer G4-FITCI z awidyną
3,0 mg (45 rnmoli) awidyny rozpuszczono w 1 ml 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,1.
300 μΐ (10 mg/ml, 450 pmoli) biotynylowanego koniugatu dendrymer-FITC I (otrzymanego uprzednio) dodano do roztworu awidyny i całość łagodnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nadmiaru biotynylowanego dendrymeru. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,1, aby ułatwić oczyszczanie. Uzyskany kompleks biotyna-dendrymer/awidyna usunięto z rurek mikrokoncentratora i przechowywano w - 10°C. E. Wytwarzanie koniugatu dendrymer/dichlorotriazynylofluoresaceina (I)
Około 300 μΐ dendrymeru G6 (DEA) PAMAM Starburst™ (21,5% części stałych) dodano do 700 μΐ dejonizowanej wody i zdyspergowano (645, mg 2,24 pmola). Dodano jeszcze 4 ml dejonizowanej wody, aby rozcieńczyć dendrymer do stężenia 12,9 mg/ml.
Chlorowodorek dichlorotriazynylofluoresceiny (izomer I) [DTAF (I)] (6,0 mg, 11,3 pmola) rozpuszczono w ciemności w 0,5 ml metanolu i dodano dwie krople trietyloaminy. Roztwór DTAF (I) wkroplono do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 30 s. Mieszaninę reakcyjną chroniono przed dostępem światła i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15-20 godzin. Przez cały czas reakcji roztwór o barwie pomarańczowej był klarowny.
Po wymieszaniu mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanej DTAF (I). W czasie ultrafiltracji 15-krotnie dodawano po 2 ml 0,1M bufom fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie. Z oczyszczania odzyskano około 3 ml koniugatu G6 (rdzeń EDA) dendrymeru-DTAF (I).
F. Wytwarzanie multibiotynylowanych koniugatów dendrymer-DTAF (I)
Z bazowego roztworu zawierającego 20 mg/ml koniugatu G6 (EDA) PAMAM Starburst™ z DTAF (I) (otrzymanego w poprzedniej części) pobrano 0,425 ml (8,5 mg, 0,0003 mmola) i dodano do 0,575 ml 0,lM buforu fosforanowego o pH 9,0.
8,1 mg (0,029 mmola) NHS-LC-biotyny dodano do 0,3 ml DMSO i mieszaninę wytrząsano w celu rozpuszczenia biotyny. Roztwór NHS-LC-biotyny dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
Po 4 godzinach usunięto z płytki do mieszania, przeniesiono do dwóch rurek mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 10 000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia niezwiązanej biotyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,lM buforu fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie.
U. Sprzęganie koniugacyjne insuliny z dendrymerem
A. Wytwarzanie koniugatu dansylowanego dendrymeru ml 12,7% (wagowo) metanolowego roztworu dendrymeru PAMAM G4 (NH3) wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Wydzielono około 40 mg (7,4 pmola) wysuszonego dendrymeru, który rozpuszczono w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0.
mg (0,037 mmola) chlorku dansylu dodano do 5 ml acetonu i wytrząsano przez 5-10 minut. (Uzyskano roztwór o barwie ciemno żółtej ze śladami osadu).
Roztwór chlorku dansylu dodano do roztworu dendrymeru w ciągu 30 s, po czym kolbę reakcyjną umieszczono w łaźni wodnej w 40°C na 90 minut. W czasie ogrzewania mieszaninę wytrząsano od czasu do czasu. (Stwierdzono, że barwa roztworu zmieniła się z wyraźnie żółtej w blado żółtą).
Po 90 minutach kolbę reakcyjną wyjęto z łaźni i pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej. (Mieszanina reakcyjna była nieznacznie mętna). Znakowany dendrymer oczyszczano utrzymując go w roztworze. Mieszaninę umieszczono w wyparce rotacyjnej i aceton odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w 30-35°C. Spowodowało to zasadniczo wyklarowanie roztworu. Mieszaninę reakcyjną przeniesiono następnie do dwóch probówek wirówki i
182 237 wirowano z szybkością 5000 obrotów/minutę przez 30 minut. Po wirowaniu nie zaobserwowano dodatkowego osadu.
Roztwór dansylowanego dendrymeru czwartej generacji umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia niezwiązanego chlorku dansylu. Przebieg ultrafiltracji śledzono również metodą chromatografii cienkowarstwowej sprawdzając czystość, aby zapewnić całkowite usunięcie jakiegokolwiek nieprzereagowanego chlorku dansylu. Przesącz zachowywano i badano metodą TLC w sposób następujący: stosowano płytki z żelu krzemionkowego 60 (Merck) oraz 100% octan etylu jako układ rozpuszczalników (obrazowanie promieniami UV). Podczas gdy znakowany dendrymer pozostawał na starcie, resztkowy chlorek dansylu eluował się z Rf około 0,3. Odzyskano około 1-2 ml przewidywanego roztworu dansylowanego dendrymeru. B. Wytwarzanie koniugatu insuliny z dansylowanym dendrymerem
Do 0,5 ml dansylowanego dendrymeru (otrzymanego uprzednio) w fiolce dodano 1,5 ml dejonizowanej wody do uzyskania roztworu 10 mg/ml. Pobrano porcje 1 ml (10,0 mg, 0,0019 mmola) i zastosowano do sprzęgania insuliny.
W drugiej fiolce 12,3 mg (0,0020 mmola) insuliny (z trzustki bydlęcej) rozpuszczono w 2 ml dejonizowanej wody. Uzyskany roztwór był mętny, w związku z czym jego pH obniżono do 4 dodając 1 kroplę IN kwasu solnego w celu rozpuszczenia osadu.
W trzeciej fiolce 88,7 mg (0,46 mmola) EDAC rozpuszczono w 1 ml dejonizowanej wody.
Roztwór insuliny dodano do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1 -2 minut, co spowodowało natychmiastowe zmętnienie. pH doprowadzono z 7,0 do 4,0 IN kwasem solnym (Roztwór wyklarował się przy pH około 4,2). Kontynuując mieszanie dodano roztwór EDAC porcjami po 200-300 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 3,9-4,2 dodając IN kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc (15-20 godzin).
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji dejonizowaną wodą co powodowało wytrącanie się osadu, który następnie zawieszano dodając 1 kroplę IN kwasu solnego. Proces ten powtarzano 2-3 razy i koniugat dansylowanego dendrymeru z insuliną ponownie rozpuszczano. Z procesu ultrafiltracji otrzymano około 1 ml koniugatu dansylowanego dendrymeru z insuliną.
C. Wytwarzanie insuliny/dichlorotriazynylofluoresceiny
W fiolce rozpuszczono 9,3 mg (0,002 mmola) insuliny (z trzustki bydlęcej) w 2 ml 0,1 M roztworu buforu fosforanowego o pH 9,0. Chlorowodorek dichlorotriazynylofluoresceiny (izomer I) [DTAF (I)] (4,1 mg, 0,008 mmola) rozpuszczono w ciemności w 0,5 ml metanolu, po czym dodano 2 krople trietyloaminy.
Roztwór DTAF (I) wkroplono w ciągu 2 minut do mieszanego roztworu insuliny. Mieszaninę reakcyjną chroniono przed światłem i mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym umieszczono na noc w 2-8°C. (W czasie reakcji pomarańczowy roztwór pozostawał klarowny).
Następnego ranka mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 3000 daltonów) i poddano ultrafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanej DTAF (I). W czasie ultrafiltracji 10-krotnie dodawano po 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 9,0, aby ułatwić oczyszczanie. Z oczyszczania wydzielono około 2 ml insuliny-DTAF (I).
D. Wytwarzanie koniugatu insulina-DTAF (I) /dendrymer
Do fiolki dodano 1 ml (7,05 mg, 0,0014 mmola) dendrymeru G4 (NH3) i pH doprowadzono do 4,5 stosując IN kwas solny. Do mieszanego dendrymeru dodano 1 ml (10,1 mg, 0,0020 mmola) insuliny-DTAF (I) (otrzymanej uprzednio) i pH ponownie doprowadzono do 4,0 stosując IN kwas solny.
W drugiej fiolce 54,3 mg (0,28 mmola) EDAC rozpuszczono w 0,5 ml dejonizowanej wody.
Roztwór EDAC dodano do mieszaniny reakcyjnej w porcjach po 100 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 3,9-4,2 dodając IN
182 237 kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, po czym umieszczono na noc w 2-8°C.
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 5000 daltonów) i poddano ultrafiltracji dejonizowaną wodą utrzymując pH w zakresie 4-5 za pomocą IN kwasu solnego.
Proces ten powtórzono 2-3 razy; koniugat insulina-DTAF (I) /dendrymer wydzielono w postaci klarownej pomarańczowej cieczy.
III. Sprzęganie koniugacyjne dendrymeru z awidyną
A. Wytwarzanie koniugatów dendrymer/awidyna
W fiolce 120 μΐ dendrymeru G7 (EDA) (21,9%...) części stałych dodano do 0,8 ml dejonizowanej wody. Pobrano 0,5 ml rozcieńczonego dendrymeru i dodano do 4,5 ml dejonizowanej wody uzyskując roztwór o stężeniu 2,6 mg/ml.
W drugiej fiolce 3,0 mg (0,045 mmola) EDAC rozpuszczono w 0,5 ml wody dejonizowanej.
Roztwór awidyny dodano do mieszanego roztworu dendrymeru w ciągu 1-2 minut; mieszanina pozostała klarowna. pH doprowadzono następnie do 4,0 stosując IN kwas solny. Kontynuując mieszanie dodano roztwór EDAC porcjami po 100 μΐ co 10-15 minut (w ciągu 1 godziny). pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 4,5-5,5 stosując IN kwas solny. Po dodaniu całości EDAC mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez noc (10-15 godzin).
Mieszaninę reakcyjną umieszczono w dwóch rurkach mikrokoncentratora Centricon™ (odcinany ciężar cząsteczkowy: 100 000 daltonów) i poddano ultrafiltracji 10 mM buforem fosforanowym w celu usunięcia niezwiązanego dendrymeru lub awidyny. W czasie ultrafiltracji ośmiokrotnie dodawano po 2 ml 0,lM buforu fosforanowego o pH 7,1, aby ułatwić oczyszczanie.
Przykład OO. Ukierunkowywanie dendrymeró w typu gęstej gwiazdy solą sodową kwasu pirogronowego
0,5 g EDC wymieszano z 0,0065 g soli sodowej kwasu pirogronowego w 2 ml wody. pH roztworu doprowadzono do 5,0 (na podstawie papierka wskaźnikowego) i roztwór mieszano przez 5 minut. Następnie dodano 62 μΐ (20 mg) dendrymeru G6 (NH3) (32,45% części stałych) do mieszaniny reakcyjnej i roztwór wytrząsano przez 21 godzin. Oczyszczanie w celu uwolnienia roztworu od nadmiaru EDC przeprowadzono w koncentratorze Amicon™ Microcon-10. Wskaźnik rozcieńczania wynosił 57 χ 106. Zaobserwowano niewielki rezonans w widmie l3C NMR odpowiadający grupie metylowej pirogronianu skoniugowanego z dendrymerem G6; dla koniugatu zaobserwowano także unikatowy pik w elektroforezie kapilarnej.
Przy wytwarzaniu koniugatów wykorzystuje się materiały wyjściowe opisane powyżej, materiały wyjściowe wytwarzane w analogiczny sposób, materiały wyjściowe opisane lub materiały wyjściowe dostępne.
Przykład 1. WytwarzaniedendrymeruPAMAMgeneracji5,0modyfikowanegoepoksy oktanem.
0,30 g (2,7 równoważnika) dendrymeru PAMAM generacji 5,0 rozpuszczono w 10 ml metanolu. Do roztworu dodano 0,5 g (3,9 mmola) epoksyoktanu (Aldrich). Roztwór ogrzewano w 40°C na łaźni olejowej przez 3 dni. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość odgazowano w temperaturze pokojowej pod wysoką próżnią otrzymując 0,60 g (93% wydajności teoretycznej) modyfikowanego dendrymeru w postaci oleju. Widma 13C i *H NMR potwierdziły powierzchniowe przyłączenie epoksyoktanu i wykazały asocjację epoksyoktanowego dendrymeru.
Przy powtarzaniu powyższego procesu z zastosowaniem dendrymeru PAMAM generacji 2,0, 3,0, 4,0, 6,0 lub 7,0 otrzymano odpowiedni koniugat.
Przykład 2. Wytwarzanie dendrymertu PAMAM generacji 4,5 modyfikowanego kwasem abscysynowym
Wodny roztwór dendrymeru PAMAM generacji 4,5 zhydrolizowano NaOH w MeOH (1 mM, 10 ml), po czym pH nastawiono na 11 stosując NaOH/HCl. Do roztworu dodano duży nadmiar kwasu abscysynowego. Roztwór mieszano intensywnie w temperaturze pokojowej. Po 1, 2, 6 i
182 237 godzinach pobierano próbki po 500 μΐ do probówki Eppendorfa (probówka 1,5 ml do mikrowirówki) i nierozpuszczony kwas abscysynowy usuwano przez wirowanie z szybkością 15 000 obrotów/minutę przez 1 minutę. Stężenie kwasu abscysynowego wyliczono z absorbancji supematantu (λ = 260 nm, ε = 19400).
Przy powtarzaniu tego procesu z zastosowaniem innych generacji dendrymerów PAMAM im wyższa była generacja, tym więcej rozpuściło się kwasu abscysynowego. Dendrymery generacji 5 i 6 rozpuszczały więcej kwasu niż generacji 4. Przy pH 7 uzyskuje się jedynie 0,004M roztwór kwasu abscysynowego w wodzie i roztworze β-CD, natomiast przy stosowaniu dendrymerów uzyskuje się roztwory 0,02-0,08 M. Połówkowe generacje dendrymerów rozpuszczały takie same ilości kwasu jak generacje pełne. Sądzi się w związku z tym, że kwas abscysynowy jest wchłaniany przez wnętrze dendrymeru.
Procedura transfekcji dla dendrymeru-dekstranu
Podstawowa procedura transfekcji jest następująca:
Dzień 1: Zaszczepić płytki z 6 studzenkami około 200 000 komórek/studzienkę (w zależności od charakterystyki wzrostu)
Dzień 2: Etap 1: Przygotować następujące roztwory:
A. Bufor rozcieńczania dendrymeru mM HEPES o pH 7,9
100 mMKCl
0,2 mM EDTA
0,5 mM DTT
20% (objętościowych) gliceryny
B. Bufor wiązania 10 X mM EDTA
40% (objętościowych) gliceryny mMDTT
100 mM TRIS HC1 o pH 7,5
1000 mM NaCl
Wymieszać i wyjałowić przez filtrację
C. Roztwór 1 (stosowany w pewnych przykładach) 25 mg DEAE-dekstranu (Pharmacia lub Sigma Chemical)
5,0 ml IM TRIS o pH 7,4 ml DMEM pozbawionego surowicy
Mieszać w 37°C w wytrząsarce przez 30 minut, wyjałowić przez filtrację (do każdej studzienki wprowadza się 1 ml roztworu 1)
D. Roztwór 2 (stosowany w pewnych przykładach)
10% DMSO w PBS o pH 7,4
Wymieszać i wyjałowić przez filtrację (do każdej studzienki wprowadza się 2 ml roztworu 2)
Etap 2: Przygotować kompleksy DNA/dendrymer (20 μΐ kompleksu należy dodać do każdej studzienki
Umieścić odpowiednią objętość buforu wiązania 10Χ i wody w sterylnej probówce Eppendorfa™
Dodać rozcieńczony dendrymer, a następnie DNA (stężone bazowe mieszanki rozpuszczalników powinny być zawieszone w wodzie i nie powinny zawierać metanolu, gdy jest to możliwe. Rozcieńczyć dendrymery w buforze rozcieńczania do uzyskania stężenia około 10Χ większego od ostatecznego stężenia, przed dodaniem buforu wiązania)
Mimo iż okazało się, że kompleks tworzy się natychmiast po wymieszaniu składników, mieszaninę należy odstawić na 3-15 minut, aby zapewnić powstanie kompleksu.
182 237
Przykład kompleksowania DNA/dendrymer: DNA RSV-luc i dendrymer G10 (EDA) DNA plazmidu RSV-luc o 7,2 kb zawiera 1,71 χ 1015 (-) ładunków powierzchniowych/gg. Dendrymer G10 (EDA) zawiera 2,64 χ 1015 (+) ładunków/gg. W związku z tym przy stosunku ładunków 1:10 należy dodać 1 gg DNA do 6,5 gg dendrymeru. Stężenie bazowego roztworu G10 (EDA) wynosiło 236,4 gg/ml. Po rozcieńczeniu buforem rozcieńczania w stosunku 1:364 uzyskano stężenie 0,65 gg/ml. Aby otrzymać 20 gl kompleksów (ilość wystarczająca do transfekcji 1 gg DNA w każdej studzience z komórkami na płytce z 6 studzienkami) połączono 2 gl buforu wiązania 10Χ, 7 gl wyjałowionej wody, 10 gl rozcieńczonego dendrymeru i 1 gl DNA (o stężeniu 1 gg/gl). Jeśli przewiduje się transfekcję w więcej niż jednej studzience, albo zamierza się zastosować większe ilości DNA, należy po prostu przygotować większą objętość kompleksu przy takich samych proporcjach buforu wiązania, dendrymeru i DNA.
Etap 3: Przemyć komórki 2X 2 ml ośrodka pozbawionego surowicy
Etap 4: Dodać po 1 ml roztworu 1 do każdej studzienki
Etap 5: Dodać 20 gl kompleksów DNA/dendrymer do każdej studzienki. Wymieszać przez łagodne potrząsanie płytki.
Etap 6: Inkubować przez 3 godziny w 37°C
Etap 7: Przemyć IX 2 ml DMEM pozbawionego surowicy
Etap 8: Poddać komórki szokowi dodając 2 ml roztworu 2 do każdej studzienki, na 2 minuty
Etap 9: Przemyć 2X 2 ml DMEM pozbawionego surowicy
Etap 10: Zastąpić ośrodek przez DMEM z 5% surowicy. Inkubować przez noc w 37°C. Dzień 3: Przygotować następujące roztwory:
Roztwór 4. Odczynnik do lizy hodowli komórek IX mM TRIS-fosforan, pH 7,8 ml DTT mM kwas 1,2-diaminocykloheksano-N,N,N',N' - tetraoctowy 10% gliceryny 1% Triton Χ-100
Roztwór 5. Odczynnik do testu lucyferazowego mM TRIS glicyna
1,07 mM (MgCO3)Mg (OH)2 · 5H2O
2,67 mM MgSO4
0,1 mM EDTA
33,3 mM DTT
270 gM koenzym A pM Luciferin™
530 gM ATP; nastawić na ostateczne pH 7,8
Etap 1: Przemyć komórki 2 x 2 ml lx PBS o pH 7,4 (bez Mg** i Za**)
Etap 2: Dodać 200 gl roztworu 4 do każdej studzienki i odstawić na 15 minut w 27°C.
Etap 3: Zdrapać komórki i zebrać je w probówkach Eppendorfa™
Etap 4: Oznaczyć stężenie białka w każdym lizacie komórkowym
Etap 5: Zebrać nie więcej niż 20 gl każdego z lizatów komórkowych w probówkach Eppendorfa™
Etap 6: Dodać 80 gl roztworu 5 i natychmiast zmierzyć chemiluminescencję
W przykładach zastosowano wiele różnych rodzajów materiału genetycznego. O ile nie zaznaczono tego inaczej, stosowanym DNA był bakteryjny plazmid ekspresji (RSV-luc), który zawiera gen enzymu lucyferazy wytwarzany w wyniku ekspresji przez promotor z wirusa oskrzelowego (RSV). Stężenie materiału genetycznego względem dendrymeru określano na podstawie wymaganego stosunku ładunków DNA:dendrymer lub stosunku molowego, jak to podano w konkretnym przykładzie. W przykładach transfekcji dodawano kompleks DNA:dendrymer w ilości wystarczającej do wprowadzenia 1 gg DNA do każdej ze studzienek (około 200 000 komórek), o ile nie podano inaczej.
182 237
W większości przykładów stosowano dendrymery PAMAM typu gęstej gwiazdy. Zmieniano generację, a więc i średnicę dendrymeru, a także rdzenie; w pewnych przypadkach zmieniono także funkcyjność powierzchni.
Przeprowadzono z powodzeniem transfekcję wielu linii komórek. O ile w przykładach nie zaznaczono inaczej, transfekowano komórki RAT2.
Gdy w przykładach stosowano DEAE-dekstran, jego stężenie było 0,5 μΜ, o ile nie zaznaczono tego inaczej. O ile nie zaznaczono inaczej, ilość DNA w kompleksie DNA:dendrymer wynosiła 1,0 pg/studzienkę.
Elektroforeza
Żele agarozowe stosowane w elektroforezie umieszczano w polu elektrycznym z katodąna górze żelu (jak to pokazano na rysunkach) oraz anodą na dole żelu (jak to pokazano na rysunkach). Żele barwiono bromkiem etydiowym, który wiąże DNA i powoduje fluorescencję wskazując w ten sposób zakres migracji DNA w żelu. W pewnych przykładach ścieżki zaczynały się zarówno w szczycie płytki z żelem jak w jej środku, przy czym w każdym przypadku migracja była skierowana do dołu. Zakłada się, że kompleksowanie i zobojętnianie ładunku DNA występuje wtedy, gdy migracja w kierunku anody ulega spowolnieniu.
W zakresie nie opisanym powyżej w przykładach wykorzystane techniki doświadczalne znane specjalistom i dostępne z literatury, tak że dokładny ich opis nie był konieczny.
Przykład3. Wytwarzanie koniugatów dendrymeru z materiałem genetycznym i dświadczenia(fig. 17-19)
W tej serii doświadczeń różne polimery dendrytowe skompleksowano z DNA i użyto w transfekcji w różnych warunkach. W kompleksowaniu z dendrymerem jako DNA zastosowano plazmid RSV-luc oczyszczany w podwójnej kolumnie z gradientem cezowym. W wyniku transfekcji plazmidu ekspresji DNA następuje transkrypcja i translacja genu lucyferazy. Uzyskuje się białko lucyferazę, enzym który katalizuje rozpad Luciferin™, a w efekcie następuje mierzalna emisja światła. Ilość emitowanego światła jest miarą stopnia powodzenia transfekcji tym genem. Zbadano następujące dendrymery:
A. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G8 (NH3) o ciężarze cząsteczkowym (MW) około 87 342 i średnicy około 76 A.
B. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G6 (NH3) o MW około 21 591 i średnicy około 53 A. C. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G5 (NH3) o MW około 10 663 i średnicy około 40 A. D. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G7 (NH3) o MW około 43 508 i średnicy około 67 A. E. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G3 (NH3) o MW około 2 414 i średnicy około 22 A. F. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G4 (NH4) o MW okóło 5 154 i średnicy około 31 Ά G. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G2 (NH3) o MW około 1 044 i średnicy około 15,8 A. H. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G1 (NH3) o MW około 359 i średnicy około 10,4 A.
I. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G1 (EDA) o MW około 517 i średnicy około 14 A.
J. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G2 (EDA) o MW około 1 430 i średnicy około19 A.
K. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G3 (EDA) o MW około 3 256 i średnicy około26 A.
L. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G4 (EDA) o MW około 6 909 i średnicy około36 A.
M.Dendrymer typu gęstej gwiazdy G5 (EDA) o MW około 14 215 i średnicy około 44 A. N. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G6 (EDA) o MW około 28 826 i średnicy około 57 A. O. Dendrymer typu gęstej gwiazdy G7 (EDA) o MW około 58 048 i średnicy około 72 A. P. Mieszanina dendrymerów typu gęstej gwiazdy o następującym składzie procentowym:
1.G6 (NH3) 58,8%
2. G5 (NH3) 30,5%
3.G2 (EDA) 1,86%
4. G2 (NH3) 1,10%
5. G1 (EDA) 3,37%
6. G1 (NH3) 4,41%
182 237
Q. Mieszanka dendrymerów typu gęstej gwiazdy o następującym składzie procentowym:
1.G6 (NH3) 60,0%
2. G5 (NH3) 31,1%
3. G2 (EDA) 1,90%
4. G2 (NH3) 1,12%
5. G1 (EDA) 1,30%
6. G1 (NH3) 4,50%
R. Częściowo zdegradowany dendrymer G6 (NH3) typu gęstej gwiazdy.
S. Częściowo zdegradowany dendrymer G7 (NH3) typu gęstej gwiazdy.
Podstawowe dane dotyczące tych dendrymerów zamieszczono poniżej w tabeli III.
T a b e 1 a III
Dendrymer MW Powierzchniowe grupy NH2 Minimalna ilość dendrymeru8
0,5 pgc DNA 1 pgc DNA
A 87 342 384 0.1 Pg NO
B 21 591 96 0,1 Pg NO
C 10 663 48 o.i pg NO
D 43 508 192 o.i pg NO
E 2414 12 ♦ 0,5 pg
F 5 154 24 * 0,1 Pg
G 1 044 6. * ♦
H 359 3 * *
I 517 4 ♦ ♦
J 1 430 8 0,5 pg NO
K 3 256 16 0,1 pg NO
L 6 909 32 0,1 pg NO
M 14215 64 0,1 pg NO
N 28 826 128 0,1 pg NO
0 58 048 256 0,1 pg NO
P 25 951 96 * 0,1 Pg
Q 25 951 96 ♦ 0,1 Pg
R b b 0,001 μg NO
s b b ----------------------------------------------------------------------------------------i 0,001 pg NO
* nie zaobserwowano wiązania a=minimalna ilość dendrymeru niezbędna do całkowitego skompleksowania DNA (całkowite zahamowanie jakiejkolwiek migracji DNA w żelu w kierunku anody) b = mieszaniny, różne wielkości; wyjaśnienie - patrz poprzednie strony tego przykładu c = minimalna ilość dendrymeru niezbędna do całkowitego skompleksowania DNA NO = nie oznaczono
Z tabeli III wynika, że wszystkie dendrymery z wyjątkiem dendrymerów z rdzeniem NH3 generacji poniżej G4 (G, Η, I) mogą wiązać i kompleksować/zobojętniać ładunek DNA.
W celu sprawdzenia, czy dendrymery skomplikowane z DNA mogą być przydatne w transfekcji, przeprowadzono doświadczenia w różnych warunkach.
182 237
Na fig. 17 przedstawiono wyniki transfekcji próbek w komórkach RAT2, przy czym dla każdego z różnych warunków oznaczonych liczbami od 1 do 18, patrz tabela IV, podano jednostki światła na 1 pg białka komórkowego.
Tabela IV
Próbka nr Dendrymer lub kontrolna Stosunek ładunków DNA: dendrymer Warunki
1 D 1 :0,7 a
2 s 1 :0,7 a
3 Q 1 :0,8 a
4 D 1 : 3,3 a
5 s 1 : 3,3 a
6* RAT2 nie transie kowany ND a
7 D 1 :0,7 b
8 s 1 : 0,7 b
9 Q 1 : 0,8 b
10 D 1 : 3,3 b
11 S 1 :3,3 b
12* Sam Dex ND b
13 D 1 :0,7 c
14 S 1 : 0,7 c
15 Q 1 : 0,8 c
16 D 1 : 3,3 c
17 s 1 : 3,3 c
18* RSV + hsDNA-Dex ND c
* = kontrolne
ND = nie dotyczy; Dex = dekstran a = DNA i dendiymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DMEM b = DNA i dendrymer skompleksowano w HBS i transfekowano w DMEM c = DNA i dendrymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DEAE-dekstranie
Próbki 6, 12 i 18 stanowią próbki kontrolne. Próbkę 6 stanowią nietransfekowane komórki RAT2. Próbka 12 jest podobna do próbki 6, z tym że dodano DEAE-dekstran. W próbce 18 usiłowano wykonać transfekcję stosując wektor i DNA plemników śledzia w obecności DEAE-dekstranu. Wyniki w tabeli IV wskazują, że dendrymery generacji niższej niż 8 nie uczestniczą w transfekcji, chyba że kompleksy DNA:dendrymer umieści się w DEAE-dekstranie.
Aby potwierdzić te wyniki z wykorzystaniem szerszego zakresu stosunków ładunków DNA:dendrymer, przeprowadzono badania zilustrowane na fig. 18. Parametry doświadczeń podano poniżej w tabeli V.
182 237
Tabela V
Próbka nr Dendrymer lub kontrolna Stosunek ładunków DNA:dendrymer Warunki
1 D 1 : 14,6 c
2 D 1 : 3,3 c
3 D 1 : 1,2 c
4 D 1 : 0,6 c
5 D 1 : 0,3 c
6 D 1 : 0,15 c
7 s. 1 : 14,6 c
8 s 1 : 3,3 c
9 s 1 : 1,2 c
10 s 1 : 0,6 c
11 s 1 : 0,3 c
12 s 1 :0,15 c
13 D 1 : 14,6 b
14 D 1 : 3,3 __________b__________
15 D 1 : 0,6 b
16 S 1 : 14,6 b
17 S 1 : 3,3 b
18 s 1 : 0,6 b
19 d 1 : 0,03 c
20 S 1 : 0,03 c
21 RSV Dex* ND ND
22 RSV + hsDNA Dex* ND ND
23 sam Dex* ND ND
24 sam HSB ND ND
* = kontrolne
ND = nie dotyczy;
Dex = dekstran b = DNA i dendrymer skompleksowano w HBS i transfekowano w DMEM c = DNA i dendrymer skompleksowano w buforze wiązania i transfekowano w DEAE-dekstranie
Próbki kontrolne 21-24 zawierały odpowiednio wektor w DEAE-dekstranie, wektor i DNA plemników śledzia w DEAE-dekstran, DEAE-dekstran i HBS.
Wyniki te wskazują że kompleksy DNA:dendrymer wykazują nieoczekiwanie większą skuteczność transfekcji komórek w obecności DEAE-dekstranu. Sugerują one również, że dla czystych dendrymerów zawierających na powierzchni funkcyjne grupy aminowe (o ładunku dodatnim) tylko kompleksy z nadmiarem dendrymerowych ładunków dodatnich są zdolne do skutecznej transfekcji (patrz ścieżka 4, fig. 18).
Zdolność do transfekcji szerokiego zakresu różnych dendrymerów przedstawiono (A-S) na fig. 19. Przedstawiono wykres słupkowy względnych jednostek światła na 1 pg białka z komórek transfekowanych DNA skompleksowanym z różnymi dendrymerami (A-S) w obecności DEAE-dekstranu. Wykonywano podwójne pomiary dla trzech różnych stosunków ładunków
182 237
DNA: dendrymer, 1:2,1:10 i l:20.Nafig. 19 spośród 6 słupków dla każdego z dendrymerów A-S pierwsze dwa przedstawiają transfekcję przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:2, druga para przy 1:10, a trzecia para przy 1:20. Próba kontrolna (RSVJ obejmuje transfekcję plazmidowego DNA wykonaną w obecności DEAE-dekstranu. Można stwierdzić, że dla różnych stosunków DNA:dendrymer powodzenie w transfekcji, transkrypcji i translacji zależy od typu stosowanego dendrymeru.
Przykład 4. Mikroskopia elektronowa kompleksów DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstranu (fig. 60, zdjęcia 3, 4 i 5)
Stwierdzono, że dodatek DEAE-dekstranu lub innych środków do kompleksu DNA:dendrymer po jego utworzeniu skutecznie wzmaga transfekcję w unikatowy sposób. Aby dokładniej zrozumieć rolę tych środków we wpływie na niespecyficzną transfekcję, wykonano mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstran. W przykładzie tym DNA skompleksowano z dendrymerami, jak to zaznaczono poniżej i na fig. 60.
Zdjęcie 3: DNA:dendrymer Gil (EDA) przy stosunku ładunków 1:10
Zdjęcie 4: DNA:dendrymer Gil (EDA) w 0,5 μΜ DEAE-dekstranie
Zdjęcie 5: DNA skompleksowany z polidyspersyjną mieszaniną dendrymerów (związek B) przy stosunku ładunków 1:1.
Na fig. 60 zdjęcia 3, 4 i 5 przedstawiają mikrofotografie elektronowe kompleksów DNA:dendrymer. DNA skompleksowano z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10, w 1 mM TRJS, pH 7,8. Dla takich warunków mikroskopia elektronowa wykazuje, że kompleksy DNA:dendrymer tworzą duże nieregularne agregaty nie obserwowane dla samego dendrymeru (fig. 60, zdjęcie 3). Dodatek DEAE-dekstranu do uzyskania jego ostatecznego stężenia 0,5 μΜ powoduje zdecydowane zmniejszenie wielkości kompleksów DNA:dendrymer (fig. 60, zdjęcie 4). Mniejsze kompleksy (i całkowity brak dużych agregatów) zaobserwowano także w przypadku kompleksowania DNA z polidyspersją mieszaniną dendrymerów (np. określoną jako związek B) przy stosunku ładunków 1:10. Wyniki te dostarczają wyjaśnienia, dlaczego środki takie mogą wzmagać transfekcję. Nie wiążąc się żadną teorią można z pewnym prawdopodobieństwem przyjąć, że kompleksy o mniejszych wymiarach uzyskiwane przy zastosowaniu takich środków będą miały łatwiejszy dostęp do komórek w celu osiągnięcia transfekcji.
Przykład 5. Porównanie wiązania DNA i zdolności do transfekcji dla dendrymerów z lub bez podstawienia powierzchni przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer (fig. 12 i 13)
W celu określenia wpływu zmniejszenia powierzchniowego ładunku w dendrymerze na skuteczność transfekcji przeprowadzono następujące doświadczenie. Wytworzono kompleksy DNA-dendrymer o podanych stosunkach ładunków, stosując różne dendrymery zestawione poniżej w tabeli VI. Jak poprzednio Liczba „G” oznacza generację dendrymeru; a „NH3” lub „EDA” oznacza rdzeń dendrymeru. Podstawione dendrymery przedstawiono jako próbki 26-31 na fig. 12 oraz ścieżki 26-31 na fig. 13. W podstawionych dendrymerach dodatnio naładowane powierzchniowe grupy aminowe zmodyfikowano poprzez reakcję z kwasem akrylowym. W związku z tym w takich podstawionych dendrymerach liczba powierzchniowych grup aminowych została zmniejszona. Tak np. w dendrymerze G6 (NH3) podstawionym w 25% teoretycznie 25% powierzchniowych grup aminowych przereagowała z grupami kakrboksylowymi kwasu akrylowego. W dendrymetrze G6 podstawionym w 100% każda powierzchniowa grupa aminowa przereagowała z grupą karboksylową. Z tego względu zmniejszeniu ulega dodatni ładunek grup funkcyjnych na dendrymerach, dostępny do oddziaływania z ujemnie naładowanym DNA. Próbki 1 i 32 w tabeli VI stanowią „plazmidy kontrolne”, czyli sam DNA.
182 237
Tabela VI
Ścieżka nr Generacja i rdzeń Stosunek ładunków DNA:dendrymer
1 Sam plazmid kontrolna
2 G5 (NH3) 1:1
3 G5 (NHj) 1:5
4 G5 (NH3) 1:10
5 G5 (EDA) 1:1
6 G5 (EDA) 1:5
7 G5 (EDA) 1:10
8 G6 (NH3) 1:1
9 G6 (NHj) 1:5
10 G6 (NHj) 1:10
11 G6 (EDA) 1:1
12 G6 (EDA) 1:5
13 G6 (EDA) 1:10
14 G7 (NHj) 1:1
15 G7 (NHj) 1:5
16 G7 (NHj) 1:10
17 G7 (EDA) 1:1
18 G7 (EDA) 1:5
19 G7 (EDA) 1:10
20 G4 (NHj) 1:1
21 G4 (NHj) 1:5
22 G4 (NHj) 1:10
23 G4 (EDA) 1:1
24 G4 (EDA) 1:5
25 G4 (EDA) 1:10
26 G6 (NHj)’ 1:1
27 G6 (NHj)’ 1:5
28 G6 (NHj)“ 1:10
29 G6 (NHj)b ND
30 G6 (NHj)b ND
31 G6 (NHj)b ND
32 Sam plazmid kontrolna
a = 25% podstawienia b= 100% podstawienia
ND = nie dotyczy; dendrymery podstawione w 100% wymieszano w takich samych ilościach jak dendrymery podstawione w 25%
Próbki kompleksów DNA:dendrymer w roztworze dodano do komórek w celu wykonania transfekcji, zgodnie z opisaną powyżej metodyką transfekcji z udziałem dendrymerów, w obe
182 237 cności DEAE-dekstranu w stężeniu 0,5 μΜ. Jak można stwierdzić na podstawie fig. 12, także w tym przypadku widoczne jest, że dendrymery G6 sąbardziej skuteczne (porównaj kolumny 8-19 z kolumnami 2-7 i kolumnami 20-25). Gdy powierzchnia dendrymeru została w 25% podstawiona ujemnymi grupami funkcyjnymi, niewątpliwie stosunek ładunków DNA:dendrymer uległ obniżeniu.
Kompleksy dendrymerów i próbki kontrolne 1-32, zestawione w tabeli VI, umieszczono na żelu agarozowym do elektroforezy (patrz fig. 13). Ścieżki 1 i 32 wskazują zakres, w jakim sam DNA migruje przez żel (fig. 13). Ścieżki 2-28 nie wykazująmigracji, co świadczy o tym, że DNA został skompleksowany z dendrymerem i w związku z tym migracja przez żel jest zahamowana. Migrację można natomiast zaobserwować dla ścieżek 29-31, gdy polimery dendrytowe zawierają zmniejszoną ilość grup funkcyjnych o ładunku dodatnim. Pewien resztkowy ładunek dodatni można jednak stwierdzić nawet w dendrymerach podstawionych w 100%, gdyż przy niższych stosunkach DNA:dendrymer obserwuje się zahamowanie (ścieżki 30-31). Wyniki przedstawione na fig. 12il3 wskazują, że gęstość powierzchniowych ładunków dodatnich odgrywa istotną rolę w wiązaniu, kompleksowaniu i transfekcji DNA.
Przykład 6. Wzrost skuteczności transfekcji DNA w funkcji generacji dendrymeru w porównaniu z próbą kontrolną z DEAE-dekstranem (fig. 14).
W przykładzie tym wytworzono z zastosowaniem dendrymerów G2-G8 (NH3) i G3-G11 (EDA). Ich zdolność do transfekcji DNA w komórkach RAT2 w obecności DEAE-dekstranu porównano ze stopniem transfekcji osiąganym przy stosowaniu jedynie DNA i DEAE-dekstranu . Procent wzrostu transfekcji dla każdego dendrymeru w porównaniu z próbą kontrolną DNA/DEAE-dekstran przedstawiono na fig. 14. Z rysunku tego wynika, że skuteczność transfekcji wzrasta wykładniczo przy zwiększaniu się generacji dendrymeru, od generacji 5 do 10. Sugeruje to, że wzrost powierzchni i ładunku dendrymerów powoduje wzrost skuteczności transfekcji.
Przykład 7. Badanie wpływu kolejnego dodawania dendrymerów G9 i G5 na skuteczność transfekcji w komórkach RAT2 bez stosowania DEAE-dekstranu (fig. 15 i 16)
W przykładzie tym
1. DNA najpierw skompleksowano z dendrymerem G9, po czym dodano roztwór zawierający dendrymer G5; albo
2. DNA najpierw skompleksowano z dendrymerem G5, po czym dodano roztwór zawierający dendrymer G9.
Wyniki uzyskane dla dendrymerów z rdzeniem EDA przedstawiono na fig. 15, a wyniki dla dendrymerów z rdzeniem amoniakalnym przedstawiono na fig. 16. Na fig. 15 i 16 stężenie drugiego dendrymeru dodawanego do kompleksu podano na osi odciętych wykresu słupkowego. W pierwszej kolumnie stężenie „zero” dotyczy próby kontrolnej, w której nie zastosowano drugiego dendrymeru.
W obydwu przypadkach wyjściowe dendrymery G9 i G5, dodawano do uzyskania ich stężenia odpowiedniego 0,5 μΜ i 20,0 μΜ. W każdym przypadku średnica dendrymeru G5 wynosiła około 40 A, a średnica dendrymeru G9 około 88 A. W obydwu przypadkach zastosowano kuliste dendrymery typu gęstej gwiazdy. Gdy dendrymer G9 dodawano do kompleksu DNA:dendrymer G5, zazwyczaj uzyskiwano lepsze wyniki niż przy dodawaniu dendrymeru G5 do uprzednio skompleksowanego dendrymeru G9. Oznacza to, że powstawanie kompleksu DNA:dendrymer może obejmować 2 etapy, a mianowicie kompleksowanie i kurczenie DNA, a następnie „pokrywanie” kompleksu dodatnim ładunkiem zapewniającym przyczepność do komórek. Okazało się, że w drugim etapie korzystniejszy jest dendrymer o większej średnicy, z większą gęstością ładunków powierzchniowych.
Przykład 8. Porównanie właściwości kompleksujących i zdolności do transfekcji szeregu dendrymerów (NH3) z fragmentami DNA (fig. 20 i 21).
W przykładzie tym stosunkowo niewielkie fragmenty DNA kompleksowano z różnymi dendrymerami. Na fig. 20 przedstawiono dane dla syntetycznego jednoniciowego DNA o 15 nukleotydach, skompleksowanego z dendrymerami G2-G7 (NH3) przy stosunkach DNA:dendrymer podanych poniżej w tabeli VII.
182 237
Tabela VII
Ścieżka Stosunek ładunków DNAidendrymer Dendrymer
1 6:1 G6 (NH3)
2 1:1 G6 (NHj)
3 1:1,5 G6 (NHj)
4 6:1 G7 (NH3)
5 1:1 G7 (NHj)
6 1:1,5 G7 (NHj)
7 6:1 G3 (NHj)
8 1:1 G3 (NH3)
9 1:1,5 G3 (NHj)
10 6:1 G4 (NHj)
11 1:1 G4 (NHj)
12 1:1,5 G4 (NHj)
13 5:1 G2 (NHj)
14 1:1 G2 (NHj)
15 1:2 G2 (NHj)
16 - ♦
* Marker wielkości DNA
Na fig. 20 pokazano wyniki elektroforezy na żelu agarozowym różnych kompleksów. Jak można stwierdzić, w kolumnach 1,4,7 i 10 nastąpiła znaczna migracja oligonukleotydów. Oznacza to, że przy stosunku ładunków DNA.dendrymer 6:1 nie tworzą się trawałe kompleksy. Natomiast brak migracji oligonukleotydów w kolumnach 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 i 12 jest oznaką tego, że syntetyczny oligonukleotydowy DNA tworzy trwałe kompleksy z dendrymerami G3-G7 (NH3) przy stosunkach ładunków 1:1 i 1:1,5. Kolumny 13-15 wskazują, że oligonukleotyd nie tworzy trwałych kompleksów z dendrymerami G2 (NH3) przy żadnym z podanych stosunków ładunków.
Powodzenie w przenoszeniu radioznaczonego dwuniciowego oligonukleotydu o 23 parach zasad (bp) skompleksowanego z dendrymerem G8 (NH3) (przy stosunku ładunków 1:10) przedstawiono na fig. 21. W związku z tym, że oligomer nie stanowił funkcyjnego genu reporterowego, zajście przenoszenia określono na podstawie pomiaru przenikania radioznaczonego DNA. Radioaktywność w komórkach po przenikaniu przedstawiono na osi rzędnych na fig. 21 w funkcji czasu po zainicjowaniu przenoszenia przedstawionego na osi odciętych.
Zależność wnikania DNA-dendrymeru do komórek od energii potwierdzają wyniki wykazujące, że dodatek azydku sodowego do kompleksu znacznie obniża przenikanie, prawie do poziomu uzyskanego dla samego oligonukleotydu. Oznacza to, że dendrymery mogą ułatwiać wnikanie do komórek kwasów nukleinowych o niskim ciężarze cząsteczkowym.
Przykład 9. Transfekcja kolistego (superzwiniętego) i linearyzowanego RSV-luc w komórkach RAT2 z wykorzystaniem dendrymerów G8 (NH3) i dendrymerów G11 (EDA), z dodatkiem i bez DEAE-dekstranu (fig. 22)
W przykładzie tym skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i Gil (EDA) gen RSV-luc zarówno w formie kolistej (superzwiniętej) jak i liniowej. Linearyzację osiągnięto stosując specyficzną względem jednego miejsca endonukleazę restrykcyjną. Na fig. 22 na osi pionowej słupki nr 1, 3, 5 i 7 dotyczą plazmidu w postaci liniowej, a słupki nr 2, 4, 6 i 8 dotyczą
182 237 plazmidu w kolistej formie DNA. Fig. 22 ilustruje, że transfekcję zarówno liniowej jak i kolistej formy DNA osiągnięto stosując dendrymer G8 (NH3) lub Gil (EDA), oraz że we wszystkich przypadkach transfekcja zostaje wzmocniona, jeśli zastosuje się DEAE-dekstran.
Przykład 10. Unikatowa zdolność dendrymerów do wiązania DNA (fig. 23)
W przykładzie tym określono korzystne stosunki ładunków DNA:dendrymer oraz warunki wiązania przy skutecznym powstawaniu trwałych kompleksów DNA:dendrymer. Wytwarzano kompleksy DNA:dendrymer o stosunku ładunków od około 40:1 do 1:50 (fig. 23 itabela VIII).
Tabela VIII
Ścieżka Stosunek ładunków DNA:dendrymer
1 a
2 b
3 40:1
4 20:1
5 10:1
6 2:1
7 1:1
8 1:5
9 1:10
10 1:20
11 1:25
12 1:50
a = marker wielkości DNA b = kontrolna - DNA bez dendrymeru
Wyniki elektroforezy kompleksów na żelach pokazano na fig. 23 (a-d). Ścieżka 1 dla każdego z żeli do elektroforezy dotyczy markera wielkości DNA, a ścieżka 2 kontrolnego DNA, to znaczy bez dendrymeru. W żelach A i B na fig. 23 do kompleksowania DNA zastosowano dendrymer G8 (NH3). W żelach C i D na fig. 23 do kompleksowania DNA zastosowano dendrymer G8 (EDA). Górne plansze (23 a i c) dotyczą kompleksów wytwarzanych w obecności ditiotreitolu (DTT), który eliminuje (poprzez redukcję wiązań disulfidowych) zanieczyszczenia białkowe, oraz eksponowanych na działanie EDTA, który mógłby skompleksować ewentualnie występujące kationy, które z kolei mogłyby wytrącać DNA. W tych dwóch etapach usuwane są zanieczyszczenia, które mogłyby zafałszować wyniki dotyczące kompleksów DNA:dendrymer. Uzyskane wyniki wskazują ponadto, że tworzenie się kompleksu nie wymaga warunków redukujących lub obecności jonów metali.
Wyniki na planszach A i C sąporówny walne z wynikami na planszach B i D. DNA kompleksowany z dendrymerami przy stosunku ładunków 20:1 lub powyżej nie tworzy trwałych kompleksów (patrz ścieżka 2-5 na planszach A-D fig. 23). Zahamowanie migracji kompleksów DNA:dendrymer zaczyna się od stosunku ładunków DNA:dendrymer 2:1 i postępuje do stosunku ładunków 1:50 (patrz ścieżka 6-12 na każdej z planszy A-D na fig. 23). Oznacza to, że DNA jest w dalszym ciągu skompleksowany z dendrymerem nawet przy niskich stosunkach ładunków DNA: dendrymer.
182 237
Przykład 11. Zdolność dendrymerów do wiązania DNA jest przede wszystkim zależna od stosunku ładunków (fig. 24)
W tym przykładzie 0,2pg plazmidowego DNA (2,9 kb) skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) w stosunkach molowych podanych w tabeli IX, przy czym ścieżka 1 dotyczy niekompleksowanego markera wielkości DNA.
Tabela IX
Ścieżka Stosunek ładunków DNA:dendrymer
1 a
2 1:0,32b
3 1:3,2b
4 l:16b
5 l:32b
6 l:64b
__________________________7__________________________ 1:128b
8 1:0,32c
9 1:3,2C
10 1:16c
11 1:32'
12 1:64'
13 1:128'
a = Marker wielkości DNA b = DNA:G8 NH3 c = DNA:Gll EDA
Wyniki elektroforezy tych kompleksów na żelu agarozowym przedstawiono na fig. 24. Można stwierdzić, że przy stosunkach molowych 1:0,32,1:3,2 i 1:16 (patrz ścieżki 2-4 na fig. 24) DNA nie tworzy kompleksu z dendrymerem G8 (NH3). Natomiast tylko przy stosunkach 1.0,32 i 1:3,2 (ścieżki 8 i 9) DNA nie tworzy kompleksów z dendrymerem Gil (EDA). Oznacza to, że większy dendrymer G11 (EDA), o znacznie większej gęstości ładunków powierzchniowych niż dendrymer G8 (NH3), jest zdolny do kompleksowania przy niższych stosunkach molowych DNA:dendrymer, co oznacza, że ważniejszym parametrem w kompleksowaniu DNA przez dendrymer jest stosunek ładunków.
Wszystkie trwałe kompleksy, które są przedstawione na ścieżkach 5-7 i 11-13, fig. 24, charakteryzują się stosunkiem ładunków DNA:dendrymer poniżej 5:1.
Przykład 12. Stabilność kompleksu DNA:dendrymer w szerokim zakresie pH (fig. 25)
W przykładzie tym wytworzono kompleksy DNA z dendrymerami G8 (NH3) i G8 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 10:1 i 1:5 w buforze zawierającym 100 mM chlorek sodowy i 10 mM TRIS, przy zmiennym pH, jak to podano poniżej w tabelki X.
182 237
Tabela X
Ścieżka pH Stosunek ładunków DNA:dendrymer*
1 7,4 10:1 (NH3)
2 7,4 1:5 (NH3)
3 7,4 10:1 (EDA)
4 7,4 1:5 (EDA)
5 7,4 sam DNA
6 5,2 10:1 (NH3)
7 7,0 10:1 (NH3)
8 9,8 10:1 (NH3)
9 5,2 1:5 (NH3)
10 7,0 1:5 (NH3)
11 9,8 1:5 (NH3)
12 5,2 10:1 (EDA)
13 7,0 10:1 (EDA)
14 9,8 10:1 (EDA)
15 5,2 1:5 (EDA)
16 7,0 1:5 (EDA)
17 9,8 1:5 (EDA)
18 5,2 sam DNA
19 7,0 sam DNA
20 9,8 sam DNA
* G8
Wyniki elektroforezy uzyskanych kompleksów na żelu agarozowym pokazano na fig. 25.
Ścieżki 1-5 dotyczą kompleksowania prowadzonego w standardowych warunkach (pH 7,4). Zgodnie z oczekiwaniami DNA nie tworzy kompleksów z dendrymerem przy stosunkach ładunków 10:1 (ścieżki 1,3,6-8 i 12-14) i podobniejak kontrolny DNA, który poddano elektroforezie bez dendrymeru (ścieżki 5 i 18-20), migruje przez żel. Na częściowe kompleksowanie DNA przy stosunku ładunków 10:1 (o czym świadczy rozmazanie obserwowane na pasach 1, 3,6-8 i 12-14) nie wpływa również zmiana pH. Natomiast kompleks DNA utworzony przy stosunku ładunków 1:5 wykazuje stabilność przy pH w zakresie 5,2-9,8 i nie migruje przez żel (ścieżki 9-11 i 15-17). Ścieżki 9 i 15 wykazują, że kompleks tworzy się przy pH 5,2, natomiast ścieżka 17 obrazuje dysocjację kompleksu przy pH 9,8. W związku z tym kompleksy utworzone z dendrymerem G8 (NH3) wykazywały stabilność przy pH 9,8 natomiast kompozycje z dendrymerami G8 (EDA) były w tych warunkach nietrwałe. Sugeruje to różną charakterystykę ładunków dla tych dwóch dendrymerów, co może wpływać na ich zdolność do wiązania DNA w pewnych warunkach.
Przykład 13. Wiązanie DNA z dendrymerem przy wzrastających stężeniach chlorku sodowego (fig. 26 a i b)
W przykładzie 13 DNA kompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G8 (EDA) przy stosunku ładunków 5:1 i 1:5, w środowisku o wzrastających stężeniach chlorku sodowego, co podano poniżej w tabeli XI.
182 237
Tabela XI
Ścieżka Stężenie NaCl
1 *
2“ & 10b 0
3“ & llb 50 μΜ
4' & 12b 100 μΜ
5’& 13b 200 μΜ
6‘& 14b 500 μΜ
7‘& I5b 750 μΜ
8 & 16b 1,0 Μ
9“& 17b 1,5 Μ
* Marker wielkości DNA a - stosunek ładunków 5:1 b = stosunek ładunków 1:5
Wyniki elektroforezy tych kompleksów przedstawiono na fig. 26a i 26b; fig. 26a dotyczy kompleksów DNA z dendrymerem G8 (NH3), a fig. 26b kompleksów DNA z dendrymerem G8 (EDA). Pełne kompleksy DNA:dendrymer nie tworząsię przy stosunku ładunków 5:1 w żadnych z przebadanych warunków, o czym świadczy migracja DNA w żelu (ścieżki 2-9 na fig. 26a i 26b). Natomiast pełne kompleksy DNA:dendrymer tworzą się i zachowują trwałość przy stosunku ładunków 1:5 w zakresie stężeń chlorku sodowego od 0 (ścieżki 2 i 10) do 1,5M (ścieżki 9 i 17). W związku z tym tworzenie się kompleksu DNA:dendrymer zachodzi niezależnie od siły jonowej buforu.
Przykład 14. Stabilność DNA skompleksowanego z dendrymerem w obecności endonukleaz restrykcyjnych (fig. 27)
W przykładzie tym 0,2 pg DNA plazmidu pRSV-lac skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) przy stosunku ładunków 1:10, a następnie inkubowano z enzymami, endonukleazami restrykcyjnymi Hindlll lub EcoRl przez 1 godzinę w 37°C. Próbki poddano następnie obróbce SDS w celu oddzielenia DNA od dendrymeru i przeprowadzono elektroforezę na żelu agarozowym (fig. 27, oznaczenie ścieżek wyjaśniono poniżej w tabeli XII).
T a b e 1 a XII
Ścieżka Kompleks plazmidu
1 Marker wielkości DNA
2 Nie trawiony plazmidowy DNA
3 Plazmidowy DNA strawiony Hind III
4 Plazmidowy DNA skompleksowany z G8 (NH3), strawiony Hind III
5 Plazmidowy DNA skompleksowany z G11 EDA, strawiony Hind III
6 Plazmidowy DNA strawiony EcoRl
7 Plazmidowy DNA skompleksowany z G8 ΝΗβ, strawiony EcoRl
8 Plazmidowy DNA skompleksowany z G11 EDA, strawiony EcoRl
Niekompleksowany plazmidowy DNA strawiony Hindlll lub EcoRl migrował we fragmentach odpowiadających liczbie miejsc restrykcji w plazmidzie (porównaj ścieżki 3 i 6 ze strawionym DNA na ścieżce 2, fig. 27). Natomiast skompleksowany DNA zasadniczo nie został
182 237 strawiony (ścieżki 4, 5, 7 i 8), co oznacza że kompleksowanie przez dendrymer chroni DNA przed trawieniem przez endonukleazy.
Przykład 15. Stabilność kompleksów DNA:dendrymer w obecności nukleaz komórkowych (fig. 28)
Przykład 15jest podobny do przykładu 14, z tym że zastosowano nukleazy komórkowe otrzymane z komórek cytoplazmatycznych U937 do niespecyficznego trawienia DNA. Plazmidowy DNA (2,9 kb) skompleksowano z dendrymerem G8 (EDA) przy stosunkach ładunków zapewniających pełne (1:5) lub niepełne (5:1) kompleksowanie DNA. Kompleksy DNA. dendrymer inkubowano następnie z ekstraktem komórkowym przez 4 godziny w 47°C. Z kolei dodano SDS w celu oddzielenia DNA od dendrymeru i próbki poddano elektroforezie na żelu agarozowym (fig. 28); identyfikację ścieżek podano poniżej w tabeli XHL
Tabela XIII
Ścieżka Próbki
1 Marker wielkości DNA
2 Plazmid kontrolny; bez ekstraktu komórkowego, bez dendrymeru
3 Strawiony plazmid kontrolny; 5 pg ekstraktu komórkowego, bez dendrymeru, bez SDS
4 Plazmidowy DNA:G8 (EDA) (1:5), bez ekstraktu komórkowego
5 Plazmidowy DNA:G8 (EDA) (1:5), 5 pg ekstraktu komórkowego
6 Plazmidowy DNA:G8 (EDA) (5:1), bez ekstraktu komórkowego
7 Plazmidowy DNA:G8 (EDA) (5:1), 5 pg ekstraktu komórkowego
Migrację nienaruszonego plazmidu przedstawiono na ścieżce 2, natomiast migrację plazmidu strawionego nukleazami komórkowymi pokazano na ścieżce 3. Z porównania ścieżek 2 i 3 wynika, że ekspozycja DNA na działanie nukleaz komórkowych powoduje jego strawienie na małe fragmenty o różnej wielkości (o czym świadczy rozmazanie na ścieżce 3).
Ścieżka 4 dotyczy kompleksu DNA:dendrymer przy stosunku ładunków 1:5, którego nie eksponowano na działanie ekstraktu komórkowego ani na SDS, a następnie poddano elektroforezie. Nie zaobserwowano migracji, czego można było oczekiwać w przypadku trwałego kompleksu DNA:dendrymer.
Na ścieżce 5 ten sam kompleks 1:5 poddano działaniu ekstraktu komórkowego (5gg), a następnie zdysocjowano za pomocą SDS i poddano elektroforezie. Plazmid pozostał praktycznie nienaruszony, co wynika z porównania ścieżki 5 ze ścieżkami 3 i 4. Oznacza to, że trawienie DNA zachodzi w niewielkim stopniu lub nie zachodzi wcale, gdy jest on skompleksowany z dendrymerem.
Ścieżka 6 dotyczy kompleksu DNA.dendrymer 5:1 nie poddanego działaniu ekstraktu komórkowego, a następnie podanego elektroforezie. Zgodnie z oczekiwaniami kompleks nie jest trwały i DNA migruje w żelu. Ścieżka 7 dotyczy tego samego kompleksu eksponowanego na 5 μg ekstraktu komórkowego, a następnie poddanego obróbce SDS w celu uwolnienia DNA od dendrymeru i poddanego elektroforezie. W związku z tym, że kompleks nie był stabilny, DNA został prawie całkowicie strawiony, tak że na ścieżce 7 fig. 28 widoczna jest zróżnicowana migracja różnych strawionych fragmentów. Uzyskane wyniki świadczą o tym, że pełne kompleksowanie DNA przez dendrymer chroni DNA przed stawieniem przez nukleazy.
Przykład 16. Transfekcja DNA skompleksowanego z dendrymerami G8 (NH3) z udziałem lub bez DEAE-dekstranu, w porównaniu z transfekcjąz wykorzystaniem środka Lipofectin™ (fig. 29).
W tym przykładzie DNA skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy różnych stosunkach ładunków DNA:dendrymer (od 1:100 do 1:1). Następnie przeprowadzono transfekcję
182 237 różnych ilości DNA (1, 5 i 10 pg) w obecności lub bez DEAE-dekstranu. Powyższe ilości DNA transfekowane także z 20 pg środka Lipofectin™.
Wyniki tych transfekcji, których miarą jest luminescencja (w jednostkach światła/pg białka) przedstawiono na fig. 29. Bardzo małą transfekcję zaobserwowano dla próbek kontrolnych, to znaczy dla DNA w obecności dendrymeru lub samego DNA. Znaczną transfekcję osiągnięto w przypadku kompleksów DNA:dendrymer przy dodawaniu 10 pg, 5 pg i 1 pg DNA/studzienkę, przy stosunkach ładunków DNA:dendrymer od 1:100 do 1:1 w obecności dendrymeru. Znaczną transfekcję osiągnięto również dla kompleksów DNA:dendrymer nawet w nieobecności dendrymeru, gdy większe ilości DNA skompleksowano przy niższych stosunkach ładunków. W nieobecności dendrymeru transfekcja kompleksami DNA:dendrymer zachodzi tylko w przypadku dendrymerów wyższych generacji (>G7).
W tych przypadkach, gdy transfekcja jest znacząca, uzyskane wyniki wypadają korzystnie w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy stosowaniu środka transfekcyjnego opartego na lipidach, Lipofectin™.
Przykład 17. Transfekcja DNA skompleksowanego z różnymi dendrymerami w obecności lub bez DEAE-dekstranu (fig. 30 i 31)
W tym przykładzie przedstawiono wyniki transfekcji DNA skompleksowanego z dendrymerami G9 (EDA), G9 (NH3) (fig. 30) oraz G8 (NH3) i G11 (EDA) (fig. 31) przy różnych stosunkach ładunków. Transfekcja DNA w obecności DEAE-dekstranu jest zdecydowanie wzmocniona, gdy stosunek ładunków DNA:dendrymer waha się w granicach od 1:5 (0,2) do 1:100 (0,01) (fig. 30 i 31). Nawet przy stosunkach wysokich, 4:1 (4,0) lub bardzo niskich, około 1:10 000 (0,0001) zaobserwowano pewną transfekcję. Znaczącą transfekcję w nieobecności DEAE-dekstranu obserwuje się tylko wtedy, gdy stosunek ładunków DNA:dendrymeru jest niższy od 1:5, przy czym obserwuje się tendencję wzrostową przy spadku stosunku ładunków do 1:1 000, a nawet do 1:10 000 dla G9 (NH3) (fig. 30). Sugeruje to, że niższe stosunki ładunków materiału genetycznego do dendrymeru mogą ewentualnie zastępować wzmacniające działanie DEAE-dekstranu.
Przykład 18. Transfekcja DNA skompleksowanego z dendrymerem G7 (NH3) w obecności DEAE-dekstranu lub HBS (fig. 32)
W tym przykładzie kompleksy DNA:dendrymer o stosunkach ładunków podanych na osi odciętych na fig. 32 transfekowano w komórkach RAT2 w obecności DEAE-dekstranu lub HBS. Wyniki transfekcji, których miarąjest luminescencja we względnych jednostkach światła/pg białka komórkowego, przedstawiono na fig. 32. Jak można stwierdzić, DEAE-dekstran zasadniczo wzmaga transfekcję kompleksów, w których stosunek ładunków wynosi od około 1:15 do około 1:1, a nawet do 1:0,6. Praktycznie nie zaobserwowano transfekcji w obecności HBS, co potwierdza, że transfekcja dendrymerami generacji 7 lub niższej wymaga dodawania DEAE-dekstranu.
Przykład 19. Wpływ generacji dendrymeru i stosunku ładunków DNA/dendrymer na wydajność transfekcji (fig. 33)
W tym przykładzie kompleksy DNA z dendrymerami typu gęstej gwiazdy G4-G8 (NH3) przy stosunkach ładunków DNA :dendrymer 1:1,1:511:10 transfekowano w komórkach RAT2 w obecności dendrymeru. Procent wzrostu transfekcji w odniesieniu do mieszaniny kontrolnej DEAE-dekstranu z DNA przedstawiono dla każdego z uzyskanych kompleksów na fig. 33. Bardzo znaczący wzrost w stosunku do próby kontrolnej zaobserwowano przy wszystkich stosunkach ładunków dla dendrymerów G6, G7 i G8, których średnica wynosi ponad około 50 Ά, a niewielką poprawę stwierdzono da dendrymerów G4 i G5. Ponadto w przypadku, gdy stosunek ładunków wynosił 1:5 lub 1:10, transfekcja była zdecydowanie wydajniejsza niż w przypadku kompleksów, w których stosunek ładunków wynosił 1:1. W związku z tym wzrost generacji dendrymeru i stosunku ładunków synergistycznie poprawia skuteczność transfekcji.
Przykład 20. Wpływ DEAE-dekstranu na transfekcję w szerokim zakresie stosunków ładunków (fig. 34)
W tym przykładzie DNA skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy stosunku ładunków od 1:1 do 1:3805. Wyniki transfekcji z udziałem i bez DEAE-dekstranu przedstawiono na fig. 34 dodając stopień luminescencji we względnychjednostkach światła/pg białka. Przy sto
182 237 simkach 1:1 i 1:100 osiągnięto minimalną transfekcję zarówno w obecności jak i bez DEAE-dekstranu. Natomiast dla stosunków 1:5 i 1:10 ponownie zaobserwowano synergistyczny wpływ zastosowania DEAE-dekstranu na wzrost transfekcji. W związku z tym okazało się, że DEAEdekstran może wzmagać transfekcję kompleksów DNA:dendrymer tylko przy pewnych stosunkach ładunków.
Przykład 21: Wpływ zmiany stężenia DEAE-dekstranu na skuteczność transfekcji (fig. 35)
W przykładzie tym kompleksy DNA:dendrymer G11 (EDA) wytworzone przy stosunkach DNA.dendrymer od 1:1 do 1:100 zastosowano do transfekowania komórek RAT2 w obecności DEAE dekstranu o różnym stężeniu (0-2 μΜ). Wyniki transfekcji, których miarąjest luminescencja ( w jednostkach światła/pg białka komórkowego) przedstawiono na fig. 35. Pewne transfekcje zaobserwowano we wszystkich warunkach, przy czym DEAE-dekstran w stężeniach 0,125 - 2 μΜ wydaje się wzmagać transfekcję. Jednakże wzrost ten jest najwyraźniejszy przy stężeniach DEAE-dekstranu 0,25 -1 pM oraz dla stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5 lub 1:10. Oznacza to, że zarówno stosunek ładunków jak i stężenie DEAE-dekstranu należy optymalizować, aby osiągnąć synergistyczną poprawę transfekcji.
Przykład22: Porównanie transfekcji DNA z wykorzystaniem dendrymerów i środka Lipofectin™ (fig. 36)
W przykładzie tym 5 pg DNA skompleksowano z dendrymerami G8 (NH3) przy stosunku ładunków 1:5, po czym zastosowano do transfekcji różnych linii komórek. Transfekcję 5 linii komórek podatnych na fig. 35 porównano z transfekcją z udziałem środka Lipofectin™. Dodatkowo transfekcję kompleksu DNA:dendrymer wzmocnioną przez DEAE-dekstran porównano z transfekcją przy stosowaniu samego kompleksu. Na fig. 36 środki transfekcyjne oznaczono w sposób następujący: 1 dotyczy środka Lipofectin™ przy dwóch różnych stężeniach (20 pg i 2 pg); 2 dotyczy dendrymeru i DEAE-dekstranu; 3 dotyczy samego dendrymeru; 4 dotyczy samego DEAE-dekstranu i stanowi próbę kontrolną; 5 dotyczy plazmidu i stanowi próbę kontrolną.
Jak to wynika z fig. 36, transfekcja przy stosowaniu kompleksu DNA:dendrymer w obecności DEAE-dekstranu jest o wiele intensywniejsza niż przy stosowaniu środka Lipofectin™ przy 2 i 20 pg/studzienkę, w przypadku wszystkich komórek z wyjątkiem ludzkich komórek HMEC-1. Transfekcja kompleksów DNA:dendrymer w obecności DEAE-dekstranu również przebiegała korzystniej niż przy stosowaniu samego kompleksu DNA:dendrymer. W przypadku pewnych komórek, np. szczura: Klon 9, myszy NIH3T3 i myszy 10-1 transfekcja przy zastosowaniu samych kompleksów DNA:dendrymer jest korzystniejsza niż przy zastosowaniu środka Lipofectin™ w ilości 2 lub 20 pg. Oznacza to, że kompleksy DNA:dendiymer mogą być stosowane do transfekowania szeregu różnych komórek; jednakże wyniki te sugerują, że skuteczność transfekcji może się zmieniać w zależności od typu komórki.
Przykład 23. Transfekcja dodatkowych linii komórek, trudnych do transfekowania za pomocą obecnie dostępnych środków transfekcyjnych (fig. 37)
Przeprowadzono próby transfekcji kompleksami DNA:dendrymer dodatkowych linii komórek, w przypadku których stwierdzono trudności w transfekcji z wykorzystaniem innych technik. DNA skompleksowano z dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5 i stopień, wjakim kompleksy DNA: dendrymer transfekują linie komórek NRK52E i YB2 porównano z transfekcją tych samych komórek dostępnym w handlu środkiem transfekcyjnym Lipofectin™ stosowanym w ilości 20 i 2 pg. Na fig. 37 środki oznaczono tymi samymi liczbami co na fig. 36.
Wyniki transfekcji, których miarąjest luminescencja we względnych jednostkach światła/pg białka komórkowego, przedstawiono na fig. 37. Najlepsze wyniki w przypadku wszystkich komórek uzyskuje się przy zastosowaniu kompleksu DNA:dendrymer w połączeniu z DEAE-dekstranem. Jakkolwiek środek Lipofectin™ zapewniał skutecznątransfekcję liii komórek NRK52E, to nie sprawdził się w przypadku linii komórek YB2, dla której skuteczność kompleksu DNA:dendrymer w DEAE-dekstranie była zdecydowanie wyższa. Ponownie należy podkreślić, że ogólna skuteczność transfekcji zmienia się w zależności od linii komórek.
182 237
Przykład 24. Porównanie transfekcji DNA z wykorzystaniem dendrymerów i dwóch różnych środków lipidowych, Lipofectin™ i Lipofectamine™ (fig. 38)
W przykładzie tym linie komórek RAT2 transfekowano DNA RSV-luc skompleksowanym z dendrymerem G8 (NH3) lub dendrymerem Gil (EDA). Zbadano stosunki ładunków DNA:dendrymer 1:1, 1:5 i 1:10. W pewnych przypadkach zastosowano DEAE-dekstran w celu wzmocnienia transfekcji. Wyniki transfekcji porównano z transfekcją z wykorzystaniem 2,10 i 20 μΐ Lipofectin™ oraz 2, 12,5 i 25 μΐ Lipofectamine™.
Wyniki przedstawione na fig. 38 wykazująwyjątkowy stopień, w jakim DNA ulega transfekcji po skompleksowaniu z dendrymerami przy stosunku DNA:dendrymer 1:5 lub 1:10 w obecności DEAE-dekstranu. Lipofectamine™ zapewniał transfekcję, ale działał skutecznie tylko w wąskim zakresie stężeń.Lipofectin™ wykazywał minimalną aktywność w przypadku tej linii komórek.
Przykład 25. Porównanie wpływu zwiększania przepuszczalności błon komórkowych za pomocą DMSO na skuteczność transfekcji z działaniem DEAE-dekstranu (fig.39)
Aby sprawdzić przypuszczenie, że DEAE-dekstran działa jedynie jako środek zakłócający lub zwiększający przepuszczalność, porównano transfekcję komórek RAT2 kompleksem DNA z dendrymerem G9 (NH3) przy zastosowaniu lub bez stosowania DMSO do obróbki komórek. Wyniki przedstawione na fig. 39 wykazują trzykrotny wzrost transfekcji przy zastosowaniu DEAEdekstranu w porównaniu z transfekcją bez dekstranu. Natomiast DMSO nie wywiera wpływu na transfekcję w nieobecności DEAE-dekstranu. W związku z tym działanie wzmacniające DEAEdekstranu nie jest po prostu wynikiem zakłócania lub zwiększania przepuszczalności komórek.
Należy podkreślić, że kombinacja DMSO i DEAE-dekstranu wywiera jeszcze silniejsze działanie synergistyczne na transfekcję DNA skompleksowanego z dendrymerem, zwłaszcza przy stosunkach ładunków 1:5 i 1:10. Sugeruje to, że te dwa środki działają według różnych mechanizmów.
P r z y k ł ad 26. Zastosowanie skompleksowanych dendrymerów do transfekcji komórek (fig. 40i41)
Koniugowanie prowadnika docelowego (trisacharydu galaktozowego) z dendrymerami nie zakłóca tworzenia trwałego kompleksu DNA:dendrymer (fig. 41), a może być wykorzystane do zwiększania skuteczności transfekcji (fig. 40). W tym przykładzie dendrymer Gil (EDA) skoniugowano z trisacharydem galaktozowym. Następnie DNA skompleksowano z ukierunkowanym dendrymerem i kompleks zastosowano do transfekcji komórek RAT2, HepG2, NIH3T3 i AL. Niekoniugowane dendrymery także skompleksowano z DNA i zastosowano jako próbki kontrolne. Wyniki przedstawione na fig. 40 wykazują, że koniugowanie prowadnika docelowego wzmacnia transfekcję komórek HepG2 i AL wytwarzających w wyniku ekspresji receptor trisacharydu galaktozowego.
Przeprowadzono także elektroforezę kompleksów DNA:dendrymer. Na fig. 41 przedstawiono wyniki dla 1 pg DNA skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) z prowadnikami docelowymi lub bez nich, patrz tabela XIV.
T a b e 1 a XIV
Ścieżka Stężenie dendrymeru, μΜ
1 sam DNA
2 0,1'
3 0,05°
4 0,025°
5 o,ib
6 0,05b
7 0,025b
a = nie skoniugowany b = skoniugowany
182 237
Przy bardzo niskich stężeniach dendrymeru, czyli przy wysokim stosunku ładunków DNA:dendrymer nie tworzą się trwałe kompleksy (jak tego można było oczekiwać), zarówno z nieukierunkowanym, to znaczy nieskoniugowanym dendrymerem, jak i z dendrymerem skoniugowanym z trisacharydem galaktozowym (patrz ścieżki 3,4,6 i 7). Trwałe kompleksy utworzyły natomiast nieskoniugowane i skoniugowane dendrymery przy odpowiednich stosunkach ładunków (patrz ścieżki 2 i 5, fig. 41). Potwierdza to potencjalną przydatność skoniugowanych dendrymerów w transfekcji ukierunkowanej.
Przykład 27. Wpływ potencjalnych prowadników docelowych oraz innej modyfikacji powierzchni dendrymerów na skuteczność transfekcji (fig. 43)
W przykładzie tym dendrymery G5 i G6 (NH3) skoniugowano z 20 biotynami/dendrymer, 100 pirogronianami/dendrymer i 64 pirogronianami/dendrymer, albo, alternatywnie, zmodyfikowano powierzchnię tak, że 25% powierzchniowych grup aminowych poddano reakcji z kwasem akrylowym. Dendrymery zastosowano następnie do kompleksowania z DNA plazmidu RSV-luc i transfekcji komórek RAT2. Miarą zakresu transfekcji są względne jednostki światła/pg białka. Wszystkie próby transfekcji przeprowadzano w obecności DEAE-dekstranu. Stosunki ładunków dla podstawionych dendrymerów określano przy założeniu, że nie nastąpiło podstawienie ujemnych grup funkcyjnych. Wyniki transfekcji, patrz fig. 43, wskazują, że takie modyfikacje powierzchni nie wpływają niekorzystnie na transfekcję w porównaniu z transfekcją przy zastosowaniu niemodyfikowanego dendrymeru G6 (NH3).
Przykład 28. Trwałość aktywności środka Luciferase™ po transfekcji z udziałem dendrymeru (fig. 44)
W przykładzie tym zmiany w czasie aktywności środka Luciferase™ w komórkach RAT2 transfekowanych kompleksami DNA:dendrymer w obecności i bez DEAE-dekstranu. Aktywność oznaczono po 21, 45, 69 i 141 godzinach. Wyniki przedstawiono na fig. 44.
Zarówno w obecności jak i bez DEAE-dekstranu zakres transfekcji jest zasadniczo zwiększony, zwłaszcza po 21 i 45 godzinach w przypadku DNA skompleksowanego z dendrymerem niż przy transfekcji samym DNA (plazmid kontrolny). Stosunek ładunków w każdym z kompleksów wynosił 1:10. Wyniki są szczególnie uderzające dla transfekcji kompleksem DNA:dendrymer w obecności DEAE-dekstranu po 21 i 45 godzinach. Sugeruje to, że geny są wytwarzane w wyniku ekspresji dłużej przy transfekcji z dendrymerami.
Przykład 29. Cytotoksyczność (fig. 45 i 46)
W tym przykładzie przeprowadzono testy w celu określenia cytotoksyczności kompleksów DNA:dendrymer w obecności lub bez DEAE-dekstranu, w stosunku do szeregu różnych typów komórek: komórek RAT2 (fig. 45) oraz komórek Klon 9, NIH3T3, 10-1 i COS7 (fig. 46). Na fig. 45 różne liczby przy słupkach oznaczają: 1 oznacza ośrodek kontrolny; 2 oznacza ośrodek kontrolny z DNA; 3 oznacza dendrymer; 4 oznacza dendrymer z DNA; 5 oznacza kontrolny DEAE-dekstran; 6 oznacza kontrolny DEAE-dekstran z DNA; 7 oznacza dendrymer z DEAE-dekstranem; a 8 oznacza dendrymer z DNA i DEAE-dekstranem. Zwykła przeżywalność w hodowli wynosi 90-95%. Kompleksy DNA:dendrymer wywierają nieznaczny wpływ lub nie wywierają wcale wpływu na przeżywalność komórek z wyjątkiem linii komórek Klon 9, w przypadku której stopień zużywania się komórek w przybliżeniu podwoił się w obecności kompleksów DNA:dendiymer. Dodatek DEAE-dekstran zwiększa w pewnym stopniu cytotoksyczność, ale nie tak, aby powstrzymać się przed wyjątkowo korzystnym użyciem takiej kombinacji in vitro.
Przykład 30.W chłanianie i lokalizacj a w komórce radioznaczonego DN A tr ansfeko wanego z dendrymerem (fig. 47)
W tym przykładzie radioznaczony DNA (2,9 kb) transfekowano w komórkach RAT2 i U937 z wykorzystaniem dendrymeru G8 (NH3). Ogólne przenoszenie przedstawiono na fig. 47 a-f wraz określeniem lokalizacji uzyskanym przez frakcjonowanie komórek na części związane z błoną, jądrem i cytoplazmą. W ten sposób oznaczono zawartości radioznaczonego DNA osobno w jądrze i w błonie.
182 237
Figura 47 a-c dotyczy komórek U937 tansfekowanych samym DNA (47 a), DNA z dendrymerem (47 b) i DNA z dendrymerem i azydkiem sodowym (47 c). Ta sama seria transfekcji dla komórek RAT2 przedstawiona jest odpowiednio na fig. 47 d, e oraz f.
Uzyskane wyniki wskazują nie tylko na znaczne przejmowanie przez komórki przy zastosowaniu DNA z dendrymerem, ale również na znaczące przejmowanie przez jądro (fig. 47 b oraz e). Zależność modulowanej transfekcji DNA od energii wykazano dodając azydek sodowy (fig. 47 c oraz f), który zmniejsza stopień wchłaniania DNA w przybliżeniu do poziomu obserwowanego wtedy, gdy sam DNA inkubuje się z komórkami (fig. 47 a i d).
Przykład31. Mikrofotografie transfekowanych komórek (fig. 481,48b, 49,50a i 50b)
W przykładzie tym wykonano mikrofotografie komórek czerniaka myszy D5 i fibroblastu szczura RAT2 transfekowanych DNA plazmidu RSY-fTgal z zastosowaniem odpowiednio dendrymerów G11 (EDA) typu gęstej gwiazdy i dendrymerów G8 (NH3) typu gęstej gwiazdy. Komórki, w których zaszła transfekcja, widoczne są jako ciemne (błękitne) komórki na fig. 48-50.
Na fig. 48a przedstawiono transfekcję komórek D5 przeprowadzoną z zastosowaniem kompleksów DNA-dendrymer w ilości 1 pg materiału genetycznego/studzienkę. Na fig. 48b widać więcej komórek transfekowanych, gdy ilość DNA zwiększono do 5 pg/studzienkę. Na fig. 49 pokazano w powiększeniu szereg transfekowanych komórek, w przypadku których zastosowano 3 pg materiału genetycznego/studzienkę.
Na fig. 50a pokazano mikrofotografię komórek fibroblastu szczura RAT2 transfekowanych 3 pg materiału genetycznego/studzienkę. Na fig. 50b pokazano kontrolne, nietransfekowane komórki. Badania wykazały, że znaczna większość komórek w hodowli (50-95%) ulega transfekcji przy stosowaniu kompleksów DNA:dendrymer.
Przykład 32. Porównanie różnych sposobów otrzymywania trwale tansfekowanych linii komórkowych D5, RAT2 i MSU 1.2 (fig. 52, 53, 54, 55 i 59)
W przykładzie tym przeprowadzono próby transfekcji linii komórkowych D5, Rat2 i MSU 1.2 przy zastosowaniu 5 lub 10 pg/hodowlę plazmidu zawierającego geny oporności na antybiotyk G418 (neomycynę) oraz oporności na β-galaktozydazę lub migromycynę B. Na fig. 52 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek D5 oraz podano ilości DNA plazmidu RSV-p-gal/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:13 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:7.
Na fig. 53 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek RAT2 oraz podano ilości plazmidowego DNA/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,2 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:6 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,2 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:3.
5. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:13 oraz
6. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:7.
0, 5 pM DEAE-dekstran wprowadzano do ośrodka hodowli po skompleksowaniu materiału genetycznego z dendrymerem.
Komórki umieszczono w ośrodkach zawierających antybiotyk G418 lub higromycynę B. Komórki te wykazują24-godzinny cykl podwajania (czyli replikacja następuje co 24 godziny).
182 237
Po 4 tygodniach hodowle oceniono pod względem liczby klonów, w których następuje ekspresja oporności na G418 i oporności na β-galaktozydazę i/lub hygromycynę.
Na fig. 54 porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek
MSU 1.2 oraz podano ilości DNA plazmidu EBV-A-hygromycyny/studzienkę.
1. 5 pg w obecności 0,5 μΜ DEAE-dekstranu
2. 5 pg w obecności 0,125 pM fosforanu wapniowego
3. 5 pg skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:2
4. 5 pg skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5
5. 5 pg skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10
6. 5 pg skompleksowanego z dendrymerem Gil (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:20
7. 5 pg skompleksowanego z 10 pg środka Lipofectamine™.
Figura 59 ilustruje transfekcję przedstawioną na fig. 52.
Porównano następujące techniki transfekcji w odniesieniu do linii komórek D5 oraz poda no ilości DNA plazmidu RSV-[3-gal/studzienkę.
1. 10 pg w obecności 0,125M fosforanu wapniowego
2. 10 pg w obecności 0,5 pM DEAE-dekstranu
3. 5 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA: dendrymer 1:13 oraz
4. 10 pg skompleksowanego z 0,5 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA: dendrymer 1:7.
5. 5 pg skompleksowanego z 0,2 pM dendrymerem G8 (NH3) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:6.
Należy zwrócić uwagę na wzrost liczby klonów uzyskanych w wyniku transfekcji z dendry merem.
Figura 55 ilustruje transfekcję linii komórek D5 z wykorzystaniem plazmidu ekspresji ICAM i dendrymeru Gil (DEA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10. Najpierw wyselekcjonowano klony, w których następuje ekspresja ICAM, wykazujące oporność na neomycynę. Klony oporne na neomycynę zanalizowano techniką sortowania komórek uaktywnionych fluorescencyjnie (FACS) stosując przeciwciało anty-ICAM skoniugowane z fluoresceiną. Porównano następujące linie komórek i klony:
1. Linia komórek D5, ujemna (nie barwiąca się) względem przeciwciała anty-ICAM
2. Linia komórek IC-21 dodatnio barwiona przez przeciwciało anty-ICAM.
3. Klon nr 23 po transfekcji 15 pg DNA z dendrymerem G11 (EDA) przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10
4. Klon nr 27 otrzymany w sposób opisany powyżej.
5. Klon nr 31 otrzymany w sposób opisany powyżej.
6. Klon nr 9 otrzymany w sposób opisany powyżej.
Profile dodatnio barwiących się komórek (kropkowane) nałożono na profil IC AM-ujemnej kontrolnej linii komórek D5 (fig. 55A) stosowanej w transfekcji. Wyniki te wykazują, że przy transfekcji kompleksem DNA:dendrymer uzyskać można trwałe linie komórek, w których zachodzi wysoki poziom ekspresji ICAM od transfekowanego genu.
Jak to można zobaczyć na fig. 52,53,54,55 i 59, liczba klonów, w których kontynuowana jest ekspresja zarówno oporności na G418 jak i gen β-galaktozydazy, oporności na hygromycynę i gen dla ICAM po 4 tygodniach, jest znaczna, jeśli transfekcję przeprowadzi się sposobem według wynalazku, to znaczy kompleksując materiał genetyczny z polimerami dendrytowymi, w porównaniu z próbami transfekcji w obecności tylko fosforanu wapniowego, DEAE-dekstranu lub środka Lipofectamine™. Oznacza to, że transfekcja komórek kompleksem DNA:dendry
182 237 mer jest o wiele bardziej skuteczna niż inne dostępne techniki w wytwarzaniu trwale transfekowanych linii komórek.
Przykład33. Porównanie transfekcji komórek COS 1 i RAT2 z wykorzystaniem różnych dendrymerów i kombinacji dendrymerów przy różnych stosunkach ładunków oraz w trzech różnych warunkach (fig. 61A i 61B)
W tym przykładzie 1 pg RSV-luc/studzienkę skompleksowano z podanymi dendrymerami lub próbkami kontrolnymi w podanych stosunkach ładunków, przedstawionych poniżej w tabeli XV.
T a b e1 a XV
Nr próbki Środek transfekujący Stosunek ładunków materiał genetyczny-.dendrymer
1 Agregat dendrymerów G8 (NH3) i G8,5 (NH3) przy stosunku ładunków G8:G8,5 50 (próbka 13 z przykładu 34 poniżej) 1:10
2 jak próbka 1 1:20
3 jak próbka 1 1:50
4 Agregat dendrymerów G6 (NH3) i G6,5 (NH3) przy stosunku ładunków G6:G6,5 100 (próbka 8 z przykładu 34 poniżej) 1:10
5 jak próbka 4 1:20
6 jak próbka 4 1:50
7 Próbka Q z przykładu 3, polidyspersyjna mieszanka dendrymerów 1:10
8 jak próbka 7 1:50
9 G10(NH3) 1:20
10 GIO(NHj) 1:50
11 Lipofectamine™ Nie dotyczy: stosowany zgodnie z zaleceniami producenta.
Powyższe kombinacje zastosowano do transfekcji komórek COSI (fig. 61 A) i RAT2 (fig. 61B) w trzech różnych warunkach. We wszystkich przypadkach jako podstawowy ośrodek zastosowano DMEM. W przykładach przedstawionych słupkami zakropkowanymi na fig. 61A i 61B stosowano same kompleksy materiał genetyczny:dendrymer. W przykładach przedstawionych słupkami zakreskowanymi ukośnie transfekcję przeprowadzono w obecności 0,5 μΜ DEAE-dekstranu. W przykładach przedstawionych słupkami pełnymi transfekcję przeprowadzono w obecności 25 pg/ml chlorochiny.
Wyniki tych doświadczeń wskazują, że skuteczność chlorochiny zależy od transfekowanej linii komórek (fig. 61B); oraz że w przypadku co najmniej pewnych komórek zastosowanie chlorochiny powoduje wyjątkowo wysoką skuteczność transfekcji (fig. 61 A).
Przykład 34. Wywarzanie agregatów dendrymerów regulowanych zmianami pH oraz zastosowanie tych agregatów w badaniach transfekcji
Agregaty dendrymerów wytworzono z roztworów dendrymerów z końcowymi grupami aminowymi i dendrymerów z grupami karboksylanu sodu. Stosunek różnych dendrymerów stosowanych w tym przykładzie podano poniżej w tabeli XVI
182 237
T a b e 1 a XVI
Próbka G n,5 NH3 Gn NH3 Stosunek ładunków Gn/Gn,5
1 G6,5 G6 0,5
2 G6,5 G6 1
3 G6,5 G6 2,5
4 G6,5 G6 5
5 G6,5 G6 10
6 G6,5 G6 25
7 G6,5 G6 50
8 G6,5 G6 100
9 G6,5 G6 200
10 G6,5 G8 25
11 G6,5 G8 50
12 G6,5 G8 100
13 G8,5 G8 50
14 G8,5 G8 100
15 * G6 ♦
16 * G8 *
* nie dotyczy
Liczba ”,5” w odniesieniu do generacji (np. G8,5 i G6,5) oznacza, że jest to połówkowa generacja dendrymeru (w tym przypadku połówkowa generacja dendrymerów PAMAM). W połówkowej kondygnacji generacji dendrymery są zakończone karboksyłanami, natomiast w pełnej kondygnacji generacji są one zakończone grupami aminowymi.
Typowe wytwarzanie agregatów dendrymerów opisano poniżej. Przygotowano roztwory bazowe dendrymeru G8,5 (NH3) (2,34% wagowych) i dendrymeru G8 (NH3) (2,28% Wagowych) w buforze TRIS (pH 7,4). Aby uzyskać agregaty dendrymerów o stosunku ładunków 50:1 8,8 mg roztworu dendrymeru G8,5 (NH3) wymieszano z 15,4 mg roztworu dendrymery G8 (NH3). Uzyskany roztwór rozcieńczono następnie buforem TRIS, tak aby uzyskać 2,0689 g roztworu. Całkowite stężenie roztworu wynosiło 0,74% wagowych. Na fig. 56 przedstawiono aktywność lucyferazy w komórkach RAT2 po transfekcji agregatami dendrymerów. Agregaty utworzone przez dendrymery G6,5 (NH3) i G8 (NH3) oraz przez dendrymery G8,5 (NH3) i G8 (NH3) zapewniają znaczny wzrost skuteczności transfekcji w porównaniu z macierzystymi dendrymerami pełnych generacji, jeśli przy wytwarzaniu agregatów zastosuje się w odpowiednim stosunku dendrymery zakończone aminą i dendrymery zakończone karboksylanem sodu.
Przykład 35. Wytwarzanie dendrymerów zmodyfikowanych lizyną i badania transfekcji z wykorzystaniem zmodyfikowanych wektorów dendrymerowych (fig. 57)
Do intensywnie mieszanego roztworu G7 (NH3) (0,50 g, 11 μmoli) w bezwodnym dimetyloformamidzie szybko dodano p-nitrofenylowy ester N,N'-di-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny. Po około 5 minutach pH mieszaniny doprowadzono do około 8,5 za pomocą trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny, po czym powoli dodano ją do intensywnie mieszanej wody. Następnie dodano trietyloaminę (0,6 ml) i nasycony roztwór NaCl (35 ml) do wodnej mieszaniny, którą mieszano przez kolejne 2 dni. Supematant zdekantowano i odzyskany surowy produkt wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 40°C przez 12 godzin. Wysuszony, surowy produkt intensywnie mieszano w eterze etylowym, przesączono i przemyto dodatkową porcją eteru dietylowego. Analiza NMR wysuszonego stałego produktu (0,96 g,
182 237
78% wydajności) potwierdziła przyłączenie grup N,N'-di-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny do powierzchni dendrymeru.
Następnie usunięto chroniące grupy tert-butoksykarbonylowe z reszt lizynowych rozpuszczając produkt (0,35 g, 3,3 pmola) w bezwodnym chlorku metylenu i powoli dodając do mieszaniny kwas trifluorooctowy (3 ml). Wydzielające się gazy usunięto z kolby w strumieniu azotu. Po 3 godzinach mieszaninę zatężono w strumieniu azotu (40°C) i próbkę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano na drodze dializy (membrana odcinająca ciężar cząsteczkowy 10 000) przez 24 godziny względem 1 litra wody. Po usunięciu stałych cząstek przez filtrację i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem oddzielono bezbarwną substancję stałą (0,26 g, 69% wydajności). Analiza produktu metodami spektroskopii Ή i l3C rezonansu magnetycznego jądrowego, chromatografii wykluczenia według wielkości, elektroforezy kapilarnej i elektroforezy na żelu poliakryloamidowym potwierdziły prawidłową strukturę.
Na fig. 57 względne jednostki światła/pg uzyskanego białka dla transfekcji w komórkach RAT2 z wykorzystaniem dendrymeru G7 (NH3) zmodyfikowanego lizyną z niemodyfikowanymi dendrymerami od G7 (NH3) do G10 (NH3) (we wszystkich przypadkach przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:10 i w obecności DEAE-dekstranu). Dendrymer modyfikowany lizyną zapewnia nieoczekiwanie wysoką skuteczność transfekcji w porównaniu z niemodyfikowanym dendrymerem tej samej generacji, a w rzeczywistości skuteczność transfekcji jest zbliżona do transfekcji dla niemodyfikowanego dendrymeru G10 (NH3).
Przykład 36. Skuteczność transfekcji w liniach komórek COS 1 i RAT2 z wykorzystaniem polidyspersyjnych mieszanin dendrymerów (fig. 58).
W przykładzie tym DNA skompleksowano z dendrymerem G11 (EDA), mieszaniną dendrymerów G11, G3, G2 i G1 (EDA) oraz polidyspersyjną mieszaniną dendrymerów o składzie podanym poniżej w tabeli XVII.
Tabela XVII
Próbka Dendrymer lub kontrolna Stosunek ładunków DNAidendrymer
1 Gil (EDA) 1:10
1 Gil (EDA) 1:20
1 Gil (EDA) 1:100
2 Mieszanina 1 (EDA)8 1:10
2 Mieszanina 1 (EDA)a 1:20
2 Mieszanina 1 (EDA)a 1:100
3 Mieszanina 2 (EDA)b 1:10
3 Mieszanina 2 (EDA)b 1:20
3 Mieszanina 2 (EDA)b 1:100
4 Qc 1:10
4 Qc 1:20
4 Qc 1:100
5 Lipofectamine™ 6 □ L
5 Lipofectamine™ 10 □ L
a = mieszanina dendrymerów G1 (EDA), G2 (EDA) i G3 (EDA) b = mieszanina 90% Gl 1 (EDA) i 10% mieszaniny 1 c = mieszanina dendrymerów opisanych w przykładzie 3, polidyspersyjną mieszanka dendrymerów
Uzyskane wyniki transfekcji z wykorzystaniem tych kompleksów przedstawiono na fig. 58. W komórkach COS 1 skuteczność transfekcji osiągnięta w przypadku polidyspersyjnej mieszani
182 237 ny była o wiele wyższa niż przy zastosowaniu G11 (EDA), mieszanki G11, G1, G2 i G3 (EDA) lub Lipofectamine™. Różnica jest szczególnie duża przy stosunkach ładunków 1:10 i 1:20. Jednakże porównanie wyników dla linii COS 1 i RAT2 wykazuje różnice w skuteczności transfekcji dla dwóch rodzajów komórek przy zastosowaniu preparatów dendrymerów tego samego typu. Tak np. okazało się, że polidyspersyjna mieszanka (dendrymer Q z przykładu 42) jest mniej skuteczny w transfekcji komórek RAT2 niż COS 1. Właściwość ta może być przydatna w przenoszeniu genów.
Przykład 37 (fig. 60, zdjęcia 1 i 2)
W celu sprawdzenia, czy kompleksy DNA:dendrymer można zastosować do transfekcji komórek in vivo komórki czerniaka D5 zaszczepiono podskórnie jednorodnym myszom. Do nowotworów o średnicy około 0,5 cm, które rozwinęły się, wstrzyknięto bezpośrednio DNA RSV-p-gal, sam lub w postaci skompleksowanej z dendrymerem Gil (EDA), a także sam dendrymer w próbie kontrolnej. Po 24 godzinach zwierzęta uśmiercono i nowotwory utrwalono formaliną, wycięto i zabarwiono środkiem X-gal, aby wykryć ekspresję enzymu β-galaktozydazy. Na fig. 60, zdjęcie 1 zaobserwować można znaczne ilości komórek wykazujących zajście transfekcj i (barwienie X-gal) w nowotworze, w który wstrzyknięto kompleks DNA:dendrymer w porównaniu z zabarwieniem tła (nowotwór z wstrzykniętym dendrymerem, zdjęcie 2). W przypadku żadnego z nowotworów nie zaobserwowano toksyczności lub uszkodzenia tkanki. Barwienie nowotworów, którym wstrzyknięto sam DNA, nie wykazało ekspresji, co wskazuje, że transfekcja in vivo ulega wzmocnieniu poprzez zastosowanie kompleksów DNA:dendrymer.
Przykład 38. Porównanie aktywności środka Luciferase™ w komórkach RAT2 po transfekcji opartymi na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzionymi dendrymerami oraz dendrymerami G8 (NH3) i G11 (EDA) typu gęstej gwiazdy
W przykładzie tym porównano pod względem zdolności do transfekcji oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery z dendrymerami typu gęstej gwiazdy. Oparte na lizynie dendrymery wytworzono zasadniczo sposobami podanymi w patentach USA nr 4 289 872, 4 360 646 i 4 410 688. Przeprowadzono próby transfekcji w obecności i bez DEAE-dekstranu. Stosunek ładunków DNA:dendrymeru we wszystkich przypadkach wynosił 1:5. Zastosowano taką ilość kompleksu DNA:dendrymer, aby wprowadzić 1 pg DNA/studzienkę. W kolumnach 1-16 zastosowano następujące dendrymery.
1. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G1 z rdzeniem TREN, opartego na lizynie
2. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G2 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie.
3. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G3 z rdzeniem TREN, opartego na lizynie
4. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G4 z rdzeniem TREN, oparty na lizynie.
5. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G5 z rdzeniem TREN, opartego na lizynie
6. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G1 z rdzeniem BHA, oparta na lizynie
7. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G2 z rdzeniem BHA, opartego na lizynie
8. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G3 z rdzeniem BHA, oparta na lizynie
9. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G4 z rdzeniem BHA, opartego na lizynie
10. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G5 z rdzeniem BHA, oparta na lizynie
11. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G6 z rdzeniem BHA, opartego na lizynie
12. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G7 z rdzeniem BHA, oparta na lizynie
13. Sól trifluorooctanowa niesymetrycznie rozgałęzionego dendrymeru G8 z rdzeniem BHA, opartego na lizynie
182 237
14. Niesymetrycznie rozgałęziony dendrymer G8 z rdzeniem BHA, oparty na lizynie, nie będący w formie soli trifluorooctanowej;
15. Dendrymer G8 (NH3) typu gęstej gwiazdy; oraz
16. Dendrymer Gil (EDA) typu gęstej gwiazdy.
Jak można stwierdzić z fig. 62, oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery zapewniają znaczącą transfekcję przy generacjach G4 i G5, zwłaszcza przy rdzeniu TREN. Wydaje się, że sole trifluorooctanowe niesymetrycznie rozgałęzionych dendrymerów hamują transfekcję w przypadku dendrymerów z rdzeniem BHA. Okazało się, że dendrymer G8 z rdzeniem BHA w nieobecności soli trifluorooctanowej zapewnia dobrą transfekcję.
Podobnie jak w przypadku dendrymerów typu gęstej gwiazdy również oparte na lizynie, niesymetrycznie rozgałęzione dendrymery zapewniają doskonałą transfekcję przy stosunku ładunków DNA:dendrymer 1:5 w obecności DEAE-dekstranu.
Inne rozwiązania według wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z opisem lub realizacji ujawnionego wynalazku. Cele opisu i przykładów należy przyjmować jedynie przykładowo, a rzeczywisty zakres i istotę wynalazku podano w zastrzeżeniach.
182 237
182 237
FIG.
182 237
FIG.
(A) (B) (C)
182 237
1400000
Względne jednostki światła/pg białka
Numer próbki
182 237
23456789 1011 1213141516
1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
FIG. I3
182 237
O-CM
Generacja dendrymeru · Rdzeń NH, ----- Rdzeń EDA
45000
Procent wzrostu transfekcji w stosunku do dekstranowej próby kontrolnej
182 237
FIG.15
Względne jednostki światła/pg białka
DNA skompleksowany z dendrymerem G9 a następnie dodanym dendrymerem G5
DNA skompleksowany z dendrymerem G5· a następnie dodanym dendrymerem G9
182 237
Względne jednostki światła/pg białka
FIG.16
DNA skompleksowany z dendrymerem G9 a następnie dodanym dendrymerem G5
DNA skompleksowany z dendrymerem G5 a następnie dodanym dendrymerem G9
182 237
FIG. 17
Numer próbki
Względne jednostki światła (na pg białka)
182 237
FIG.I8
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24
Względne jednostki światła (na pg białka)
182 237
0000001
Względne jednostki światła/pg biaŁka
Typ dendrymeru i stosunek DNA:dendrymer
182 237
2 34 5 678910111213141516
FIG. 20
182 237
F1G.2I
1(/ impulsów/104 komórek
GODZINY
- »—23 bp ss DNA — •—DNA/ DendrymerG8 NH^ — A— DNA/ Dendrymer G8 NH^ plus NaN-z
182 237
FIG.22
Względne Jednostki światła/pg białka
10000000ą
9000000
8000000
7000000
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
I000000 i r
G8 G8 Gil Gil G8 G8 Gil Gil
3 4 5 6 7 8 bez dekstrantJl m 0.5jjM DEAE- dekstran
182 237
FIG. 23A
FIG. 23 B
182 237
3 A 5 6 7 6 9 10 11 12
FIG. 23D
182 237
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13
F I G. 24
182 237
2 3 4 5 6 7 8 9 10 Η 12 131415161718 19 20
FIG. 25
182 237
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
FIG. 26A
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
FIG. 26B
182 237
2 3 4 5 6 7 8
FI G. 27
FIG. 28
182 237
16000000
182 237
18000000
FIG. 30
Względne jednostki światła na pg białka
16000000
14000000
12000000
10000000
8000000
600000040000002000000-
o 0.0001 0.001 0.01 0.1
Stosunek ładunków DNA:dendrymer
100 1000
G9 EDA
-O- G9 EDA + DEAEdekstran
G9 NH3 + DEAEdekstran
G9 NH3
182 237
FIG.3I
Względne jednostki światła/gg białka
30000000 , 25000000 1 20000000
15000000
10000000
5000000 '
I 0.1 0.01
Stosunek ładunków DNA:dendrymer
G8NH3
Gil EDA
182 237
CO
ΛΗ a £>
FIG. 32 taO
CO £2000000 -r «0' '“1OOOOOOO -
to
Stosunek ładunków DNA:dendrymer «8000000 -c.
Ό •^000000 -c' ^4000000 -taO.
N *2000000 -
DEAEdekstran —φ— Roztwór soli z buforem Hanksa
182 237
FIG. 33
Procent wzrostu transfekcji (w stosunku do dekstranowej próbki kontrolnej)
stosunek ładunków 1-5 stosunek ładunków I 10 stosunek ładunków
182 237
FIG. 34
Względne jednostki światła/pg białka
16000000140000004
120000004
100000004 80000004 60000004 40000004 20000004
0— — o o —— — rr\
Próba kontrolna Plazmid/DEAE-dekstran
Stosunek ładunków DNA/Dendrymer
DEAE - dekstran bez dekstranu
182 237
FIG. 35
Stężenie DEAE-Dekstranu 2^Μ IjuM 0.5 jUM 0.25 juM 0.125 uM OuM 25000000π--------—i—--r — i-----------1——------—।-----O OJ in
O O O
na pg białka
100 Plazmid
100 plazmid
100 Plazmid kontr.
100 Plazmid kontr.
100 Plazmid kontr.
kontr.
kontr.
|; 100 Plazmid kontr. 1-50 l· 10 H5
Względne jednostki światła
182 237
FIG. 36
182 237
182 237 ro ω
30000000
Względne jednostki światła (na pg białka)
O
O
O
O m
o <o
OJ o o o o o o o o o o ID
ΓΙΟ Oj 1-55
CO
ΙΊ
25μΙ*
I2.5pli
2ul5 co tM l· 10~
DEAE Dekstran kontrolny 20pl lOpl
2μΙ
110 h5
Plazmid kontrolny
Dendrymer GB NH,
Dendrymer Gil EDA z DEAE— dekstranem
Lipofektyna
Dendrymer G8 NH^
DEAE Dekstran
Lipofektarnina
182 237
FIG. 39
względne jednostki światła/pg białka
1/-.7-:1= DEAE Dekstran z etapem DMSO
DEAE Dekstran bez etapu DMSO (^33 ~ tez DEAE-Dekstran, z etapem DMSO b | -|-R = bez DEAE-Dekstran. bez etapu DMSO
182 237
I 200000
182 237
FIG. 41
182 237
ID
ID ro
OJ
ID ro
ID
OJ
Stężenie surowicy
450000
Względne jednostki światła na pg białka
0.05 μΜ G8NH3
0.5 μΜ G8NH3 jął Ο.ΙμΜ G8NH3
bez dendrymeru
182 237
FIG.43
1:10
182 237
Względne jednostki światła/gg białka
FIG. 44
Transfekcję bez DEAE-dekstranu Transfekcję z DEAE-dekstranein
Czas od transfekcji do zbioru
godzin godzin godzin
141 godzin
182 237
FIG. 45
% Obumarłych komórek
Dendrymer-DEAE Dekstran
Dendrymer GS z rdzeniem NH, 3
Dendrymer G8 z rdzeniem EDA
182 237
FIG. 46
’ PRÓBA KONTROLNA l6.75jugG8 EDA 3.35/jgG8 EDA l6.5/igG8NH3 3.3/jgG8 NH3 PRÓBA KONTROLNA IG.75/jgG8 EDA 3.35jugG8 EDA l6.5/igG8 NH3 3.3/jgG8 NH3 próba kontrolna l675jugG8EDA 3.35/igG8 EDA l6.5/jgG8NH3 3.3juqG8NH3 PRÓBA KONTROLNA !6.75/jgG8EDA 3.35/jgG8 EDA l6.5/jgG8NH3 3.3jugG8NH3 PRÓBA KONTROLNA l6.75/jgG8EDA 3.35jugG8EDA l6.5/igG8 NH3 3.3jugG8 NH3 PRÓBA KONTROLNA l6.75jugG8EDA 3.35jugG8EDA l6.5jugG8 NH3 33/igG8NH3 3RÓBA KONTROLNA 16.75/jgEDA 3.35/jgG8EDA l6.5jugG8NH3 3.3aiqG8 NH3 PRÓBA KONTROLNA !6.75jugEDA 3.35jug G8 EDA l6.5/jgG8NH3 3.3jugG8NH3 o o o o o o o o o o o o o CO L- ID lO rO OJ ~ % Obumarłych komórek | tez DEAE-dekstranu
O.5/jM
DEAE-dekstran
182 237
2 cpm/IO^ komórek
co \O s o bć
182 237
FIG. 47D FIG. 47E FIG. 47F
182 237
182 237
FIG 49
182 237
182 237
F1G.5IA
FIG.5IC
182 237
Liczba Klonów
FIG.52
400 n
350- I
300^
2507
200 7
1507
IOO: 5 o 4-*—---1 -----r~—nnn ]——ttt
3 4
Nr doświadczenia
Klony oporne na g418
Klony wytwarzające Beta- galaktozydazy
182 237
Liczba Klonów
FIG.53
Klony oporne na G418
Klony, w których zachodzi ekspresja
182 237
Kolonie na 1 x 10 komórek
FIG.54
Numery próbek
182 237
F I G.55A
Liczba komórek Liczba komórek
FI G.55B
182 237
FIG.55C
F I G.55D
200 χ 160 ω \o
I 120 λ co
S θο
O
182 237
Liczba komórek Liczba komórek
FIG.55E
F I G.55F
182 237
FIG.56
Względne jednostki światła na gg białka
Próbki
182 237
Względne jednostki światła na gg białka
FIG.57
Próbki
182 237
Numery próbek
1000000
Względne jednostki światła na 3 pg białka komórkowego
182 237
G. 59
182 237
FI G. 60A
182 237
182 237
800000
Względne jednostki światła na 3 pg białka
182 237
□ Sam DMEM
S 0.5 μΜ DEAE-dekstran ® 25 gg/ml chlorochiny
800000-η
Względne jednostki światła na 3 pg białka
182 237
20000000
Względne jednostki światła na pg białka
Bez DEAE-dekstran
Ul z DEAE-dekstran
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiągnięcia biodostępności materiału genetycznego in vitro i ex vivo, znamienny tym, że komórki, które mająbyć transfekowane, kontaktuje się z kompleksem polimeru dendrytowego z materiałem genetycznym, w którym stosunek ładunków materiału genetycznego do dendrymeru wynosi od około 1:1 do około 1:100, w roztworze DEAE -dekstranu lub gliceryny, przy czym polimer dendrytowy stanowi co najmniej; jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymetr, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
  2. (2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a - Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe.
    2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kompleks, w którym do polimeru dendrytowego przyłączony jest prowadnik docelowy.
    3. Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiągnięcia biodostępności materiału genetycznego in vitro i ex vivo, znamienny tym, że wytwarza się kompleks materiału genetycznego z pierwszym polimerem dendrytowym, który stanowi co najmniej jeden rozpuszczalny w rozpuszczalniku, promieniowo symetryczny dendrymer, który zawiera co najmniej jedną gałąź wychodzącą z rdzenia, która to gałąź zawiera co najmniej jedną grupę końcową, z tym że (1) stosunek grup końcowych do gałęzi rdzenia wynosi dwa lub więcej;
    (2) gęstość grup końcowych w przeliczeniu na jednostkę objętości polimeru jest co najmniej 1,5 razy większa od gęstości wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego o podobnym rdzeniu i składnikach monomerycznych mającego porównywalny ciężar cząsteczkowy i liczbę gałęzi, przy czym każda z gałęzi wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego zawiera tylko jedną grupę końcową; oraz (3) objętość cząsteczki wyznaczona na podstawie badania wymiarów z wykorzystaniem skalowanych modeli cząsteczkowych Core/a-Paulinga stanowi nie więcej niż około 80% objętości cząsteczki wydłużonego konwencjonalnego polimeru gwiaździstego, a polimer zawiera regularne rozgałęzienia dendrytowe, po czym kompleks ten umieszcza się w roztworze zawierającym drugi polimer dendrytowy, określony jak wyżej, ale którego cząstki są większe niż pierwszego polimeru dendrytowego; oraz kontaktuje się wytworzony kompleks i drugi polimer dendrytowy z komórkami, które mają być transfekowane.
    4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do co najmniej jednego spośród pierwszego i drugiego polimeru dendrytowego przyłączony jest prowadnik docelowy.
    ♦ * ♦
    182 237
PL95335982A 1994-03-07 1995-03-07 Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL PL182237B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20749494A 1994-03-07 1994-03-07
US31653694A 1994-09-30 1994-09-30
PCT/US1995/003045 WO1995024221A1 (en) 1986-08-18 1995-03-07 Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL182237B1 true PL182237B1 (pl) 2001-11-30

Family

ID=26902287

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95311633A PL181064B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy
PL95335982A PL182237B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95311633A PL181064B1 (pl) 1994-03-07 1995-03-07 Kompleks polimeru typu gęstej gwiazdy, kompozycja do przenoszenia materiału genetycznego i sposób wytwarzania kompleksu polimeru typu gęstej gwiazdy

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5714166A (pl)
EP (1) EP0699079B1 (pl)
JP (1) JPH08510761A (pl)
KR (1) KR100357839B1 (pl)
AT (1) ATE277640T1 (pl)
AU (1) AU2118195A (pl)
CA (1) CA2161684C (pl)
DE (2) DE699079T1 (pl)
ES (1) ES2104518T1 (pl)
FI (1) FI955320L (pl)
GR (1) GR970300044T1 (pl)
IL (7) IL128773A (pl)
MX (1) MX9504664A (pl)
NO (1) NO317691B1 (pl)
PL (2) PL181064B1 (pl)
RU (1) RU2127125C1 (pl)
WO (1) WO1995024221A1 (pl)
ZA (1) ZA951877B (pl)

Families Citing this family (320)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3938992A1 (de) 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
JP4074658B2 (ja) * 1992-04-03 2008-04-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 自己構築ポリヌクレオチド送達システム
US6113946A (en) * 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US6537579B1 (en) 1993-02-22 2003-03-25 American Bioscience, Inc. Compositions and methods for administration of pharmacologically active compounds
US20070117862A1 (en) * 1993-02-22 2007-05-24 Desai Neil P Novel formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
CA2206915A1 (en) * 1994-12-21 1996-06-27 Konstantinos Skobridis Oligonucleotide-dendrimer conjugates
US6165988A (en) * 1995-02-10 2000-12-26 Christian Noe Medicament in particulate form
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US7141676B1 (en) * 1996-02-08 2006-11-28 University Of Washington Water soluble multi-biotin-containing compounds
AU734420B2 (en) * 1996-04-15 2001-06-14 Nymox Corporation Compositions containing bacteriophages and methods of using bacteriophages to treat infections
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040171031A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6893664B1 (en) * 1996-06-17 2005-05-17 Powderject Research Limited Particle delivery techniques
US20050003431A1 (en) * 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
DE19726340C2 (de) * 1996-08-16 1999-05-06 Schering Ag Zinndendrimere, ihre Verwendung als Röntgenkontrastmittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
GB9623051D0 (en) * 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
CA2281684C (en) 1997-02-28 2006-08-29 The Regents Of The University Of California Inhibition of cell-cell binding by lipid assemblies
ES2353840T3 (es) * 1997-04-21 2011-03-07 California Institute Of Technology Recubrimientos tisulares poliméricos multifuncionales.
PT1023050E (pt) * 1997-06-27 2013-12-04 Abraxis Bioscience Llc Novas formulações de agentes farmacológicos, métodos para a sua preparação e métodos para a sua utilização
DE19728954C1 (de) * 1997-06-30 1999-04-22 Schering Ag Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
AU707186B2 (en) * 1997-07-01 1999-07-01 Transgene S.A. Compositions useful for transferring therapeutically active substances into a target cell, and their use in gene therapy
US5929049A (en) * 1997-08-08 1999-07-27 Dade Behring Marburg Gmbh Polysaccharide conjugates of biomolecules
US20040072937A1 (en) * 2001-02-10 2004-04-15 Tomalia Donald A. Nanocomposites of dendritic polymers
DE19743135A1 (de) * 1997-09-30 1999-04-01 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine
DE19758105A1 (de) * 1997-12-18 1999-06-24 Schering Ag Dendritische Polymer-Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US6475994B2 (en) * 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
US6537813B1 (en) * 1998-02-13 2003-03-25 Selective Genetics, Inc. Concurrent flow mixing methods and apparatuses for the preparation of gene therapy vectors and compositions prepared thereby
CA2295510A1 (en) * 1998-05-06 1999-11-11 Transgene S.A. Use of a nuclease inhibitor or interleukin-10 (il-10) for the preparation of a therapeutic composition for improving transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
US7157418B1 (en) 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US20030215421A1 (en) * 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US5962423A (en) * 1998-08-07 1999-10-05 The Governors Of The University Of Alberta Treatment of bacterial dysentery
US6310043B1 (en) 1998-08-07 2001-10-30 Governors Of The University Of Alberta Treatment of bacterial infections
US6333051B1 (en) * 1998-09-03 2001-12-25 Supratek Pharma, Inc. Nanogel networks and biological agent compositions thereof
US6696089B2 (en) * 1998-09-03 2004-02-24 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Nanogel networks including polyion polymer fragments and biological agent compositions thereof
JP4854853B2 (ja) * 1998-11-12 2012-01-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トランスフェクション薬剤
US6224935B1 (en) 1999-01-28 2001-05-01 Cornell Research Foundation, Inc. Ordered arrays via metal-initiated self-assembly of ligand containing dendrimers and bridging ligands
US6306662B1 (en) * 1999-02-04 2001-10-23 Texas Tech University Fingerprint development methods
JP2002537426A (ja) * 1999-02-16 2002-11-05 ザ ダウ ケミカル カンパニー コア−シェル型テクトデンドリマー
FR2790642A1 (fr) * 1999-03-08 2000-09-15 Aventis Cropscience Sa Nouvelles compositions pesticides et/ou regulatrices de croissance
US6251927B1 (en) 1999-04-20 2001-06-26 Medinox, Inc. Methods for treatment of sickle cell anemia
EP1196199A4 (en) * 1999-06-02 2002-06-19 Univ Washington WATER-SOLUBLE MULTI-BIOTIN COMPOUNDS
US6656730B1 (en) * 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
GB9915231D0 (en) 1999-06-29 1999-09-01 Pfizer Ltd Pharmaceutical complex
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
DE19933024C2 (de) * 1999-07-15 2003-03-13 Medinnova Ges Med Innovationen Kationische Blockcopolymere
DE19936997B4 (de) * 1999-08-02 2007-06-14 Biolitec Ag Verfahren zur Applikation von Photosensibilisatoren (PS) mittels Multiplikatoren in der photodymamischen Therapie
US6548248B1 (en) * 1999-11-10 2003-04-15 Propper Manufacturing Co., Inc. DNA sterilization indicator
FR2801592B1 (fr) * 1999-11-25 2002-02-22 Centre Nat Rech Scient Dendrimeres phosphores et leurs applications comme agents de transfection
NL1013942C2 (nl) * 1999-12-23 2001-06-26 Dsm Nv Multifunctionele thermisch-oxidatieve stabilisator.
WO2001047563A1 (en) 1999-12-28 2001-07-05 Transgene S.A. Use of lithium (li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
CN1433478A (zh) * 1999-12-30 2003-07-30 诺瓦提斯公司 用于基因治疗的新的胶体合成载体
EP1118333A1 (en) * 2000-01-18 2001-07-25 Eurand International S.P.A. Compositions with enhanced oral bioavailability
US20040146918A1 (en) * 2000-02-18 2004-07-29 Weiner Michael L. Hybrid nucleic acid assembly
DE10016881B4 (de) * 2000-04-05 2006-06-01 Qiagen Gmbh Gezielte Transfektion von Zellen mittels biotinyliertem Dendrimer
DE10019135A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6471968B1 (en) 2000-05-12 2002-10-29 Regents Of The University Of Michigan Multifunctional nanodevice platform
US6716450B1 (en) 2000-05-18 2004-04-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Enhancing protein activity through nanoencapsulation
US20040120979A1 (en) * 2000-06-02 2004-06-24 Roessler Blake J. Delivery systems comprising biocompatible and bioerodable membranes
US6410680B1 (en) * 2000-06-21 2002-06-25 Dendrimolecular, Inc. Dendrimer constructs and metal complexes thereof having superoxide dismutase activity
WO2002026867A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 The Regents Of The University Of California Dendrimeric support or carrier macromolecule
US6350819B1 (en) 2000-10-27 2002-02-26 Union Carbide Chemicals & Plastics Technology Corporation Dendritic macromolecules for metal-ligand catalyzed processes
AU2002245206A1 (en) * 2001-01-08 2002-07-30 Tropix, Inc. Dendritic chemiluminescent substrates
RU2218913C2 (ru) * 2001-01-24 2003-12-20 Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Препарат интерферона
FR2820434A1 (fr) * 2001-02-05 2002-08-09 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'oligonucleotides pour ameliorer la transfection des plasmides dans les cellules, procede et kit de transfection
JP2004523624A (ja) * 2001-02-26 2004-08-05 デューク ユニバーシティ 新規なデンドリティックポリマー、およびその生物医学的使用
US20020146684A1 (en) * 2001-04-09 2002-10-10 Meldal Morten Peter One dimensional unichemo protection (UCP) in organic synthesis
US6939564B2 (en) * 2001-06-08 2005-09-06 Labopharm, Inc. Water-soluble stabilized self-assembled polyelectrolytes
US6780428B2 (en) 2001-06-08 2004-08-24 Labopharm, Inc. Unimolecular polymeric micelles with an ionizable inner core
WO2003001218A2 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Macromolecular imaging agents for liver imaging
GB0119001D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Use of dendrimers and poly-branched molecules to enhance signal in fluorescent assay systems
US7314956B2 (en) 2001-08-08 2008-01-01 Vaxim, Inc. Multifunctional carrier for the delivery of a pharmacological agent or genetic material into a cell
US9201067B2 (en) * 2003-03-05 2015-12-01 Posco Size-controlled macromolecule
US20030054042A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Elaine Liversidge Stabilization of chemical compounds using nanoparticulate formulations
AU2002326950A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-01 Pe Corporation (Ny) Membrane transportable fluorescent substrates
US7906102B2 (en) 2001-10-03 2011-03-15 Vanderbilt University Ligands to radiation-induced molecules
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
GB0125216D0 (en) * 2001-10-19 2001-12-12 Univ Strathclyde Dendrimers for use in targeted delivery
CN101327326A (zh) * 2001-10-29 2008-12-24 哥伦比亚实验室(百慕大群岛)有限公司 阴道给药治疗骨盆痛和不孕症的抗节律障碍剂
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
EP1527341B1 (en) * 2001-11-20 2009-06-17 Duke University Interfacial biomaterials
US7060498B1 (en) * 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US20040009495A1 (en) * 2001-12-07 2004-01-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products related to drug screening using gene expression patterns
JP4632664B2 (ja) 2002-02-13 2011-02-16 デューク ユニバーシティ 非ペプチド結合ストレス応答性ポリペプチドによる免疫応答の調節
US20040131582A1 (en) * 2002-02-26 2004-07-08 Grinstaff Mark W. Novel dendritic polymers and their biomedical uses
US6984734B2 (en) 2002-02-26 2006-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Cyclo[n]pyrroles and methods thereto
US7635463B2 (en) * 2002-02-27 2009-12-22 Pharmain Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials
ATE494010T1 (de) * 2002-02-27 2011-01-15 Pharmain Corp Zusammensetzungen zur abgabe von therapeutika und anderen materialien und verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
CA2479665C (en) * 2002-03-20 2011-08-30 Elan Pharma International Ltd. Nanoparticulate compositions of angiogenesis inhibitors
US20080220075A1 (en) * 2002-03-20 2008-09-11 Elan Pharma International Ltd. Nanoparticulate compositions of angiogenesis inhibitors
US20030180250A1 (en) * 2002-03-22 2003-09-25 Council Of Scientific And Industrial Research Compositions and complexes containing a macromolecular compound as potential anti-inflammatory agents
GB0209022D0 (en) 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
GB0220080D0 (en) * 2002-08-29 2002-10-09 Isis Innovation Blended dendrimers
US20050271615A1 (en) * 2002-08-30 2005-12-08 Doron Shabat Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
BR122012021252B8 (pt) 2002-09-06 2021-05-25 Cerulean Pharma Inc polímeros à base de ciclodextrina para o fornecimento de agentes terapêuticos ligados a eles por covalência
JP3970811B2 (ja) * 2002-09-09 2007-09-05 独立行政法人科学技術振興機構 リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法
JP4430344B2 (ja) * 2002-09-09 2010-03-10 独立行政法人科学技術振興機構 多岐用途型リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法
WO2004030631A2 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Chiron Corporation Anti-cancer and anti-infectious disease compositions and methods for using same
EP2957568B1 (en) * 2002-11-05 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2002953073A0 (en) * 2002-11-21 2003-01-16 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of biotin-mediated targeting
AU2003283205A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-18 Danmarks Fodevare- Og Veterinaerforskning Dendrimer conjugates for selective of protein aggregates
EP1587908A4 (en) * 2003-01-09 2008-02-20 Invitrogen Corp RELEASE AND ACTIVATION OF COMPLEX CELLS OF POLYPEPTIDES AND NUCLEIC ACIDS
US20090186343A1 (en) * 2003-01-28 2009-07-23 Visigen Biotechnologies, Inc. Methods for preparing modified biomolecules, modified biomolecules and methods for using same
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
WO2004078140A2 (en) 2003-03-05 2004-09-16 Halozyme, Inc. SOLUBLE HYALURONIDASE GLYCOPROTEIN (sHASEGP), PROCESS FOR PREPARING THE SAME, USES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEREOF
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
US8969543B2 (en) * 2003-04-03 2015-03-03 Bioneer Corporation SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
US8324365B2 (en) * 2003-04-03 2012-12-04 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP1616957B1 (en) * 2003-04-18 2017-05-17 National Cerebral and Cardiovascular Center Vector
US20040258614A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 University Of Maryland, Baltimore Microparticles for microarterial imaging and radiotherapy
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
WO2005014035A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
AU2004272081A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Bankruptcy Estate Of Ferx, Inc. Magnetically targetable particles comprising magnetic components and biocompatible polymers for site-specific delivery of biologically active agents
EP1525890A1 (en) 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
US20050085417A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-21 Thomas Jefferson University Compounds and methods for diagnostic imaging and therapy
CA2545653C (en) * 2003-11-21 2014-07-08 Anp Technologies, Inc. Asymmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP1696974B1 (de) * 2003-12-19 2007-05-23 Basf Aktiengesellschaft Quellbare hydrogelbildende polymere mit geringem feinstaubanteil
US20050171424A1 (en) * 2004-01-13 2005-08-04 The Gov. Of The Usa As Rep. By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services Methods for imaging the lymphatic system using dendrimer-based contrast agents
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
EP1737899B1 (en) 2004-04-20 2015-07-08 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
WO2005112977A2 (en) * 2004-04-23 2005-12-01 Pharmain, Ltd. Compositions for treatment with glucagon-like peptide, and methods of making and using the same
CA2569419A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
EP1796537A4 (en) * 2004-08-25 2012-03-07 Univ Michigan DENDRIMER BASED COMPOSITIONS AND METHOD FOR THEIR USE
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
JP2006096870A (ja) * 2004-09-29 2006-04-13 Stella Chemifa Corp ホウ素含有化合物
US20060078535A1 (en) * 2004-10-13 2006-04-13 The Regents Of The University Of Michigan Anticancer compounds and methods
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7794699B2 (en) * 2005-01-05 2010-09-14 Michigan Molecular Institute Nano-structured blood substitutes
NZ556436A (en) * 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006086391A2 (en) * 2005-02-07 2006-08-17 Massachusetts Institute Of Technology Electrochemically-degradable layer-by-layer thin films
EP1879551A2 (de) * 2005-02-21 2008-01-23 Basf Aktiengesellschaft Wirkstoffzusammensetzung die wenigstens ein stickstoffatomhaltiges, hyperverzweigtes polymer enthält
US20060204443A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Methods for tumor treatment using dendrimer conjugates
WO2006102484A2 (en) * 2005-03-21 2006-09-28 Anp Technologies, Inc. Symmetrically branched polymer conjugates and microarray assays
US9187546B2 (en) * 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
MX2007010402A (es) 2005-04-20 2008-01-22 Dendritic Nanotechnologies Inc Polimeros dendriticos con amplificacion mejorada y funcionalidad interior.
US8563329B2 (en) * 2005-05-02 2013-10-22 Anp Technologies, Inc. Polymer conjugate enhanced bioassays
KR100667171B1 (ko) * 2005-05-10 2007-01-12 서애희 세포내 물질전달용 ｐａｍａｍ 유도체 및 이를 이용한세포내 원하는 물질의 전달방법
US20060269480A1 (en) * 2005-05-31 2006-11-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Multi-triggered self-immolative dendritic compounds
JP2009501245A (ja) * 2005-07-08 2009-01-15 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーおよびアニオン性生物活性因子のトランスフェクション剤としてのそれらの使用
US20070041934A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8114393B2 (en) * 2005-09-14 2012-02-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and compositions for phosphate binding
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CA2629300C (en) 2005-11-17 2014-07-08 Zogenix, Inc. Delivery of viscous formulations by needle-free injection
CU23556A1 (es) * 2005-11-30 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Estructura polimérica semejante a dendrímero para la obtención de conjugados de interés farmacéutico
JP2009520040A (ja) 2005-12-19 2009-05-21 ファーマイン コーポレーション 治療薬の送達のための疎水性コアの担体組成物、及び同担体組成物の作製法及び使用法
TWI311486B (en) * 2005-12-30 2009-07-01 Ind Tech Res Inst Nuclear molecular imaging contrast agent
US9603941B2 (en) * 2006-01-24 2017-03-28 Minghui Chai Method of preparing dendritic drugs
US8263103B2 (en) * 2006-01-31 2012-09-11 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical articles containing biodegradable polymers and acid-neutralizing cationic species
WO2007149500A2 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Formulations containing hybrid dendrimers
US20080020043A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Marc Gingras Dendrimer-Drug Conjugates
US9187532B2 (en) * 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
WO2008035229A2 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Labopharm, Inc. Compositions and methods for ph targeted drug delivery
WO2008057683A2 (en) * 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CN101600448B (zh) * 2006-10-04 2015-11-25 诺和诺德公司 甘油连接的peg化的糖和糖肽
US8232267B2 (en) * 2006-10-06 2012-07-31 The Trustees Of Princeton University Porphyrin catalysts and methods of use thereof
IL178645A0 (en) * 2006-10-16 2007-02-11 Ariel University Res And Dev C Dendrimeric platform for controlled release of drugs
US8268347B1 (en) 2006-10-24 2012-09-18 Aradigm Corporation Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile
US9239329B2 (en) * 2006-12-18 2016-01-19 Japan Science And Technology Agency Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods
WO2008082627A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Divergent synthesis of looped poly (ester)-and poly (ether)- substituted dendrons and dendrimers
DE102007002726A1 (de) * 2007-01-18 2008-07-31 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neue Kaskaden-Polymer-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US20080207822A1 (en) * 2007-02-22 2008-08-28 General Electric Company Composition and associated method
BRPI0809670A8 (pt) * 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
EP2137656A2 (en) * 2007-04-19 2009-12-30 The Regents of the University of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
WO2008134289A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Mallinckrodt Inc. High relaxivity coordinatively unsaturated lanthanide complexes
US20080294089A1 (en) * 2007-06-06 2008-11-27 Biovaluation & Analysis, Inc. Dendritic Polymers for Use in Acoustically Mediated Intracellular Drug Delivery in vivo
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
WO2008157372A2 (en) 2007-06-14 2008-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Self assembled films for protein and drug delivery applications
US8658148B2 (en) 2007-06-22 2014-02-25 Genzyme Corporation Chemically modified dendrimers
US7960336B2 (en) * 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
RU2435851C2 (ru) * 2007-08-13 2011-12-10 Коули Фармасьютикал ГмбХ Мотивы последовательности рнк в контексте определенных межнуклеотидных связей, индуцирующие специфические иммуномодулирующие профили
US8563527B2 (en) * 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
WO2009045536A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Receptor targeted oligonucleotides
PL2214646T3 (pl) 2007-10-05 2021-12-20 Wayne State University Dendrymery do przedłużonego uwalniania związków
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
JP5647899B2 (ja) * 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
US20090176892A1 (en) * 2008-01-09 2009-07-09 Pharmain Corporation Soluble Hydrophobic Core Carrier Compositions for Delivery of Therapeutic Agents, Methods of Making and Using the Same
US8668863B2 (en) 2008-02-26 2014-03-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic macroporous hydrogels prepared by crystal templating
RU2573587C2 (ru) 2008-02-27 2016-01-20 Ново Нордиск А/С Конъюгированные молекулы фактора viii
US8252834B2 (en) 2008-03-12 2012-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
US8575123B2 (en) 2008-04-11 2013-11-05 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CN103550847A (zh) 2008-04-28 2014-02-05 佐吉尼克斯股份有限公司 用于治疗偏头痛的新制剂
US9198875B2 (en) * 2008-08-17 2015-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled delivery of bioactive agents from decomposable films
US8962580B2 (en) 2008-09-23 2015-02-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
US8889635B2 (en) 2008-09-30 2014-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
WO2010042815A2 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Duke University Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
US9017644B2 (en) 2008-11-07 2015-04-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
WO2010054406A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
EP3424939A1 (en) 2009-03-02 2019-01-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid chemical modifications
WO2010123973A1 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Multifunctional metal-chelating ligands
KR102066189B1 (ko) 2009-06-10 2020-01-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
JP2012533064A (ja) 2009-07-08 2012-12-20 エイエヌピー テクノロジーズ， インコーポレイテッド 免疫原性アッセイ
US8518405B2 (en) 2009-10-08 2013-08-27 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibodies and uses therefor
US9856456B2 (en) 2009-10-12 2018-01-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Delivery agent
WO2011059609A2 (en) 2009-10-13 2011-05-19 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer compositions and methods of synthesis
CA2777030C (en) * 2009-10-16 2022-06-07 Dow Agrosciences Llc Use of dendrimer nanotechnology for delivery of biomolecules into plant cells
WO2011059586A2 (en) 2009-10-30 2011-05-19 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
EP2509636B1 (en) 2009-12-07 2017-07-19 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
NZ600725A (en) 2009-12-18 2015-08-28 Univ British Colombia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
ES2640906T3 (es) 2010-03-24 2017-11-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Modelo primate de la familia de los cercopitécidos infectado por una cepa del VHB de genotipo humano
CA2830052C (en) * 2010-03-31 2018-10-09 Wayne State University Injectable dendrimer hydrogel nanoparticles
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
AU2011274229A1 (en) 2010-07-02 2013-01-10 Angiochem Inc. Short and D-amino acid-containing polypeptides for therapeutic conjugates and uses thereof
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US8946194B2 (en) 2010-10-08 2015-02-03 Board Of Regents, University Of Texas System One-step processing of hydrogels for mechanically robust and chemically desired features
US9095558B2 (en) 2010-10-08 2015-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-adhesive barrier membrane using alginate and hyaluronic acid for biomedical applications
AU2011341744B2 (en) 2010-12-14 2016-09-08 Dso National Laboratories Human monoclonal antibody with specificity for dengue virus serotype 1 E protein and uses thereof
CA2824063C (en) * 2011-01-09 2020-02-18 Anp Technologies, Inc. Hydrophobic molecule-induced branched polymer aggregates and their use
US9999673B2 (en) 2011-01-11 2018-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PEGylated lipids and their use for drug delivery
EP2672958A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
CN103687624B (zh) 2011-05-11 2018-02-02 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 靶向的聚合缀合物和其用途
WO2013049328A1 (en) 2011-09-27 2013-04-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
CN102382856B (zh) * 2011-10-25 2013-06-19 上海交通大学 含可降解亚胺键的聚阳离子基因载体、制备方法和复合物
WO2013085718A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
US20130149381A1 (en) * 2011-12-08 2013-06-13 Centro De Investigacion En Quimica Aplicada Absorption method for entrapment of drugs in polymeric nanoparticles
WO2013163234A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Stable layer-by-layer coated particles
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
CA2889044A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Anti apob antisense conjugate compounds
EP3505197B1 (en) 2012-12-11 2023-09-06 Board of Regents, The University of Texas System Hydrogel membrane for adhesion prevention
US11565027B2 (en) 2012-12-11 2023-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydrogel membrane for adhesion prevention
CN105263528A (zh) 2013-02-05 2016-01-20 Anp科技公司 包含紫杉烷的纳米颗粒及其用途
WO2014134029A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid particles, methods and use thereof
US9463244B2 (en) 2013-03-15 2016-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for nucleic acid delivery
CN105188764B (zh) 2013-03-21 2020-03-20 詹尼斯费尔公司 Dna嵌入剂的细胞递送
EP2978446B1 (en) 2013-03-27 2020-03-04 The General Hospital Corporation Anti-cd33 antibody for use in treating alzheimer's disease
US20150148415A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Fundacion Fraunhofer Chile Research Derivatized dendrimer with low citotoxicity for in vivo, ex vivo, in vitro or in situ chelation of heavy metals or actinides
US11135316B2 (en) 2014-01-31 2021-10-05 Washington University Imaging and treatment of pathophysiologic conditions by Cerenkov radiation
US10369124B2 (en) 2014-04-30 2019-08-06 The Johns Hopkins University Dendrimer compositions and their use in treatment of diseases of the eye
US9974870B2 (en) 2014-06-09 2018-05-22 Washington University Compositions and methods for treatment and imaging using nanoparticles
AU2015273353B2 (en) 2014-06-13 2020-09-10 Tenboron Oy Conjugates comprising an anti-EGFR1 antibody
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
CA2956161A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions related to antibody fragments that bind to tumor-associated glycoprotein 72 (tag-72)
US10449261B2 (en) 2014-07-24 2019-10-22 Washington University Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof
CN106573070A (zh) 2014-08-13 2017-04-19 约翰霍普金斯大学 树枝状聚合物到脑肿瘤的选择性传递
ES2727137T3 (es) 2014-08-28 2019-10-14 Halozyme Inc Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario
WO2016038596A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-17 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. AGROCHEMICAL DELIVERY SYSTEM BASED ON ENZYME- OR pH- RESPONSIVE AMPHIPHILIC PEG-DENDRON HYBRIDS
EP3234141A4 (en) 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
WO2017015109A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10869939B2 (en) 2015-08-03 2020-12-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Delivery system in micellar form having modular spectral response based on enzyme-responsive amphiphilic PEG-dendron hybrid polymers
AU2016319133B2 (en) 2015-09-11 2023-06-08 Mark C. Glassy Enhanced delivery of drugs to the brain
CA2999916C (en) 2015-09-23 2021-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for modified dendrimer nanoparticle vaccine delivery
KR20180063885A (ko) 2015-09-24 2018-06-12 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 전이 감소를 위한 방법 및 조성물
WO2017062407A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Genentech, Inc. Systems and methods for predicting vitreal half-life of therapeutic agent-polymer conjugates
RU2611399C1 (ru) * 2016-01-19 2017-02-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Меченые дендримерные пептиды
AU2017220012B2 (en) 2016-02-19 2024-05-02 Code Biotherapeutics, Inc. Nucleic acid carriers and therapeutic methods of use
WO2017143171A1 (en) * 2016-02-19 2017-08-24 Genisphere Llc Nucleic acid carriers and therapeutic methods of use
PL417159A1 (pl) 2016-05-11 2017-11-20 Instytut Biologii Doświadczalnej Im. Marcelego Nenckiego Koniugaty białka prionowego z dendrymerami do zastosowania w leczeniu choroby Alzheimera
US10183058B2 (en) 2016-06-17 2019-01-22 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the progression of prostate cancer
US10172910B2 (en) 2016-07-28 2019-01-08 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the incidence of acute urinary retention
US10532081B2 (en) 2016-09-07 2020-01-14 Nymox Corporation Method of ameliorating or preventing the worsening or the progression of symptoms of BPH
CN110418650A (zh) 2016-11-16 2019-11-05 免疫治疗有限公司 用于治疗过敏的核酸
US10335453B2 (en) 2017-03-01 2019-07-02 Nymox Corporation Compositions and methods for improving sexual function
WO2018165327A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Alafair Biosciences, Inc. Hydrogel medium for the storage and preservation of tissue
BR112019022108A2 (pt) 2017-04-22 2020-05-12 Immunomic Therapeutics, Inc. Construções de lamp aprimoradas
KR20200016224A (ko) 2017-05-02 2020-02-14 이뮤노믹 쎄라퓨틱스, 인크. 암 항원을 포함하는 lamp (리소솜 연관 막 단백질) 구축물
US20190001001A1 (en) * 2017-07-03 2019-01-03 General Electric Company Drug design for application-dependent payload, controlled pharmacokinetic distribution, and renal clearance
JP7122757B2 (ja) * 2017-07-06 2022-08-22 学校法人京都薬科大学 腎ターゲティング型薬物送達用担体
US11419947B2 (en) 2017-10-30 2022-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
CN108299562B (zh) * 2018-02-09 2021-05-28 中国人民解放军陆军军医大学 一种超支化聚合多肽及其制备方法和应用
AU2019266207B2 (en) 2018-05-07 2025-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery
CA3100004A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Immunomic Therapeutics, Inc. Improved lamp constructs comprising allergens
TW202028465A (zh) 2018-09-28 2020-08-01 美商阿尼拉製藥公司 甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其治療或預防ＴＴＲ相關眼部疾病之使用方法
CN113939740A (zh) 2019-01-03 2022-01-14 离子路径公司 用于离子束成像的组合物和试剂
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
US20220163537A1 (en) * 2019-03-26 2022-05-26 Fast Bt Ug Detection and Quantification of Molecular Species
JP2022532652A (ja) 2019-05-17 2022-07-15 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドの経口送達
US12018315B2 (en) 2019-05-30 2024-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Peptide nucleic acid functionalized hydrogel microneedles for sampling and detection of interstitial fluid nucleic acids
EP3986956A1 (en) * 2019-06-24 2022-04-27 Promega Corporation Modified polyamine polymers for delivery of biomolecules into cells
US12319967B2 (en) 2019-08-21 2025-06-03 University Of Virginia Patent Foundation Methods and compositions for diagnosing and treating prostate cancer based on long noncoding RNA overlapping the LCK gene that regulates prostate cancer cell growth
US11788091B2 (en) 2019-08-21 2023-10-17 University Of Virginia Patent Foundation Methods and compositions for diagnosing and treating prostate cancer based on long noncoding RNA overlapping the LCK gene that regulates prostate cancer cell growth
AU2020366515A1 (en) 2019-10-18 2022-04-21 Immunomic Therapeutics, Inc. Improved lamp constructs comprising cancer antigens
AU2020378414A1 (en) 2019-11-06 2022-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery
WO2021092145A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna composition and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
PH12022551208A1 (en) 2019-11-18 2023-04-24 Janssen Biotech Inc Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
IL293606A (en) 2019-12-04 2022-08-01 Ashvattha Therapeutics Inc Dendrimer preparations and methods of administering a drug to the eye
CN115484932B (zh) 2020-03-04 2024-12-10 维乎医疗有限公司 用于靶向rna递送的组合物和方法
EP4176087A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230257745A1 (en) 2020-07-10 2023-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular siRNAs
CN116368226A (zh) 2020-09-04 2023-06-30 维乎医疗有限公司 用于加帽rna的组合物和方法
US20240336914A1 (en) 2020-12-31 2024-10-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs
JP2024501857A (ja) 2020-12-31 2024-01-16 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 環状ジスルフィド修飾リン酸ベースのオリゴヌクレオチドプロドラッグ
US20250270562A1 (en) 2021-07-09 2025-08-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
KR20240036041A (ko) 2021-07-21 2024-03-19 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 대사 장애-연관 표적 유전자 iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
CN118369427A (zh) 2021-10-15 2024-07-19 阿尔尼拉姆医药品有限公司 肝外递送irna组合物及其使用方法
EP4508071A1 (en) 2022-04-10 2025-02-19 Immunomic Therapeutics, Inc. Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof
EP4522742A2 (en) 2022-05-13 2025-03-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
EP4547683A2 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs
EP4594492A1 (en) 2022-09-30 2025-08-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double-stranded rna agents
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
WO2024216155A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery of double-stranded rna agents
WO2024238385A2 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
WO2025064660A2 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Activin a receptor type 1c (acvr1c) irna compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3200106A (en) * 1960-08-04 1965-08-10 Petrolite Corp Derivatives of branched polyalkylene-polyamines
US3514250A (en) * 1965-03-25 1970-05-26 Petrolite Corp Process of inhibiting corrosion
US3445441A (en) * 1965-03-25 1969-05-20 Petrolite Corp Amino-amido polymers
US3580891A (en) * 1968-04-16 1971-05-25 Seekay Chemical Co Water-insoluble,cross-linked polymeric reaction product of ethylene diamine and nitrilotriacetic acid or derivative
US3528928A (en) * 1969-01-13 1970-09-15 Petrolite Corp Process of breaking oil-in-water emulsions
US3578643A (en) * 1969-06-06 1971-05-11 Grace W R & Co New polymers from nitrilotriacetonitrile and iminodiacetonitrile
BE756896A (fr) * 1969-10-01 1971-03-30 Montedison Spa Polyamides basiques, leurs procedes de preparation et leurs applications
US4036808A (en) * 1972-08-14 1977-07-19 California Institute Of Technology Conductive hydrogel containing 3-ionene
US4102827A (en) * 1973-12-26 1978-07-25 California Institute Of Technology Novel polyelectrolytes
US4315087A (en) * 1975-04-28 1982-02-09 Petrolite Corporation Quaternary polyaminoamides
US4141847A (en) * 1977-05-11 1979-02-27 Shell Oil Company Star-shaped polymer reacted with dicarboxylic acid and amine as dispersant viscosity index improver
US4360646A (en) * 1979-04-06 1982-11-23 Allied Corporation Preparation of lysine based macromolecular highly branched homogeneous compound
US4289872A (en) * 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
US4581337A (en) * 1983-07-07 1986-04-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyether polyamines as linking agents for particle reagents useful in immunoassays
JPS5719660A (en) * 1980-07-09 1982-02-01 Fuji Photo Film Co Ltd Microcapsule for immune reaction
US4435548A (en) * 1981-04-27 1984-03-06 The Dow Chemical Company Branched polyamidoamines
US4410688A (en) * 1981-04-29 1983-10-18 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound
US4957939A (en) * 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) * 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4568737A (en) * 1983-01-07 1986-02-04 The Dow Chemical Company Dense star polymers and dendrimers
US4558120A (en) * 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4737550A (en) * 1983-01-07 1988-04-12 The Dow Chemical Company Bridged dense star polymers
US4507466A (en) * 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4631337A (en) * 1983-01-07 1986-12-23 The Dow Chemical Company Hydrolytically-stable dense star polyamine
US4946824A (en) * 1983-02-22 1990-08-07 Union Carbide Chemicals And Plastics Company Inc. Connected branch copolymers, methods for their production, and copying materials including same
US4855403A (en) * 1983-02-22 1989-08-08 Union Carbide Corporation Connected branch copolymers, methods for their production, and copying materials including same
US4634586A (en) * 1984-05-21 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Reagent and method for radioimaging leukocytes
US4606907A (en) * 1984-07-02 1986-08-19 The Dow Chemical Company Bone seeking Tc-99m complexes of phosphonate derivatives of polyamidoamines
US4587329A (en) * 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US4857218A (en) * 1984-08-17 1989-08-15 Union Carbide Corporation Lubrication method and compositions for use therein
US4980148A (en) * 1985-02-06 1990-12-25 Mallinckrodt, Inc. Methods for enhancing magnetic resonance imaging
US4703018A (en) * 1985-02-20 1987-10-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company High refractive index haloalkyl-functional shell-core polymers and their use in light scattering immunoassays
US4675173A (en) * 1985-05-08 1987-06-23 Molecular Biosystems, Inc. Method of magnetic resonance imaging of the liver and spleen
US4824659A (en) * 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US4871779A (en) * 1985-12-23 1989-10-03 The Dow Chemical Company Ion exchange/chelation resins containing dense star polymers having ion exchange or chelate capabilities
IT1213029B (it) * 1986-01-30 1989-12-07 Bracco Ind Chimica Spa Chelati di ioni metallici paramagnetici.
US4694064A (en) * 1986-02-28 1987-09-15 The Dow Chemical Company Rod-shaped dendrimer
US4713975A (en) * 1986-05-30 1987-12-22 The Dow Chemical Company Dense star polymers for calibrating/characterizing sub-micron apertures
US5039512A (en) * 1986-08-04 1991-08-13 Salutar, Inc. NMR imaging with paramagnetic polyvalent metal salts of poly-(acid-alkylene-amino)-alkanes
IL83567A (en) * 1986-08-18 1992-02-16 Dow Chemical Co Starburst conjugates with a carried material,such as an agricultural or pharmaceutical material
US5527524A (en) * 1986-08-18 1996-06-18 The Dow Chemical Company Dense star polymer conjugates
US5338532A (en) * 1986-08-18 1994-08-16 The Dow Chemical Company Starburst conjugates
US5175270A (en) * 1986-09-10 1992-12-29 Polyprobe, Inc. Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences
US4863717A (en) * 1986-11-10 1989-09-05 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Methods for circumventing the problem of free radial reduction associated with the use of stable nitroxide free radicals as contrast agents for magnetic reasonance imaging
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US4857599A (en) * 1988-02-08 1989-08-15 The Dow Chemical Company Modified dense star polymers
US4931553A (en) * 1988-05-11 1990-06-05 Gill Devinder S Platinum-polymer complexes and their use as antitumor agents
JPH0750111B2 (ja) * 1988-12-22 1995-05-31 積水化学工業株式会社 疎水性物質の固定化用担体およびそれを用いた疎水性物質の固定化方法
DE3910901A1 (de) * 1989-04-04 1990-10-11 Ppg Ind Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung einer waesserigen feinteiligen dispersion eines chlorierten polyolefins und verwendung derselben in waesserigen beschichtungszusammenetzungen
US5364613A (en) * 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
AU5649290A (en) * 1989-04-12 1990-11-05 New York University Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine
US5041516A (en) * 1989-06-21 1991-08-20 Cornell Research Foundation, Inc. Dendritic molecules and method of production
US4938885A (en) * 1989-09-28 1990-07-03 Texaco Inc. Antioxidant dispersant polymer dendrimer
DE3938992A1 (de) * 1989-11-21 1991-05-23 Schering Ag Kaskadenpolymer-gebundene komplexbildner, deren komplexe und konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende pharmazeutische mittel
MY108621A (en) * 1990-08-01 1996-10-31 Novartis Ag Polylactide preparation and purification
IL99234A (en) * 1990-08-27 1994-05-30 Michigan Molecular Inst Non-cross-linked multi-branch polymers and their preparation
US5098475A (en) * 1991-01-28 1992-03-24 Xerox Corporation Inks with dendrimer colorants
US5154853A (en) * 1991-02-19 1992-10-13 University Of South Florida Unimolecular micelles and method of making the same
US5120361A (en) * 1991-06-27 1992-06-09 Xerox Corporation Ink compositions
WO1993003406A1 (en) * 1991-08-09 1993-02-18 Australian And Overseas Telecommunications Corporation Limited Sagnac loop gates
JPH07505915A (ja) * 1992-04-14 1995-06-29 コーネル　リサーチ　ファウンデーション、インコーポレーテッド 樹枝状巨大分子およびその製造法
WO1995002397A1 (en) * 1993-07-14 1995-01-26 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US5362843A (en) * 1993-09-22 1994-11-08 Hoechst Celanese Corporation Process for preparing highly branched macromolecule polymers

Also Published As

Publication number Publication date
ATE277640T1 (de) 2004-10-15
CA2161684A1 (en) 1995-09-14
IL128775A (en) 2001-05-20
DE69533569D1 (de) 2004-11-04
IL128774A (en) 2001-05-20
PL311633A1 (en) 1996-03-04
KR100357839B1 (ko) 2003-08-02
EP0699079A1 (en) 1996-03-06
CA2161684C (en) 2010-11-09
WO1995024221A1 (en) 1995-09-14
IL128773A (en) 2001-05-20
FI955320A7 (fi) 1995-11-24
KR960703342A (ko) 1996-08-17
FI955320L (fi) 1995-11-24
US5714166A (en) 1998-02-03
IL128774A0 (en) 2000-01-31
AU2118195A (en) 1995-09-25
NO954434D0 (no) 1995-11-06
DE699079T1 (de) 1997-09-25
FI955320A0 (fi) 1995-11-06
NO954434L (no) 1996-01-05
PL181064B1 (pl) 2001-05-31
GR970300044T1 (en) 1997-11-28
DE69533569T2 (de) 2006-01-05
IL128773A0 (en) 2000-01-31
EP0699079B1 (en) 2004-09-29
IL112920A (en) 2003-04-10
RU2127125C1 (ru) 1999-03-10
ZA951877B (en) 1996-09-09
MX9504664A (es) 1997-05-31
IL128775A0 (en) 2000-01-31
NO317691B1 (no) 2004-12-06
IL112920A0 (en) 1995-12-08
JPH08510761A (ja) 1996-11-12
ES2104518T1 (es) 1997-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL182237B1 (pl) Sposób przeprowadzania transfekcji komórek i osiagniecia biodostepnosci materialu genetycznego in vitro i ex vivo PL PL
DK174053B1 (da) Stjerneesksplosionskonjugater, fremgangsmåder til fremstilling deraf, fremgangsmåde til fremstilling af en stjerneeksplosionspolyethylenimin og fremgangsmåde til rensning af en stjerneeksplosionsdendrimer
CN101443048B (zh) 具有增强的扩增性和内部官能度的树枝状聚合物
Brownlie et al. PEI-based vesicle-polymer hybrid gene delivery system with improved biocompatibility
Uritu et al. Hybrid fullerene conjugates as vectors for DNA cell-delivery
Neu et al. Bioreversibly crosslinked polyplexes of PEI and high molecular weight PEG show extended circulation times in vivo
AU2007238965B2 (en) Biodegradable cationic polymers
US5527524A (en) Dense star polymer conjugates
CA2788736C (en) Polyanionic multivalent macromolecules for intracellular targeting of proliferation and protein synthesis
BRPI0721759B1 (pt) Composições farmacêuticas compreendendo drogas anticancerígenas
Huang et al. Polypeptide–poly (ethylene glycol) miktoarm star copolymers with a fluorescently labeled core: Synthesis, delivery and imaging of siRNA
JP2022550901A (ja) 核酸治療薬のための腫瘍標的化ポリペプチドナノ粒子送達システム
CN101218204A (zh) 改性的聚（丙烯亚胺）树枝状聚合物及其作为用于阴离子生物活性因子的转染剂的用途
AU768662B2 (en) Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
US20040086481A1 (en) Cationic polymer-nucleic acid complexes and methods of making them
Li et al. Cyclen‐Based Side‐Chain Homopolymer Self‐Assembly with Plasmid DNA: Protection of DNA from Enzymatic Degradation
Xiang et al. Novel cyclen-based linear polymer as a high-affinity binding material for DNA condensation
MARTÍNEZ-BONET et al. Delivery Applications
Sharma An ABC triblock copolymer based approach for non-viral gene delivery

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100307