CN101218204A - 改性的聚（丙烯亚胺）树枝状聚合物及其作为用于阴离子生物活性因子的转染剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括阳离子内部铵基和外部非毒性端基的改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物、包括所述树枝状聚合物的药物组合物、用于制备所述树枝状聚合物的方法及其作为用于阴离子生物活性治疗因子的转染剂的用途、用于基因治疗特别是用于治疗癌症的用途。1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，包括外部端基和内部胺官能团，其特征在于：(a)基本上所有的外部端基为式(I)的基团，其中R为选自C1－10烷基、聚乙二醇基和聚乙二醇没食子基的基团；和(b)基本上所有的内部胺官能团为季铵化的阳离子铵官能团。最优选的为季铵化的化合物DAB－树枝状－(NHCOCH3)4，DAB－树枝状－(NHCOCH3)8，DAB－树枝状－(NHCOCH3)16，DAB－树枝状－(NHCOCH3)32，DAB－树枝状－(NHCOCH3)64，DAB－树枝状－(NHCOPh((EO)4OMe)3)4，DAB－树枝状－(NHCOPh((EO)4OMe)3)8，DAB－树枝状－(NHCOPh((EO)4OMe)3)16，DAB－树枝状－(NHCOPh((EO)4－OMe)3)32和DAB－树枝状－(NHCOPh((EO)4OMe)3)64。

Description

改性的聚（丙烯亚胺）树枝状聚合物及其作为用于阴离子生物活性因子的转染剂的用途
发明领域
本发明涉及包括内部阳离子胺(铵)基和外部非毒性端基的改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物、包括所述树枝状聚合物的药物组合物、用于制备所述树枝状聚合物的方法及其作为用于阴离子生物活性治疗因子的转染剂的用途、用于基因治疗特别是用于治疗癌症的用途。
背景技术
树枝状聚合物为具有明确定义的、高度支化的分子结构的合成大分子，其以算术逐步方式合成。每个重复的反应序列产生所谓的“更高代”(G)分子，其具有实际上双倍的分子量和双倍(离散)数量的官能端基。从1985年以来，已经研发了许多化学不同类型的树枝状聚合物，比如Tomalia的聚(酰胺基氨基)PAMAM-树枝状聚合物、Newkome的arborols、Fréchet的聚醚树枝状聚合物、Meijer和Mülhaupt的聚(丙烯亚胺)PPI-树枝状聚合物和Moore的苯乙炔树枝状聚合物(Schlüter DA，1999)。因为它们限定的结构、窄的多分散性、限定的纳米尺寸和端基的易改进性，树枝状聚合物被认为是用于生命科学和药物化学中各种功能的令人感兴趣的候选物。特别地，已经研究了它们作为在药物治疗中的结合剂和释放剂及作为在基因治疗中的递送载体的作用(PatriAK等人，2002；Esfand R等人，2001，Liu M等人1999，Stiriba SE等人，2002，Bosman AW等人，1999，Tang MX等人，1997)。基因治疗定义为将核酸(比如DNA)递送至细胞中，优选真核细胞(比如人类细胞)以获得治疗效果。该效果可由对治疗有用的矫正遗传缺陷或者(过)表达蛋白质引起。
在树枝状聚合物中，PAMAM树枝状聚合物作为用于基因递送的潜在转染剂最受注意，因为这些树枝状聚合物带正电荷，并且可以结合在生理学pH下的DNA。也已研究了一些其它的树枝状聚合物类型(Loup C等人，1999，Choi JS等人，2000，Ohasaki M等人，2002，ShahDS等人，2000，Liu MJ等人，1999，Joester D等人，2003)。Szoka等人最先提供了成功地由PAMAM树枝状聚合物介导的DNA-转染，如由体外试验证实(HaenslerJ等人，1993)。随后，公开了有关PAMAM-树枝状聚合物的协同和转染行为的其它研究(Kukowska-Latallo J等人，1996，DeLong R等人，1997，Bielinska A等人，1996，Shchepinov MS等人，1997，Qin L等人，1998，Yoo H等人，1999，Cheng H等人，2000，Ottaviani MF等人，2000，Kihara F等人，2003)。特别地，已经发现热处理的、部分降解的PAMAM-树枝状聚合物作为体外DNA载体进行得更好(Tang MX等人，1996)：这些活化的PAMAMs是以名称SuperFect(Qiagen)商业可获得的。已经报道用于PAMAM树枝状聚合物的成功转染必须使用约5-20的电荷比(电荷比定义为位于PAMAM中的末端阳离子胺的数目与在DNA中的磷酸酯的数目之比)，即过量的转染剂(HaenslerJ等人，1993，Bielinska AU，等人，1999)。也已提出将其中一部分末端胺已经用二醇链改性的PAMAM树枝状聚合物作为潜在的DNA-转染剂(Luo D等人，2002)。然而，在该研究中，高浓度的树枝状聚合物已被用于DNA结合和转染试验，同时需要使用那些以较低浓度作用的试剂。对PAMAM树枝状聚合物的最新研究给出了它们与细胞膜相互作用的基本信息(Hong S等人，2004)，同样在基因载体设计中下一步骤已作为已经制备和研究的靶向抗体部分的PAMAMs(Thomas TP等人，2004)，并且已经表明PAMAMs可以与RNA分子相互作用，导致抑制某些核酶的活性(WuJ等人，2005)。
确定转染剂的有用性的重要因素是该试剂的毒性和效力。虽然某些文献(Roberts JC等人，1996)已经表明PAMAM树枝状聚合物具有的毒性取决于它们的代，并且其它文献(Szoka FC等人，1996)已证实PAMAM树枝状聚合物比聚赖氨酸(pLys)的毒性更小，但其它数据建议特别是胺封端的PAMAM树枝状聚合物显示出溶血和细胞毒性行为，而具有末端羧酸酯基团的PAMAM树枝状聚合物是无毒的(Duncan R等人，1996，Malik N等人，2000)。不幸的是，当使用具有高级胺官能化的PAMAM树枝状聚合物时，似乎转染更有效，大概是因为这对于在生理学pH的DNA结合产生了更多的阳离子位点(参见例如在TangMX 1996中的图7)。
聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物是在DSM Research(Geleen，theNetherlands)(de Brabander-van-den Berg EMM等人，1993)和独立地在Mülhaupt组(Wrner等人，1993)中研发的一类特定种类的树枝状聚合物。
表1显示五种胺封端的PPI-树枝状聚合物的分子特征
 树枝状聚合物的代  分子式  分子量  外部胺端基  内部叔胺基
 G1  C16N6H40  316.5  4  2
 G2  C40N14H96  773.3  8  6
 G3  C88N30H208  1686.8  16  14
 G4  C184N62H432  3513.9  32  30
 G5  C376N126H880  7168.1  64  62
它们是在SyMO-Chem(www.svmo-chem.nl，Eindhoven，theNetherlands)商业可获得的，而且可以作为用于改性目的的原料起作用。作为一个实例，第二代PPI-树枝状聚合物的分子结构表示在图1中。PPI-树枝状聚合物的特征在于它们的分子量、它们的外部胺端基和内部叔胺基(参见表1)。当然，由于在各代合成中的反应不完全，树枝状聚合物可以是不完善的，因此某些内胺的功能也可以具有仲胺功能。在本发明的上下文中，应当理解PPI树枝状聚合物指1、2、3、4或5代树枝状聚合物，进一步包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，在改性前，包括相当数量的内叔胺基。
具有胺端基的PPI-树枝状聚合物在水中缓慢地降解，更重要地，毒性太大而不能用于在DNA-递送系统中使用，尽管有结合(KabanovVA等人，2000)和转染(Zinselmayer BH等人，2002)测定的报道。文献数据有力地表明树枝状聚合物的末端或表面基团(外部)决定整个树状结构的毒性，而与其内部结构无关(Malik N等人，2000)。因此，可以化学改性PPI-树枝状聚合物的表面以产生具有低毒性的递送系统；另外，表面改性也可以促进水溶性和对水解的稳定性。
除了外部改性外，通过季铵化内部叔胺以产生阳离子铵位点来改性PPI或PAMAM树枝状聚合物的内部是可能的。实际上，之前已经报道了PPI-树枝状聚合物的季铵化反应(Elissen-Roman C等人，1997，Pan Y等人，1999，Pan Y等人，2000)。Ford等人(KreiderJL等人，2001)给出了具有在外部和季铵化的内部位点的短的二醇链的G2和G4 PPI树枝状聚合物，但是该作者没有研究或报道它们作为转染剂的用途。最近，也已经报道了具有阳离子改性的内部的PAMAMs：当用荧光素酶基因表达试验测定时，它们的转染效力比PEI或未改性的PAMAM参照物的低(Lee JH等人，2003)。虽然作者没有提及这一点，但内部季铵化的PAMAMs很可能易于显示出逆向迈克尔加成反应，意味着这些阳离子改性的树枝状聚合物大都可能降解而不稳定。
发明内容
根据本发明，给出了改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，其中所述聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物在外部和内部改性，旨在产生用于阴离子生物活性因子的水溶性的、水解稳定的和无毒的转染剂。通过将胺端基转变成式(I)的基团来在外部改性所述PPI-树枝状聚合物：
Figure S2006800248477D00041
其中R为选自C1-10烷基、聚乙二醇基和聚乙二醇没食子基(gallyl)的基团，因为这些端基保留了水溶性，同时证实其阻断了胺端基产生无毒的物质。
通过内部(主要是叔)胺基与季铵化试剂比如碘甲烷、氯甲烷等反应来改性PPI-树枝状聚合物的内部，从而产生具有多个季铵化阳离子位点的微环境。根据PPI-树枝状聚合物的代，分别对于第1代和第5代，阳离子位点的量可以从2至60变化，条件是所述季铵化反应定量地进行。预期在树枝状聚合物内部高局部浓度的阳离子位点会使这类树枝状分子能够与阴离子生物活性因子形成络合物。
因此，本发明涉及1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，包括外部端基和内部胺基，其特征在于：
(a)基本上所有的外部端基为式(I)的基团，其中R为选自下述的基团：C1-10烷基，下式的聚乙二醇基：
-CH2-OCH2-CH2-OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和下式的聚乙二醇没食子基：
-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和
(b)基本上所有的内部胺基为阳离子季铵基团。
另外，本发明涉及1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，其特征在于所述改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物通过下述步骤获得：
(a)首先聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物与酰化剂反应，所述聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物基本上包含外部胺端基和内部叔胺基，所述酰化剂选自乙酸酐、C1-10烷基卤化物、下式的聚乙二醇酸：
HOOC-CH2-OCH2-CH2-OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和下式的聚乙二醇没食子酰卤化物：
X-C(＝O)-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，并且X为卤化物；和
(b)步骤(a)中得到的产物与季铵化试剂反应。
优选地，所述C1-10烷基为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、正丁基或戊基。最优选地，C1-10烷基为甲基。
作为卤化物，氯化物、溴化物或碘化物是优选的。氯化物为特别优选的。
优选地，n为3、4、5或6，最优选3或4。
优选地，m为3、4、5或6，最优选3或4。
作为季铵化试剂，可以使用本领域技术人员已知用于进行预期任务，即将叔胺基转化成季铵基的任何试剂。优选地，使用卤代甲烷，最优选碘甲烷，但也可以使用包括C10烷基的试剂作为相转移剂。
结合是指可逆地偶合具有至少一个阴离子位点的化学个体与至少一个阳离子位点的任何相互作用。
本发明也涉及适于给药至哺乳动物，优选人类的药物组合物，其特征在于其包括：(a)根据本发明的改性聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物；和(b)阴离子生物活性治疗因子。
阴离子生物活性因子是指任何能够与阳离子位点结合的化学个体，特别是药物活性化合物、核酸、核酸序列、DNA和RNA的低聚物、多核苷酸、DNA酶、单链和双链DNA、单链和双链RNA、反义RNA和DNA、锤头(hammerhead)RNA、短干扰RNA、微RNA、核酶等；或其组合。
特别优选的是具有相对低分子量，优选等于或少于5,000道尔顿的阴离子生物活性因子，更特别地是具有相对低数量的碱基对(例如低聚DNAs或低聚RNAs)，优选少于50个碱基对。在本申请中，本发明人使用了33个链节的单链催化的DNA酶作为核酸模型来研究新提出的改性PPI-树枝状聚合物的结合和转染能力。已经在体外以及体内进行了所述转染试验。
因为它们在血清和血液中的低毒性和稳定性，本发明的树枝状化合物适宜作为转染剂，并且包括所述化合物的药物组合物尤其适用于基因治疗，最优选在人类中，更特别用于癌症的治疗。
更优选地，所述癌症为与肝、肾有关的肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性粒细胞白血病、尤因肉瘤、妊娠期滋养层癌、何杰金病、非何杰金(氏)淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤扩散大细胞淋巴瘤(Burkitt′slymphoma diffuse large cell lymphoma)、滤泡性混合淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、横纹肌肉瘤、阴囊癌、肾母细胞瘤、肛门癌、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、毛细胞白血病、脑癌和颈癌、肺(小细胞)癌、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、卵巢癌、脑肿瘤(星形细胞瘤)、宫颈癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、肺(非小细胞)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、乳腺癌、结肠直肠癌(III期)、骨肉瘤、卵巢癌(III期)或其组合。
本发明也涉及1、2、3、4或5代的改性聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全树枝状聚合物及其混合物，包括外部端基和内部胺基，其特征在于基本上所有的外部端基为式(I)的基团，其中R为选自下述的基团：C1-10烷基、下式的聚乙二醇基：
-CH2-OCH2-CH2-OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和下式的聚乙二醇没食子基：
-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
另外，本发明涉及1、2、3、4或5代的改性聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，其特征在于所述改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物是通过下述步骤获得的：首先聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物与酰化剂反应，所述聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物基本上包含外部胺端基和内部叔胺基，所述酰化剂选自乙酸酐、C1-0烷基卤化物，下式的聚乙二醇酸：
HOOC-CH2-OCH2-CH2nMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和
下式的聚乙二醇没食子酰卤化物：
X-C(＝O)-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，并且X为卤化物。
本发明现在将用大量实验来更详细地阐述和解释，但不限于此。
实验
1.改性聚(聚乙烯亚胺)树枝状聚合物的合成
1.1.总则
已经在文献中描述了用二醇没食子酸酯基改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物的合成(参见Baars，M.W.P.L.Kleppinger，R.Koch，M.H.J.Yeu，S.L.Meijer，E.W.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2000，39，1285和该文献的引用信息)。对于二醇没食子酸酯(即没食子酸或3，4，5-三羟基苯甲酸，由三个单甲氧基四甘醇基团修饰)的合成，可以参阅相同的参考文献。在之前的文献中没有报道用乙酰基或聚乙二醇没食子酸酯基季铵化的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。
具有胺端基的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物从SyMO-Chem(www.svmo-chem.nl)获得，并且通常表示为DAB-Am-4(1代)、DAB-Am-8(2代)、DAB-Am-16(3代)、DAB-Am-32(4代)和DAB-Am-64(5代)，分别为第一、第二、第三、第四和第五代。DAB代表1，4-二氨基丙烷核，Am代表胺端基，给定的数字代表端基的数目。
使用的溶剂通常具有p.a.性质。使用的溶剂和试剂包括甲醇(Biosolve p.a.)、甲苯(Biosolve p.a.)、二氯甲烷(Biosolve p.a.)、水(经柱软化)、三乙胺(Fluka，＞99％，储存在KOH-小球上)、乙酸酐(Acros p.a.)、草酰氯(Acros)和碘甲烷(Merck，保存在冰箱中)。
已经使用了具有容积＞1.2meq/ml(Acros)的Dowex 1x8-50(Acros)Cl-阴离子交换树脂和Dowex 550A OH(25-35目)强碱性OH-阴离子交换树脂(Aldrich)。可以通过进行试验来检查从碘化物到氯化物的离子交换成功。首先，将几mg的树枝状聚合物产物溶于约1mL水中，加入几滴浓的H2O2(35％-溶液，Merck)。在该阶段，含I-的树枝状聚合物溶液变成略微黄色，而含Cl-的树枝状聚合物溶液保持无色(略微的颜色应归于形成I2)。在加入约1mL新制备的淀粉溶液后，含I-的树枝状聚合物溶液变成深蓝色，而含Cl-的树枝状聚合物没有引起所述溶液有颜色。通过加入可溶性淀粉粉末(1g，Merck)至良好搅拌的沸水(100mL)中获得淀粉溶液。在一分钟后，冷却所述溶液，并立即用于该试验。
表II：改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。
 树枝状聚合物结构式 相应的缩写式   分子量*
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)8     G2     1109
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+6MeI     G2MeI     1961
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+6MeCl     G2MeCl     1413
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)32     G4     4859
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)32+30MeI     G4MeI     9117
 DAB-树枝状-(NHCOCH3)32+30MeCl     G4MeCl     6374
 DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)32     G4PEG     26644
 DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)32+30MeI     G4PEGMeI     30903
 DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)32+30MeCl     G4PEGMeCl     28161
 DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)64     G5PEG     53429
 DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)64+62MeI     G5PEGMeI     62228
表II列出了已经合成的改性聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。
作为透析膜，使用Spectrum Laboratories Spectra/Por管(已经施用了多种切去(cutoff)MWCO物质)。在氩气的惰性气氛下常规地进行反应。在Varian Mercury Vx 400 MHz或Varian Gemini 300 MHz光谱仪上进行NMR分析。在分离后，将制备的树枝状聚合物通常储存在-20℃或4℃的黑暗中。
1.2.DAB-树枝状-(NHCOCH3)8或“G2”
Figure S2006800248477D00101
将第二代胺封端的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(6.50g；8.40mmol；FW＝773)溶于甲醇(50mL)和三乙胺(6.8g；67.24mmol)中。在1分钟期间加入乙酸酐(8.24g；80.8mmol)(回流；没有外部冷却)。在搅拌2.5小时后，在旋转蒸发器上蒸发所述溶液，并且用甲醇洗提一次。用Dowex 550A OH(25-35目)填充柱，先用水洗涤，然后用甲醇(这是有些放热性的)洗涤所述离子交换树脂。以滴加的方式洗脱在甲醇中的粗树枝状聚合物，以便给予所述交换过程足够的时间。通过旋转蒸发分离产物，用甲醇洗提，然后使用油泵真空排空。得到透明的无色油。
1HNMR(CD3OD)：δ＝8.1(t)，3.2(t)，2.5(m)，1.9(s)，1.7(m)，1.5(m).13CNMR(CD3OD)：δ＝173.1，55.2，53.3，53.2，52.7，39.0，27.7，25.8，24.9，22.7.ES/MSM+＝1109.4.
1.3.DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+6 MeI或“G2(MeI)”
理论上所有6个都为内部叔胺
将酰化的第二代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(725mg)溶于甲醇(2mL)和碘甲烷(4.6g)中。在氩气氛下，在50℃的油浴温度下搅拌所述溶液20小时。蒸发挥发物后，得到淡黄色脆性粉末。
1HNMR(CD3OD)：δ＝8.0(t)3.9(b)，3.7-3.5(b)，3.3(m)，2.5(b)， 2.2(b)，2.05(b)，2.0(s).13CNMR(CD3OD)：δ＝173.5，62.8，61.8，60.2，.59.8，50.0，37.3，23.9，23.3，20.7，19.3.
1.4.DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+6 MeCl或“G2(MeCl)”
Figure S2006800248477D00103
理论上所有6个都为内部叔胺
将酰化的和碘甲基季铵化的第二代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(309mg)溶于甲醇(2mL)中，并施加到装有Dowex 1x8-50离子交换树脂的柱上，所述树脂已经采用水和甲醇洗涤过。用甲醇进行洗脱。蒸发滤液，得到MeCl-加成物(0.21g)。
1HNMR(CD3OD)：δ＝3.7(b)，3.6-3.4(b)，3.3(m)，2.4(b)，2.0(b)，1.95(s).
1.5.DAB-树枝状-(NHCOCH3)32或“G4”
Figure S2006800248477D00111
将第4代胺封端的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(2.02g；0.57mmol；FW＝3514g/mol)溶于二氯甲烷(50mL)和三乙胺(2.05g；20.3mmol)中。在一分钟期间，滴加入乙酸酐(2.15g；21.06mmol)(放热反应，无外部冷却)。在搅拌过夜后，加入甲醇(20mL)，得到透明溶液，将其再搅拌3小时。蒸发所述溶液，用甲醇洗提三次。在Dowex 550A OH(25-35目)离子交换树脂的预洗涤柱上洗脱所述产物的甲醇溶液。在旋转蒸发仪上蒸发所述洗脱液，用甲醇重复洗提三次，真空干燥，得到粘性油状物(2.7g)。
1HNMR(CD3OD)：δ＝3.2(t)，2.5(m)，1.9(s)，1.7(m)，1.5(m).13CNMR(CD3OD)：δ＝173.0，53.5-52.7，39.0， 27.8，25.0-24.5，22.5.
1.6.DAB-树枝状-(NHCOCH3)32+30MeI或“G4(MeI)”
Figure S2006800248477D00112
理论上所有30个都为内部胺
将酰化的第4代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(FW＝4859/mol；1.0g；0.206mmol；6.17mmol内部叔胺)溶于甲醇(2mL)和碘甲烷(7mL)中。在45℃的油浴温度下搅拌所述混合物60小时。蒸发所述双层混合物的易挥发物，得到黄色粉末。将该产物溶于甲醇中，并且沉淀在良好搅拌的醚中。得到细碎的黄色粉末。
1HNMR(CD3OD)：δ＝8.2(b)，4.1-3.5(b)，3.3(m)，2.8-2.5(b)，2.3-2.1(b)，2.05(s).13C NMR(CD3OD)：δ＝173.5，61.8，60.4，59.7，51.2，50.2，37.5，23.9，23.5，20.5，19.4.
1.7.DAB-树枝状-(NHCOCH3)32+30 MeCl或“G4(MeCl)”
Figure S2006800248477D00121
理论上所有30个都为内部胺
将酰化的和碘甲基季铵化的第4代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物溶于甲醇中，并施加到装有Dowex 1x8-50离子交换树脂的柱上，所述树脂已经采用水和甲醇洗涤过。用甲醇进行洗脱。蒸发滤液，得到MeCl-加成物。
1HNMR(CD3OD)：δ＝8.3(b)，3.9-3.2(b)，2.7-2.4(b)，2.1-2.0(b)，2.0(s).13CNMR(CD3OD)：δ＝173.5，61.5，60.4，60.0，59.6，49.9，37.4，23.6，22.9，20.7，18.4.
1.8.二醇没食子酰氯结构嵌段，Cl(O)C-Ph((EO)4OMe)3
Figure S2006800248477D00122
将二醇没食子酸酯(HOOC-Ph((EO)4OMe)3)(2.05g，2.68mmol，FW＝741)贮存在真空中的粉末状P2O5上。在使用前，用甲苯洗提两次(共蒸发)。然后，将其溶于60ml蒸馏的二氯甲烷中，加入2.8ml的草酰氯，之后加入3滴DMF。一小时后加入另一份0.2mL的草酰氯，因为IR分析仍显示在1714cm-1有峰值(COOH-基)。再搅拌10分钟，得到完全转化成酰氯(IR：1745 cm-1)。通过在旋转蒸发器上蒸发溶剂分离产物Cl(O)C-Ph((EO)4OMe)3，用甲苯共蒸发。将其立即用于与聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物的偶联反应。
1.9.DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe3)32或“G4-PEG”
Figure S2006800248477D00131
用甲苯洗提第4代胺封端的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(276mg；FW＝3514g/mol)四次，将其溶于6mL的二氯甲烷和1mL的三乙胺中。在半分钟内将该溶液加至酰氯Cl(O)C-Ph((EO)4OMe)3在60mL的二氯甲烷(使用1.1当量的酰氯)的溶液中。得到透明的溶液。在过夜搅拌后，加入30mL的水和550mg的KOH粉末，将全部混合物转移到分液漏斗中。分离有机层，用50mL的二氯甲烷萃取水层。先用200mg的KOH在25mL水中的溶液，接着用两份25mL的水洗涤合并的二氯甲烷层。用无水硫酸钠干燥所述二氯甲烷溶液，过滤，并浓缩至得到1.85g的油状产物。先用甲醇/水/三乙胺500∶60∶10(v/v/v)，最后用甲醇/水500∶25 (v/v)透析该产物两次。蒸发后，用甲醇共蒸发以除去上次的三乙胺，在真空炉中干燥，得到略浅黄色油状产物(1.24g)。
1HNMR(CDCl3)：δ＝8.0(bs)，7.1(bs)，4.1(b)，4.0(b)，3.8-3.4， 3.35(s)，3.3(s)，2.5-2.2(b)，2.0-1.4(b).13CNMR(CDCl3)：δ＝167.1，152.3，141.0，129.7，106.8，72.4，72.1，70.8，70.7，69.8，69.0，58.9，53-51(b)，38.6，27.0，24.0.
1.10.DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3))32+MeI或“G4-PEG(Mel)”
Figure S2006800248477D00132
理论上所有30个都是内部叔胺
在装有回流冷凝器的圆底烧瓶中在40-45℃(油浴温度)在5mL的甲醇和2mL的碘甲烷中搅拌用二醇没食子酸酯基改性的第4代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(590mg)40小时。在旋转蒸发器上蒸发所述溶液。随后用甲醇洗提该产物三次。产率：0.69g的粘性黄棕色油状物。
1HNMR(CD3OD)：δ＝7.2(bs)，4.2(b)，4.0-3.4，3.35(S)，3.3(s)，2.8-2.4(b)，2.3-2.1(b).
1.11.DAB-树枝状-(NHCOPh(EO)4OMe)3)32+MeCl或“G4-PEG(MeCl)”
Figure S2006800248477D00141
理论上所有30个都是内部叔胺
用软化水和甲醇洗涤具有3.0g的Dowex 1 X8-50(Acros)离子交换树脂的柱以除去污染物。将具有用MeI季铵化的二醇没食子酸酯基的G4-树枝状聚合物(I-形式；290mg)溶于5mL的甲醇中并上柱。用甲醇连续洗脱直至级分不在二氧化硅-60TLC板上显示出任何UV-活性。在旋转蒸发仪上蒸发该甲醇溶液，得到247mg的产物(粘性浅黄色油状物)。
1HNMR(CDCl3)：δ＝8.5(b)，7.3(bs)，4.3-4.1(b)，3.9-3.4，3.35(s)，3.3(s)，2.8-2.4(b)，2.3-2.0(b).13CNMR(CDCl3)：δ＝167.5，152.3，140.8，129.0，106.8，72.3，71.8，70.5，69.6，69.0，60.4(b)，58.9，49.5-49.0(b)，37.1(b)，22.5(b)，17.2(b).
1.12.DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3]64或“G5-PEG”
Figure S2006800248477D00142
用甲苯洗提第五代胺封端的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(251mg，包含约20wt％的甲醇)以除去甲醇，然后将其溶于二氯甲烷(40mL)和三乙胺(250mg)的混合物中。在一分钟内，将20mL新制备的酰氯(Cl(O)C-Ph((EO)4OMe)3；1.2当量每份伯胺)加入到强力搅拌的树枝状聚合物溶液中。该溶液立即变得浑浊。在氩气氛下搅拌过夜后，在旋转蒸发仪上浓缩该混合物。将所述产物溶于水(5mL)和氢氧化钠溶液(300mg在5mL水中)中。通过先对MeOH/水/三乙胺(400/40/40mL)透析，然后对MeOH/水(500/50mL)透析进行纯化。蒸发并干燥(油泵)，得到1.44g的油状产物。
1HNMR(CDCl3)：δ＝8.2(b)，7.1(bs)，4.1(b)，3.9(b)，3.8-3.4，3.35(s)，3.3(s)，2.5-2.3(b)，1.8-1.3(b).13CNMR(CDCl3)：δ＝167.1，152.3，141.0，129.7，106.8，73-68，59，53-51，38.9，27.0，24.0.
1.12.DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)64+62MeI或“G5-PEG(MeI)”
理论上所有62个都是内部叔胺
将用二醇没食子酸酯基改性的第五代聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物(150mg)溶于2mL的甲醇中。加入碘甲烷(360mg)在甲醇(0.5mL)中的溶液，在惰性氩气氛下，在40℃(油浴温度)搅拌该得到的混合物20小时。在旋转蒸发仪上蒸发挥发物，得到黄棕色产物。
1HNMR(CD3OD)：δ＝7.3(bs)，4.3(b)，3.8-3.4，3.35(s)，3.3(s)，2.8-2.4(b)，2.3-2.1(b).13CNMR(CD3OD)：δ＝168.9，1.53.7，142.2， 130.3，107.9，73.7-71.3，61.8-60.0(b)，59.2，50.7(b)，38.5(b)24.2(b)，19.5(b).
2.使用1H NMR、13C NMR和SEC测定在含水混合物中的稳定性
将树枝状化合物溶于D2O中，将该溶液转移至NMR管。将所述管置于保持在35至39℃的油浴中4天。每天记录1H NMR谱，在其之前或之后进行13C NMR。在测定期间也记录pH值：在测定期间，DAB-树枝状-(NHCOCH3)8保持碱性(pH＝约9)，DAB-树枝状-(NHCOCH3)32+30MeI保持酸性(pH＝约2)和DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+MeCl保持弱酸性(pH＝约5-6)，而DAB-树枝状-(NHCOCH3)8+MeI从弱酸性(pH＝约5-6)变得酸性更强(pH＝约2)。包含碘甲烷季铵化的树枝状聚合物的溶液的酸性可能由存在的一些HI引起，HI是在MeOH/MeI中季铵化反应步骤期间形成的。每天仅仅通过使用常用的pH试纸评价溶液的pH。对于SEC-测定，使用类似的步骤。使用TSK-GEL G3000PWx1柱，施用0.5mL/min的0.1M柠檬酸和0.05％叠氮化钠在水中的洗脱液流；使用RI-检测。
3.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的树枝状聚合物和DNA的结合实验
使用BIO-RAD Mini-PROTEAN 3细胞进行PAGE。通过混合5.7mL30％的丙烯酰胺和2.67％的二丙烯酰胺溶液与1.0mL的缓冲溶液(10x)、3.3mL的H2O制备17％交联密度的微凝胶，并随后将该凝胶浇铸到空玻璃平皿、60μL新制备的10％的过硫酸铵(APS)溶液和10μL的TEMED之间。对于pH＝4.4的凝胶，施用双倍量的TEMED和APS溶液。使该溶液胶凝至少一小时，之后使所述凝胶流动。在所有的情况下，使用18MΩ的水。
在pH为7下进行的实验中使用包含108克Tris(890mM)、55克H3BO3(890mM)和7.5克EDTA(20mM)每升的Tris/硼酸/EDTA缓冲液(TBE缓冲液；10x)。对于在pH＝4.4下的测定，使用包含12克乙酸(197mM)和71.2克β-丙氨酸(800mM)每升(10x)的β-丙氨酸/乙酸缓冲液。所述负载的缓冲液包含0.2mL在H2O中的1％溴酚蓝溶液、25mL缓冲液(1x)和15mL甘油。该负载的样品由适当选择容积的DNA-水溶液、树枝状聚合物水溶液和负载的缓冲液组成。用10μL或12.5μL的负载样品负载所述凝胶的每道，以使负载DNA的每道为约0.4μg(除非另有说明)，如此使得对于多种检验的树枝状聚合物/DNA组合而言，树枝状聚合物/DNA的电荷比(CR)为约2∶1、3∶2、1∶1或1∶2。通过用所述树枝状聚合物中正电荷的量(即在树枝状聚合物中叔胺和季铵的总量)除以所述DNA中磷酸基的含量来计算电荷比。使用的DNA为单链未标记的33-链节。在每种凝胶上，作为参考，保留一个道用于未标记的ss-DNA，而一个道用于该ss-DNA 33-链节和FITC-标记的ss-DNA 33-链节的混合物。某些道未使用。
在200伏的电压下，运行所述微凝胶约45分钟。使用具有标准BIORAD试剂盒和标准BIORAD协议的Ag-染色来显影所述凝胶。在所有的情况下，得到在浅棕色背景上的白线；处理该凝胶的所有图片的对比度和亮度，以便得到在白色或浅灰色背景上的黑线。
在图A中，可以评价在pH＝7下，树枝状聚合物G2(MeCl)、G4(MeI)、G4-PEG(MeCl)、G5-PEG和G5-PEG(MeI)与DNA-酶33-链节的结合量。
在图B中，显示了在pH＝7下的浓度结合研究：DNA-负载从0.1至0.2至0.4至0.8微克每道(具有12.5微升的负载量)升高，使用指定电荷比的树枝状聚合物G4-PEG(MeI)。
4.细胞、动物和材料
在该研究中使用下述所有的人类细胞系：乳房癌MCF7细胞系和恶性黑色素瘤Malme-3M细胞系，两者都在达尔伯克最小必需培养基中培养。在RPMI 1640中培养卵巢癌A2780细胞系、结肠直肠腺癌细胞系HT29和白血病细胞系K562-Cl000。用5％的胎牛血清(FCS)、50μg/ml的庆大霉素和2 mM的L-谷氨酰胺补充这些培养基。也用1mM的丙酮酸钠补充MCF7细胞培养基和Malme-3M培养基。在含有5％CO2的湿润培养箱中，在37℃培养细胞。所有的培养基和补充剂购自Invitrogen(Paisley，UK)。
雄性NMRI小鼠购自Janvier(Le Genest-St-Isle，France)。所有动物实验均在动物伦理委员会批准下进行。随后的伦理准则满足UKCCCR准则所要求的标准。x＝3′dG5′的5′-荧光素标记的和非标记的ss-DNA酶33-链节(5′-标记物-TGAGGGGCAGGCTAGCTACAACGACGTCGCGGx-3′)购自Eurogentec(Seraing，Belgium)。为了改善稳定性，在3′-末端引入3′-3′鸟嘌呤倒位。
5.改性的PPI-树枝状聚合物的细胞毒性
使用MTT-试验在4个细胞系(Malme-3M、K562、HT29和MCF7)上表征不同代(G2、G2(MeI)和G2(MeCl)、G4、G4(MeI)和G4(MeCl)及G5-PEG和G5-PEG(MeI))的改性PPI-树枝状聚合物的毒性。为了该目的，使用细胞毒性测定，其中在转染前，将细胞以2000个细胞/孔放置在96孔平皿上24小时。根据树枝状聚合物的代，将所述树枝状聚合物以各种浓度加入到细胞中。第二代树枝状聚合物以500μM至1μM的浓度加入。第4代和第五代树枝状聚合物分别以100μM至0.2μM和12.5μM至50nM的浓度范围加入。用所述树枝状聚合物处理细胞4小时，然后用完全培养基使其恢复，再培养4天。在该培养期后，检查细胞的线粒体脱氢酶，其仅仅存在于活细胞中。当存在时，用该酶还原加入的黄色MTT盐以形成蓝色甲
Figure S2006800248477D00181
晶体，可以将其溶于DMSO中，并使用分光光度计(λmax在540nm)测定。然后，用测定的吸收率除以进行相同的实验步骤但没有用所述树枝状聚合物处理的细胞的吸收率，得到MTT-生存力，与在所有图中显示的对照相比。
当更详细地检验一些改性的第4代PPI-树枝状聚合物的细胞毒性时，也按照MTT协议进行。使用一定浓度范围(从1μM、2μM、5μM、10μM至20μM)来测定季铵化的(用MeI或MeCl)或非季铵化的乙酰化的或PEG基化的树枝状聚合物，同时也研究血清的增加量(10％、20％、30％、40％、)。在A2780细胞上进行这些MTT-试验，所述A2780细胞是根据它们在我们部门的体内模型中的适合性选择的。
6.荧光标记的DNA酶的体外递送
使用第4代树枝状聚合物作为转染剂进行荧光活化细胞分类器(FACS)分析，以测定FITC-标记的DNA酶的细胞摄取。在转染前24小时，在6孔平皿中种下2*10E+6A2780细胞/孔。将所述树枝状聚合物和DNA酶都稀释在培养基中至最终浓度为1μM，当络合时获得约1的电荷比。15分钟的培养期能使所述两种组分复合。随后，将该复合物加入到细胞中，在培养4小时后，用PBS洗涤细胞两次，通过胰蛋白酶作用收集，在FACS缓冲液和Cell Scrub缓冲液中洗涤两次(基因治疗系统，San Diego，CA)。将碘化丙啶以20μg/ml的最终浓度加入到每种样品中以测定死细胞的数量比例。最后，通过流动细胞仪(FACScan，Becton Dickenson)分析所述细胞的DNA酶摄取。将非转染的细胞用作基线对照以测定所述细胞的自发荧光。将单独用DNA酶处理的细胞用作阴性对照。因此，单独的所述DNA酶的自发荧光和转染用于解释在所有图中的转染效率的值。
7.荧光标记的DNA酶的体内递送
7.1.显微镜检查
使用整体成像(WBI)系统来研究荧光标记的DNA酶的体内肿瘤递送。该成像系统由荧光立体显微镜(Olympus)SZX 12组成，所述立体显微镜装有绿色荧光性蛋白质(GFP)(激发波长：485-501nm；发射波长：510nm)和红色荧光性蛋白质(RFP)(激发波长：540-552nm；发射波长：568-643nm)过滤器装置(详细参见：Bakker A，Floren W，VoetenJ，Janssens B，Smets G，Wouters W和Janicot M(2001)，Automation ofwhole body imaging of GFP-expressing tumors in living animals.G I.T.Imaging and Microscopy 03/2001：52-54)。使用(Jai)CV-M90 3-CCD RGB彩色照相机以每秒的1/60获得图像(752x582像素)并使用基于IMAQVision软件元件和LabVIEW(National Instruments)的内部开发的应用软件分析。
使用荧光显微镜研究在肿瘤切片上的细胞内DNA酶的递送。简言之，在每个动物实验结束时，取出发荧光的肿瘤，冷冻固定并切片。使用偶联至AxioCam HR (Zeiss)CCD摄像机的AxioPlan2(Zeiss)荧光显微镜观察12μm的切片，俘获高分辨率图片(1300x1030像素)，使用Axio Vision软件(Zeiss)进一步分析。使用核染料TOPRO3(红色)研究FITC(绿色)标记的DNA酶的细胞内分配。使用氟硼荧鬼笔环肽(bodipy phalloidin)(蓝色)获得β-肌动蛋白染色。
7.2.体内DNA酶给药
使用26GA注射器(BD，26 GA 3/8 1ml)将107 A2780卵巢癌细胞/200μl不含血清的培养基注射入雄性NMRI小鼠的腹股沟区。14天后，肿瘤达到用于WBI测定的足够尺寸。在第一组小鼠中，静注1mg的FITC-共轭的c-真菌DNA酶(FITC-DNA酶)来处理对照组小鼠(n＝5)，而用包含1mg FITC-DNA酶和约3mg的G4-PEG(MeI)的树枝状聚合物-DNA酶复合制剂来处理试验小鼠(n＝5)，获得CR为1(即DNA和树枝状聚合物在所述小鼠中的最终浓度为50μM，如果假定稀释进入小鼠的血量为约2mL)。以～200μl/10秒的注射速率经由尾静脉给药静脉内(i.v.)注射剂。在45’(分钟)处死所述小鼠(n＝10)，立即将肿瘤冷冻固定在TissueTek(Triangle Biomedical Sciences)中。除了这些处理的小鼠(n＝10)，将几只未处理的小鼠用作阴性对照。给第二组小鼠(n＝10)注射相同的DNA酶-树枝状聚合物复合物，在24小时的时期后，使用WBI检查肿瘤中的荧光。24小时后，处死该第二组小鼠，检查内部的荧光。在注射后5’(分钟)、15’、30’和45’(对于第一组小鼠)和在24小时(对于第二组小鼠)通过WBI监测静脉注射后的DNA酶清除率。
结果和讨论
1.用于核酸的树枝状横切面试剂的合成和表征
在图2中总结了聚(丙烯亚胺)转染剂的合成，其中图解了第2代树枝状聚合物的转化步骤。按相似的方式转化其它代的PPI-树枝状聚合物。在第一步中，通过与活化的羧酸衍生物“RCOOH”(本文已经使用的乙酸酐或者没食子酰氯衍生物；其它类型的活化的羧酸也是可能的，参见例如Kreider JL等人，2001)反应而酰胺化伯胺端基。在第二步中，通过与碘甲烷反应季铵化内部叔胺。在第三步中，用碘化物抗衡阴离子交换氯化物。
所有制备的树枝状聚合物均可溶于水和醇，并且大多数还可溶于更多非极性溶剂比如氯仿中。报道的1H NMR和13C NMR数据与指定的结构一致。在CDCl3和CD3OD中，来自所述树枝状聚合物内部的所有质子和碳是相当宽泛的，尤其对于较高代的树枝状聚合物。当甲基化(季铵化)时，接近叔胺的亚甲基质子的宽信号约2.2-2.5ppm迁移至乙酰化树枝状聚合物的3.5-4.0ppm和PEG基化的树枝状聚合物的约2.7-2.9ppm。在13C NMR中，可见两种类型的树枝状聚合物，这些亚甲基碳从约50-55ppm迁移至约60ppm，而对于引入的甲基，另外的信号出现在约50ppm。在D2O中，接近叔胺或季铵的亚甲基的信号较不宽。所有的NMR数据与之前对其它季铵化的树枝状聚合物的报道结果一致。
应注意，NMR数据证实季铵化进行得非常好，但是它们没有证实甲基化进行得完全，即未必所有的叔胺都转化成了季铵化的阳离子位点。在较低代的未季铵化的树枝状聚合物上有可能获得质谱(mass)数据，但是所述季铵化的树枝状聚合物的MS分析迄今为止都失败了，可能是由于在所述树枝状分子上有许多电荷。为方便起见，在本文中所有绘制的结构都是完美的全部甲基化的类型(图2)。
作为最后的表征工具，有可能使用尺寸排阻色谱法(SEC)，一种通常用于研究大分子的分子量(分布)的技术来分析所制备的树枝状聚合物。使用TSK-GEL G3000PWX1柱和使用在选择的pH下的水性洗脱液(例如在较低pH值下的0.1M的柠檬酸缓冲液)，可以分析未季铵化的和季铵化的所有制备的PPI-树枝状聚合物。使用该技术来评价所制备的树枝状聚合物的稳定性(参见下一部分)。
2.改性的PPI-树枝状聚合物在水中的稳定性
所设计和制备的树枝状聚合物可以仅用作转染剂，如果能确保它们在生理条件下的稳定性。因此，在4天内通过每日监测保存在约37℃下的这些树枝状聚合物的D2O溶液的1H NMR和13C NMR谱测试选择的树枝状聚合物。记录第2代树枝状聚合物G2、G2(MeI)和G2(MeCl)及第4代树枝状聚合物G4(MeI)的光谱。在4天测试期之前、期间和之后，所有的树枝状聚合物显示出类似的光谱特性，因此所述树枝状聚合物在模拟的生理条件下没有显示出明显的水解。
通过使用SEC监测保持在37℃下的第4代树枝状聚合物G4-PEG和G4-PEG(MeCl)获得证实(季铵化的)树枝状聚合物稳定性的更强证据。所有SEC数据均图解在图3中。在实验的几天期间，样品的SEC色谱根本没有改变它们的形状，所以没有发现将导致形成较低分子量的物质的降解的证据。SEC-迹线显示出在所述色谱的较高分子量(左)侧有一个肩峰(shoulder)。可能，该肩峰指示存在有限量的二聚树枝状聚合物物种。应注意所述肩峰也存在于作为合成起点的第4代胺封端的树枝状聚合物的SEC中。
3.使用PAGE的树枝状聚合物-DNA酶结合实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种通常用于分析蛋白质和核酸的技术。所研究的物质的洗脱取决于其尺寸和其电荷。例如，SDS-PAGE(向凝胶缓冲液中加入十二烷基硫酸钠)被用于评价(未折叠的)蛋白质的分子量。
本文中，进行PAGE来研究几种聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物结构与DNA酶分子的结合性质(详细参见实验部分)。在洗脱和染色后，游离的DNA酶在凝胶上出现单个带。如果当混合DNA酶和另一种物质时出现结合，则与所述游离的DNA酶相比，DNA酶在混合物中的洗脱行为改变了，因为所述DNA物质的容积和/或电荷改变了。这导致在相同位置的DNA带，但是其具有较低的强度(一部分DNA是复合的)，导致在凝胶另一个位置的带，或导致所述带完全消失。为了评价该组制备的树枝状聚合物的结合能力，将所述DNA酶和所述树枝状聚合物以不同的电荷比混合，其中电荷比定义为在所述树枝状聚合物中的叔胺加季铵的数量除以在所述DNA上带负电的磷酸盐基团的数量。
已经研究了在表2中给出的DNA酶分子与不同的树枝状聚合物的结合。本文中，选择三种凝胶，并且显示在下述图4中以阐述所述发现；制备所述凝胶，并且使其在pH＝7的TBE缓冲液中运行。在附加信息中，收集更多记录的PAGE凝胶。
凝胶A显示了酰化的和碘甲烷季铵化的树枝状聚合物G2(MeI)和G4 (MeI)之间的比较。显而易见，第4代树枝状聚合物比第二代相应物结合DNA酶更好，所述第二代树枝状聚合物在所研究的浓度下似乎不诱导结合。该观察可通过G4(MeI)树枝状聚合物负载多达两倍的阳离子位点每分子(30对14)的事实来解释，因此其设计与在所述DNA酶中的33个负电荷更匹配。凝胶B比较了季铵化(G4(MeC1))或未季铵化的(G4)的酰化的第4代树枝状聚合物。这两种树枝状聚合物都能相当有效地结合所述DNA酶，但是季铵化的G4(MeCl)物质更有效，如即使在1/2的树枝状聚合物-DNA电荷比，几乎所有的DNA被结合。最后，凝胶C比较了季铵化的(G4-PEG(MeI))或非未季铵化的(G4-PEG)的乙二醇没食子酸酯(glycolgallate)改性的第4代树枝状聚合物。再次，显然季铵化的物质结合DNA酶更好，但是该结果也表明酰化的G4-树枝状聚合物(参见凝胶B)与DNA的结合比PEG基化的G4-树枝状聚合物的更好，因为较高过量的PEG基化的树枝状聚合物是有效地结合DNA酶所必需的。
也研究了使用乙酸/β-丙氨酸缓冲液在4.4的pH值下的树枝状聚合物的结合性质(没有凝胶显示)。与在pH＝7下的测试相比，所研究的未季铵化的树枝状聚合物似乎结合得更好，而季铵化树枝状聚合物结合DNA的程度略微少些。该结果可通过未季铵化的树枝状聚合物在较低pH-值下的质子化来解释，以便这些树枝状聚合物也在它们的内部具有多个阳离子位点，促进与DNA酶的结合。
最后，选择G4-PEG(MeI)用于浓度范围结合研究。使用负载每道在12.5微升中0.1、0.2、0.4、0.8和1.6微克的DNA，而电荷比从2∶1至3∶2至1∶1(树枝状聚合物过量)改变。当然，PAGE-研究表明结合在较低的浓度下减少：在0.1微克的负载下，所述DNA几乎完全不结合，而在0.8微克或更高的负载下，甚至在1∶1的最低电荷比下，所有的DNA结合(参见用于获得该浓度结合研究而获得的PAGE-凝胶的附加信息)。
该结果证实在它们的内部具有多个阳离子位点的合成的树枝状聚合物可以按约40微克DNA每mL(相当于约4μM的摩尔浓度)的浓度和约2∶1-1∶1的电荷比(稍过量的树枝状聚合物)结合ss-DNA酶33-低聚物。在文献中报道的转染剂通常需要更高的浓度和/或更高的电荷比，以使得与DNA客体有效地复合(参见例如Haensler J 1993，其中在200μg/ml的DNA浓度下进行某些结合测试)。而且，在G4-PEG(MeI)物质上的浓度范围结合研究显示出在树枝状聚合物和DNA酶之间的结合是可逆的，能分离所述复合物和释放所述DNA酶。
5.改性的PPI-树枝状聚合物的体外毒性
为了评价它们作为基因转染剂的适合性，在4种不同的细胞系MCF7、Malme-3M、HT29和K562-C1000上使用MTT试验研究选择的改性PPI-树枝状聚合物的毒性。第2代酰化的树枝状聚合物G2、G2(MeI)和G2(MeCl)在低于100μM的浓度下，不会对所有的4种细胞系产生毒性，而第4代酰化的树枝状聚合物G4、G4(MeI)和G4(MeCl)在低于用于这些细胞的20μM的水平下没有显示出毒性的信号。最后，第5代树枝状聚合物G5-PEG和G5-PEG(MeI)在最高的研究水平(2.5μM)下是无毒的。这些浓度比用相应的第2代、第4代和第5代树枝状聚合物的标准体外转染实验使用的水平高20、20和5倍。
已经特别地研究了第4代树枝状聚合物的毒性，因为发现第4代树枝状聚合物比它们的第二代相应物结合所述DNA酶更有效(参见如上所述的PAGE试验)。对于六种所研究的树枝状聚合物(即G4、G4(MeI)、G4(MeCl)、G4-PEG、G4-PEG(MeI)和G4-PEG(MeCl))中的每种，使用MTT试验评价细胞毒性，同时施用可变量的树枝状聚合物(1μM、2μM、5μM、10μM和20μM)和血清浓度(10％、20％、30％和40％的胎牛血清)。如在图5中可见，在1-5μM的浓度下，所有六种树枝状聚合物没有产生特定的毒性，在4天处理后，＞70％的细胞幸存。然而，在较高的浓度下，特别是G4-PEG(MeI)显示出明确的毒性，如细胞存活率明显下降低于50％。其它的树枝状聚合物在10μM的浓度下仍显示出约30％的低细胞死亡，并且在20μM的浓度下显示出30-60％的部分毒性。G4-PEG(MeCl)即使在20μM水平也保持其低毒性。图6以其它方式表示相同的MTT-试验数据，对每种树枝状聚合物分类，并显示出在较高浓度下增加的毒性。在图5和图6显示的数据中使用10％的血清水平。
在增加量的血清存在下，使用10％至40％的水平，也测定六种G4-树枝状聚合物中每种的毒性。当使用较高量的血清时，所有的树枝状聚合物产生较低的毒性(图7)。明显地，当使用20％-40％的血清时，树枝状聚合物的毒性似乎(几乎)与使用的浓度无关；即使在20μM水平下，对于所有的树枝状聚合物，细胞存活率显然高于50％，除了树枝状聚合物G4-PEG(MeI)在高于10μM的浓度下变得有毒性。
可以从本文描述的MTT毒性试验得出结论，几乎所有设计的和制备的PPI-树枝状聚合物显示出低水平的毒性。根据本发明的化合物的这一性质非常重要，因为低毒性或无毒性对于成功地用于人类，特别是用于基因治疗是相当重要(sine qua none)的条件。可能在季铵化的树枝状聚合物中的抗衡阴离子在某些程度上决定了物质的毒性，并且看来使用氯化物抗衡阴离子代替碘化物是有利的。
6.使用改性的G4 PPI-树枝状聚合物的DNA酶的体外转染
已经使用FACS分析在A2780卵巢癌细胞上研究了使用第4代改性的PPI-树枝状聚合物作为递送剂的DNA酶的转染。在所有转染试验中使用电荷比CR＝1和浓度为1μM的树枝状聚合物-DNA酶以保持低水平的毒性(参见以上给出的MTT毒性试验)，并保留在所述浓度域内，其中预期在DNA和树枝状聚合物之间存在结合(参见以上给出的PAGE结合试验)。已经研究了在培养基中增加水平的血清(10％、20％、30％和40％FCS)来模拟体内条件。
所有6种树枝状聚合物显示出高的转染效率，通常超过80％，乙酰化的季铵化树枝状聚合物G4(MeI)和G4(MeCl)显示出最好的结果(图8)。明显地，在PEG基化的树枝状聚合物种类中(图8B)，当未季铵化的体系G4-PEG与季铵化的体系G4-PEG(MeI)和G4-PEG(MeCl)比较时，功效几乎不存在差异。最后，转染试验显示出血清在培养基中的含量几乎不影响体外递送的效率。游离的DNA酶，即没有使用树枝状聚合物转染剂，转染效率仅仅为5-10％，如在对照实验中确定的。在毒性试验的确定中，在这些体外递送试验中已经发现了约15％的细胞毒性，如通过碘化丙啶染色显示的。
当使用阳离子脂质体转染剂DOTAP(Roche)(MW＝约700)时，对于所述树枝状聚合物体系，发现的转染效率与在相同的组织中发现的类似。然而，该脂质体只可以中和一个负电荷/分子，从而需要达到CR为1的量使得所述转染混合物的毒性很高。结论是，使用DOTAP递送方法在体内似乎不可行。
7.使用改性的G4 PPI-树枝状聚合物的DNA酶的体内递送
使用G4-PEG (MeI)树枝状聚合物进行在本文给出的初步体内试验。为了该目的，已经拒绝显示出最有力的体外转染能力的乙酰化的季铵化的树枝状聚合物G4(MeI)和G4(MeCl)，因为当将它们与DNA酶以制备用于体内研究的样品所需的浓度混合时，它们产生不溶性沉淀物(例如，当以约700μM的浓度，即比在上述结合、毒性或体外转染试验中使用的高得多的浓度混合时，G4(MeI)和DNA酶产生白色沉淀)。
在用树枝状聚合物/FITC-标记的DNA酶复合物静脉处理小鼠后，使用整体成像(WBI)显像荧光。5分钟后，荧光在体内随处可见。在45′后，使用WBI，在五只小鼠的三只中，荧光不再外部可见，尽管荧光在十二指肠起始段局部聚集，如在死后解剖后可见的。然而，五只小鼠的两只显示出靠近肿瘤的弱外部可见的荧光。使用共聚焦显微镜分析这两种样品来确定用WBI观察的荧光是否实际上共存(co-localized)在细胞内。在注射24小时后，不能看到荧光，无论在外部还是解剖后的体内。
在显示出FITC标记物的外部可见聚集后，切片肿瘤并经由共聚焦显微镜分析，得到类似FITC标记物在组织中聚集的密集斑点(intensivespotty)。该斑点样图案和在核中广泛聚集的原因仍然不清楚。存在高的与TOPRO3(红色)染料的共存，显示出FITC标记物存在于核中。进行另一种染色(氟硼荧鬼笔环肽(蓝色))以观察细胞的β-肌动蛋白水平。
在从处理的小鼠切除的肿瘤制备的切片中，可见类似孔的大腔，并且似乎存在于大多数聚集的FITC标记物的附近。从未处理的小鼠的肿瘤中得到的切片没有这些类似腔的结构。而且，至于这些腔是怎样和为何存在的仍然是不清楚的。它们是否作为用于寡DNA的陷阱工作或如果它们由树枝状聚合物-DNA酶复合物或一旦分离的所述复合物(单独的树枝状聚合物)的一部分产生需要进一步研究。没有处理的样品在核周围具有更好的β-肌动蛋白染色。然而，在处理的样品中，在包含FITC标记的区域，这是几乎不可能检测到的。
结论
由于后转录基因领域的静寂不断被新的另外的参与者例如短干扰性(si)RNA和微(mi)RNA推进，药物递送领域在提供更好和更安全的转染剂以适应寡核苷酸治疗剂的需要方面承受着越来越大的压力。尽管市场上的多数递送剂自称能在很多细胞类型中获得高的转染效率和低毒性，但目前没有一种表明它们自己可适宜作为在体内的药物递送工具。
在本申请中，已经描述了改性的PPI-树枝状聚合物-其中的某些在以前从未报道过-其可以容易地制备，并且可以作为在基因治疗中的转染剂。证实设计和制备的PPI-树枝状聚合物在水性环境中是稳定的，并且这些树枝状聚合物能体外递送ss-DNA酶低聚物进入卵巢癌细胞，同时仅诱导低的细胞毒性。该递送是有效的，因为DNA酶的结合和转染可以在低浓度和低电荷比下进行(即低过量的树枝状聚合物仍然能转染)。而且，初步的体内实验表明递送是可行的。最后，最初的PAGE结合研究表明双链的siRNA(44个核苷酸)也结合到本文描述的PPI-树枝状聚合物上，因此核酸的结合和转染似乎不会只限于在本申请中作为模型的ssDNA酶。
附图目录
图1：第二代PPI-树枝状聚合物的分子结构。
图A：在pH＝7下树枝状聚合物G2(MeCl)、G4(MeI)、G4-PEG(MeCl)、G5-PEG和G5-PEG(MeI)与DNA-酶33-链节的结合量。
图B：在pH＝7下浓度结合研究。
图2：聚(丙烯亚胺)转染剂的合成，图解了第2代树枝状聚合物的转化步骤。
图3：改性的PPI-树枝状聚合物在水中的稳定性(SEC数据)。
图4：使用PAGE的树枝状聚合物-DNA酶结合实验。
图5：改性的PPI-树枝状聚合物的体外毒性：MTT-试验数据，按每个电荷比分类。
图6：改性的PPI-树枝状聚合物的体外毒性：MTT-试验数据，按每种树枝状聚合物分类。
图7：在增加浓度的血清存在下，改性的PPI-树枝状聚合物的体外毒性：MTT-试验数据，按每个电荷比和每种树枝状聚合物分类。
图8：改性的PPI-树枝状聚合物的体外转染效率：FACS分析，按每种树枝状聚合物分类。
参考文献目录
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Claims (12)

1.1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，包括外部端基和内部胺基，其特征在于：
(a)基本上所有的外部端基为式(I)的基团：
Figure S2006800248477C00011
其中R为选自下述的基团：C1-10烷基、下式的聚乙二醇基：
-CH2-OCH2-CH2--OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和
下式的聚乙二醇没食子基：
-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和
(b)基本上所有的内部胺基为阳离子季铵基团。
2.1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，其特征在于所述改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物是通过下述步骤获得的：
(a)首先聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物与酰化剂反应，所述聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物基本上包含外部胺端基和内部叔胺基，所述酰化剂选自乙酸酐、C1-10烷基卤化物，下式的聚乙二醇酸：
HOOC-CH2-OCH2-CH2-OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和
下式的聚乙二醇没食子酰卤化物：
X-C(＝O)-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，并且X为卤化物；和
(b)步骤(a)中得到的产物与季铵化试剂反应。
3.根据权利要求2的改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，其特征在于所述卤化物为氯化物。
4.根据权利要求1至3任一项的改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，其特征在于所述树枝状聚合物选自季铵化的下列化合物：
DAB-树枝状-(NHCOCH3)4，
DAB-树枝状-(NHCOCH3)8，
DAB-树枝状-(NHCOCH3)16，
DAB-树枝状-(NHCOCH3)32，
DAB-树枝状-(NHCOCH3)64，
DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)4，
DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)8，
DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)16，
DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)32和
DAB-树枝状-(NHCOPh((EO)4OMe)3)64。
5.适于给药至哺乳动物的药物组合物，其特征在于其包括：(a)根据权利要求1至4任一项的改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物；和(b)阴离子生物活性治疗因子。
6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于所述阴离子生物活性治疗因子选自药物活性化合物、核酸、核酸序列、DNA和RNA的低聚物、多核苷酸、DNA酶、单链和双链DNA、单链和双链RNA、反义RNA和DNA、锤头RNA、短干扰RNA、微RNA、核酶等；或其组合。
7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于所述阴离子生物活性治疗因子具有等于或少于5,000道尔顿的分子量。
8.根据权利要求1至4任一项的化合物作为用于阴离子生物活性治疗因子的转染剂的用途。
9.根据权利要求5至7任一项的药物组合物在基因治疗中的用途。
10.根据权利要求5至7任一项的药物组合物用于治疗下述病症的用途：与肝、肾有关的癌症肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性粒细胞白血病、尤因肉瘤、妊娠期滋养层癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤扩散大细胞淋巴瘤、滤泡性混合淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、横纹肌肉瘤、阴囊癌、肾母细胞瘤、肛门癌、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、毛细胞白血病、脑癌和颈癌、肺(小细胞)癌、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、卵巢癌、脑肿瘤(星形细胞瘤)、宫颈癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、肺(非小细胞)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、乳腺癌、结肠直肠癌(III期)、骨肉瘤、卵巢癌(III期)或其组合。
11.1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，包括外部端基和内部胺基，其特征在于：
基本上所有的外部端基为式(I)的基团，其中R为选自下述的基团：C1-10烷基、下式的聚乙二醇基：
-CH2-OCH2-CH2-OnMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；和下式的聚乙二醇没食子基：
-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
12.1、2、3、4或5代改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物，也包括不完全的树枝状聚合物及其混合物，其特征在于所述改性的聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物是通过下述步骤获得的：
首先聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物与酰化剂反应，所述聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物基本上包含外部胺端基和内部叔胺基，所述酰化剂选自乙酸酐、C1-10烷基卤化物，下式的聚乙二醇酸：
HOOC-CH2-OCH2-CH2nMe
其中n为3、4、5、6、7、8、9、10、11或1 2；和
下式的聚乙二醇没食子酰卤化物：
X-C(＝O)-C6H2-3，4，5-(OCH2-CH2-OmMe)3
其中每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，并且X为卤化物。
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