JP2004523624A - 新規なデンドリティックポリマー、およびその生物医学的使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】
【解決手段】新規なデンドリティックポリマーを使用して、創傷を臨床的にシールするかまたは修復し、そして外傷を受けた組織または変性した組織を処置する。デンドリティック高分子のような新規な架橋可能バイオポリマーを、インビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)で用いて、眼科、整形外科、心臓血管、形成外科、肺、または泌尿器の、創傷または傷害を処置する。架橋可能デンドリティック高分子は、一光子分光分析法および多光子分光分析法を用いて、特定の形状およびサイズの細胞の足場/ゲル/マトリックスに加工され得る。この架橋されたポリマーを、細胞とともに播種して用いて、器官、組織、または骨を修復する。あるいは、このポリマーおよび細胞を混合して、器官、組織、もしくは骨の修復または置換のために、インビボ部位に注射して、その場所(in situ)で架橋させてもよい。
【解決手段】新規なデンドリティックポリマーを使用して、創傷を臨床的にシールするかまたは修復し、そして外傷を受けた組織または変性した組織を処置する。デンドリティック高分子のような新規な架橋可能バイオポリマーを、インビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)で用いて、眼科、整形外科、心臓血管、形成外科、肺、または泌尿器の、創傷または傷害を処置する。架橋可能デンドリティック高分子は、一光子分光分析法および多光子分光分析法を用いて、特定の形状およびサイズの細胞の足場/ゲル/マトリックスに加工され得る。この架橋されたポリマーを、細胞とともに播種して用いて、器官、組織、または骨を修復する。あるいは、このポリマーおよび細胞を混合して、器官、組織、もしくは骨の修復または置換のために、インビボ部位に注射して、その場所(in situ)で架橋させてもよい。
Description
【関連出願の引用】
【0001】
本出願は、その内容全体が参考として本明細書中に明確に援用されている、2001年2月26日出願の米国仮出願番号60/270,881号に基づき、かつその出願の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【0002】
本発明は、創傷をシールするかまたは修復するような臨床的な処置、および他の外傷を受けた組織または変性した組織の処置に関する。特に好ましい形態では、本発明は、デンドリティック高分子(dendritic macromolecule)などの新規な架橋可能なバイオポリマーの使用、およびそれらのインビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)における使用において特に具体化される。このような用途としては、眼科、整形外科、心臓血管、肺、または泌尿器の創傷および傷害が挙げられる。これらの生体材料/バイオポリマーは、創傷の部位に容易に接近できない場所か、または縫合糸なしの手術が所望される時の、他の外科手術のために有効なシーラント/グルー(glue)となると考えられる。架橋可能なデンドリティック高分子は、一光子分光分析法および多光子分光分析法を用いて、特定の形状およびサイズの細胞の足場/ゲル/マトリックスに加工され得る。このポリマーを、架橋した後に、細胞とともに播種して用い、次に器官、組織、または骨の修復、または置換に用い得る。あるいは、このポリマーおよび細胞を混合して、次に器官、組織、もしくは骨の修復または置換のために、インビボ部位に注射して、その場所(in situ)で架橋させてもよい。この架橋されたポリマーは、新生の細胞増殖のために3次元の鋳型を提供する。この方法は、種々の再建術(3次元の組織欠損を再建するための細胞移植物の注文成形を含む)に用いることが可能である。架橋可能なバイオデンドリティック高分子および架橋不可能なバイオデンドリティック高分子は、薬物送達ビヒクル、または医薬のキャリア、および医療用画像処理の造影剤として用いられ得る。
【0003】
(発明の背景および要旨)
A.デンドリティック高分子
デンドリティックポリマーは、中心のコアから放射する反復する分岐単位から構成される、球形の単分散ポリマーである。(US5714166;US4289872;US4435548;US5041516;US5362843;US5154853;US05739256;US5602226;US5514764;Bosman,A.W.;Janssen,H.M.;Meijer,E.W.Chem.Rev.1999,99,1665〜1688.Fischer,M.;Vogtle,F.Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,884〜905.Zeng,F.;Zimmerman,S.C.Chem.Rev.1997,97,1681−1712.Tomalia,D.A.;Naylor,A.M.;Goddard,W.A.Angew.Chem.int.編、Engl.1990,29,138)。これらの高分子は、ダイバージェント(divergent)(コアから表面へ)なアプローチ(Buhleier,W.;Wehner,F.V.;Vogtle,F.Synthesis 1987,155−158.Tomalia,D.A.;Baker,H.;Dewald,J.;Hall,M.;Kallos,G.;Martin,S.;Roeck,J.;Ryder,J.;Smith,P.Polymer journal 1985,17,117〜132.Tomalia,D.A.;Baker,H.;Dewald,J.;Hall,M.;Kallos,G.;Martin,S.;Roeck,J.;Ryder,J.;Smith,P.Macromolecules 1986,19,2466.Newkome,G.R.;Yao,Z.;Baker,G.R.;Gupta,V.K.J.Org.Chem.1985,50,2003)1、またはコンバージェント(convergent)(表面からコアへ)なアプローチ(Hawker,C.J.;Frechet,J.M.J.J.Am.Chem.Soc.1990,112,7638−7647)のいずれかを用いて合成される。この研究領域は、TomaliaおよびNewkomeの初期の研究以来、この10年間に驚異的な発展を遂げた。線状ポリマーに比べて、デンドリマーは、高次であり、ボリュームレシオ(容積比)に対して高い表面積を有し、そして官能化のための多数の末端基を表出する。結果として、デンドリマーは、産業上の適用および生体医学適用の両方について、以下を含む、いくつかの好適な物理的特徴を示す:小さい多分散性指数(PDI)、低い粘性、高い溶解度および混和性、ならびに優れた接着性。生体医学/生物工学の適用(例えば、MRI、遺伝子送達、および癌の治療)について検討された多くのデンドリマーは、芳香族ポリエーテルまたは脂肪族アミドの誘導体であり、従ってインビボ用途のためには理想的ではない(Service,R.F.Science 1995,267,458−459.Lindhorst,T.K.;Kieburg,C.Angew.Chem.Int.編、1996,35,1953−1956.Ashton,P.R.;Boyd,S.E.;Brown,C.L.;Yayaraman,N.;Stoddart,J.F.Angew.Chem.Int.編.1997,1997,732−735.Wiener,E.C.;Brechbeil,M.W.;Brothers,H.;Magin,R.L.;Gansow,O.A.;Tomalia,D.A.;Lauterbur,P.C.Magn.Reson.Med.1994,31,1−8.Wiener,E.C.;Auteri,F.P.;Chen,J.W.;Brechbeil,M.W.;Gansow,O.A.;Schneider,D.S.;Beldford,R.L.;Clarkson,R.B.;Lauterbur,P.C.J.Am.Chem.Soc.1996,118,7774−7782.Toth,E.;Pubanz,D.;Vauthey,S.;Helm,L.;Merbach,A.E.Chem.Eur.J.1996,2,1607−1615.Adam,G.A.;Neuerburg,J.;Spuntrup,E.;Muhler,A.;Scherer,K.;Gunther,R.W.J.Magn.Reson.Imag.1994,4,462−466.Bourne,M.W.;Margerun,L.;Hylton,N.;Campion,B.;Lai,J.J.;Dereugin,N.;Higgins,C.B.J.Magn.Reson.Imag.1996,6,305−310.Miller,A.D.Angrew.Chem.Int.編.1998,37,1768−1785.Kukowska−Latallo,J.F.;Bielinska,A.U.;Johnson,J.;Spinder,R.;Tomalia,D.A.;Baker,J.R.Proc.Natl.Acad.Sci.1996,93,4897−4902.Hawthorne,M.F.Angew.Chem.Int編.1993,32,950−984.Qualmann,B.;Kessels M.M.;Musiol H.;Sierralta W.D.;Jungbiut P.W.;L.,M.Angew.Chem,lnt.編、1996,35,909−911)。バイオデンドリマーは、生体適合性であるか、またはインビボにおいて天然の代謝物に分解可能であることが公知の構成単位から全体として構成されるデンドリティック高分子の新規なクラスである。本特許は、新規なデンドリマーおよびデンドリティック高分子の合成、特徴づけ、および用途を記載する。この新規なデンドリマーおよびデンドリティック高分子は、このような生体適合性または天然の代謝物のモノマー(例えば、限定はしないが、グリセロール、乳酸、グリコール酸、コハク酸、リボース、アジピン酸、リンゴ酸、グルコース、クエン酸など)から構成され、「バイオデンドリマー(biodendrimer)またはバイオデンドリティック高分子(biodendritic macromolecule)」と呼ばれる。
【0004】
本発明は該して、ポリエステル、ポリエーテル、ポリエーテルエステル、およびポリアミノ酸、またはそれらの組み合わせのデンドリティックポリマーおよびコポリマーの合成および製造(加工)の領域にある。例えば、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、およびそれらのコポリマーは、合成ポリエステルであって、特定の用途についてFDAに承認されており、そして縫合糸、薬物送達のキャリア、および臓器不全または組織欠損のための組織工学の足場として首尾よく用いられている(Gilding、およびReed,Polymer,20:1459(1979);Mooneyら、Cell Transpl.,2:203(1994);ならびにLewis,D.H.(Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,Chasin,M.,およびLanger,R.編,Marcel Dekker,New York,1990))。組織工学の適用においては、単離された細胞または細胞クラスターを、合成の生分解性ポリマーの足場に付着または埋め込み、そしてこのポリマー−細胞の足場を、次にレシピエントに移植する(LangerおよびVacanti,Science,260:920(1993))。軟骨細胞を含む多数の細胞タイプが用いられている(Freedら,BIO/Technology,12:689(1994))。本発明に記載される新規なバイオデンドリマーと同様、この利点としては、天然に存在する代謝産物を生じるような生理学的環境中でのその分解性、および乳酸の比を変化させることによってその分解の速度を制御する能力が挙げられる。デンドリティック構造において、分解は、用いられるモノマーのタイプ、および生成数の両方によって制御され得る。
【0005】
本発明のさらなる実施形態は、末端基に対して、またはデンドリマー構造内に、細胞認識のための生物学的認識単位を結合させることである。例えば、トリペプチドであるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)が、細胞結合のための構造に付加されてもよい。Barreraらは、低濃度のN−イプシロン−カルボベンゾキシ−L−リジン単位を含むポリ(乳酸)(pLAL)の合成を記載した。このポリマーは、ポリマー−細胞相互作用を改善するために、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド配列または他の増殖因子を導入するためのリジン単位の反応を通じて化学的に改変された(Barreraら、J.Am.Chem.Soc.,115:11010(1993);Barteraらの米国特許第5,399,665号)。Barreraらによって開発されたコポリマーにおける最大の制約は、限定された数のリジン単位しか、骨格中に組み込まれ得ないことである。多くの組織工学適用において、線状ポリマーに付着された生物学的に活性な分子の濃度は、ポリマーと身体との間に所望の相互作用を生じるには低すぎる。結果として、組織工学の適用においては、細胞増殖および組織の発達を支持するための足場としての使用のための最適な材料の開発の必要性が存在する。さらに、ポリマーの生体適合性および他の特性を改善するために、ポリアミノ酸、ペプチド、炭水化物のような官能基を、ポリエステル、ポリエーテル−エステル、ポリカーボネートなどに導入する方法が必要である。さらに、異なる生体医学的適用のためにポリマーの化学的改変を可能にするために十分な濃度の誘導体化可能な基を含む、ポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリエステルアミンなどの材料を開発する必要性が存在する。
【0006】
従って、本発明の目的は、異なる生体医学適用(例えば、組織工学適用、創傷管理、造影剤ビヒクル、薬物送達ビヒクルなど)のために化学的に改変され得る、ポリエステルおよびポリアミノ酸、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミノアルコールのデンドリティックポリマーおよびコポリマーを提供することである。本発明のさらなる目的は、改善された特性(例えば、生分解性、生体適合性、機械的強度)を有するポリエステルおよびポリアミノ酸のデンドリティックポリマーおよびコポリマーを提供することである。本発明のなお別の目的は、ポリマーと、細胞、組織または骨との相互作用を改善するために、ペプチド配列または増殖因子のような官能基を含むように誘導体化され得るデンドリティックポリマーを提供することである。
【0007】
従来の線状ポリマーに対する細胞応答(細胞の接着、増殖、および/または分化を含む)は、ポリマーの構造における変化を通じては、制御も改変もされ得ない。なぜなら、これらのポリマーは、末端基以外に、それらの特性を変化させるための化学的改変を可能にする官能基を有さず、それによってこれらのポリマーの適用は制限されるからである。結果として、本明細書に記載される新規なポリマーは実質的に異なる。
【0008】
B.ゲル
本発明は該して、医療処置において、デンドリティックポリマーゲルおよびゲル−細胞組成物を用いる領域にある。ゲルは、3Dポリマー材料であって、これは水中で膨潤する能力、および溶解することなく構造内に水の画分を保持する能力を示す。水含量、環境条件(例えば、pH、温度、溶媒、ストレス)に対する感受性、軟性、接着力、および弾性コンシステンシーのような、ゲルによって示される物理的特性は、生体医学適用および生物工学適用に好適である。実際、ゲルはコーティングとして(例えば、バイオセンサー、カテーテル、および縫合糸)、「同種の(homogenous)」材料として(例えば、コンタクトレンズ、火傷の包帯、および義歯)、およびデバイスとして(例えば、人工臓器、および薬物送達システム)用いられ得る(Peppas,N.A.Hydrogel in Medicine and Pharmacy,第I巻およびII巻 1987.Wichterle,O.;Lim,D.Nature 1960,185,117−118.Ottenbrite,R.M.;Huang,S.J.;Park,K.Hydrogels and Biodegradable polymers for Bioapplications 1994;627巻,268頁)。
【0009】
人工臓器としての細胞の取り込みのためのゲル材料は、15年より長くにわたって探索されてきており、そしてマイクロカプセル化は、多数の疾患状態についての見込みのあるアプローチである。この疾患状態としては、パーキンソン病(L−ドーパミン細胞)、肝臓疾患(肝細胞)、および糖尿病(ランゲルハンス島)が挙げられる。例えば、過去に、ランゲルハンス島(膵臓のインスリン産生細胞)は、ポリ−L−リジンコーティングを有するイオンで架橋されたアルギン酸塩(天然のヒドロゲル)マイクロカプセル中にカプセル化されており、そして移植後に、糖尿病のマウスにおいて血糖値を首尾よく低下させている。
【0010】
C.マクロ多孔性バイオデンドリティックのゲル/構造/材料
組織工学における現在の課題は、十分整列された三次元細胞足場の形成である(R.P.Lanza,R.Langer,W.L.Chick,Principles of Tissue Engineering,R.G.Landes/Academic Press,San Diego,CA,1997.L.Christenson,A.G.Mikos,D.F.Gibbons,G.L.Piccolo,Tissue Eng.3(1997)71.R.Langer,J.P.Vacanti,Science 260(1993)920.N.A.Peppas,R.Langer,Science 263(1994)1715.B.D.Ratner,A.S.Hoffman,F.J.Schoen,J.E.Lemons,Biomaterials Science:An Introduction to Material in Medicine,Academic Press,San Diego,2000.Scientific American April(1999)。このような一時的な細胞足場は、細胞の足場、増殖、遊走、およびある場合には分化の場所を提供することによる、再建された組織のための鋳型として探索されている(J.Patrick,C.W.,A.G.Mikos,L.V.Mclntire,Frontiers in Tissue Engineering,Pergamon,New York,1998)。細胞の足場を構築するために代表的に使用されるバイオポリマーは、ポリエーテルグリコール、およびポリα−ヒドロキシ酸のような線状高分子である(S.W.Shalaby,R.A.Johnson,Biomedical Polymers(1994)2.M.Vert,S.M.Li,J.Mater.Sci.Mater.Med.3(1992)432.E.J.Frazza,E.E.Schmitt,J.Biomed.Mater.Res.Symp.1(1971)43.)。バイオデンドリティックポリマーは、ファイバー結合(A.G.Mikos,Y.Bao,L.G.Cima,D.E.Ingber,C.A.Vacanti,R.Langer,J.Biomed.Mater.Res.27(1993)183.D.J.Mooney,G.Organ,J.P.Vacanti,R.Langer,Cell Transplantation 3(1994)203.)、溶媒キャスティングおよび塩リーチング(A.G.Mikos,A.J.Thorsen,L.A.Czerwonka,Y.Bai,R.Langer,D.N.Wislow,J.P.Vacanti,Polymer 35(1994)1068)、メンブレンラミネーション(膜張合わせ)(membrane lamination)(A.G.Mikos,G.Sarakinos,S.M.Leite,J.P.Vacanti,R.Langer,Biomater.14(1993)323.)、メルトモールディング(溶解成形)(melt molding)(R.C.Thomson,M.J.Yaszemski,J.M.Powers,A.G.Mikos,J.Biomed.Sci.Polym.編.7(1995)23)extrusion,M.S.Widmer,P.K.Gupta,L.Lu,R.K.Meszlenyi,G.R.D.Evans,K.Brandt,S.T.Gurelk,C.W.Patrick Jr,A.G.Mikos,Biomaterials 19(1998)1945)、炭化水素鋳型(hydrocarbon templating)(V.P.Shastri,I.Martin,R.Langer,Proc.Natl.Acad.Sci.97(2000)1970)、および相分離(H.Lo,M.S.Ponticiello,K.W.Leong,Tissue Eng.1(1995)15)のような、マクロ多孔性材料を作製するための処理方法の影響を受けやすい。
【0011】
本発明のさらなる実施形態は、鋳型化−指向性マクロ多孔性製造技術(templated−directed macroporous fabrication technique)における架橋可能なバイオデンドリティックポリマーの使用である。この方法は、種々の物性物理学の適用(分離媒体、および吸収媒体、触媒性支持体、機械的ダンプナー(dampner)、および光結晶が挙げられる)に適用されてきたが、生体材料には適用されなかった。代表的には、無機材料またはポリマー材料は、犠牲的な鋳型の存在下において、制御された沈殿または重合体化によって製造(加工)される(O.D.Velev,T.A.Jede,R.F.Lobo,A.M.Lenhoff,Nature 389(1997)447.A.A.Zakhidov,R.H.Baughman,Z.Lobal,C.Cui,L.Khayyrullin,O.Dantas,J.Marti,V.G.Ralchenko,Science 282(1998)897.J.E.G.J.Wijnhoven,W.L.Vos,Science 281(1998)802.S.A.Johnson,P.J.Olivier,T.E.Mallouk,Science 283(1999)963.C.R.Martin,Science 266(1994)1961.S.H.Park,Y.Xia,Chem.Mater.10(1998)1745)。ついでこの鋳型は、焼成、フッ化水素酸溶解、または有機溶媒溶解によって取り除かれて、鋳型を連想させる空隙を有するマクロ多孔性材料(例えば、ポリスチレンビーズ)を生じる。この技術によって、いくつかの利点(制御された孔径および密度、単分散孔直径、および室温処理)が広範なポリマーに提供される。材料製造(加工)に関するこれらの利点を考慮して、本発明者らは、このアプローチを、足場/ゲル/マトリックスの組織工学のためのバイオポリマーおよびバイオデンドリティック高分子の処理に適合させた。
【0012】
代表的な手順は、以下のとおりである。第一に、所望の大きさのポリスチレンビーズを、エッペンドルフ微量遠心管中での遠心分離によって水性懸濁液から最初に単離する。次に、光重合可能なバイオポリマーおよび光開始剤(DMAP)をこのエッペンドルフに(所望の濃度に対して特異的な容積で)添加して、ボルテックススピナーで、このビーズと混合する。次いで、このポリマーをUVランプを用いて光架橋して、エッペンドルフ管から取り出す。次いで、ポリスチレンビーズを含む架橋されたポリマーを、トルエン中に約72時間浸して、ビーズを溶解させる。ついで、マクロ多孔性生体材料を、多量のエタノールおよび水を用いてリンスして、さらなる使用まで貯蔵する。
【0013】
一連の異なるマクロ多孔性生体材料の走査電子顕微鏡写真によって、光架橋およびビーズ溶解の前に、バイオポリマー中のポリスチレンビーズの立方最密配列から生成されたハニカム構造が示される。ポリスチレンビーズ/バイオポリマーの比を変化させることによって、異なるマクロ多孔性構造が生成され得る。本発明者らはまた、近年、0.2〜90ミクロンのポリスチレン鋳型を用いて、そして光架橋可能なポリサッカライド(ヒアルロン酸)を用いて、マクロ多孔性生体材料を調製した。細孔の大きさは、犠牲的な鋳型の大きさに関連しており、そしてその構造を通じて均一である。
【0014】
まとめると、十分に整列されたマクロ多孔性生体材料を形成するための温和な手順が記載される。上記の実施形態に実証されるとおり、この技術の利点としては、以下が挙げられる:1)約0.2〜90ミクロンの制御された細孔サイズ、2)0.1g〜1.0g/mLの制御された細孔密度、3)単分散細孔直径、4)相互接続された細孔構造、および5)温和な室温処理。
【0015】
合成された光架橋可能なバイオデンドリマーはまた、マスクを用いた単純な線模様(100ミクロン)の構成によって実証されるように、標準的な露光処理方法の影響を受けやすい。原子間力顕微鏡(AFM)によって、このフィルムが、50nmの解像度で感知できるほどの欠損がなく、滑らかでかつ均一であることが示される。高度偏差のRMS平均は、約1.5nmである。
【0016】
本発明のさらなる実施形態は、光、光開始剤、および光架橋可能なバイオポリマー/生態デンドリティック高分子を用いる微細構造加工手順である。光重合化は、一光子過程または多光子過程を介して生じ得る。二光子重合化において、光開始剤のレーザー励起は、少なくとも1つの仮想的状態または非定常状態を通じて進行する(S.Maruo,O.Nakamura,S.Kawata,Opt.Lett.22(1997)132.J.D.Pitts,P.J.Campagnola,G.A.Epfing,S.L.Goodman,Macromolecules 33(2000)1514)。光開始剤は、2つの近赤外光子を吸収し、それをS2状態にさせ、続いてS1状態に減衰させ、そして長寿命の三重項状態へ系間交差させる。入射光子の空間的密度が大きい場合、開始剤分子(三重項状態である)は、TEAからの電子を抽出し、これによってポリマーの光架橋反応を開始して足場を作製する。重要なことに、複雑かつ詳細な構造は、高精度で加工され得る。なぜなら、2光子吸収は、狭い集束条件下では極端に限局化しているからである。2光子誘導性重合化(TRIP)を介した制御された加工を用いて、光バンドギャップ材料および半導体として使用するために、光重合可能な樹脂から3次元構造が開発されてきた(S.M.Kirkpatrick,J.W.Baur,C.M.Clark,L.R.Denny,D.W.Tomlin,B.R.Reinhardt,R.Kannan,M.O.Stone,Appl.Physics.A.69(1999)461)。本発明に従って、TPIPは、バイオポリマーの溶液からの生体医学的に有用な構造の合成に対して適用され、本発明者らの新規な光架橋可能なバイオデンドリマーを用いる、十分に規定された三次元構造の組織工学足場を最終的に作製するためのこの方法を実証する。
【0017】
TPIPは、以下のシステムを用いて実施される。詳細には、レーザー自動読み取り共焦点顕微鏡と組み合わせたフェムト秒近赤外チタンサファイアレーザー(コヒーレント 900°F)が使用される。設定は図面中に図示する。TPIPに用いる平均出力および波長は、それぞれ50mWおよび780nmである。この顕微鏡は、点走査およびラスター走査(ラスタースキャン)のために走査鏡が装備される。レーザー照射のために顕微鏡のステージ上への装填のまえに、顕微鏡用ガラススライドに、約20μLの溶液を滴下する。
【0018】
Pittsらは、BSAおよびフィブリノーゲンのTPIPを試験した[Pitts,2000 #438]、しかしこれらのポリマーは、高密度の光架橋基を有さない。アクリラート終端バイオポリマー、開始剤、および共開始剤の、10000:1000:1の濃度比による水性混合物を最初に調製した。エオシンY(EY)を開始剤として用い、そしてトリエタノールアミン(TEA)を共開始剤として用いた。単純な線模様が作成された。光学顕微鏡、走査電子顕微鏡、および原子力間顕微鏡によって、製造(加工)された構造を確認した。
【0019】
共有結合的に架橋したゲル/マトリックス/足場以外に、本発明は、水素結合またはイオン荷電網目状構造を介する自己組織化のための末端基を記載している。第一の例は、リジンで官能化された1つのバイオデンドリマーを用い、第二の例はコハク酸で官能化されたものを用いる。pH=7.4での混合の際、2つのバイオデンドリマーは、自己組織化してゲルを形成する。同様に、DNA中に存在する水素結合網目状構造、例えば、G:C塩基対を使用することが提案される。これらのG/C誘導体化デンドリマーは、PNAを調製するのに用いられるのと同じヌクレオシド出発物質を用いて合成され得る。
【0020】
本発明はまた、ゲルを形成するためにペプチド水素結合相互作用を用いることを提案する。絹は、反復するGly−Ala単位から主に構成される天然のポリペプチドである。これらのペプチドは、隣接するアミドの水素イオンとカルボニルとの間の強力な水素結合相互作用による長い逆平衡のシートを形成する。バイオデンドリマーの末端にこれらのペプチドを付着することによって、三次元の架橋されたゲルが形成されることが期待される。非共有結合的な相互作用に基づく原理を用いて、バイオデンドリマーから構成される巨視的なゲルが作製され得る。
【0021】
D.器官/組織の修復または置換のためのデンドリティックな細胞構築物/足場/マトリックス/ゲル
本発明はまた、医療処置におけるデンドリティックポリマー−細胞(dendritic polymeric−cell)組成物使用の領域において一般に使用される。いくつかの有用な例(本発明を限定すると解釈されるべきではない)を以下に記載する。
【0022】
(頭蓋顔面の輪郭奇形(craniofacial contour deformities))頭蓋顔面の輪郭奇形は、現在のところ、矯正のための侵襲的な外科手術を必要とする。これらの外傷性または先天性の奇形はしばしば、重篤である。あるいは、審美上の個人的観点のために手術が要求される。これらの奇形はしばしば、異物形成的な補綴物の形態による補強を必要とするが、これは感染および押出の問題を被る。頭蓋顔面の骨格に追加の自家性の軟骨または骨を送達する最小侵襲の方法によって、外科的外傷が最小限になり、そして異物形成的な補綴物の必要性が排除される。架橋可能なゲルおよび細胞(自家性(autoglous)かまたはそうでないもの)を注射することによって、広範な手術なしに、自家性の組織を用いて、頭蓋顔面の骨軟骨骨格を補強し得る。本発明の実施形態は、頭蓋顔面の輪郭奇形を処置するためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0023】
(乳房腫瘍修復の補強)乳腺は、結合組織の層によって、前胸壁の基礎にある筋肉に付着している変性した汗腺である。1つの乳腺は、15〜25の乳腺葉(主に線維芽細胞および膠原線維の束によって形成された密性結合組織によって分離された)、ならびに脂肪細胞(adipose cell(fat cell))を含む脂肪組織(細網繊維および膠原線維によって一緒に保持された)から構成される。広範に分岐する乳管が、各々の乳腺葉の中にある。乳汁を合成して乳管系に分泌する腺上皮細胞(腺房細胞)は、最小の分岐の末端に位置する。乳管は、単純な立方上皮細胞および円柱上皮細胞から構成される。腺房細胞は、疎性結合組織に埋め込まれており、この疎性結合組織は、膠原線維および線維芽細胞、リンパ球、および形質細胞を含む。腺房細胞および乳管上皮細胞に近接して筋上皮細胞があり、これは、収縮して乳汁を搾り出すことによって、ホルモン刺激および神経刺激に応答する。各々の乳管は、乳首を覆う皮膚を通じて、乳房の表面上で開口する。
【0024】
乳房手術は、美容または治療のいずれかとして広範に分類され得る。美容手術としては、インプラント(移植物)を用いる増強、縮小、または再建が挙げられる。治療的な手術は、最も早期の癌のための主な処置であって、以下が挙げられる:1)軟性組織前胸部壁、ならびに頭および頸に伸びるリンパ節および血管の全体の除去を含み得る根治手術、2)乳房の小部分のみを含み得る乳腺腫瘤摘出術;ならびに3)組織の小領域の破壊のためのレーザー手術。しばしば、インプラントを用いた再建手術が、乳房の大切除術において用いられる。根治的乳房切除術は、乳房、大胸筋および小胸筋の両方、ならびにリンパ節の除去を含む。
【0025】
現在、1年に250,000を超える再建術が実施されており、乳癌、先天性欠損、または外傷による損傷の結果としての再建に対する代替手段は少ない。乳房再建は、癌の乳房切除の時点で、またはその直後に頻繁に用いられる。再建手技は頻繁に、下にある結合組織および脂肪組織を伴う血管新生した皮膚皮弁を、身体の1つの領域から別の領域へ移動する手技を包含する。乳房再建には多くの手術方法があり、これには、ティッシュエキスパンジョン(tissue expansion)とその後のシリコン埋め込み、広背筋皮弁、横方向腹直筋皮弁(TRAM)、遊離TRAM皮弁、および遊離臀筋皮弁が挙げられる。完全な再建にはしばしば、乳房切除術および初期再建後にさらなる手技を要する。これらの手技としては、永続的インプラントのためのティシュエキスパンダー交換、再建の修正、乳首の再建、および乳房固定術/乳房縮小が挙げられる。
【0026】
再建および補充のために頻繁に用いられるシリコン補綴物は、多くの医療上の問題をもたらした。適切に機能し、正常な組織と同様に見えてかつ感じられ、そしてX線診断に干渉しない、埋め込み用の代替材料を有することが所望され得る。従って、デンドリティックポリマーまたはデンドリティック高分子および細胞構築物を用いて、乳房組織の再建および補充のための方法および組成物を提供することが本発明の目的である。
【0027】
(口腔の組織修復)口腔の組織修復は、別の領域であり、ここでは、口腔組織細胞を増殖するため、およびインビボで見出された対応物に対する口腔組織類似物の構成要素の形成のために、3次元のポリマー足場/マトリックス/ゲルが用いられ得る。これらの増殖細胞は、タンパク質を生成し、このマトリックス上に播種された口腔組織細胞の長期増殖を支持するのに必要な細胞外マトリックス成分、増殖因子、および調節因子を分泌する。このマトリックス上に沈着する線維性のまたは間質性の細胞外マトリックス組織の生成は、インビトロにおける口腔組織の長期増殖によってもたらされる。この足場/マトリックス/ゲルの3次元構造は、特定の口腔組織のためのインビボ条件に、より接近して近くなり、これによって細胞の成熟および移動を促進する微小環境の形成が可能になる。特定の増殖因子または調節因子がまた、添加されて、細胞増殖および細胞外マトリックス生成をさらに増強し得る。
【0028】
目的の組織としては、歯髄、象牙質、歯肉、粘膜下組織、セメント質、歯周組織、口腔粘膜下組織または舌組織の細胞が挙げられる。引き続き形成された組織サンプルは、歯髄、象牙質、歯肉粘膜下組織、セメント質、歯周組織、口腔粘膜下組織または舌組織のサンプルである。この組織サンプルは、歯髄由来線維芽細胞において富化された口腔組織サンプルから得られた生存可能な出発細胞を培養することによって形成され得る。本発明の特定の局面において、この歯髄由来線維芽細胞において富化された生存可能な出発細胞は、抜歯された歯から得られる。さらに、この組織サンプルは、細胞の供給源として、歯肉粘膜下線維芽細胞、歯髄、または歯根膜線維芽細胞において富化された口腔組織サンプルから得られる生存可能な出発細胞を培養することによって形成され得る。歯肉生検は、ドナー部位の罹患をほとんどまたは全く伴わずに、慣用的な歯科の手技によって得ることができる。本発明の実施形態は、口腔修復のためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0029】
この口腔組織サンプルは、患者への適用の前にこのマトリックスから再度分離され得るか、またはインビボに置かれ、そしてその場所(in situ)で架橋され得ることが理解される。同等に、この口腔組織サンプルは、このマトリックスとの組み合わせで適用され得、ここでこのマトリックスは好ましくは、生体適合性マトリックスである。口腔組織の再建をもたらすための、動物の特定の口腔組織部位への培養したマトリックス−細胞調製物の埋め込みは、この調製物の意図される機能に依存して、生分解性マトリックスを含んでも、または非生分解性マトリックスを含んでもよい。
【0030】
(尿失禁)尿失禁は、全てのGU疾患のうちで最も普通であり、かつ最も難治性である。尿を保持することができないこと、および尿を無意識に排尿しないことができないことは、2セットの筋肉の間の相互作用によって管理される。排尿筋(膀胱の外部筋肉被覆を形成する縦方向の線維の複合体)は、副交感神経系を活性化する。第二の筋肉(膀胱括約筋の平滑筋/横紋筋である)、および排尿の活動は、排尿筋が収縮するのと同時に、括約筋が随意的に弛緩されることを必要とする。年をとるにつれて、括約筋を随意的に制御する能力が低下する。最も共通の失禁(特に高齢者において)は、急迫性尿失禁であり、これは差し迫った排尿の前にごく短い予兆しかない。急迫性尿失禁は、機能亢進性の排尿筋による結果であり、そして代表的には医薬、および/または「トイレトレーニング(toilet training)」で処置される。しかし、反射性尿失禁は、予兆なしに生じ、そして通常は副交感神経系の障害の結果である。高齢の女性で見出される通常の尿失禁は、緊張性尿失禁であり、これはまた妊婦でも観察される。このタイプの失禁は、総症例数の過半数を占める。緊張性尿失禁は、くしゃみ、笑い、または身体的努力のような条件下でも生じ、そして尿の漏れによって特徴付けられる。緊張性尿失禁の重篤度には5つの認知されたカテゴリーがあり、これは0、1、2a、2b、および3というタイプに命名されている。タイプ3は、最も重篤であり、そして内因性の括約筋欠損すなわちISD(Contemporary Urology,March 1993)の診断を要する。投薬、体重減少、運動、および外科的介入を含む、いくつかの処置が存在する。2つの最も通常の外科手術は、漏れを相殺するために膀胱頸部を上げること、または尿道に圧力をかけるために、患者自身の身体の組織からの裏層、もしくは補綴材料(例えば、PTFE)を構築することのいずれかを含む。第二の選択肢は、膣内バルーンまたは陰茎のクランプのような外的デバイスに対して人工括約筋のような補綴デバイスを使用することである。上記の処置方法は、代表的には1年を超える期間については非常に有効である。溢流性尿失禁は、膀胱の解剖学的閉塞または低反応性排尿筋によって生じる。本発明のある実施形態は、尿失禁を処置するためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0031】
(臓器移植)
細胞−足場/ゲル/マトリックス組成物は、その場所(in situ)での重合化のために、またはインビトロ用途のためであって、インビボで機能的な臓器組織を生成するための引き続く埋め込みのために調製される。この足場/ゲル/マトリックスは3次元であり、そして架橋された(共有結合、イオン結合、水素結合など)デンドリティックポリマーまたはコポリマーから構成される。この足場はまた、デンドリティックポリマーのファイバーから形成されてもよい。用いられる細胞は、血管新生した器官組織または幹細胞由来であり、次いでポリマー中に懸濁され、引き続いてインビボで注射され、そして光架橋されて、ゲル−細胞複合体を形成する。あるいは、この細胞は、実施された架橋された足場またはゲルの表面に対してインビトロで付着されて、インビボで、機能的な血管新生した器官組織を生成する。この足場/ゲル/マトリックスはまた、塩基または酸の洗浄を用いて部分的に化学的に分解されて、より親水性の材料を提供し得る。ある距離(これを超えて栄養分および気体の拡散が生じ得る、代表的には100〜300ミクロン)で、織物の足場の線状のファイバー/デンドリティックなファイバーを分離することが、本発明のさらなる実施形態である。あるいは、マクロ多孔性ゲルが、鋳型、発泡など、本発明に記載される手順によって生成され得、これによって1〜1000ミクロンの均一または不均一な細孔が形成される。これらのゲル/足場/マトリックス構造によって、この足場にわたって増殖する細胞へ、そしてこの細胞からの栄養、気体、および廃棄物の拡散および交換が、血管新生のない材料にわたって細胞生存度を維持するのに有効な量で、提供される。
【0032】
ゲル/足場/マトリックスに対して付着する細胞は、リンパ管細胞、膵臓島細胞、肝細胞、造骨細胞、筋細胞、腸細胞、腎臓細胞、血管細胞、甲状腺細胞(単数または複数)、副腎−視床下部下垂体系の細胞であり得る。これらのタイプの細胞以外に、引き続いて所望の特定の細胞タイプに転換する幹細胞も用いられ得る。
【0033】
例えば、糖尿病は、膵臓機能の消失によって生じる疾患である。詳細には、膵臓のβ細胞を生成するインスリンが破壊され、これによって血糖値が高値に上昇する。結果として、血管変化に対する全ての二次的な系において重大な問題が発生する。糖尿病は、米国で16,000,000を超える人が罹患していると推定される。不幸にも、この数は、毎年約600,000の新症例が診断されるという、驚くべき速度で増えている。現在、糖尿病は主に微小血管および大血管の合併症によって、米国の死亡のうち3番目に大きい原因である。これらの合併症としては、手足の切断、潰瘍形成、血管損傷、腎不全、発作(卒中)、および心発作(これらは結果である)が挙げられる。毎日のインスリン注射はかつては、糖尿病の有効な処置であると考えられた。しかし、インスリン依存性糖尿病(IDDM)を有し、かつ伝統的なインスリン療法を受けている人にとっては、これらの恐ろしい合併症がなお存続している。1992年には、糖尿病のコントロールおよび合併症に関するトライアル(Diabets Control and Complications Trial)(DCCT)によって、厳格に調節したグルコースは、これらの合併症のリスクを軽減することが報告された。しかし、集中的なインスリン処置は、低血糖性の症状の発見の頻度の増大によって、完全に安全ではない。糖尿病の処置についてのDCCTの影響に対する記載で、EastmanおよびGordonは、以下のように述べた「DCCTにおいて行われた集中的な処置の成功は、保健医療制度の業績でもあり課題でもある:業績とは、我々がいまや、代謝コントロール問題を知ったためであり、そして課題とは、医学、教育、栄養、糖尿病、自己管理技術、およびヒトの行動において専門性を有する保健医療研究者の統合されたチームによってこの結果が達成されたためである」。これらのチームは、大部分の糖尿病の患者の処置には利用できず、おそらく将来も利用できない。結果として、血糖値の正常な調節を提供する、彼の発明に記載された技術のような新しい技術が必要である。
【0034】
糖尿病に利用可能な現在の処置方法は、定期的なインスリンの外因性の投与である。しかし、この処置ではまだ、血糖値の不完全な制御しか得られない。膵臓組織全体の移植という実験的アプローチは、高リスクである。しかし、糖尿病に利用可能なドナーの膵臓の数は十分ではない。移植後、血糖値は、より生理学的な様式で制御されると考えられる。このアプローチは、単離した島細胞自体の移植に比べればかなり劣る。近年では、改良は、宿主による免疫の攻撃を防止するための細胞の封入になっている。短期の効用の証明はあるが、長期の結果は満足には至らなかった(D.E.R.Sutherland,Diabetologia 20,161〜18(1981);D.E.R.Sutherland,Diabetologia 20,435〜500(1981))。従って膵臓器官全体の移植が、好ましい処置である。本発明のさらなる実施形態は、バイオデンドリティックな架橋可能ポリマー中に島細胞を封入/埋め込むこと、および引き続く宿主への移植である。
【0035】
このようなバイオデンドリティックポリマーの別の有用な適用は、肝不全の処置における適用である。肝不全は、疾患に起因する瘢痕、遺伝的不規則性の結果として、または傷害から生じる。現在の解決法は、移植であり、そしてこのような処置がなければ結果は死である。米国では毎年、肝不全で30,000人が死んでおり、毎年、約140億ドルの社会的なコストを要すると推定される。
【0036】
肝臓移植のための指標としては、例えば、急性劇症肝不全、慢性活動性肝炎、胆道閉鎖症、突発性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、代謝の先天異常、およびいくつかのタイプの悪性腫瘍が挙げられる。現在の処置方法は、肝臓が移植に利用可能になるまで、患者を維持する手技が挙げられる。肝臓全体の移植は、ますます首尾よい外科操作となっている。しかし、この手術の技術的な複雑性、血液の膨大な損失、術後条件、および手術の費用によって、この手順は大きな医療施設でしか行えない。ドナーの器官の不足を考慮すれば、患者の要望は満たされない。不幸にも、肝疾患の末期段階で毎年30,000例の患者が死亡する。移植を待機している患者のための良好な人工肝臓サポートは、広く利用可能ではない。アルコール誘導性肝疾患に罹患している患者は、処置を待機している患者の別の大きい群を示す。アルコール消費の結果として末期段階の肝臓疾患を有する今日の患者は、移植の手段を有さない。なぜなら、ドナーの器官、および現在の保健制度のコンプライアンスが不足しているからである。肝硬変の死亡率は、各国間で非常に異なり、フィンランドでの100,000人あたり7.5人から、フランスでの100,000人あたり57.2人に及ぶ。米国では、過去25年にわたって、死亡数は70%増大している。さらに、肝硬変の罹患率は、飲酒しない人よりも深刻な問題の飲酒者では28倍高い。
【0037】
肝臓および膵臓は、失われた機能の置換または回復の形態において処置が不十分である唯一の重要な臓器系ではない。例えば、腸のほとんどが失われれば、過去には致死的な状態であった。しかし、今では患者は、血管を介して供給される静脈栄養で生存することができる。静脈栄養は、不十分なアプローチである。なぜなら、介護の間に多くの合併症が生じるからである。総非経口栄養の患者は、致死的な肝疾患を発症し得るか、または重篤な血流感染を発症し得る。腸移植は、現在選択肢とはなっていない。なぜならドナーの腸の多数のリンパ球がレシピエントに移されるからである。これによって免疫学的反応である「移植片対宿主」病がもたらされ、ここでは、移植された腸からのリンパ球が攻撃する。これによって最終的には死がもたらされる。本発明のさらなる実施形態は、器官の損失または修復を処置するバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0038】
心臓および筋肉の疾患はまた、世界の罹患率および死亡率の主な原因である。心臓移植は、ますます首尾よい技術となってきているが、肝臓移植の場合と同様、免疫抑制薬およびドナーの心臓が必要である。器官移植は、現在多くの指標についての救済方法であるが、ドナー組織の不足が増大している。例えば、肝臓移植の必要な1年あたり800〜1,000の小児に対して、米国ではごく少数のドナーしか利用可能ではない。移植はしばしば、以下に関連する:1)非常に重症であり、従って成功の確率が減少しているレシピエント、2)代表的には血液損失に関連する複雑な外科手術、3)迅速な手術の必要性(なぜなら保存時間が短い)。全体的または部分的な臓器移植の代替として、失われた機能を置換するために必要な実質性の要素のみの移植が、推奨されている(P.S.Russell,Ann.Surg.201(3)、255〜262(1985))。このアプローチは、いくつかの魅力的な特徴を有する。この特徴としては、付属する血液損失、麻酔の困難性、および合併症を伴う大手術を回避することが挙げられる。必要な機能を供給する細胞のみが置換されるので、パッセンジャー白血球、抗原提示細胞、および他の細胞型(拒絶プロセスを促進し得る)に伴う問題は、減少または回避さえされ得る。このアプローチを用いて、自己移植手技において細胞を使用する可能性は、培養におけるレシピエントの増殖された細胞または特定の細胞形に分化した幹細胞を用いて可能である。例えば、Demetriouらは、コラーゲンでコーティングしたマイクロキャリアビーズに付着した肝細胞の首尾よい移植を報告した(A.A.Demetriouら、Science 233、1190〜1192(1986))。本発明のさらなる実施形態は、器官移植のためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0039】
皮膚は、疾患または傷害によって損傷され得る別の器官である。皮膚は、体液の損失および疾患からの身体の保護の重要な役割を果たす。皮膚移植片は以前に、動物の皮膚または患者の皮膚から調製されており、より最近では上皮細胞を培養することによって形成された「人工皮膚(artificial skin)」である。米国特許第4,485,097号において、Bellは、水和したコラーゲン格子(血小板および線維芽細胞を伴う)およびケラチノサイトのような細胞から構成された皮膚等価材料を開示している。Yannasらに対する、米国特許第4,060,081号は、膜全体にわたる湿度の変化を制御するための、合成ポリマーのような、不溶性の非免疫原性および非毒性材料から形成された、合成皮膚として有用な多層膜を開示している。米国特許第4,458,678号において、Yannasらは、皮膚等価材料を作製するためのプロセスを開示している。ここでは、グリコサミノグリカンで架橋されたコラーゲンから形成された線維性格子が、上皮細胞とともに播種される。最初の2つの方法に対する不利な点は、そのマトリックスが、「永久的な(permanent)」合成ポリマーから形成されるということである。実際、この材料の限界は、1980年に公開された著者らの文献中に考察されている(YannasおよびBurke J.Biomed.Mater.Res.14,65〜81(1980))。
【0040】
本発明における用途に適切な細胞の例としては、肝細胞、および胆管細胞、膵臓の島細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎−視床下部−下垂体系の細胞(ホルモン産生性腺細胞を含む)、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、血管細胞、リンパ管細胞、腎臓細胞、および腸細胞、骨および軟骨を形成する細胞、平滑筋および骨格筋が挙げられるがこれらに限定されない。
【0041】
細胞増殖および移植のための一時的な足場としての人工的デンドリティックマトリックスを設計、構築、および利用するための方法および手段を提供することが本発明のさらなる目的である。本発明のさらなる実施形態は、インビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)、の全てにおいて細胞増殖のために利用され得る生体分解性の非毒性マトリックスを提供することである。この細胞足場/マトリックス/ゲルは、架橋によってインビトロまたはその場所(in situ)で形成され得る。生分解性の人工的なマトリックスが、細胞増殖のための支持体を提供するだけでなく、移植後の増殖する細胞塊の血管新生および分化を可能にし、かつ増強するように、この生分解性の人工的なマトリックスを構成および構築するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。細胞の挙動、および他の細胞との相互作用、細胞基質、ならびに分子シグナルがインビトロに適合され得るように、異なる構成のマトリックスを提供することが本発明のなお別の目的である。
【0042】
ポリマーマトリックスは、Vacantiらの米国特許第5,041,138号に記載のように、種細胞に対して用いられ、そして引き続き移植されて軟骨性構造を形成し得るが、これには、このマトリックスの外科的移植、および所望の解剖学的構造に形成するための移植の前のこのマトリックスの形成が必要である。Hubbell(米国特許第1995000478690号)は、細胞との混合、その後のインビボ注射、およびその場所(in situ)での重合化のための線状架橋可能ポリマーを記載している。しかしこのポリマーは、デンドリティック構造ではなく、分解、架橋、ならびに化学的および生物学的な誘導体化のより優れた最適化が欠如している。
【0043】
(E.組織シーラント)
本発明のデンドリティック高分子はまた、組織シーラントとして有効に使用される。この生体材料は、創傷の部位に容易に接近できない場所か、または縫合糸なしの手術が望ましい時に、他の外科手術(例えば、漏出ブレブ、腎切開閉鎖、気管支胸腔瘻修復、消化性潰瘍修復、鼓膜穿孔の修復など)のために有効なシーラント/グルー(glue)であると考えられる。
【0044】
(角膜穿孔の処置:)角膜穿孔は、集団のある割合を冒し、そして種々の医学的状態(例えば、感染、炎症、乾燥症、神経栄養および変性)、および外傷(化学的、熱的、外科的、および貫通性)によって生じる。不幸にも、角膜穿孔はしばしば、視覚の消失および個人のクオリティーオブライフ(生活の質)の低下をもたらす。穿孔のタイプおよび起源に依存して、創傷と角膜移植片を縫合するのとは異なる処置が、現在利用可能である。しかし、角膜のデリケートな組成および創傷の重篤度(手術後の漏出および重篤な乱視の可能性を増大する)を考慮すれば、これは困難な外科手術である。標準的な縫合手順によって処置され得ない穿孔という特定の場合には、この創傷を修復するために、組織接着剤(adhesive)(グルー)(glue)が用いられる。このタイプの処置は、非常に魅力的になってきている。なぜならこの方法は、最も簡単かつ迅速かつ安全であり、そしてさらなる合併症を回避するための眼球の完全性の迅速な回復という要件に対応するからである。創傷への容易かつ迅速な適用以外に、接着のための基準は、以下である:1)十分な接着力で組織(壊死しているかまたはしていない、頻繁に湿性)に結合すること、2)非毒性であること、3)生分解性または吸収性であること、4)滅菌可能であること、および5)治癒の過程を妨害しないこと。種々のアルキル−シアノアクリレートが、小さい穿孔の修復のために利用可能である。しかし、これらの「スーパーグルー(super glue)」は、重大な不都合を示す。それらのモノマーは、特に短いアルキル鎖を有するモノマーは、毒性であり得る。それらはまた、過度に急速に重合して、適用が困難になるかもしれず、そして一旦、重合すれば、このグルー(glue)の表面は、粗くかつ硬く、これが患者の不快さおよびコンタクトレンズの装着の必要性をもたらす。シアノアクリレートが角膜シーラントとして許容されても、多数の合併症が報告されており、これには白内障の形成、角膜浸潤、緑内障、巨大乳頭結膜炎、および瞼球癒着形成が挙げられる。さらに、患者の60%より多くにおいて、さらなる外科的介入が必要であった。
【0045】
他のグルーも開発されている。フィブリンに基づく接着性止血剤は、通常、フィブリノーゲン、トロンビン、および第XIII因子から構成される。フィブリノーゲンおよび光で活性化された光増感剤を有する系も試験されている。接着性止血剤が、組織接着のための要件を満たす内在性の特性を有する場合、患者に対するあらゆる汚染を回避するためには、自家性の生成物(緊急の場合は時間がかかる)、または臨床使用の前の厳格な処置が必要である。角膜穿孔のための理想的なシーラントは、以下でなければならない:1)正常な視覚を妨げない、2)眼内圧力IOPを急速に回復する、3)眼の構造的な完全性を維持する、4)治癒を促進する、5)湿性の組織表面に接着する、6)分子量依存性であり、かつ正常な角膜機能に好適である溶質拡散特性を保有する、7)創傷上にポリマーの制御された配置を可能にする流体力学的特性を保有する、そして8)温和な条件下で重合化する。本発明のさらなる実施形態は、角膜穿孔をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0046】
(網膜裂孔)網膜裂孔の処置のために通常用いられる技術(例えば、凍結療法、ジアテルミー、および光凝固術)は、複雑な網膜剥離の場合には成功しない。主な理由は、適用の遅れ、および脈絡網膜性接着の強度の弱さである。特定の場合には、シアノアクリレート網膜復位術が用いられた。また、この脈絡網膜性接着は、初期の技術よりも強力かつ持ちが良いことが、実証されている。角膜穿孔処置に関して以前に注記されたとおり、シアノアクリレートグルーの非常に急速な重合化(例えば、網膜に対する注射器の接着のリスク)、水性条件中でそれらを使用することの困難性、および毒性が、この方法に関する不都合およびリスクである。重合化は、モノマーに対してイオフェンジレート(iophendylate)を添加することによって遅らせられ得るが、なおこの反応は2〜3秒間で生じる。一旦重合化されればシアノアクリレートの硬度のせいで、処置した孔の端での網膜の引き裂きのリスクがまた、観察され得る。本発明のさらなる実施形態は、網膜裂孔をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0047】
(漏出ブレブ(leaking bleb))緑内障手術後の漏出する濾過胞(leaking filtering bleb)は、管理が困難であり、重篤な視覚に脅威である合併症をもたらし得る。漏出ブレブは、前眼房の低緊張および薄型化、脈絡膜浸出、黄斑、網膜襞および脈絡襞、脈絡膜上の出血、角膜代償不全、末梢虹彩前癒着、および白内障形成を生じ得る。漏出ブレブはまた、ブレブ機能の損失および眼内炎の重篤な合併症をもたらし得る。ブレブ漏出の頻度は、代謝拮抗剤の使用にともなって増大する。5−フルオロウラシルまたはマイトマイシンCで処置した眼におけるブレブ漏出は、20〜40%程度の患者で生じ得る。代謝拮抗剤で処置した眼におけるブレブ漏出は、薄く無血管性の組織のせいで、そして異常な血管結合組織の応答のせいで、治癒するのが難しいかもしれない。保存的管理の使用にもかかわらず、漏出が持続する場合、テーパー状の血管注射針で、9−10〜10−0のナイロンまたは吸収性縫合糸を用いて、結膜の創傷を閉鎖し得る。薄い壁のブレブまたは無血管性のブレブにおいては、縫合糸は得策ではないかもしれない。なぜなら、縫合糸は、組織を引き裂いて、より大きい漏出を生じ得るからである。ブレブ漏出を閉鎖するために、フィブリン接着が用いられている。この接着は、トロンビンと同時に結膜創傷に適用されて、適用部位においてフィブリン凝血を形成する。適用の間、術野は、乾燥されていなければならない。なぜならフィブリンは、湿性の組織には接着しないからである。シアノアクリレートグルー(glue)が、結膜の開口部を閉鎖するために用いられ得る。このグルーを適用するため、周囲の組織は、乾燥されていなければならず、そして一滴のシアノアクリレートが垂らされる。この操作は、グルーの急速な反応を考慮すれば、組織に対するアプリケーターをシールしないように、または周囲の組織をシールしないように、気をつけなければならない。次いで、軟性のコンタクトレンズ(ソフトコンタクトレンズ)をこのグルーの上に適用して、患者の不快感を減弱する。しかし、シアノアクリレートがブレブから引き裂き、そしてより大きい創傷を生じる場合、この手技は、実際には問題を悪化し得る。本発明のさらなる実施形態は、漏出ブレブをシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0048】
(角膜移植:)角膜移植において、新しい角膜を所定の位置に固定するために、外科医は、移植片の周囲に約16の縫合を行う。従って、縫合糸なしの手術は、極めて望ましく、
以下の利点をもたらす:(1)縫合は、感染の部位を提供する、(2)縫合された角膜は、治癒に3ヶ月かかり、その後に縫合糸が除去されることが必要になる、そして(3)縫合糸から新しい角膜に適用された緊張は、角膜を変形させ得る。本発明のさらなる実施形態は、角膜移植片をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能なポリマーを使用することである。
【0049】
(水晶体嚢内水晶体置換:)白内障は、主に眼の自然な老化およびいくつかの疾患に起因する、水晶体の混濁である。浮腫、水晶体線維のタンパク質変性、および壊死が、盲目をもたらし得る不透明な領域を生じる。水晶体全摘出術が、現在たまに実施される。この傷害性の手術は、超音波および吸引による水晶体の断片化後の、水晶体の核および皮質の吸引によって取って代わられた。次にインプラント(移植片)が水晶体嚢胞内に挿入される。第一のポリマーマトリックス(50年より長く用いられる)は、水晶体置換物または水晶体嚢内胞インプラントとしての、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)であった。剛直なインプラントのために用いた切開より小さい切開を通じて、水晶体嚢胞内に移植され得るシリコンおよびヒドロゲルが、開発されている。この材料の生体適合性以外の重要な問題の1つは、このインプラントの機械的な転位である。材料、移植部位、および手術方法に依存して、異なるデザインのインプラントが見出され得る。例えば、シリコンが、水晶体嚢胞中に前に移植された、膨張可能な薄いシリコン膜に注射される。
【0050】
異なる半径の曲率を有する同軸輪状環のヒドロゲルから構成される人工的なレンズが、米国特許第4,906,246号に提唱されている。さらに、アリールケトンのような光開始剤の存在下で照射によって架橋され得る、プレポリマー(例えば、ウレタン、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびシリコン)の注射が、米国特許第4,919,151号に開示されている。このポリマーの分子量および架橋の程度は、適切な屈折率を可能にするように改変され得る。しかしこれらの系の生体適合性は、実証されていない。
【0051】
眼科の適用以外に、これらの光架橋可能なポリマーは、創傷の部位が容易に接近できない場合、または縫合糸なしの手術が所望される場合、さらなる外科用途を有している。これらの光重合可能なシーラント/グルーは、以下のための可能性のある用途を有し得る:尿路手術(腎切開閉鎖、尿道修復、尿道下裂修復)、肺の手術(実質性および気管支の漏出のシール、気管支胸腔瘻修復、持続性空気漏出の修復)、G.I.路および胃の手術(耳下腺皮膚瘻、気管食道瘻、消化性潰瘍の修復)、関節手術(軟骨修復、半月板修復)、心臓手術(心臓血管の破裂の修復)、脳手術(硬膜欠損の修復)、耳手術(鼓膜穿孔)、および術後廃液減少(乳房切除術、腋窩切開)。適用の容易さ、ならびに湿性または乾性の創傷を迅速かつ正確にシールする能力は、この材料が上記の適用の多くにおいて用いられた、以前のグルーに対して優れていることが証明され得ることを意味する。
【0052】
(F.創傷のドレッシング(包帯))
ほとんどの場合において、創傷閉鎖のために用いた処置は、古典的な縫合技術である。しかし、創傷のタイプ、起源、ならびに患者の位置に依存して、組織接着剤(例えば、グルー、シーラント、パッチ、フィルム、など)の使用は、縫合糸の使用に対して魅力的な代替である。創傷に対する容易かつ速い適用以外に、接着剤の基準は、十分な接着力で組織(壊死しているか、またはしていない、時に湿性)へ結合すること、非毒性であり、生分解性または生体吸収性であり、滅菌可能であり、選択的に気体を透過可能であり、細菌に対して不透過性であり、そして蒸発による水の損失を制御し得ることである。結局、接着剤の2つの主要な特性は、創傷を保護すること、および治癒過程を増強するか、または少なくともそれを妨害しないことである。多くのシーラントが検討されており、そして異なる臨床適用に用いられている。
【0053】
フィブリンに基づく接着性の止血剤は、生物学的起源の最も通常の生成物(製品)である。これらのシーラントは、通常、フィブリノーゲン、トロンビン、および第XIII因子、ならびにフィブリノーゲン/光増感剤系から構成される。それらの内因性の特性が、組織接着剤のための要件を満たしている場合、患者に対するあらゆる汚染を回避するためには、自家性の生成物(緊急の場合には時間がかかる)または臨床使用の前の厳格な処置が必要である。
【0054】
合成材料、詳細には、主にポリマーおよびヒドロゲルが、創傷閉鎖のために開発された。アルキル−シアノアクリレートが、角膜穿孔の修復に利用可能である。縫合糸またはエチル−2−シアノアクリレート−「Mediglue(メディグルー)」適用によって処置された治癒した皮膚切開において、1人の研究者は、差異を観察しなかった。しかし、これらの「スーパーグルー(super glue)」は、重要な不都合を示す。それらのモノマー、詳細には、短いアルキル鎖を有するモノマーは、毒性であるか、または毒性であり得、そしてそれらは、過度に急速に重合して、創傷の処置を困難にする。一旦、重合すれば、このグルーの表面は、粗くかつ硬い。このことは、患者に対する不快さ、および例えば、角膜穿孔処置の場合は、コンタクトレンズの装着の必要性を伴う。「BiobraneII」(ナイロン織物上のポリジメチルシロキサンの混成)、および「Opsite」(一方の側にビニルエーテルコーティングを有するポリウレタン層)などの他の材料が市販されている。シアノアクリレート(vournakis)と入れ替わるために、新しいポリマー性止血剤(ポリ−N−アセチルグルコサミン)が、胃静脈瘤の処置のような生物医学的な適用について研究された。皮膚の創傷を処置するための改質ゼラチンに基づく接着剤もまた見出された。ラクテート基およびアクリレート基で置換された光重合可能なポリ(エチレングリコール)は、肺の手術において空気の漏出をシールするために用いられる。
【0055】
G.癒着の防止
本発明のなお別の局面は、損傷した組織の間に、バイオデンドリティックポリマー、または線状ポリマーおよびバイオデンドリティックポリマーの組み合わせから構成される障壁を挿入することによって、損傷した組織の間の癒着の形成を防止するための方法を提供する。このポリマー障壁は、曝露された、損傷した組織上のシートまたはコーティングとして機能して、外科的癒着を防止する(Urryら、Mat.Res.Soc.Symp.Proc.292,253〜64(1993)。このポリマー障壁は、時間経過につれて溶解して、癒着/瘢痕などの形成なしに正常な治癒が生じることを可能にする。癒着の形成は、主な術後合併症である。今日、臨床的に重大な癒着の頻度は、約5〜10パーセントであり、ある場合には、ほぼ100パーセントである。癒着形成の中でも最も通常の合併症は、閉塞、不妊症、および疼痛である。時に、癒着形成には、癒着を除去するための第二の手術手技が必要であり、このことが処置をさらに複雑にする。術後癒着の広範な発生を考慮して、癒着を防止するために多数のアプローチが探索されている(Stangelら、「Formation and Prevention of Postoperative Abdominal Adhesions」、The Journal of Reproductive Medicine,第29巻、第3号、1984年3月(第143〜156頁)、およびdiZerega、「The Cause and Prevention of Postsurgical Adhesions」発行:Pregnancy Research Branch,National Institute of Child Health and Human Development,National Institutes of Health,Building 18,Room 101,Bethsda,Md.20205)。
【0056】
術後癒着の防止のために、多数の手技が探索されており、これには以下が挙げられる:1)イブプロフェンの全身投与(例えば、Singer、米国特許第4,346,108号を参照のこと)、2)抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、および抗生物質の非経口投与、3)デキストラン溶液の腹腔内投与、およびポリビニルピロリドン溶液の腹腔内投与、4)プロスタグランジン生成を阻害することによって作用する非ステロイド性抗炎症性薬物であるオキシフェンブタゾンの全身投与、ならびに5)線状の合成ポリマーおよび天然ポリマーの投与(Hubell 6060582;Fertil.Steril.,49:1066;Steinleitnerら(1991)「Poloxamer 407 as an Intraperitoneal Barrier Material for the Prevention of Postsurgical Adhesion Formation and Reformation in Rodent Models for Reproductive Surgery」Obstetrics and Gynecology、77(1):48、およびLechら(1990)「Reduction of postoperative adhesions in the rat uterine horn model with poloxamer 407」、Am J.Obstet.Gynecol.162(5):1317、Linskyら、1987「Adhesion reduction in a rabbit uterine horn model using TC−7」J.Reprod.Med.,32:17、Diamondら、1987「Pathogenesis of adhesions formation/reformation:applications to reproductive surgery」Microsurgery,8:103)。
【0057】
例えば、腹膜腔の器官および腹膜壁に関する術後癒着の形成は、腹部手術の望ましくない結果である。これは、頻繁に生じ、そして手術外傷から惹起される。術中、漿液血液状の(タンパク質性の)浸出液が放出され、これが、骨盤腔において集まる傾向である(Holtz,G,1984)。この浸出液が短期間で吸収されず、溶解もされない場合、この浸出液は線維芽細胞に食い込み、引き続くコラーゲン沈着が癒着をもたらす。デンドリティック高分子、またはデンドリティック高分子と線状の合成ポリマーもしくは天然ポリマーとの組み合わせ(癒着の防止のためのペプチドを含む)を投与することが本発明のさらなる実施形態である。
【0058】
H.薬物送達
デンドリティック高分子を用いる薬物送達の概念は、以前に探索されている(Liu,M.Frechet,M.J.Pharm.Sci.Technol.Today 1999,2,393〜401)が、探索されたデンドリマーの組成は、インビボ適用には適しておらず、従って、その学術的な研究を制限する。実際に、これらのポリマー(例えば、PAMAM)は、世代数の増大とともに毒性の増大を示した。本発明に記載されるバイオデンドリマーは、インビボ用途に適切な構成単位を保有するデンドリマーをデザインするための多くの機会を提供する。
【0059】
ペンダントなヘテロ原子または官能基(例えば、アミン、カルボン酸)を有する本発明のデンドリティックポリマーは、物理的特性を制御するか、薬物を用いてポリマーを誘導体化するか、またはポリマーの生分解性を変更するための要件を満たす。従って、本発明はまた、本発明のポリマーを含む、長期または短期移植可能な医療用デバイスを包含する。本発明の更なる実施形態では、ポリマーは、有効な部位特異的、または全身の薬物送達のために十分な、生物学的または薬学的に活性な化合物(薬物、ペプチド、核酸など)と合わせられる(Gutowskaら、J.Biomater.Res.,29,811〜21(1995)、およびHoffman,J.Controlled Release,6,297〜305(1987))。この生物学的にまたは薬学的に活性な化合物は、水素結合、塩架橋などによって、デンドリティック高分子と物理的に混合されても、デンドリティック高分子に埋め込まれても、デンドリティック高分子中に分散されても、デンドリティック高分子と共有結合されても、または接着されてもよい。さらに、本発明は、本発明のポリマーと組み合わせて、治療上有効な量の生物学的なまたは薬学的な活性な化合物を含有する、移植可能な薬物送達デバイスを、その必要な患者の身体中に移植することによる、部位特異的または全身の薬物送達のための方法を提供する。
【0060】
生物学的、または薬学的な活性な化合物(薬物を含む)の誘導体はまた、共有結合によってデンドリティック高分子に結合され得る。これによって、薬物とポリマー骨格との間の共有結合の加水分解による、そして、このデンドリティック構造中の薬物の部位(例えば、内部対外部)による、この活性な化合物の持続性の放出が、提供される。デンドリティック構造のペンデント基の多くは、pH感受性である(例えば、pH依存性溶出速度をさらに制御するカルボン酸基など)。このようなデンドリティック高分子をまた、胃腸の薬物放出キャリアのコーティングのために用いて、取り込まれた生物学的、または薬学的な活性な化合物(例えば、薬物)を、胃の酸性環境における分解から保護し得る。本発明のデンドリティックポリマーは、比較的高濃度のペンダントなカルボン酸基を有して調製され得、そしてこれは酸性環境では安定および不安定(またはわずかに可溶性)であるが、より塩基性の環境に曝された場合、急速に溶解/分解する。本発明のさらなる実施形態は、制御された薬物送達系を提供する。この薬物送達系では、生物学的にまたは薬学的に活性な因子が、物理的にコーティングされるか、または本発明のポリマーに共有結合される。
【0061】
グリセロールおよび乳酸(例えば、グリコール酸、コハク酸)からなるコア単位に基づくバイオデンドリマーは、本発明に従う別のクラスのポリマーを示す。このポリマーのクラスにおけるグリセロールおよび乳酸は、インビボで見出され、そして生体適合性である。従って、以下に示すような広範な構造を構築し得る。コアが合成された後、PEGおよびPLAのようなポリマーは、このコア単位に結合されて、大きい星形またはデンドリティックのポリマーを作製し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0062】
以下の実施例から、本発明のより完全な理解が得られる。以下の実施例は、例示を意図したものでしかなく、本発明を限定するものではない。
【実施例1】
【0063】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸]の合成 − cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(10.9g、60.4mmol)を1,4−ジオキサン(250mL)に溶解し、続いてNaH(7.0g、0.30mol)を添加した。この反応混合物を、室温で1時間撹拌し、その後0℃に冷却する。次いで、2−ブロモプロピオン酸(8.64mL、96mmol)を、15分間にわたって添加した。この反応混合物を室温にもどし、次いで50℃で12時間撹拌し、その後、これを0℃に冷却して、エタノールでクエンチし、続いて水(250mL)を添加する。1N HClを用いて、この溶液をpH4.0に調製し、CH2Cl2(200mL)で抽出した。pHを4.0に再調節した後、この手順をもう1回繰り返した。合わせた有機相を、Na2SO4で乾燥し、重力濾過して、エバポレートした。この固体をエチルエーテル(50mL)中で45分間撹拌し、そして−25℃に3時間冷却して、その後11.7gの白色粉末を収集した(収率77.3%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 253m/z(MH+)(理論値:252m/z(M+))、元素分析 C:61.75%;H 6.37%(理論値:C:61.90%;H:6.39%)。
【実施例2】
【0064】
ベンジリデン保護[G0]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](4.02g、15.9mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(2.62g、14.5mmol)、およびDPTS(1.21g、4.10mmol)をCH2Cl2(40mL)に溶解した。この反応フラスコを窒素でフラッシュし、次いでDCC(3.61g、17.5mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下で14時間続けた。反応終了の際に、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、そして濾液をエバポレートした。3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過して(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧に曝して、5.63gの白色粉末を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:GC−MS 415m/z(MH+)(理論値:414m/z(M+))、元素分析 C:66.63%;H 6.33%(理論値:C:66.65%;H:6.32%)。
【実施例3】
【0065】
[G0]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLLA(5.49g、13.2mmol)含有EtOAc/MeOH(3:1、40mL)の溶液に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後20分間振盪した。触媒を濾過して、EtOAc(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして2.94gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た。(理論値:238m/z(M+))元素分析 C:45.52%;H 7.65%(理論値 C:45.37%;H:7.62%)。
【実施例4】
【0066】
ベンジリデン保護[G1]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](4.41g、17.50mmol)、[GO]−PGLLA(0.791g、3.32mmol)、およびDPTS(2.46g、8.36mmol)をDMF(80mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いでDCC(5.31g、25.74mmol)を添加した。内容物を、窒素雰囲気下において室温で14時間撹拌した。高真空下でDMFを除去して、残りの残留物をCH2Cl2に溶解した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、そして濾液を濃縮した。3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過して(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、3.45gの白色粉末を得た(収率88.3%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 1175.6m/z(MH+)(理論値:1175.2m/z(M+))元素分析 C:62.11%;H 6.46%(理論値:C:62.34%;H:6.35%)。SEC MW:1280,Mn:1260、PDI:1.01。
【実施例5】
【0067】
[G1]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G1]−PGLLA(0.270g、0.230mmol)含有THFの溶液(15mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして0.178gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 823.3m/z(MH+)(理論値:822.8m/z(M+))元素分析 C:47.72%;H 7.41%(理論値 C:48.17%;H:7.11%)。SEC MW:1100,Mn:1090、PDI:1.01。
【実施例6】
【0068】
ベンジリデン保護[G2]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](8.029g、31.83mmol)、DCC(9.140g、44.30mmol)、およびDPTS(4.629g、15.74mmol)を、THF(80mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、30分間撹拌して、その後[G1]−PGLLA(0.825g、1.00mmol)を少量のTHFに溶解することによって添加した。この反応物を窒素下において室温で14時間撹拌した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄した。THF濾液をエバポレートし、そして3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、2.09gの白色粉末を得た(収率77%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 2697.0m/z(MH+)(理論値:2696.8m/z(M+))元素分析 C:60.86%;H 6.37%(理論値 C:61.02%;H:6.35%).SEC MW:2350,Mn:2310、PDI:1.01。
【実施例7】
【0069】
[G2]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G2]−PGLLA(0.095g、0.035mmol)含有THFの溶液(10mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.061gの無色粘稠性の油状物を得た(収率88.0%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI−TOF MS 1991.8m/z(MH+)(理論値:1991.9m/z(M+))。SEC MW:2170,Mn:2130、PDI:1.01。
【実施例8】
【0070】
[G2]−PGLLA−Acの合成 − [G2]−PGLLA(0.098g、0.049mmol)を、5mLのピリジンに溶解した。次いで、無水酢酸(6.0mL、64mmol)を、シリンジで添加し、その反応混合物を40℃で8時間撹拌した。高真空下でピリジンおよび無水酢酸を取り除いた。その生成物を4:96のMeOH:CH3Clで溶出する分取TLCで単離した。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 2665.0m/z(MH+)(理論値:2664.5m/z(MH+))元素分析 C:50.70%;H 6.71%(理論値 C:50.94%;H:6.43%)。
【実施例9】
【0071】
ベンジリデン保護[G3]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](0.376g、1.49mmol)、DCC(0.463g、2.24mmol)、およびDPTS(0.200g、0.680mmol)を、THF(15mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、1.5時間撹拌して、その後[G2]−PGLLA(0.070g、0.035mmol)を少量のTHFに溶解することによって添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間撹拌した。DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄した。THF濾液をエバポレートし、そして3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、0.164gの白色粉末を得た(収率89.1%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI MS 5743.3m/z(MH+)(理論値:5739.9m/z(M+))元素分析 C:60.32%;H 6.34%(理論値 C:60.47%;H:6.36%).SEC MW:4370,Mn:4310、PDI:1.01。
【実施例10】
【0072】
[G3]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G3]−PGLLA(0.095g、0.035mmol)含有THFの溶液(15mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.128gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95.4%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI MS 4332.5m/z(MH+)(理論値:4330.2m/z(M+))元素分析 C:49.56%;H 7.21%(理論値 C:49.09%;H 6.94%)。SEC MW:4110、Mn:4060、PDI:1.01。
【実施例11】
【0073】
[G0]−PGLSA−bzld(2)の合成 − コハク酸(1.57g、13.3mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(5.05g、28.0mmol)、およびDPTS(4.07g、13.8mmol)を、CH2Cl2(120mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(8.19g、39.7mmol)を添加した。室温での撹拌を窒素雰囲気下において14時間継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄した。3:97のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。減圧濾過後、5.28gの白色固体を収集した(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 443m/z(MH+)(理論値:442m/z(M+))。HR FAB 442.1635m/z(M+)(理論値:442.1628m.z(M+))。元素分析 C:65.25%;H 5.85%(理論値 C:65.15%;H:5.92%)。
【実施例12】
【0074】
[G0]−PGLSA−OH(3)の合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLSA(2.04g、4.61mmol)含有THF溶液(30mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして1.18gの透明な粘稠性の油状物を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 284m/z(M+NH4+)(理論値:266m/z(M+))。元素分析C:44.94%;H 6.87%(理論値 C:45.11%;H 6.81%)。
【実施例13】
【0075】
2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(4)の合成 − cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(9.90g、54.9mmol)を、ピリジン(100mL)に溶解し、続いて無水コハク酸(8.35g、83.4mmol)を添加した。この反応混合物を、室温で18時間撹拌し、その後、このピリジンを40℃で減圧下において除去した。残りの固体をCH2Cl2(100mL)に溶解して、冷0.2N HCl(100mL)で3回洗浄するか、または水相がpH1になるまで洗浄した。この有機相をエバポレートして、固体を脱イオン水(300mL)に溶解した。pHが7になるまで、1NのNaOHを添加し、そしてその生成物を溶液に溶解した。その水相をCH2Cl2(200mL)で抽出し、次いでpH7.4に再調整した。その水相を引き続き、CH2Cl2(200mL)で2回抽出し、Na2SO4で乾燥し、濾過して、エバポレートした。この固体をエチルエーテル(50mL)中で撹拌して、−25℃に3時間冷却し、その後、14.6gの白色粉末を収集した(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 281m/z(MH+)(理論値:280m/z(M+))。元素分析 C:60.07%;H 5.80%(理論値 C:59.99%;H:5.75%)。
【実施例14】
【0076】
[G1]−PGLSA−bzld(5)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(6.33g、22.6mmol)、[G0]−PGSLA(1.07g、4.02mmol)、およびDPTS(2.51g、8.53mmol)を、THF(60mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(7.04g、34.1mmol)を添加した。この反応物を、室温で窒素雰囲気下において14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、5.11gの白色粉末を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 1315.6m/z(MH+)(理論値:1315.3m/z(M+))。元素分析 C:60.13%;H 5.82%(理論値 C:60.27%;H:5.67%)。SEC MW:1460,Mn:1450,PDI:1.01。
【実施例15】
【0077】
[G1]−PGLSA−OH(6)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G1]−PGLSA(0.270g、0.230mmol)含有THF溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.178gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 963.2m/z(MH+)(理論値:962.9m/z(M+))。元素分析C:47.13%;H 6.11%(理論値 C:47.40%;H 6.07%)。SEC MW:1510,Mn:1500,PDI:1.01。
【実施例16】
【0078】
[G2]−PGLSA−bzld(7)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(4.72g、16.84mmol)、[G1]−PGSLA(1.34g、1.39mmol)、およびDPTS(1.77g、6.02mmol)を、THF(100mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(4.62g、22.4mmol)を添加した。この反応物を、室温で窒素雰囲気下において14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、4.00gの白色粉末を得た(収率94%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 3060.7m/z(MH+)(理論値:3060.9m/z(M+))。元素分析 C:59.20%;H 5.64%(理論値 C:58.86%;H:5.60%)。SEC MW:3030,Mn:2990,PDI:1.01。
【実施例17】
【0079】
[G2]−PGLSA−OH(8)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G2]−PGLSA(2.04g、0.667mmol)含有のTHFの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして1.49gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 2357.3m/z(MH+)(理論値:2356.1m/z(M+))。元素分析C:48.32%;H 5.97%(理論値 C:47.92%;H 5.90%)。SEC MW:3060,Mn:3000,PDI:1.02。
【実施例18】
【0080】
コハク酸モノメタリルエステル(SAME)の合成 − 2−メチル−2−プロペン−1−オール(4.90mL、58.2mmol)を、ピリミジン(20mL)に溶解し、続いて無水コハク酸(7.15g、71.4mmol)を添加した。反応混合物を室温で15時間撹拌し、その後、減圧下30℃でピリジンを除去した。残りの液体をCH2Cl2(100mL)に溶解し、そして冷0.2N HCl(100mL)で2回洗浄した。この有機相をNa2SO4で乾燥させ、重力濾過し、そしてエバポレートして、9.25gの透明な液体を得た(収率92%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 173m/z(MH+)(理論値:172m/z(M+))。元素分析 C:55.51%;H 7.09%(理論値 C:55.81%;H:7.02%)。
【実施例19】
【0081】
[G2]−PGLSA−SAME(9)の合成 − コハク酸モノメタリルエステル(0.826g、4.80mmol)、[G2]−PGLSA(0.401g、0.170mmol)、およびDPTS(0.712g、2.42mmol)を、THF(50mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(1.52g、7.37mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下において14時間、継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、0.558gの無色透明の油状物を得た(収率68.2%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 4840.9m/z(MH+)(理論値:4838.7m/z(M+))。元素分析 C:55.37%;H 6.22%(理論値 C:55.35%;H:6.29%)。SEC MW:5310,Mn:5230,PDI:1.02。
【実施例20】
【0082】
[G3]−PGLSA−bzld(10)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2.77g、9.89mmol)、[G2]−PGLSA(1.00g、0.425mmol)、およびDPTS(1.30g、4.42mmol)を、THF(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(2.67g、12.9mmol)を添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、3.51gの白色粉末を得た(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 6553.4m/z(MH+)(理論値:6552.2m/z(M+))。元素分析 C:58.50%;H 5.66%(理論値 C:58.29%;H:5.57%)。SEC MW:5550,Mn:5480,PDI:1.01。
【実施例21】
【0083】
[G3]−PGLSA−OH(11)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G3]−PGLSA(1.23g、0.188mmol)含有の9:1のTHF/MeOHの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、9:1のTHF/MeOH(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.923gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 5144.8m/z(MH+)(理論値:5142.5m/z(M+))。元素分析C:48.07%;H 5.84%(理論値 C:48.11%;H 5.84%)。SEC MW:5440,Mn:5370,PDI:1.01。
【実施例22】
【0084】
[G4]−PGLSA−bzld(12)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2.43g、8.67mmol)、[G3]−PGLSA(0.787g、0.153mmol)、およびDPTS(1.30g、4.42mmol)を、10:1のTHF/DMF(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(2.63g、12.7mmol)を添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間、撹拌した。反応終了の際、減圧下で溶媒を除去し、そして残りの固体をCH2Cl2に再溶解した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、1.50gの白色粉末を得た(収率73%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 13536.8m/z(MH+)(理論値:13534.7m/z(M+))。元素分析 C:58.20%;H 5.56%(理論値 C:58.04%;H:5.56%)。SEC MW:9000,Mn:8900,PDI:1.01。
【実施例23】
【0085】
[G4]−PGLSA−OH(13)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G4]−PGLSA(0.477g、0.0352mmol)含有の9:1のTHF/MeOHの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のために、このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、9:1のTHF/MeOH(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.351gの無色粘稠性の油状物を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 10715.6m/z(MH+)(理論値:10715.3m/z(M+))。元素分析C:48.50%;H 5.83%(理論値 C:48.20%;H 5.81%)。SEC MW:8800,Mn:8720,PDI:1.01。
【実施例24】
【0086】
[G2]−PGLSA−SAMEの重合化 − [G2]−PGLSA−SAMEおよびDMPA(0.1% w/w)を、CH2Cl2に溶解して、10%(w/w)溶液を作製することによって、ゲルを調製した。ピペット先端から新鮮マイカ表面に1滴の溶液を滴下し、直ちに、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。この表面を1.0mLのヘキサンで洗浄し、一晩乾燥させた。
【実施例25】
【0087】
[G2]−PGLSA−SAMEのフォトマスク重合化 − [G2]−PGLSA−SAME、DMPA、およびVP(それぞれ、1,000:10:1)を、CH2Cl2に溶解して、ゲルを調整し、そしてその溶液を濃縮した。次に、少量のポリマー(開始剤および促進剤とともに)を、最少量のCH2Cl2に溶解して、カバーガラスのスピンコーティングをさせた。フォトマスクを、このカバーガラスの上に置き、そして、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。この表面を1.0mLのヘキサンで洗浄し、一晩、風燥させた。
【実施例26】
【0088】
2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(2)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(50.00g、178.4mmol)、およびDCC(22.09g、107.0mmol)を、DCM(300mL)に溶解して、14時間、撹拌した。DCU沈殿物を濾過によって収集して、DCM(50mL)で洗浄した。この有機相を900mLのヘキサンに直接添加した。このヘキサンおよび沈殿物を−20℃に3時間冷却して、その後、濾過によって46.11gの沈殿物を収集した(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB−MS 543.2m/z(MH+)(理論値:542.53m/z(M+))。元素分析C:61.83%;H 5.70%(理論値 C:61.99%;H 5.57%)。
【実施例27】
【0089】
[G0]−PGLSA−bzld)2−PEG(3)の合成 − PEG、Mn=3400,(5.00g、1.49mmol)(これは、120℃において減圧下で3時間、乾燥させた)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(4.10g、7.56mmol)を、DCM(25mL)に溶解して、窒素下で撹拌させた。DMAP(67.0mg、0.548mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(1.0mL、11mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(25mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、炭酸水素ナトリウム(50mL 3×)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて収集して、5.22gの白色固体を得た(収率91%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3960、Mn:3875、PDI:1.02。SEC MW:3880,Mn:3750,PDI:1.04。Tm=44.7。
【実施例28】
【0090】
[G0]−PGLSA−OH)2−PEG(4)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G0]−PGLSA−bzld)2−PEG(4.98g、1.28mmol)含有30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。この濾液を濃縮して、PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて、4.63gの白色固体を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3769、Mn:3696、PDI:1.02。SEC MW:3640,Mn:3500,PDI:1.04。Tm=46.6。
【実施例29】
【0091】
[G0]−PGLSA−MA)2−PEG(5)の合成 − ([G0]−PGLSA−OH)2−PEG(0.502g、0.135mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.35mL、2.35mmol)を注射器で添加した。DMAP(52.0mg、0.426mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.497gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3996、Mn:3914、PDI:1.02。SEC MW:3680,Mn:3520,PDI:1.04。Tm=46.3。
【実施例30】
【0092】
[G1]−PGLSA−bzld)2−PEG(6)の合成 − ([G0]−PGLSA−OH)2−PEG(4.33g、1.17mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(9.99g、18.4mmol)を、DCM(30mL)に溶解して、窒素下で撹拌させた。DMAP(63.7mg、0.480mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.0mL、22mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(45mL)で希釈して、0.1N HCl(75mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(75mL 3×)、およびブライン(75mL)で洗浄した。この有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて収集して、5.15gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:4844、Mn:4749、PDI:1.02。SEC MW:3950,Mn:3790,PDI:1.04。Tm=38.8。
【実施例31】
【0093】
[G1]−PGLSA−OH)2−PEG(7)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G1]−PGLSA−bzld)2−PEG(4.64g、0.974mmol)含有20mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。この濾液を濃縮して、PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて、4.00gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:4487、Mn:4394、PDI:1.02。SEC MW:4590,Mn:4440,PDI:1.03。Tm=41.9。
【実施例32】
【0094】
[G1]−PGLSA−MA)2−PEG(8)の合成 − ([G1]−PGLSA−OH)2−PEG(0.500g、0.113mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.56mL、3.76mmol)を注射器で添加した。DMAP(86.0mg、0.704mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物を、DCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.519gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:5012、Mn:4897、PDI:1.02。SEC MW:3910,Mn:3740,PDI:1.04。Tm=40.8。
【実施例33】
【0095】
[G2]−PGLSA−bzld)2−PEG(9)の合成 − ([G1]−PGLSA−OH)2−PEG(3.25g、0.737mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(12.68g、23.37mmol)を、DCM(50mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.588g、4.81mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.5mL、28mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(50mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(400mL)中で沈殿させて収集して、4.57gの白色固体を得た(収率91%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:6642、Mn:6492、PDI:1.02。SEC MW:4860,Mn:4680,PDI:1.04。Tm=31.4。
【実施例34】
【0096】
[G2]−PGLSA−OH)2−PEG(10)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G2]−PGLSA−bzld)2−PEG(3.26g、0.500mmol)含有の25mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:5910、Mn:5788、PDI:1.02。SEC MW:5340,Mn:5210,PDI:1.03。Tm=36.5。
【実施例35】
【0097】
[G2]−PGLSA−MA)2−PEG(11)の合成 − ([G2]−PGLSA−OH)2−PEG(0.501g、0.0863mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.50mL、3.36mmol)を注射器で添加した。DMAP(72.1mg、0.990mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.534gの白色固体を得た(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:6956、Mn:6792、PDI:1.02。SEC MW:4580,Mn:4390,PDI:1.04。Tm=27.0。
【実施例36】
【0098】
[G3]−PGLSA−bzld)2−PEG(12)の合成 − ([G2]−PGLSA−OH)2−PEG(2.13g、0.367mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(12.71g、23.43mmol)を、DCM(45mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.608g、4.98mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.0mL、22mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(55mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過して濃縮し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(400mL)中で一晩沈殿させて収集して、3.35gの白色固体を得た(収率92%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:10215、Mn:9985、PDI:1.02。SEC MW:7020,Mn:6900,PDI:1.02。Tg=−13.6。
【実施例37】
【0099】
[G3]−PGLSA−OH)2−PEG(13)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G3]−PGLSA−bzld)2−PEG(2.88g、0.288mmol)含有の30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:8765、Mn:8575、PDI:1.02。SEC MW:8090,Mn:7820,PDI:1.03。Tm=−38.2。
【実施例38】
【0100】
[G3]−PGLSA−MA)2−PEG(14)の合成 − ([G3]−PGLSA−OH)2−PEG(0.223g、0.0260mmol)を、THF(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(1.10mL、7.38mmol)を注射器で添加した。DMAP(90.0mg、0.737mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.2mL、7.89mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.248gの白色固体を得た(収率89%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:10722、Mn:10498、PDI:1.02。SEC MW:7000,Mn:6820,PDI:1.03。Tg=−37.9。
【実施例39】
【0101】
([G4]−PGLSA−bzld)2−PEG(15)の合成 − ([G3]−PGLSA−OH)2−PEG(1.82g、0.212mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(15.93g、29.36mmol)を、THF(50mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.537g、4.40mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.5mL、28mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(50mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過して濃縮し、その後PEGベースのデンドリマーを、エチルエーテル(400mL)中で沈殿させて収集して、3.11gの白色固体を得た(収率87%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:17289、Mn:16968、PDI:1.02。SEC MW:8110,Mn:7950,PDI:1.02。Tg=5.3。
【実施例40】
【0102】
[G4]−PGLSA−OH)2−PEG(16)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G4]−PGLSA−bzld)2−PEG(2.88g、0.170mmol)含有の30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:14402、Mn:14146、PDI:1.02。SEC MW:9130,Mn:8980,PDI:1.02。Tg=−18.0。
【実施例41】
【0103】
角膜組織接着剤としての使用のための([Gn]−PGLSA−MA)2−PEGデンドリマーの一般的調製 − 一例として、([G1]−PGLSA−MA)2−PEG(0.100g、0.202mmol)を、エタノールに溶解した(ポリマー:溶媒比が2.5:1(w/w))。一旦、眼を準備したら、5μLの0.5% EY含有DI水、50μLの5Mトリエタノールアミン、および1μLのVPを含有する、5μLの光開始系を、添加して徹底的に混合した。
【実施例42】
【0104】
眼の手術のための一般的手技。眼球摘出したヒトの眼(NC Eye Bank)を、角膜面を上向きにして外科用顕微鏡の下に置いた。4.1mmの角膜切開刀の刃で角膜上皮を剥がし、次いで2.75mmの角膜切開刀の刃を用いて角膜中央を切開した。次に角膜切開刀を用いて4.1mmの線状の裂創を形成した。3つの断続性の10−0ナイロン縫合糸、または光架橋可能バイオデンドリマーコポリマーのいずれかを用いて、この創傷を閉鎖した。次いで、光開始系を含むポリマーを、以下の様式で、この創傷に塗布した。第一に、23ゲージの針を用いて、10μLの5、8、11、または14をツベルクリン注射器に収集した。次に、光架橋可能デンドリマーを、同じ注射器を用いて、この線状の切開の長さにそって、細い帯状に塗布した(約1mm幅で5mm長)。光重合化を開始するために、塗布されたコポリマーにとってレーザービームを動かしながら、アルゴン−イオンレーザー(コヒーレント;光ファイバーアタッチメントをインストール)で、眼から0.5cmの距離で、コポリマーに照射した(200mW、1秒パルス照射、全50パルス)。次に、シリンジポンプ(kdScientific,Model 100シリーズ)に接続した25ゲージのバタフライ針を、眼筋に隣接した強膜中に挿入した。創傷漏出圧を測定するため、20ゲージの針を介して眼を心トランスデューサー(cardiac transducer)に接続し、この針を視神経に1cm挿入した。この針を、外科手術用テープで所定の位置に保持した。次いで圧力を記録した。シリンジポンプで、緩衝化生理食塩水を(15〜20mL/hrの速度で)眼に与え、このとき、心トランスデューサーで同時に圧力を読み取った。このシリンジポンプの速度を維持して、圧力の1mmHgの連続的な上昇を達成した。外科用顕微鏡のもとで、眼から流体が漏出することが観察された圧力を、漏出圧力として記録した。
【0105】
角膜表面を上向きにした眼球摘出した眼を、外科用顕微鏡の下に置いき、角膜切開刀の刃で4.1mmの裂創を作製した。次いで、3つの断続性の10−0ナイロン縫合糸(標準の3−1−1縫合構成)、または光架橋可能バイオデンドリティックコポリマー(スキーム1を参照のこと)のいずれかを用いて、この創傷を閉鎖した。詳細には、10μLのコポリマー5、8、11、または14をこの裂創に塗布し、そしてアルゴンイオンレーザー照射で、この創傷のデンドリティックゲルシーリングを行った(200mW、1秒照射、総照射時間50秒;このポリマー溶液は、エチルエオシン含有1−ビニルピロリドン、およびTEA(光開始剤および共触媒として)を含んだ)。次に、修復した裂創が漏れるまで、眼筋に隣接する強膜壁を通じて挿入された注射器を介して、前眼房に生理食塩水を注射した。視神経を通じて約1cm挿入した心臓トランスデューザープローブで、ナイロン縫合糸(N=6)で処置した眼、およびバイオデンドリマーシーラント(N=3;試験した各々のコポリマーについて)で処置した眼の両方について、漏出圧力をモニターした。例えば、ヒトの眼の正常な眼内圧は、18mmHg〜20mmHgである。縫合された処置された眼についての平均漏出圧力(LP)は、90±18mmHgであった。コポリマー8でシールした眼についてのLPは、171±44mmHg(142〜222mmHgの範囲)であった。コポリマー5は、創傷をシールせず、そして測定値が得られる前に漏出した。コポリマー11は、顕微鏡の操作下で、制御された様式で、創傷に送達されるには、重合するのが速すぎた(LP<15mmHg)。コポリマー14は、水中で不溶性であり、アルコール中ではごくわずかに可溶性であり、そして裂創に塗布された場合、創傷をシールしない。
【実施例43】
【0106】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシンエチルエステル]の合成。2−[(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)−2−酢酸](4.02g、16.9mmol)、グリシンエチルエステル(3.53g、25.3mmol)、およびDCC(5.22g、25.3mmol)を、CH2Cl2(40mL)に溶解した。室温での撹拌をTEAとともに窒素雰囲気下で14時間継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、その濾液をエバポレートさせた。MeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、2.07gの白色粉末を得た(収率38%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 324m/z(MH+)(理論値:323m/z(M+))FAB−MS。
【実施例44】
【0107】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシン]の合成。2−[(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシンエチルエステルを、DMFに溶解して、NaOHを添加した。1H NMRによってFAB−MSを得た。
【実施例45】
【0108】
ベンジリデン保護[G0]−PGLGA−GLY 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシン]の合成。(4.02g、15.9mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(2.62g、14.5mmol)、およびDPTS(1.21g、4.10mmol)を、CH2Cl2(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(3.61g、17.5mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下において14時間、継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、その濾液をエバポレートさせた。3:97のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、5.63gの白色粉末を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:GC−MS 415m/z(MH+)(理論値:414m/z(M+))。元素分析 C:66.63%;H 6.33%(理論値 C:66.65%;H:6.32%)。
【実施例46】
【0109】
[G0]−PGLGA−GLYの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLGA−GLY(5.49g、13.2mmol)含有EtOAc/MeOH(3:1、40mL)の溶液に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後20分間振盪した。触媒を濾過して、EtOAc(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして、2.94gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た。(理論値:238m/z(M+))元素分析C:45.52%;H 7.65%(理論値 C:45.37%;H 7.62%)。
【実施例47】
【0110】
高分岐(hyperbranched)バイオデンドリマー:TEAの存在下での2−O−(コハク酸)グリセロール誘導体のNHS保護エステルの溶液を撹拌して、高分岐したポリマーを得た。NMRを得た。1当量の四官能性のコアと、60当量のNHSエステルとで、重量約10kDのバイオデンドリティック高分岐ポリマーを得る。
【実施例48】
【0111】
[G2]−PGLSA−MAの重合化 − [G2]−PGLSA−MAおよびDMPA(0.1% w/w)を、CH2Cl2に溶解して10%w/w溶液を作製することによって、ゲルを調製した。ピペット先端から新鮮なマイカ表面へ、1滴の溶液を滴下し、そして直ちに、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。その表面を1.0mLのCH2Cl2で洗浄して、一晩乾燥させた。
【実施例49】
【0112】
[G2]−PGLSA−MAのフォトマスク重合化 − [G2]−PGLSA−MA、DMPA、およびVP(それぞれ、1,000:10:1)を、CH2Cl2に溶解して、ゲルを調製し、その溶液を濃縮した。次に、少量のポリマー(開始剤および促進剤とともに)を、少量のCH2Cl2に溶解して、カバーガラスをスピンコーティングさせた。フォトマスクをこのカバーガラスの上に置き、そしてUVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。その表面を1.0mLのヘキサンで洗浄して、一晩乾燥させた。100ミクロンのバイオデンドリティックゲルラインを形成して、SEMで観察した。原子間力顕微鏡(AFM)によって、このフィルムが、円滑かつ均一であり50nmの解像度では感知できるほどの欠損はないことが示される。高度偏差のRMS平均は、約1.5nmである。
【実施例50】
【0113】
マクロ多孔性デンドリティックゲル。エッペンドルフ微量遠心管中での遠心分離によって、所望の大きさ(例えば、1ミクロン)のポリスチレンビーズを、最初に水性懸濁液から分離した。次に光架橋可能なバイオデンドリティック高分子G2−PGLSA−MMAおよび光開始剤(DMAP)を、このエッペンドルフに(所望の濃度に対して特異的な容積で)添加し、そしてボルテックス撹拌器で、このビーズと混合した。次いで、このサンプルをUVランプで光架橋させて、エッペンドルフ管から取り出した。次いで、このポリスチレンビーズを含有する架橋されたポリマーを、トルエン中に約72時間浸漬して、ビーズを溶解させた。次いで、このマクロ多孔性生体材料を、大量のエタノールおよび水でリンスして、さらなる使用まで保管した。マクロ多孔性生体材料の走査電子顕微鏡写真によって、光架橋およびビーズ溶解の前の、このバイオポリマーにおけるポリスチレンビーズの立方最密配列から生じたハニカム(ハチの巣)構造が示される。
【実施例51】
【0114】
(ゲルの多光子製造(加工))二光子重合化において、光開始剤のレーザー励起は、少なくとも1つの仮想的または非定常的な状態を通じて進行する。光開始剤は、2つの近赤外線光子を吸収し、それをS2状態に駆動し、続いてS1および長寿命三重項状態への系間交差へ減衰する。入射光子の空間密度が高い場合、開始分子(三重項状態)は、TEAからの電子を抽出し、これによってポリマーの光架橋反応を開始して足場を作製する。重要なことに、複雑かつ詳細な構造は、高い精度で製造(加工)され得る。なぜなら、2光子吸収は、狭い集束条件下で極度に局在化されるからである。2光子誘導性重合化(TPIP)を介した、制御された微細加工を用いて、バイオポリマーの溶液から生体医学的に有用な構造を合成した。レーザー走査共焦点顕微鏡と組み合わされたフェムト秒近赤外線チタンサファイアレーザー(Coherent 900−F)を用いて、TPIPを実施した。TPIPに用いた平均出力および波長は、それぞれ50mWおよび780nmであった。この顕微鏡は、点走査およびラスター走査のための走査鏡を装備されていた。約20μLの溶液(バイオポリマー、エオシンy(EY)、およびトリエタノールアミン(TEA)、10000:1000:1)を、共開始剤として用い、それをレーザー照射のために顕微鏡のステージ上に装填する前にカバーガラス上に滴下した。
【実施例52】
【0115】
(バイオデンドリティックファイバー)バルク溶液からポリマーを引き出しながら、架橋可能バイオデンドリマーの溶液を光重合化することによって、バイオデンドリティックファイバーを調製した。走査電子顕微鏡写真は、ミクロン幅の明確なファイバーを示す。濃度、光重合化、および押し出し速度を変化させることによって、異なるファイバーを形成し得る。
【実施例53】
【0116】
(バイオデンドリティックゲル上の細胞播種)G2−PGLSA−MMA由来の光架橋したゲルは、以前に記載されたように、約20μlのポリマーを添加すること、およびUVランプを用いて、10分間光架橋することによって96ウェルプレートの底に由来する。次いで、適切な培地中の幹細胞を、96ウェルプレートに添加した。この幹細胞を、48時間の間、特定の時間間隔で、光学顕微鏡によってモニターした。幹細胞は生存しており、そして架橋したバイオデンドリティックゲルに結合された。
【実施例54】
【0117】
(光架橋可能なデンドリティックポリマーを用いた角膜移植片のシール)眼球摘出したドナーのヒトの眼において、5.5mmの角膜中央穿孔を実施した。次いで、粘弾性のHealonのベッドを前眼房中に導入して、自家移植片の安定化を補助する。滅菌の光架橋可能なバイオデンドリティックポリマーを、27ゲージカニューレを用いて移植片−宿主接合部に塗布する(N=5)。次いで、514nmの波長で、かつ51W/cm2で作動する持続波アルゴンレーザーを用いて、この溶液を重合する。移植された眼の角膜輪部上の既知の高さで、平衡塩溶液のリザーバーに連結された23ゲージの眼内カニューレを使用して、水柱検圧法を用いて、全ての眼についての破裂圧力を決定した。参照として、16の従来の断続性10−0ナイロン縫合糸を用いて、どのような光架橋可能なポリマーも用いずに、10の角膜ボタンを本来の位置に縫合する。破裂圧力は、従来のナイロン縫合糸に比べて、光架橋可能なバイオデンドリティックポリマーでシールした角膜移植片については高かった。
【実施例55】
【0118】
(BGL−GA−PHE−OHの合成)−フェニルアラニンエチルエステルHCl(1.2当量)、BGL−GA(1当量)、およびHOBt(1.2当量)を無水CH2Cl2に溶解した。TEA(1.2当量)、およびDCC(1.2当量)を添加して、反応物を、環境温度で一晩撹拌した。濾過によってDCUを取り除き、CH2Cl2(100mL)で希釈した。次いで、この生成物を3.5%HCl(130mL)、水(2×130mL)、で洗浄し、乾燥し、そして溶媒を除去した。フェニルアラニンエチルエステルHClを、0.2M LiOH(水溶液)と一緒に45℃で2時間、撹拌した。この水相をpH4に酸性化して、CH2Cl2を用いて抽出し、乾燥し、そして溶媒を除去して、フワフワした白色の生成物を得た。全体的収率66%。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例56】
【0119】
(G0−PGLGAPHE−Bzldの合成)−BGL(1当量)、BGLGAPHE−OH(1.1当量)、およびDPTS(0.5当量)を、塩化メチレンに溶解して、DCC(1.1当量)を添加した。この反応物を、環境温度で一晩撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして溶媒を除去した。EtOAc中でDPTSを沈殿させて、濾過によって除去した。1:5のEtOH/CH2Cl2を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。EtOH中で沈殿させて、酸を除いた。収率80%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 508 PDI 1.01。
【実施例57】
【0120】
(G0−PGLGAPHE−OHの合成)−G0−Bzldを、THFに溶解し、Pd(OH)2を添加し、水素発生器に、80psiで1時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率96%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 416 PDI 1.01。
【実施例58】
【0121】
(G1−PGLGAPHE−Bzldの合成)−G0−OH(1当量)をDMFに溶解させた。酸(5当量)およびDPTS(2.5当量)を添加し、続いてDCC(5当量)を添加した。次いで、この反応物を、環境温度で一晩、撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして高真空下で溶媒を除去した。次いで、エーテルで生成物を洗浄し、EtOAcに溶解し、濾過によってDPTSを除去した。次いで、この生成物を最小EtOHに溶解して、冷蔵庫中で一晩沈殿させた。最終的に、5:1のCH2Cl2/EtOHを用いるカラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。収率71%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 1704 PDI 1.01。
【実施例59】
【0122】
(G1−PGLGAPHE−OHの合成)−G1−Bzldを、THFに溶解し、Pd(OH)2を添加し、そして水素発生器に、80psiで1.5時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率98%。1H NMRおよびIRを得た。SEC Mw 1671 PDI 1.01。
【実施例60】
【0123】
(G2−PGLGAPHE−Bzldの合成)−G1−OH(1当量)を、DMFに溶解した。酸(16当量)およびDPTS(16当量)を添加し、続いてDCC(16当量)を添加した。次いで、この反応物を、環境温度で48時間、撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして高真空下で溶媒を除去した。EtOAc中でDPTSを沈殿させ、濾過によって除去した。15%EtOH含有塩化メチレンを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。EtOHで生成物を洗浄した。収率25%を超える。1H NMRおよびIRを得た。SEC 3681 PDI 1.01。
【実施例61】
【0124】
(G2−PGLGAPHE−OHの合成)−G2−Bzldを、THF/MeOHに溶解し、Pd(OH)2を添加し、そして水素発生器に、80psiで12時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率95%。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例62】
【0125】
(2(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2)の合成)
【化14】
17.00g(0.09434モル)のcis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(1)、および14.42g(0.1441モル)の無水コハク酸を、ピリジン中において室温で18時間撹拌させた。ピリジンを除去して、白色粉末をdH2Oに溶解した。1N NaOHを用いて、水のpHを7.0に調節した。水相をCH2Cl2で洗浄して不純物を除いた。次いで、1N HClを用いて、この水相をpH4.0に調節した。この生成物をCH2Cl2で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濾過して、乾燥し、白色粉末として、25.023gの純粋な生成物を得た(収率、94.6%)1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:281m/z(MH+)(理論値:280m/z(M+))。元素分析:C、60.07%;H,5.80%(理論値:C,59.99%;H,5.75%)。
【実施例63】
【0126】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロール(bzld−G1−PGLSA−phth デンドロン)(3)の合成)
【化15】
4.004g(0.01429モル;1当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)、および3.803g(0.01584モル:1.1当量)のN−ブロモメチルフタルイミド、および2.002g(0.03446モル;2.4当量)のフッ化カリウムを、85℃のDMF中で、2時間撹拌した。次いで、DMFを減圧下で除去した。固体生成物を、CH2Cl2に溶解して、水、飽和NaHCO3で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、エーテル中で回転蒸発させて、沈殿させた。最終生成物を、MeOH中で、4.169gの白色粉末として再結晶化した(収率、66.5%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:440.1m/z(MH+)(理論値:439.4m/z(M+))。
【実施例64】
【0127】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールのベンジリデン脱保護)
【化16】
cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールのベンジリデン保護基を、触媒性加水分解によって除去した。2.00gのcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールを、EtOAc/MeOH(9:1)に溶解して、10%(w/w 10%)のPd/Cを添加した。次いで、この溶液を水素発生器上のパー(Parr)チューブに入れ、そして50atmのH2下で1時間、振盪させた。次いで、この溶液を湿性セライト上に濾過させた。この生成物をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH 95:5)で精製して、1.5gの透明な油状物を得た(収率、94%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例65】
【0128】
(DPTSの合成)
MooreおよびStubbの手順に従って、DPTSを合成した[Moore,1990#197]。p−トルエンスルホン酸(PTSA)を、トルエンに溶解して、真空ライン上で乾燥させた。それを、無水トルエン中に40℃で溶解した。等モル量のDMAP(4−ジメチルアミノピリジン;122.17g/モル)を、温かいトルエンに溶解して、この溶液に添加した。この溶液を一晩撹拌して、白色固体を沈殿させた。この溶液を濾過した。この沈殿物を真空ライン上で乾燥させて、さらなる精製なしに用いた。これは、p−トルエンスルホン酸および4−ジメチルアミノピリジンの1:1の塩複合体であって165℃の融点を有する。
【実施例66】
【0129】
(ベンジリデン−G−2 PGLSA−メチルフタルイミド デンドロンの合成)
【化17】
1.50g(4.27mmol)の脱保護生成物を、無水CH2Cl2中で、2.63g(9.38mmol、2.2当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール、1.26g(4.28mmol、1当量)DPTS、および2.64g(12.8mmol、3当量)のDCCとともに、室温で1晩、撹拌した。この溶液を濾過して、回転蒸発させて、冷THF中に入れ、再度濾過して、回転蒸発させ、エーテル中で再結晶化させ、濾過して、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2〜CH2Cl2:MeOH 95:5)で精製して、3.23g(3.69mmol)の白色粉末(収率、86%)を生成した。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:876.3m/z(MH+)、(理論値:875.3m/z(M+))。HR−FAB:874.2537m/z(M−H+)(理論値:875.2637m/z(M+))。
【実施例67】
【0130】
(Bzld−G2−PGLSA−phth デンドロンのベンジリデン脱保護)
【化18】
0.746gのBzld−G2−phth デンドロン(5)を、THFに溶解した。10%(w/w)の10%Pd/Cを、この溶液に添加し、引き続いてこれを、水素発生器中に40atm H2(g)のもとで1時間おいた。この溶液をセライトを通して濾過して、乾燥させ、0.52g(0.743mmol)の油状生成物(6)を得た(収率、95%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例68】
【0131】
(Bzld−G3−PGLSA−phth デンドロン(7)の合成)
【化19】
0.52gのベンジリデン脱保護G2−PGLSA−phth デンドロン(6)(0.743mmol)を、無水CH2Cl2に溶解した。0.916gのcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)(3.27mmol;4.4当量)、0.44g(1.44mmol)DPTS、および0.674g(3.27mmol)DCCを添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。それを濾過して、生成されたDCUを除去し、冷THF中で精製してさらにDCUを除き、そして冷エーテル中で再結晶化した。この産物をカラムクロマトグラフィー(95:5 CH2Cl2:MeOH;Rf=0.82)で精製して、白色固体粉末(7)を得た(収率、84%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:1749.5m/z(MH+)、(理論値:1748.7m/z(M+))。元素分析:C,59.17%;H,5.56%(理論値:C,59.07%;H,5.36%)。SEC:MW=1880,Mn=1850,PDI=1.01。
【実施例69】
【0132】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸(t−ブチル−ジフェニルシリル))グリセロール(bzld−G1−GLSA−Si デンドロン(9)の合成)
【化20】
4.002g(0.0143mmol)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)および3.24g(3.3当量のイミダゾール)を、少量のDMF中で撹拌した。6.4mL(1.7当量)のジフェニル−t−塩化ブチルシリルを、添加して、その反応物を25℃で48時間撹拌した。CH2Cl2を添加して、飽和NaHCO3および水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過して、回転蒸発させ、そして真空ライン上で乾燥させた。この生成物を、カラムクロマトグラフィー(4:1 ヘキサン:EtOAc)によって精製して、6.38g(0.123mol)の生成物を厚い不透明な油状物として得た(9)(収率、86.1%)。Rf=0.130(4:1のヘキサン:EtOAc中)。1H NMRおよびIRを得た。GC−MS:519.2m/z(MH+)(理論値:518.7m/z(M+))。HR−FAB:517.2028m/z(M−H+)(理論値:518.2125m/z(M+))。
【実施例70】
【0133】
(bzld−G1−GLA−Siデンドロン(10)のベンジリデン除去)
【化21】
1当量のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸(ジフェニル−t−ブチルシリル))グリセロールを、THFに溶解し、10%(w/w)10%Pd/Cを添加した。次いで、その溶液を水素発生器上のパーチューブに入れ、排気して、水素でフラッシュし、そして40atmのH2下で3時間、振盪した。次いで、その溶液を湿性セライトを通して濾過した。回転蒸発させて、カラムクロマトグラフィー(1:1 Hex:EtOAc〜1:4 Hex:EtOAc)によって精製した。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例71】
【0134】
(bzld−G2−PGLSA−Si デンドロン(11)の合成)
【化22】
1.90g(4.41mmol)の2−O−(コハク酸(ジフェニル−t−ブチルシリル)グリセロールを、無水CH2Cl2中で撹拌し、1.30g(1当量;4.41mmol)DPTS、2.72g(9.70mmol;2.2当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール、および2.00g(9.70mmol;2.2当量)のDCCを添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した(15分以内にDCUは析出し始める)。DCU沈殿物を濾過除去して、その溶液をエバポレートした。1:1のエチルアセテート:ヘキサンの溶液を添加して、その不純物を破砕したが、その生成物(G−2デンドロン)は、溶液中に残る。その溶液を濾過して回転蒸発させ、そして真空ライン上に置いて、カラムクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン:EtOAc)で精製して、3.70g(3.87mmol)の生成物を得た(収率、88%)。Rf=0.2155(1:1 ヘキサン:EtOAc);Rf=0.5091(3:7 ヘキサン:EtOAc)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:955.3m/z(MH+)、(理論値:955.1m/z(M+))。SEC:MW=940,Mn=930,PDI=1.01。
【実施例72】
【0135】
(G2−PGLSA−Siデンドロン(12)を得るためのbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)のベンジリデン除去)
【化23】
1.55g(1.62mmol)のbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)をTHFに溶解し、過剰の20%Pd(OH)2/Cを添加した。次いで、その溶液を水素発生器上のパーチューブに入れて、50atmのH2下で4時間、振盪した。次いで、その溶液を、湿性セライトを通して濾過し、回転蒸発させて、カラムクロマトグラフィー(1:1 Hex:EtOAc〜1:4 Hex:EtOAc)によって精製して、1.12g(1.54mmol)のベンジリデン脱保護G2−PGLSA−Siデンドロン(12)を得た(収率、95%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例73】
【0136】
(bzld−G2−PGLSAデンドロン(14)を得るためのbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)からのシリル除去)
【化24】
1.00g(1.04mmol)のbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)をTHFに溶解した。1.25g(3.96mmol;3.8当量)のフッ化テトラブチルアンモニウム水和物(TBAF/3H2O;315.51g/mol)をその溶液に添加し、そしてそれを室温で1時間撹拌した。1時間後、TLCによって証明されたとおり、反応が完了した。その溶液をH2O(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、回転蒸発させ、そして真空ライン上で乾燥させた。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(100%CH2Cl2〜2%MeOH含有CH2Cl2)によって精製して、0.65g(0.907mmol;収率87%)の生成物(14)を得た。1H NMRおよびIRを得た。GC−SEC:MW=810、Mn=800,PDI=1.01。
【実施例74】
【0137】
(bzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)の合成)
【化25】
0.55g(0.71mmol)のベンジリデン脱保護G2デンドロン(12)を、CH2Cl2中で撹拌し、0.415g(1.41mmol;2当量)DPTS、0.871g(3.11mmol;4.4当量)のcis−O−ベンジリデン−2−(コハク酸)グリセロールモノエステル(2)、および4.4当量のDCCを添加した。この溶液を窒素下、室温で一晩撹拌した(15分以内にDCUは析出し始める)。DCU沈殿物を濾過除去して、その溶液をエバポレートした。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(3:7 ヘキサン:EtOAc)で精製して、0.71gの(13)を得た(収率、54%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:1825.6m/z(M−H+)、(理論値:1827.9m/z(M+))。HR−FAB:1825.6124m/z(M−H+)(理論値:1826.6233m/z(M+))。SEC:MW=1830、Mn=1810,PDI=1.01。
【実施例75】
【0138】
(bzld−G3−PGLSA(8)を生成するためのbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)からのシリル除去)
【化26】
t−ブチル−ジフェニルシリル基をG3デンドロンから除去し、そして生成物をG2デンドロンと類似の様式で精製した。2.00g(1.09mmol)のbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)をTHFに溶解した。1.3g(4.1mmol;3.8当量)のフッ化テトラブチルアンモニウム水和物(TBAF・3H2O;315.51g/mol)をその溶液に添加し、そしてそれを室温で1時間撹拌した。1時間後、TLCによって証明されるように、反応が完了した。その溶液をH2O(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、回転蒸発させて、真空ライン上で乾燥させた。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(100%CH2Cl2から2%MeOH含有CH2Cl2まで漸増)によって精製して、1.44g(0.906mmol;収率83%)の生成物(17)を得た。1H NMRおよびIRを得た。SEC:MW=1650、Mn=1620、PDI=1.02、Mactual=1589.50。
【実施例76】
【0139】
(bzld−G3−PGLSA−Siデンドロンからのベンリリデン除去)
【化27】
0.484gのbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)をTHFに溶解した。20%Pd(OH)2を、添加して、フラスコを排気して、50psi H2を充填した。その混合物を1時間振盪して、次にセライトを通して濾過した。この濾液を乾燥して、0.38g、すなわち収率97%で、油状物を生成した。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例77】
【0140】
(bzld−G4−PGLSA−Siデンドロン(16)の合成)
bzld−G4−PGLSA−Siデンドロンを、2つの方法で、すなわちDCCカップリングによるモノエステル(2)のG3−PGLSA−Siデンドロン(bzldなし)(15)への付加(G3+G1法)によってか、またはこれもDCCカップリングによるbzld−G2−PGLSA(Siなし)(14)のG2−PGLSA−Si(bzldなし)(12)への付加(G2+G2法)によって合成した。両方の方法の描写についてはスキーム4.4を参照のこと。
【0141】
G3+G1:0.38gのG3−PGLSA−Si(0.26mmol)を、無水DCMに溶解した。1.00g(3.57mmol)のcis−O−ベンジリデン−2−(コハク酸)グリセロールモノエステル(2)、0.10g(0.34mmol)DPTS、および0.656g(3.57mmol)DCCを、この混合物に添加した。この溶液を窒素下において室温で48時間撹拌した。DCU沈殿物を濾過除去して、その濾液を乾燥して、カラムクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン:EtOAc〜1:4 ヘキサン:EtOAc)によって精製した。0.572g(0.16mmol)の白色含水性粉末(16)を分離した(収率60%)。1H NMRおよびIRを得た。MALDI−MS:3574.54m/z(MH+)(理論値:3573.54m/z(M+))。SEC:MW=3420、Mn=3350,PDI=1.02。
【実施例78】
【0142】
(PGLSAデンドリマー四官能性コア(bzld−G0−PGLSA)(17)の合成)
【化28】
コハク酸、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロールおよびDPTSを、無水CH2Cl2に溶解した。DCCを添加して、その反応物を窒素下において室温で一晩、撹拌した。DCUを濾過除去して、その濾液を濃縮して、カラムクロマトグラフィー(97:3 CH2Cl2:MeOH)によって精製した。収率90%。1H NMRおよびIRを得た。GC−MS:443m/z(MH+)(理論値:442m/z(M+))。HR−FAB:442.1635m/z(M+)(理論値:442.1628m/z(M+))。元素分析:C,65.25%;H,5.85%(理論値:C,65.15%;H,5.92%)。
【実施例79】
【0143】
(四官能性コアのベンジリデン脱保護)
【化29】
1.00g(0.0023mol)のbzld−G0−PGLSA(17)を、パーチューブ中のTHFに溶解した。10%(w/w)Pd(OH)2/Cを添加した。このパーチューブを排気して、H2(g)でフラッシュして、50psiのH2で充填した。この溶液を3時間、振盪した。この触媒を濾過して、THFで洗浄した。この濾液をエバポレートして、0.57g(0.0022mol)の透明な油状生成物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRを得た。元素分析:C,44.94%;H,6.87%(理論値:C,45.11%;H,6.81%)。
【実施例80】
【0144】
(bzld−G3−PGLSAデンドリマー(19)の合成)
【化30】
0.029g(0.11mmol)の四官能性コア(18)を無水DCMに溶解して、0.9g(0.57mmol)bzld−G3−PGLSA(8)、33mg(0.11mmol)DPTS、および0.12g DCC(0.57mmol)を添加した。この溶液を窒素下において室温で72時間撹拌した。SEC:MW=4740、Mn=4590、PDI=1.01、Mtheoretical=6552.19。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例81】
【0145】
((bzld−G3−PGLSA)−PEG線状ハイブリッド(20)の合成)
【化31】
0.29g(0.18mmol)のbzld−G3−PGLSAデンドロン(8)を、無水DCMに溶解し、0.45g(0.09mmol)5000MW ポリ(エチレングリコール)モノ−メチルエーテル(PEG−MME)(Polyscience,Inc.,Warrington,PA)、0.037g(0.18mmol)DCC、および0.026g(0.09mmol)DPTSを、この溶液に添加した。その溶液を窒素下において室温で168時間撹拌した。DCUを濾過除去した。その濾液を回転乾燥してTHFに溶解し、冷却し、そしてDCUを濾過除去した。この生成物をエチルエーテル中で沈殿させた。その溶液をTHFに溶解し、Amberlyst A−21イオン交換樹脂(Aldrich)(弱塩基性樹脂)とともに撹拌して、過剰のbzld−G3−PGLSA−酸(8)を排除した。その溶液を濾過して、その濾液を乾燥させて、0.528gの白色固体生成物を得た(収率89%)(20)。MALDI−MS:MW=6671、Mn=6628 PDI=1.01(理論値 MW=6588;PEG−MME(5000g/mol)サンプル:MALDI−MS MW=5147、Mn=5074、PDI=1.01)。SEC:MW=6990、Mn=6670,PDI=1.04。1H NMRおよびIRを得た。
【図面の簡単な説明】
【0146】
【図1】上記の実施例に記載されるG0−PGLGA−PHE−OHへの合成経路を示す。
【図2】上記の実施例に記載されるG2−PGLGA−PHE−OHへの合成経路を示す。
【図3】上記の実施例に記載されるG0、G1、G2、およびG3 PGLSA−PEGバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図4】上記の実施例に記載されるG4 PGLSA−PEGバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図5】上記の実施例に記載されるG0、G1、G2、およびG3 PGLSAバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図6】上記の実施例に記載されるG4 PGLSAバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【0001】
本出願は、その内容全体が参考として本明細書中に明確に援用されている、2001年2月26日出願の米国仮出願番号60/270,881号に基づき、かつその出願の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【0002】
本発明は、創傷をシールするかまたは修復するような臨床的な処置、および他の外傷を受けた組織または変性した組織の処置に関する。特に好ましい形態では、本発明は、デンドリティック高分子(dendritic macromolecule)などの新規な架橋可能なバイオポリマーの使用、およびそれらのインビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)における使用において特に具体化される。このような用途としては、眼科、整形外科、心臓血管、肺、または泌尿器の創傷および傷害が挙げられる。これらの生体材料/バイオポリマーは、創傷の部位に容易に接近できない場所か、または縫合糸なしの手術が所望される時の、他の外科手術のために有効なシーラント/グルー(glue)となると考えられる。架橋可能なデンドリティック高分子は、一光子分光分析法および多光子分光分析法を用いて、特定の形状およびサイズの細胞の足場/ゲル/マトリックスに加工され得る。このポリマーを、架橋した後に、細胞とともに播種して用い、次に器官、組織、または骨の修復、または置換に用い得る。あるいは、このポリマーおよび細胞を混合して、次に器官、組織、もしくは骨の修復または置換のために、インビボ部位に注射して、その場所(in situ)で架橋させてもよい。この架橋されたポリマーは、新生の細胞増殖のために3次元の鋳型を提供する。この方法は、種々の再建術(3次元の組織欠損を再建するための細胞移植物の注文成形を含む)に用いることが可能である。架橋可能なバイオデンドリティック高分子および架橋不可能なバイオデンドリティック高分子は、薬物送達ビヒクル、または医薬のキャリア、および医療用画像処理の造影剤として用いられ得る。
【0003】
(発明の背景および要旨)
A.デンドリティック高分子
デンドリティックポリマーは、中心のコアから放射する反復する分岐単位から構成される、球形の単分散ポリマーである。(US5714166;US4289872;US4435548;US5041516;US5362843;US5154853;US05739256;US5602226;US5514764;Bosman,A.W.;Janssen,H.M.;Meijer,E.W.Chem.Rev.1999,99,1665〜1688.Fischer,M.;Vogtle,F.Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,884〜905.Zeng,F.;Zimmerman,S.C.Chem.Rev.1997,97,1681−1712.Tomalia,D.A.;Naylor,A.M.;Goddard,W.A.Angew.Chem.int.編、Engl.1990,29,138)。これらの高分子は、ダイバージェント(divergent)(コアから表面へ)なアプローチ(Buhleier,W.;Wehner,F.V.;Vogtle,F.Synthesis 1987,155−158.Tomalia,D.A.;Baker,H.;Dewald,J.;Hall,M.;Kallos,G.;Martin,S.;Roeck,J.;Ryder,J.;Smith,P.Polymer journal 1985,17,117〜132.Tomalia,D.A.;Baker,H.;Dewald,J.;Hall,M.;Kallos,G.;Martin,S.;Roeck,J.;Ryder,J.;Smith,P.Macromolecules 1986,19,2466.Newkome,G.R.;Yao,Z.;Baker,G.R.;Gupta,V.K.J.Org.Chem.1985,50,2003)1、またはコンバージェント(convergent)(表面からコアへ)なアプローチ(Hawker,C.J.;Frechet,J.M.J.J.Am.Chem.Soc.1990,112,7638−7647)のいずれかを用いて合成される。この研究領域は、TomaliaおよびNewkomeの初期の研究以来、この10年間に驚異的な発展を遂げた。線状ポリマーに比べて、デンドリマーは、高次であり、ボリュームレシオ(容積比)に対して高い表面積を有し、そして官能化のための多数の末端基を表出する。結果として、デンドリマーは、産業上の適用および生体医学適用の両方について、以下を含む、いくつかの好適な物理的特徴を示す:小さい多分散性指数(PDI)、低い粘性、高い溶解度および混和性、ならびに優れた接着性。生体医学/生物工学の適用(例えば、MRI、遺伝子送達、および癌の治療)について検討された多くのデンドリマーは、芳香族ポリエーテルまたは脂肪族アミドの誘導体であり、従ってインビボ用途のためには理想的ではない(Service,R.F.Science 1995,267,458−459.Lindhorst,T.K.;Kieburg,C.Angew.Chem.Int.編、1996,35,1953−1956.Ashton,P.R.;Boyd,S.E.;Brown,C.L.;Yayaraman,N.;Stoddart,J.F.Angew.Chem.Int.編.1997,1997,732−735.Wiener,E.C.;Brechbeil,M.W.;Brothers,H.;Magin,R.L.;Gansow,O.A.;Tomalia,D.A.;Lauterbur,P.C.Magn.Reson.Med.1994,31,1−8.Wiener,E.C.;Auteri,F.P.;Chen,J.W.;Brechbeil,M.W.;Gansow,O.A.;Schneider,D.S.;Beldford,R.L.;Clarkson,R.B.;Lauterbur,P.C.J.Am.Chem.Soc.1996,118,7774−7782.Toth,E.;Pubanz,D.;Vauthey,S.;Helm,L.;Merbach,A.E.Chem.Eur.J.1996,2,1607−1615.Adam,G.A.;Neuerburg,J.;Spuntrup,E.;Muhler,A.;Scherer,K.;Gunther,R.W.J.Magn.Reson.Imag.1994,4,462−466.Bourne,M.W.;Margerun,L.;Hylton,N.;Campion,B.;Lai,J.J.;Dereugin,N.;Higgins,C.B.J.Magn.Reson.Imag.1996,6,305−310.Miller,A.D.Angrew.Chem.Int.編.1998,37,1768−1785.Kukowska−Latallo,J.F.;Bielinska,A.U.;Johnson,J.;Spinder,R.;Tomalia,D.A.;Baker,J.R.Proc.Natl.Acad.Sci.1996,93,4897−4902.Hawthorne,M.F.Angew.Chem.Int編.1993,32,950−984.Qualmann,B.;Kessels M.M.;Musiol H.;Sierralta W.D.;Jungbiut P.W.;L.,M.Angew.Chem,lnt.編、1996,35,909−911)。バイオデンドリマーは、生体適合性であるか、またはインビボにおいて天然の代謝物に分解可能であることが公知の構成単位から全体として構成されるデンドリティック高分子の新規なクラスである。本特許は、新規なデンドリマーおよびデンドリティック高分子の合成、特徴づけ、および用途を記載する。この新規なデンドリマーおよびデンドリティック高分子は、このような生体適合性または天然の代謝物のモノマー(例えば、限定はしないが、グリセロール、乳酸、グリコール酸、コハク酸、リボース、アジピン酸、リンゴ酸、グルコース、クエン酸など)から構成され、「バイオデンドリマー(biodendrimer)またはバイオデンドリティック高分子(biodendritic macromolecule)」と呼ばれる。
【0004】
本発明は該して、ポリエステル、ポリエーテル、ポリエーテルエステル、およびポリアミノ酸、またはそれらの組み合わせのデンドリティックポリマーおよびコポリマーの合成および製造(加工)の領域にある。例えば、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、およびそれらのコポリマーは、合成ポリエステルであって、特定の用途についてFDAに承認されており、そして縫合糸、薬物送達のキャリア、および臓器不全または組織欠損のための組織工学の足場として首尾よく用いられている(Gilding、およびReed,Polymer,20:1459(1979);Mooneyら、Cell Transpl.,2:203(1994);ならびにLewis,D.H.(Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,Chasin,M.,およびLanger,R.編,Marcel Dekker,New York,1990))。組織工学の適用においては、単離された細胞または細胞クラスターを、合成の生分解性ポリマーの足場に付着または埋め込み、そしてこのポリマー−細胞の足場を、次にレシピエントに移植する(LangerおよびVacanti,Science,260:920(1993))。軟骨細胞を含む多数の細胞タイプが用いられている(Freedら,BIO/Technology,12:689(1994))。本発明に記載される新規なバイオデンドリマーと同様、この利点としては、天然に存在する代謝産物を生じるような生理学的環境中でのその分解性、および乳酸の比を変化させることによってその分解の速度を制御する能力が挙げられる。デンドリティック構造において、分解は、用いられるモノマーのタイプ、および生成数の両方によって制御され得る。
【0005】
本発明のさらなる実施形態は、末端基に対して、またはデンドリマー構造内に、細胞認識のための生物学的認識単位を結合させることである。例えば、トリペプチドであるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)が、細胞結合のための構造に付加されてもよい。Barreraらは、低濃度のN−イプシロン−カルボベンゾキシ−L−リジン単位を含むポリ(乳酸)(pLAL)の合成を記載した。このポリマーは、ポリマー−細胞相互作用を改善するために、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド配列または他の増殖因子を導入するためのリジン単位の反応を通じて化学的に改変された(Barreraら、J.Am.Chem.Soc.,115:11010(1993);Barteraらの米国特許第5,399,665号)。Barreraらによって開発されたコポリマーにおける最大の制約は、限定された数のリジン単位しか、骨格中に組み込まれ得ないことである。多くの組織工学適用において、線状ポリマーに付着された生物学的に活性な分子の濃度は、ポリマーと身体との間に所望の相互作用を生じるには低すぎる。結果として、組織工学の適用においては、細胞増殖および組織の発達を支持するための足場としての使用のための最適な材料の開発の必要性が存在する。さらに、ポリマーの生体適合性および他の特性を改善するために、ポリアミノ酸、ペプチド、炭水化物のような官能基を、ポリエステル、ポリエーテル−エステル、ポリカーボネートなどに導入する方法が必要である。さらに、異なる生体医学的適用のためにポリマーの化学的改変を可能にするために十分な濃度の誘導体化可能な基を含む、ポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリエステルアミンなどの材料を開発する必要性が存在する。
【0006】
従って、本発明の目的は、異なる生体医学適用(例えば、組織工学適用、創傷管理、造影剤ビヒクル、薬物送達ビヒクルなど)のために化学的に改変され得る、ポリエステルおよびポリアミノ酸、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミノアルコールのデンドリティックポリマーおよびコポリマーを提供することである。本発明のさらなる目的は、改善された特性(例えば、生分解性、生体適合性、機械的強度)を有するポリエステルおよびポリアミノ酸のデンドリティックポリマーおよびコポリマーを提供することである。本発明のなお別の目的は、ポリマーと、細胞、組織または骨との相互作用を改善するために、ペプチド配列または増殖因子のような官能基を含むように誘導体化され得るデンドリティックポリマーを提供することである。
【0007】
従来の線状ポリマーに対する細胞応答(細胞の接着、増殖、および/または分化を含む)は、ポリマーの構造における変化を通じては、制御も改変もされ得ない。なぜなら、これらのポリマーは、末端基以外に、それらの特性を変化させるための化学的改変を可能にする官能基を有さず、それによってこれらのポリマーの適用は制限されるからである。結果として、本明細書に記載される新規なポリマーは実質的に異なる。
【0008】
B.ゲル
本発明は該して、医療処置において、デンドリティックポリマーゲルおよびゲル−細胞組成物を用いる領域にある。ゲルは、3Dポリマー材料であって、これは水中で膨潤する能力、および溶解することなく構造内に水の画分を保持する能力を示す。水含量、環境条件(例えば、pH、温度、溶媒、ストレス)に対する感受性、軟性、接着力、および弾性コンシステンシーのような、ゲルによって示される物理的特性は、生体医学適用および生物工学適用に好適である。実際、ゲルはコーティングとして(例えば、バイオセンサー、カテーテル、および縫合糸)、「同種の(homogenous)」材料として(例えば、コンタクトレンズ、火傷の包帯、および義歯)、およびデバイスとして(例えば、人工臓器、および薬物送達システム)用いられ得る(Peppas,N.A.Hydrogel in Medicine and Pharmacy,第I巻およびII巻 1987.Wichterle,O.;Lim,D.Nature 1960,185,117−118.Ottenbrite,R.M.;Huang,S.J.;Park,K.Hydrogels and Biodegradable polymers for Bioapplications 1994;627巻,268頁)。
【0009】
人工臓器としての細胞の取り込みのためのゲル材料は、15年より長くにわたって探索されてきており、そしてマイクロカプセル化は、多数の疾患状態についての見込みのあるアプローチである。この疾患状態としては、パーキンソン病(L−ドーパミン細胞)、肝臓疾患(肝細胞)、および糖尿病(ランゲルハンス島)が挙げられる。例えば、過去に、ランゲルハンス島(膵臓のインスリン産生細胞)は、ポリ−L−リジンコーティングを有するイオンで架橋されたアルギン酸塩(天然のヒドロゲル)マイクロカプセル中にカプセル化されており、そして移植後に、糖尿病のマウスにおいて血糖値を首尾よく低下させている。
【0010】
C.マクロ多孔性バイオデンドリティックのゲル/構造/材料
組織工学における現在の課題は、十分整列された三次元細胞足場の形成である(R.P.Lanza,R.Langer,W.L.Chick,Principles of Tissue Engineering,R.G.Landes/Academic Press,San Diego,CA,1997.L.Christenson,A.G.Mikos,D.F.Gibbons,G.L.Piccolo,Tissue Eng.3(1997)71.R.Langer,J.P.Vacanti,Science 260(1993)920.N.A.Peppas,R.Langer,Science 263(1994)1715.B.D.Ratner,A.S.Hoffman,F.J.Schoen,J.E.Lemons,Biomaterials Science:An Introduction to Material in Medicine,Academic Press,San Diego,2000.Scientific American April(1999)。このような一時的な細胞足場は、細胞の足場、増殖、遊走、およびある場合には分化の場所を提供することによる、再建された組織のための鋳型として探索されている(J.Patrick,C.W.,A.G.Mikos,L.V.Mclntire,Frontiers in Tissue Engineering,Pergamon,New York,1998)。細胞の足場を構築するために代表的に使用されるバイオポリマーは、ポリエーテルグリコール、およびポリα−ヒドロキシ酸のような線状高分子である(S.W.Shalaby,R.A.Johnson,Biomedical Polymers(1994)2.M.Vert,S.M.Li,J.Mater.Sci.Mater.Med.3(1992)432.E.J.Frazza,E.E.Schmitt,J.Biomed.Mater.Res.Symp.1(1971)43.)。バイオデンドリティックポリマーは、ファイバー結合(A.G.Mikos,Y.Bao,L.G.Cima,D.E.Ingber,C.A.Vacanti,R.Langer,J.Biomed.Mater.Res.27(1993)183.D.J.Mooney,G.Organ,J.P.Vacanti,R.Langer,Cell Transplantation 3(1994)203.)、溶媒キャスティングおよび塩リーチング(A.G.Mikos,A.J.Thorsen,L.A.Czerwonka,Y.Bai,R.Langer,D.N.Wislow,J.P.Vacanti,Polymer 35(1994)1068)、メンブレンラミネーション(膜張合わせ)(membrane lamination)(A.G.Mikos,G.Sarakinos,S.M.Leite,J.P.Vacanti,R.Langer,Biomater.14(1993)323.)、メルトモールディング(溶解成形)(melt molding)(R.C.Thomson,M.J.Yaszemski,J.M.Powers,A.G.Mikos,J.Biomed.Sci.Polym.編.7(1995)23)extrusion,M.S.Widmer,P.K.Gupta,L.Lu,R.K.Meszlenyi,G.R.D.Evans,K.Brandt,S.T.Gurelk,C.W.Patrick Jr,A.G.Mikos,Biomaterials 19(1998)1945)、炭化水素鋳型(hydrocarbon templating)(V.P.Shastri,I.Martin,R.Langer,Proc.Natl.Acad.Sci.97(2000)1970)、および相分離(H.Lo,M.S.Ponticiello,K.W.Leong,Tissue Eng.1(1995)15)のような、マクロ多孔性材料を作製するための処理方法の影響を受けやすい。
【0011】
本発明のさらなる実施形態は、鋳型化−指向性マクロ多孔性製造技術(templated−directed macroporous fabrication technique)における架橋可能なバイオデンドリティックポリマーの使用である。この方法は、種々の物性物理学の適用(分離媒体、および吸収媒体、触媒性支持体、機械的ダンプナー(dampner)、および光結晶が挙げられる)に適用されてきたが、生体材料には適用されなかった。代表的には、無機材料またはポリマー材料は、犠牲的な鋳型の存在下において、制御された沈殿または重合体化によって製造(加工)される(O.D.Velev,T.A.Jede,R.F.Lobo,A.M.Lenhoff,Nature 389(1997)447.A.A.Zakhidov,R.H.Baughman,Z.Lobal,C.Cui,L.Khayyrullin,O.Dantas,J.Marti,V.G.Ralchenko,Science 282(1998)897.J.E.G.J.Wijnhoven,W.L.Vos,Science 281(1998)802.S.A.Johnson,P.J.Olivier,T.E.Mallouk,Science 283(1999)963.C.R.Martin,Science 266(1994)1961.S.H.Park,Y.Xia,Chem.Mater.10(1998)1745)。ついでこの鋳型は、焼成、フッ化水素酸溶解、または有機溶媒溶解によって取り除かれて、鋳型を連想させる空隙を有するマクロ多孔性材料(例えば、ポリスチレンビーズ)を生じる。この技術によって、いくつかの利点(制御された孔径および密度、単分散孔直径、および室温処理)が広範なポリマーに提供される。材料製造(加工)に関するこれらの利点を考慮して、本発明者らは、このアプローチを、足場/ゲル/マトリックスの組織工学のためのバイオポリマーおよびバイオデンドリティック高分子の処理に適合させた。
【0012】
代表的な手順は、以下のとおりである。第一に、所望の大きさのポリスチレンビーズを、エッペンドルフ微量遠心管中での遠心分離によって水性懸濁液から最初に単離する。次に、光重合可能なバイオポリマーおよび光開始剤(DMAP)をこのエッペンドルフに(所望の濃度に対して特異的な容積で)添加して、ボルテックススピナーで、このビーズと混合する。次いで、このポリマーをUVランプを用いて光架橋して、エッペンドルフ管から取り出す。次いで、ポリスチレンビーズを含む架橋されたポリマーを、トルエン中に約72時間浸して、ビーズを溶解させる。ついで、マクロ多孔性生体材料を、多量のエタノールおよび水を用いてリンスして、さらなる使用まで貯蔵する。
【0013】
一連の異なるマクロ多孔性生体材料の走査電子顕微鏡写真によって、光架橋およびビーズ溶解の前に、バイオポリマー中のポリスチレンビーズの立方最密配列から生成されたハニカム構造が示される。ポリスチレンビーズ/バイオポリマーの比を変化させることによって、異なるマクロ多孔性構造が生成され得る。本発明者らはまた、近年、0.2〜90ミクロンのポリスチレン鋳型を用いて、そして光架橋可能なポリサッカライド(ヒアルロン酸)を用いて、マクロ多孔性生体材料を調製した。細孔の大きさは、犠牲的な鋳型の大きさに関連しており、そしてその構造を通じて均一である。
【0014】
まとめると、十分に整列されたマクロ多孔性生体材料を形成するための温和な手順が記載される。上記の実施形態に実証されるとおり、この技術の利点としては、以下が挙げられる:1)約0.2〜90ミクロンの制御された細孔サイズ、2)0.1g〜1.0g/mLの制御された細孔密度、3)単分散細孔直径、4)相互接続された細孔構造、および5)温和な室温処理。
【0015】
合成された光架橋可能なバイオデンドリマーはまた、マスクを用いた単純な線模様(100ミクロン)の構成によって実証されるように、標準的な露光処理方法の影響を受けやすい。原子間力顕微鏡(AFM)によって、このフィルムが、50nmの解像度で感知できるほどの欠損がなく、滑らかでかつ均一であることが示される。高度偏差のRMS平均は、約1.5nmである。
【0016】
本発明のさらなる実施形態は、光、光開始剤、および光架橋可能なバイオポリマー/生態デンドリティック高分子を用いる微細構造加工手順である。光重合化は、一光子過程または多光子過程を介して生じ得る。二光子重合化において、光開始剤のレーザー励起は、少なくとも1つの仮想的状態または非定常状態を通じて進行する(S.Maruo,O.Nakamura,S.Kawata,Opt.Lett.22(1997)132.J.D.Pitts,P.J.Campagnola,G.A.Epfing,S.L.Goodman,Macromolecules 33(2000)1514)。光開始剤は、2つの近赤外光子を吸収し、それをS2状態にさせ、続いてS1状態に減衰させ、そして長寿命の三重項状態へ系間交差させる。入射光子の空間的密度が大きい場合、開始剤分子(三重項状態である)は、TEAからの電子を抽出し、これによってポリマーの光架橋反応を開始して足場を作製する。重要なことに、複雑かつ詳細な構造は、高精度で加工され得る。なぜなら、2光子吸収は、狭い集束条件下では極端に限局化しているからである。2光子誘導性重合化(TRIP)を介した制御された加工を用いて、光バンドギャップ材料および半導体として使用するために、光重合可能な樹脂から3次元構造が開発されてきた(S.M.Kirkpatrick,J.W.Baur,C.M.Clark,L.R.Denny,D.W.Tomlin,B.R.Reinhardt,R.Kannan,M.O.Stone,Appl.Physics.A.69(1999)461)。本発明に従って、TPIPは、バイオポリマーの溶液からの生体医学的に有用な構造の合成に対して適用され、本発明者らの新規な光架橋可能なバイオデンドリマーを用いる、十分に規定された三次元構造の組織工学足場を最終的に作製するためのこの方法を実証する。
【0017】
TPIPは、以下のシステムを用いて実施される。詳細には、レーザー自動読み取り共焦点顕微鏡と組み合わせたフェムト秒近赤外チタンサファイアレーザー(コヒーレント 900°F)が使用される。設定は図面中に図示する。TPIPに用いる平均出力および波長は、それぞれ50mWおよび780nmである。この顕微鏡は、点走査およびラスター走査(ラスタースキャン)のために走査鏡が装備される。レーザー照射のために顕微鏡のステージ上への装填のまえに、顕微鏡用ガラススライドに、約20μLの溶液を滴下する。
【0018】
Pittsらは、BSAおよびフィブリノーゲンのTPIPを試験した[Pitts,2000 #438]、しかしこれらのポリマーは、高密度の光架橋基を有さない。アクリラート終端バイオポリマー、開始剤、および共開始剤の、10000:1000:1の濃度比による水性混合物を最初に調製した。エオシンY(EY)を開始剤として用い、そしてトリエタノールアミン(TEA)を共開始剤として用いた。単純な線模様が作成された。光学顕微鏡、走査電子顕微鏡、および原子力間顕微鏡によって、製造(加工)された構造を確認した。
【0019】
共有結合的に架橋したゲル/マトリックス/足場以外に、本発明は、水素結合またはイオン荷電網目状構造を介する自己組織化のための末端基を記載している。第一の例は、リジンで官能化された1つのバイオデンドリマーを用い、第二の例はコハク酸で官能化されたものを用いる。pH=7.4での混合の際、2つのバイオデンドリマーは、自己組織化してゲルを形成する。同様に、DNA中に存在する水素結合網目状構造、例えば、G:C塩基対を使用することが提案される。これらのG/C誘導体化デンドリマーは、PNAを調製するのに用いられるのと同じヌクレオシド出発物質を用いて合成され得る。
【0020】
本発明はまた、ゲルを形成するためにペプチド水素結合相互作用を用いることを提案する。絹は、反復するGly−Ala単位から主に構成される天然のポリペプチドである。これらのペプチドは、隣接するアミドの水素イオンとカルボニルとの間の強力な水素結合相互作用による長い逆平衡のシートを形成する。バイオデンドリマーの末端にこれらのペプチドを付着することによって、三次元の架橋されたゲルが形成されることが期待される。非共有結合的な相互作用に基づく原理を用いて、バイオデンドリマーから構成される巨視的なゲルが作製され得る。
【0021】
D.器官/組織の修復または置換のためのデンドリティックな細胞構築物/足場/マトリックス/ゲル
本発明はまた、医療処置におけるデンドリティックポリマー−細胞(dendritic polymeric−cell)組成物使用の領域において一般に使用される。いくつかの有用な例(本発明を限定すると解釈されるべきではない)を以下に記載する。
【0022】
(頭蓋顔面の輪郭奇形(craniofacial contour deformities))頭蓋顔面の輪郭奇形は、現在のところ、矯正のための侵襲的な外科手術を必要とする。これらの外傷性または先天性の奇形はしばしば、重篤である。あるいは、審美上の個人的観点のために手術が要求される。これらの奇形はしばしば、異物形成的な補綴物の形態による補強を必要とするが、これは感染および押出の問題を被る。頭蓋顔面の骨格に追加の自家性の軟骨または骨を送達する最小侵襲の方法によって、外科的外傷が最小限になり、そして異物形成的な補綴物の必要性が排除される。架橋可能なゲルおよび細胞(自家性(autoglous)かまたはそうでないもの)を注射することによって、広範な手術なしに、自家性の組織を用いて、頭蓋顔面の骨軟骨骨格を補強し得る。本発明の実施形態は、頭蓋顔面の輪郭奇形を処置するためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0023】
(乳房腫瘍修復の補強)乳腺は、結合組織の層によって、前胸壁の基礎にある筋肉に付着している変性した汗腺である。1つの乳腺は、15〜25の乳腺葉(主に線維芽細胞および膠原線維の束によって形成された密性結合組織によって分離された)、ならびに脂肪細胞(adipose cell(fat cell))を含む脂肪組織(細網繊維および膠原線維によって一緒に保持された)から構成される。広範に分岐する乳管が、各々の乳腺葉の中にある。乳汁を合成して乳管系に分泌する腺上皮細胞(腺房細胞)は、最小の分岐の末端に位置する。乳管は、単純な立方上皮細胞および円柱上皮細胞から構成される。腺房細胞は、疎性結合組織に埋め込まれており、この疎性結合組織は、膠原線維および線維芽細胞、リンパ球、および形質細胞を含む。腺房細胞および乳管上皮細胞に近接して筋上皮細胞があり、これは、収縮して乳汁を搾り出すことによって、ホルモン刺激および神経刺激に応答する。各々の乳管は、乳首を覆う皮膚を通じて、乳房の表面上で開口する。
【0024】
乳房手術は、美容または治療のいずれかとして広範に分類され得る。美容手術としては、インプラント(移植物)を用いる増強、縮小、または再建が挙げられる。治療的な手術は、最も早期の癌のための主な処置であって、以下が挙げられる:1)軟性組織前胸部壁、ならびに頭および頸に伸びるリンパ節および血管の全体の除去を含み得る根治手術、2)乳房の小部分のみを含み得る乳腺腫瘤摘出術;ならびに3)組織の小領域の破壊のためのレーザー手術。しばしば、インプラントを用いた再建手術が、乳房の大切除術において用いられる。根治的乳房切除術は、乳房、大胸筋および小胸筋の両方、ならびにリンパ節の除去を含む。
【0025】
現在、1年に250,000を超える再建術が実施されており、乳癌、先天性欠損、または外傷による損傷の結果としての再建に対する代替手段は少ない。乳房再建は、癌の乳房切除の時点で、またはその直後に頻繁に用いられる。再建手技は頻繁に、下にある結合組織および脂肪組織を伴う血管新生した皮膚皮弁を、身体の1つの領域から別の領域へ移動する手技を包含する。乳房再建には多くの手術方法があり、これには、ティッシュエキスパンジョン(tissue expansion)とその後のシリコン埋め込み、広背筋皮弁、横方向腹直筋皮弁(TRAM)、遊離TRAM皮弁、および遊離臀筋皮弁が挙げられる。完全な再建にはしばしば、乳房切除術および初期再建後にさらなる手技を要する。これらの手技としては、永続的インプラントのためのティシュエキスパンダー交換、再建の修正、乳首の再建、および乳房固定術/乳房縮小が挙げられる。
【0026】
再建および補充のために頻繁に用いられるシリコン補綴物は、多くの医療上の問題をもたらした。適切に機能し、正常な組織と同様に見えてかつ感じられ、そしてX線診断に干渉しない、埋め込み用の代替材料を有することが所望され得る。従って、デンドリティックポリマーまたはデンドリティック高分子および細胞構築物を用いて、乳房組織の再建および補充のための方法および組成物を提供することが本発明の目的である。
【0027】
(口腔の組織修復)口腔の組織修復は、別の領域であり、ここでは、口腔組織細胞を増殖するため、およびインビボで見出された対応物に対する口腔組織類似物の構成要素の形成のために、3次元のポリマー足場/マトリックス/ゲルが用いられ得る。これらの増殖細胞は、タンパク質を生成し、このマトリックス上に播種された口腔組織細胞の長期増殖を支持するのに必要な細胞外マトリックス成分、増殖因子、および調節因子を分泌する。このマトリックス上に沈着する線維性のまたは間質性の細胞外マトリックス組織の生成は、インビトロにおける口腔組織の長期増殖によってもたらされる。この足場/マトリックス/ゲルの3次元構造は、特定の口腔組織のためのインビボ条件に、より接近して近くなり、これによって細胞の成熟および移動を促進する微小環境の形成が可能になる。特定の増殖因子または調節因子がまた、添加されて、細胞増殖および細胞外マトリックス生成をさらに増強し得る。
【0028】
目的の組織としては、歯髄、象牙質、歯肉、粘膜下組織、セメント質、歯周組織、口腔粘膜下組織または舌組織の細胞が挙げられる。引き続き形成された組織サンプルは、歯髄、象牙質、歯肉粘膜下組織、セメント質、歯周組織、口腔粘膜下組織または舌組織のサンプルである。この組織サンプルは、歯髄由来線維芽細胞において富化された口腔組織サンプルから得られた生存可能な出発細胞を培養することによって形成され得る。本発明の特定の局面において、この歯髄由来線維芽細胞において富化された生存可能な出発細胞は、抜歯された歯から得られる。さらに、この組織サンプルは、細胞の供給源として、歯肉粘膜下線維芽細胞、歯髄、または歯根膜線維芽細胞において富化された口腔組織サンプルから得られる生存可能な出発細胞を培養することによって形成され得る。歯肉生検は、ドナー部位の罹患をほとんどまたは全く伴わずに、慣用的な歯科の手技によって得ることができる。本発明の実施形態は、口腔修復のためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0029】
この口腔組織サンプルは、患者への適用の前にこのマトリックスから再度分離され得るか、またはインビボに置かれ、そしてその場所(in situ)で架橋され得ることが理解される。同等に、この口腔組織サンプルは、このマトリックスとの組み合わせで適用され得、ここでこのマトリックスは好ましくは、生体適合性マトリックスである。口腔組織の再建をもたらすための、動物の特定の口腔組織部位への培養したマトリックス−細胞調製物の埋め込みは、この調製物の意図される機能に依存して、生分解性マトリックスを含んでも、または非生分解性マトリックスを含んでもよい。
【0030】
(尿失禁)尿失禁は、全てのGU疾患のうちで最も普通であり、かつ最も難治性である。尿を保持することができないこと、および尿を無意識に排尿しないことができないことは、2セットの筋肉の間の相互作用によって管理される。排尿筋(膀胱の外部筋肉被覆を形成する縦方向の線維の複合体)は、副交感神経系を活性化する。第二の筋肉(膀胱括約筋の平滑筋/横紋筋である)、および排尿の活動は、排尿筋が収縮するのと同時に、括約筋が随意的に弛緩されることを必要とする。年をとるにつれて、括約筋を随意的に制御する能力が低下する。最も共通の失禁(特に高齢者において)は、急迫性尿失禁であり、これは差し迫った排尿の前にごく短い予兆しかない。急迫性尿失禁は、機能亢進性の排尿筋による結果であり、そして代表的には医薬、および/または「トイレトレーニング(toilet training)」で処置される。しかし、反射性尿失禁は、予兆なしに生じ、そして通常は副交感神経系の障害の結果である。高齢の女性で見出される通常の尿失禁は、緊張性尿失禁であり、これはまた妊婦でも観察される。このタイプの失禁は、総症例数の過半数を占める。緊張性尿失禁は、くしゃみ、笑い、または身体的努力のような条件下でも生じ、そして尿の漏れによって特徴付けられる。緊張性尿失禁の重篤度には5つの認知されたカテゴリーがあり、これは0、1、2a、2b、および3というタイプに命名されている。タイプ3は、最も重篤であり、そして内因性の括約筋欠損すなわちISD(Contemporary Urology,March 1993)の診断を要する。投薬、体重減少、運動、および外科的介入を含む、いくつかの処置が存在する。2つの最も通常の外科手術は、漏れを相殺するために膀胱頸部を上げること、または尿道に圧力をかけるために、患者自身の身体の組織からの裏層、もしくは補綴材料(例えば、PTFE)を構築することのいずれかを含む。第二の選択肢は、膣内バルーンまたは陰茎のクランプのような外的デバイスに対して人工括約筋のような補綴デバイスを使用することである。上記の処置方法は、代表的には1年を超える期間については非常に有効である。溢流性尿失禁は、膀胱の解剖学的閉塞または低反応性排尿筋によって生じる。本発明のある実施形態は、尿失禁を処置するためのバイオデンドリティック細胞組成物の使用である。
【0031】
(臓器移植)
細胞−足場/ゲル/マトリックス組成物は、その場所(in situ)での重合化のために、またはインビトロ用途のためであって、インビボで機能的な臓器組織を生成するための引き続く埋め込みのために調製される。この足場/ゲル/マトリックスは3次元であり、そして架橋された(共有結合、イオン結合、水素結合など)デンドリティックポリマーまたはコポリマーから構成される。この足場はまた、デンドリティックポリマーのファイバーから形成されてもよい。用いられる細胞は、血管新生した器官組織または幹細胞由来であり、次いでポリマー中に懸濁され、引き続いてインビボで注射され、そして光架橋されて、ゲル−細胞複合体を形成する。あるいは、この細胞は、実施された架橋された足場またはゲルの表面に対してインビトロで付着されて、インビボで、機能的な血管新生した器官組織を生成する。この足場/ゲル/マトリックスはまた、塩基または酸の洗浄を用いて部分的に化学的に分解されて、より親水性の材料を提供し得る。ある距離(これを超えて栄養分および気体の拡散が生じ得る、代表的には100〜300ミクロン)で、織物の足場の線状のファイバー/デンドリティックなファイバーを分離することが、本発明のさらなる実施形態である。あるいは、マクロ多孔性ゲルが、鋳型、発泡など、本発明に記載される手順によって生成され得、これによって1〜1000ミクロンの均一または不均一な細孔が形成される。これらのゲル/足場/マトリックス構造によって、この足場にわたって増殖する細胞へ、そしてこの細胞からの栄養、気体、および廃棄物の拡散および交換が、血管新生のない材料にわたって細胞生存度を維持するのに有効な量で、提供される。
【0032】
ゲル/足場/マトリックスに対して付着する細胞は、リンパ管細胞、膵臓島細胞、肝細胞、造骨細胞、筋細胞、腸細胞、腎臓細胞、血管細胞、甲状腺細胞(単数または複数)、副腎−視床下部下垂体系の細胞であり得る。これらのタイプの細胞以外に、引き続いて所望の特定の細胞タイプに転換する幹細胞も用いられ得る。
【0033】
例えば、糖尿病は、膵臓機能の消失によって生じる疾患である。詳細には、膵臓のβ細胞を生成するインスリンが破壊され、これによって血糖値が高値に上昇する。結果として、血管変化に対する全ての二次的な系において重大な問題が発生する。糖尿病は、米国で16,000,000を超える人が罹患していると推定される。不幸にも、この数は、毎年約600,000の新症例が診断されるという、驚くべき速度で増えている。現在、糖尿病は主に微小血管および大血管の合併症によって、米国の死亡のうち3番目に大きい原因である。これらの合併症としては、手足の切断、潰瘍形成、血管損傷、腎不全、発作(卒中)、および心発作(これらは結果である)が挙げられる。毎日のインスリン注射はかつては、糖尿病の有効な処置であると考えられた。しかし、インスリン依存性糖尿病(IDDM)を有し、かつ伝統的なインスリン療法を受けている人にとっては、これらの恐ろしい合併症がなお存続している。1992年には、糖尿病のコントロールおよび合併症に関するトライアル(Diabets Control and Complications Trial)(DCCT)によって、厳格に調節したグルコースは、これらの合併症のリスクを軽減することが報告された。しかし、集中的なインスリン処置は、低血糖性の症状の発見の頻度の増大によって、完全に安全ではない。糖尿病の処置についてのDCCTの影響に対する記載で、EastmanおよびGordonは、以下のように述べた「DCCTにおいて行われた集中的な処置の成功は、保健医療制度の業績でもあり課題でもある:業績とは、我々がいまや、代謝コントロール問題を知ったためであり、そして課題とは、医学、教育、栄養、糖尿病、自己管理技術、およびヒトの行動において専門性を有する保健医療研究者の統合されたチームによってこの結果が達成されたためである」。これらのチームは、大部分の糖尿病の患者の処置には利用できず、おそらく将来も利用できない。結果として、血糖値の正常な調節を提供する、彼の発明に記載された技術のような新しい技術が必要である。
【0034】
糖尿病に利用可能な現在の処置方法は、定期的なインスリンの外因性の投与である。しかし、この処置ではまだ、血糖値の不完全な制御しか得られない。膵臓組織全体の移植という実験的アプローチは、高リスクである。しかし、糖尿病に利用可能なドナーの膵臓の数は十分ではない。移植後、血糖値は、より生理学的な様式で制御されると考えられる。このアプローチは、単離した島細胞自体の移植に比べればかなり劣る。近年では、改良は、宿主による免疫の攻撃を防止するための細胞の封入になっている。短期の効用の証明はあるが、長期の結果は満足には至らなかった(D.E.R.Sutherland,Diabetologia 20,161〜18(1981);D.E.R.Sutherland,Diabetologia 20,435〜500(1981))。従って膵臓器官全体の移植が、好ましい処置である。本発明のさらなる実施形態は、バイオデンドリティックな架橋可能ポリマー中に島細胞を封入/埋め込むこと、および引き続く宿主への移植である。
【0035】
このようなバイオデンドリティックポリマーの別の有用な適用は、肝不全の処置における適用である。肝不全は、疾患に起因する瘢痕、遺伝的不規則性の結果として、または傷害から生じる。現在の解決法は、移植であり、そしてこのような処置がなければ結果は死である。米国では毎年、肝不全で30,000人が死んでおり、毎年、約140億ドルの社会的なコストを要すると推定される。
【0036】
肝臓移植のための指標としては、例えば、急性劇症肝不全、慢性活動性肝炎、胆道閉鎖症、突発性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、代謝の先天異常、およびいくつかのタイプの悪性腫瘍が挙げられる。現在の処置方法は、肝臓が移植に利用可能になるまで、患者を維持する手技が挙げられる。肝臓全体の移植は、ますます首尾よい外科操作となっている。しかし、この手術の技術的な複雑性、血液の膨大な損失、術後条件、および手術の費用によって、この手順は大きな医療施設でしか行えない。ドナーの器官の不足を考慮すれば、患者の要望は満たされない。不幸にも、肝疾患の末期段階で毎年30,000例の患者が死亡する。移植を待機している患者のための良好な人工肝臓サポートは、広く利用可能ではない。アルコール誘導性肝疾患に罹患している患者は、処置を待機している患者の別の大きい群を示す。アルコール消費の結果として末期段階の肝臓疾患を有する今日の患者は、移植の手段を有さない。なぜなら、ドナーの器官、および現在の保健制度のコンプライアンスが不足しているからである。肝硬変の死亡率は、各国間で非常に異なり、フィンランドでの100,000人あたり7.5人から、フランスでの100,000人あたり57.2人に及ぶ。米国では、過去25年にわたって、死亡数は70%増大している。さらに、肝硬変の罹患率は、飲酒しない人よりも深刻な問題の飲酒者では28倍高い。
【0037】
肝臓および膵臓は、失われた機能の置換または回復の形態において処置が不十分である唯一の重要な臓器系ではない。例えば、腸のほとんどが失われれば、過去には致死的な状態であった。しかし、今では患者は、血管を介して供給される静脈栄養で生存することができる。静脈栄養は、不十分なアプローチである。なぜなら、介護の間に多くの合併症が生じるからである。総非経口栄養の患者は、致死的な肝疾患を発症し得るか、または重篤な血流感染を発症し得る。腸移植は、現在選択肢とはなっていない。なぜならドナーの腸の多数のリンパ球がレシピエントに移されるからである。これによって免疫学的反応である「移植片対宿主」病がもたらされ、ここでは、移植された腸からのリンパ球が攻撃する。これによって最終的には死がもたらされる。本発明のさらなる実施形態は、器官の損失または修復を処置するバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0038】
心臓および筋肉の疾患はまた、世界の罹患率および死亡率の主な原因である。心臓移植は、ますます首尾よい技術となってきているが、肝臓移植の場合と同様、免疫抑制薬およびドナーの心臓が必要である。器官移植は、現在多くの指標についての救済方法であるが、ドナー組織の不足が増大している。例えば、肝臓移植の必要な1年あたり800〜1,000の小児に対して、米国ではごく少数のドナーしか利用可能ではない。移植はしばしば、以下に関連する:1)非常に重症であり、従って成功の確率が減少しているレシピエント、2)代表的には血液損失に関連する複雑な外科手術、3)迅速な手術の必要性(なぜなら保存時間が短い)。全体的または部分的な臓器移植の代替として、失われた機能を置換するために必要な実質性の要素のみの移植が、推奨されている(P.S.Russell,Ann.Surg.201(3)、255〜262(1985))。このアプローチは、いくつかの魅力的な特徴を有する。この特徴としては、付属する血液損失、麻酔の困難性、および合併症を伴う大手術を回避することが挙げられる。必要な機能を供給する細胞のみが置換されるので、パッセンジャー白血球、抗原提示細胞、および他の細胞型(拒絶プロセスを促進し得る)に伴う問題は、減少または回避さえされ得る。このアプローチを用いて、自己移植手技において細胞を使用する可能性は、培養におけるレシピエントの増殖された細胞または特定の細胞形に分化した幹細胞を用いて可能である。例えば、Demetriouらは、コラーゲンでコーティングしたマイクロキャリアビーズに付着した肝細胞の首尾よい移植を報告した(A.A.Demetriouら、Science 233、1190〜1192(1986))。本発明のさらなる実施形態は、器官移植のためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0039】
皮膚は、疾患または傷害によって損傷され得る別の器官である。皮膚は、体液の損失および疾患からの身体の保護の重要な役割を果たす。皮膚移植片は以前に、動物の皮膚または患者の皮膚から調製されており、より最近では上皮細胞を培養することによって形成された「人工皮膚(artificial skin)」である。米国特許第4,485,097号において、Bellは、水和したコラーゲン格子(血小板および線維芽細胞を伴う)およびケラチノサイトのような細胞から構成された皮膚等価材料を開示している。Yannasらに対する、米国特許第4,060,081号は、膜全体にわたる湿度の変化を制御するための、合成ポリマーのような、不溶性の非免疫原性および非毒性材料から形成された、合成皮膚として有用な多層膜を開示している。米国特許第4,458,678号において、Yannasらは、皮膚等価材料を作製するためのプロセスを開示している。ここでは、グリコサミノグリカンで架橋されたコラーゲンから形成された線維性格子が、上皮細胞とともに播種される。最初の2つの方法に対する不利な点は、そのマトリックスが、「永久的な(permanent)」合成ポリマーから形成されるということである。実際、この材料の限界は、1980年に公開された著者らの文献中に考察されている(YannasおよびBurke J.Biomed.Mater.Res.14,65〜81(1980))。
【0040】
本発明における用途に適切な細胞の例としては、肝細胞、および胆管細胞、膵臓の島細胞、上皮小体細胞、甲状腺細胞、副腎−視床下部−下垂体系の細胞(ホルモン産生性腺細胞を含む)、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、血管細胞、リンパ管細胞、腎臓細胞、および腸細胞、骨および軟骨を形成する細胞、平滑筋および骨格筋が挙げられるがこれらに限定されない。
【0041】
細胞増殖および移植のための一時的な足場としての人工的デンドリティックマトリックスを設計、構築、および利用するための方法および手段を提供することが本発明のさらなる目的である。本発明のさらなる実施形態は、インビトロ、インビボ、およびその場所(in situ)、の全てにおいて細胞増殖のために利用され得る生体分解性の非毒性マトリックスを提供することである。この細胞足場/マトリックス/ゲルは、架橋によってインビトロまたはその場所(in situ)で形成され得る。生分解性の人工的なマトリックスが、細胞増殖のための支持体を提供するだけでなく、移植後の増殖する細胞塊の血管新生および分化を可能にし、かつ増強するように、この生分解性の人工的なマトリックスを構成および構築するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。細胞の挙動、および他の細胞との相互作用、細胞基質、ならびに分子シグナルがインビトロに適合され得るように、異なる構成のマトリックスを提供することが本発明のなお別の目的である。
【0042】
ポリマーマトリックスは、Vacantiらの米国特許第5,041,138号に記載のように、種細胞に対して用いられ、そして引き続き移植されて軟骨性構造を形成し得るが、これには、このマトリックスの外科的移植、および所望の解剖学的構造に形成するための移植の前のこのマトリックスの形成が必要である。Hubbell(米国特許第1995000478690号)は、細胞との混合、その後のインビボ注射、およびその場所(in situ)での重合化のための線状架橋可能ポリマーを記載している。しかしこのポリマーは、デンドリティック構造ではなく、分解、架橋、ならびに化学的および生物学的な誘導体化のより優れた最適化が欠如している。
【0043】
(E.組織シーラント)
本発明のデンドリティック高分子はまた、組織シーラントとして有効に使用される。この生体材料は、創傷の部位に容易に接近できない場所か、または縫合糸なしの手術が望ましい時に、他の外科手術(例えば、漏出ブレブ、腎切開閉鎖、気管支胸腔瘻修復、消化性潰瘍修復、鼓膜穿孔の修復など)のために有効なシーラント/グルー(glue)であると考えられる。
【0044】
(角膜穿孔の処置:)角膜穿孔は、集団のある割合を冒し、そして種々の医学的状態(例えば、感染、炎症、乾燥症、神経栄養および変性)、および外傷(化学的、熱的、外科的、および貫通性)によって生じる。不幸にも、角膜穿孔はしばしば、視覚の消失および個人のクオリティーオブライフ(生活の質)の低下をもたらす。穿孔のタイプおよび起源に依存して、創傷と角膜移植片を縫合するのとは異なる処置が、現在利用可能である。しかし、角膜のデリケートな組成および創傷の重篤度(手術後の漏出および重篤な乱視の可能性を増大する)を考慮すれば、これは困難な外科手術である。標準的な縫合手順によって処置され得ない穿孔という特定の場合には、この創傷を修復するために、組織接着剤(adhesive)(グルー)(glue)が用いられる。このタイプの処置は、非常に魅力的になってきている。なぜならこの方法は、最も簡単かつ迅速かつ安全であり、そしてさらなる合併症を回避するための眼球の完全性の迅速な回復という要件に対応するからである。創傷への容易かつ迅速な適用以外に、接着のための基準は、以下である:1)十分な接着力で組織(壊死しているかまたはしていない、頻繁に湿性)に結合すること、2)非毒性であること、3)生分解性または吸収性であること、4)滅菌可能であること、および5)治癒の過程を妨害しないこと。種々のアルキル−シアノアクリレートが、小さい穿孔の修復のために利用可能である。しかし、これらの「スーパーグルー(super glue)」は、重大な不都合を示す。それらのモノマーは、特に短いアルキル鎖を有するモノマーは、毒性であり得る。それらはまた、過度に急速に重合して、適用が困難になるかもしれず、そして一旦、重合すれば、このグルー(glue)の表面は、粗くかつ硬く、これが患者の不快さおよびコンタクトレンズの装着の必要性をもたらす。シアノアクリレートが角膜シーラントとして許容されても、多数の合併症が報告されており、これには白内障の形成、角膜浸潤、緑内障、巨大乳頭結膜炎、および瞼球癒着形成が挙げられる。さらに、患者の60%より多くにおいて、さらなる外科的介入が必要であった。
【0045】
他のグルーも開発されている。フィブリンに基づく接着性止血剤は、通常、フィブリノーゲン、トロンビン、および第XIII因子から構成される。フィブリノーゲンおよび光で活性化された光増感剤を有する系も試験されている。接着性止血剤が、組織接着のための要件を満たす内在性の特性を有する場合、患者に対するあらゆる汚染を回避するためには、自家性の生成物(緊急の場合は時間がかかる)、または臨床使用の前の厳格な処置が必要である。角膜穿孔のための理想的なシーラントは、以下でなければならない:1)正常な視覚を妨げない、2)眼内圧力IOPを急速に回復する、3)眼の構造的な完全性を維持する、4)治癒を促進する、5)湿性の組織表面に接着する、6)分子量依存性であり、かつ正常な角膜機能に好適である溶質拡散特性を保有する、7)創傷上にポリマーの制御された配置を可能にする流体力学的特性を保有する、そして8)温和な条件下で重合化する。本発明のさらなる実施形態は、角膜穿孔をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0046】
(網膜裂孔)網膜裂孔の処置のために通常用いられる技術(例えば、凍結療法、ジアテルミー、および光凝固術)は、複雑な網膜剥離の場合には成功しない。主な理由は、適用の遅れ、および脈絡網膜性接着の強度の弱さである。特定の場合には、シアノアクリレート網膜復位術が用いられた。また、この脈絡網膜性接着は、初期の技術よりも強力かつ持ちが良いことが、実証されている。角膜穿孔処置に関して以前に注記されたとおり、シアノアクリレートグルーの非常に急速な重合化(例えば、網膜に対する注射器の接着のリスク)、水性条件中でそれらを使用することの困難性、および毒性が、この方法に関する不都合およびリスクである。重合化は、モノマーに対してイオフェンジレート(iophendylate)を添加することによって遅らせられ得るが、なおこの反応は2〜3秒間で生じる。一旦重合化されればシアノアクリレートの硬度のせいで、処置した孔の端での網膜の引き裂きのリスクがまた、観察され得る。本発明のさらなる実施形態は、網膜裂孔をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0047】
(漏出ブレブ(leaking bleb))緑内障手術後の漏出する濾過胞(leaking filtering bleb)は、管理が困難であり、重篤な視覚に脅威である合併症をもたらし得る。漏出ブレブは、前眼房の低緊張および薄型化、脈絡膜浸出、黄斑、網膜襞および脈絡襞、脈絡膜上の出血、角膜代償不全、末梢虹彩前癒着、および白内障形成を生じ得る。漏出ブレブはまた、ブレブ機能の損失および眼内炎の重篤な合併症をもたらし得る。ブレブ漏出の頻度は、代謝拮抗剤の使用にともなって増大する。5−フルオロウラシルまたはマイトマイシンCで処置した眼におけるブレブ漏出は、20〜40%程度の患者で生じ得る。代謝拮抗剤で処置した眼におけるブレブ漏出は、薄く無血管性の組織のせいで、そして異常な血管結合組織の応答のせいで、治癒するのが難しいかもしれない。保存的管理の使用にもかかわらず、漏出が持続する場合、テーパー状の血管注射針で、9−10〜10−0のナイロンまたは吸収性縫合糸を用いて、結膜の創傷を閉鎖し得る。薄い壁のブレブまたは無血管性のブレブにおいては、縫合糸は得策ではないかもしれない。なぜなら、縫合糸は、組織を引き裂いて、より大きい漏出を生じ得るからである。ブレブ漏出を閉鎖するために、フィブリン接着が用いられている。この接着は、トロンビンと同時に結膜創傷に適用されて、適用部位においてフィブリン凝血を形成する。適用の間、術野は、乾燥されていなければならない。なぜならフィブリンは、湿性の組織には接着しないからである。シアノアクリレートグルー(glue)が、結膜の開口部を閉鎖するために用いられ得る。このグルーを適用するため、周囲の組織は、乾燥されていなければならず、そして一滴のシアノアクリレートが垂らされる。この操作は、グルーの急速な反応を考慮すれば、組織に対するアプリケーターをシールしないように、または周囲の組織をシールしないように、気をつけなければならない。次いで、軟性のコンタクトレンズ(ソフトコンタクトレンズ)をこのグルーの上に適用して、患者の不快感を減弱する。しかし、シアノアクリレートがブレブから引き裂き、そしてより大きい創傷を生じる場合、この手技は、実際には問題を悪化し得る。本発明のさらなる実施形態は、漏出ブレブをシールするためにバイオデンドリティック架橋可能ポリマーを使用することである。
【0048】
(角膜移植:)角膜移植において、新しい角膜を所定の位置に固定するために、外科医は、移植片の周囲に約16の縫合を行う。従って、縫合糸なしの手術は、極めて望ましく、
以下の利点をもたらす:(1)縫合は、感染の部位を提供する、(2)縫合された角膜は、治癒に3ヶ月かかり、その後に縫合糸が除去されることが必要になる、そして(3)縫合糸から新しい角膜に適用された緊張は、角膜を変形させ得る。本発明のさらなる実施形態は、角膜移植片をシールするためにバイオデンドリティック架橋可能なポリマーを使用することである。
【0049】
(水晶体嚢内水晶体置換:)白内障は、主に眼の自然な老化およびいくつかの疾患に起因する、水晶体の混濁である。浮腫、水晶体線維のタンパク質変性、および壊死が、盲目をもたらし得る不透明な領域を生じる。水晶体全摘出術が、現在たまに実施される。この傷害性の手術は、超音波および吸引による水晶体の断片化後の、水晶体の核および皮質の吸引によって取って代わられた。次にインプラント(移植片)が水晶体嚢胞内に挿入される。第一のポリマーマトリックス(50年より長く用いられる)は、水晶体置換物または水晶体嚢内胞インプラントとしての、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)であった。剛直なインプラントのために用いた切開より小さい切開を通じて、水晶体嚢胞内に移植され得るシリコンおよびヒドロゲルが、開発されている。この材料の生体適合性以外の重要な問題の1つは、このインプラントの機械的な転位である。材料、移植部位、および手術方法に依存して、異なるデザインのインプラントが見出され得る。例えば、シリコンが、水晶体嚢胞中に前に移植された、膨張可能な薄いシリコン膜に注射される。
【0050】
異なる半径の曲率を有する同軸輪状環のヒドロゲルから構成される人工的なレンズが、米国特許第4,906,246号に提唱されている。さらに、アリールケトンのような光開始剤の存在下で照射によって架橋され得る、プレポリマー(例えば、ウレタン、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびシリコン)の注射が、米国特許第4,919,151号に開示されている。このポリマーの分子量および架橋の程度は、適切な屈折率を可能にするように改変され得る。しかしこれらの系の生体適合性は、実証されていない。
【0051】
眼科の適用以外に、これらの光架橋可能なポリマーは、創傷の部位が容易に接近できない場合、または縫合糸なしの手術が所望される場合、さらなる外科用途を有している。これらの光重合可能なシーラント/グルーは、以下のための可能性のある用途を有し得る:尿路手術(腎切開閉鎖、尿道修復、尿道下裂修復)、肺の手術(実質性および気管支の漏出のシール、気管支胸腔瘻修復、持続性空気漏出の修復)、G.I.路および胃の手術(耳下腺皮膚瘻、気管食道瘻、消化性潰瘍の修復)、関節手術(軟骨修復、半月板修復)、心臓手術(心臓血管の破裂の修復)、脳手術(硬膜欠損の修復)、耳手術(鼓膜穿孔)、および術後廃液減少(乳房切除術、腋窩切開)。適用の容易さ、ならびに湿性または乾性の創傷を迅速かつ正確にシールする能力は、この材料が上記の適用の多くにおいて用いられた、以前のグルーに対して優れていることが証明され得ることを意味する。
【0052】
(F.創傷のドレッシング(包帯))
ほとんどの場合において、創傷閉鎖のために用いた処置は、古典的な縫合技術である。しかし、創傷のタイプ、起源、ならびに患者の位置に依存して、組織接着剤(例えば、グルー、シーラント、パッチ、フィルム、など)の使用は、縫合糸の使用に対して魅力的な代替である。創傷に対する容易かつ速い適用以外に、接着剤の基準は、十分な接着力で組織(壊死しているか、またはしていない、時に湿性)へ結合すること、非毒性であり、生分解性または生体吸収性であり、滅菌可能であり、選択的に気体を透過可能であり、細菌に対して不透過性であり、そして蒸発による水の損失を制御し得ることである。結局、接着剤の2つの主要な特性は、創傷を保護すること、および治癒過程を増強するか、または少なくともそれを妨害しないことである。多くのシーラントが検討されており、そして異なる臨床適用に用いられている。
【0053】
フィブリンに基づく接着性の止血剤は、生物学的起源の最も通常の生成物(製品)である。これらのシーラントは、通常、フィブリノーゲン、トロンビン、および第XIII因子、ならびにフィブリノーゲン/光増感剤系から構成される。それらの内因性の特性が、組織接着剤のための要件を満たしている場合、患者に対するあらゆる汚染を回避するためには、自家性の生成物(緊急の場合には時間がかかる)または臨床使用の前の厳格な処置が必要である。
【0054】
合成材料、詳細には、主にポリマーおよびヒドロゲルが、創傷閉鎖のために開発された。アルキル−シアノアクリレートが、角膜穿孔の修復に利用可能である。縫合糸またはエチル−2−シアノアクリレート−「Mediglue(メディグルー)」適用によって処置された治癒した皮膚切開において、1人の研究者は、差異を観察しなかった。しかし、これらの「スーパーグルー(super glue)」は、重要な不都合を示す。それらのモノマー、詳細には、短いアルキル鎖を有するモノマーは、毒性であるか、または毒性であり得、そしてそれらは、過度に急速に重合して、創傷の処置を困難にする。一旦、重合すれば、このグルーの表面は、粗くかつ硬い。このことは、患者に対する不快さ、および例えば、角膜穿孔処置の場合は、コンタクトレンズの装着の必要性を伴う。「BiobraneII」(ナイロン織物上のポリジメチルシロキサンの混成)、および「Opsite」(一方の側にビニルエーテルコーティングを有するポリウレタン層)などの他の材料が市販されている。シアノアクリレート(vournakis)と入れ替わるために、新しいポリマー性止血剤(ポリ−N−アセチルグルコサミン)が、胃静脈瘤の処置のような生物医学的な適用について研究された。皮膚の創傷を処置するための改質ゼラチンに基づく接着剤もまた見出された。ラクテート基およびアクリレート基で置換された光重合可能なポリ(エチレングリコール)は、肺の手術において空気の漏出をシールするために用いられる。
【0055】
G.癒着の防止
本発明のなお別の局面は、損傷した組織の間に、バイオデンドリティックポリマー、または線状ポリマーおよびバイオデンドリティックポリマーの組み合わせから構成される障壁を挿入することによって、損傷した組織の間の癒着の形成を防止するための方法を提供する。このポリマー障壁は、曝露された、損傷した組織上のシートまたはコーティングとして機能して、外科的癒着を防止する(Urryら、Mat.Res.Soc.Symp.Proc.292,253〜64(1993)。このポリマー障壁は、時間経過につれて溶解して、癒着/瘢痕などの形成なしに正常な治癒が生じることを可能にする。癒着の形成は、主な術後合併症である。今日、臨床的に重大な癒着の頻度は、約5〜10パーセントであり、ある場合には、ほぼ100パーセントである。癒着形成の中でも最も通常の合併症は、閉塞、不妊症、および疼痛である。時に、癒着形成には、癒着を除去するための第二の手術手技が必要であり、このことが処置をさらに複雑にする。術後癒着の広範な発生を考慮して、癒着を防止するために多数のアプローチが探索されている(Stangelら、「Formation and Prevention of Postoperative Abdominal Adhesions」、The Journal of Reproductive Medicine,第29巻、第3号、1984年3月(第143〜156頁)、およびdiZerega、「The Cause and Prevention of Postsurgical Adhesions」発行:Pregnancy Research Branch,National Institute of Child Health and Human Development,National Institutes of Health,Building 18,Room 101,Bethsda,Md.20205)。
【0056】
術後癒着の防止のために、多数の手技が探索されており、これには以下が挙げられる:1)イブプロフェンの全身投与(例えば、Singer、米国特許第4,346,108号を参照のこと)、2)抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、および抗生物質の非経口投与、3)デキストラン溶液の腹腔内投与、およびポリビニルピロリドン溶液の腹腔内投与、4)プロスタグランジン生成を阻害することによって作用する非ステロイド性抗炎症性薬物であるオキシフェンブタゾンの全身投与、ならびに5)線状の合成ポリマーおよび天然ポリマーの投与(Hubell 6060582;Fertil.Steril.,49:1066;Steinleitnerら(1991)「Poloxamer 407 as an Intraperitoneal Barrier Material for the Prevention of Postsurgical Adhesion Formation and Reformation in Rodent Models for Reproductive Surgery」Obstetrics and Gynecology、77(1):48、およびLechら(1990)「Reduction of postoperative adhesions in the rat uterine horn model with poloxamer 407」、Am J.Obstet.Gynecol.162(5):1317、Linskyら、1987「Adhesion reduction in a rabbit uterine horn model using TC−7」J.Reprod.Med.,32:17、Diamondら、1987「Pathogenesis of adhesions formation/reformation:applications to reproductive surgery」Microsurgery,8:103)。
【0057】
例えば、腹膜腔の器官および腹膜壁に関する術後癒着の形成は、腹部手術の望ましくない結果である。これは、頻繁に生じ、そして手術外傷から惹起される。術中、漿液血液状の(タンパク質性の)浸出液が放出され、これが、骨盤腔において集まる傾向である(Holtz,G,1984)。この浸出液が短期間で吸収されず、溶解もされない場合、この浸出液は線維芽細胞に食い込み、引き続くコラーゲン沈着が癒着をもたらす。デンドリティック高分子、またはデンドリティック高分子と線状の合成ポリマーもしくは天然ポリマーとの組み合わせ(癒着の防止のためのペプチドを含む)を投与することが本発明のさらなる実施形態である。
【0058】
H.薬物送達
デンドリティック高分子を用いる薬物送達の概念は、以前に探索されている(Liu,M.Frechet,M.J.Pharm.Sci.Technol.Today 1999,2,393〜401)が、探索されたデンドリマーの組成は、インビボ適用には適しておらず、従って、その学術的な研究を制限する。実際に、これらのポリマー(例えば、PAMAM)は、世代数の増大とともに毒性の増大を示した。本発明に記載されるバイオデンドリマーは、インビボ用途に適切な構成単位を保有するデンドリマーをデザインするための多くの機会を提供する。
【0059】
ペンダントなヘテロ原子または官能基(例えば、アミン、カルボン酸)を有する本発明のデンドリティックポリマーは、物理的特性を制御するか、薬物を用いてポリマーを誘導体化するか、またはポリマーの生分解性を変更するための要件を満たす。従って、本発明はまた、本発明のポリマーを含む、長期または短期移植可能な医療用デバイスを包含する。本発明の更なる実施形態では、ポリマーは、有効な部位特異的、または全身の薬物送達のために十分な、生物学的または薬学的に活性な化合物(薬物、ペプチド、核酸など)と合わせられる(Gutowskaら、J.Biomater.Res.,29,811〜21(1995)、およびHoffman,J.Controlled Release,6,297〜305(1987))。この生物学的にまたは薬学的に活性な化合物は、水素結合、塩架橋などによって、デンドリティック高分子と物理的に混合されても、デンドリティック高分子に埋め込まれても、デンドリティック高分子中に分散されても、デンドリティック高分子と共有結合されても、または接着されてもよい。さらに、本発明は、本発明のポリマーと組み合わせて、治療上有効な量の生物学的なまたは薬学的な活性な化合物を含有する、移植可能な薬物送達デバイスを、その必要な患者の身体中に移植することによる、部位特異的または全身の薬物送達のための方法を提供する。
【0060】
生物学的、または薬学的な活性な化合物(薬物を含む)の誘導体はまた、共有結合によってデンドリティック高分子に結合され得る。これによって、薬物とポリマー骨格との間の共有結合の加水分解による、そして、このデンドリティック構造中の薬物の部位(例えば、内部対外部)による、この活性な化合物の持続性の放出が、提供される。デンドリティック構造のペンデント基の多くは、pH感受性である(例えば、pH依存性溶出速度をさらに制御するカルボン酸基など)。このようなデンドリティック高分子をまた、胃腸の薬物放出キャリアのコーティングのために用いて、取り込まれた生物学的、または薬学的な活性な化合物(例えば、薬物)を、胃の酸性環境における分解から保護し得る。本発明のデンドリティックポリマーは、比較的高濃度のペンダントなカルボン酸基を有して調製され得、そしてこれは酸性環境では安定および不安定(またはわずかに可溶性)であるが、より塩基性の環境に曝された場合、急速に溶解/分解する。本発明のさらなる実施形態は、制御された薬物送達系を提供する。この薬物送達系では、生物学的にまたは薬学的に活性な因子が、物理的にコーティングされるか、または本発明のポリマーに共有結合される。
【0061】
グリセロールおよび乳酸(例えば、グリコール酸、コハク酸)からなるコア単位に基づくバイオデンドリマーは、本発明に従う別のクラスのポリマーを示す。このポリマーのクラスにおけるグリセロールおよび乳酸は、インビボで見出され、そして生体適合性である。従って、以下に示すような広範な構造を構築し得る。コアが合成された後、PEGおよびPLAのようなポリマーは、このコア単位に結合されて、大きい星形またはデンドリティックのポリマーを作製し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0062】
以下の実施例から、本発明のより完全な理解が得られる。以下の実施例は、例示を意図したものでしかなく、本発明を限定するものではない。
【実施例1】
【0063】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸]の合成 − cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(10.9g、60.4mmol)を1,4−ジオキサン(250mL)に溶解し、続いてNaH(7.0g、0.30mol)を添加した。この反応混合物を、室温で1時間撹拌し、その後0℃に冷却する。次いで、2−ブロモプロピオン酸(8.64mL、96mmol)を、15分間にわたって添加した。この反応混合物を室温にもどし、次いで50℃で12時間撹拌し、その後、これを0℃に冷却して、エタノールでクエンチし、続いて水(250mL)を添加する。1N HClを用いて、この溶液をpH4.0に調製し、CH2Cl2(200mL)で抽出した。pHを4.0に再調節した後、この手順をもう1回繰り返した。合わせた有機相を、Na2SO4で乾燥し、重力濾過して、エバポレートした。この固体をエチルエーテル(50mL)中で45分間撹拌し、そして−25℃に3時間冷却して、その後11.7gの白色粉末を収集した(収率77.3%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 253m/z(MH+)(理論値:252m/z(M+))、元素分析 C:61.75%;H 6.37%(理論値:C:61.90%;H:6.39%)。
【実施例2】
【0064】
ベンジリデン保護[G0]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](4.02g、15.9mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(2.62g、14.5mmol)、およびDPTS(1.21g、4.10mmol)をCH2Cl2(40mL)に溶解した。この反応フラスコを窒素でフラッシュし、次いでDCC(3.61g、17.5mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下で14時間続けた。反応終了の際に、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、そして濾液をエバポレートした。3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過して(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧に曝して、5.63gの白色粉末を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:GC−MS 415m/z(MH+)(理論値:414m/z(M+))、元素分析 C:66.63%;H 6.33%(理論値:C:66.65%;H:6.32%)。
【実施例3】
【0065】
[G0]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLLA(5.49g、13.2mmol)含有EtOAc/MeOH(3:1、40mL)の溶液に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後20分間振盪した。触媒を濾過して、EtOAc(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして2.94gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た。(理論値:238m/z(M+))元素分析 C:45.52%;H 7.65%(理論値 C:45.37%;H:7.62%)。
【実施例4】
【0066】
ベンジリデン保護[G1]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](4.41g、17.50mmol)、[GO]−PGLLA(0.791g、3.32mmol)、およびDPTS(2.46g、8.36mmol)をDMF(80mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いでDCC(5.31g、25.74mmol)を添加した。内容物を、窒素雰囲気下において室温で14時間撹拌した。高真空下でDMFを除去して、残りの残留物をCH2Cl2に溶解した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、そして濾液を濃縮した。3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過して(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、3.45gの白色粉末を得た(収率88.3%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 1175.6m/z(MH+)(理論値:1175.2m/z(M+))元素分析 C:62.11%;H 6.46%(理論値:C:62.34%;H:6.35%)。SEC MW:1280,Mn:1260、PDI:1.01。
【実施例5】
【0067】
[G1]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G1]−PGLLA(0.270g、0.230mmol)含有THFの溶液(15mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして0.178gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 823.3m/z(MH+)(理論値:822.8m/z(M+))元素分析 C:47.72%;H 7.41%(理論値 C:48.17%;H:7.11%)。SEC MW:1100,Mn:1090、PDI:1.01。
【実施例6】
【0068】
ベンジリデン保護[G2]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](8.029g、31.83mmol)、DCC(9.140g、44.30mmol)、およびDPTS(4.629g、15.74mmol)を、THF(80mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、30分間撹拌して、その後[G1]−PGLLA(0.825g、1.00mmol)を少量のTHFに溶解することによって添加した。この反応物を窒素下において室温で14時間撹拌した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄した。THF濾液をエバポレートし、そして3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、2.09gの白色粉末を得た(収率77%)。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 2697.0m/z(MH+)(理論値:2696.8m/z(M+))元素分析 C:60.86%;H 6.37%(理論値 C:61.02%;H:6.35%).SEC MW:2350,Mn:2310、PDI:1.01。
【実施例7】
【0069】
[G2]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G2]−PGLLA(0.095g、0.035mmol)含有THFの溶液(10mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.061gの無色粘稠性の油状物を得た(収率88.0%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI−TOF MS 1991.8m/z(MH+)(理論値:1991.9m/z(M+))。SEC MW:2170,Mn:2130、PDI:1.01。
【実施例8】
【0070】
[G2]−PGLLA−Acの合成 − [G2]−PGLLA(0.098g、0.049mmol)を、5mLのピリジンに溶解した。次いで、無水酢酸(6.0mL、64mmol)を、シリンジで添加し、その反応混合物を40℃で8時間撹拌した。高真空下でピリジンおよび無水酢酸を取り除いた。その生成物を4:96のMeOH:CH3Clで溶出する分取TLCで単離した。1H NMRによって以下を得た:FAB MS 2665.0m/z(MH+)(理論値:2664.5m/z(MH+))元素分析 C:50.70%;H 6.71%(理論値 C:50.94%;H:6.43%)。
【実施例9】
【0071】
ベンジリデン保護[G3]−PGLLAの合成 − 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−プロピオン酸](0.376g、1.49mmol)、DCC(0.463g、2.24mmol)、およびDPTS(0.200g、0.680mmol)を、THF(15mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、1.5時間撹拌して、その後[G2]−PGLLA(0.070g、0.035mmol)を少量のTHFに溶解することによって添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間撹拌した。DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄した。THF濾液をエバポレートし、そして3:97のMeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントして、その沈殿物を減圧下に曝して、0.164gの白色粉末を得た(収率89.1%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI MS 5743.3m/z(MH+)(理論値:5739.9m/z(M+))元素分析 C:60.32%;H 6.34%(理論値 C:60.47%;H:6.36%).SEC MW:4370,Mn:4310、PDI:1.01。
【実施例10】
【0072】
[G3]−PGLLAの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G3]−PGLLA(0.095g、0.035mmol)含有THFの溶液(15mL)に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後15分間振盪した。触媒を濾過して、THF(10mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.128gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95.4%)。1H NMRによって以下を得た:MALDI MS 4332.5m/z(MH+)(理論値:4330.2m/z(M+))元素分析 C:49.56%;H 7.21%(理論値 C:49.09%;H 6.94%)。SEC MW:4110、Mn:4060、PDI:1.01。
【実施例11】
【0073】
[G0]−PGLSA−bzld(2)の合成 − コハク酸(1.57g、13.3mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(5.05g、28.0mmol)、およびDPTS(4.07g、13.8mmol)を、CH2Cl2(120mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(8.19g、39.7mmol)を添加した。室温での撹拌を窒素雰囲気下において14時間継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄した。3:97のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。減圧濾過後、5.28gの白色固体を収集した(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 443m/z(MH+)(理論値:442m/z(M+))。HR FAB 442.1635m/z(M+)(理論値:442.1628m.z(M+))。元素分析 C:65.25%;H 5.85%(理論値 C:65.15%;H:5.92%)。
【実施例12】
【0074】
[G0]−PGLSA−OH(3)の合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLSA(2.04g、4.61mmol)含有THF溶液(30mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして1.18gの透明な粘稠性の油状物を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 284m/z(M+NH4+)(理論値:266m/z(M+))。元素分析C:44.94%;H 6.87%(理論値 C:45.11%;H 6.81%)。
【実施例13】
【0075】
2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(4)の合成 − cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(9.90g、54.9mmol)を、ピリジン(100mL)に溶解し、続いて無水コハク酸(8.35g、83.4mmol)を添加した。この反応混合物を、室温で18時間撹拌し、その後、このピリジンを40℃で減圧下において除去した。残りの固体をCH2Cl2(100mL)に溶解して、冷0.2N HCl(100mL)で3回洗浄するか、または水相がpH1になるまで洗浄した。この有機相をエバポレートして、固体を脱イオン水(300mL)に溶解した。pHが7になるまで、1NのNaOHを添加し、そしてその生成物を溶液に溶解した。その水相をCH2Cl2(200mL)で抽出し、次いでpH7.4に再調整した。その水相を引き続き、CH2Cl2(200mL)で2回抽出し、Na2SO4で乾燥し、濾過して、エバポレートした。この固体をエチルエーテル(50mL)中で撹拌して、−25℃に3時間冷却し、その後、14.6gの白色粉末を収集した(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 281m/z(MH+)(理論値:280m/z(M+))。元素分析 C:60.07%;H 5.80%(理論値 C:59.99%;H:5.75%)。
【実施例14】
【0076】
[G1]−PGLSA−bzld(5)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(6.33g、22.6mmol)、[G0]−PGSLA(1.07g、4.02mmol)、およびDPTS(2.51g、8.53mmol)を、THF(60mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(7.04g、34.1mmol)を添加した。この反応物を、室温で窒素雰囲気下において14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、5.11gの白色粉末を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 1315.6m/z(MH+)(理論値:1315.3m/z(M+))。元素分析 C:60.13%;H 5.82%(理論値 C:60.27%;H:5.67%)。SEC MW:1460,Mn:1450,PDI:1.01。
【実施例15】
【0077】
[G1]−PGLSA−OH(6)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G1]−PGLSA(0.270g、0.230mmol)含有THF溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.178gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 963.2m/z(MH+)(理論値:962.9m/z(M+))。元素分析C:47.13%;H 6.11%(理論値 C:47.40%;H 6.07%)。SEC MW:1510,Mn:1500,PDI:1.01。
【実施例16】
【0078】
[G2]−PGLSA−bzld(7)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(4.72g、16.84mmol)、[G1]−PGSLA(1.34g、1.39mmol)、およびDPTS(1.77g、6.02mmol)を、THF(100mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(4.62g、22.4mmol)を添加した。この反応物を、室温で窒素雰囲気下において14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、4.00gの白色粉末を得た(収率94%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB MS 3060.7m/z(MH+)(理論値:3060.9m/z(M+))。元素分析 C:59.20%;H 5.64%(理論値 C:58.86%;H:5.60%)。SEC MW:3030,Mn:2990,PDI:1.01。
【実施例17】
【0079】
[G2]−PGLSA−OH(8)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G2]−PGLSA(2.04g、0.667mmol)含有のTHFの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、THF(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして1.49gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 2357.3m/z(MH+)(理論値:2356.1m/z(M+))。元素分析C:48.32%;H 5.97%(理論値 C:47.92%;H 5.90%)。SEC MW:3060,Mn:3000,PDI:1.02。
【実施例18】
【0080】
コハク酸モノメタリルエステル(SAME)の合成 − 2−メチル−2−プロペン−1−オール(4.90mL、58.2mmol)を、ピリミジン(20mL)に溶解し、続いて無水コハク酸(7.15g、71.4mmol)を添加した。反応混合物を室温で15時間撹拌し、その後、減圧下30℃でピリジンを除去した。残りの液体をCH2Cl2(100mL)に溶解し、そして冷0.2N HCl(100mL)で2回洗浄した。この有機相をNa2SO4で乾燥させ、重力濾過し、そしてエバポレートして、9.25gの透明な液体を得た(収率92%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 173m/z(MH+)(理論値:172m/z(M+))。元素分析 C:55.51%;H 7.09%(理論値 C:55.81%;H:7.02%)。
【実施例19】
【0081】
[G2]−PGLSA−SAME(9)の合成 − コハク酸モノメタリルエステル(0.826g、4.80mmol)、[G2]−PGLSA(0.401g、0.170mmol)、およびDPTS(0.712g、2.42mmol)を、THF(50mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(1.52g、7.37mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下において14時間、継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、0.558gの無色透明の油状物を得た(収率68.2%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 4840.9m/z(MH+)(理論値:4838.7m/z(M+))。元素分析 C:55.37%;H 6.22%(理論値 C:55.35%;H:6.29%)。SEC MW:5310,Mn:5230,PDI:1.02。
【実施例20】
【0082】
[G3]−PGLSA−bzld(10)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2.77g、9.89mmol)、[G2]−PGLSA(1.00g、0.425mmol)、およびDPTS(1.30g、4.42mmol)を、THF(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(2.67g、12.9mmol)を添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間、撹拌した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のTHF(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を分離して、3.51gの白色粉末を得た(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 6553.4m/z(MH+)(理論値:6552.2m/z(M+))。元素分析 C:58.50%;H 5.66%(理論値 C:58.29%;H:5.57%)。SEC MW:5550,Mn:5480,PDI:1.01。
【実施例21】
【0083】
[G3]−PGLSA−OH(11)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G3]−PGLSA(1.23g、0.188mmol)含有の9:1のTHF/MeOHの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のためにフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、9:1のTHF/MeOH(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.923gの無色粘稠性の油状物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 5144.8m/z(MH+)(理論値:5142.5m/z(M+))。元素分析C:48.07%;H 5.84%(理論値 C:48.11%;H 5.84%)。SEC MW:5440,Mn:5370,PDI:1.01。
【実施例22】
【0084】
[G4]−PGLSA−bzld(12)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2.43g、8.67mmol)、[G3]−PGLSA(0.787g、0.153mmol)、およびDPTS(1.30g、4.42mmol)を、10:1のTHF/DMF(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(2.63g、12.7mmol)を添加した。この反応物を、窒素雰囲気下において室温で14時間、撹拌した。反応終了の際、減圧下で溶媒を除去し、そして残りの固体をCH2Cl2に再溶解した。DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(20mL)で洗浄し、その溶媒をエバポレートさせた。3:97〜5:95のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。このエチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、1.50gの白色粉末を得た(収率73%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 13536.8m/z(MH+)(理論値:13534.7m/z(M+))。元素分析 C:58.20%;H 5.56%(理論値 C:58.04%;H:5.56%)。SEC MW:9000,Mn:8900,PDI:1.01。
【実施例23】
【0085】
[G4]−PGLSA−OH(13)の合成 − Pd/C(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G4]−PGLSA(0.477g、0.0352mmol)含有の9:1のTHF/MeOHの溶液(20mL)に添加した。触媒水素加分解のために、このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後10時間振盪した。触媒を濾過して、9:1のTHF/MeOH(20mL)で洗浄した。この濾液をエバポレートして0.351gの無色粘稠性の油状物を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS 10715.6m/z(MH+)(理論値:10715.3m/z(M+))。元素分析C:48.50%;H 5.83%(理論値 C:48.20%;H 5.81%)。SEC MW:8800,Mn:8720,PDI:1.01。
【実施例24】
【0086】
[G2]−PGLSA−SAMEの重合化 − [G2]−PGLSA−SAMEおよびDMPA(0.1% w/w)を、CH2Cl2に溶解して、10%(w/w)溶液を作製することによって、ゲルを調製した。ピペット先端から新鮮マイカ表面に1滴の溶液を滴下し、直ちに、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。この表面を1.0mLのヘキサンで洗浄し、一晩乾燥させた。
【実施例25】
【0087】
[G2]−PGLSA−SAMEのフォトマスク重合化 − [G2]−PGLSA−SAME、DMPA、およびVP(それぞれ、1,000:10:1)を、CH2Cl2に溶解して、ゲルを調整し、そしてその溶液を濃縮した。次に、少量のポリマー(開始剤および促進剤とともに)を、最少量のCH2Cl2に溶解して、カバーガラスのスピンコーティングをさせた。フォトマスクを、このカバーガラスの上に置き、そして、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。この表面を1.0mLのヘキサンで洗浄し、一晩、風燥させた。
【実施例26】
【0088】
2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(2)の合成 − 2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(50.00g、178.4mmol)、およびDCC(22.09g、107.0mmol)を、DCM(300mL)に溶解して、14時間、撹拌した。DCU沈殿物を濾過によって収集して、DCM(50mL)で洗浄した。この有機相を900mLのヘキサンに直接添加した。このヘキサンおよび沈殿物を−20℃に3時間冷却して、その後、濾過によって46.11gの沈殿物を収集した(収率95%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:FAB−MS 543.2m/z(MH+)(理論値:542.53m/z(M+))。元素分析C:61.83%;H 5.70%(理論値 C:61.99%;H 5.57%)。
【実施例27】
【0089】
[G0]−PGLSA−bzld)2−PEG(3)の合成 − PEG、Mn=3400,(5.00g、1.49mmol)(これは、120℃において減圧下で3時間、乾燥させた)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(4.10g、7.56mmol)を、DCM(25mL)に溶解して、窒素下で撹拌させた。DMAP(67.0mg、0.548mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(1.0mL、11mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(25mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、炭酸水素ナトリウム(50mL 3×)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて収集して、5.22gの白色固体を得た(収率91%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3960、Mn:3875、PDI:1.02。SEC MW:3880,Mn:3750,PDI:1.04。Tm=44.7。
【実施例28】
【0090】
[G0]−PGLSA−OH)2−PEG(4)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G0]−PGLSA−bzld)2−PEG(4.98g、1.28mmol)含有30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。この濾液を濃縮して、PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて、4.63gの白色固体を得た(収率97%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3769、Mn:3696、PDI:1.02。SEC MW:3640,Mn:3500,PDI:1.04。Tm=46.6。
【実施例29】
【0091】
[G0]−PGLSA−MA)2−PEG(5)の合成 − ([G0]−PGLSA−OH)2−PEG(0.502g、0.135mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.35mL、2.35mmol)を注射器で添加した。DMAP(52.0mg、0.426mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.497gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:3996、Mn:3914、PDI:1.02。SEC MW:3680,Mn:3520,PDI:1.04。Tm=46.3。
【実施例30】
【0092】
[G1]−PGLSA−bzld)2−PEG(6)の合成 − ([G0]−PGLSA−OH)2−PEG(4.33g、1.17mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(9.99g、18.4mmol)を、DCM(30mL)に溶解して、窒素下で撹拌させた。DMAP(63.7mg、0.480mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.0mL、22mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(45mL)で希釈して、0.1N HCl(75mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(75mL 3×)、およびブライン(75mL)で洗浄した。この有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて収集して、5.15gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:4844、Mn:4749、PDI:1.02。SEC MW:3950,Mn:3790,PDI:1.04。Tm=38.8。
【実施例31】
【0093】
[G1]−PGLSA−OH)2−PEG(7)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G1]−PGLSA−bzld)2−PEG(4.64g、0.974mmol)含有20mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。この濾液を濃縮して、PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(500mL)中で沈殿させて、4.00gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:4487、Mn:4394、PDI:1.02。SEC MW:4590,Mn:4440,PDI:1.03。Tm=41.9。
【実施例32】
【0094】
[G1]−PGLSA−MA)2−PEG(8)の合成 − ([G1]−PGLSA−OH)2−PEG(0.500g、0.113mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.56mL、3.76mmol)を注射器で添加した。DMAP(86.0mg、0.704mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物を、DCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.519gの白色固体を得た(収率93%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:5012、Mn:4897、PDI:1.02。SEC MW:3910,Mn:3740,PDI:1.04。Tm=40.8。
【実施例33】
【0095】
[G2]−PGLSA−bzld)2−PEG(9)の合成 − ([G1]−PGLSA−OH)2−PEG(3.25g、0.737mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(12.68g、23.37mmol)を、DCM(50mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.588g、4.81mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.5mL、28mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(50mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(400mL)中で沈殿させて収集して、4.57gの白色固体を得た(収率91%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:6642、Mn:6492、PDI:1.02。SEC MW:4860,Mn:4680,PDI:1.04。Tm=31.4。
【実施例34】
【0096】
[G2]−PGLSA−OH)2−PEG(10)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G2]−PGLSA−bzld)2−PEG(3.26g、0.500mmol)含有の25mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:5910、Mn:5788、PDI:1.02。SEC MW:5340,Mn:5210,PDI:1.03。Tm=36.5。
【実施例35】
【0097】
[G2]−PGLSA−MA)2−PEG(11)の合成 − ([G2]−PGLSA−OH)2−PEG(0.501g、0.0863mmol)を、DCM(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(0.50mL、3.36mmol)を注射器で添加した。DMAP(72.1mg、0.990mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.1mL、3.95mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.534gの白色固体を得た(収率90%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:6956、Mn:6792、PDI:1.02。SEC MW:4580,Mn:4390,PDI:1.04。Tm=27.0。
【実施例36】
【0098】
[G3]−PGLSA−bzld)2−PEG(12)の合成 − ([G2]−PGLSA−OH)2−PEG(2.13g、0.367mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(12.71g、23.43mmol)を、DCM(45mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.608g、4.98mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.0mL、22mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(55mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過して濃縮し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(400mL)中で一晩沈殿させて収集して、3.35gの白色固体を得た(収率92%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:10215、Mn:9985、PDI:1.02。SEC MW:7020,Mn:6900,PDI:1.02。Tg=−13.6。
【実施例37】
【0099】
[G3]−PGLSA−OH)2−PEG(13)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G3]−PGLSA−bzld)2−PEG(2.88g、0.288mmol)含有の30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:8765、Mn:8575、PDI:1.02。SEC MW:8090,Mn:7820,PDI:1.03。Tm=−38.2。
【実施例38】
【0100】
[G3]−PGLSA−MA)2−PEG(14)の合成 − ([G3]−PGLSA−OH)2−PEG(0.223g、0.0260mmol)を、THF(15mL)に溶解し、そして窒素下で撹拌し、その後、無水メタクリル酸(1.10mL、7.38mmol)を注射器で添加した。DMAP(90.0mg、0.737mmol)を、添加して、撹拌を14時間、継続した。メタノール(0.2mL、7.89mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(35mL)で希釈して、0.1N HCl(50mL)、およびブライン(50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過し、その後PEGベースのデンドリマーを、冷(−20℃)エチルエーテル(300mL)中で沈殿させて収集して、0.248gの白色固体を得た(収率89%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:10722、Mn:10498、PDI:1.02。SEC MW:7000,Mn:6820,PDI:1.03。Tg=−37.9。
【実施例39】
【0101】
([G4]−PGLSA−bzld)2−PEG(15)の合成 − ([G3]−PGLSA−OH)2−PEG(1.82g、0.212mmol)、および2−(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル無水物(15.93g、29.36mmol)を、THF(50mL)に溶解して、窒素下で撹拌した。DMAP(0.537g、4.40mmol)を添加して、撹拌を14時間継続した。n−プロパノール(2.5mL、28mmol)の添加によって、あらゆる残留している無水物をクエンチし、これをさらに5時間撹拌させた。この反応物をDCM(50mL)で希釈して、0.1N HCl(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(100mL 3×)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥して、濾過して濃縮し、その後PEGベースのデンドリマーを、エチルエーテル(400mL)中で沈殿させて収集して、3.11gの白色固体を得た(収率87%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:17289、Mn:16968、PDI:1.02。SEC MW:8110,Mn:7950,PDI:1.02。Tg=5.3。
【実施例40】
【0102】
[G4]−PGLSA−OH)2−PEG(16)の合成 − Pd(OH)2/C(10%w/w)を、([G4]−PGLSA−bzld)2−PEG(2.88g、0.170mmol)含有の30mLの2:1 DCM/メタノールの溶液に添加した。触媒の加水分解のために装置を排気して、60psiのH2を充填し、その後8時間振盪した。触媒を濾過除去し、DCM(20mL)で洗浄した。溶媒のエバポレーション後、PEGベースのデンドリマーを分離して、2.86gの白色固体を得た(収率98%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:MALDI MS MW:14402、Mn:14146、PDI:1.02。SEC MW:9130,Mn:8980,PDI:1.02。Tg=−18.0。
【実施例41】
【0103】
角膜組織接着剤としての使用のための([Gn]−PGLSA−MA)2−PEGデンドリマーの一般的調製 − 一例として、([G1]−PGLSA−MA)2−PEG(0.100g、0.202mmol)を、エタノールに溶解した(ポリマー:溶媒比が2.5:1(w/w))。一旦、眼を準備したら、5μLの0.5% EY含有DI水、50μLの5Mトリエタノールアミン、および1μLのVPを含有する、5μLの光開始系を、添加して徹底的に混合した。
【実施例42】
【0104】
眼の手術のための一般的手技。眼球摘出したヒトの眼(NC Eye Bank)を、角膜面を上向きにして外科用顕微鏡の下に置いた。4.1mmの角膜切開刀の刃で角膜上皮を剥がし、次いで2.75mmの角膜切開刀の刃を用いて角膜中央を切開した。次に角膜切開刀を用いて4.1mmの線状の裂創を形成した。3つの断続性の10−0ナイロン縫合糸、または光架橋可能バイオデンドリマーコポリマーのいずれかを用いて、この創傷を閉鎖した。次いで、光開始系を含むポリマーを、以下の様式で、この創傷に塗布した。第一に、23ゲージの針を用いて、10μLの5、8、11、または14をツベルクリン注射器に収集した。次に、光架橋可能デンドリマーを、同じ注射器を用いて、この線状の切開の長さにそって、細い帯状に塗布した(約1mm幅で5mm長)。光重合化を開始するために、塗布されたコポリマーにとってレーザービームを動かしながら、アルゴン−イオンレーザー(コヒーレント;光ファイバーアタッチメントをインストール)で、眼から0.5cmの距離で、コポリマーに照射した(200mW、1秒パルス照射、全50パルス)。次に、シリンジポンプ(kdScientific,Model 100シリーズ)に接続した25ゲージのバタフライ針を、眼筋に隣接した強膜中に挿入した。創傷漏出圧を測定するため、20ゲージの針を介して眼を心トランスデューサー(cardiac transducer)に接続し、この針を視神経に1cm挿入した。この針を、外科手術用テープで所定の位置に保持した。次いで圧力を記録した。シリンジポンプで、緩衝化生理食塩水を(15〜20mL/hrの速度で)眼に与え、このとき、心トランスデューサーで同時に圧力を読み取った。このシリンジポンプの速度を維持して、圧力の1mmHgの連続的な上昇を達成した。外科用顕微鏡のもとで、眼から流体が漏出することが観察された圧力を、漏出圧力として記録した。
【0105】
角膜表面を上向きにした眼球摘出した眼を、外科用顕微鏡の下に置いき、角膜切開刀の刃で4.1mmの裂創を作製した。次いで、3つの断続性の10−0ナイロン縫合糸(標準の3−1−1縫合構成)、または光架橋可能バイオデンドリティックコポリマー(スキーム1を参照のこと)のいずれかを用いて、この創傷を閉鎖した。詳細には、10μLのコポリマー5、8、11、または14をこの裂創に塗布し、そしてアルゴンイオンレーザー照射で、この創傷のデンドリティックゲルシーリングを行った(200mW、1秒照射、総照射時間50秒;このポリマー溶液は、エチルエオシン含有1−ビニルピロリドン、およびTEA(光開始剤および共触媒として)を含んだ)。次に、修復した裂創が漏れるまで、眼筋に隣接する強膜壁を通じて挿入された注射器を介して、前眼房に生理食塩水を注射した。視神経を通じて約1cm挿入した心臓トランスデューザープローブで、ナイロン縫合糸(N=6)で処置した眼、およびバイオデンドリマーシーラント(N=3;試験した各々のコポリマーについて)で処置した眼の両方について、漏出圧力をモニターした。例えば、ヒトの眼の正常な眼内圧は、18mmHg〜20mmHgである。縫合された処置された眼についての平均漏出圧力(LP)は、90±18mmHgであった。コポリマー8でシールした眼についてのLPは、171±44mmHg(142〜222mmHgの範囲)であった。コポリマー5は、創傷をシールせず、そして測定値が得られる前に漏出した。コポリマー11は、顕微鏡の操作下で、制御された様式で、創傷に送達されるには、重合するのが速すぎた(LP<15mmHg)。コポリマー14は、水中で不溶性であり、アルコール中ではごくわずかに可溶性であり、そして裂創に塗布された場合、創傷をシールしない。
【実施例43】
【0106】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシンエチルエステル]の合成。2−[(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)−2−酢酸](4.02g、16.9mmol)、グリシンエチルエステル(3.53g、25.3mmol)、およびDCC(5.22g、25.3mmol)を、CH2Cl2(40mL)に溶解した。室温での撹拌をTEAとともに窒素雰囲気下で14時間継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、その濾液をエバポレートさせた。MeOH:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、CH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、2.07gの白色粉末を得た(収率38%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS 324m/z(MH+)(理論値:323m/z(M+))FAB−MS。
【実施例44】
【0107】
2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシン]の合成。2−[(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシンエチルエステルを、DMFに溶解して、NaOHを添加した。1H NMRによってFAB−MSを得た。
【実施例45】
【0108】
ベンジリデン保護[G0]−PGLGA−GLY 2−[(cis−1,3−ベンジリデングリセロール)−2−アセテートグリシン]の合成。(4.02g、15.9mmol)、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(2.62g、14.5mmol)、およびDPTS(1.21g、4.10mmol)を、CH2Cl2(40mL)に溶解した。この反応フラスコを、窒素でフラッシュし、次いで、DCC(3.61g、17.5mmol)を添加した。室温での撹拌を、窒素雰囲気下において14時間、継続した。反応終了の際、DCC−尿素を濾過して、少量のCH2Cl2(10mL)で洗浄し、その濾液をエバポレートさせた。3:97のメタノール:CH2Cl2で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。その生成物を、最小のCH2Cl2に溶解し、濾過し(あらゆるDCUを除くため)、そしてエチルエーテル中で−20℃で沈殿させて、残りのDCCを除去した。エチルエーテルをデカントし、そしてこの沈殿物を減圧に曝して、5.63gの白色粉末を得た(収率94.0%)。1H NMRによって以下を得た:GC−MS 415m/z(MH+)(理論値:414m/z(M+))。元素分析 C:66.63%;H 6.33%(理論値 C:66.65%;H:6.32%)。
【実施例46】
【0109】
[G0]−PGLGA−GLYの合成 − Pd/C(10%)(10%w/w)を、ベンジリデン保護[G0]−PGLGA−GLY(5.49g、13.2mmol)含有EtOAc/MeOH(3:1、40mL)の溶液に添加した。このフラスコを排気して、50psiのH2を充填し、その後20分間振盪した。触媒を濾過して、EtOAc(10mL)で洗浄した。次いで、濾液をエバポレートして、2.94gの無色粘稠性の油状物を得た(収率94.0%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た。(理論値:238m/z(M+))元素分析C:45.52%;H 7.65%(理論値 C:45.37%;H 7.62%)。
【実施例47】
【0110】
高分岐(hyperbranched)バイオデンドリマー:TEAの存在下での2−O−(コハク酸)グリセロール誘導体のNHS保護エステルの溶液を撹拌して、高分岐したポリマーを得た。NMRを得た。1当量の四官能性のコアと、60当量のNHSエステルとで、重量約10kDのバイオデンドリティック高分岐ポリマーを得る。
【実施例48】
【0111】
[G2]−PGLSA−MAの重合化 − [G2]−PGLSA−MAおよびDMPA(0.1% w/w)を、CH2Cl2に溶解して10%w/w溶液を作製することによって、ゲルを調製した。ピペット先端から新鮮なマイカ表面へ、1滴の溶液を滴下し、そして直ちに、UVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。その表面を1.0mLのCH2Cl2で洗浄して、一晩乾燥させた。
【実施例49】
【0112】
[G2]−PGLSA−MAのフォトマスク重合化 − [G2]−PGLSA−MA、DMPA、およびVP(それぞれ、1,000:10:1)を、CH2Cl2に溶解して、ゲルを調製し、その溶液を濃縮した。次に、少量のポリマー(開始剤および促進剤とともに)を、少量のCH2Cl2に溶解して、カバーガラスをスピンコーティングさせた。フォトマスクをこのカバーガラスの上に置き、そしてUVP BLAK−RAY長波長紫外線ランプからのUV光に15分間、露光させた。その表面を1.0mLのヘキサンで洗浄して、一晩乾燥させた。100ミクロンのバイオデンドリティックゲルラインを形成して、SEMで観察した。原子間力顕微鏡(AFM)によって、このフィルムが、円滑かつ均一であり50nmの解像度では感知できるほどの欠損はないことが示される。高度偏差のRMS平均は、約1.5nmである。
【実施例50】
【0113】
マクロ多孔性デンドリティックゲル。エッペンドルフ微量遠心管中での遠心分離によって、所望の大きさ(例えば、1ミクロン)のポリスチレンビーズを、最初に水性懸濁液から分離した。次に光架橋可能なバイオデンドリティック高分子G2−PGLSA−MMAおよび光開始剤(DMAP)を、このエッペンドルフに(所望の濃度に対して特異的な容積で)添加し、そしてボルテックス撹拌器で、このビーズと混合した。次いで、このサンプルをUVランプで光架橋させて、エッペンドルフ管から取り出した。次いで、このポリスチレンビーズを含有する架橋されたポリマーを、トルエン中に約72時間浸漬して、ビーズを溶解させた。次いで、このマクロ多孔性生体材料を、大量のエタノールおよび水でリンスして、さらなる使用まで保管した。マクロ多孔性生体材料の走査電子顕微鏡写真によって、光架橋およびビーズ溶解の前の、このバイオポリマーにおけるポリスチレンビーズの立方最密配列から生じたハニカム(ハチの巣)構造が示される。
【実施例51】
【0114】
(ゲルの多光子製造(加工))二光子重合化において、光開始剤のレーザー励起は、少なくとも1つの仮想的または非定常的な状態を通じて進行する。光開始剤は、2つの近赤外線光子を吸収し、それをS2状態に駆動し、続いてS1および長寿命三重項状態への系間交差へ減衰する。入射光子の空間密度が高い場合、開始分子(三重項状態)は、TEAからの電子を抽出し、これによってポリマーの光架橋反応を開始して足場を作製する。重要なことに、複雑かつ詳細な構造は、高い精度で製造(加工)され得る。なぜなら、2光子吸収は、狭い集束条件下で極度に局在化されるからである。2光子誘導性重合化(TPIP)を介した、制御された微細加工を用いて、バイオポリマーの溶液から生体医学的に有用な構造を合成した。レーザー走査共焦点顕微鏡と組み合わされたフェムト秒近赤外線チタンサファイアレーザー(Coherent 900−F)を用いて、TPIPを実施した。TPIPに用いた平均出力および波長は、それぞれ50mWおよび780nmであった。この顕微鏡は、点走査およびラスター走査のための走査鏡を装備されていた。約20μLの溶液(バイオポリマー、エオシンy(EY)、およびトリエタノールアミン(TEA)、10000:1000:1)を、共開始剤として用い、それをレーザー照射のために顕微鏡のステージ上に装填する前にカバーガラス上に滴下した。
【実施例52】
【0115】
(バイオデンドリティックファイバー)バルク溶液からポリマーを引き出しながら、架橋可能バイオデンドリマーの溶液を光重合化することによって、バイオデンドリティックファイバーを調製した。走査電子顕微鏡写真は、ミクロン幅の明確なファイバーを示す。濃度、光重合化、および押し出し速度を変化させることによって、異なるファイバーを形成し得る。
【実施例53】
【0116】
(バイオデンドリティックゲル上の細胞播種)G2−PGLSA−MMA由来の光架橋したゲルは、以前に記載されたように、約20μlのポリマーを添加すること、およびUVランプを用いて、10分間光架橋することによって96ウェルプレートの底に由来する。次いで、適切な培地中の幹細胞を、96ウェルプレートに添加した。この幹細胞を、48時間の間、特定の時間間隔で、光学顕微鏡によってモニターした。幹細胞は生存しており、そして架橋したバイオデンドリティックゲルに結合された。
【実施例54】
【0117】
(光架橋可能なデンドリティックポリマーを用いた角膜移植片のシール)眼球摘出したドナーのヒトの眼において、5.5mmの角膜中央穿孔を実施した。次いで、粘弾性のHealonのベッドを前眼房中に導入して、自家移植片の安定化を補助する。滅菌の光架橋可能なバイオデンドリティックポリマーを、27ゲージカニューレを用いて移植片−宿主接合部に塗布する(N=5)。次いで、514nmの波長で、かつ51W/cm2で作動する持続波アルゴンレーザーを用いて、この溶液を重合する。移植された眼の角膜輪部上の既知の高さで、平衡塩溶液のリザーバーに連結された23ゲージの眼内カニューレを使用して、水柱検圧法を用いて、全ての眼についての破裂圧力を決定した。参照として、16の従来の断続性10−0ナイロン縫合糸を用いて、どのような光架橋可能なポリマーも用いずに、10の角膜ボタンを本来の位置に縫合する。破裂圧力は、従来のナイロン縫合糸に比べて、光架橋可能なバイオデンドリティックポリマーでシールした角膜移植片については高かった。
【実施例55】
【0118】
(BGL−GA−PHE−OHの合成)−フェニルアラニンエチルエステルHCl(1.2当量)、BGL−GA(1当量)、およびHOBt(1.2当量)を無水CH2Cl2に溶解した。TEA(1.2当量)、およびDCC(1.2当量)を添加して、反応物を、環境温度で一晩撹拌した。濾過によってDCUを取り除き、CH2Cl2(100mL)で希釈した。次いで、この生成物を3.5%HCl(130mL)、水(2×130mL)、で洗浄し、乾燥し、そして溶媒を除去した。フェニルアラニンエチルエステルHClを、0.2M LiOH(水溶液)と一緒に45℃で2時間、撹拌した。この水相をpH4に酸性化して、CH2Cl2を用いて抽出し、乾燥し、そして溶媒を除去して、フワフワした白色の生成物を得た。全体的収率66%。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例56】
【0119】
(G0−PGLGAPHE−Bzldの合成)−BGL(1当量)、BGLGAPHE−OH(1.1当量)、およびDPTS(0.5当量)を、塩化メチレンに溶解して、DCC(1.1当量)を添加した。この反応物を、環境温度で一晩撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして溶媒を除去した。EtOAc中でDPTSを沈殿させて、濾過によって除去した。1:5のEtOH/CH2Cl2を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。EtOH中で沈殿させて、酸を除いた。収率80%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 508 PDI 1.01。
【実施例57】
【0120】
(G0−PGLGAPHE−OHの合成)−G0−Bzldを、THFに溶解し、Pd(OH)2を添加し、水素発生器に、80psiで1時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率96%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 416 PDI 1.01。
【実施例58】
【0121】
(G1−PGLGAPHE−Bzldの合成)−G0−OH(1当量)をDMFに溶解させた。酸(5当量)およびDPTS(2.5当量)を添加し、続いてDCC(5当量)を添加した。次いで、この反応物を、環境温度で一晩、撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして高真空下で溶媒を除去した。次いで、エーテルで生成物を洗浄し、EtOAcに溶解し、濾過によってDPTSを除去した。次いで、この生成物を最小EtOHに溶解して、冷蔵庫中で一晩沈殿させた。最終的に、5:1のCH2Cl2/EtOHを用いるカラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。収率71%。1H NMRおよびIRによって以下を得た:SEC Mw 1704 PDI 1.01。
【実施例59】
【0122】
(G1−PGLGAPHE−OHの合成)−G1−Bzldを、THFに溶解し、Pd(OH)2を添加し、そして水素発生器に、80psiで1.5時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率98%。1H NMRおよびIRを得た。SEC Mw 1671 PDI 1.01。
【実施例60】
【0123】
(G2−PGLGAPHE−Bzldの合成)−G1−OH(1当量)を、DMFに溶解した。酸(16当量)およびDPTS(16当量)を添加し、続いてDCC(16当量)を添加した。次いで、この反応物を、環境温度で48時間、撹拌した。濾過によってDCUを除去し、そして高真空下で溶媒を除去した。EtOAc中でDPTSを沈殿させ、濾過によって除去した。15%EtOH含有塩化メチレンを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。EtOHで生成物を洗浄した。収率25%を超える。1H NMRおよびIRを得た。SEC 3681 PDI 1.01。
【実施例61】
【0124】
(G2−PGLGAPHE−OHの合成)−G2−Bzldを、THF/MeOHに溶解し、Pd(OH)2を添加し、そして水素発生器に、80psiで12時間、置いた。セライトのベッドを通じた濾過によって炭素を除き、そして溶媒を除いた。収率95%。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例62】
【0125】
(2(cis−1,3−O−ベンジリデングリセロール)コハク酸モノエステル(2)の合成)
【化14】
17.00g(0.09434モル)のcis−1,3−O−ベンジリデングリセロール(1)、および14.42g(0.1441モル)の無水コハク酸を、ピリジン中において室温で18時間撹拌させた。ピリジンを除去して、白色粉末をdH2Oに溶解した。1N NaOHを用いて、水のpHを7.0に調節した。水相をCH2Cl2で洗浄して不純物を除いた。次いで、1N HClを用いて、この水相をpH4.0に調節した。この生成物をCH2Cl2で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濾過して、乾燥し、白色粉末として、25.023gの純粋な生成物を得た(収率、94.6%)1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:281m/z(MH+)(理論値:280m/z(M+))。元素分析:C、60.07%;H,5.80%(理論値:C,59.99%;H,5.75%)。
【実施例63】
【0126】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロール(bzld−G1−PGLSA−phth デンドロン)(3)の合成)
【化15】
4.004g(0.01429モル;1当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)、および3.803g(0.01584モル:1.1当量)のN−ブロモメチルフタルイミド、および2.002g(0.03446モル;2.4当量)のフッ化カリウムを、85℃のDMF中で、2時間撹拌した。次いで、DMFを減圧下で除去した。固体生成物を、CH2Cl2に溶解して、水、飽和NaHCO3で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、エーテル中で回転蒸発させて、沈殿させた。最終生成物を、MeOH中で、4.169gの白色粉末として再結晶化した(収率、66.5%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:440.1m/z(MH+)(理論値:439.4m/z(M+))。
【実施例64】
【0127】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールのベンジリデン脱保護)
【化16】
cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールのベンジリデン保護基を、触媒性加水分解によって除去した。2.00gのcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸メチルフタルイミド)グリセロールを、EtOAc/MeOH(9:1)に溶解して、10%(w/w 10%)のPd/Cを添加した。次いで、この溶液を水素発生器上のパー(Parr)チューブに入れ、そして50atmのH2下で1時間、振盪させた。次いで、この溶液を湿性セライト上に濾過させた。この生成物をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH 95:5)で精製して、1.5gの透明な油状物を得た(収率、94%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例65】
【0128】
(DPTSの合成)
MooreおよびStubbの手順に従って、DPTSを合成した[Moore,1990#197]。p−トルエンスルホン酸(PTSA)を、トルエンに溶解して、真空ライン上で乾燥させた。それを、無水トルエン中に40℃で溶解した。等モル量のDMAP(4−ジメチルアミノピリジン;122.17g/モル)を、温かいトルエンに溶解して、この溶液に添加した。この溶液を一晩撹拌して、白色固体を沈殿させた。この溶液を濾過した。この沈殿物を真空ライン上で乾燥させて、さらなる精製なしに用いた。これは、p−トルエンスルホン酸および4−ジメチルアミノピリジンの1:1の塩複合体であって165℃の融点を有する。
【実施例66】
【0129】
(ベンジリデン−G−2 PGLSA−メチルフタルイミド デンドロンの合成)
【化17】
1.50g(4.27mmol)の脱保護生成物を、無水CH2Cl2中で、2.63g(9.38mmol、2.2当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール、1.26g(4.28mmol、1当量)DPTS、および2.64g(12.8mmol、3当量)のDCCとともに、室温で1晩、撹拌した。この溶液を濾過して、回転蒸発させて、冷THF中に入れ、再度濾過して、回転蒸発させ、エーテル中で再結晶化させ、濾過して、カラムクロマトグラフィー(CH2Cl2〜CH2Cl2:MeOH 95:5)で精製して、3.23g(3.69mmol)の白色粉末(収率、86%)を生成した。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:876.3m/z(MH+)、(理論値:875.3m/z(M+))。HR−FAB:874.2537m/z(M−H+)(理論値:875.2637m/z(M+))。
【実施例67】
【0130】
(Bzld−G2−PGLSA−phth デンドロンのベンジリデン脱保護)
【化18】
0.746gのBzld−G2−phth デンドロン(5)を、THFに溶解した。10%(w/w)の10%Pd/Cを、この溶液に添加し、引き続いてこれを、水素発生器中に40atm H2(g)のもとで1時間おいた。この溶液をセライトを通して濾過して、乾燥させ、0.52g(0.743mmol)の油状生成物(6)を得た(収率、95%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例68】
【0131】
(Bzld−G3−PGLSA−phth デンドロン(7)の合成)
【化19】
0.52gのベンジリデン脱保護G2−PGLSA−phth デンドロン(6)(0.743mmol)を、無水CH2Cl2に溶解した。0.916gのcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)(3.27mmol;4.4当量)、0.44g(1.44mmol)DPTS、および0.674g(3.27mmol)DCCを添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。それを濾過して、生成されたDCUを除去し、冷THF中で精製してさらにDCUを除き、そして冷エーテル中で再結晶化した。この産物をカラムクロマトグラフィー(95:5 CH2Cl2:MeOH;Rf=0.82)で精製して、白色固体粉末(7)を得た(収率、84%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:1749.5m/z(MH+)、(理論値:1748.7m/z(M+))。元素分析:C,59.17%;H,5.56%(理論値:C,59.07%;H,5.36%)。SEC:MW=1880,Mn=1850,PDI=1.01。
【実施例69】
【0132】
(cis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸(t−ブチル−ジフェニルシリル))グリセロール(bzld−G1−GLSA−Si デンドロン(9)の合成)
【化20】
4.002g(0.0143mmol)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール(2)および3.24g(3.3当量のイミダゾール)を、少量のDMF中で撹拌した。6.4mL(1.7当量)のジフェニル−t−塩化ブチルシリルを、添加して、その反応物を25℃で48時間撹拌した。CH2Cl2を添加して、飽和NaHCO3および水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過して、回転蒸発させ、そして真空ライン上で乾燥させた。この生成物を、カラムクロマトグラフィー(4:1 ヘキサン:EtOAc)によって精製して、6.38g(0.123mol)の生成物を厚い不透明な油状物として得た(9)(収率、86.1%)。Rf=0.130(4:1のヘキサン:EtOAc中)。1H NMRおよびIRを得た。GC−MS:519.2m/z(MH+)(理論値:518.7m/z(M+))。HR−FAB:517.2028m/z(M−H+)(理論値:518.2125m/z(M+))。
【実施例70】
【0133】
(bzld−G1−GLA−Siデンドロン(10)のベンジリデン除去)
【化21】
1当量のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸(ジフェニル−t−ブチルシリル))グリセロールを、THFに溶解し、10%(w/w)10%Pd/Cを添加した。次いで、その溶液を水素発生器上のパーチューブに入れ、排気して、水素でフラッシュし、そして40atmのH2下で3時間、振盪した。次いで、その溶液を湿性セライトを通して濾過した。回転蒸発させて、カラムクロマトグラフィー(1:1 Hex:EtOAc〜1:4 Hex:EtOAc)によって精製した。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例71】
【0134】
(bzld−G2−PGLSA−Si デンドロン(11)の合成)
【化22】
1.90g(4.41mmol)の2−O−(コハク酸(ジフェニル−t−ブチルシリル)グリセロールを、無水CH2Cl2中で撹拌し、1.30g(1当量;4.41mmol)DPTS、2.72g(9.70mmol;2.2当量)のcis−1,3−O−ベンジリデン−2−O−(コハク酸)グリセロール、および2.00g(9.70mmol;2.2当量)のDCCを添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した(15分以内にDCUは析出し始める)。DCU沈殿物を濾過除去して、その溶液をエバポレートした。1:1のエチルアセテート:ヘキサンの溶液を添加して、その不純物を破砕したが、その生成物(G−2デンドロン)は、溶液中に残る。その溶液を濾過して回転蒸発させ、そして真空ライン上に置いて、カラムクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン:EtOAc)で精製して、3.70g(3.87mmol)の生成物を得た(収率、88%)。Rf=0.2155(1:1 ヘキサン:EtOAc);Rf=0.5091(3:7 ヘキサン:EtOAc)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:955.3m/z(MH+)、(理論値:955.1m/z(M+))。SEC:MW=940,Mn=930,PDI=1.01。
【実施例72】
【0135】
(G2−PGLSA−Siデンドロン(12)を得るためのbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)のベンジリデン除去)
【化23】
1.55g(1.62mmol)のbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)をTHFに溶解し、過剰の20%Pd(OH)2/Cを添加した。次いで、その溶液を水素発生器上のパーチューブに入れて、50atmのH2下で4時間、振盪した。次いで、その溶液を、湿性セライトを通して濾過し、回転蒸発させて、カラムクロマトグラフィー(1:1 Hex:EtOAc〜1:4 Hex:EtOAc)によって精製して、1.12g(1.54mmol)のベンジリデン脱保護G2−PGLSA−Siデンドロン(12)を得た(収率、95%)。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例73】
【0136】
(bzld−G2−PGLSAデンドロン(14)を得るためのbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)からのシリル除去)
【化24】
1.00g(1.04mmol)のbzld−G2−PGLSA−Siデンドロン(11)をTHFに溶解した。1.25g(3.96mmol;3.8当量)のフッ化テトラブチルアンモニウム水和物(TBAF/3H2O;315.51g/mol)をその溶液に添加し、そしてそれを室温で1時間撹拌した。1時間後、TLCによって証明されたとおり、反応が完了した。その溶液をH2O(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、回転蒸発させ、そして真空ライン上で乾燥させた。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(100%CH2Cl2〜2%MeOH含有CH2Cl2)によって精製して、0.65g(0.907mmol;収率87%)の生成物(14)を得た。1H NMRおよびIRを得た。GC−SEC:MW=810、Mn=800,PDI=1.01。
【実施例74】
【0137】
(bzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)の合成)
【化25】
0.55g(0.71mmol)のベンジリデン脱保護G2デンドロン(12)を、CH2Cl2中で撹拌し、0.415g(1.41mmol;2当量)DPTS、0.871g(3.11mmol;4.4当量)のcis−O−ベンジリデン−2−(コハク酸)グリセロールモノエステル(2)、および4.4当量のDCCを添加した。この溶液を窒素下、室温で一晩撹拌した(15分以内にDCUは析出し始める)。DCU沈殿物を濾過除去して、その溶液をエバポレートした。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(3:7 ヘキサン:EtOAc)で精製して、0.71gの(13)を得た(収率、54%)。1H NMRおよびIRによって以下を得た:GC−MS:1825.6m/z(M−H+)、(理論値:1827.9m/z(M+))。HR−FAB:1825.6124m/z(M−H+)(理論値:1826.6233m/z(M+))。SEC:MW=1830、Mn=1810,PDI=1.01。
【実施例75】
【0138】
(bzld−G3−PGLSA(8)を生成するためのbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)からのシリル除去)
【化26】
t−ブチル−ジフェニルシリル基をG3デンドロンから除去し、そして生成物をG2デンドロンと類似の様式で精製した。2.00g(1.09mmol)のbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)をTHFに溶解した。1.3g(4.1mmol;3.8当量)のフッ化テトラブチルアンモニウム水和物(TBAF・3H2O;315.51g/mol)をその溶液に添加し、そしてそれを室温で1時間撹拌した。1時間後、TLCによって証明されるように、反応が完了した。その溶液をH2O(2×)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、回転蒸発させて、真空ライン上で乾燥させた。その生成物を、カラムクロマトグラフィー(100%CH2Cl2から2%MeOH含有CH2Cl2まで漸増)によって精製して、1.44g(0.906mmol;収率83%)の生成物(17)を得た。1H NMRおよびIRを得た。SEC:MW=1650、Mn=1620、PDI=1.02、Mactual=1589.50。
【実施例76】
【0139】
(bzld−G3−PGLSA−Siデンドロンからのベンリリデン除去)
【化27】
0.484gのbzld−G3−PGLSA−Siデンドロン(13)をTHFに溶解した。20%Pd(OH)2を、添加して、フラスコを排気して、50psi H2を充填した。その混合物を1時間振盪して、次にセライトを通して濾過した。この濾液を乾燥して、0.38g、すなわち収率97%で、油状物を生成した。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例77】
【0140】
(bzld−G4−PGLSA−Siデンドロン(16)の合成)
bzld−G4−PGLSA−Siデンドロンを、2つの方法で、すなわちDCCカップリングによるモノエステル(2)のG3−PGLSA−Siデンドロン(bzldなし)(15)への付加(G3+G1法)によってか、またはこれもDCCカップリングによるbzld−G2−PGLSA(Siなし)(14)のG2−PGLSA−Si(bzldなし)(12)への付加(G2+G2法)によって合成した。両方の方法の描写についてはスキーム4.4を参照のこと。
【0141】
G3+G1:0.38gのG3−PGLSA−Si(0.26mmol)を、無水DCMに溶解した。1.00g(3.57mmol)のcis−O−ベンジリデン−2−(コハク酸)グリセロールモノエステル(2)、0.10g(0.34mmol)DPTS、および0.656g(3.57mmol)DCCを、この混合物に添加した。この溶液を窒素下において室温で48時間撹拌した。DCU沈殿物を濾過除去して、その濾液を乾燥して、カラムクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン:EtOAc〜1:4 ヘキサン:EtOAc)によって精製した。0.572g(0.16mmol)の白色含水性粉末(16)を分離した(収率60%)。1H NMRおよびIRを得た。MALDI−MS:3574.54m/z(MH+)(理論値:3573.54m/z(M+))。SEC:MW=3420、Mn=3350,PDI=1.02。
【実施例78】
【0142】
(PGLSAデンドリマー四官能性コア(bzld−G0−PGLSA)(17)の合成)
【化28】
コハク酸、cis−1,3−O−ベンジリデングリセロールおよびDPTSを、無水CH2Cl2に溶解した。DCCを添加して、その反応物を窒素下において室温で一晩、撹拌した。DCUを濾過除去して、その濾液を濃縮して、カラムクロマトグラフィー(97:3 CH2Cl2:MeOH)によって精製した。収率90%。1H NMRおよびIRを得た。GC−MS:443m/z(MH+)(理論値:442m/z(M+))。HR−FAB:442.1635m/z(M+)(理論値:442.1628m/z(M+))。元素分析:C,65.25%;H,5.85%(理論値:C,65.15%;H,5.92%)。
【実施例79】
【0143】
(四官能性コアのベンジリデン脱保護)
【化29】
1.00g(0.0023mol)のbzld−G0−PGLSA(17)を、パーチューブ中のTHFに溶解した。10%(w/w)Pd(OH)2/Cを添加した。このパーチューブを排気して、H2(g)でフラッシュして、50psiのH2で充填した。この溶液を3時間、振盪した。この触媒を濾過して、THFで洗浄した。この濾液をエバポレートして、0.57g(0.0022mol)の透明な油状生成物を得た(収率95%)。1H NMRおよびIRを得た。元素分析:C,44.94%;H,6.87%(理論値:C,45.11%;H,6.81%)。
【実施例80】
【0144】
(bzld−G3−PGLSAデンドリマー(19)の合成)
【化30】
0.029g(0.11mmol)の四官能性コア(18)を無水DCMに溶解して、0.9g(0.57mmol)bzld−G3−PGLSA(8)、33mg(0.11mmol)DPTS、および0.12g DCC(0.57mmol)を添加した。この溶液を窒素下において室温で72時間撹拌した。SEC:MW=4740、Mn=4590、PDI=1.01、Mtheoretical=6552.19。1H NMRおよびIRを得た。
【実施例81】
【0145】
((bzld−G3−PGLSA)−PEG線状ハイブリッド(20)の合成)
【化31】
0.29g(0.18mmol)のbzld−G3−PGLSAデンドロン(8)を、無水DCMに溶解し、0.45g(0.09mmol)5000MW ポリ(エチレングリコール)モノ−メチルエーテル(PEG−MME)(Polyscience,Inc.,Warrington,PA)、0.037g(0.18mmol)DCC、および0.026g(0.09mmol)DPTSを、この溶液に添加した。その溶液を窒素下において室温で168時間撹拌した。DCUを濾過除去した。その濾液を回転乾燥してTHFに溶解し、冷却し、そしてDCUを濾過除去した。この生成物をエチルエーテル中で沈殿させた。その溶液をTHFに溶解し、Amberlyst A−21イオン交換樹脂(Aldrich)(弱塩基性樹脂)とともに撹拌して、過剰のbzld−G3−PGLSA−酸(8)を排除した。その溶液を濾過して、その濾液を乾燥させて、0.528gの白色固体生成物を得た(収率89%)(20)。MALDI−MS:MW=6671、Mn=6628 PDI=1.01(理論値 MW=6588;PEG−MME(5000g/mol)サンプル:MALDI−MS MW=5147、Mn=5074、PDI=1.01)。SEC:MW=6990、Mn=6670,PDI=1.04。1H NMRおよびIRを得た。
【図面の簡単な説明】
【0146】
【図1】上記の実施例に記載されるG0−PGLGA−PHE−OHへの合成経路を示す。
【図2】上記の実施例に記載されるG2−PGLGA−PHE−OHへの合成経路を示す。
【図3】上記の実施例に記載されるG0、G1、G2、およびG3 PGLSA−PEGバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図4】上記の実施例に記載されるG4 PGLSA−PEGバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図5】上記の実施例に記載されるG0、G1、G2、およびG3 PGLSAバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
【図6】上記の実施例に記載されるG4 PGLSAバイオデンドリマーへの合成経路を示す。
Claims (92)
- デンドリティックポリマーまたはコポリマーであって、グリセロール、乳酸、グリコール酸、グリセロール、アミノ酸、カプロン酸、リボース、グルコース、コハク酸、リンゴ酸、アミノ酸、ペプチド、合成ペプチドアナログ、ポリ(エチレングリコール)、およびポリ(ヒドロキシ酸)からなる群より選択される少なくとも1つの生体適合性代謝物またはインビボの天然の代謝物に由来する構成単位から構成される、デンドリティックポリマーまたはコポリマー。
- 創傷のケアまたは創傷の管理のための、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 組織シーラントとしての、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- インビトロでの細胞の播種、引き続くインビボでの置換のための、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 細胞の播種、および引き続くインビボのその場所(in situ)での重合化のための、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 接着の防止のための、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 器官修復または再建のための、請求項1に記載の架橋可能/重合可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 前記架橋が、共有結合、イオン結合、または疎水性結合の性質である、請求項1に記載の架橋可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 薬物送達のための、請求項1に記載のデンドリティックポリマー。
- 遺伝子送達のための、請求項1に記載のデンドリティックポリマー。
- 医療用画像処理のための、請求項1に記載のデンドリティックポリマー。
- 美容外科または形成外科のための、請求項1に記載のデンドリティックポリマー。
- 医療用、または組織工学適用のための線状ポリマーと混合された、請求項1に記載のデンドリティックポリマー。
- 前記架橋デンドリティックポリマーが、1つ以上の線状ポリマーと混合される、請求項1に記載の架橋可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 前記最終ポリマー形態が、ゲル、フィルム、ファイバー、または織物シートである、請求項1に記載の架橋可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 前記最終ポリマー形態が、一光子過程または多光子過程によって生成される、請求項1に記載の架橋可能なデンドリティックポリマーまたはモノマー。
- 前記ポリマーが、以下の構造式:
ここで、R1、R2、R3、R4、R5、A、またはZは、同じであっても異なってもよく、そして−H、−CH3、−OH、メトキシ、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩、アルデヒド、アミン、アミド、チオール、ジスルフィド、直鎖または分枝鎖のアルカン、直鎖または分枝鎖のアルケン、直鎖または分枝鎖のエステル、直鎖または分枝鎖のエーテル、直鎖または分枝鎖のシラン、直鎖または分枝鎖のウレタン、直鎖または分枝鎖、炭酸塩、直鎖または分枝鎖の硫酸塩、直鎖または分枝鎖のリン酸塩、直鎖または分枝鎖のチオールウレタン、直鎖または分枝鎖のアミン、直鎖または分枝鎖のチオール尿素、直鎖または分枝鎖のチオールエーテル、直鎖または分枝鎖のチオールエステルであり、
ここで、Y、X、およびMは、同じであっても異なってもよく、そしてO、S、Se、N(H)、およびP(H)であり、そしてnは、1〜50である、架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。 - 完全に飽和されるか、および/または不飽和である、請求項17に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 請求項17に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマーであって、ここで直鎖または分枝鎖が同じ炭素数または異なる炭素数であり、ここでR1、R2、R3、R4、R5、A、またはZが、エステル、シラン、尿素、アミド、アミン、ウレタン、チオールウレタン、炭酸塩、チオエステル、チオエステル硫酸塩、リン酸塩、およびエステルからなる群より選択される少なくとも1つのリンカーによって連結される、架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 請求項17に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマーであって、ハイドロカーボン、フルオロカーボン、ハロカーボン、アルケン、およびアルキンからなる群より選択される少なくとも1つの鎖を含む、架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 線状ポリマーおよびデンドリティックポリマーからなる群より選択される少なくとも1つの鎖を含む、請求項17に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 請求項21に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマーであって、ここで前記ここで前記線状ポリマーおよびデンドリティックポリマーが、分子量200〜1,000,000に及ぶ、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミン、ポリアクリル酸、ポリカーボネート、ポリアミノ酸、ポリ核酸、およびポリサッカライドからなる群より選択される少なくとも1つを含み、ここで前記鎖が、0、1、または2以上の光重合可能な基を含む、架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 前記ポリエーテルがPEGであって、前記ポリエステルがPLA、PGA、またはPLGAである、請求項22に記載の架橋可能なポリマーまたは架橋不可能なポリマー。
- 請求項22に記載のポリマーまたは線状ポリマーであって、前記鎖が、以下:
のポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、またはポリカーボネートのポリマーまたはコポリマーであり、
ここで、R6−R15は、同じであっても異なってもよく、そして−H、−CH3、−OH、メトキシ、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩、アルデヒド、アミン、アミド、チオール、ジスルフィド、直鎖または分枝鎖のアルカン、直鎖または分枝鎖のアルケン、直鎖または分枝鎖のエステル、直鎖または分枝鎖のエーテル、直鎖または分枝鎖のシラン、直鎖または分枝鎖のウレタン、直鎖または分枝鎖、炭酸塩、直鎖または分枝鎖の硫酸塩、直鎖または分枝鎖のリン酸塩、直鎖または分枝鎖のチオールウレタン、直鎖または分枝鎖のアミン、直鎖または分枝鎖のチオール尿素、直鎖または分枝鎖のチオールエーテル、直鎖または分枝鎖のチオールエステルであり、そして
そしてここで、各々のo、s、およびpは、1と10000との間の数であり、そして各々のm、q、r、およびeは、1と10との間の数である、ポリマー。 - 一般構造式Iの反復単位からなる請求項24に記載のポリマーであって、ここでAが、O、S、Se、またはN−R7であり、ここでR7がR1と同じである、ポリマー。
- W、X、およびZが、各々の存在ごとに同じかまたは異なり、そしてO、S、Se、N(H)、またはP(H)である、請求項24に記載のポリマー。
- 請求項24に記載のポリマーであって、R6−R15のいずれか1つが、水素基、1〜20炭素の直鎖アルキル基もしくは分枝鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、オレフィン基、シリル基、アルキルシリル基、アリールシリル基、アルキルアリール基、またはアリールアルキル基であって、これは、1つ以上のヒドロキシル置換基、ヒドロキシエーテル置換基、カルボキシル置換基、カルボキシエステル置換基、カルボキシアミド置換基、アミノ置換基、一置換アミノ置換基もしくは二置換アミノ置換基、チオール置換基、チオエステル置換基、硫酸塩置換基、リン酸塩置換基、ホスホン酸塩置換基、またはハロゲン置換基によって内部または末端で置換されている、ポリマー。
- 請求項24に記載のポリマーであって、R6−R15のいずれか1つが、ポリ(エチレングリコール)ポリエチレンオキシド)、もしくはポリ(ヒドロキシ酸から選択されるポリマーであるか、あるいは炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、DNAもしくはRNAセグメント、脂質、ポリサッカライド、抗体、医薬品、または生物学的レセプターのエピトープから選択される、ポリマー。
- R6−R15のいずれか1つが、光架橋可能な基またはイオン的に架橋可能な基である、請求項24に記載のポリマー。
- 請求項24〜28のいずれか1項に記載のポリマーであって、ここでDが、1〜5炭素の直鎖アルキルまたは分枝鎖アルキルであり、mは、0または1であり、そしてR2、R3、R4、R5、R5、およびR7は、各々の存在において同じかまたは異なっており、そして水素基、1〜20炭素の直鎖アルキル基もしくは分枝鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、オレフィン基、アルキルアミン基、ジアルキルアミン基、アリールアミン基、ジアリールアミン基、アルキルアミド基、ジアルキルアミド基、アリールアミド基、ジアリールアミド基、アルキルアリール基、またはアリールアルキル基である、ポリマー。
- 一般構造式IIの反復単位からなる請求項24に記載のポリマーであって、ここでL、N、およびJが、各々の存在ごとに同じかまたは異なり、そしてO、S、Se、N(H)、またはP(H)である、ポリマー。
- 一般構造式IIIの反復単位からなる請求項24に記載のブロックポリマーまたはランダムコポリマーであって、ここでM、T、およびQが、各々の存在ごとに同じかまたは異なり、そしてO、S、Se、N(H)、またはP(H)であり、そしてR15が、1〜5炭素の直鎖アルキルもしくは分枝鎖アルキルであり、該アルキルは、置換されていないか、または1つ以上のヒドロキシル置換基、ヒドロキシエーテル置換基、カルボキシル置換基、カルボキシエステル置換基、カルボキシアミド置換基、アミノ置換基、一置換アミノ置換基もしくは二置換アミノ置換基、チオール置換基、チオエステル置換基、硫酸塩置換基、リン酸塩置換基、ホスホン酸塩置換基、もしくはハロゲン置換基によって置換されている、ブロックポリマーまたはランダムコポリマー。
- 高次ブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであって、3つ以上の反復単位からなり、かつ請求項24〜32のいずれか1項に記載の1つ以上の反復単位を有する、高次ブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- 請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであって、アミン、チオール、アミド、リン酸塩、硫酸塩、水酸化物、アルケン、およびアルキンからなる群より選択される少なくとも1つの末端光重合可能基を含む、ブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- 請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであって、ここでX、Y、Mが、O、S、N−H、N−Rであり、ここでRが、−H、CH2、CR2、Se、または酸素の等電子種である、ブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- アミノ酸が、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- ポリペプチドが、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- 抗体が、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- ヌクレオチドが、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- ヌクレオシドが、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- オリゴヌクレオチドが、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- リガンドが、生物学的レセプターに結合する、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- 医薬品が、R1、R2、R3、R4、R5、A、および/またはZに結合される、請求項24に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- 請求項1に記載の架橋可能ポリマーもしくは架橋不可能なポリマーまたは架橋可能コポリマーもしくは架橋不可能なコポリマーであって、該ポリマーが、以下:
ここで、R1、R2、R5、A、またはZは、同じであっても異なってもよく、そして−H、−CH3、−OH、メトキシ、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩、アルデヒド、アミン、アミド、チオール、ジスルフィド、直鎖または分枝鎖のアルカン、直鎖または分枝鎖のアルケン、直鎖または分枝鎖のエステル、直鎖または分枝鎖のエーテル、直鎖または分枝鎖のシラン、直鎖または分枝鎖のウレタン、直鎖または分枝鎖、炭酸塩、直鎖または分枝鎖の硫酸塩、直鎖または分枝鎖のリン酸塩、直鎖または分枝鎖のチオールウレタン、直鎖または分枝鎖のアミン、直鎖または分枝鎖のチオール尿素、直鎖または分枝鎖のチオールエーテル、直鎖または分枝鎖のチオールエステルであり、そして
そしてここで、R3およびR4は、同じであっても異なってもよく、そして上記で規定される基であるR1、R2、R5、A、およびZと同じであるか、またはBの反復パターンであり;そして、
ここで、X、Y、Mは、O、S、N−H、N−Rであり、ここでRは、−H、CH2、CR2、または上記に規定される鎖、Se、または酸素の任意の等電子種であり;そしてnが1〜50である、ポリマーまたはコポリマー。 - 請求項44のポリマーであって、ここで、R3が、限定はされないが、フタルイミドメチルエステル、t−ブチルジメチルシリルエステル、またはt−ブチルジフェニルシリルエステルなどのカルボキシサイクリック酸保護基である、ポリマー。
- 請求項44に記載のポリマーであって、R3、R4、A、およびZが、同じかまたは異なっており、そして−H、−OH、−CH3、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩、アルデヒド、メトキシ、アミン、アミド、チオール、ジスルフィド、直鎖または分枝鎖のアルカン、直鎖または分枝鎖のアルケン、直鎖または分枝鎖のエステル、直鎖または分枝鎖のエーテル、直鎖または分枝鎖のシラン、直鎖または分枝鎖のウレタン、直鎖または分枝鎖、炭酸塩、直鎖または分枝鎖の硫酸塩、直鎖または分枝鎖のリン酸塩、直鎖または分枝鎖のチオールウレタン、直鎖または分枝鎖のアミン、直鎖または分枝鎖のチオール尿素、直鎖または分枝鎖のチオールエーテル、直鎖または分枝鎖のチオールエステル、または天然もしくは非天然のアミノ酸である、ポリマー。
- 完全に飽和されるか、そして/または完全に不飽和である、請求項44に記載のポリマー。
- 請求項44に記載のポリマーであって、ここで直鎖または分枝鎖が、同じ炭素数または異なる炭素数であり、ここで、R1、R2、R3、R4、R5、A、またはZが、エステル、シラン、尿素、アミド、アミン、ウレタン、チオールウレタン、炭酸塩、チオエーテル、チオエステル、硫酸塩、リン酸塩、およびエーテルからなる群より選択される少なくとも1つのリンカーによって連結される、ポリマー。
- 前記鎖が、ハイドロカーボン、フルオロカーボン、ハロカーボン、アルケン、およびアルキンからなる群より選択される少なくとも1つの鎖を含む、請求項44に記載のポリマー。
- 請求項44に記載のポリマーであって、ここで前記鎖が、分子量200〜1,000,000に及ぶ、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミン、ポリアクリル酸、ポリアミノ酸、ポリ核酸、およびポリサッカライドを含み、そしてここで該鎖が、1以上の光重合可能な基を含む、ポリマー。
- 前記鎖が、PEG、PLA、PGA、PGLA、およびPMMAのうちの少なくとも1つを含む、請求項44に記載のポリマー。
- 請求項51に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであって、アミン、チオール、アミド、リン酸塩、硫酸塩、水酸化物、アルケン、およびアルキンからなる群より選択される少なくとも1つの末端光重合可能基を含む、ブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- アミノ酸が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- ポリペプチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- 抗体が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- ヌクレオチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- ヌクレオチドシドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- オリゴヌクレオチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- リガンドが、生物学的レセプターに結合する、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- 医薬品が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- 炭水化物が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- PETまたはMRI造影剤が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- 前記造影剤がGd(DPTA)である、請求項44に記載のポリマー。
- X線撮影のためのヨウ素酸塩化合物が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項44に記載のポリマー。
- 医薬品が、Z、A、R3、および/またはR4に結合され、そして抗菌剤、抗癌剤、抗炎症剤、および抗ウイルス剤からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項44に記載のポリマー。
- 前記炭水化物が、マンノースまたはシアル酸である、請求項44に記載のポリマー。
- 請求項44に記載のポリマーであって、以下:
のポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、もしくはポリカーボネートのポリマーまたはコポリマーである鎖を含み、
ここで、R6−R15は、同じであっても異なってもよく、そして−H、−CH3、−OH、メトキシ、カルボン酸、硫酸塩、リン酸塩、アルデヒド、アミン、アミド、チオール、ジスルフィド、直鎖または分枝鎖のアルカン、直鎖または分枝鎖のアルケン、直鎖または分枝鎖のエステル、直鎖または分枝鎖のエーテル、直鎖または分枝鎖のシラン、直鎖または分枝鎖のウレタン、直鎖または分枝鎖、炭酸塩、直鎖または分枝鎖の硫酸塩、直鎖または分枝鎖のリン酸塩、直鎖または分枝鎖のチオールウレタン、直鎖または分枝鎖のアミン、直鎖または分枝鎖のチオール尿素、直鎖または分枝鎖のチオールエーテル、直鎖または分枝鎖のチオールエステルであり、そして
そしてここで、各々のo、s、およびpは、1と10000との間の数であり、そして各々のm、q、r、およびeは、1と10との間の数である、ポリマー。 - 請求項67に記載のブロックコポリマーまたはランダムコポリマーであって、アミン、チオール、アミド、リン酸塩、硫酸塩、水酸化物、アルケン、およびアルキンからなる群より選択される少なくとも1つの末端光重合可能基を含む、ブロックコポリマーまたはランダムコポリマー。
- アミノ酸が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- ポリペプチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- 抗体が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- ヌクレオチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- ヌクレオチドシドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- オリゴヌクレオチドが、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- リガンドが、生物学的レセプターに結合する、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- 医薬品が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- 炭水化物が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- PETまたはMRI造影剤が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- 前記造影剤がGd(DPTA)である、請求項67に記載のポリマー。
- X線撮影のためのヨウ素酸塩化合物が、Z、A、R3、および/またはR4に結合される、請求項67に記載のポリマー。
- 医薬品が、Z、A、R3、および/またはR4に結合され、そして抗菌剤、抗癌剤、抗炎症剤、および抗ウイルス剤からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項67に記載のポリマー。
- 前記炭水化物が、マンノースまたはシアル酸である、請求項67に記載のポリマー。
- 請求項1に記載の光重合可能なポリマーまたはコポリマーを用いる工程を包含する、外科手術。
- 請求項83に記載の外科手術であって、眼科手術、心臓血管手術、形成外科手術、整形外科手術、婦人科手術、ENT手術、脳手術、形成外科手術、および皮膚手術からなる群より選択される、少なくとも1つの手術である、外科手術。
- 請求項83に記載の外科手術であって、ここで前記光重合可能なポリマーまたはコポリマーは、水溶液中に溶解または懸濁され、ここで該水溶液は、水、緩衝化水性媒体、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アミノ酸溶液、糖類溶液、ビタミン類の溶液、炭水化物の溶液、またはそれらの任意の2つ以上の組み合わせから選択される、外科手術。
- 前記デンドリマーの超分子構造が、リポソームまたはベシクルである、請求項83に記載の外科手術。
- 請求項83に記載の外科手術であって、前記光重合可能なポリマーまたはコポリマーが、ダイズ油、鉱油、コーンオイル、菜種油、ヤシ油、オリーブオイル、サフラワーオイル、綿実油、4〜30個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素もしくは芳香族炭化水素、1〜30個の炭素原子を有する脂肪族アルコールもしくは芳香族アルコール、2〜30個の炭素原子を有する脂肪族エステルもしくは芳香族エステル、2〜30個の炭素原子を有するアルキル、アリールもしくは環状エーテル、1〜30個の炭素原子を有し、かつ必要に応じて1つ以上のハロゲン置換基を有するハロゲン化アルキルもしくはハロゲン化アリール、3〜30個の炭素原子を有するケトン、ポリアルキレングリコール、またはそれらの任意の2つ以上の組み合わせなどの非水性溶液中に溶解または懸濁される、外科手術。
- 前記デンドリマーの超分子構造が、ミセルまたはエマルジョンである、請求項83に記載の外科手術。
- 必要に応じて、少なくとも1つの立体化学的中心を含む、請求項1に記載のデンドリティックポリマーまたはコポリマー。
- 前記少なくとも1つの立体化学的中心がキラルまたはアキラルである、請求項89に記載のデンドリティックポリマーまたはコポリマー。
- 分岐が不完全である少なくとも1つの部位を、必要に応じて含む、請求項1に記載のデンドリティックポリマーまたはコポリマー。
- コンバージェント合成またはダイバージェント合成によって作製された、請求項1に記載のデンドリティックポリマーまたはコポリマー。
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