KR20210018828A - 세포 및 조직 이동을 위한 나노섬유-하이드로겔 복합재료 - Google Patents

세포 및 조직 이동을 위한 나노섬유-하이드로겔 복합재료 Download PDF

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KR20210018828A
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hydrogel
composite
cell
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KR1020207035344A
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사샹크 레디
러셀 마틴
샤오웨이 리
켈빈 창
케빈 콜버트
하이-퀀 마오
Original Assignee
더 존스 홉킨스 유니버시티
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Publication date
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Abstract

연조직 기기는 겔 및 상기 겔 내에서 배치된 적어도 하나의 나노구조물을 포함하는 복합 재료를 편입시킬 수 있다. 연조직 기기는 생물학적 활성 재료 예컨대 세포, 조직을 추가로 편입시킬 수 있다. 연조직 재생을 촉진시키면서 연조직 결손부를 치유하는 방법은 연조직 기기를 연조직 결손부에 적용하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 복합 재료는 겔 및 상기 겔 내에서 배치된 나노구조물을 포함한다. 연조직 결손부 치유에서 사용을 위한 연조직 기기의 제조 방법은 겔을 제공하는 단계, 상기 겔 내에서 나노섬유, 및 생물학적 활성 재료를 배치하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

세포 및 조직 전달을 위한 나노섬유-하이드로겔 복합재료
본원은, 그 전체가 본 명세서에 참고로 편입되는, 2018년 5월 9일 출원된, 미국 가출원 62/669,287의 이익을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 교부 번호 1R21NS085714 및 국립 과학 재단에 의해 수여된 교부 번호 DMR1410240 하에서 정부 지원으로 실시되었다. 정부는 본 발명에서 일정 권리를 갖는다.
배경
1. 분야
본 개시내용은 연조직 재생을 촉진시키는 한편, 손실된 연조직 부피를 회복하는 복합 재료 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미용, 재건, 및 세포 요법에 대하여 세포 및 조직 전달을 위한 복합 재료 및 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
외상, 종양 절제, 또는 선천성 기형에서 비롯하는 연조직 결손부는 종래의 수단으로 치료하기 어렵다. 조직 재배열 또는 조직 전이를 비롯한 현행 요법은 공여체 부위 결손부를 야기시킨다. 다른 요법, 예컨대 보철 임플란트는 섬유증 및 캡슐화를 초래한다. 조직 내부성장을 촉진시키기 위한 기존의 전략은 또한 연조직 결손부의 치료에 부적합하다. 현행 무세포 기질은 이상적 재건에 요구되는 3차원의 연조직보다는 편평한 섬유성 시트의 조직을 초래한다. 최종적으로, 지방 이식이 연조직 결손부를 복구시킬 수 있는 반면, 이의 더 광범위한 적용은 가변적 이식편 생존 및 제한된 부피의 복구에 의해 저해된다. 연조직 재건에 대한 이상적 접근법은 연조직 예컨대 생체내 지방 조직의 재생을 조장하고 이어서 조직을 이식화시켜 재생을 촉진시킬 것이다. 하지만, 조직 재성장은 신 조직속에 부착, 이주, 증식, 분화, 및 조직화하기 위해 세포에 적합한 기질을 요구한다. 다수의 천연 세포외 기질 (ECM)은 복구 부위에서 실종된다. 그러므로, 지방 조직-기반의 재건을 이용하여 연조직 결손부를 복구할 때, 손실된 조직 부피를 즉시 복구시키는 것뿐만 아니라 미세환경을 재조건화하고 숙주 세포 침윤을 지원하고 그리고 연조직의 재생을 조장하는 합성 기질을 재창출하는 것이 필수 과제가 된다.
하이드로겔은 그들의 높은 수분 함량 그리고 수-가용성 생체분자의 손쉬운 수송을 허용하는 수-팽윤된 네트워크로 인해 ECM 모방체로서 상당한 관심을 받아 왔다. 그러므로, 하이드로겔은 연조직 재건을 위한 충전재 재료로서 몇몇 이점을 제공한다. 이들은 또한 적합한 플랫폼으로서 작용하여 생물학적 활성 재료 예컨대 세포, 조직을 편입시켜 조직 재생을 추가로 촉진시키면서 충전재 재료로서 작용한다. 예를 들어, 세포는 세포 이식술 공정의 각 단계 (예비-주사, 주사, 급성 사후-주사, 및 장기 생존)에서 세포 기능을 손상시킬 수 있고 세포사를 초래할 수 있는 기계적 및 구조적 도전을 경험한다. 그리고, 이들 도전이 하이드로겔에 의해 극복될 수 있는 될 수 있는 것은 이들이 이식술화된 세포의 숙주 조직에의 생존 및 생착 비율이 증가하도록 주사 동안 막 피해로부터 세포를 보호할 수 있기 때문이다.
몇몇 하이드로겔이 연조직 재건 및 줄기 세포 이식술에서 일부 이익을 보여준 반면, 잇따른 기계적 문제점 모두를 해결할 수 있는 현행 재료는 없다.
충분한 기계적 특성을 달성하기 위해 더 높은 가교 밀도가 일반적으로 요구된다. 그러나, 이들 조건 하에서, 숙주 조직 세포 (예를 들면, 지방세포 전구체 및 내피 전구체)는 스캐폴드 내로 침투하고 성장할 수 없다. 분해성 하이드로겔의 경우, 흉터형성 및 섬유성 조직 형성이 전형적인데, 숙주 조직의 내부성장이 너무 느리게 발생하거나 또는 적어도 섬유 재료의 흡수보다 더 느린 페이스로 발생하기 때문이다.
최근, 기능화된 나노섬유는 다양한 세포 활성을 지원하는 ECM 모방체로서 작용하도록 개발되어 왔다. FDA-에 따른 합성 생분해성 폴리-a-에스테르, 예컨대 폴리카프로락톤 (PCL) 또는 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (PLGA)는 전기방사로 알려진 공정을 통해 나노섬유를 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 중합체로부터 제조된 생분해성 봉합술 및 임플란트는 생체적합성에서 그들의 탁월한 실적으로 인해 임상적으로 널리 사용되어 왔다. 줄기 세포 공학 적용을 위한 가변하는 직경 및 토포그래피의 다양한 나노섬유가 개발되어 왔다. 그러나, 이들 나노섬유는 거시적 구조를 제공하지 않아, 이들을 3D 스캐폴드로서 사용하기가 어렵다.
많은 상용화된 하이드로겔 충전재는 환자에서 중등도 내지 심각한 염증을 야기하는 동시에, 경시적으로 완전한 본래 부피를 유지하지 않는다.
이와 같은 종래의 방법 및 시스템과 연관된 다양한 문제를 감안하면, 연조직 결손부 치유에 대한 개선된 해법이 당 업계에서 여전히 필요하다. 본 개시내용은 당 업계에서 주목된 다양한 문제를 극복하는 이 필요성에 대한 해법을 제공한다.
개요
하기 개시내용에서 조성물 및 방법은 개선된 특성 (예를 들면, 아래에서 추가로 상세된 바와 같이, 연조직의 재건을 위하여 개선된 품질)을 구비하는 섬유-하이드로겔 복합재료 예컨대 섬유-하이드로겔 복합 마이크로비드를 포함하는 조성물을 사용함으로써 이 필요성을 해결하도록 설계되어졌다.
따라서, 일 양태에서, 생물학적 활성 재료 및 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 중합체성 섬유에 공유결합된 하이드로겔 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하는 스캐폴드 복합체 (즉, 연조직 기기)가 본 명세서에 개시되고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 상기 비구형 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 상기 생물학적 활성 재료는 상기 비구형 마이크로비드와 작동가능하게 회합되거나, 또는 이들의 조합이고, 여기서 상기 마이크로비드의 평균 크기는 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고, 여기서 상기 마이크로비드는 예비-반응되고, 여기서 상기 마이크로비드는 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 여기서 상기 연조직 기기는 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식될 수 있거나 주사될 수 있다.
특정 양태에서, 생물학적 활성 재료 그리고 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하는, 연조직 기기가 본 명세서에 개시되고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 비구형 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 상기 생물학적 활성 재료는 비구형 마이크로비드와 작동가능하게 회합되거나, 또는 이들의 조합이고, 여기서 상기 마이크로비드의 평균 크기는 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고, 여기서 상기 마이크로비드는 예비-반응되고, 여기서 상기 마이크로비드는 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 여기서 상기 연조직 기기는 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식될 수 있거나 또는 주사될 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로비드는 실질적으로 비-염증성이다.
일 구현예에서, 생물학적 활성 재료는 성장 인자, 사이토카인, 항체, 세포, 조직, 조직 담체, 또는 조직-결합 모이어티, 핵산, 세포 담체, 또는 세포-결합 모이어티, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 세포-결합 모이어티 또는 조직-결합 모이어티는 펩타이드, 항체, 단백질, 압타머, 올리고당류, 또는 생물학적 재료를 포함한다.
일 구현예에서, 생물학적 활성 재료는 지방 세포, 자가 지방 세포, 동종 세포, 유전자 변형 동종 세포, 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유전자 변형 줄기 세포, 유전자 변형 동종 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 및 유전자 변형 저면역원성 만능 줄기 세포, 지방 조직으로부터의 간질 혈관 분획, 이의 유도체, 또는 이들의 조합의 집단을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 생물학적 활성 재료는 기기 내에서 또는 가까이 내구성있게 존재할 수 있는 의 집단을 포함한다.
특정한 구현예에서, 생물학적 활성 재료는 지방 간질 혈관 분획을 포함한다.
일 구현예에서, 생물학적 활성 재료는 지방 조직을 포함한다. 선택적으로, 지방 조직은 지방흡인제이다. 선택적으로, 지방 조직은 자가성이다. 선택적으로, 지방 조직은 동종이다. 일 구현예에서, 지방 조직을 포함하는 연조직 기기는 37℃에서 안정하다. 또 다른 구현예에서, 지방 조직을 포함하는 연조직 기기는 대상체의 표적 조직 속에 투여에 앞서 1 시간, 2 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간, 또는 10 시간의 기간 동안 4℃에서 유지된다.
일 양태에서 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 지방 조직을 포함하는 기기의 제조를 위한 키트로서, (i) 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하는 약 1-cc 내지 약 20-cc 또는 20-cc 초과 주사기 부피를 갖는 주사기; 및 (ii) 지방흡인제를 포함하는 약 1-cc 내지 약 20-cc 또는 20-cc 초과 주사기 부피를 갖는 주사기를 포함하는 키트가 제공되고, 여기서 2개의 주사기는 루어 연결기를 통해 서로와 연결할 수 있고, 이로 인해 지방흡인제는 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 지방흡인제는 마이크로비드와 작동가능하게 회합된다.
본 발명의 추가 양태는 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 지방 조직을 포함하는 기기의 제조 방법으로서, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 7 일 동안 적당한 매질에서 지방흡인제 및 마이크로비드를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 지방 조직을 포함하는 기기의 제조를 위한 키트로서, (i) 동결건조된 마이크로비드를 포함하는 주사기; (ii) 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체를 포함하는 바이알로서, 여기서 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체는 바이알로부터 주사기 속에 인출될 수 있어서, 이로 인해 동결건조된 마이크로비드는 이에 의해 재수화되는 것인 바이알; 및 (iii) 지방흡인제를 포함하는 주사기를 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 2개의 주사기는 루어 연결기를 통해 서로와 연결할 수 있고, 이로 인해 상기 지방흡인제는 수화된 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 지방흡인제는 수화된 마이크로비드와 작동가능하게 회합된다.
본 발명의 또 다른 양태는, 지방 조직 그리고 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하는 연조직 기기를 조직 또는 조직 결손부 속에 주사 또는 이식하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 지방 이식 방법을 제공하고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 비구형 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 상기 생물학적 활성 재료는 비구형 마이크로비드와 작동가능하게 회합되거나, 또는 이들의 조합이고, 여기서 상기 마이크로비드의 평균 크기는 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고, 여기서 상기 마이크로비드는 예비-반응되고, 여기서 상기 마이크로비드는 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 여기서 상기 연조직 기기는 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식될 수 있거나 주사될 수 있다.
일 구현예에서, 연조직 기기는 복수의 기공을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 기공의 적어도 한 서브셋은 마이크로비드 도처에 배치될 수 있어서 이로써 대상체에서 존재하는 표적 조직 속에 이식 또는 주사된 경우 조직 성장 및 세포 침윤을 촉진시킨다. 특정 구현예에서, 복수의 기공은 cm2당 50개 이상의 기공의 면밀도를 포함하고, 기공의 적어도 약 80%가 약 5 마이크론 이상의 평균 크기를 갖는다.
일 구현예에서, 기능화된 히알루론산은 아크릴화된 히알루론산을 포함하고, 가교 제제는 티올화된 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 이의 유도체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 기능화된 히알루론산은 티올화된 히알루론산을 포함하고, 가교 제제는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA), 또는 이의 유도체를 포함한다. 선택적으로, 복수의 폴리카프로락톤 섬유는 전기방사된 섬유를 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리카프로락톤 섬유의 직경은 약 100 나노미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위내이다.
일 구현예에서, 마이크로비드는 약 50 Pa 내지 약 2500 Pa의 평균 저장 탄성률을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 상기 기기는 대상체의 표적 조직 내로 진피 또는 피하 투여를 위한 이식가능한 또는 주사가능한 기기로서 제형화된다.
본 발명의 추가 양태는 제1항 기기의 약 0.1 mL 내지 약 20 mL를 포함하는 주사기를 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 마이크로비드는 i) 실질적으로 탈수된 비드 또는 ii) 대상체의 표적 조직 속으로 주사되도록 준비된 수화된 비드로서 제형화된다.
본 발명의 또 다른 양태는 연조직 기기를 포함하는 제형을 제공하고, 여기서 상기 마이크로비드는 동결건조되어 탈수된 마이크로비드를 형성하고, 상기 탈수된 마이크로비드는 대상체의 표적 조직 속으로 투여되기에 앞서 (중량 기준으로 측정된 경우) 손실된 수괴를 실질적으로 대체하는 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체에 의한 재구성에 적합하여 이로써 손실된 수괴가 대체되는 경우, 재구성 유체에서의 마이크로비드의 농도는 동결건조전 마이크로비드의 농도와 동일하거나 실질적으로 동일하다.
본 발명의 추가적인 양태는 탈수된 마이크로비드가 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속으로 투여되기에 앞서 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체에 의한 재구성시 이의 비드화된 형태를 유지 또는 재취득하는 제형을 제공한다. 특정 구현예에서, 탈수된 마이크로비드는 적어도 약 12 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하다.
본 발명의 일 양태는 대상체의 표적 조직 속에 즉시 투여하기 위한 연조직 기기를 제조하기 위한 키트로서, 상기 키트가 마이크로비드를 함유하는 바이알을 포함하되, 상기 마이크로비드가 동결건조되고 분말 케이크로 형성되고, 상기 동결건조된 분말 케이크가 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체에 의해 재구성될 수 있는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체의 표적 조직 속으로 즉시 주사하기 위하여 본원에 기재된 바와 같은 기기의 제조를 위한 키트로서, 상기 키트가 (i) 동결건조된 겔 비드로서 제형화된 마이크로비드를 포함하는 주사기; 및 (ii) 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체를 포함하는 바이알을 포함하되, 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체가 바이알로부터 주사기 내로 인출될 수 있고, 이에 의해 동결건조된 마이크로비드가 재수화되는 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 연조직 기기는 추가로 성장 인자, 혈관신생을 자극시키는 화합물, 면역조절제, 염증 억제제, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 연조직 기기는 추가로 치료적 효과, 혈관화 효과, 항-혈관화 효과, 항-염증성 효과, 항-박테리아 효과, 항히스타민 효과, 또는 이들의 조합을 갖는 화합물을 포함한다.
일 구현예에서, 연조직 기기는 추가로 가공된 조직 세포외 기질을 포함하고, 여기서 상기 가공된 조직 세포외 기질은 지방 조직에서 유래가능하다.
본 발명의 또 다른 양태는, 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단 내에서 작동가능하게 캡슐화된 생물학적 활성 재료를 포함하는, 연조직 기기를 조직 및/또는 조직 결손부 속에 주사하는 단계를 포함하는, 외상, 외과 수술, 또는 연령관련 질환, 장애 또는 병태에서 비롯하는 조직 결손부의 감소 또는 반전 혹은 미용적 절차 또는 재구성적 절차의 수행 방법을 제공하고, 여기서 상기 마이크로비드의 평균 크기는 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고, 여기서 상기 마이크로비드는 예비-반응되고, 여기서 상기 마이크로비드는 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 여기서 상기 연조직 기기는 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식될 수 있거나 주사될 수 있다.
적용가능한 경우 또는 구체적으로 거부하지 않는 경우에, 본 명세서에 기재된 구현예들 중 어느 하나가 본 발명의 상이한 양태 하에서 기재된다고 하더라도 임의의 다른 하나 이상의 구현예와 조합할 수 있는 것으로 고려된다.
이들 및 다른 구현예들은 하기 상세한 설명에 의해 포괄되고 상기로부터 개시되거나 명백하다.
도 1은 주사후 염증성 반응을 도시하는 이미지의 셋트이다. 도 1a는 아크릴화된 HA (HA-Ac) + 티올화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEGSH, 하향 표시 화살표)를 함유하는 겔과 비교하여 티올화된 HA (HA-SH) + 디아크릴화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEGDA) (가교 제제) (상향 표시 화살표)를 함유하는 겔에 대하여 주사후 1 일째에 염증성 반응의 비교를 묘사한다. 도 1b는 시행후(POD) 0 일째 (중앙 패널) 및 POD 2 일째 (우측 패널)에 돼지의 안쪽 허벅지 모델에서 염증 연구로부터 이미지를 도시한다. 좌측 패널은 안쪽 허벅지 이미지에서 보여진 패턴에 상응하는 각 s.c. 주사에서 복합재료의 정체성을 도시한다. 도 1c는 이식화 48 시간후 돼지의 안쪽 허벅지 모델에서 핵심 그룹에 대한 조직학적 반응을 도시한다. 청색 염색은 히알루론산을 나타내고, 적색 염색은 면역 세포 염색을 나타낸다. 주사 부위는, 이러한 HA 그룹에 대한 강한 급성 면역 반응을 묘사하는, 주사 부위의 주변에서 단핵구 활성화에 의해 가시화되는 경우, 티올화된-HA 그룹에서 숙주 조직과 주사 부위 사이 명확한 경계로 캡슐화된다. 도 1d는 LS 강직 및 연질 복합재료 및 관련된 상업적 대조군에 대하여 전단 저장 탄성률 (Pa 단위)을 도시하는 그래프이다. 도 1e는 상업적 대조군과 비교된 복합재료에 대하여 부피 유지를 도시하는 그래프이다.
도 2는 개별 비드를 이미지화하기 위해 100X 희석 후 LS 비드화된 복합재료의 4개 광학 현미경검사 이미지이다. 도 2a는 250 μm 직경 비드로 특수화된 후의 복합재료를 도시하고; 도 2b는, 복합재료가 이의 본래의 모습을 보유하는 것을 실례하는, 동결건조된 그리고 재수화된 후 복합재료를 도시하고; 도 2c는 LS 비드화된 제형의 하이드로겔 성분 및 나노섬유를 묘사하는 10X 이미지이고; 그리고 도 2d는 비-희석된 상태에서 비드화된 제형의 광학 현미경검사 이미지이다. 도 2e는 저장 탄성률에 관한 비드화 및 동결건조의 비-효과를 도시한다.
도 3은 150 및 250 ㎛에서 비드화된 입자와 비교하여 벌크 복합 겔에 대한 저장 탄성률을 도시한다.
도 4는 복합재료 LS-1의 분석을 도시하는 2개 그래프이다. 도 4a는 MRI 정량화에 의해 사정된 경우 상업적 대조군과 비교하여 비드화된 복합재료에 대한 부피 유지를 도시한다. 도 4b는 4a에서 사용된 바와 동일한 HA 농도 및 섬유 장입 하에서 제조된 복합재료의 전단 저장 탄성률에 관한 HA 분자량 (MW)의 효과를 도시한다. 도 4c는 동일한 HA MW 및 섬유 장입 조건 하에서 제조된 복합재료의 전단 저장 탄성률에 관한 HA 농도 (mg/ml)의 효과를 도시한다; 도 4d는 동일한 HA MW 및 섬유 장입 조건 하에서 제조된 복합재료의 압축 저장 탄성률에 관한 HA 농도 (mg/ml)의 효과를 도시한다; 도 4e는, 복합재료의 조율가능성을 증명하는, 특성에서의 변이가 있는 스캐폴드의 부피 유지를 도시한다 (참고 표 1).
도 5는, 경쟁업체 제품과 비교된 경우, LS9 비드 복합재료 주사 부위를 침윤하는 신 조직을 도시하는 MRI 이미지의 시리즈이다. 도 5a는, 이러한 제품에서 숙주 세포 조직 내부성장의 부족을 증명하는, 쥬비덤(
Figure pct00001
)® 충전재로 주사후 14, 30, 및 50 일째에 0% 조직 내부성장을 도시한다. 도 5b는 LS-9 제형의 주사후 조직 내부성장: 14 일째에 18% 신 조직, 30 일째에 52% 신 조직, 및 50 일째에 84% 신 조직을 도시한다. 도 5c는 생체내 복합재료의 지속성에서 최대 효과를 가졌는지를 결정하기 위해 변경된 5개의 파라미터: 하이드로겔 분자량, 하이드로겔 변형도, 하이드로겔 농도, 나노섬유 농도, 및 가교 밀도를 묘사한다. 도시된 바와 같이, 선형 회귀 모델의 선형 예측 능력은 14 및 30 일 (R2 =0.95 및 0.86, 각각)에 허용가능하다. 하이드로겔 농도 및 나노섬유 농도는 최대 효과를 갖는 것처럼 보였다.
도 6은 시판되는 대조군과 비교하여 예비-형성된 LS 비드화된 복합재료의 팽윤 측정의 결과를 도시한다. 도 6a는 양쪽 이미지 (최상부 패널) 및 MRI 횡단면 (최하부 패널)로 0 일째 및 2 일째에 쥬비덤(하부 우측 주사)와 비교하여 예비-형성된 복합재료 (하부 좌측 주사)의 이미지를 도시한다. 도 6b는 쥬비덤® 볼루마 XC® (좌측 쌍), 울트라 플러스(ULTRA PLUS) XC® (중앙 쌍) 및 LS 비드 (우측 쌍)의 0 일째 (좌측 막대) 및 2 일째 (우측 막대)에서 팽윤 효과의 쌍별 그래프 비교를 도시한다. 도 6c는 LS-9 비드화된 복합재료가 절차후 팽윤을 제한하고 숙주 조직 내부성장을 최대화함으로써 비교가능한 시장으로부터 자체를 차별화함을 보여주는 그래프이다.
도 7은 주사가능한 연조직에 대하여 강직성 (도 7a) 및 tan 델타 (도 7b)를 도시하는 2개의 그래프이다 (에너지 손실과 저장 사이 균형을 정량화한다. 탄성률 또는 점도와 무관하게, 더 높은 Tan δ는 더욱 액체형 특성을 나타내는 반면, 더 낮은 tan δ는 더욱 고체형 특성을 제안한다). 도 7c는 천연 인간 지방 (최하부 좌측)과 복합재료 (최상부 좌측)의 비교를 보여주는 3개의 이미지이다. 2개의 재료는 우측 패널에서 나란히 도시된다.
도 8은 합성 연조직 재생을 위한 방법을 도시한다. 도 8a는 토끼 모델내 서혜 지방 패드에서 결손부를 형성시키기 위한 일반 절차를 도시한다. 도 8b는 POD 14에서 상이한 이식편 기질 (150-Pa 복합재료, 150-Pa 하이드로겔, 및 80-Pa 하이드로겔) 속에 숙주 혈관 침윤을 도시한다. 내피 세포는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다. 스케일 바: 100 μm.
도 9는 LS 복합재료를 사용하여 지방 조직 전달을 도시하는 몇몇 이미지이다. 도 9a는 본 발명의 (좌측) 조합된 복합재료 기질 및 지방흡인제를 1:1 비로, 그리고 (우측) 지방흡인제 단독을 도시한다. 도 9b-c는, 적색 및 맥관구조에 의해 확인된, 거시적으로 개선된 혈관신생, (도 9b); 및 100% 지방 그룹에 비교하여 50% 지방: 50% 복합재료 그룹으로 CD31 염색에 의해 미시적으로 개선된 혈관신생 (도 9c)를 도시한다. 내피 세포는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다.
도 10은 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)로 씨딩된 LS 복합재료 및 LS 비드화된 제형 도처에서의 hMSC의 증식을 도시하는 몇몇 이미지이다. 도 10a는 96-웰 현탁 플레이트를 사용하여 밤새 hMSC로 씨딩된 LS-14의 공촛점 현미경검사 이미지를 도시한다. LS 비드로 세포의 밤새 배양은 주로 세포의 표면 코팅된 층을 산출하였다. LS 비드는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다. 도 10b는 LS 비드 및 세포 씨딩 프로토콜의 생성을 위한 개략도를 도시한다. 벌크 하이드로겔-섬유 복합재료는 250-μm 체 메시를 통해 압출되었고, 수집되었고 체에 두번째 통과되어 대략 50-300 μm 직경 입자를 생성하였다. 도 10b는 상이한 웰 플레이트를 사용하는 것이 LS 비드에서 세포의 분포에 얼마나 영향을 미치는지를 추가로 도시한다. 도 10c는 세포 씨딩에 대한 12-웰 스피너 마운트(spinner mount)이다. 도 10d는 12-웰 마운트된 스피너 플라스크를 사용하여 밤새 hMSC로 씨딩된 LS-14의 공촛점 현미경검사 이미지를 도시한다. 12-웰 마운트된 스피너 플라스크를 사용하는 것 (도 10d)은 세포의 더욱 균일한 분포를 허용하고 세포가 미립자의 다공성 스캐폴드를 상호관통하게 한다. LS 비드는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다. hMSC가 LS 비드에 부착하였고 형태 불규칙을 따라 형태론을 채택하였다는 것이 도 10d로부터 명백하다. 도 10d는 hMSC의 액틴 필라멘트가 하이드로겔 내에서 섬유 성분의 축을 따라 공-국재화한다는 것을 증명한다.
도 10e는 2-D 세포 배양물을 형성하기 위해 LS 마이크로비드에서 hMSC의 증식을 도시한다. 도 10e(a)는 200rpm 진탕기의 현탁 웰에서 특정한 기간 (3 일, 6 일, 및 12 일) 동안 hMSC로 배양된 LS-14의 공촛점 현미경검사 이미지를 도시한다. LS 비드는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다. LS 복합 마이크로비드 도처에 경시적으로 hMSC의 증식은 도 10e(a)에서 명확하게 관찰되었다. 도 10e(b)는 부착 시점에 (0 일째) LS 비드에서 hMSC의 수 그리고 증식 후 (1, 3, 12 일째) LS 비드에서 hMSC의 수를 도시하는 그래프이다. 세포의 정량화는 이미지 분석을 통해 수행되었다. 이미지 정량화로부터 측정은 공촛점 현미경검사를 통해 미립자-hMSC (50+ 입자)를 개별적으로 이미지화함 그리고 전체 구조를 통해 z-스택킹함으로써 결정되었다. 입자의 부피는 총 z-스택 두께로 곱셈된 입자의 면적의 ImageJ 분석에 의해 결정되었다. 이것은 세포 정량화의 도면에서 제시되었던 세포/부피 측정을 초래하였다. 비드의 다공성 특성으로 인한 증가된 표면적은 도 10e(b)에서 보여진 바와 같이 비드의 코어 속에 그리고 미세담체의 표면에서 둘 모두 hMSC가 성장하게 한다. RGD 펩타이드의 첨가는 hMSC의 세포 접착을 개선하는 것으로 관찰되었고 입자에서 세포의 감소된 배가 시간이 허용되었다. 도 10e(b)는 부착 시점에 (0 일째) LS 비드에서 hMSC의 수 그리고 증식 후 (1, 3, 12 일째) LS 비드에서 hMSC의 수를 도시하는 그래프이다.
도 10f는 POD 28에서 MI-유도된 랫트 심장 심근 속에 주사된 3 일 동안 배양된 AD-hMSC (지방-유래된 hMSC)가 있는 LS-14의 공촛점 현미경검사 이미지를 도시한다. LS-14/hMSC 비드는 양성 GS4-이소렉틴 B4 염색을 통한 혈관 침윤 및 숙주 조직에 의한 높은 세포성 침윤을 나타냈다. 도 10g는 POD 28에서 주사된 마이크로비드 LS-14, LS-14+hMSC, 및 PBS 완충액이 있는 랫트 MI-모델을 도시한다 (최상부 이미지: 메이슨 트리크롬, 최하부 이미지: H&E). 4 주 수술후 및 치료에서, 랫트 심근은 심근 벽 온전함을 추가로 개선하는 hMSC 첨가로 감소된 흉터 조직 형성 및 콜라겐 침착을 나타낸다. 도 10h는 POD 72에서 랫트의 피하 공간 속에 주사된 3 일 동안 배양된 hMSC (LS-14/hMSC)가 있는 LS-14의 공촛점 현미경검사 이미지를 도시한다. 세포성 침윤이 POD72에서 주사된 재료의 코어 속에 완전 회복을 보여주지 않는 반면, 숙주 조직과 이식편 사이의 계면은 그 영역에서 양성 RECA-1 (내피 세포) 염색 및 강건한 세포 성장을 나타낸다.
도 10i는 랫트 피하 주사 (주사 부피: 200 μL)에 대하여 부피 유지를 도시하는 그래프이다. MRI 측정을 통해, 재료의 부피 유지는 각 슬라이스에 주사된 재료의 면적을 측정함으로써 정량화되었다. 도 10i는 G1 (배양된 7 일, LS-14/hMSC, RGD 접착 펩타이드 있음), G2 (배양된 1 일, LS-14/hMSC, RGD 접착 펩타이드 있음), G3 (배양된 0 일, LS-14/hMSC 제자리, RGD 접착 펩타이드 있음), G4 (배양된 7 일, LS-14/hMSC 무 펩타이드), G5 (LS-14만)에 대하여 POD 72에서 부피 유지를 증명한다.
도 10j는 LS-5의 주사 후 POD 13 주에 랫트 모델내 (H&E-염색된) 조직학적 분석을 도시한다. 세포의 성장/침윤 패턴이 기저 비드 형태론을 재현한다는 것이 명확하게 관찰된다.
도 11은 비드화된 복합재료의 동결건조된 형태의 발달을 묘사한다. 도 11a-c는 LS 비드화된 복합재료의 광학 현미경검사 이미지를 도시한다. HA-Ac, 나노섬유, 및 5k 2-아암 PEGSH는 PBS에서 제형화되고 밤새 반응된다. 도 11a는 밤새 반응 전 복합재료의 이미지이고 ("예비-비드화"); 도 11b는 비드 형성 후 복합재료의 이미지이고 ("비드"); 도 11c는 동결건조 및 재수화 후 복합재료의 이미지이다 ("동결건조-후"). 도 11d는, 벌크 복합재료에 비교된 비드화된 복합재료의 증가된 안정성을 증명하는, 11a-11c의 각각에 대하여 전단 저장 탄성률의 측정을 도시하는 그래프이다.
도 12는 개선된 동결건조 공정의 예비-비드화, 비드화된, 및 동결건조후 샘플에 대하여 전단 탄성률 (도 12a) 및 압축 탄성률 (도 12b)를 도시하는 2개의 그래프이다.
도 13은 저장성 제형을 사용하여 동결건조 방법의 발달을 도시하는 일련의 그래프이다. 도 13a는 비드화 전, 비드화 후, 당류 용액에서 동결건조된, PBS에서 동결건조된 것을 포함하는 250-㎛ 복합재료 비드 샘플에 대한 저장 탄성률을 도시한다. 도 13b는 비드화 후 전단 탄성률을 도시한다. 도 13c는 250-㎛ 및 150-㎛ 비드의 비드화 후 tan 델타를 도시한다. 도 13d는, 본 명세서에 기재된 복합재료를 포함하는, 상업적 제형의 더 낮은 tan 델타에서 추세를 도시한다.
도 14는 LS 복합재료에 대하여 비드 크기 및 섬유 길이 특성규명 데이터를 제공한다. 도 14a는 비드 직경 (평균=209.4±62.3μm, 중앙=210μm, n=51)의 히스토그램이다. 비드의 직경은 공촛점 현미경 이미지 하에서 입자의 최장축을 따라 측정되었다. 도 14b는 75um 체 (좌측), 150μm 체 (중간), 250μm 체 (우측)을 이용한 비드의 현미경검사 이미지이다. 도 14b는 입자 내에서 최장축을 측정함으로써 크기 ~75μm, ~150μm 및 ~200μm의 비드를 증명한다. 추가로 특성규명된 비드 분포는 더욱 일관된 측정을 위하여 에지 검출을 사용할 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수행되었다. 도 14c는 그들의 비드 크기에 따라 복합재료의 주사가능성을 사정하기 위해 특정한 압력 하에서 변위를 도시하는 주사력 곡선이다. 150 μm 및 75 μm 비드로 충전된 주사기는 MTS Criterion 43 기계 테스터에 부착된 주사기 정착물 (Instron)에 장입되었다. 겔은 1mm/초의 크로스헤드 스피드로 27게이지 바늘 (1/2" 길이, BD)를 통해 주사기 밖으로 주사되었다. 150-μm 및 75-μm 그룹 양쪽은 허용가능한 주사 프로파일을 초래하였다.
도 14d는 하이드로겔 도처에 분산된 섬유의 길이 분포 (평균=110.4±85.5μm, 범위=12-442 μm, n=108)을 도시한다.
도 14e는 하이드로겔 도처에 분산된 최초 Good Manufacturing Protocol (GMP) (롯트 0001-0025) 운용으로부터 섬유의 길이 분포 (평균=30.1± 26.9 μm, 범위=2.5-205.0 μm, n=993)을 도시한다.
도 15는 LS-14/hMSC (배양된 3 일)의 주사 후 POD 30에 토끼에서 조직학적 분석을 도시하는 2개 이미지이다. 도 15a, LS-14/hMSC (배양된 3 일)의 주사 후 POD 30에 토끼 지방 패드에서 H&E (좌측) 및 메이슨 트리크롬 (우측)은 강건한 조직 및 세포성 침윤을 도시한다. 도 15b, LS-14/hMSC (배양된 3 일)의 주사 후 POD 30에 토끼 피하 공간에서 H&E (좌측) 및 메이슨 트리크롬 (우측)은 중간정도의 조직 및 세포성 침윤을 도시한다.
도 16은 시험관내 지방 이식편 생존을 향상시키기 위해 복합재료의 능력을 증명하는 일련의 이미지를 도시한다. 도 16a (상)는 금형에서 24 시간 겔형성 기간 후 지방흡인제 (F) 대 복합재료 (C) 또는 하이드로겔 (H)의 상이한 비를 도시한다. 100% 지방흡인제 (100F), 50% 복합재료 대 50% 지방흡인제 (50C), 25% 복합재료 대 75% 지방흡인제 (25C), 및 100% 하이드로겔 (100H). 백분율 비는 지방흡인제 (F) 대 복합재료 (C) 또는 하이드로겔 (H)의 부피 비에 기반하여 계산되었다. 도 16a (하)는 G2 Ares 유량계에서 시험된 샘플을 증명한다. 도 16b는 유동적 분석을 통해 지방흡인제 (F) 대 복합재료 (C) 또는 하이드로겔 (H)의 상이한 비의 기계적 특성을 도시한다. 도 16b (좌측)은 각 샘플 그룹의 대표적 스트레인 스위프(Strain Sweep)이다. 도 16b에 대한 샘플 그룹 (좌측 및 우측)은 100% 지방흡인제 (100F), 100% 복합재료 (100C), 50% 복합재료 (50C), 25% 복합재료 (25C), 50% 하이드로겔 (50H), 및 100% 하이드로겔 (100H)로서 선택되었다. 백분율 비는 지방흡인제 (F) 대 복합재료 (C) 또는 하이드로겔 (H)의 부피 비에 기반하여 계산되었다. 도 16b (우측)은 각 샘플 그룹에 대하여 평균 전단 탄성률 (G')를 도시한다.
도 16c는 상이한 지방흡인제, 복합재료, 또는 하이드로겔 조합을 이용한 알라마 블루(Alamar Blue) 검정의 결과를 도시한다. 알라마 블루 검정은 0, 1, 2, 3, 및 7 일째에 세포 생존의 상대적 양을 정량화하는데 사용되었다. 결과는, 1 일째에 수득된 것들에 정상화되는 값으로, 7 일의 기간 동안 백분율 지방세포 세포 생존으로서 도시된다. 지방흡인제와 비교하여, 모든 다른 그룹은 생존하는 세포의 상당히 더 높은 백분율을 가졌다 (p 값 < 0.05).
도 16d는 지방흡인제 (F) 및 복합재료 (C)의 가변하는 비의 면역조직화학 (IHC) 분석을 도시한다. 섬유는 F8BT로 표지화되었고 IHC를 위하여 지방흡인제와 조합되었다. 샘플은 (적색으로 도시된) 형태론을 사정하기 위해 페리리핀에 대하여 염색되었다. 지방세포는 보존된 세포성 건축물을 증명하였다. DAPI 염색은 (청색으로 도시된) 세포 핵을 증명한다. 스케일 바 = 100 μm. 세포성 수준으로, LS 복합재료는 지방흡인제와 조합된 경우 (녹색으로 도시된) 균질 통합을 나타냈다. 섬유는 양쪽 복합재료-함유 그룹 (50C 및 25C)에서 균질하게 분산된 것처럼 보이고, 100% 지방흡인제 샘플과 비교된 경우, 페리리핀에 대한 염색에서 기반하여, 역으로 지방세포 형태론을 변경시키지 않는다.
도 17은 생체내 혈관 내부성장 및 지방 이식편 부피 유지의 면에서 지방흡인제 (F) 및 복합재료 (C)의 가변하는 비의 능력을 사정하는 일련의 이미지를 도시한다. 도 17에 대하여 샘플 그룹은 100% 지방흡인제 (100F), 100% 복합재료 (100C), 50% 복합재료 (50C), 25% 복합재료 (25C), 및 50% 하이드로겔 (50H)로서 선택되었다. 백분율 비는 지방흡인제 (F) 대 복합재료 (C) 또는 하이드로겔 (H)의 부피 비에 기반하여 계산되었다. 도 17a는 각 샘플 그룹에 대하여 MRI (자기 공명 영상) 부피측정 분석으로부터 결과를 증명한다. 부피 유지를 위하여, 25C 그룹은 POD 84 시점에 최상의 결과를 산출하였다 (도 17a). 모든 그룹은 이식편의 본래 이식된 부피의 상당한 양을 손실하였지만, 25C는 유지된 가장 높은 부피로 표시되었다. 100C는 POD 84에서 가장 불량한 부피 유지를 가져, 복합재료 단독이 지방 조직에 대하여 충분한 대체로서 작용하지 않고 지방 이식에 대한 지원 부속물로서 작용할 수 있을 뿐이라는 것을 증명한다.
도 17b는 형태 유지 분석의 결과를 도시한다. 최대 이식편 높이는 POD 2 및 POD 84에서 측정되었고 높이에서 퍼센트 차이는 계산되었다. 이식편은 경시적으로 평평해질 수 있지만 유사한 전체적 부피를 여전히 유지할 수 있다. 이러한 이유로, 최대 이식편 높이는 형태 유지를 위한 마커로서 채택되었다. 100F 및 25C는 최대 이식편 높이에서 최소 변화를 가져서, 최상의 형태 유지를 제안하였다. 50C, 50H, 및 100C는 참고로서 100F와 비교하여 상당히 더 불량한 형태 유지를 가졌다. 부피측정 분석 및 형태 유지 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 맹검된 조사자에 의해 수행되었다. 형태 유지가 재료의 기능에 중요한 것은, 자가 지방 이식의 주목적이 연조직 결손에 대한 충전재로서 작용하는 것이기 때문이다.
도 17c는 POD7에서 페리리핀에 대하여 IHC 분석 염색의 결과를 도시한다. 스케일 바: 100 μm. POD7에서 페리리핀에 대하여 IHC 염색은 모든 그룹에 걸쳐 보존된 지방세포 형태론을 증명한다 (도 17c). 도 17d는 POD28에서 페리리핀에 대하여 IHC 분석 염색의 결과를 도시한다. 스케일 바: 100 μm. 도 17d는 25C 샘플이 다른 샘플과 비교하여 가장 완전히 보존된 지방세포 구조를 갖는다는 것을 증명한다. 섬유가 또한 생체내 셋팅에서 균질하게 분산하였고 조직과 잘 통합하는 것이 또한 보여진다.
도 17e는 POD7에서 CD31에 대하여 IHC 분석 염색의 결과를 도시한다. 스케일 바: 100 μm. CD31 염색에 대하여 IHC 결과는 경시적으로 혈관질에서의 변화를 명확하게 증명한다. POD 7에서, 제한된 혈관화는 모든 그룹에 걸쳐 관찰된다 (도 17e). 하지만, 이 시점에서 다른 그룹에 대해 비교된 경우 25C 그룹 내에서 존재하는 적어도 미미하게 더 큰, 더 강건한 혈관이 있는 것처럼 보였다. 도 17f는 POD28에서 CD31에 대하여 IHC 분석 염색의 결과를 도시한다. 스케일 바: 100 μm. 복합재료를 함유하는 모든 샘플 그룹 (25C, 50C, 및 100C)는 POD28 시점에서 상당히 발달된 혈관을 갖는다 (도 17f). 대조로, 100F 및 50H 그룹은 CD 31에 대하여 강건한 염색을 보여주지 않아서, 혈관신생의 열악한 비율을 제안한다. 충분한 혈액 공급은 이식편 생존에 필수적이고, 이는 복합재료-함유 그룹이 부피 유지의 최고 비율을 갖는 이유를 설명하는데 도울 수 있다.
도 17g는 MicroFil 관류 이어서 VivoQuant 소프트웨어 분석을 사용하여 POD 84 이식편의 3-D CT (전산화된 단층촬영) 재구성 이미지로 구성된다. 괄호로 도시된 총 이식편 부피의 백분율로서 각 이식편의 혈관질.
도 17g에서 도시된 3D 이미지는 복합재료를 함유하는 이식편이 100F 또는 50H 이식편보다 극적으로 더 양호하게 혈관화되는 것을 증명한다. 25C는 총 이식편 부피에 비해 혈관의 최고 백분율을 가져, 다른 표본에 비교된 혈관질의 더 우수한 수준을 나타낸다.
상세한 설명
하기 상세한 설명은 예로써 주어진 것으로, 기재된 특정 구현예로만 본 발명을 제한하려는 것은 아니며, 첨부 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
본 발명은 연조직의 재구성 방법에서 사용을 위하여 하이드로겔 및 나노구조물을 포함하는 예비-반응된, 비드화된 복합 재료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미용, 재건, 및 세포 요법에 대하여 세포 및 조직 전달을 위한 비드화된 복합 재료를 포함하는 연조직 기기에 관한 것이다.
본 발명은 또한 비제한적으로 지방세포, 다른 중간엽 세포, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 특이적 조직 구성요소를 동원, 포착, 캡슐화, 회합, 및/또는 매립할 수 있는 복합 재료에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 비제한적으로 지방 조직을 포함하는 특이적 조직을 동원, 포착, 캡슐화, 회합, 및/또는 매립할 수 있는 복합 재료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생분해성 섬유에 공유결합된 생체재료를 포함하는 스캐폴드 복합체 (예컨대 연조직 기기)를 포함하는 조성물을 사용하는 연조직 부상의 복구 또는 재구성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다른 양태에서 또한 조성물이 하이드로겔 및 그안에 배치된 나노구조물을 포함하는 연조직 재구성에서 사용을 위하여 조성물의 제작 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특정 양태에서 또한 미용적, 재구성적, 및 세포성 요법에 대하여 세포 및 조직 전달에서 사용을 위하여 조성물의 제작 방법에 관한 것이다.
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하기 용어들은, 달리 명시되지 않는 한, 아래 그들에 부여된 의미를 가질 수 있다. 하지만, 당업자에 의해 공지되거나 이해되는 다른 의미가 또한 가능하고, 본 발명의 범위내인 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참고로 편입된다. 대립의 경우에, 정의를 포함하는, 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 실례적일 뿐이고 제한되기 위한 것은 아니다.
정의
용어 "한" 및 "하나"는 관사의 문법적 목적어의 1개 또는 1개 초과 (즉, 적어도 1개)를 지칭한다. 예로써, "하나의 요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약"은, 당업자에 의해 공지되거나 공지가능한 그리고 상황에 따라, 플러스 또는 마이너스 1 미만 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 또는 30 퍼센트 초과를 의미할 수 있다.
여기 본 명세서에 사용된 바와 같이 "대상체" 또는 "대상체들" 또는 "개체들"은, 비제한적으로, 포유동물 예컨대 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들면, 사육, 농업 또는 야생, 동물, 뿐만 아니라 조류, 및 수생 동물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 재료"는 생물학적으로 활성인, 즉 살아있는 조직, 기관 또는 유기체에서 통계상 유의미한 생물학적 반응을 유도하는 임의의 유기 또는 무기 제제를 지칭한다. 생물학적 활성 제제는 의약, 펩타이드, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 DNA 및 RNA일 수 있다. 소화/대사, 혈액 및 응고, 심장혈관, 피부과, 비뇨생식기, 호르몬, 면역학, 감염, 암, 근골격, 신경학, 기생성, 안과, 호흡 및 감각 같은 치료 영역에서 질환의 치료를 위한 제제일 수 있다. 이는 추가로 골다공증, 간질, 파킨슨병, 통증 및 인지 기능장애 같은 질환의 치료를 위한 것일 수 있다. 이는 호르몬 기능장애 질환의 치료 또는 호르몬 치료를 위한 예를 들면 피임, 호르몬 대체 요법 또는 스테로이드성 호르몬을 이용한 치료를 위한 제제일 수 있다. 이는 추가로 제제 예컨대 항생 또는 항바이러스, 항-염증, 신경보호, 예방적 백신, 기억 증강제, 진통 (또는 진통 조합), 면역억제, 항당뇨 또는 항바이러스 제제일 수 있다. 이는 항천식제, 항경련제, 항울제, 항당뇨제, 또는 항종양제일 수 있다. 이는 항정신병제, 진경제, 항콜린제, 교감신경흥분제, 항부정맥제, 항고혈압제, 또는 이뇨제일 수 있다. 이는 통증 완화 또는 진정을 위한 제제일 수 있다. 이는 또한 인지 기능장애에 대한 약물 또는 진정제일 수 있다. 제제는 자유 산 또는 염기 형태, 염 또는 중성 화합물일 수 있다. 이는 펩타이드, 예를 들면 레보도파; 또는 항체 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드, 가용성 이온 또는 염일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "스캐폴드 복합체"는 2개 성분: 중합체성 섬유 및 하이드로겔 재료의 임의의 공유 회합을 포함한다. 스캐폴드 복합체는, 성분들 사이 상호작용이 화학적, 생화학적, 생물물리학적, 물리적, 또는 생리학적 이익을 초래하는 것을 의미하는, "기능적 네트워크"에서 중합체성 섬유 및 하이드로겔 재료를 함유한다. 또한, 기능적 네트워크는, 세포, 생물학적 재료 (예를 들면, 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 탄수화물), 치료적 화합물, 합성 분자, 및 기타 등등을 포함하는, 추가의 성분을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 스캐폴드 복합체는 인간 대상체에서 존재하는 표적 조직 속에 이식된 경우 조직 성장 및 세포 침윤을 촉진시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은 "겔"의 일 유형이고, 탄성 겔을 형성하기 위해 물의 실질적 양 (예를 들면, 비-물 분자의 유닛당 50%, 60% 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과)을 흡수할 수 있는 공유 또는 비-공유 가교에 의해 함께 유지된 거대분자 (예를 들면, 친수성 중합체, 소수성 중합체, 이들의 블랜드)의 3차원 네트워크로 이루어지는 수팽윤성 중합체성 기질을 지칭한다. 중합체성 기질은 임의의 적합한 합성 또는 자연 발생 중합체 재료로 형성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "겔"은 액체 매질의 부피에 미치고 표면 장력 효과를 통해 이것을 빠지게 하는 고체 3차원 네트워크를 지칭한다. 이러한 내부 네트워크 구조물은 물리적 결합 (물리적 겔) 또는 화학적 결합 (화학적 겔), 뿐만 아니라 확장 유체 내에서 온전히 남아있는 미소결정 또는 다른 접합부에서 비롯될 수 있다. 사실상 임의의 유체는 물 (하이드로겔), 오일, 및 에어 (에어로겔)을 포함하는 확장제로서 사용될 수 있다. 양쪽 중량 및 부피 기준으로, 겔은 조성물에서 주로 유체이고 따라서 그들의 구성하는 액체의 것들과 유사한 밀도를 나타낸다. 하이드로겔은 액체 매질로서 물을 사용하는 겔의 한 유형이다.
"소수성" 및 "친수성" 중합체의 정의는 100% 상대 습도에서 중합체에 의해 흡수된 수증기의 양을 기준으로 한다. 이러한 분류화에 따르면, 소수성 중합체는 100% 상대 습도 ("rh")에 단지 최대 1% 물을 흡수하는 반면, 적당히 친수성 중합체는 1-10% 물을 흡수하고, 친수성 중합체는 10% 초과의 물을 흡수할 수 있고, 흡습성 중합체는 20% 초과의 물을 흡수한다. "수팽윤성" 중합체는, 수성 매질에 담금시, 이의 자체 중량의 적어도 50% 초과의 물의 양을 흡수하는 것이다.
본 명세서에 용어 "가교된"은, 공유 또는 비공유 결합을 통해 발생하든, 분자내 및/또는 분자간 크로스링크를 함유하는 조성물을 지칭하고, 직접적일 수 있거나 가교제를 포함할 수 있다. "비공유" 결합은 수소 결합 및 정전기 (이온) 결합 둘 모두를 포함한다.
용어 "중합체"는 선형 및 분지형 중합체 구조를 포함하고, 또한 (가교될 수 있거나 아닐 수 있는) 가교된 중합체 뿐만 아니라 공중합체를 포괄하고, 따라서 블록 공중합체, 교대 공중합체, 랜덤 공중합체, 및 기타 등등을 포함한다. "올리고머"로서 본 명세서에 지칭된 그들 화합물은 약 1000 Da 미만, 바람직하게는 약 800 Da 미만 분자량을 가지고 있는 중합체이다. 중합체 및 올리고머는 자연 발생일 수 있거나 합성 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로비드"는 최장 치수에서 300 ㎛ 미만의 본 발명 재료의 입자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가공된 조직 세포외 기질"은 동물 대상체, 바람직하게는 인간으로부터 취득된, 그리고 세포를 소독 및 제거하기 위해 가공된 세포외 기질 (ECM)을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "생체재료"는 생물학적 시스템과 상호작용하도록 조작된 유기 재료를 의미한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 생체재료는 하이드로겔이다. 일부 구현예에서, 생체재료는 박테리아로 유래된 히알루론산이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "생분해성"은 대상체에서 생물학적 수단에 의해 파괴될 수 있는 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "저장 탄성률"은 얼마나 재료가 변형 또는 응력에 반응하는지를 실례하는 동적 탄성률의 탄성 성분의 측정을 정의하는데 사용된다. 한 구현예에서, "변형"은 인가된 힘으로 인한 물체의 형태 또는 크기의 변화를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, G로 표시된, 강성의 탄성률로서 또한 공지된 용어 "전단 탄성률"은 전단 응력 대 전단 변형의 비로서 정의된다. 한 구현예에서, "전단 응력"은 재료 횡단면과 동일 평면상의 응력의 성분을 의미한다. 한 구현예에서, "전단 변형"은 재료 횡단면에 수직인 힘을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이식가능한"은 대상체에게 주사기를 통한 이식화를 위하여 제형화될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "연조직"은 바디의 다른 구조물 및 기관을 연결, 지원, 또는 둘러싸는 조직을 지칭한다. 연조직은 근육, 힘줄, 인대, 근막, 신경, 섬유성 조직, 지방, 혈관, 및 활막을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "안정한"은 실온에서 분해하지 않는 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "지방흡인제"는 지방흡입술에 의해 제거된 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 개체속에 나중에 재-도입되는 것에 동일한 개체로부터 유래되는 임의의 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이계" 또는, 대안적으로, "동종"은 재료가 도입되는 것에 개체로서 상이한 환자 또는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "동결건조된"은, 초저온에서, 진공 하에, 재료의 1차 냉동 및 이후 그의 건조를 포함하는, 재료로부터 물을 제거함으로써 재료 보존에 사용된 공정인, 동결건조를 진행한 후 재료를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능화된"은 이와 연관된 기능적 화학적 모이어티를 갖기 위해 균일하게 또는 비-균일하게 변형되는 (예를 들면, 화학적으로 변형되는) 재료를 지칭한다. 일부 경우에, 기능적 화학적 모이어티는 공유 또는 비-공유 결합의 형성을 허용하기 위해 반응할 수 있다. 일부 경우에, 기능적 화학적 모이어티는 재료에 개선된 특성을 제공할 수 있다.
연조직 재건
종양 박멸, 외상, 노화, 또는 선천성 기형으로부터 굉장한 연조직 손실은 매년 수백만의 사람들에 영향을 미친다. 피부, 지방, 및 근육을 포함하는 조직의 손실은 종래의 수단으로 치료하기 어려운 주요 기능적 및 심미적 훼방을 초래한다. 예로서, 300,000 이상의 부분 유방절제술은 매년 미국에서 수행되어, 유방 연조직의 손실로부터 훼손 가슴 흉터를 초래한다. 연조직 회복을 위한 기존의 옵션은 상당한 결점이 있다. 자가 조직 플랩이 공여체-부위 결손부를 떠나는 매우 긴 수술 절차에서 바디의 또 다른 부분으로부터 연조직 이동을 요구한다 LoTempio 2010. Plastic and Reconstructive Surgery, 126(2), 393-401; Patel 2012. Annals of Plastic Surgery, 69(2), 139-144}. 보철 임플란트는 섬유화 및 캡슐화를 초래하는 외래-바디 반응이 일어나기 쉽다 {Calobrace 2014 Plastic and Reconstructive Surgery, 134(1 Suppl), 6S-11; Tsoi 2014. Plastic and Reconstructive Surgery, 133(2), 234-249}. 지방흡입술 동안 수확된 지방세포의 배치를 포함하는 지방 이식은 작은 부피로 제한되고 불량한 이식편 생존에 의해 저해된다 {Kakagia 2014 Surgical Innovation, 21(3), 327-336; Largo 2014 British Journal of Plastic Surgery, 67(4), 437-448}.
마지막으로, 주사가능한 하이드로겔 연조직 충전재는 사용될 수 있지만, 이들은 더 작은 결손부에만 적합하다. 하지만, 기존의 충전재에 의해 제공된 부피 회복은 일시적이다 {Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049; Varma 2014 Acta Biomaterialia, 10(12), 4996-5004}. 노화-관련된 심미적 결손부에 해법을 제공할 수 있는 장기지속적 충전재를 제공할 필요가 종래 기술에 있다. 새로운 세대의 조직 공학 해법은 재건 부위에서 연조직 예컨대 지방 조직을 재생하기 위한 템플레이트로서 하이드로겔 스캐폴드 이용에 집중하도록 제안되어 왔다.
연조직 재건에 대한 현행 조직 공학 접근책
지방-유래 줄기 세포 (ASC)는 연조직 결손부를 둘러싸는 상처 층에서 확인되어 왔다 {Salibian 2013 Archives of plastic surgery 40.6: 666-675}. 이들은, 적합한 기질 미세환경으로 지원된 경우, 연조직 예컨대 지방으로 분화될 수 있다. 그러므로 기능적 재료로 복구 부위를 충전하는 전략은 표준 외과 실무를 사용하여 용이하게 수득가능한 지방흡입술 흡인제에서 존재하는 다른 중간엽 세포 및/또는 ASC를 사용하여 또는 내인성 ASC를 사용하여 신 조직의 재생을 가능하게 할 잠재력을 갖는다. 하이드로겔은, 연조직의 것들과 유사한, 그들의 3차원 (3D) 성질 및 탄성 특성으로 인해 조직 결손부의 재생을 위한 스캐폴드 기질로서 널리 연구되어 왔다. 다양한 방법은 주위 조직으로부터 물리적 응력에 대해 그들의 부피 및 형태를 유지하면서 천연 지방 조직의 것과 유사한 탄성률 (~2 kPa)를 가진 하이드로겔 스캐폴드를 생성하는데 사용되어 왔다 {Alkhouli 2013 American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism, 305(12), E1427-35; Sommer 2013 Acta biomaterialia 9.11 (2013): 9036-9048}. 이것은, 낮은 세포성 침윤 및 불량 재생을 초래하는, 더 높은 가교 밀도 및 더 작은 평균 기공 크기를 요구한다 {Ryu 2011 Biomacromolecules 12.7 (2011): 2653-2659; Khetan 2013 Nature Materials, 12(5), 458-465; Li 2014 Journal of Neurotrauma, 31(16), 1431-1438}. 하이드로겔 스캐폴드가 세포성 침윤을 촉진시키는 능력은 성공적인 연조직 회복의 핵심이다. 혈관 침윤의 부족은 대형-부피 지방 이식 및 다른 조직 공학 시도 실패의 원인이다. 현재 이용가능한 재료는 연조직을 재생하기 위해 초기 혈관화 및 ASC 분화를 촉진시키면서 연조직 결손부에서 손실된 부피를 충전시킬 수 없다.
하이드로겔 기질
다양한 방법은 천연 지방 조직의 것 (150 내지 500 Pa)과 유사한 전단 저장 탄성률 (G')을 가진 하이드로겔 충전재를 생성하기 위해 사용되어 왔고, 그래서 이들은 주위 조직으로부터 물리적 응력에 대해 그들의 독특한 부피 및 형태를 유지할 수 있다. 현재까지, 이들 회복성 구조 특성은 하이드로겔 네트워크에서 높은 가교 밀도 및 작은 평균 기공 크기의 비용으로 달성되어 와서, 제한된 세포성 침윤 및 결국 불량 재생을 초래한다.
임플란트 재료의 다공률 및 기공 크기는 대식세포 침윤 및 활동에서 그들의 효과 때문에 숙주 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 연구는 스캐폴드의 기계적 특성 및 기공 특성에 의해 유발된 대식세포의 기울어진 분극화가 섬유증 및 흉터 형성 (M1 대식세포-우세 반응) 대 혈관신생 및 기질 리모델링 (M2 대식세포-우세 반응)의 정도에 영향을 미칠 수 있음을 나타냈다. 다공성 재료는, 비다공성 임플란트와 비교하여, 연조직에서 이식하였고, 대식세포의 프로-재생성 분극을 조절하였고, 혈관신생을 촉진시켰고, 섬유증 및 흉터 형성을 감소시켰다. 그러므로, 하이드로겔 스캐폴드가 세포성 침윤 및 혈관 내부성장을 촉진시키는 능력은 급성 및 만성 염증의 조절, 조직 리모델링, 혈관신생, 및 재생의 촉진, 그리고 장기지속적 연조직 회복의 달성에 핵심이다.
과거 수년에 걸쳐, Li 및 Wen은 줄기 세포 이식법을 위하여 최적화된 기공 크기 및 탄성률 (10 - 100 Pa)를 가진 라미닌-유래 루프 펩타이드 (CCRRIKVAVWLC (서열번호: 1), 10 μM)로 접합된 히알루론산 (HA) 하이드로겔을 개발하였다. 이들은 이러한 하이드로겔이 분화된 세포로부터 신경돌기 발아 및 강건한 신경 줄기 세포 (NSC) 이주를 지원함을 보여주었다 {Li 2014 Journal of Neurotrauma, 31(16), 1431-1438}. 외상성 뇌 손상에 대한 랫트 제어된 피질 부상 (CCI) 모델에서, 이러한 하이드로겔은, CCI 부상 후 3 일째에 주사된 경우, 이식화 후 4 주 내지 6 개월에 병변 부위 (> 10 mm)를 충전하는 중요한 맥관구조 네트워크 형성을 촉진시켰다. 이러한 개선된 혈관신생은 조직-분비된 성장 인자, 특히 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 유지 및 제시하기 위한 이러한 하이드로겔의 능력에 기인되었다. 문헌 보고는 또한 3-10 이당류 유닛의 작은 HA 분해 단편이 내피 세포 증식, 이주, 세관 형성, 및 혈관신생의 잠재적 조절제임을 드러냈다 {Slevin 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(43), 41046-41059}. 최근 연구에서, CCI 부상 후 뇌 병변 부위에서 인간 태아 조직 유래된-NSC 구상체를 전달하기 위한 이러한 HA 하이드로겔의 유효성은 시험되었다. 이러한 HA 하이드로겔은 이식법에 따라 스캐폴드 기질 내부에서 강건한 혈관 형성을 전달하였다. 재생된 혈관은 병변 속에 성장하였고 이식된 기질을 관통하였고, 뉴런 전구체 생존 및 성장을 지원하였다. 이들 결과는 숙주 혈관 내부성장의 촉진에서 이러한 최적화된 HA 하이드로겔 조성물의 독특한 능력을 확인하였다. 더욱 중요하게, 하이드로겔 기질은 하이드로겔 기질 내부에서 강건한 세포 이주를 허용하기 위해 충분히 다공성이다. 하지만, 연조직 재건을 위하여 직접적으로 이러한 HA 하이드로겔을 사용하는 것은, 이의 기계적 특성이 이식법 부위의 통합성을 유지하기 위해 충분히 높지 않기 때문에, 실현가능하지 않고 - 주위 지방 조직이 10배 초과 더 높은 탄성률을 갖는다. 이의 탄성률을 개선하기 위해 가교 밀도를 증가시키는 것은 세포 침윤 및 이주에 대하여 불량한 침투성으로 만들 것이다. 새로운 전략은 벌크 하이드로겔의 평균 기공 크기를 상당히 감소시킴 없이 기계적 특성을 증가시키기 위해 필요하다. 한 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔은, 바람직하게는 박테리아에 의해 생산된, 실질적으로 정제된 히알루론산 (HA)이다.
충분한 다공률 및 강도를 유지하면서, 밀도, 겔 대 섬유의 비, 및 다른 특성이 가변적이도록 제형화된, 중합체성 섬유와 하이드로겔 재료 또는 다른 생체재료를 조합하는 스캐폴드 기질이 제공된다. 가공된 조직 세포외 기질, 예컨대 지방 조직으로부터 유래되고/거나 유래가능한 세포외 기질로부터 단리되고/거나 상기를 함유하는 재료를 포함하는 스캐폴드 기질이 제공된다.
일부 구현예에서, 하이드로겔 재료는 기능화된다. 특정 구현예에서, 하이드로겔 재료는 하이드록실, 아미노, 카복실, 티오, 아크릴레이트, 설포네이트, 포스페이트, 아미드, 뿐만 아니라 이들의 변형된 형태, 예컨대 활성화된 또는 보호된 형태를 포함하는 그룹으로 기능화된다. 바람직한 구현예에서, 하이드로겔 재료는 히알루론산 (HA)를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 하이드로겔 재료는 기능화된 히알루론산 (HA)를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 하이드로겔 재료는 아크릴화된 히알루론산 (HA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하이드로겔 재료는 티올화된 히알루론산 (HA)를 포함한다.
스캐폴드 복합체
예를 들면, 주사 또는 이식화로, 복합체가 투여되는 인간 대상체의 조직 속에 편입되는 의료 기기 사용에 적합한 스캐폴드 복합체가 본 명세서에 제공된다. 스캐폴드 복합체는, 일반적으로 약 10nm 내지 약 10,000 nm, 예컨대 약 100nm 내지 약 8000nm, 또는 약 150nm 내지 약 5,000nm, 또는 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500, 7,000, 7,500, 또는 8,000의 평균 직경을 갖는 중합체성 섬유를 함유한다. 중합체성 섬유는 일반적으로 약 10 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 예컨대 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 ㎛의 평균 길이를 갖는다. 한 구현예에서, 섬유의 길이는 광학 형광 현미경검사를 사용하여 결정된다. 한 구현예에서, 섬유의 길이는 전자 현미경검사를 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 섬유는 기능화된다. 일부 구현예에서, 섬유는 하이드록실, 아미노, 카복실, 티오, 아크릴레이트, 설포네이트, 포스페이트, 말레이미드, 아미드, 뿐만 아니라 이들의 변형된 형태, 예컨대 활성화된 또는 보호된 형태를 포함하는 그룹으로 기능화된다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 중합체성 섬유 대 하이드로겔 재료의 비는 종래 기술에서 공지된 나의 임의의 수단 결정될 수 있다. 예를 들어, 중합체성 섬유 대 하이드로겔 재료의 비는 성분-질량 기준으로 약 1:100 내지 약 100:1, 예컨대 약 1:50 내지 약 50:1, 또는 1:10 내지 약 10:1, 예컨대 1:5 내지 약 5:1, 예컨대 약 1:3 내지 약 3:1이다. 중합체성 섬유 대 하이드로겔 재료의 비는 농도 기준, 예를 들면, 중합체성 섬유의 주어진 중량 / 하이드로겔 재료의 부피로서 또한 제공된다. 예를 들어, 농도는 약 1 내지 50mg/mL이다. 하이드로겔 재료는, 예컨대 중합체 섬유의 외부 표면 (또는 조성물 및 형태에 따라, 외부 표면)에 결합중인, 중합체 섬유에서 일반적으로 배치된다. 스캐폴드 복합체는 일반적으로 균일한 고체 재료가 아니다. 대신, 스캐폴드 복합체는 스캐폴드 복합체의 표면상에 또는 표면 내에서 존재하는 복수의 기공들을 함유한다. 기공의 존재, 크기, 분포, 빈도 및 다른 파라미터는 스캐폴드 복합체의 창출 동안 조절될 수 있다. 기공 크기는, 1, 2, 3, 4 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90 또는 100 ㎛를 포함하는, 약 1 ㎛ 미만 내지 최대 100 ㎛일 수 있고, 이의 크기는, 예를 들면, 기공의 적어도 40%, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과가 원하는 크기이거나 원하는 크기 범위 내에 있도록 협소하게 제작될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드 복합체는 인간 대상체의 조직 내로의 편입에 적합하고, 따라서 이들은, 그안에 및/또는 그때문에 병태생리적 반응 유도 없이 (예컨대 인간 대상체에서 발견된) 생물학적 시스템과 상호작용할 수 있음을 의미하는, 일반적으로 "생체적합성"이다. 일부 구현예에서 스캐폴드 복합체는 조직에서 내구성있게 유지되기 위해 제공된다. 대안적으로, 스캐폴드 복합체는 인간 대상체에서 일시적으로 유지되고 실질적으로 생분해성으로서 제공된다. 바람직하게는, 중합체성 섬유는 생체적합성 생분해성 폴리에스테르를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 중합체성 섬유는 폴리카프로락톤을 함유한다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 중합체 섬유 및 하이드로겔을 함유하는 복합체의 상호작용의 하나의 바람직한 형태는, 예를 들면, 폴리카프로락톤 섬유와 히알루론산 사이의 가교를 유도하기 위해, 중합체 섬유와 하이드로겔 재료 사이에 결합을 도입하는데 효과적인 양으로 일반적으로 존재하는 가교 모이어티를 포함한다.
연조직 회복을 위한 스캐폴드 설계
복합재료 개념은 재료-보강 기전으로서 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, 하이드로겔에 하이드록시아파타이트 입자를 첨가하는 것은 이의 강직성을 증가시킬 수 있고 {Wu 2008 Materials Chemistry and Physics 107.2 (2008): 364-369}, 복합 인장 탄성률은 신장된 입자에 대하여 심지어 더욱 증가한다 {Yusong 2007 Journal of Materials Science, 42(13), 5129-5134}. 전기방사된 나노섬유 메시는 천연 ECM에 대한 그들의 지형적 유사성으로 인해 조직 공학 기체로서 널리 사용되어 왔다. 특히 흥미롭게, 지방 조직의 탈세포화된 ECM은 사실상 고도로 섬유성 및 다공성이다 (도 6g) {Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049}. 몇몇 최근 연구는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리아크릴아미드, 또는 알긴산염 하이드로겔에 단편화된 폴리(락티드) (PLA) 또는 키토산 섬유를 도입함으로써 섬유성 성분 재현을 시도하여 왔다 {Coburn 2011 Smart Structures and Systems, 7(3), 213; #37; Zhou 2011 Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84(1), 155-162; Shin 2015 Journal of Materials Chemistry}. 단편화된 섬유는 하이드로겔 전구체 용액과 혼합되고 겔형성 공정 동안 하이드로겔 속으로 편입되어 3D 건축물을 창출한다. 이들 섬유-매립된 하이드로겔은 상응하는 하이드로겔을 능가하는 개선된 기계적 특성을 나타냈다. 하지만, 생체내 숙주 세포 침윤 시험에 관한 보고는 없었다. 또한, 이들 하이드로겔은 비-분해성이고 지방세포 접착 및 분화를 위한 접착성 리간드를 요구한다.
나노섬유-생체재료 복합재료 설계
하이드로겔 상에서 높은 다공률을 유지하면서 섬유-보강 효과를 달성하기 위해, 다른 스캐폴드와 비교된 경우 우수한 특성을 제공하는 전기방사된 섬유-하이드로겔 복합재료는 제공된다. 이전에 보고된, 나노섬유 및 하이드로겔 기질 블렌딩 외에 {Coburn 2011 Smart Structures and Systems, 7(3), 213}, 섬유 표면과 하이드로겔 가교 네트워크 사이 계면 결합이 본 명세서에 도입된다 (도 6). 이와 같은 복합재료 설계는 고체 섬유 성분으로부터 더 강한 기계적 보강을 허용할 뿐만 아니라, 양쪽 최적 세포 침윤 특성 및 구조적 통합성을 가능하게 하는, 하이드로겔 상의 평균 기공 크기/다공률 및 벌크 기계적 특성의 독립적 조율을 허용한다. 섬유가 ASC 및 내피 전구체를 위한 바람직한 세포 접착 기체로서 이용되므로, 세포 이주 및 ASC 분화를 지원하기 위한 안내로서 작용할 수 있음이 추가로 고려된다.
원하는 효과를 추가로 달성하기 위해, 본 발명은 나노섬유들 사이에 그리고 또한 나노섬유들과 하이드로겔 사이에 가교를 도입하기 위해 PEG 가교 제제를 포함한다. 이것은 제품의 내구성 확장을 돕고, 최적의 다른 특성을 달성하기 위해 가교 밀도의 조절을 허용한다.
지방 조직과 조합된 섬유-하이드로겔 복합재료 (복합재료 - 지방)
복합체가, 예를 들면, 주사 또는 이식화에 의해 투여되는 인간 대상체의 조직 속에 편입되는 의료 기기 사용을 위하여 지방 조직과 조합된 섬유-하이드로겔 복합재료 (복합재료 - 지방)이 본 명세서에 제공된다. 복합재료 - 지방은 종래 기술에서 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 지방 및 섬유-하이드로겔 복합재료의 상이한 비는 조합되어 원하는 성과를 위하여 최적 결과를 수득할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지방 조직은 지방흡인제이다.
일부 구현예에서, 섬유-하이드로겔 복합재료 및 지방 조직은 제자리 조합되고, 특정한 기간 예컨대 약 1 시간, 3 시간, 5 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 또는 약 1 시간 내지 24 시간 동안 실리콘 금형에서 또는 주사기에서 또는 유리 컨테이너에서 겔화하게 된다.
바람직한 구현예에서, 섬유-하이드로겔 복합재료 및 지방흡인제는 제자리 조합되고, 특정한 기간 예컨대 약 1 시간, 3 시간, 5 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 또는 약 1 시간 내지 24 시간 동안 실리콘 금형에서 또는 주사기에서 또는 유리 컨테이너에서 겔화하게 된다. 복합재료-지방흡인제는 지방흡인제 단독과 비교하여 우수한 특성을 제공한다. 복합재료-지방흡인제는, 천연 세포외 기질을 모방하는 조직 스캐폴드로서 작용하는, 지방 이식편 유지 및 혈관화를 촉진시키기 위해 인간 대상체 속에 투여 (예를 들면 주사)될 수 있다. 상기 접근법은 임플란트 실패 및 섬유증의 위험 없이 더 큰 부피 재구성에 대하여 전망을 제공한다. 복합재료 - 지방흡인제는, 현재 임상적으로 사용된 가공된 지방흡인제와 비교하여, 생체내 지방과 더욱 유사한 향상된 기계적 특성을 갖는다.
지방 (예를 들면 지방흡인제) 대 복합재료 비에 따라, 조합된 재료의 저장 탄성률 (G')는 상승작용적 방식으로 증가될 수 있다. 이것이 중요한 것은 저장 탄성률이 얼마나 재료가 변형가능한지의 측정이기 때문이고, 이상적 조직 스캐폴드는 천연 지방 조직과 유사한 특성/강도를 가질 것이다. 더 높은 저장 탄성률로, 지방/복합재료 조합은 덜 변형가능하고 따라서 더 강하고 전단력에 덜 취약하다. 이전의 연구는 이것이 시험관내 더 높은 지방세포 생존 및 더 적은 지방분해로 해석한다는 것을 증명하였다 {Luan, Anna, 등, Plastic and Reconstructive Surgery, vol. 140, no. 3, 2017, pp. 517-524}. 따라서, 저장 탄성률이 높은 지방-복합재료 조합을 갖는다는 것이 생체내 개선된 지방세포 및 지방 이식편 생존으로 해석할 것이 합리적으로 추론될 수 있다. 이것이 강한 임상적 암시를 갖는 것은, 이것이 연조직 재구성을 위하여 지방 이식을 경험하는 환자에 대하여 더 적은 이환율 및 더 적은 절차로 해석하기 때문이다.
복합재료-지방은 지방흡인제와 비교하여 혈관신생 및 혈관 내부성장의 우수한 비율을 증명하는 능력을 갖는다. 충분한 혈액 공급은 지방 이식편 생존에 필수적이다. 이것은 복합재료-지방에 의해 제공된 증가된 혈관신생 및 혈관 내부성장이 장기 지방세포 생존에 필요한 이유이다.
또한, 복합재료-지방은 생존을 위하여 세포 배양 배지 접근으로부터 지방세포를 방해하지 않는다. 복합 재료는 장기 생존에 요구된 혈관생성적 성장 인자에 지방세포 접근을 제공한다. 다른 한편으로, 지방흡인제 단독은 샘플을 둘러싸는 지질 층을 갖고, 따라서 세포 배지 접근으로부터 지방세포를 방지한다.
비-구형 비드화된 제형
종래 기술에서 공지된 다른 진피 충전재 조성물에서, 복합재료/하이드로겔은, 각 성분의 더 높은 농도 및 향상된 안정성을 사용하게 하는, 미립자 제형으로 형성된다. 예를 들어, 일부 상업적 하이드로겔-기반 충전재는 이들 비드를 형성하기 위해 블렌딩 방법을 사용한다. 이러한 방법은 비드 크기 및 형태에 대해 미미한 제어를 허용하기 때문에 이상적이지 않다.
본 발명의 버젼에서, 나노입자-하이드로겔 스캐폴드 기질은 벌크 복합 겔로서 형성된다. 비드화된 겔로서 복합재료의 도입을 포함하는 개선이 제공된다. 이것은 바람직한 결과를 얻기 위해 (표 1, 도 4b, 4c, 및 4d) 비드 특성을 사용자가 다양하게 하고 복합재료의 저장 탄성률을 개선한다 (도 3). 본 발명은 예비-형성된 하이드로겔-나노섬유 복합재료가, 예컨대 1개, 2개, 3개, 또는 3개 초과 메시 스크린을 통해 밀림으로써, 물리적으로 조절되는 미립자화의 시스템을 도입하여, 형태 및 크기에서 서로 상대적으로 유사한 비구형 비드의 집단을 창출한다. 이러한 2스크린 시스템은 비드의 크기에 대해 엄격한 제어를 허용하고, 따라서 사용자가 필요시 크기를 조절하게 한다 (표 1).
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예비-반응된 복합재료
본 명세서에 언급된 바와 같이, 기재된 본 발명은 주사에 앞서 또는 저장에 앞서 반응되는 복합체를 포함한다. 본 발명의 이전 구현예에서, 제형의 성분은 대상체에게 주사 직전에 최종 사용자에 의해 혼합되었다. 이것은 인간 인자, 예를 들면 이것이 필요하였던 사용자 준비 및 취급의 복잡화를 도입하였다. 가변하는 혼합 및 대기 시간은 반응 시간을 변화시킬 수 있고 따라서 복합체의 강직성을 상당히 변경시킬 수 있다. 이것은 주사기를 통해 주사되기에 겔을 너무 강직성으로, 또는 충분히 강직성이지 않도록 야기시킬 수 있어, 이는 대상체에 주사된 경우 바람직하지 않은 특성을 창출할 것이다. 이러한 문제를 설명하기 위해, 본 발명가들은 예비-반응된 조성물을 개발하였고, 여기서 반응 (예를 들면 겔화)은 저장에 앞서 발생한다.
7mg/mL HA-Ac, 말레이미드를 가진 8 - 10mg/mL의 섬유, 및 6.9mg/mL의 PEGSH를 포함하는 제형은 섭씨 37도에서 벌크로 완전히 반응되었다. 제조 동안 겔을 예비-반응시킴으로써, 본 발명가들은 불안정한 기능적 그룹을 보호할 필요성을 제거하였고 최종 사용자에 의한 확장성 혼합 및 경화에 대한 필요성을 제거하였다.
동결건조
본 발명은 복합체의 저장에 앞서 동결건조의 단계를 포함한다. 동결건조의 도입은 기능의 상실 없이 연장된 기간 동안 실온에서 제품의 저장을 허용한다. 한 구현예에서, 비드화된 제품은 수크로스, 트레할로스, 및 염화나트륨의 등장성 용액에서 동결건조된다. 이들 변수는 건조 공정 동안 미세구조를 보호하고 제품의 유통기한을 연장시킨다.
한 구현예에서, 동결건조된 겔 비드는 저장 후 물과 재구성되어, 이들을 수초 내에 주사에 준비되도록 한다.
섬유-하이드로겔 복합재료의 나노섬유 상의 기계적 특성은, 대부분의 하이드로겔 성분과 반대로, 건조된 또는 냉동된 상태에서 실질적으로 변화하지 않는다. 따라서, 냉동 또는 동결건조 동안, 섬유 파편은 전체적인 복합재료 미세구조물 유지를 도울 수 있다. 정확한 동결건조 사이클 및 제형으로, 복합재료는, 재수화시 별개의 비드로서 여전히 잔류하면서, 동결건조될 수 있다.
혁신
특정한 양태에서, 혁신은, 재수화후 이의 조성물을 유지할 수 있고 동결건조될 수 있는, 나노섬유 표면과 하이드로겔 네트워크 사이 계면 결합 및 가교를 가진 예비-반응된, 비드화된 나노섬유-하이드로겔 복합재료 설계이다. 이러한 공학 복합재료는 하이드로겔 상에서 평균 기공 크기의 상당한 감소 없이 하이드로겔의 기계적 특성을 과감하게 개선하는 잠재력을 갖는다. 계면 결합의 도입은 2개 성분의 겨우 물리적 블렌딩과 비교하여 우수한 기계적 강화 효과를 제공할 수 있다. 이러한 연구는 블랜드와 대조적으로 전기방사된 폴리카프로락톤 (PCL) 섬유-HA 하이드로겔 복합재료로 달성가능한 기계적 특성 (밀도, 다공률, 및 전단 탄성률)의 범위를 계획할 것이다.
핵심 혁신은 이러한 복합 재료의 제자리 형성에서 화학을 최적화함으로써 달성된 염증의 감소이다. 본 발명가들은 대상체에서 염증을 야기시키는 화학적 특성을 확인함으로써 이전 작업과 비교하여 본 발명을 개선하였고, 이러한 문제를 감소시켰던 새로운 특성을 가진 조성물을 창출하였다. 본 발명의 이전 구현예는 티올화된-HA (HA-SH) 및 아크릴화된 PEG 가교제 (PEGDA)를 사용하였다. 이것은, 도 1c에서 도시된 바와 같이 급성 면역 반응을 포함하여, 대상체에서 음성 반응, 그리고 주사 후 염증을 가졌다 (도 1a 및 1b). 아크릴화된 HA (HA-Ac) 및 티올화된 PEG 가교 제제 (PEGSH)를 포함하는 대안적 조성물 사용. 반응성 그룹의 이러한 감소는 염증 문제에 대한 해법을 제공하였다. 도 1a 및 1b는 본 발명의 이전 구현예와 비교하여 그리고 다른 상업적으로 이용가능한 충전재와 비교하여 이러한 개선을 증명한다.
또 다른 혁신은 연조직 결손부를 회복하기 위한 이와 같은 나노섬유-하이드로겔 복합재료의 증명이다. 예비 특성규명은 복합재료가 지방 조직과 구조적 특징을 공유한다는 것을 증명하였다 (도 6) {Christman, 2012 US 20120264190 A1; Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049}. 이러한 복합재료가 연조직 재생에 중요한 기계적 특성 및 구조적 통합성을 제공함이 가정되었다. 이러한 연구는 또한 하이드로겔과 비교하여 복합재료의 다능성 및 능률을 증명하였다.
다른 양태에서, 핵심 혁신은 세포-결합 또는 조직-결합 모이어티의 나노섬유-하이드로겔 복합 재료에의 편입이다. 펩타이드, 압타머, 항체, 소분자, 또는 다른 결합 시약을 포함하는 이들 모이어티는 국소 상처 환경으로부터의 세포 또는 외인성으로 제공된 세포를 편입시키기 위한 복합재료의 향상된 능력을 부여한다. 결합된 나노섬유, 하이드로겔, 및 세포의 수득한 통합 구조는 나노섬유-하이드로겔 복합재료 단독보다 더욱 천연 조직처럼 거동한다. 지방세포, 내피 세포, 페릭티에스, 및 다른 중간엽 세포를 포함하는 편입된 세포성 요소는 나노섬유-하이드로겔 복합재료 뿐만 아니라 주위 조직과 더욱 양호하게 조화할 수 있고 리모델링할 수 있어서 더욱 천연 및 내구성 복구를 유효화시킨다.
다른 양태에서, 핵심 혁신은 세포의 나노섬유-하이드로겔 복합 재료에의 회합이다. 지방세포, 내피 세포, 페릭티에스, 및 다른 중간엽 세포를 포함하는 회합된 세포성 요소는 나노섬유-하이드로겔 복합재료 뿐만 아니라 주위 조직과 더욱 양호하게 조화할 수 있고 리모델링할 수 있어서 ECM을 모방하기 위한 적합한 기계적 강도를 제공하면서 더욱 천연 및 내구성 복구를 유효화시킨다.
다른 양태에서, 핵심 혁신은 조직의 나노섬유-하이드로겔 복합 재료에의 회합이다. 회합된 조직 예컨대 지방 조직은 나노섬유-하이드로겔 복합재료 뿐만 아니라 주위 조직과 더욱 양호하게 조화할 수 있고 리모델링할 수 있어서 ECM을 모방하기 위한 적합한 기계적 강도를 제공하면서 더욱 천연 및 내구성 복구를 유효화시킨다.
본 발명의 핵심 혁신은 실온 (15 ℃ (59 ℉) 내지 18 ℃ (64 ℉))에서 복합체의 안정성이다. 많은 상업적으로 이용가능한 하이드로겔- 또는 히알루론산-기반 충전재에 의해 직면된 문제는 냉각 상태에서 저장되어야 하는 필요성이다. 이것은 이들이 저장될 수 있는 시간의 총계를 제한하여, 따라서 최종 사용자가 제품을 대상체에게 투여할 수 있는 기간을 단축시킨다. 본 명세서에 본 발명의 목적은 개선된 저장 안정성이다. 투여를 위하여 동결건조 및 재수화될 수 있는 예비-반응된, 비드화된 제형의 창출은 이러한 미충족된 필요를 설명한다.
이러한 프로젝트의 성공적 완료는 누락 연조직 부피의 회복을 위하여, 특히 혈관 네트워크의 확립, 조직 복구 부위 통합성의 유지, 세포 이주 및 조직화의 촉진, 및 숙주 세포의 동원이 지속가능한 조직 회복에 모두 중요한 더 큰 결손부를 위하여 기성 용액을 전달할 것이다. 조직 적합성에 관한 이들 예비 데이터와 함께, 이러한 복합재료 설계에서 사용된 재료 성분, 즉 HA 하이드로겔 및 생분해성 폴리에스테르 섬유에 대한 광범위한 임상 실적은 임상 해석을 위하여 간단한 규제 승인 경로 및 우수한 조직 적합성을 제안하였다.
특성:
일부 구현예에서, 본 발명은 하이드로겔 성분에서 나노섬유와 중합체 네트워크 사이 가교 및 계면 결합을 제공한다. 이것은 "진정한" 복합재료의 형성에 중요하다. 이와 같은 섬유 및 하이드로겔의 블렌딩이 동일한 정도의 기계적 향상을 제공하지 않음이 증명되었다. 나노섬유-하이드로겔 블랜드의 사용에 관한 이전 보고가 또한 있다. 다시 말해서, 가교 및 계면 결합은 중요하게 종래 기술과 이러한 새로운 작업을 구별한다. 게다가, 계면 결합은 본 필사본에서 나타난 바와 같이 공유 결합, 및 이차 결합, 예컨대 수소 결합 및 정전하 상호작용을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중간엽 세포를 동원, 포획 및/또는 매립하기 위해 수득한 복합재료의 능력을 향상시킬 수 있는 나노섬유-하이드로겔 복합재료에서 중간엽 세포 결합 요소를 제공한다. 양쪽 세포 및 나노섬유-하이드로겔 복합재료로 이루어지는 수득한 재료는 더욱 천연 조직처럼 거동할 수 있고 나노섬유-하이드로겔 복합재료 단독보다 더욱 천연 및 내구성 복구를 유효화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 복합재료 구조 속에 편입된 중간엽 세포를 제공한다. 선택적으로, 이들 세포는 당업자에 의해 일상적 임상 실무에서 지방흡입술 흡인제로부터 수득될 수 있다. 지방세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 전구체, 지방세포 전구체, 내피 세포, 및 주피세포를 포함하는 이와 같은 세포는 나노섬유-하이드로겔 복합재료 속에 편입되어 천연 연조직을 닮은 신규한 재료를 생성할 수 있다.
이것은 또한, 임의의 기하학의 부피 결손부를 대체하기 위해 필요시, 복합재료가 모든 배향에서 더욱 강력한 - 등방성 보강을 증명하는 분야에서 최초 작업이다. 나노섬유 매트 또는 소수의 정렬된 필라멘트를 이용한 설계는 내재적으로 비등방성이다. 이러한 설계는 양쪽 등방성 및 비등방성 재료를 형성할 수 있다.
본 발명에서, 각 성분의 화학적 조성물은, 스캐폴드의 다른 중요한 물리적 특성, 예컨대 강도 및 저장 탄성률을 유지하면서, 환자에서 염증을 감소시키기 위해 변경되어 왔다 [[이에 관한 특수사항은 실시예에서 개시될 수 있다. 특히 중요: 이러한 제형에서 티올 그룹의 위치 (발명 개시내용의 A2 섹션)은 감수성에 관해 큰 효과를 가졌다.]]
본 명세서에 제시된 작업은 비구형 마이크로비드로 제형화되는 스캐폴드 복합체를 정의한다. 이러한 비드화는 겔의 저장 안정성을 개선하고 복합체의 기능을 개선할 수 있는 그리고 상이한 목적을 위하여 품질을 구별할 수 있는 다른 특성의 변동을 허용한다.
본 명세서에 제시된 작업은, 최종 사용자의 실수 가능성을 감소시키기 위해, 주사에 앞서 반응되는 스캐폴드 복합체를 정의한다. 복합재료의 제자리 형성은, 이것을 필요로 하는 사용자 준비 및 취급을 포함하는, 인간 인자의 복잡화를 도입한다. 분 단위로 혼합 및 대기 시간은 제형의 특성, 예컨대 바람직하지 않은 강직성 및 탄력성 (도 12a 및 12b)에 영향을 미친다.
본 명세서에서 본 발명은, 실온에서 저장된 경우 안정되게 하는, 비드화된 스캐폴드 복합체의 동결건조 단계를 도입한다 (도 11). 비드는, 그들의 본래 특성을 유지하면서, 수초 내에 사용에 앞서 재수화될 수 있다. 기존의 HA 충전재는 수성 환경이 너무 많은 HA 쇄 절단을 가능하게 하기 때문에 멸균화를 위하여 방사선조사될 수 없다. 저장에 앞서 제품의 동결건조는 조성물이 더 오랜 기간 동안 저장되도록 할 뿐만 아니라, 추가의 말단 멸균화 양상, 즉 감마 또는 e-빔을 통한 방사선조사를 가능하게 한다.
적어도 특정한 양태에 대하여, 본 명세서에 제시된 작업은 세포 이주 및 숙주 조직 내부성장을 위하여 (비드 주위 및 비드 내에서) 충분한 기공 크기 및 다공률을 가진 하이드로겔 네트워크, 그리고 50 nm 내지 10 ㎛ 범위의 직경을 가진 중합체 섬유를 느슨하게 포함하는 나노섬유가 되도록 복합재료의 형성에 사용된 성분을 정의한다.
겔/하이드로겔 성분
한 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드 복합체는 하이드로겔을 포함하는 복합재료이다. 하이드로겔은 적합한 하이드로겔 성분의 임의의 유형을 포함할 수 있다. 본 발명은, 종래 기술에서 공지된 임의의 적합한 하이드로겔 성분을 포함하여, 임의의 적합한 겔 성분을 포함하는 나노구조물/겔 복합재료를 고려한다. 겔 및/또는 하이드로겔은 임의의 적합한 합성 또는 자연발생 재료로 형성될 수 있다.
예를 들어, 겔 및/또는 하이드로겔의 중합체 성분은 셀룰로스 에스테르, 예를 들어, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트 (CAP), 셀룰로스 아세테이트 부티레이트 (CAB), 셀룰로스 프로피오네이트 (CP), 셀룰로스 부티레이트 (CB), 셀룰로스 프로피오네이트 부티레이트 (CPB), 셀룰로스 디아세테이트 (CDA), 셀룰로스 트리아세테이트 (CTA), 또는 기타 등등을 포함할 수 있다. 이들 셀룰로스 에스테르는 미국 특허 번호 1,698,049, 1,683,347, 1,880,808, 1,880,560, 1,984,147, 2,129,052, 및 3,617,201에서 기재되고, 종래 기술에서 공지된 또는 상업적으로 수득된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에 적합한 상업적으로 이용가능한 셀룰로스 에스테르는, Eastman Chemical Company, Kingsport, Tenn으로부터 모두 이용가능한, CA 320, CA 398, CAB 381, CAB 551, CAB 553, CAP 482, CAP 504를 포함한다. 이와 같은 셀룰로스 에스테르는 전형적으로 약 10,000 내지 약 75,000의 수평균 분자량을 갖는다.
셀룰로스 에스테르는 및 셀룰로스 및 셀룰로스 에스테르 단량체 유닛의 혼합물을 포함하고; 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 셀룰로스 아세테이트 부티레이트는 셀룰로스 아세테이트 단량체 유닛 뿐만 아니라 셀룰로스 부티레이트 단량체 유닛 및 에스테르화되지 않은 셀룰로스 유닛을 함유한다.
본 발명의 겔/하이드로겔은, 아크릴산, 메타크릴산, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 및/또는 다른 비닐 단량체로부터 일반적으로 형성되는, 다른 수팽윤성 중합체, 예컨대 아크릴레이트 중합체로 또한 구성될 수 있다. 적합한 아크릴레이트 중합체는, 상기, 명시된 바와 같이, Rohm Pharma (독일)로부터 상표명 "유드라지트(EUDRAGIT)®" 하에 이용가능한 공중합체들이다. 유드라지트 시리즈 E, L, S, RL, RS 및 NE 공중합체는 유기 용매에서 가용화된 채로, 수성 분산액에서, 또는 건조 분말로서 이용가능하다. 바람직한 아크릴레이트 중합체는 메타크릴산 및 메틸 메타크릴레이트의 공중합체, 예컨대 유드라지트 L 및 유드라지트 S 시리즈 중합체이다. 특히 바람직한 이와 같은 공중합체는 유드라지트 L-30D-55 및 유드라지트 L-100-55이다 (후자 공중합체는 물로 재구성될 수 있는 유드라지트 L-30D-55의 스프레이-건조된 형태이다). 유드라지트 L-30D-55 및 유드라지트 L-100-55 공중합체의 분자량은, 대략 1:1의 자유 카복실 기 대 에스테르 기의 비를 가지며 대략 135,000 Da이다. 공중합체는 5.5 미만의 pH를 갖는 수성 유체에서 일반적으로 불용성이다. 또 다른 특히 적합한 메타크릴산-메틸 메타크릴레이트 공중합체는 유드라지트 S-100으로, 이는 자유 카복실 기 대 에스테르 기의 비가 대략 1:2라는 점에서 유드라지트 L-30D-55와 상이하다. 유드라지트 S-100은 5.5 미만 pH에서 불용성이지만, 유드라지트 L-30D-55와 달리, 5.5 내지 7.0의 범위에서 pH를 갖는 수성 유체에서 불량하게 가용성이다. 이러한 공중합체는 pH 7.0 이상에서 가용성이다. 6.0 미만 pH에서 불용성인 한, 유드라지트 L-30D-55 및 유드라지트 S-100의 것 사이의 pH-의존성 용해도 프로파일을 갖는 유드라지트 L-100이 또한 사용될 수 있다. 유드라지트 L-30D-55, L-100-55, L-100, 및 S-100이 유사한 pH-의존성 용해도 특징을 갖는 다른 허용가능한 중합체로 대체될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.
히알루론산 (HA).
다양한 다른 구현예에서, 본 발명의 복합 재료는 하이드로겔 재료로서 히알루론산 (HA)에 기반될 수 있다. HA는 하이드로겔 성분을 형성하는 반복 이당류 유닛을 가진 비-황화, 선형 다당류이다. HA는 또한 인간 조직에서 세포외 기질의 비-면역원성, 천연 성분이고, 심미적 및 재건 절차에서 진피 충전재로서 널리 사용된다.
일부 구현예에서, 히알루론산은 기능화된다. 특정 구현예에서, 히알루론산은 하이드록실, 아미노, 카복실, 티오, 아크릴레이트, 설포네이트, 포스페이트, 아미드, 뿐만 아니라 이들의 변형된 형태, 예컨대 활성화된 또는 보호된 형태를 포함하는 그룹으로 기능화된다.
HA의 파괴는 발현이 조직 손상 및 염증의 영역에서 증가되는 천연 히알루로니다제에 의해 촉진된다. 중요하게, 연구는 3-10개의 이당류 유닛의 작은 HA 분해 단편이 내피 세포 증식, 이주, 세관 형성, 및 혈관신생의 유력한 조절제임을 나타냈다. HA의 이들 생물학적 기능은 Ras 및 PKC를 포함하는 경로에서 CD44를 통해 매개된다고 생각된다. 항-CD44 항체를 사용하는 CD44/HA 상호작용의 차단은 시험관내 인간 미세혈관 내피 세포의 증식 및 이주를 감소시켰다. HA 하이드로겔은 세포 및 조직 부상의 다양한 모델에서 세포 전달을 위한 잠재적 기질로서 조사되어 왔다. 이들 하이드로겔은 세포를 위한 보호성 및 지지성 스캐폴드로서 작용할 수 있고 또한 흉터형성을 감소시킬 수 있다. 따라서, HA가 세포 침윤의 촉진 및 혈관신생의 촉진에 의해 조직 재생의 향상에서 중요한 역할을 한다고 믿어진다.
첫째, 재료는 천연 지방 조직의 것과 유사한 3차원 통합성 및 일관성을 갖는다. 이것은 누락 연조직 부피의 기성 회복에 적합하게 만든다. 둘째, 재료는 바람직하게는 지방세포 및 내피 전구체의 이주를 위한 기체로서 작용할 수 있는 복수의 유연성 나노섬유로 침착될 수 있다. 셋째, 재료는 전구체 세포를 그것 주변 섬유성 캡슐 형성보다는 스캐폴드 속에 신속하게 침윤 및 통합하도록 하기 위한 충분한 다공률을 갖는다. 넷째, HA 하이드로겔 성분은 중요한 혈관신생적 단서를 제공하면서도 압축성 및 부피 팽창을 제공한다. 다섯째, 나노섬유 및 하이드로겔 성분은 이들을 재생된 연조직에 의해 대체되도록 하는 생분해성이다. 여섯째, 모든 성분 재료는, 수많은 FDA-승인된 기기에서 강한 안전성 실적을 가지며, 임상 해석을 위한 규제 장애를 잠재적으로 낮춘다.
히알루론산의 분자량은 복합재료의 전체적 특성에 영향을 미친다 (도 4b). 엘러간(Allergan) 및 다른 진피 충전재 제조자는 또한 제품 지속성에 관해 HA 분자량의 중대성을 인식한다. 엘러간의 쥬비덤 제품은 2.5 MDa 분자량 HA로 제조된다. 추가로, 쥬비덤 특허 US8450475 B2에서, 엘러간은, "본 발명의 전형적 구현예에서, 고 분자량 대 저 분자량 HA의 비가 1.0 MDa 초과의 분자량을 고 분자량 HA로 적어도 약, 및 바람직하게는 2 초과 (w/w≥2)이다"를 설명한다.
HA의 개시내용은 미국 특허 출원 시리즈 번호 12/393,884; 미국 특허 번호 6,921,819 (HA의 수화 동안 다기능적 링커와 그것의 반응에 의한 고체 히알루론산 (HA)의 가교 공정); 미국 특허 번호 6,685,963 (HA의 아크릴성 입자); 미국 공보 200610194758 (고 및 저 분자량 나트륨 HA의 가교에 의한 하이드로겔의 제조 방법); 미국 공보 2009/0036403 ("조율가능하게" 가교된 HA를 제공하기 위해 4중 기능적 PEG 에폭사이드와 HA의 가교); 미국 공보 2009/0143331 (더 오래 지속하는 충전재를 제공하기 위해, 분해 억제제, 예컨대 콘드로이틴 설페이트를 가진 HA 진피 충전재); 미국 공보 2009/0143348 (스테로이드와 조합된 HA); 및 미국 공보 2009/0155314 (보툴리눔 독소와 조합된 HA)를 포함한다. 추가적으로, 미국 공보 2009/0148527, 2009/0093755, 및 2009/0022808은, 각각, 콜라겐과 가교된, 그리고 단백질로 코팅된, 미소구체에서 HA를 개시한다. HA의 추가 개시내용은 하기를 포함한다: WO 2009/034559 (적어도 하나의 C-글리코시드 유도체를 함유하는 조성물로 피부의 심미적 및/또는 복구적 치료 공정); WO 2009/024719 (피부에서 오목한 부분/오목한 곳 충전에 유용한 HA 및 C-글리코시드 유도체를 함유하는, 바디 또는 얼굴의 부피를 회복하는, 그리고 노화의 신호를 감소시키기 위한 미용적 및 약제학적 조성물); WO 2007/128923 (하나 이상의 활성 지용성 및/또는 양친성 구성성분의 제어된 방출을 가진 생체적합성 겔의 제조 방법); 미국 공보 2009/0018102 (주름, 라인 섬유아세포 고갈 및 흉터를 치료하기 위해, 올리고당류 및 HA 분해 억제제와 결합하여 HA 및 적어도 하나의 레티노이드 또는 이들의 염/유도체를 함유하는 조성물); 미국 특허 번호 3,763,009 (아스코르브산, 말토스 및/또는 올리고당류의 혼합물을 아스페르길루스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 또는 기타 속에서 유래된 효소에 적용하여 혼합물을 아스코르브산 글루코시드로 효소적으로 전환시킴으로써 아스코르브산의 산화 저항의 개선 공정); 미국 특허 번호 5,616,611 (직접 감소 활성을 나타내지 않고 안정하고 약제 및 미용 산업에서 안정화제, 품질개선 제제, 항산화제, 생리적으로 활성 제제, UV-흡수제로서 유용한 α-글리코실-L-아스코르브산); 미국 특허 번호 5,843,907 (비타민 C 농축 제제, 식품 재료, 약학, 및 미용에 적합한 결정성 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 생산 및 용도); 및 EP 0539196 (고 순도 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산의 산업적 규모의 제조) 및 US 공보 2002/0151711. HA 및/또는 비타민 C 제제를 편입시키는 상업적 제품은 하기를 포함한다: 메소글로우(MESOGLOW)® 제품, 레비타케어(REVITACARE)®, 및 NCTF® 135/135HA Mesotherapy 제품. 각각의 상기 인용된 참고문헌 및 인쇄된 공보는 그 전체가 본 명세서에 참고로 개별적으로 편입된다.
한 구현예에서, 본 발명의 HA는 박테리아 발효에서 유래된 멸균화된 HA이다. 히알루론산은 스트렙토콕쿠스(Streptococcus) 박테리아의 그룹 A 및 C 균주에 의해 생산될 수 있다. HA가 면역 반응을 개시하지 않음에 따라, 박테리아 예컨대 스트렙토콕쿠스 주에피데미쿠스(zooepidemicus)는 그들의 세포를 캡슐화하기 위한 수단으로서 HA를 합성하고 숙주의 면역계로부터 검출을 벗어나기 위해 분자 모방을 나타낸다 (Boyce JD, Chung JY, Adler B, J Biotechnol. 2000 Sep 29; 83(1-2):153-60.; Wessels MR, Moses AE, Goldberg JB, DiCesare TJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 1; 88(19):8317-21.). HA는 스트렙토콕쿠스 피오게네스(pyogenes), 스트렙토콕쿠스 우베리스(uberis), 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 및 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)를 포함하는 다른 병원성 박테리아에 의해 또한 자연적으로 생산된다 (Blank LM, Hugenholtz P, Nielsen LKJ Mol Evol. 2008 Jul; 67(1):13-22.; DeAngelis PL, Jing W, Drake RR, Achyuthan AM, J Biol Chem. 1998 Apr 3; 273(14):8454-8.; Jong A, Wu CH, Chen HM, Luo F, Kwon-Chung KJ, Chang YC, Lamunyon CW, Plaas A, Huang SH Eukaryot Cell. 2007 Aug; 6(8):1486-96.).
박테리아 발효에 의한 HA의 생산은 지난 20년 동안 꾸준히 진화하였다. 개발의 초기 단계에서, HA를 자연적으로 생산하였던 그룹 A 및 C 스트렙토콕쿠스는 발효조에서 성장되었고 HA는 정제되었다. 하지만, 이들 박테리아가 다수의 독소를 생산함에 따라, 대안적 박테리아가 모색되었다. 일단 HA 생합성 경로에 대하여 인코딩하는 유전자가 결정되었다면, 다수의 박테리아 (바실러스(Bacillus), 아그로박테리움, E. 콥 및 락토콕쿠스(Lactococcus))는 유전적으로 변형되어 이들 유전자를 발현시키고 HA를 생산한다. 후속 작업은 배양 배지 및 배양화 조건의 최적화에 집중하였다 (Mao Z, Chen RR, Biotechnol Prog. 2007 Sep-Oct; 23(5):1038-42.; Wessels MR, Moses AE, Goldberg JB, DiCesare TJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 1; 88(19):8317-21.; Widner B, Behr R, Von Dollen S, Tang M, Heu T, Sloma A, Sternberg D, Deangelis PL, Weigel PH, Brown S, Appl Environ Microbiol. 2005 Jul; 71(7):3747-52; Sze, Brownlie, Love, 3 Biotech. 2016;6(1):67. doi:10.1007/s13205-016-0379-9.).
활성 제제의 전달.
임의의 본 명세서에-기재된 겔/하이드로겔 조성물은 활성 제제를 함유하기 위해 그리고 이에 의해 활성 제제-전송 관계에서 바디 표면 (예를 들면, 조직 복구의 부위)에 적용될 때에 활성 제제 전달 시스템으로서 작용하도록 이용될 수 있다. 본 발명의 본 하이드로겔 조성물 속에 "장입된" 활성 제제의 방출은 전형적으로 팽윤-제어된 확산 기전을 통해 제제의 탈착 및 물의 흡수 둘 모두를 포함한다. 활성 제제-함유 하이드로겔 조성물은 예로써 경피 약물 전달 시스템에서, 상처 드레싱에서, 국부 약제학적 제형에서, 이식된 약물 전달 시스템에서, 경구 투약 형태에서, 그리고 기타 등등에서 이용될 수 있다.
본 하이드로겔 조성물 속에 편입될 수 있고 전신적으로 (예를 들면, 경피, 경구, 또는 약물의 전신 투여에 적합한 다른 투약 형태로) 전달될 수 있는 적합한 활성 제제는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 강장 제제; 진통 제제; 마취 제제; 항관절염 제제; 항천식 제제를 포함하는, 호흡 약물; 항신생물성 약물을 포함하는, 항암 제제; 항콜린제; 항경련제; 항울제; 항당뇨 제제; 지사제; 안티헬민틱스(antihelminthics); 항히스타민; 항고지혈증 제제; 항고혈압 제제; 항-감염 제제 예컨대 항생제 및 항바이러스 제제; 항염증성 제제; 항편두통 제제; 항구토제; 항파킨슨증 약물; 항소양제; 항정신병제; 해열제; 진경제; 항결핵 제제; 항궤양 제제; 항바이러스 제제; 항불안제; 식욕 억제제; 주의력 결핍 장애 (ADD) 및 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD) 약물; 칼슘 채널 차단제, 항협심증 제제, 중추 신경계 (CNS) 제제, 베타-차단제 및 항부정맥 제제를 포함하는 심혈관 제제; 중추 신경계 자극제; 충혈제거제를 포함하는, 기침 및 감기 제제; 이뇨제; 유전 물질; 초본 치료제; 호르몬분해제; 최면제; 저혈당증 제제; 면역억제 제제; 류코트리엔 억제제; 유사분열 억제제; 근육 이완제; 마약 길항제; 니코틴; 영양 제제, 예컨대 비타민, 필수 아미노산 및 지방산; 안과 약물 예컨대 항녹내장 제제; 부교감신경억제제; 펩타이드 약물; 정신자극제; 진정제; 프로게스테론, 에스트로겐, 코르티코스테로이드, 안드로겐 및 동화 제제를 포함하는, 스테로이드; 금연 제제; 교감신경유사작용제; 정신안정제; 및 일반 관상동맥, 말초 및 대뇌를 포함하는 혈관확장제. 본 접착성 조성물이 유용한 특정 활성 제제는, 제한 없이, 아나바신(anabasine), 캡사이신(capsaicin), 이소소르비드 디니트레이트, 아미노스티그민(aminostigmine), 니트로글리세린, 베라파밀(verapamil), 프로프라놀롤(propranolol), 실라볼린(silabolin), 포리돈(foridone), 클로니딘(clonidine), 시티신(cytisine), 페나제팜(phenazepam), 니페디핀(nifedipine), 플루아시진(fluacizin), 및 살부타몰(salbutamol)을 포함한다.
국부 약물 투여 및/또는 약제를 넣은 쿠션 (예를 들면, 약제를 넣은 풋패드)에 대하여, 적합한 활성 제제는 예로써 하기를 포함한다:
정균 및 살균 제제: 적합한 정균 및 살균 제제는 예로써 하기를 포함한다: 할로겐 화합물 예컨대 요오드, 요오도포비돈 착물 (즉, PVP 및 요오드의 착물, 또한 "포비딘"으로서 지칭되고 Purdue Frederick으로부터 상표명 베타딘으로 이용가능), 요오드화물 염, 클로라민, 클로로헥시딘, 및 차아염소산나트륨; 은 및 은-함유 화합물 예컨대 설파디아진, 은 단백질 아세틸탄네이트, 질산은, 아세트산은, 락트산은, 황산은 및 염화은; 유기주석 화합물 예컨대 트리-n-부틸주석 벤조에이트; 아연 및 아연 염; 산화제, 예컨대 과산화수소 및 과망간산칼륨; 아릴 수은 화합물, 예컨대 붕산 페닐수은 또는 메르브로민; 알킬 수은 화합물, 예컨대 티오머살(thiomersal); 페놀, 예컨대 티몰, o-페닐 페놀, 2-벤질-4-클로로페놀, 헥사클로로펜 및 헥실레조르시놀; 및 유기 질소 화합물 예컨대 8-하이드록시퀴놀린, 클로르퀴날돌, 클리오퀴놀, 에타크리딘, 헥세티딘, 클로르헥세딘, 및 암바존.
항생 제제: 적합한 항생 제제는, 비제한적으로, (스트렙토마이세스 린콜넨시스(streptomyces lincolnensis)로부터 본래 회수되는 항생 제제의 클래스를 지칭하는) 린코마이신 계열의 항생제, (스트렙토마이세스 아우레오파시엔스(aureofaciens)로부터 본래 회수되는 항생 제제의 클래스를 지칭하는) 테트라사이클린 계열의 항생제, 및 황기반 항생제, 즉, 설폰아미드를 포함한다. 린코마이신 계열의 예시적 항생제는 린코마이신, 클린다마이신, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,475,407, 3,509,127, 3,544,551 및 3,513,155에서 기재된 바와 같은, 관련 화합물, 및 이들의 약리학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함한다. 테트라사이클린 계열의 예시적 항생제는 테트라사이클린 자체, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 데메클로사이클린, 롤리테트라사이클린, 메타사이클린 및 독시사이클린 그리고 그들의 약제학적으로 허용가능한 염 및 에스테르, 특히 산 부가 염 염 예컨대 염화수소 염을 포함한다. 예시적 황기반 항생제는, 비제한적으로, 설폰아미드, 설프아세트아미드, 설파벤즈아미드, 설파디아진, 설파독신, 설파메라진, 설파메타진, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 및 이들의 약리학적으로 허용가능한 염 및 에스테르, 예를 들면, 설프아세트아미드 나트륨을 포함한다.
통증 완화 제제: 적합한 통증 완화 제제는, 비제한적으로, 아세트아미도유게놀, 알파돌론 아세테이트, 알팍살론, 아무케인, 아몰라논, 아밀로케인, 베녹시네이트, 베톡시케인, 비페나민, 부피바케인, 부레타민, 부타케인, 부타벤, 부타닐리케인, 부탈리탈, 부톡시케인, 카르티케인, 2-클로로프로케인, 신코케인, 코카에틸렌, 코케인, 시클로메티케인, 디부케인, 디메티소퀸, 디메토케인, 디페라돈, 디클로닌, 엑고니딘, 엑고닌, 에틸 아미노벤조에이트, 염화에틸, 에티도케인, 에톡사드롤, .베타.-유케인, 유프로신, 페날코민, 포모케인, 헥소바르비탈, 헥실케인, 하이드록시디온, 하이드록시프로케인, 하이드록시테트라케인, 이소부틸 p-아미노벤조에이트, 켄타민, 류시노케인 메실레이트, 레복사드롤, 리도케인, 메피바케인, 메프릴케인, 메타부톡시케인, 메토헥시탈, 염화메틸, 미다졸람, 미르테케인, 나에페인, 옥타케인, 오르토케인, 옥세타제인, 파레톡시케인, 페나케인, 펜시클리딘, 페놀, 피페로케인, 피리도케인, 폴리도카놀, 프라목신, 프릴로케인, 프로케인, 프로파니디드, 프로파노케인, 프로파라케인, 프로피포케인, 프로포폴, 프로폭시케인, 슈도케인, 피로케인, 리소케인, 살리실 알코올, 테트라케인, 티알바르비탈, 티밀랄, 티오부타바르비탈, 티오펜탈, 톨리케인, 트리메케인, 졸라민, 및 이들의 조합을 포함하는, 국소 마취제이다. 테트라케인, 흐도케인 및 프릴로케인은 본 명세서에서 바람직한 통증 완화 제제이다.
약물 전달 시스템으로서 본 하이드로겔 조성물을 사용하여 전달될 수 있는 다른 국부 제제는 하기를 포함한다: 항진균 제제 예컨대 운데실렌산, 톨나프테이트, 미코나졸, 그리세오풀빈, 케토코나졸, 시클로피록스, 클로트리마졸 및 클로록실레놀; 각질용해 제제, 예컨대 살리실산, 락트산 및 우레아; 베시칸트 예컨대 칸타라딘; 항-여드름 제제 예컨대 유기 과산화물 (예를 들면, 과산화벤조일), 레티노이드 (예를 들면, 레티노산, 아다팔렌, 및 타자로텐), 설폰아미드 (예를 들면, 나트륨 설프아세트아미드), 레조르시놀, 코르티코스테로이드 (예를 들면, 트리암시놀론), 알파-하이드록시산 (예를 들면, 락트산 및 글리콜산), 알파-케토 산 (예를 들면, 글리옥실산), 그리고, 아젤라산, 클린다마이신, 에리트로마이신, 메클로사이클린, 미노사이클린, 나디플록사신, 세팔렉신, 독시사이클린, 및 오플록사신을 포함하는, 여드름의 치료를 위하여 특이적으로 표시된 항박테리아 제제; 피부-미백 및 표백 제제, 예컨대 하이드로퀴논, 코지산, 글리콜산 및 다른 알파-하이드록시산, 아르토카르핀, 및 특정한 유기 과산화물; 살리실산, 이미퀴모드, 디니트로클로로벤젠, 디부틸 스쿠아르산, 포도필린, 포도필로톡신, 칸타리딘, 트리클로로아세트산, 블레오마이신, 시도포비르, 아데포비르, 및 이들의 유사체를 포함하는, 사마귀 치료를 위한 제제; 그리고 항-염증성 제제 예컨대 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID), 여기에서 상기 NSAIDS는 케토프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 베녹사프로펜, 인도프로펜, 피르프로펜, 카르프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜, 부티부펜, 펜부펜, 및 티아프로펜산을 포함함.
상처 드레싱에 대하여, 적합한 활성 제제는 상처의 치료에 유용한 것들이고, 비제한적으로, 정균 및 살균 화합물, 항생 제제, 통증 완화 제제, 혈관확장제, 조직-치유 향상 제제, 아미노산, 단백질, 단백질분해 효소, 사이토카인, 및 폴리펩타이드 성장 인자를 포함한다.
일부 활성 제제의 국부 및 경피 투여에 대하여, 그리고 상처 드레싱에서, 피부 속에 또는 피부를 통해 제제의 관통의 속도를 향상시키기 위해 하이드로겔 조성물 속에 침투 향상제를 편입시키는 것이 필요 또는 바람직할 수 있다. 적합한 향상제는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 설폭사이드 예컨대 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 데실메틸설폭사이드; 에테르 예컨대 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (Transcutol로서 상업적으로 이용가능) 및 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르; 계면활성제 예컨대 나트륨 라우레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 폴록사머(Poloxamer) (231, 182, 184), 트윈(Tween) (20, 40, 60, 80) 및 레시틴 (미국 특허 번호 4,783,450); 1-치환된 아자시클로헵탄-2-온, 특히 1-n-도데실시클라자-시클로헵탄-2-온 (Nelson Research & Development Co., Irvine, Calif.로부터 상표명 아존(Azone) 하에 이용가능; 참고 미국 특허 번호 3,989,816, 4,316,893, 4,405,616 및 4,557,934); 알코올 예컨대 에탄올, 프로판올, 옥탄올, 데칸올, 벤질 알코올, 및 기타 등등; 지방 산 예컨대 라우르산, 올레산 및 발레르산; 지방 산 에스테르 예컨대 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 메틸프로피오네이트, 및 에틸 올레에이트; 폴리올 및 이의 에스테르 예컨대 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 부탄디올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트 (PEGML; 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,568,343); 아미드 및 다른 질소성 화합물 예컨대 우레아, 디메틸아세트아미드 (DMA), 디메틸포름아미드 (DMF), 2-피롤리돈, 1-메틸-2-피롤리돈, 에탄올아민, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민; 테르펜; 알카논; 및 유기 산, 특히 살리실산 및 살리실산염, 시트르산 및 석신산. 2개 이상의 향상제의 혼합물은 또한 사용될 수 있다.
특정한 다른 구현예에서, 겔 (예를 들면, 하이드로겔 성분) 및 나노구조물을 포함하는 본 발명의 복합 조성물은 또한 추가의 선택적 첨가제 성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 성분은 종래 기술에서 공지되고, 예를 들어, 충전재, 보존제, pH 조절제, 연화제, 증점제, 안료, 염료, 굴절성 입자, 안정화제, 강인 제제, 탈점착제, 약제학적 제제 (예를 들면, 항생제, 혈관신생 프로모터, 항진균 제제, 면역억제 제제, 항체, 및 기타 등등), 및 침투 향상제를 포함할 수 있다. 이들 첨가제, 및 이의 양은 하이드로겔 조성물의 원하는 화학적 및 물리적 특성을 상당히 방해하지 않는 방식으로 선택된다.
흡수성 충전재는 접착제가 피부 또는 다른 바디 표면에 있는 경우 수화의 정도를 제어하기 위해 유리하게 편입될 수 있다. 이와 같은 충전재는 미세결정성 셀룰로스, 탈크, 락토스, 카올린, 만니톨, 콜로이드성 실리카, 알루미나, 산화아연, 산화티탄, 규산마그네슘, 규산알루미늄마그네슘, 소수성 전분, 황산칼슘, 스테아르산칼슘, 인산칼슘, 인산칼슘 2수화물, 직조된 및 부직된 종이 및 면직물 재료를 포함할 수 있다. 다른 적합한 충전재는 불활성, 즉, 실질적으로 비-흡착성이고, 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄 폴리에테르 아미드 공중합체, 폴리에스테르 및 폴리에스테르 공중합체, 나일론 및 레이온을 포함한다.
상기 조성물은 또한 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는 예로써 p-클로로-m-크레졸, 페닐에틸 알코올, 페녹시에틸 알코올, 클로로부탄올, 4-하이드록시벤조산 메틸에스테르, 4-하이드록시벤조산 프로필에스테르, 염화벤즈알코늄, 염화세틸피리디늄, 클로로헥시딘 디아세테이트 또는 글루코네이트, 에탄올, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
상기 조성물은 또한 pH 조절 화합물을 포함할 수 있다. pH 조절제로서 유용한 화합물은, 비제한적으로, 글리세롤 완충액, 시트레이트 완충액, 보레이트 완충액, 포스페이트 완충액을 포함하거나, 시트르산-포스페이트 완충액은 또한 하이드로겔 조성물의 pH가 개체의 바디 표면의 것과 상용성인 것을 확보하기 위해 포함될 수 있다.
상기 조성물은 또한 적합한 연화 제제를 포함할 수 있다. 적합한 연화제는 시트르산 에스테르, 예컨대 트리에틸시트레이트 또는 아세틸 트리에틸시트레이트, 타르타르산 에스테르 예컨대 디부틸타르트레이트, 글리세롤 에스테르 예컨대 글리세롤 디아세테이트 및 글리세롤 트리아세테이트; 프탈산 에스테르, 예컨대 디부틸 프탈레이트 및 디에틸 프탈레이트; 및/또는 친수성 계면활성제, 바람직하게는 친수성 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 예를 들어, 당의 부분 지방 산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방 산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방 알코올 에테르, 및 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄-지방 산 에스테르를 포함한다.
상기 조성물은 또한 증점 제제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 바람직한 증점제는 자연 발생 화합물 또는 이의 유도체이고 예로써 하기를 포함한다: 콜라겐; 갈락토만난; 전분; 전분 유도체 및 가수분해물; 셀룰로스 유도체 예컨대 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 및 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스; 콜로이드성 규산; 및 당 예컨대 락토스, 사카로스, 푸룩토스 및 글루코스. 합성 증점제 예컨대 폴리비닐 알코올, 비닐피롤리돈-비닐아세테이트-공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜은 또한 사용될 수 있다.
특정한 구현예에서, 하이드로겔 및 나노구조물을 포함하는 본 발명의 하이드로겔 복합재료는 추가로 혈관신생을 촉진시키는 성분을 포함한다. 본 발명에 앞서 임상적으로 관련한 연조직 재생의 달성에 대한 도전은 재생된 조직이 바람직하게는 혈관재형성될 수 있어야 한다는 것이다. 그러므로, 연조직 재생을 촉진시키는 임의의 재료는 바람직하게는 혈관신생을 또한 조장할 수 있다. 이것을 달성하기 위한 하나의 방식은, 혈관신생 및 조직 형성을 촉진시키는 성장 인자를 농축 및 유지하기 위해 성장 인자 결합 부위로서 작용할 수 있는, 헤파린-함유 하이드로겔 성분의 사용을 통한 것이다.
한 구현예에서, 상기 조성물은 추가로 항체를 포함하고 전달한다. 용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 본 명세서에 사용되고 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자의 특정한 유형을 포함한다. 항체는 구체적으로 온전한 항체 (예를 들면, 온전한 면역글로불린), 항체 단편, 및 다중특이적 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 한 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 키메라성 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 대안적 스캐폴드를 포함한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전 항체"는 자연 발생 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 그리고 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본 명세서에 호환적으로 사용된다. 예를 들어, IgG 분자를 지칭하는데 사용된 경우, "전장 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이다.
용어 "Fc 영역"은, 자연 발생 항체에서, 보체계의 특정한 단백질 및 Fc 수용체와 상호작용하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 다양한 면역글로불린의 Fc 영역의 구조, 및 그안에 함유된 당화 부위는 종래 기술에서 공지된다. 그 전체가 참고로 편입된, Schroeder 및 Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52를 참고한다. Fc 영역은 당 업계에서 또는 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역, 또는 자연 발생 Fc 영역일 수 있다.
VH 및 VL 영역은 더욱 보존되는 영역으로 점재된 초가변성의 영역 ("초가변 영역 (HVR)"; 또한 일명 "상보성 결정 영역" (CDR))으로 추가로 세분될 수 있다. 더욱 보존된 영역은 프레임워크 영역 (FR)로 불린다. 각 VH 및 VL은 일반적으로, (N-말단부터 C-말단까지) 하기 순서로 정렬된, 3개 CDR 및 4개 FR을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. CDR은 항원 결합에 관여되고, 항체의 결합 친화성 및 항원 특이성에 영향을 미친다. 그 전체가 참고로 편입된, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md을 참고한다.
임의의 척추동물 종으로부터 경쇄는, 이의 불변 도메인의 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는, 2개 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 중쇄는 5개 상이한 클래스 (또는 아이소타입) 중 하나로 할당될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 클래스는 또한 α, δ, ε, γ, 및 μ 각각으로 지정된다. IgG 및 IgA 클래스는 서열 및 기능에서의 차이를 기준으로 하여 서브클래스로 추가 구분된다. 인간은 하기 서브클래스를 발현시킨다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
CDR의 아미노산 서열 경계는, 상기, Kabat 등에 의해 기재된 것들을 포함하는, 임의의 다수의 공지된 넘버링 스킴을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다 ("Kabat" 넘버링 스킴); Al-Lazikani 등, 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 ("Chothia" 넘버링 스킴); MacCallum 등, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("Contact" 넘버링 스킴); Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" 넘버링 스킴); 및 Honegge 및
Figure pct00003
, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 ("AHo" 넘버링 스킴); 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입됨.
"항체 단편"은 온전한 항체의 한 부분, 예컨대 온전한 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv (sFv) 단편, 및 scFv-Fc 단편을 포함한다.
"Fv" 단편은 1개 중쇄 가변 도메인 및 1개 경쇄 가변 도메인의 비-공유-결합된 이량체를 포함한다.
"Fab" 단편은, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 외에, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어, 재조합 방법으로 또는 전장 항체의 파파인 소화로 생성될 수 있다.
"F(ab')2" 단편은, 힌지 영역 근처에서, 디설파이드 결합으로 연결된 2개의 Fab' 단편을 함유한다. F(ab')2 단편은, 예를 들어, 재조합 방법으로 또는 온전한 항체의 펩신 소화로 생성될 수 있다. F(ab') 단편은, 예를 들어, 1-머캅토에탄올을 이용한 처리로 해리될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 일반적으로 펩타이드 링커로 결합된다.
Figure pct00004
A. (1994)를 참고한다. 임의의 적합한 링커는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 127)이다. 일부 구현예에서, n=1, 2, 3, 4, 5, 또는 6. 그 전체가 참고로 편입된, Antibodies from Escherichia coli. In Rosenberg M. & Moore G. P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York을 참고한다.
"scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은, scFv에서 가변 도메인의 배향에 따라, VH 또는 VL을 따를 수 있다 (즉, VH-VL 또는 VL-VH). 당 업계에서 공지된 또는 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다. 일부 경우에, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인을 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체"는 항체의 1개 가변 도메인이 다른 가변 도메인의 존재 없이 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 단일 도메인 항체, 및 이의 단편은 Arabi Ghahroudi 등, FEBS Letters, 1998, 414:521-526 및 Muyldermans 등, Trends in Biochem. Sci., 2001, 26:230-245에 기재되고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입된다. 단일 도메인 항체는 또한 sdAb 또는 나노바디로서 공지된다.
"다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 에피토프를 일괄하여 특이적으로 결합하는 2개 이상의 상이한 항원-결합 도메인을 포함하는 항체이다. 2개 이상의 상이한 에피토프는 동일한 항원 (예를 들면, 세포에 의해 발현된 단일 TIGIT 분자)상의 또는 상이한 항원 (예를 들면, 동일한 세포에 의해 발현된 상이한 TIGIT 분자, 또는 TIGIT 분자 및 비-TIGIT 분자)상의 에피토프일 수 있다. 일부 양태에서, 다중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프를 결합시킨다 (즉, "이중특이적 항체"). 일부 양태에서, 다중특이적 항체는 3개의 상이한 에피토프를 결합시킨다 (즉, "삼중특이적 항체"). 일부 양태에서, 다중특이적 항체는 4개의 상이한 에피토프를 결합시킨다 (즉, "사중특이적 항체"). 일부 양태에서, 다중특이적 항체는 5개의 상이한 에피토프를 결합시킨다 (즉, "오중특이적 항체"). 일부 양태에서, 다중특이적 항체는 6, 7, 8 개 이상의 상이한 에피토프를 결합시킨다. 각 결합 특이성은 임의의 적합한 원자가로 존재할 수 있다.
"단일특이적 항체"는 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 항체이다. 단일특이적 항체의 예는, 2가이면서 (즉, 2개의 항원-결합 도메인을 갖는), 2개 항원-결합 도메인의 각각에 동일한 에피토프를 인지하는 자연 발생 IgG 분자이다. 결합 특이성은 임의의 적합한 원자가로 존재할 수 있다.
용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 항체를 지칭한다. 실질적으로 동종 항체의 집단은, 단클론성 항체의 생산 동안 자연적으로 발생할 수 있는 변이체를 제외하고, 실질적으로 유사한 그리고 동일한 에피토프(들)을 결합시키는 항체를 포함한다. 이와 같은 변이체는 소량으로만 일반적으로 존재한다. 단클론성 항체는 복수의 항체로부터 단일 항체의 선택을 포함하는 공정으로 전형적으로 수득된다. 예를 들어, 선택 공정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론, 또는 다른 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 개선하기 위해 ("친화도 성숙화"), 항체를 인간화하기 위해, 세포 배양물에서 이의 생산을 개선하기 위해, 및/또는 대상체에서 이의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "키메라성 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정 공급원 또는 종에서 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종에서 유래되는 항체를 지칭한다.
비-인간 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 인간화된 항체는 하나 이상의 CDR로부터의 잔기가 비-인간 항체 (공여체 항체)의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 일반적으로 인간 항체 (수령체 항체)이다. 공여체 항체는 임의의 적합한 비-인간 항체, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 닭, 또는 원하는 특이성, 친화성, 또는 생물학적 효과를 갖는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 경우에, 수령체 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여체 항체로부터 상응하는 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수령체 항체 또는 공여체 항체 어느 한쪽에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같은 변형은 항체 기능을 추가로 개선하기 위해 실시될 수 있다. 추가 상세에 대하여, Jones 등, Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann 등, Nature, 1988, 332:323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596을 참고하고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원에서 유래된 (예를 들면, 인간 공급원으로부터 수득된 또는 드 노보 설계된) 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체는 구체적으로 인간화된 항체를 배제한다.
한 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물로 제공된 항체 또는 항원-결합 단백질은 특정 숙주 세포 유형을 표적한다. 한 구현예에서, 상기 항체 또는 항체는 비-숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진균 세포에 결합한다. 한 구현예에서, 항체 또는 ADP는 적어도 이중특이적이고 적어도 2개의 숙주 표적에 결합한다. 한 구현예에서, 항체 또는 ADC는 적어도 이중특이적이고 적어도 하나의 숙주 표적 및 하나의 비-숙주 표적에 결합한다. 한 구현예에서, 항체 또는 ADP는 단일특이적 또는 이중특이적이다. 한 구현예에서, 항체는 삼중특이적 또는 사중특이적이다.
한 구현예에서, 항체는 수용체를 효능화한다. 한 구현예에서, 항체는 수용체를 길항한다.
한 구현예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 추가로 전달을 위한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 이들이 투여되는 대상체에서 유래된다. 일부 양태에서, 세포는 이들이 투여되는 대상체 이외 공급원에서 유래된다. 일부 양태에서, 세포는 세포주에서 유래된다. 일부 양태에서, 세포는 인간 공급원에서 유래된다. 일부 양태에서, 세포는 인간화된 동물 공급원에서 유래된다.
일부 양태에서, 제공된 세포는 줄기 세포이다.
일부 양태에서, 제공된 세포는 지방 세포 (지방세포)이다. 일부 양태에서, 제공된 세포는 근육 세포, 신경 세포, 피부 세포, 또는 기관 세포이다. 일부 양태에서, 제공된 세포는 간 세포, 췌장 세포, 심장 세포, 폐 세포, 식도 세포, 내피 세포, 또는 상피 세포이다.
일부 양태에서, 제공된 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서 제공된 면역 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포는 CD-8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포는 CD-4+ T 세포이다.
일부 양태에서, 제공된 세포는 유용한 물질, 예컨대 인슐린, 콜라겐, 또는 항체를 생산한다. 일부 구현예에서, 이러한 능력은 재조합 DNA를 통해 도입된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 추가로 전달을 위한 소분자를 포함하되, 여기서 상기 소분자는 생물학적 활성 재료이다. 일부 구현예에서, 소분자는 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에서 약리학적 활성 또는 또 다른 직접 효과를 야기시킬 수 있거나 바디의 구조 또는 기능에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 겔/하이드로겔/나노구조물 복합재료는 또한 조직-복구 제제, 예컨대, 표피 성장 인자 (EDF), PDGF, 및 신경 성장 인자 (NGF)를 포함하는, 다수의 성장 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 EGF를 포함할 수 있다. 표피 성장 인자 (EGF)는 마우스가 이들을 핥도록 허용된 경우 실험실 마우스내 피부 상처가 더욱 신속하게 치유하게 된 것처럼 보인 관찰 후 발견되었다. 이것은 단순히 타액내 소독 제제 (예컨대 리소자임)때문이 아니었다. EGF로서 이제 공지된, 특이적 성장 인자는 원인인 것으로 밝혀졌다. EGF는 우로가스트론과 동일하고 혈관신생 특성을 갖는다. 형질전환 성장 인자-알파 (TGFa)는 동일한 수용체에 매우 유사한, 결합이고 상피 세포 재생 (상피형성) 자극에서 심지어 더욱 효과적이다.
따라서, EGF/TGF를 포함하는 본 발명의 하이드로겔은 상처 치유 및 붐스, 켈로이드 흉터 형성 (특히 화상의 경우), 피부 생착 드레싱, 및 만성 다리 궤양의 치료의 촉진에서 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 조직-복구 제제는, 표피 성장 인자 (EDF), PDGF, 및 신경 성장 인자 (NGF)를 포함하는, 다수의 성장 인자를 포함한다. 일반적으로, 성장-촉진 호르몬은 1개와 4개 조직 사이 영향을 미칠 것이다. 이와 같은 단백질로부터 개발된 다수의 제품은, 다른 징후가 있어도, 1 종류 또는 또 다른 종류의 상처 복구쪽으로 표적된다. 가장 중요한 조직 성장 인자의 일부는 추가로 아래 기재된다.
본 발명의 겔/나노구조물 조성물은 또한 본 발명의 조직 복구 방법 및 다른 적용분야에서 유용할 수 있는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 본 발명의 조성물에서 PDGF를 포함한다 고려한다. 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF)는 거의 모든 중간엽으로-유래된 세포, 즉 혈액, 근육, 골, 연골, 및 결합 조직 세포에 대하여 유사분열촉진인자이다. AA 또는 BB 호모이량체로서, 또는 AB 헤테로이량체로서 실재하는 이량체성 당단백질이다. 다수의 성장 인자와 마찬가지로, PDGF는 인자들의 더 큰 계열의 구성원이도록 이제 고려된다. PDGF 이외에, 이러한 계열은 호모이량체성 인자 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 태반 성장 인자 (PIGF), VEGF/PIGF 헤테로이량체, 및 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 인간 혈관 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 분비된 PDGF-유사 인자를 포함한다. NGF, TGFp 및 당단백질 호르몬 예컨대 인간 융모성 성선자극 호르몬 (hCG)와 마찬가지로, PDGF는 시스테인-놋트 성장 인자 수퍼패밀리의 구성원으로서 이제 분류된다. 이들 인자들의 모두는 본 발명의 하이드로겔과 함께 사용될 수 있다.
PDGF는 혈소판에 의해 생산되고 혈액 응고의 과정에서 방출된다. 이들 세포에서 유래하는 성장 인자들 중 단 하나이다. PDGF는 섬유아세포 및 백혈구를 부상의 부위에 유인하고, 뿐만 아니라 대체 연결 조직 (주로 섬유아세포 및 평활근 세포)의 성장을 자극시킨다. 콜라겐을 생산하는 것들을 포함하는, 다양한 세포에서 세포 분할을 자극하고, 그래서 혈관신생을 조장한다. 또한 유사분열촉진, 혈관수축, 화학주성, 효소 활성 및 칼슘 동원을 자극시킨다.
혈액 혈소판 유래된 성장 인자는 본 발명의 조성물을 사용하는 특정한 치료 동안 골조직 및 연조직 재성장을 회복하는데 그리고 만성 및 급성 상처의 치유 공정을 가속화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은 혈소판 유래된 성장 인자 칵테일을 유리하게 포함할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 예를 들어, PDGF 유전자의 국소 전달을 위한 유전자 요법에서 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA 인코딩 PDGF는 하이드로겔 기질 및 과립화 조직 섬유아세포 속에 편입되고, 이는 상처 주위 생존가능한 조직에서 기원하고, 기질 속으로 증식 및 이주하여, 플라스미드 유전자 전이 및 발현을 위한 표적으로서 작용한다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한 혈관신생을 촉진시키기 위한 VEGF를 포함할 수 있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF--또한 혈관 투과성 인자로서 공지됨)은 다기능적 혈관생성 사이토카인인 또 다른 혈관 성장 인자이다. 미세혈관 수준에서 내피 세포의 증식을 자극시킴으로써 양쪽 간접적으로 및 직접적으로 혈관신생 (혈관 성장)에 기여하여, 이들을 이주시키고 그들의 일반 발현을 변경시킨다. VEGF는 또한 이들 내피 세포를 초가변성으로 만들어, 이들이 혈관 공간 밖으로 혈장 단백질을 방출하게 하고, 이는 그 영역에서 변화를 야기시켜, 혈관신생에 기여한다.
본 발명의 조성물은 또한 FGF를 포함할 수 있다. 섬유아세포 성장 인자 (FGF)는 실제로 헤파린-결합 성장 인자 계열에 속하는 적어도 19 14 18 kD 펩타이드의 계열이고 배양된 섬유아세포 및 혈관 내피 세포에 대하여 유사분열촉진성이다. 이들은 또한 생체내 혈관신생성이고 이러한 혈관신생성은 TNF에 의해 향상된다. FGF는 EGF와 유사한 방식으로 사용될 수 있다. FGF-2로도 공지된 bFGF는 인간 거핵구생성 제어에 관여되고 FGF는 내피 세포 형성의 자극에서 그리고 결합 조직 복구의 도움에서 효과적인 것으로 밝혀졌다.
하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한, 상피 세포 파괴를 포함하는 다른 장애 및 상처 치유에서 사용을 위하여, FGF-7로서 또한 공지된, 케라틴생성세포 성장 인자 (KGF)를 포함할 수 있다.
형질전환 성장 인자 (TGF)는 다양한 세포주를 형질전환시키는 능력을 갖고, 예를 들어, 제한된 수 초과의 생성, 단일층 보다 다중 층에서의 성장, 및 비정상 핵형의 획득을 위하여 배양물에서 성장하는 능력을 수여할 수 있다. TGF 계열 중 적어도 5개의 구성원이 있고, 가장 널리 연구된 2개는 TGF-알파 및 TGF-베타이다. 전자는 섬유아세포 및 내피 세포에 대하여 유사분열촉진성이고, 혈관신생적이고, 골 흡수를 촉진시킨다. 조성물은 또한 TGF를 포함할 수 있다. TGF-베타는 세포 조절의 일반 매개제, 세포 성장의 강력 억제제이고, 다수 세포 유형의 증식을 억제시킨다. TGF-베타는 다른 펩타이드 성장 인자의 유사분열촉진성 효과를 길항시킬 수 있고 또한 다수 종양 세포주의 성장을 억제시킬 수 있다. TGF-베타는 또한 혈관신생적 효과를 갖고 섬유아세포에서 콜라겐 형성을 촉진시킨다. 본 발명의 하이드로겔에 대한 적응증은 만성 피부 궤양, 예컨대 당뇨병 환자에서 향신경 족부 궤양을 포함한다. 다른 영역은 상처 치유, 골 복구 및 면역억제 질환을 포함한다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 예를 들어, 적합한 세포를 운반하는데 사용될 수 있다. 이들은 상처, 또는 다른 적합한 영역에 적용하기 직전에 겔에 편입되어, 유효성을 최대화할 수 있다. 적합한 세포는, 진피 및 표피 형성을 주로 담당하는, 자가 섬유아세포 및 케라틴생성세포를 포함한다. 1개의 세포 유형을 각각 포함하는 별도 겔은 연속적으로 또는 함께 적용되거나, 하나의 겔은 양쪽 세포 유형을 포함할 수 있지만, 이것은 일반적으로 덜 바람직하다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 예를 들어, 콜라겐을 유용하게 포함할 수 있다. 콜라겐이, 이러한 형태로, 유용한 구조적 기능을 작용할 것 같지 않다고 하더라도, 단백질분해 활성이 바람직하지 않게 높은 희생적 단백질로서 주로 작용하여, 이에 의해, 예를 들어, 건강한 조직의 침연 예방을 돕는다.
하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한 특정한 효소를 포함할 수 있다. 효소는 양쪽 급성 및 만성 상처의 괴사조직제거술에서 사용된다. 괴사조직제거술은 상처로부터 비생존가능한 조직 및 이물의 제거이고 상처-복구 공정에서 자연 발생 이벤트이다. 염증성 병기 동안, 호중구 및 대식세포는 상처 영역으로부터 "사용된" 혈소판, 세포성 잔해, 및 무혈관 부상된 조직을 소화하고 제거한다. 하지만, 상당량의 파손된 조직의 축적으로, 이러한 천연 공정은 압도되고 불충분해진다. 괴사성 조직의 증강은 그 다음 상처에 상당한 식세포 요구를 두고 상처 치유를 늦춘다. 결국, 괴사성 조직의 괴사조직제거술은 국부 요법의 특정 목적이고 최적 상처 관리의 중요한 구성요소이다.
효소는, 예를 들어, 괴사조직제거술의 선택적 방법을 제공하는 국부 적용을 위하여 본 발명의 하이드로겔 속에 편입될 수 있다. 적합한 효소는 다양한 공급원, 예컨대 크릴새우, 게, 파파야, 소과 추출물, 및 박테리아에서 유래될 수 있다 상업적으로 이용가능한, 적합한 효소는 콜라게나제, 파파인/우레아, 및 피브리놀리신 및 데옥시리보뉴클레아제 조합을 포함한다.
본 발명에서 사용을 위한 효소는 일반적으로 2개 방식 중 하나로 작업한다: 피부딱지의 성분 (예를 들면, 피브린, 박테리아, 백혈구, 세포 잔해, 장액 삼출물, DNA)의 직접적으로 소화에 의해; 또는, 비혈관 조직을 기저 상처 층에 고정하는 콜라겐 "앵커"의 용해에 의해.
본 발명의 하이드로겔은, 원한다면, 항균성 효과 및 악취 제어를 일반적으로 발휘하기 위해 데이킨액(Dakin's solution)을 포함할 수 있다. 괴사조직제거술 제제로서, 데이킨액은 이의 세포독성 특성 때문에 비선택적이다. 데이킨액은 단백질을 변성시켜, 상처로부터 더욱 쉽게 제거되도록 한다. 피부딱지의 와해는 또한 괴사조직제거술을 다른 방법으로 용이하게 한다. 데이킨액을 포함하는 하이드로겔은 목표가 괴사조직제거술이면 매일 2회 변화될 수 있다. 상처주변 피부 보호는 일반적으로, 예를 들어, 연고, 액체 피부 장벽 필름 드레싱, 또는 고체 피부 장벽 웨이퍼로 제공될 수 있다.
본 발명의 겔은 임의의 적합한 방법으로, 예컨대 주사기 또는 벨로우스(bellows) 팩 (단일 용량 전달 시스템) 또는 다중용량 시스템, 예컨대 가압된 전달 시스템 또는 '캔속의 백'형 시스템 (예컨대 WO98/32675에서 공개된 것)을 통한 전달을 통해 전달될 수 있다. 벨로우스 팩의 예는 공개된 UK 디자인 번호 2082665에서 나타난다.
이처럼, 본 발명은 또한, 상처의 치료를 위하여, 본 발명에 따른 겔을 포함하는 단일 용량 전달 시스템으로 연장한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 겔을 포함하는 가압된 전달 시스템, 및 이로부터 압력의 방출시 스프레이를 형성할 수 있는 에어로졸 컨테이너에서 본 발명에 따른 가압된 하이드로겔로 확장한다. 이와 같은 전달 수단의 사용은 직접 적용에 의해 달리 도달하기 어려운 환자에서, 예컨대 환자가 누워있는 경우 환자의 등에서 겔이 영역에 전달되도록 한다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔 조성물을 생물의학 전극 및 다른 전기요법 상황에서 사용을 위하여 전기 전도성으로 만드는 것, 즉, 전극 또는 다른 전기 전도성 구성원을 바디 표면에 부착시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 조성물은 경피 신경 자극 전극, 전기외과 리턴 전극, 또는 EKG 전극을 환자의 피부 또는 점막 조직에 부착시키는데 사용될 수 있다. 이들 적용은 전도성 종을 함유하기 위해 하이드로겔 조성물의 변형을 포함한다. 적합한 전도성 종은 이온 전도성 전해질, 특히 피부 또는 다른 바디 표면에의 적용에 사용된 전도성 접착제의 제조에서 정상적으로 사용되는 것들이고, 이온화가능한 무기 염, 유기 화합물, 또는 양쪽의 조합을 포함한다. 이온 전도성 전해질의 예는, 비제한적으로, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 아세트산모노에탄올아민, 아세트산디에탄올아민, 락트산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산칼슘, 염화리튬, 과염소산리튬, 시트르산나트륨 및 염화칼륨, 그리고 산화환원 커플 예컨대 제2철염 및 제1철염 예컨대 황산염 및 글루콘산염의 혼합물을 포함한다. 바람직한 염은 염화칼륨, 염화나트륨, 황산마그네슘, 및 아세트산마그네슘이고, 염화칼륨은 EKG 적용에 가장 바람직하다. 사실상 전해질의 임의의 양이 본 발명의 접착제 조성물에서 존재할 수 있어도, 존재하는 임의의 전해질이 하이드로겔 조성물의 약 0.1 내지 약 15 중량% 범위의 농도에 있는 것이 바람직하다. 생물의학 전극 제작에 대하여 Nielsen 등 저자의 미국 특허 번호 5,846,558에서 기재된 절차는 본 발명의 하이드로겔 조성물과 사용을 위하여 순응될 수 있고, 그 특허의 개시내용은 제조 상세에 관하여 참고로 편입된다. 다른 적합한 제작 절차는 당업자에 의해 인식될 바와 같이 또한 사용될 수 있다.
가교
특정한 적용을 위하여, 특히 높은 응집 강도가 필요한 경우, 본 발명의 겔/하이드로겔의 중합체는 공유 가교될 수 있다. 본 개시내용은 가교가 겔/하이드로겔 성분의 중합체 사이에서 바람직할 수 있고, 뿐만 아니라 가교는 본 발명의 복합 재료의 나노구조물 성분과 겔/하이드로겔의 중합체 사이에서 바람직할 수 있다. 본 발명은 중합체를 서로에 가교하기 위한 임의의 적합한 수단, 및 본 발명의 나노구조물 성분으로 겔/하이드로겔 중합체를 가교하기 위한 것을 고려한다. 겔/하이드로겔 중합체는 다른 중합체에 또는 나노구조물에, 어느 한쪽 분자내로 또는 분자간으로 또는 공유 결합을 통해, 공유 가교될 수 있다. 전자의 경우에, 중합체를 서로에 또는 나노구조물에 연결하는 공유 결합은 없는 반면, 후자의 경우에 중합체를 서로에 또는 나노구조물에 결합하는 공유 크로스링크는 있다. 크로스링크는, 열 이용, 방사선조사, 또는 화학적 경화 (가교) 제제를 포함하는, 임의의 적합한 수단을 사용하여 형성될 수 있다. 가교의 정도는 압축 하에서 냉류를 제거 또는 적어도 최소화하기에 충분해야 한다. 가교는 또한, 가교 공정에서 이용된 "가교제"인 제3 분자의 사용을 포함한다.
"가교제" 또는 "가교 제제"는 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) PEG, 예를 들면 티올화된 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA), 또는 이들의 유도체의 군으로부터 적합하게 선택될 수 있다.
열적 가교를 위하여, 자유 라디칼 중합 개시제는 사용되고, 비닐 중합에서 관례적으로 사용된 임의의 공지된 자유 라디칼-생성 개시제일 수 있다. 바람직한 개시제는, 중합가능한 재료의 약 0.01 중량% 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 5% 및 가장 바람직하게는 약 0.5 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 일반적으로 사용된 유기 퍼옥사이드 및 아조 화합물이다. 적합한 유기 퍼옥사이드는 디알킬 퍼옥사이드 예컨대 t-부틸 퍼옥사이드 및 2,2비스(t-부틸퍼옥시)프로판, 디아실 퍼옥사이드 예컨대 벤조일 퍼옥사이드 및 아세틸 퍼옥사이드, 퍼에스테르 예컨대 t-부틸 퍼벤조에이트 및 t-부틸 퍼-2-에틸헥사노에이트, 퍼디카보네이트 예컨대 디세틸 퍼옥시 다카보네이트 및 디사이클로헥실 퍼옥시 디카보네이트, 케톤 퍼옥사이드 예컨대 사이클로헥사논 퍼옥사이드 및 메틸에틸케톤 퍼옥사이드, 및 하이드로퍼옥사이드 예컨대 쿠멘 하이드로퍼옥사이드 및 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드를 포함한다. 적합한 아조 화합물은 아조 비스 (이소부티로니트릴) 및 아조 비스 (2,4-디메틸발레로니트릴)을 포함한다. 열적 가교를 위한 온도는 실제 성분에 좌우될 것이고 당업자에 의해 용이하게 추론될 수 있지만, 전형적으로 약 80℃. 내지 약 200℃ 범위이다.
가교는 또한 전형적으로 광개시제의 존재 하에서 방사선조사로 달성될 수 있다. 자외선 조사가 바람직하지만, 방사선조사는 자외선, 알파, 베타, 감마, 전자 빔, 및 x-선 조사일 수 있다. 유용한 감광제는 "수소 인발" 유형의 삼중 증감제이고, 벤조페논 및 치환된 벤조페논 그리고 아세토페논 예컨대 벤질 디메틸 케탈, 4-아크릴옥시벤조페논 (ABP), 1-하이드록시-사이클로헥실 페닐 케톤, 2,2-디에톡시아세토페논 및 2,2-디메톡시-2-페닐아세토-페논, 치환된 알파-케톨 예컨대 2-메틸-2-하이드록시프로피오페논, 벤조인 에테르 예컨대 벤조인 메틸 에테르 및 벤조인 이소프로필 에테르, 치환된 벤조인 에테르 예컨대 아니소인 메틸 에테르, 방향족 설포닐 클로라이드 예컨대 2-나프탈렌 설포닐 클로라이드, 광활성 옥심 예컨대 1-페닐-1,2-프로판디온-2-(O-에톡시-카보닐)-옥심, 알킬- 및 할로겐-치환된 티옥사톤세(thioxanthonse)를 포함하는 티옥산톤 예컨대 2-이소프로필티옥산톤, 2-클로로티옥산톤, 2,4 디메틸 티옥사논, 2,4 디클로로티옥사논, 및 2,4-디에틸 티옥사논, 그리고 아실 포스핀 옥사이드를 포함한다. 200 내지 800 nm, 바람직하게는 200 내지 500 nm의 파장을 갖는 방사선조사가 본 명세서에서 사용하기에 바람직하고, 낮은 강도 자외선은 대부분의 경우에 가교를 유도하는데 충분하다. 하지만, 수소 인발 유형의 감광제로, 더 높은 강도 UV 노출은 충분한 가교를 달성하는데 필요할 수 있다. 이와 같은 노출은 수은 램프 처리기 예컨대 PPG, 융합, 크세논, 및 기타로부터 이용가능한 것들에 의해 제공될 수 있다. 가교는 또한 감마 조사 또는 전자 빔으로 방사선조사함으로써 유도될 수 있다. 적당한 방사선조사 파라미터, 즉, 가교를 유효화하는데 사용된 방사선조사의 유형 및 용량은 당업자에게 명백할 것이다.
화학적 가교 "프로모터"로서 또한 지칭된, 적합한 화학적 경화 제제는, 제한 없이, 폴리머캅탄 예컨대 2,2-디머캅토 디에틸에테르, 디펜타에리트리톨 헥사(3-머캅토프로피오네이트), 에틸렌 비스(3-머캅토아세테이트), 펜타에리트리톨 테트라(3-머캅토프로피오네이트), 펜타에리트리톨 테트라티오글리콜레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디머캅토아세테이트, 폴리에틸렌 글리콜 디(3-머캅토프로피오네이트), 트리메틸올에탄 트리(3-머캅토프로피오네이트), 트리메틸올에탄 트리티오글리콜레이트, 트리메틸올프로판 트리(3-머캅토프로피오네이트), 트리메틸올프로판 트리티오글리콜레이트, 디티오에탄, 디- 또는 트리티오프로판 및 1,6-헥산 디티올을 포함한다. 가교 프로모터는 미가교된 친수성 중합체에 첨가되어 이의 공유 가교를 촉진시키거나, 미가교된 친수성 중합체 및 상보적 올리고머의 블랜드에 첨가되어, 2개 성분 사이 가교를 제공한다.
중합체 및/또는 나노구조물은 또한 상보적 올리고머와의 혼합에 앞서 가교될 수 있다. 이와 같은 경우에, 다기능적 공단량체와 중합체에 대한 단량체성 전구체를 혼합하고 공중합시킴으로써, 가교된 형태로 중합체를 합성하는 것이 바람직할 수 있다. 단량체성 전구체 및 상응하는 중합체성 생산물의 예는 하기와 같다: 폴리(N-비닐 아미드) 생산물을 위한 N-비닐 아미드 전구체; 폴리(N-알킬아크릴아미드) 생산물을 위한 N-알킬아크릴아미드; 폴리아크릴산 생산물을 이한 아크릴산; 폴리메타크릴산 생산물을 위한 메타크릴산; 폴리(아크릴로니트릴) 생산물을 위한 아크릴로니트릴; 및 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 생산물을 위한 N-비닐 피롤리돈 (NVP). 중합은 현탁액, 용액, 또는 유탁액에서 대량으로 실시될 수 있다. 용액 중합은 바람직하고, 극성 유기 용매 예컨대 에틸 아세테이트 및 저급 알칸올 (예를 들면, 에탄올, 이소프로필 알코올, 등)은 특히 바람직하다. 친수성 비닐 중합체의 제조를 위하여, 합성은 전형적으로 상기 기재된 바와 같이 자유 라디칼 개시제의 존재 하에서 자유 라디칼 중합 공정을 통해 발생할 것이다. 다기능적 공단량체는, 예를 들어, 비스아크릴아미드, 디올의 아크릴 또는 메타크릴 에스테르 예컨대 부탄디올 및 헥산디올 (1,6-헥산 디올 디아크릴레이트가 바람직함), 다른 아크릴레이트 예컨대 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 및 1,2-에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 및 1,12-도데칸디올 디아크릴레이트를 포함한다. 다른 유용한 다기능적 가교 단량체는 올리고머성 및 중합체성 다기능적 (메트)아크릴레이트, 예를 들면, 폴리(에틸렌 옥사이드) 디아크릴레이트 또는 폴리(에틸렌 옥사이드) 디메타크릴레이트; 폴리비닐성 가교 제제 예컨대 치환된 및 미치환된 디비닐벤젠; 및 이기능적 우레탄 아크릴레이트 예컨대 EBECRYL 270 및 EBECRYL 230 (1500 중량 평균 분자량 및 5000 중량 평균 분자량 아크릴화된 우레탄, 각각--Smyrna, Ga.의 UCB로부터 모두 이용가능함), 및 이들의 조합을 포함한다. 화학적 가교 제제가 이용되면, 사용된 양은 바람직하게는 가교 제제 대 친수성 중합체의 중량비가 약 1:100 내지 1:5의 범위가 되도록 할 것이다. 더 높은 가교 밀도를 달성하기 위해, 원한다면, 화학적 가교는 방사선조사 경화와 조합된다.
나노구조물
본 발명의 나노구조물 성분은 섬유, 필라멘트, 메시부, 분지형 필라멘트 또는 네트워크, 시트, 또는 성형된 입자를 포함하는 임의의 적합한 형태일 수 있다. 나노구조물은 또한 임의의 적합한 화학적 기능적 그룹을 포함하여 본 발명의 하이드로겔의 중합체와 나노구조물 사이 공유 또는 비공유 가교를 용이하게 할 수 있다. 방법, 기술, 및 재료는 나노구조물 제조 및 기능화에 대하여 종래 기술에서 널리 공지된다.
특정한 구현예에서, 미세제작 방법은 본 발명의 나노구조물을 제조하는데 사용된다. 다양한 구현예에서, 개시된 기기는 임의의 적합한 미세제작 기술을 사용하여 조립 및/또는 제조될 수 있다. 이와 같은 방법 및 기술은 종래 기술에서 널리 공지된다.
본 명세서에 개시된 나노구조물을 제조하는데 사용될 수 있는 미세제작 공정은 리소그래피; 에칭 기술, 예컨대 레이저, 플라즈마 에칭, 포토리소그래피, 또는 화학적 에칭 예컨대 습식 화학, 건식, 및 포토레지스트 제거; 또는 3차원 인쇄 (3DP), 스테레오리소그래피 (SLA), 선택적 레이저 소결 (SLS), 탄도 입자 제조 (BPM) 및 용융 침착 모델링 (FDM)을 포함하는, 고체 자유 형태 기술; 미세기계가공; 규소의 열적 산화; 전해도금 및 무전해 도금; 확산 공정, 예컨대 붕소, 인, 비소, 및 안티몬 확산; 이온 이식화; 필름 침착, 예컨대 증발 (필라멘트, 전자 빔, 플래시, 및 음영화 그리고 단차 피복), 스퍼터링, 화학 증착 (CVD), 에피택시 (기상, 액상, 및 분자 빔), 전해도금, 스크린 인쇄, 적층 또는 이들의 조합을 포함한다. Jaeger, Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1988); Runyan, 등, Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1990); Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987-1998; Rai-Choudhury, ed., Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineering Press, Bellingham, Wash. 1997)를 참고한다. 금형으로서 사용되는 재료의 선택은 표면이 분지형 구조를 형성하도록 구성되는 방법을 결정한다.
예를 들어, 반도체 산업에서 유래되는 광리소그래피 공정 및 방법을 이용하는 Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)의 최첨단 제작 공정은 사용될 수 있다. 더욱 최근 개발된 방법은 "소프트 리소그래피" (Whitesides 등, Angew chem. Int ed, 37; 550-575, (1998)) 및 미세유체 구조학 (미국 특허 번호 6,488,872, Beebe 등, Nature; 404:588-59 (2000))을 포함한다. 중합체 마이크로디바이스 제작의 검토 및 다른 논의는 Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization; 2nd ed.; CRC Press: Boca Raton, 1997; Becker, H., 및 Locascio, L. E. "Polymer microfluidic devices". Talanta, 56(2):267-287, 2002; Quake, S. R., 및 Scherer, A. "From micro- to nanofabrication with soft materials". Science, 290(5496):1536-1540, 2000; 및 Whitesides, G. M., 및 Stroock, A. D. "Flexible methods for microfluidics". Physics Today, 54(6):42-48, 2001을 포함하고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 발명의 나노구조물은 또한 (전기방사로서 또한 지칭된) 정전 방사로 제작될 수 있다. 섬유를 형성할 수 있는 액체 및/또는 용액의 전기방사의 기술은 널리 공지되고 다수의 특허, 예컨대, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,043,331 및 5,522,879에서 기재되어 왔다. 전기방사의 공정은 일반적으로 전기장 속에 액체의 도입을 포함하여, 이로써 액체가 섬유를 생산하게 된다. 이들 섬유는 일반적으로 수집을 위한 매력적 전위에서 도체에 끌린다. 액체의 섬유로의 전환 동안, 섬유는 내성강화하고/거나 건조하다. 이러한 내성강화 및/또는 건조는, 즉, 액체가 실온에서 정상적으로 고체인 경우, 액체의 냉각에 의해; 용매의 증발에 의해, 예를 들면, 탈수 (물리적으로 유도된 내성강화)에 의해; 또는 경화 기전 (화학적으로 유도된 내성강화)에 의해 야기될 수 있다.
정전 방사의 공정은 전형적으로, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,043,331에서 개시된 바와 같이, 매트 또는 다른 부직 재료를 창출하기 위해 섬유의 사용쪽으로 지향되어 왔다. 직경 50 nm 내지 5 마이크로미터 범위의 나노섬유는 부직 또는 정렬된 나노섬유 메시로 전기방사될 수 있다. 작은 섬유 직경으로 인해, 전기방사된 직물은 내재적으로 매우 높은 표면적 및 작은 기공 크기를 소유한다. 이들 특성은 전기방사된 편물을 하기를 포함하는 다수의 적용을 위한 잠재적 후보로 만든다: 막, 조직 스캐폴딩, 및 다른 생물의학 적용.
매우 얇은 직경을 갖는 정전기적으로 방사된 섬유가 생산될 수 있다. 전기방사된 섬유의 직경, 일관성, 및 균일성에 영향을 주는 파라미터는 섬유-형성 조합에서 중합체성 재료 및 가교제 농도 (장입), 인가된 전압, 및 바늘 수집기 거리를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 나노섬유는 약 1 nm 내지 약 100 .mm 범위의 직경을 갖는다. 다른 구현예에서, 나노섬유는 약 1 nm 내지 약 1000 nm의 범위에서 직경을 갖는다. 추가로, 나노섬유는 적어도 약 10 내지 약 적어도 100의 범위에서 종횡비를 가질 수 있다. 매우 작은 직경의 섬유 때문에, 섬유가 질량의 단위당 높은 표면적을 갖는 것이 인정될 것이다. 이러한 높은 표면적 대 질량 비는 섬유-형성 용액 또는 액체가 액체 또는 용매화된 섬유-형성 재료로부터 고체 나노섬유로 순식간에 변형되게 한다.
본 발명의 나노섬유/나노구조물을 형성하는데 사용된 중합체성 재료는 가교 제제와 상용성인 임의의 섬유 형성 재료로부터 선택될 수 있다. 의도된 적용에 따라, 섬유-형성 중합체성 재료는 친수성, 소수성 또는 양친성일 수 있다. 추가적으로, 섬유-형성 중합체성 재료는 열적 반응 중합체성 재료일 수 있다.
합성 또는 천연, 생분해성 또는 비-생분해성 중합체는 본 발명의 나노섬유/나노구조물을 형성할 수 있다. "합성 중합체"는 합성으로 제조되는 그리고 비-자연 발생 단량체성 유닛을 포함하는 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 합성 중합체는 비-천연 단량체성 유닛 예컨대 아크릴레이트 또는 아크릴아미드 유닛을 포함할 수 있다. 합성 중합체는 전통적 중합 반응, 예컨대 부가, 축합, 또는 자유-라디칼 중합으로 전형적으로 형성된다. 합성 중합체는 또한 천연 단량체성 유닛, 예컨대 자연발생 펩타이드, 뉴클레오타이드, 및 비-천연 단량체성 유닛 (예를 들어 합성 펩타이드, 뉴클레오타이드, 및 당류 유도체)와 결합하여 당류 단량체성 유닛을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 이들 유형의 합성 중합체는 표준 합성 기술로, 예컨대 고상 합성으로 또는 재조합으로, 허용되는 경우에, 생산될 수 있다.
"천연 중합체"는 천연으로, 재조합으로, 또는 합성으로 제조되고 중합체성 골격에서 자연 발생 단량체성 유닛으로 이루어지는 중합체를 지칭한다. 일부 경우에, 천연 중합체는 변형, 가공, 유도체화, 또는 달리 처리되어 천연 중합체의 화학적 및/또는 물리적 특성을 변화시킬 수 있다. 이들 경우에, 용어 "천연 중합체"는 변형되어 천연 중합체로의 변화 (예를 들어, "유도체화된 천연 중합체", 또는 "탈당화된 천연 중합체")를 반영할 것이다.
나노섬유 재료는, 예를 들어, 부가 중합체 및 축합 중합체 재료 둘 모두, 예컨대 폴리올레핀, 폴리아세탈, 폴리아미드, 폴리에스테르, 셀룰로스 에테르 및 에스테르, 폴리알킬렌 설파이드, 폴리아릴렌 옥사이드, 폴리설폰, 변형된 폴리설폰 중합체 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이들 일반 클래스 내에서 예시적 재료는 폴리에틸렌, 폴리(e-카프로락톤), 폴리(락테이트), 폴리(글리콜레이트), 폴리프로필렌, 폴리(비닐클로라이드), 폴리메틸메타크릴레이트 (및 다른 아크릴 수지), 폴리스티렌, 및 이들의 공중합체 (ABA 유형 블록 공중합체 포함), 폴리(비닐리덴 플루오라이드), 폴리(비닐리덴 클로라이드), 폴리비닐 알코올을 가수분해의 다양한 정도 (87% 내지 99.5%)에서 가교된 및 비가교된 형태로 포함한다. 예시적 부가 중합체는 유리질 (실온 초과 Tg)인 경향이 있다. 이것은 폴리비닐클로라이드 및 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 중합체 조성물, 또는 합금에 대한 경우이거나 폴리비닐리덴 플루오라이드 및 폴리비닐 알코올 재료에 대한 결정성은 낮다.
본 발명의 일부 구현예에서 나노섬유/나노구조물 재료는 폴리아미드 축합 중합체이다. 더욱 특이적 구현예에서, 폴리아미드 축합 중합체는 나일론 중합체이다. 용어 "나일론"은 모든 장쇄 합성 폴리아미드에 대한 총칭이다. 또 다른 나일론은 소량의 물의 존재 하에서 엡실론 카프로락탐의 중축합에 의해 제조될 수 있다. 이러한 반응은 선형 폴리아미드인 (환형 락탐으로부터 제조된--엡실론-아미노카프로산으로서 또한 공지된) 나일론-6을 형성한다. 추가로, 나일론 공중합체는 또한 고려된다. 공중합체는 반응 혼합물에서 다양한 디아민 화합물, 다양한 이산 화합물 및 다양한 환형 락탐 구조를 조합시키고 그 다음 폴리아미드 구조에서 무작위로 위치된 단량체성 재료를 가진 나일론을 형성함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 나일론 6,6-6,10 재료는 헥사메틸렌 디아민 및 이산의 C6 및 C10 블렌드로부터 제조된 나일론이다. 나일론 6-6,6-6,10은 엡실론 아미노카프로산, 헥사메틸렌 디아민 그리고 C6 및 C10 이산 재료의 블랜드의 공중합으로 제조된 나일론이다.
블록 공중합체는 또한 나노섬유 재료로서 사용될 수 있다. 나노섬유의 제조를 위한 조성물 제조에서, 용매 시스템은 양쪽 블록이 용매에서 가용성이도록 선택될 수 있다. 하나의 예는 염화메틸렌 용매에서 ABA (스티렌-EP-스티렌) 또는 AB (스티렌-EP) 중합체이다. 이와 같은 블록 공중합체의 예는 스티렌/부타디엔 및 스티렌/수소화된 부타디엔(에틸렌 프로필렌)을 포함하는 AB 및 ABA 블록 중합체의 크라톤(Kraton)-유형, 엡실론-카프로락탐/에틸렌 옥사이드의 페박스(Pebax)-유형 그리고 폴리에스테르/에틸렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드 및 이소시아네이트의 폴리우레탄의 심파텍스(Sympatex)-유형이다.
부가 중합체 예컨대 폴리비닐리덴 플루오라이드, 신디오택틱 폴리스티렌, 비닐리덴 플루오라이드 및 헥사플루오로프로필렌의 공중합체, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 무정형 부가 중합체, 예컨대 폴리(아크릴로니트릴) 그리고 아크릴산 및 메타크릴레이트와 이의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드) 및 이의 다양한 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 및 이의 다양한 공중합체가 비교적 쉽게 방사된 용액일 수 있는 것은 이들이 저압 및 저온에서 가용성이기 때문이다. 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 같은 고도 결정성 중합체는 일반적으로 이들이 방사된 용액이 되어야 한다면 고온 및 고압 용매를 필요로 한다.
나노섬유는 또한 중합체 혼합물, 합금 형식, 또는 가교된 화학적으로 결합 구조에서 2개 이상의 중합체성 재료를 포함하는 중합체성 조성물로부터 형성될 수 있다. 2개의 관련된 중합체 재료는 블렌딩되어 유익한 특성을 가진 나노섬유를 제공할 수 있다. 예를 들어, 고 분자량 폴리비닐클로라이드는 저 분자량 폴리비닐클로라이드와 블렌딩될 수 있다. 유사하게, 고 분자량 나일론 재료는 저 분자량 나일론 재료와 블렌딩될 수 있다. 추가로, 일반 중합체성 속의 상이한 종은 블렌딩될 수 있다. 예를 들어, 고 분자량 스티렌 재료는 저 분자량, 내충격성 폴리스티렌과 블렌딩될 수 있다. 나일론-6 재료는 나일론 공중합체 예컨대 나일론-6; 6,6; 6,10 공중합체와 블렌딩될 수 있다. 추가로, 낮은 정도의 가수분해를 갖는 폴리비닐 알코올 예컨대 87% 가수분해된 폴리비닐 알코올은 98 내지 99.9% 및 더 높은 정도의 가수분해를 갖는 완전 또는 초 가수분해된 폴리비닐 알코올과 블렌딩될 수 있다. 혼합물내 이들 재료의 모두는 적합한 가교 기전을 사용하여 가교될 수 있다. 나일론은 아미드 연결에서 질소 원자와 반응성인 가교 제제를 사용하여 가교될 수 있다. 폴리비닐 알코올 재료는 하이드록실 반응성 재료 예컨대 모노알데하이드, 예컨대 포름알데하이드, 우레아, 멜라민-포름알데하이드 수지 및 이의 유사체, 붕산, 및 다른 무기 화합물, 디알데하이드, 이산, 우레탄, 에폭시, 및 다른 공지된 가교 제제를 사용하여 가교될 수 있다. 가교 시약은 반응하고 중합체 쇄들 사이에서 공유 결합을 형성하여 분자량, 내화학성, 전체적 강도 및 기계적 분해에 대한 내성을 실질적으로 개선한다.
생분해성 중합체는 또한 본 발명의 나노구조물의 제조에서 사용될 수 있다. 생분해성 재료로서 연구되어 온 합성 중합체의 클래스의 예는 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리오르토에스테르, 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리이미노카보네이트, 지방족 카보네이트, 폴리포스파젠, 폴리안하이드라이드, 및 이들의 공중합체를 포함한다. 예를 들어, 이식가능한 의료 기기와 관련하여 사용될 수 있는 생분해성 재료의 특정 예는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리디옥사논, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(글리콜리드-코-폴리디옥사논), 폴리안하이드라이드, 폴리(글리콜리드-코-트리메틸렌 카보네이트), 및 폴리(글리콜리드-코-카프로락톤)을 포함한다. 다른 생분해성 중합체와 이들 중합체의 블랜드는 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 나노섬유는 비-생분해성 중합체이다. 비-생분해성은 비-효소적으로, 가수분해적으로 또는 효소적으로 보통 분해될 수 없는 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 비-생분해성 중합체는 프로테아제에 의해 야기될 수 있는 분해에 저항성이다. 비-생분해성 중합체는 천연 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다.
나노섬유를 형성하는 조성물 내에 가교 제제의 포함은 나노섬유가 지지체 표면의 넓은 범위와 상용성이도록 한다. 가교 제제는 단독으로 또는 다른 재료와 결합하여 사용되어 원하는 표면 특징을 제공할 수 있다.
적합한 가교 제제는 에너지 예컨대 방사선조사, 전기 또는 열 에너지의 공급원에 처리된 경우 다른 재료와 공유 결합을 형성할 수 있는 적어도 2개의 잠복 반응성 활성화가능한 그룹을 갖는 단량체성 (소분자 재료) 또는 중합체성 재료 어느 한쪽을 포함한다. 일반적으로, 잠복 반응성 활성화가능한 그룹은 인접한 화학적 구조에 수득한 공유 결합을 가진 활성 종을 생성하기 위해 특정 인가된 외부 에너지 또는 자극물에 반응하는 화학 독립체이다. 잠복 반응성 그룹은 저장 조건 하에서 그들의 공유 결합을 유지하지만 외부 에너지 공급원에 의한 활성화시 다른 분자와 공유 결합을 형성하는 그룹이다. 일부 구현예에서, 잠복 반응성 그룹은 활성 종 예컨대 자유 라디칼을 형성한다. 이들 자유 라디칼은 외부 인가된 전기, 전기화학 또는 열 에너지의 흡수시 니트렌, 카르빈 또는 여기 상태의 케톤을 포함할 수 있다. 공지된 또는 상업적으로 이용가능한 잠복 반응성 그룹의 다양한 예는 미국 특허 번호 4,973,493; 5,258,041; 5,563,056; 5,637,460; 또는 6,278,018에서 보고된다.
예를 들어, Aldrich Chemicals, Produits Chimiques Auxiliaires et de Syntheses, (Longjumeau, 프랑스), Shin-Nakamara Chemical, Midori Chemicals Co., Ltd. 또는 Panchim S. A. (프랑스)로부터 이용가능한 트리클로로메틸 트리아진에 기반된 상업적으로 이용가능한 다기능적 광가교제는 사용될 수 있다. 8개의 화합물은 2,4,6-트리스(트리클로로메틸)-1,3,5 트리아진, 2-(메틸)-4,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진, 2-(4-메톡시나프틸)-4,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진, 2-(4-에톡시나프틸)-4,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진, 4-(4-카복실페닐)-2,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진, 2-(4-메톡시페닐)-4,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진, 2-(1-에텐-2-2'-푸릴)-4.6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진 및 2-(4-메톡시스티릴)-4,6-비스(트리클로로메틸)-1,3,5-트리아진을 포함한다.
사용 방법 및 예시적 구현예
본 명세서에 개시된 겔/하이드로겔/나노구조물 조성물은 수많은 조직 복구 상황에서, 뿐만 아니라 다른 적용, 예컨대 카테터 및 다른 외과 기기상의 코팅물 및 임플란트 제공에서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 겔/하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한 본 명세서에 기재된 활성 제제, 예컨대 항생제, 성장 인자, 및 면역억제 제제를 전달하는데 사용될 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 연조직 결손부에 복합 재료를 적용하는 것을 포함하는 연조직 결손부의 치유 방법을 제공하되, 여기서 상기 복합 재료는 겔 및 겔 내에서 배치된 나노구조물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 하이드로겔/나노구조물 조성물의 유리한 특성이 하기 능력을 포함하는 것이 인정될 것이다: 1) 쉬운 특성규명 및 품질 관리를 제공하는 능력; 2) 기존의 조직 기질과 통합하는 능력; 3) 새롭게 형성된 기질 속에 직접적으로 편입하는 능력; 4) 세포 및 생물활성 인자를 직접적으로 포함하는 능력; 5) 생체적합성을 유지하는 능력; 6) 생체흡수를 제어하는 능력; 7) 나노구조물로 인한 더 큰 구조적 강직성 때문에 복잡한 해부학적 형태로 쉽게 주조하는 능력; 및 8) 천연 조직 예컨대 관절 연골의 기계적 특성을 나타내는 능력.
일 적용분야에서, 본 발명의 하이드로겔/나노구조물 복합 조성물은 연골 조직을 복구하는데 사용될 수 있다. 연골 복구를 위한 현행 생물학적으로-기반된 외과 절차는 자가 연골세포 이식화, 드릴링, 관절연마 연골성형술, 미세골절, 및 모자이크 관절성형술을 포함한다. 이들 절차 모두는 국소 관절 연골 부상만을 치료하고, 예컨대 심각한 골관절염 및 류마티스성 관절염에서 보여진 연골 깍인 관절 표면을 치료하지 않는다. 또한, 이들은 연골 결손부를 채우기 위해 환자로부터 수확된 연골 조직 플러그 또는 연장된 연골세포 어느 한쪽을 사용하여 연골 결손부를 채운다. 이들 조직 또는 연골세포는, 기존의 연골 기질과 통합하였고 정상 연골의 생체역학적 특성을 갖는, 완전히 드 노보 재료, 예컨대 새롭게 합성된 히아네 연골을 합성함으로써 결손부를 피로 예상된다. 하지만, 이와 같은 절차 모두는 관절을 골관절염에 걸리기 쉽다고 생각된 섬유연골에 추가 기계적 손상을 가진 진정한 히아네 연골보다는 복구적 조직 (섬유연골)의 형성을 촉진시킨다. 게다가, 복구 재료로서 내인성 연골의 이용가능성은 환자에 대한 이의 자체 위험 및 이환율을 나타내는 이의 획득으로 상당히 제한된다. 전기의 논의로부터 명백한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 수득한 하이드로겔/나노구조물 조성물은 연골 퇴행성 질환을 앓고 있는 환자에서 유망한 새로운 요법에 대하여 실용적 재료를 나타낸다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 임의의 수의 합성 조직 이식화 또는 증대, 뿐만 아니라 다른 임상적 적용에 적합한 널리 가변하는 특성을 갖는 본 하이드로겔/나노구조물 조성물은 제조될 수 있다. 이미 기재된 바와 같이, 본 재료는 어느 한쪽 부상 또는 질환의 결과로서 생산된 연골 결손부를 복구하는데 사용될 수 있다. 그렇게 복구될 수 있는 부상으로 인한 결손부는 스포츠- 또는 사고-관련될 수 있고, 피상적 연골 층만을 관여시킬 수 있거나, 기저 연골하 골을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 복구될 수 있는 질환으로 인한 결손부는 골관절염 및 류마티스성 관절염에서 비롯하는 것들을 포함한다. 부상 또는 질환으로부터이든, 이와 같은 결손부는 어느 한쪽 성숙 또는 성장 판 연골에 있을 수 있다. 합성 성장 판 연골에 대하여 하이드로겔을 위한 제형은 성장 동안 생체재료의 제어된 생체흡수를 허용하기 위해 미치환된 스캐폴드 재료의 포함을 요구할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하이드로겔/나노구조물 조성물이 유용할 수 있는 또 다른 분야는 두경부의 연골성 조직 뿐만 아니라 연조직의 복구, 재구성 또는 증대이다. 연조직 증대 및 두경부 재구성을 위한 생체재료의 이용가능성은 성형 및 재구성 외과의 분야에서 근본적인 도전으로 남아있었다. 상당한 조사 및 투자가 적절한 생물학적 상용성 및 수명을 가진 재료의 개발을 위하여 착수되어 왔다. 이러한 조사의 성과는 유망하지 않았다. 면역적격성 동물에서 배치된 경우, 현재 제안된 재료의 구조적 통합성은 프레임워크가 흡수됨에 따라 실패한 것으로 나타난다. 게다가, 종래의 합성 재료가 우수한 수명을 제공하여도, 이들은 특정한 불가피한 함정을 나타낸다. 예를 들어, 실리콘은 안전 및 장기 면역 관련 효과의 염려로 가득채워진다. 합성 중합체 PTFE (고어텍스(gortex)) 및 실래스틱(silastic)은 더 적은 조직 반응성을 제공하지만 조직 통합을 제공하지 않고 이물 감염 및 분출의 장기 위험을 나타낼 수 있다. 본원에서 기재된 재료는 두경부의 연조직 결손부의 증대 또는 복구를 위한 합성 연조직 스캐폴드 재료를 제조하는데 유용할 것이다. 특히, 비-염증성이고, 비-면역원성이고, 적절한 정도의 점탄성 (본원의 상세한 설명 참조)을 갖고 제조될 수 있는, 하이드로겔/나노구조물 조성물은 효과적 이식가능한 스캐폴드 재료로서 사용될 수 있다.
또한, 본 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 예를 들어, 신규한, 생체적합성 및 생체순응성 재료로서 사용되어 외상 또는 선천성 이상에 속발한 연골성 또는 골성 결손부를 복구하기 위해 두경부의 재구성 절차에서 빈번하게 사용되는 연골 임플란트를 제조할 수 있다. 귀에 특정한 적용은, 외상으로 인한 연골성 결손부, 신생물 (즉, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 및 흑색종), 및 선천성 결손부 예컨대 소이증을 복구하기 위해 종종 착수되는, 귀성형술 및 귀의 재구성을 포함한다. 코에 특정한 적용은 코 및 코중격의 미용적 및 재건 절차를 포함한다. 콧등 혹 증대, 코끝, 방패 및 확장 이식은 미용 융비술에서 빈번하게 사용된다. 외상 이후 코 재구성, 신생물, 자가면역 질환 예컨대 베게너 육아종증, 또는 선천성 결손부는 복구를 위한 연골이 필요하다. 중격 천공은 관리하기 어렵고 종종 치료에 실패한다. 연골 이식편은, 자가 또는 공여체 연골이 종종 이용불가능함에 따라, 이들 적용에 이상적일 것이다. 목에 특정한 적용은 후두기관 재구성을 포함하고, 이는 어린이들에서 일반적으로 늑 연골 수확이 필요하고, 이는 이환율 없이 안된다. 귀 및 중격 연골은 종종 이러한 적용에 불충분하다. 본 명세서에 개시된 하이드로겔로부터 제조된 합성 연골성 재료는, 하이드로겔 합성의 파라미터 예컨대 시약 농도, 치환 및 가교 속도의 조율에 기반하여, 전기 적용의 각각에 맞도록 합성될 수 있다. 후두기관 재구성은 성문하 또는 기관 협착증으로 인해 협소해지는 기도를 위하여 일반적으로 수행된다. 병인은 외상성 (즉, 삽관 외상, 또는 기관절개) 또는 특발성일 수 있다. 다른 가능성은 턱 및 볼 증대, 그리고 아래 눈꺼풀의 외반증 복구에서의 사용을, 수많은 두개안면 적용 외에, 포함한다. 이들 적용이 귀 연골의 엄격한 기계적 특성을 가진 연골이 필요하지 않을 수 있음이 주목될 수 있다. 세포 집단 또는 생물활성 제제의 포함은 또한 바람직할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한, 감염 및 피막으로 이어지는 비관에서 유체의 만성 풀링을 예방하기 위해, 지나치게 공격적인 수술 절제 이후 정상적으로, 비강의 복구 및 협소화에 사용될 수 있다. 또 다른 유망한 적용은, 예를 들어 수술 절차 예컨대 심혈관 수술 동안 삽관으로 인한 후두기관 부상의 결과로서, 양쪽 어린이 및 성인에서 후두기관 재구성에 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한 암에 대한 목 절제 이후 경공맥을 보호하기 위해 윤상 연골 대체를 제공하는데 사용될 수 있다--본 발명의 조성물은 피부 장벽의 상실에 대해 경동맥을 위한 보호성 장벽으로서 피부와 경동맥 사이 배치될 수 있다. 절제된 신경의 뉴런 재증식 동안 보호성 코팅물로서--종종 섬유성 조직은 이의 궁극적인 형성을 예방하는 뉴런 재증식보다 더 빨리 형성한다. 본 발명 예비-주조 튜브의 하이드로겔/나노구조물 조성물 내에서 신경 단말의 배치는 재증식의 부위로부터 섬유성 조직 형성을 배제할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한 임의의 내부 또는 외부 기관의 연조직 결손부의 복구에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재료는 턱 및 볼 증대를 위하여, 그리고 아래 눈꺼풀의 외반증 복구에서 사용을 위하여, 수많은 두개안면 적용 외에, 사용될 수 있다. 두경부 이외 부위에서 미용 및 재건 목적으로, 예를 들어 유방 또는 목에서 (즉 암으로 인한) 림프절의 제거 후 남겨진 공간을 충전하기 위해, 림프관을 밀봉하고 감염 및 다른 합병증을 초래할 수 있는 절제 부위 속으로 제어되지 않은 유체 배출을 감소시키기 위해, 예를 들어, 상처 밀봉재로서, 유방 확대를 위한 유방 임플란트로서 용도.
상기 용도 이외, 본 명세서에 기재된 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 연골의 인공 형태의 합성에 대하여 상기 기재된 바와 같이 유사한 전략 및 방법론을 사용하여, 비제한적으로, 골, 힘줄, 인대, 반월판 및 추간판을 포함하는, 합성 정형외과 조직을 생산하기 위해 다른 조직 공학 적용에서 사용될 수 있다. 하이드로겔/나노구조물 조성물은 또한, 연골의 인공 형태의 합성에 대하여 상기 기재된 바와 같이 유사한 전략 및 방법론을 사용하여, 비제한적으로 성대, 초자체, 심장 판막, 간, 췌장 및 신장을 포함하는 합성 비-정형외과 조직을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 하이드로겔/나노구조물 조성물이 사용될 수 있는 또 다른 분야는 복부 또는 위장 기관에서 흉터 조직 또는 협착의 형성을 치료 또는 예방하는데 필요한 위장 응용에 있다. 흉터형성 및/또는 협착 형성의 치료 및 예방에서 유용하도록 설계되거나 의도된, 일반적으로 "하이드로겔"로 불리는, 다양한 병기의 임상 및 FDA 승인에서 다수의 제품이 이미 있다. 본 발명의 재료는 본 명세서에 개시된 것이 하이드로겔 재료에 지지체, 형태, 및 강도를 제공할 수 있는 나노구조물을 포함할 수 있다는 점에서 다른 공지된 하이드로겔보다 우수하다. 본 명세서에 개시된 하이드로겔/나노구조물 조성물은, 위장관의 협착 또는 흉터형성의 치료를 포함하는, 이미 공지된 하이드로겔이 사용되거나 사용되기 위한 것임에 따라 유사한 적용에서 사용될 수 있다. 치료는 흉터형성을 예방하기 위해 예상된 협착의 부위에, 또는 재발로부터 협착을 예방하기 위해 협소화된 GI 관을 확대하기 위한 요법 후 기존의 협착의 부위에 하이드로겔 재료의 주사를 포함한다.
본 발명의 재료는 또한 식도 협착의 치료에 사용될 수 있다. 식도 협착은 위식도 역류 질환 (GERD)의 흔한 합병증이다. GERD는 식도 속으로 역류하는 산, 담즙 및 다른 해로운 위 내용물 및 식도 내층 세포 부상에 의해 야기된다. GERD 환자의 대략 7-23%는 식도 협착, 또는 식도의 섬유성 흉터형성을 발생시킨다. 식도 흉터형성은 또한 바렛 식도를 치료하는데 사용된 절제성 요법에 의해 야기될 수 있다. 이와 같은 절제성 요법의 주요 합병증은 절제성 부상이 식도 벽 속으로 너무 깊게 확장하고 식도 흉터 또는 협착을 초래한다는 것이다. 식도 협착은 정상 연하를 예방하고 환자 이환률의 주요 원인이다. 본 명세서에 기재된 재료는 GERD, 바렛 식도, 및 식도 절제성 요법에서 비롯하는 식도 협착을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 복합 재료는 또한 크론병의 치료에 사용될 수 있다. 크론병은, 정상 장 기능을 예방하는, 장의 내강을 차단제거 또는 협소화하는 협착 또는 흉터를 야기시킨다. 본 재료는 이와 같은 협착을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
복합 재료는 또한 원발 경화성 담관염 (PSC)의 치료 방법에서 사용될 수 있다. PSC는 간의 담관의 희귀 질환이다. 담관은 에버 내에서 분지형 네트워크를 형성하고 십이지장 속으로 담즙의 담낭 및 간을 배출하는 공통 담관 속에 조합되는 2개의 주요 가지를 통해 간을 빠져나간다. 담관은, 정상적으로 그들의 최대 최원위 부분에서 최대 2 mm만 측정하는, 직경이 매우 협소하고, 게다가 이들은 수 리터의 담즙을 매일 간에서 십이지장으로 배출시켜야 한다. 이들 담관의 임의의 차단은, 많은 독소 및 특히 헤모글로빈 파괴 산물을 바디에서 축적시키는, 황달로서 공지된 심각한 병태를 초래할 수 있다. PSC는 간을 소장에 연결하는 상기 기재된 간외 담관에서 그리고 간 내에서 담관의 흉터형성 또는 구조화 질환이다. PSC의 담관 협착은 본 하이드로겔/나노구조물 조성물로 치료 또는 예방될 수 있다.
본 발명의 복합 재료는 또한 만성 췌장염을 치료하는데 사용될 수 있다. 만성 췌장염은 췌관의 흉터 또는 협착에 의해 복잡해 수 있는 췌장의 만성 염증성 질환이다. 이들 협착은, 췌장을 관 또는 배출 도관의 시스템을 통해 소장으로 정상적으로 빠져나가야 하는, 췌액의 배출을 차단한다. 췌액은 정상 소화 및 영양 흡수에 중요한 많은 소화 효소 및 다른 요소를 함유한다. 만성 췌장염에 의한 췌관의 차단 또는 협소화는 췌장이 자가소화하고 생명위협 복부 감염 및 또는 농양을 형성하는 심각한 합병증을 초래할 수 있다. 만성 췌장염의 췌장 협착은 본 하이드로겔로 치료 또는 예방될 수 있다.
현재 기재된 조성물은 또한 담석-유도된 담관 및 췌관 협착의 치료에 사용될 수 있다. 담석은 매우 흔한 장애이고, 이의 주요 합병증은, 허혈성 장 질환의 치료를 위하여 하이드로겔로 치료 또는 예방될 수 있는, 담관 및 췌관 협착의 형성이다. 창자는 그들의 혈액 공급이 손상되는 경우 흉터 또는 협착이 형성되기 쉽다. 손상된 혈류는 허혈로 불리고, 심혈관 질환, 죽상경화증, 저혈압, 저혈량증, 신장 또는 간 질환-유도 저알부민혈증, 혈관염, 약물-유도 질환, 및 많은 기타를 포함하는, 많은 병리에 의해 야기될 수 있다. 이들 병인의 모두의 말기 결과는 장을 차단제거하고 이의 정상 기능을 예방하는 창자 협착을 초래할 수 있다. 본 하이드로겔/나노구조물 복합재료는 허헐성 장 협착을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 방사선조사-유도 창자 협착의 치료에 사용될 수 있다. 암에 대한 방사선조사 요법은 수많은 이환율과 관련되고, 이들 중 중요한 것은 창자 협착 형성이다. 본 하이드로겔 복합재료는 방사선조사-유도 창자 협착을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
합성 조직 제조 또는 천연 조직 복구 외에, 본 명세서에 개시된 하이드로겔/나노구조물 복합재료는 또한 외과에서 사용되도록 비-생물학적 구조 또는 기기를 위하여 또는 달리 생체내 이식화, 예컨대 외과용 기구, 또는 세라믹 또는 금속 보철을 위하여 코팅물을 제공하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 코팅물은 비-생물학적 기기 재료와 살아있는 조직 사이 장벽을 제공할 것이다. 비-생물학적 기기를 위한 장벽으로서 하이드로겔의 역할은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 1) 기기 표면에 단백질 찌꺼기형성 또는 혈전증을 초래할 수 있는, 비-생물학적 기기의 표면에서 거대분자 및/또는 세포의 흡수의 예방; 2) 다른 비-생물학적으로 상용성 재료로 만들어진 기기를 위한 비-독성, 비-염증성, 비-면역원성, 생물학적으로 상용성 표면의 제시; 3) 기기 기능 예컨대 글루코스 센서를 위한 글루코스의 확산, 압력 센서를 위한 기계력의 전송, 또는 혈관 이식편 또는 스텐트의 혈관내피화와의 상용성; 4) 기기 기능의 향상, 예컨대 MEMS 기반 인공 네프론에서 기존의 크기 장벽에 전하 장벽의 제공; 5) 수성, 생리학적으로 상용성 환경 내에서 봉입된 생존가능한 세포 집단의 비-생물학적 기기 속으로의 편입; 및 6) 기기의 혈관화, 상피화 또는 혈관내피화를 조장하도록 설계된 약물 또는 생물활성 인자 예컨대 성장 인자, 항-바이러스 제제, 항생제, 또는 접착 분자의 포함.
전기에 기반하여, 본 발명의 하이드로겔/나노구조물 복합재료는 당뇨병의 관리를 위하여 이식가능한 글루코스 센서를 포함하는 다양한 이식가능한 기기에 비-알레르기 코팅물을 제공하는데 사용될 수 있다. 또한, 하이드로겔/나노구조물 복합재료는 하기를 제공하는데 사용될 수 있다: MEMS-기반 인공 네프론의 발생을 위한 전하 장벽; 매립된 신장 세포 예컨대 족세포가 MEMS-기반 인공 네프론 설계 속에 편입될 수 있는 수성, 생리학적으로 상용성 환경; 및 비제한적으로, 약물 전달, 기계적 센싱, 및 생물-검출 시스템으로서 포함하는 다양한 목적으로 설계된 이식가능한 MEMS 기기를 위한 코팅물.
개시된 하이드로겔/나노구조물 복합재료, 및 특히 히알루로난-기반 하이드로겔은 또한, 예를 들면 규소 표면에 티라민의 1차 아민의 제1 공유 부착을 통해, 규소-기반 기기에 공유 부착되어 하이드록시페닐 코팅된 표면 화학을 제공할 수 있다. 이것은 규소 표면에 자유 아민으로 변형된 DNA를 결합하는데 사용된 동일한 화학을 사용할 수 있다. HA-기반 하이드로겔은 그 다음 상기 기재된 이의 바람직한 가교 모드로 사용된 동일한 퍼옥시다제 구동 화학에 의해 하이드록시페닐 코팅된 표면에 공유 커플링된다.
하이드로겔/나노구조물 복합재료는 또한 비-생물학적 심혈관 기기 예컨대 카테터, 스텐트 및 혈관 이식편 코팅을 위하여 사용될 수 있다. 이들은 그들의 생물학적 비호환성 때문에 관례적으로 사용되지 않은 재료로 만들어진 기기를 포함할 것이지만, 이는 현재 사용중인 기기들보다 우수한 설계 특징을 갖는다. 생물활성 인자는 하이드로겔 속에 편입되어 하이드로겔의, 그리고 따라서 이식된 기기의 혈관내피화 또는 상피화를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 하이드로겔/나노구조물 복합재료를 위한 특정 예 및 용도가 본 명세서에 기재되었어도, 이와 같은 특정한 용도는 제한되기 위한 것이 아니다. 본 발명의 하이드로겔/나노구조물 복합재료는 공지된 하이드로겔을 위하여 일반적으로 사용된 임의의 응용에 사용될 수 있고, 특히, 바디에서 어디든지 연조직의 복구 및/또는 재생에 유용하다.
실시예
실시예 1. 감소된 염증 프로파일을 가진 제자리 형성 복합재료
5mg/mL의 티올화된 HA (HA-SH), 10mg/mL의 폴리카프로락톤 (PCL) 섬유 및 조합된 아크릴레이트 및 말레이미드 농도 (5mg/mL)와 티올 농도 1:1을 매칭하도록 설정된 PEGDA의 농도를 포함하는 제자리-형성 복합재료는 개발되었다. 성분들은 함께 혼합되어 겔형성을 시작하기 위해 수술전 대략 30 분 반응하였고, 겔형성의 대부분은 제자리 완료되었다.
겔형성 성공이 시험관내 및 동물 (피하 (s.c.) 주사에 의한 설치류 및 토끼)에서 달성된 반면, 티올화된-HA를 이용하는 화학 제조는 피하 토끼 모델에서 주사된 경우 단기 중간정도 염증을 야기시켰다. 감소된 염증을 가진 복합 제형을 생산하기 위해, HA와 PEG 사이 반응성 그룹은, 섬유-말레이미드 성분을 포함하는 초기 제형을 유지하면서, 반전되었다.
도 1a에서 도시된 바와 같이, 상향 화살표는 HA-SH 및 PEGDA을 함유하는 겔의 주사 부위를 나타내고; 반면 하향 화살표는 HA-Ac 및 PEGSH를 함유하는 대안적 조성물의 주사 부위를 나타낸다.
유사한 염증 프로파일은 화합물이 돼지 모델에서 재차 시험된 경우 관찰되었다. 겔 및 복합재료는 주사당 400μL의 부피로 돼지 안쪽 허벅지에 피하로 주사되었다. 조직은 후속 48 시간 넘게 이미지화된 다음 수확되었다. 모든 그룹에 대한 피부 염증은 육안으로는 양성으로 보였다 (도 1b).
하지만, 조직학적 분석 (메이슨 트리크롬 염색) 하에서, 티올화된-HA 그룹내 강한 급성 (48 시간) 면역 반응은, 주사 부위, 적색의 주변에서 단핵구 활성화에 의해 가시화된 경우, 주사 부위가 숙주 조직과 주사 사이 한정적 경계로 캡슐화되기 때문에 나타났다 (도 1c). HA 아크릴레이트 (HA-Ac) 그룹은 HA 상업적 음성 대조군 그룹과 더욱 유사하여, 숙주-임플란트 계면에서 캡슐화를 거의 보여주지 않았다.
새로운 제형은 5mg/mL HA-Ac 및 6mg/mL PEGSH (PEG 티올; 4-아암 10k MW PEGSH, 그 비가 최대 기계적 강도를 제공하였기 때문에 티올 대 아크릴레이트+말레이미드의 양 2배)를 사용하였다. HA-Ac는 731k Da의 분자량 및 10-12.5% 아크릴화 정도를 가졌다. 또한, 200k HA-Ac는 또한 시도되었지만, 수득한 겔은 훨씬 더 약했다.
토끼에서 염증 프로파일을 추가로 감소시키기 위해, 2-아암 PEGSH 가교제는 티올 대 아크릴레이트+말레이미드의 1:1 화학양론으로 사용되었다. 원하는 저장 탄성률을 달성하기 위해, HA-Ac 7mg/mL의 약간 더 높은 초기 농도가 사용되었다. 섬유 성분은 8-10mg/mL로 유지되었고, 6.9 mg/mL와 동일시하였던 5k PEGSH로, 2-아암 PEGSH가 1:1 화학양론을 갖도록 설정되었다. PEGSH 샘플의 3.4kDa 및 8kDa 분자량은 또한 시험되었지만, 이들은 동일한 화학양론에서 더 약한 겔이었고, 5kDa MW는 제자리 겔화 제형으로서 선택되었다.
자기 공명 영상 (MRI)는 이러한 제형의 2개 변이형 (5.5mg/mL HA-Ac에 기반된 더욱 연한 제형, 및 7.5mg/mL에 기반된 더욱 강직한 제형; 도 1d, 표 2)를 평가하는데 사용되었다. 도면에서 보여진 바와 같이, 절차후 팽윤은 상업적 쥬비덤® 대조군과 비교하여 거의 관찰되지 않았다. 시험된 2개의 복합재료는 관심의 강직성 체제의 양쪽 단말에서 제형화되었다 (표 1). 이들 제형은, 본 명세서에 개시된 복합재료의 조율가능성을 증명하는 쥬비덤®의 2개 시험된 변이형: 울트라(Ultra) XC® 및 볼루마(Voluma)®과 강직성에서 유사하다.
Figure pct00005
도 1e에서 보여진 바와 같이, 상업적 대조군과 비교하여 복합재료에 대하여 부피 유지는, 상업적 대조군과 비교하여 본 발명의 복합재료의 감소된 염증을 보여주는, MRI 정량화로 또한 사정되었다.
실시예 2. 새로운 조성물을 가진 예비-반응된 복합 비드
저장 안정성을 개선하기 위해 그리고 최종 사용자를 위하여 겔을 더욱 단순하고 더욱 일관되게 만들기 위해, 예비-반응된 비드화된 제형을 포함하는 겔은 형성되었고, 여기서 상기 제형 (7mg/mL HA-Ac, 말레이미드가 있는 8 내지 10 mg/mL의 섬유, 및 6.9 m/mL의 PEGSH)는 37℃에 대량으로 완전히 반응된다. 제조 동안 겔을 예비-반응시킴으로써, 불안정한 기능적 그룹은 보호될 필요가 없었고, 최종 사용자에 의한 광범위 혼합 및 경화에 대한 필요성은 제거되었다.
벌크 겔은 150 또는 250 μm 비드로 형성된 다음, 건조 공정 동안 미세구조를 보호하기 위해 그리고 제품의 수명을 연장하기 위해) 수크로스, 트레할로스, 및 염화나트륨의 등장성 용액에서 동결건조된다. 겔 비드는 그 다음 물과 재구성되고 수초 내에, 동결건조에 앞서와 동일한 저장 탄성률로, 주사에 준비된다. 비드화된 복합재료의 광학 현미경검사 이미지는 도 2에서 도시된다. 도 2a는 250-㎛ 직경 비드로 특수화된 후 복합재료를 도시하고; 도 2b는 추가 동결건조 및 재수화된 후 복합재료를 도시하여, 복합재료가 이의 본래 모습을 유지함을 예시하고; 도 2c는 LS 비드화된 제형의 하이드로겔 성분 및 나노섬유를 묘사하는 10x 이미지이고; 도 2d는 비-희석된 상태에서 비드화된 제형의 광학 현미경검사 이미지이다.
도 2에서 그려진 비드가 100x로 희석되어 비드의 가시화를 가능하게 만든다는 것을 주목한다. 비-희석된 상태에서, 수득한 겔은 개별 비드가 식별할 수 없는 예비-비드화된 상태와 거시적으로 동일하게 보인다 (도 2d). 이러한 명료화는 제안된 작용의 기전에 중요하다. 숙주로부터 침윤 세포는 천연 세포외 기질 (ECM)과 유사한 방식으로 복합 재료와 상호작용한다. 동결건조된 비드는 그 다음 수초 내에 재수화될 수 있고 최종 사용자를 위하여 오랜 작업 시간과 일관된 겔 특성을 가질 수 있다. 비드 크기, 동결건조 공정, 및 동결건조 제형은 비드로 해체, 동결건조, 그 다음 재수화된 후 초기 특성에 대한 일관성을 가장 잘 유지하는 것으로 사정되어 왔다. PBS에서 건조된 제형이, 미세구조 수준에서 변화를 나타내는 이의 저장 탄성률에 대해 훨씬 더 큰 변화를 가졌기 때문에, 동결건조 제형은 중요한 변수이었다. 일차 건조 상은 개별 입자로서 비드를 유지하기 위해 -30℃에서 또는 그 이하에서 유지된 선반 온도가 필요하였다--더 높은 동결건조 온도는 주사기 속에 더 이상 흡인될 수 없는 재료의 고체 플러그를 초래하였다. 상기 기재된 복합재료에 대하여 저장 탄성률에 관한 동결건조 및 비드화의 비-효과는 도 2e에서 묘사된다.
실시예 3. 상이한 크기의 복합 비드의 유동학적 특성의 결정
상이한 크기의 비드는 1mm, 250 ㎛, 150 ㎛, 및 90 ㎛의 메시 크기를 가진 스크린을 사용하여 제조되었다. 입자는 주사가능성 (성형외과 의사들로부터의 평가) 및 유동학적 특성에 대하여 사정되었다. 1000-㎛ 비드는 그들의 직경이 25-게이지 바늘의 구멍 크기보다 훨씬 더 컸기 때문에 주사가능하지 않았고, 반면 90-㎛ 비드는 비드화 공정에서 심하게 손상되었고; 그러므로, 양쪽 크기는 추가 연구로부터 배제되었다. 250-㎛ 및 150-㎛ 비드 그룹 둘 모두는 27-게이지 바늘을 통해 부드럽게 주사하였다. 이들 비드 크기는 관련 바늘 크기 (25-게이지 = 250 ㎛, 27-게이지 =210㎛, 및 30-게이지 바늘 = 160 ㎛)의 내부 직경으로서 유사한 규모이다. 250 ㎛ 및 150-㎛ 비드의 유동학적 특성은 도 3에서 도시된다. 저장 탄성률은 재료의 고체 플러그가 비드 속에 형성되는 경우 약간 감소하지만, 수득한 비드는 우리의 표적 강직성 범위 내에 있고 초기 제형을 변화시킴으로써 더 강직하게 또는 더 연하게 만들어질 수 있다. 250-㎛ 및 150-㎛ 비드는 유사한 유동학적 특성을 보여주었고 양쪽은 추가 연구에 적합하였다.
실시예 4. 토끼 모델에서 피하 주사를 이용한 피내 반응성
비드화된 제형은 다음에 토끼 피하 주사 모델에서 쥬비덤 볼루마®에 대해 정면으로 시험되었다. 조직학에 따라, 조직 슬라이드의 맹검 사정은 실시되었다 [CRO로부터 방법을 도입할 필요가 있다]. 표 2는 3개의 상이한 카테고리 (염증, 부종, 및 섬유증)에 대하여 절개된 샘플을 사정하는데 사용된 등급화 척도를 보여준다. 이것은 피내 반응성 등급매기기를 위하여 ISO10993 시험 패키지에서 필요해질 유사한 시험 형식이다. 표 3에서 보여진 바와 같이, 본 명세서에 개시된 비드화된 제형은 쥬비덤 볼루마와 비교하여 염증, 부종, 및 섬유증에서 더 낮은 전체적 효과를 초래하였다.
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Figure pct00007
실시예 5. LS-1 비드화된 복합재료의 특성규명.
초기 비드화된 제형 LS-1 (7mg/mL HA-Ac, 7.1mg/mL PEGSH, 10mg/mL 섬유)에 대한 MRI 결과는, 랫트 모델에서 불충분한 지속성을 가졌던, 실시예 1에서 기재된 제자리 겔화 제형의 것과 유사하였다 (도 4a). 생체내 비드화된 LS-1 제형의 지속성을 향상시키기 위해, HA-Ac 및 섬유 성분의 농도는 증가되었고, HA-Ac의 분자량은 최적 생체적합성 프로파일을 유지하면서 지속성을 개선하기 위해 증가되었다. 이들 변화가, 이전 벌크 겔 제형이 아닌, 예비-형성된 나노섬유-HA 하이드로겔 복합 입자로 만들어질 수 있을 뿐임을 주목한다. HA의 MW의 증가의 효과를 시험하기 위해, 731 kDa의 평균 MW를 가진 HA를 사용하는 복합재료는 생성중이었다. 지속성을 개선하기 위한 시도로, 더 높은 분자량 HA를 가진 복합재료는 본래의 복합재료에 사용된 바와 동일한 GMP 공급원으로부터 사용되었다. 도 4b에서 도시된 바와 같이, 더 높은 MW 복합 겔 (1.55M Da 및 2.67M Da)는 초기 더 낮은 분자량 원형 (731kDa)와 비교하여 약간 더 높은 저장 탄성률을 갖지만 임상적으로-관련 게이지 바늘을 통해 완전히 주사가능해진다. 더 높은 MW 복합재료의 향상된 지속성을 증명하기 위해 시험하는 생체내 MRI.
제자리 형성 복합 제형을 최적화하는 경우, 폴리캅트로락톤 (PCL) 섬유의 장입은 31-G 바늘을 통해 벌크 하이드로겔 복합재료를 더 쉽게 주사하기 위해 1% 미만 (팽윤된 복합재료의 w/v)이도록 유지되었다. 예비-형성된 복합 입자를 최적화하는 경우, 주사가능성은 걱정이 덜하다. 그러므로, PCL 섬유 대 HA 하이드로겔의 더 높은 비에서 PCL 나노섬유의 보강 효과는 조사된다. 증가된 섬유 장입은 또한 기질을 통해 세포 이주를 개선할 수 있고 침윤 세포로부터 콜라겐 침착을 향상시킬 수 있다. 추가로, PCL 섬유 성분은 가수분해 또는 효소 분해 공정에 가장 저항성이다.
전단 저장 탄성률에 관한 HA 농도의 효과를 시험하기 위해, (더 높은 농도의 PEG 가교 제제와 함께) 더 높은 농도의 HA는 가교 밀도 및 강직성을 증가시키기 위해 그리고 내구성을 연장하기 위해 사용되었다. 이러한 방법은 PEG 가교제를 처음 사용한다. 가교 밀도는 세포 침윤을 허용하도록 최적화되어야 한다. 미립자화된 복합 입자 사이 공간은 또한 강직성이 최적화되면 세포 침윤 및 이주를 조장할 수 있다. 도 4c는 동일한 HA MW 및 섬유 장입 조건 하에서 제조된 복합재료의 전단 저장 탄성률에 관한 HA 농도 (mg/ml)의 효과를 도시하고; 도 4d는 동일한 HA MW 및 섬유 장입 조건 하에서 제조된 복합재료의 압축 저장 탄성률에 관한 HA 농도 (mg/ml)의 효과를 도시한다.
상이한 가교 밀도 및 강직성을 가진 복합 입자를 조합하기 위해, 예비-형성된 복합 입자는 높은 및 낮은 가교 밀도 (강직성)으로 혼합되고 입자들의 양쪽 유형의 이점 (더 강직한, 더 느린 분해, 및 더 오랜 지속; 대 더욱 다공성, 더욱 양호한 세포 침윤, 및 혈관화)는 조합된다. 복합 입자들의 2개 유형의 비는 또 다른 신규한 조율가능한 파라미터이다.
LS 제형의 14개 변이형은 이들 최적화 파라미터에 기반하여 만들어졌고 MRI 부피 유지 모델에서 시험중이다 (도 6a, 표 4). 설치류 연구에서 이들 파라미터의 최적화를 통해, 우리는 향상된 조직 내부성장 및 더욱 천연 느낌을 유지하면서 기존의 상업적 표준에 비교가능한 내구성을 회복하였다. 다수의 LS-2 내지 LS-14 제형이 예비-비드화된 형태로의 스위치에 의해 최종 제형으로서 심사숙고를 위하여 실용적으로 만들어졌을 뿐이고 저장 탄성률 (Pa)로 표시된 경우 본래의 LS-1 제형으로부터 (실질적으로 일부 경우에) 겔 강직성이 증가하였기 때문에 초기 제자리 반응 화학으로 불가능하였음을 주목한다. 이러한 연구로부터 대표적 그룹은 도 4e에서 묘사된다. 쥬비덤® 볼루마 XC®은 연구를 위하여 시판되는 대조군으로서 작용하였다.
Figure pct00008
실시예 6. MRI에 의한 조직 내부성장의 평가 및 조직학적 분석
조직 내부성장은 쥬비덤 볼루마 충전재와 비교하여 MRI 영상 및 조직학적 분석 (도 5a-5b)를 특징으로 하였다. MRI 분석에 의해 예시된 바와 같이 합성 조직과 숙주 조직 사이 물 함량에서 차이로 인해, 스캐폴드는 밝은 백색으로 보인다. 경시적으로, 주사 부위를 둘러싸는 숙주 조직은 침윤하기 시작하여, 신 조직을 형성한다. 이것은 절반-영구적 주사가능성으로 해석할 수 있고, 여기서 스캐폴드는 숙주 조직이 결손부 부위를 복구하기에 충분히 오래 존재하지만 천연 숙주 조직에 의해 리모델링된다. 충전재가 분해 기전을 견딜 수 있는 한 동안 바디가 존재할 뿐이고 캡슐화하는 전통적 HA 하이드로겔 (산스(sans) 섬유)와 이것은 직접 대조이다 (도 5b).
도 5a 및 5b에서 도시된 바와 같이, 5개의 입력 파라미터 (하이드로겔 분자량, 하이드로겔 변형 정도, 하이드로겔 농도, 나노섬유 농도, 및 가교 밀도)는 생체내 지속성 및 성능의 개선에 대한 파라미터가 아직 결정되지 않았기 때문에 변경되었다. 78-일 기간 (현재까지, 연구 계속)에 걸쳐 데이터 수집 후 부피 유지에서 가장 중요한 영향을 가진 입력 파라미터는 결정되었다. 도 5c에서 도시된 바와 같이, 선형 회귀 모델의 선형 예측 능력은 14 및 30 일 (R2 = 0.95 및 0.86, 각각)에 허용가능하다. 그들 선형 모델에 대한 기여자는 경시적으로 변화한다. 14-일 기간에서, 하이드로겔 농도는 최대 입력 기여자이었다. 이것은 하이드로겔이 생체내 팽윤하기 때문일 것 같고, 따라서 더 높은 농도 겔이 더 낮은 농도 겔보다 더 많은 팽윤을 야기시켰다. 가장 흥미롭게, 나노섬유 농도는 주사 후 30 일에 가장 큰 영향을 가졌다. 유사하게 섬유는 조직 내부성장 안내를 돕고 그러므로 최상의 성능화 복합 제형에서 보여진 연장된 부피 유지에 중요하다.
실시예 7. 랫트 모델에서 MRI를 이용한 팽윤 측정
상기 기재된 복합 비드의 LS 시리즈의 완전 반응된, 미립자화된 제형은 상업적 피하 충전재 예컨대 쥬비덤과 비교된 경우 우수한 팽윤 특성을 보여준다. 구체적으로, 설치류 MRI 모델에서 쥬비덤 주사로 관찰된 상당한 절차후 팽윤은 LS 복합재료로는 보여지지 않아, 임상의에 의해 요구되는 "보는 것이 얻는 것이다"의 더 많은 모습을 가능하게 한다. 현행 미립자화된 복합재료 형태에 대하여 HA 농도, 섬유 장입, 및 가교의 계속된 최적화는 진행중이고 향상된 부피화, 약화된 팽윤, 및 더욱 천연 느낌을 유지하면서 기존의 상업적 표준과 비교할만한 내구성을 회복하는 것으로 예상된다. 팽윤의 정도는 특성규명되었고 도 6a-c에서 플롯팅되었다.
Tan δ는 에너지 손실과 저장 사이 균형을 정량화한다. 더 높은 Tan δ는 더욱 액체형 특성을 나타내는 반면, 더 낮은 tan δ는, 탄성률 또는 점도와 무관하게, 더욱 고체형 특성을 제안한다.
Tan 델타 (δ) = G"/G'
G': 에너지를 저장하기 위해 재료의 능력, 탄력성을 측정하는, 저장 탄성률.
G'': 에너지를 소실하기 위해 재료의 능력을 측정하는, 손실 탄성률.
비드화된 복합재료는 유사한 강직성 프로파일 (도 7b)를 유지하면서 시판되는 충전재보다 더 낮은 tan δ 측정 (도 7a)를 갖는다. 더욱 고체형 특성은, 연조직 재건을 위하여 현행 황금 표준인, 생체내 지방의 것을 반영한다 (도 7c).
실시예 8. 비드화된 복합재료 설계에 의해 가능해진 주사가능한 제형
4개의 잠재적 주사가능한 제형은 비드화된 하이드로겔 설계로 가능해진다.
일 구현예에서, 주사가능한 제형은 주사에 앞서 바로 재건되는 동결건조된 분말 케이크의 바이알을 포함한다. 이것은 보톡스 주사에서 사용된 것과 유사한 작업흐름이다.
또 다른 구현예에서, 2주사기 시스템은 복합재료를 재수화하는데 사용된다. 임상의는 2개의 주사기를 결합하고, 재수화하고, 그 다음 제형을 바로 주사할 것이다.
또 다른 구현예에서, 단일 주사기로 사용을 위한 제형은 사용되고, 여기서 비드는 패키징 동안 제조 설비에서 재수화되고 패키지 개방시 주사에 준비된다.
또 다른 구현예에서, 동결건조된 분말을 함유하는 주사기는 재구성 유체를 포함하는 바이알과 함께 제공된다. 유체는 바이알로부터 주사기 속에 인출되어 분말과 혼합한다.
모두 4개의 구현예는 진보된 개발 시험에서 전망을 보여주었다.
실시예 9. 세포 전달을 통한 합성 연조직
대형 동물 연조직 결손부 모델
이전 실시예들은, 이들이 그안에 개시된 피하 충전재 제품과 가장 관련성이기 때문에, 피하 주사 모델에 따른 효능 및 숙주 조직 반응을 검사하였다. 이 기술의 용도를 추가로 개발하기 위해, 재구성적 수술을 위하여 더 큰 연조직 결손부의 회복은 탐구된다.
중간정도로 크기조정된 결손부 (원통:
Figure pct00009
-10 mm x h-13 mm; ~1-cc)는 10-mm 생검 펀치를 사용하여 뉴질랜드 토끼의 서혜 지방 패드에서 생성되었고, 식염 변위 방법은 상이한 동물에서 제거된 지방의 부피에서 일관성을 확보하는데 사용되었다. 1-cc 부피는 연조직 회복을 위하여 현재 사용된 개별 지방 이식편의 볼루스 크기보다 더 크고 관련한 개념 증명으로서 작용한다. 제자리-형성 및 비드화된 복합재료, 또는 대조군 하이드로겔은 결손부 형태를 추정하였다 (도 8a).
POD14 (수술후 14 일째)에서 수확된 조직 샘플의 예비 조사는 숙주 혈관이 POD 14에서 80-Pa 하이드로겔 속으로 보다 더욱 실질적으로 150-Pa 복합재료 속으로 침윤한다는 것을 확인하였다. 대조로, 150-Pa 하이드로겔은 이식편 속으로 상당한 혈관 내부성장을 보여주지 않았고; 150-Pa 하이드로겔과 숙주 조직 사이 명백한 경계가 있는 것처럼 보였다. 이러한 파일럿 조사에서, 줄기 세포는 복합재료 속에 혼합된 자가 지방 이식에도 복합재료에도 씨딩되지 않았다. 결과는 복합재료 단독에의 혈관 내부성장을 증명한다. 이것은 또한 세포의 편입으로 더 큰 부피 연조직 재구성과 앞으로 사용되는 모델일 것이다. 도 8b는 POD 14에서 상이한 이식편 기질 (150-Pa 복합재료, 150-Pa 하이드로겔, 및 80-Pa 하이드로겔) 속에 숙주 혈관 침윤을 도시한다. 내피 세포는 적색의 CD31로 염색되었고 세포 핵은 청색의 DAPI로 염색되었다. 섬유는 녹색으로 F8BT-표지화되었다. 스케일 바: 100 μm.
아래 집중된 연구는 대형 동물 외상 모델에서 더 큰, 더 깊은 연조직 결손부 회복에 진행을 증명한다.
복합 비드를 이용하는 자가 지방 조직 전달
자가 수확된 지방과 제자리-형성 복합재료의 조합은 새로운 합성 연조직 제품으로서 조사되었다. 상기 접근법은 임플란트 실패 및 섬유증의 위험 없이 더 큰 부피 재구성에 대하여 전망을 제공한다. 합성 연조직은, 현재 임상적으로 사용된 가공된 지방흡인제와 비교된, 생체내 지방과 더욱 유사한 향상된 기계적 특성을 갖는다 (도 9a). 일부 경우에, 합성 연조직 제품은 제자리-형성 복합재료 대신 비드화된 복합재료와 조합될 수 있다.
합성 연조직은 부피 유지, 조직 내부성장, 및 작업성의 면에서 최적화된 제품 형태를 결정하기 위해 상이한 비로 지방과 조합되어 왔다. 데이터는 100% 지방 그룹과 비교하여 50% 지방: 50% 복합재료 그룹에서 (적색 및 맥관구조에 의해 거시적으로 확인된 (도 9b); 그리고 미시적으로 CD31 염색에 의해 확인된 (도 9c)) 개선된 혈관신생을 제안한다.
실시예 10. 복합 비드를 사용하는 생체내 줄기 세포 전달
복합 비드의 합성
LS-14 복합 비드는 Acr-HA (10mg/mL), 2-아암된 PEG-SH (15mg/ml) 및 MAL-PCL 나노섬유 단편 (30mg/mL)의 혼합물을 사용하여 작제되었다. 각 성분은 탈수된 형태로 나왔고 PBS에서 상응하는 최종 농도에 재수화되어 요구된 저장 탄성률을 달성하였다. 섬유가 분산되도록 잘 혼합한 후, 샘플은 주사기 속에 장입되었고 밤새 적어도 4 시간 동안 37℃ 습도-제어 챔버에 보관되어 가교 (겔형성)을 완료시켰다. 완전히 겔화된 복합 재료는 주사기를 사용하여 2회 250μm 메시 스크린에 재료를 통과시킴으로써 가공되었다.
벌크 겔은 그 다음 250-μm 체 메시를 통해 압출되었고, 수집되었고, 두번째 주사기를 사용하여 체를 통과되어 대략 50-300 μm 직경 입자를 생성하였다 (도 10b).
복합 비드에서 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 씨딩
인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)는 200rpm 진탕기에서 초저 접착 96-웰 플레이트 또는 저접착 12- 웰 마운트된 스피너 플라스크 어느 한쪽에 미립자의 1백만 세포/mL로 씨딩되어 더욱 균일한 세포 씨딩을 허용하였다 (도 10b). 상이한 웰 플레이트를 사용하는 것은 LS 비드에서 세포의 분포에 영향을 미친다 (도 10b). 예를 들어, 96-웰 현탁 플레이트를 사용하여 복합 비드로 세포의 밤새 배양은 주로 세포의 표면 코팅된 층을 산출하였다 (도 10a). 다른 한편으로, 12-웰 마운트된 스피너 플라스크를 사용하는 것 (도 10c)는 세포의 더욱 균일한 분포를 허용하였고 세포가 비드의 다공성 스캐폴드를 상호관통하게 한다 (도 10d).
용액 상 내에서 복합 비드에 부착된 세포의 수의 결정
얼마나 많은 세포가 마이크로비드에 결합하는지를 계산하기 위해, 1백만 hMSC가 마이크로비드의 mL당 씨딩되었다. hMSC 및 마이크로비드의 철저한 혼합을 통해 상하 피펫팅함으로써, 이들은 그 다음 둥근바닥 비-접착성 96 웰 플레이트 속에 웰당 100uL로 분포되었다. 100uL의 가온된 RoosterNourish-MSC-XF (KT-16)은 각 웰에 첨가되었고 플레이트는 배양물의 지속기간 동안 5% CO2에 37℃ 인큐베이터에서 200 rpm으로 진탕기 플레이트상에 있었다. 30 분 내지 1 시간의 진탕 후, 세포-마이크로비드의 상청액은 다중 웰로부터 수집되어 혈색소계로 비-접착성 세포의 수를 측정하였다 - 세포의 무의미한 수는 기록되었다. 그러므로 모든 초기 세포가 마이크로비드 혼합물에서 결합 또는 포획되었음이 가정되었다.
이미지 분석을 통해 복합 비드에 부착된 세포의 수의 결정
hMSC는 경시적으로 미립자에서 부착 및 증식할 수 있다. 도 10e는 2-D 세포 배양물을 형성하기 위한 LS 마이크로비드에서 hMSC의 증식을 도시한다. 비드의 다공성 특성으로 인한 증가된 표면적은 비드의 표면에서 그리고 도 10e(a)에서 보여진 바와 같이 비드의 코어 속에서 둘 모두 hMSC가 성장하게 한다.
세포의 정량화는 이미지 분석을 통해 수행되었다. 이미지 정량화로부터 측정은 공촛점 현미경검사를 통해 미립자-hMSC (50+ 입자)를 개별적으로 이미지화함 그리고 전체 구조를 통해 z-스택킹함으로써 결정되었다. DAPI 염색은 세포 존재를 결정하는데 사용되었고 입자당 세포의 수는 표로 만들어졌다 (도10e(a)). 입자의 부피는 총 z-스택 두께로 곱셈된 입자의 면적의 ImageJ 분석에 의해 결정되었다. 세포/부피 측정에서 이러한 수득된 세포 정량화의 도면에서 제시되었다 (도10e(b) 및 (c)). RGD 펩타이드는 hMSC의 세포 접착을 개선하였고 입자에서 세포의 감소된 배가 시간을 허용하였다.
랫트 심장 심근 속에 지방-유래된 hMSC 전달
LS-14 복합 비드는 3 일 동안 1백만 세포/mL의 비드 밀도로 둥근 바닥, 비-접착성 96 웰 플레이트에서 RoosterBio MSC-021 지방-유래 hMSC로 배양되었다. 3 일째에, hMSC-LS 비드는 15mL 튜브에서 수집되었고 500 rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 흡인되었고 hMSC-LS-14 비드 슬러리는 1cc 주사기에서 수집되었다.
200 g 암컷 스프라그-돌리 랫트는 이소플루란을 사용하여 마취되었고 좌측 전방 하강 관상 동맥은 봉합을 사용하여 결찰되어, 심장의 좌심실에서 경색 부피 발생을 초래하였다. LS-14-hMSC 재료는 25G 바늘을 사용하여 좌심실 벽 속에 3개의 위치에 20μL 각각으로 주사되었다. 랫트는 그 후에 봉합되었고 4 주 동안 회복되었고, 그 시점에 이들은 희생되었고, 심장 조직은 조직학적 연구를 위하여 체외이식되었다. 랫트 심장 심근은 양성 GS4-이소렉틴 B4 염색을 통한 숙주 조직 및 혈관 침윤에 의해 높은 세포성 침윤을 나타냈던 20uL의 LS-14 비드/hMSC로 주사되었다 (도10f).
4 주 수술후 및 치료에, 조직학적 분석은 랫트 심근이 심근 벽 온전함을 추가로 개선하는 hMSC 첨가로 감소된 흉터 조직 형성 및 콜라겐 침착을 나타낸다는 것을 보여주었다 (도10g). 더욱이, PBS 주사된 그룹괴 비교하여 감소된 벽 두께감소는 LS-14와 커플링된 hMSC 전달이 조직 피해를 감소시킬 수 있는 그리고 구조적 통합성을 유지할 수 있는 방법을 증명한다.
대안적 구현예에서, 상이한 섬유 밀도를 가진 다양한 복합 비드는 1-7 일 동안 hMSC로 씨딩되고, 그 다음 랫트 심장 심근 속에 주사되어 세포 증식, 형태론적 변화, 이주 거동을 평가한다.
랫트의 피하 공간 속에 hMSC 전달 및 신-조직 형성
LS-14 복합 비드는 이전에 기재된 바와 같이 제조되었다. 그 다음, 비드는 1백만 세포/mL로 hMSC로 씨딩되었고 96 웰 둥근 바닥 비-접착성 플레이트에서 시험관내 7 일 동안 배양되었다. hMSC-LS-14 비드는 200 μL 각각으로 복부쪽에서 4개 부위에 랫트에서 1cc 주사기에서 25-게이지 바늘을 통해 피하로 주사되었다. POD72에서, 랫트는 경추 탈구에 의해 희생되었고 샘플은 수확되었고 조직학적 염색을 위하여 가공되었다 (도 10h). 세포성 침윤이 POD72에 주사된 재료의 코어 속에 충분한 회복을 보여주지 않았던 반면, 숙주 조직과 이식편 사이 계면은 그 영역에서 양성 RECA-1 (내피 세포) 염색 및 강건한 세포 성장을 나타낸다 (도10h).
대안적 구현예에서, 상이한 섬유 밀도를 가진 다양한 복합 비드는 1-7 일 동안 hMSC로 씨딩되고, 그 다음 랫트에서 피하로 주사되어 세포 증식, 형태론적 변화, 이주 거동을 평가한다.
이식화 부위에서 MRI (자기 공명 영상)을 통한 부피 유지 측정
MRI 측정을 통해, 재료 (예를 들면 복합 비드)의 부피 유지는 각 슬라이스에서 주사된 재료의 면적을 측정함으로써 정량화될 수 있다. MRI는 72 일째에 수행되어 주사된 미세담체의 부피 유지를 사정하였다. 부피를 정량화하기 위해, 불투명 주사된 재료에 의해 차지된 면적은 ImageJ를 사용하여 측정되었고 각 이미지 슬라이스의 두께로 곱셈되었다. 면적은 총 부피에 대하여 통합되었다. 도 10i는 부피 유지를 POD72에서 G1 (7 일 LS-14/hMSC), G2 (1 일 LS-14/hMSC), G3 (0 일 LS-14/hMSC 제자리), G4 (7 일 LS-14/hMSC 무 펩타이드), G5 (LS-14)에 대하여 증명한다. 도 10i는 벌크 부피가 대부분 보유되었음을 도시한다.
실시예 11. 랫트 모델에서 복합 비드의 피하 이식화
조직 샘플은 실시예 5에서 실험으로부터 LS-5 복합 비드를 가진 랫트로부터 생체내 13 주에 수확되었다. 조직 샘플은 고정되었고, 절제되었고, H&E 및 메이슨 트리크롬 염색으로 염색되었다. H&E-염색된 조직학 이미지 (도 10j)는 세포의 성장/침윤 패턴을 도시하고, 이는 기저 비드 형태론을 재현한다.
대안적 구현예에서, 상이한 섬유 밀도를 가진 다양한 복합 비드는 이식되어 세포 증식, 형태론적 변화, 이주 거동을 평가한다.
실시예 12. 동결건조 방법 및 제형의 개발
상기 실시예에서 기재된 복합재료 구조의 주요 이점은 섬유-하이드로겔 복합재료의 나노섬유 상의 기계적 특성이, 종래 기술에서 공지된 대부분의 하이드로겔 성분과 반대로, 건조된 또는 냉동된 상태에서 거의 변화하지 않는다는 것이다. 따라서, 냉동 또는 동결건조 동안, 섬유 분획은 전체적인 복합재료 마이크로구조 유지를 도울 수 있다. 올바른 동결건조 사이클 및 제형으로, 복합재료는, 재수화시 뚜렷한 비드로서 여전히 잔류하면서, 동결건조될 수 있다.
심지어 복합 구조에서도, 이상적 동결건조 제형 및 공정은 실험적으로 결정될 필요가 있다. 본 실시예에서, PBS에서 제형화된 7.3mg/mL 700kMW HA-아크릴레이트, 10mg/mL 나노섬유 및 8.18mg/mL PEGSH (5k 2-아암)은 37℃ 인큐베이터에서 5cc 주사기로 밤새 반응된다. 145μL의 용액은 또한 유동학 시험을 위하여 3개의 8mm 직경 금형에 첨가된다 (도 11a, 도 11d에서 "예비-비드화"). 겔화 후, 복합 겔은 250 ㎛ 스크린에 겔을 통과시킴으로써 비드로 만들어진다. 비드는 3개의 8mm 직경 금형 속에 주사되고 유동학에 대하여 바로 시험된다 (도 11b, 도 11d에서 "비드" 그룹). 잔류 비드 부피는 액체 질소에서 순간 냉동되었고 랍콘코(Labconco)® 플라스크 동결건조기 (프리존(FreeZone)® 6)에서 48 시간 동안 동결건조되었다. 동결건조 후, 동결건조 케이크는 냉동된 용액 부피보다 더 작아, 샘플이 전체 지속기간 동안 냉동된채 잔류하지 않음을 나타냈다. 비드는 재수화되어 (중량 기준으로 측정된 경우) 손실된 수괴를 정확하게 대체하였다. 수득한 재건된 겔은 동결건조 전과 상이한 특성을 가졌다-겔은 겔 상에 의해 완전히 흡수되지 않은 과잉 수상을 갖는 2상성(biphasic)이었다. 겔이 또한 주사기 속에 흡인을 통해 장입될 수 없는 것은 미세구조적 변화가 개별 비드를 함께 융합시켰기 때문이다. 유동학에 대하여 시험된 경우 (도 11c, 도 11d에서 "동결건조후" 그룹) 겔은, 예비-비드화된 겔보다 5.19배 더 높은 그리고 비드화된 겔보다 6.39배 더 높은 저장 탄성률로, 훨씬 더 강직성이었다. 이것은 더 농후한 2상성 구조로 붕괴하는 확산성 하이드로겔 구조에 의해 야기된다. 주사가능성, 물리적 특성, 및 다공률은 모두 동결건조 공정에 의해 영향받는다.
실시예 13. 개선된 동결건조 방법 및 제형의 개발
동일한 절차는 상기 기재된 바와 같이 재차 후속되었지만, 동결건조에 대한 더 많은 통제로, 동결건조 공정 동안 동결건조 샘플을 더 차갑게 (냉동된 샘플의 유리 전이 온도 미만) 유지하기 위해 선반내 동결건조기를 사용하였다. PBS에서 제형화된 7.3mg/mL 700kMW HA-아크릴레이트, 10mg/mL 나노섬유 및 8.18mg/mL PEGSH (5k 2-아암)은 37℃ 인큐베이터에서 5-cc 주사기로 밤새 반응하였다. 145 μL의 용액은 또한 유동학 시험을 위하여 3개의 8mm 직경 금형에 첨가된다 (도 12a-b에서 "예비-비드화"). 겔화 후, 복합 겔은 250 ㎛ 스크린에 겔을 통과시킴으로써 비드로 만들어진다. 비드는 3개의 8mm 직경 금형 속에 주사되고 유동학에 대하여 바로 시험된다 (도 12a-b에서 "비드" 그룹). 잔류 비드 부피는 -80℃ 인큐베이터에서 냉동된 다음 -10℃의 선반 온도에 24 시간 동안 예비-냉각된 랍콘토® 트리아드(Triad)® 동결건조기에서 배치되고 이후에 20℃에 24 시간 동안 2차 건조되었다. 동결건조 후, 동결건조된 케이크는 동결건조 전 냉동된 샘플과 바이알에서 동일한 부피를 차지하여, 케이크가 동결건조 동안 용융하기 시작하지 않음을 나타냈다. 비드는 재수화되어 (중량 기준으로 측정된 경우) 손실된 수괴를 정확하게 대체하였다. 재건된 겔은 주사기 속에 흡인을 통해 장입될 수 없지만, 루어-락(luer-lock) 연결기로 주사기들 사이 통과된 경우, 서로에 견고하게 처음에 달라붙은 겔 비드는 개별 비드로 분산될 수 있었다. 유동학에 대하여 시험된 경우 (도 12a-b에서 "동결건조후" 그룹), 비드는, 크게 증가된 저장 탄성률 및 영률로, 훨씬 더 강직성이었다. 이것은 더 농후한 2상성 구조로 붕괴하는 확산성 하이드로겔 구조에 의해 야기된다. 주사가능성, 물리적 특성, 및 다공률은 모두 동결건조 공정에 의해 영향받는다.
실시예 14. 저장성 제형을 이용한 동결건조 방법의 개발
7.0 mg/mL 700kMW HA-아크릴레이트, 10mg/mL 나노섬유 및 7.18mg/mL PEGSH (5k 2-아암)은 37℃ 인큐베이터에서 5cc 주사기로 밤새 반응한 다음 150-μm 또는 250-㎛ 스크린으로 비드화하였다. 본 실시예에서, 비드는 저장성 (PBS 대신 사용된 탈이온수)로서 제형화되었다.
1cc의 비드는 랍콘코® 동결건조 바이알에 장입되고, 여기에 1cc의 등장성 용액은 첨가되고 추가로 1cc의 탈이온수는 첨가되어, 부피 도처에 분산된 비드와, 바이알에서 3cc의 총 용액 부피를 갖는다. 등장성 용액은 어느 한쪽 A: 3% 수크로스, 3% 트레할로스, 0.3% NaCl 및 2mg/mL 자유 700k HA 또는 B: 2mg/ml 자유 700k HA를 가진 PBS이었다. 바이알은 액체 질소에서 순간 냉동되고, 그 다음 랍콘코 트리아드 기성 동결건조기에서 20℃로 상승된 온도로 24 시간 2차 건조하면서, 48 시간 동안 -30℃ 선반 온도 및 10Pa 진공 압력에 동결건조된다. 동결건조 후, 비드는 재수화되어 (중량 기준으로 측정된 경우) 손실된 수괴를 정확하게 대체하였다. 복합 겔 비드는 주사기 속에 쉽게 흡인될 수 있어서, 개별 비드 구조가 보존됨을 나타냈고, 이는 광학 현미경으로 확인되었다. 수크로스-트레할로스 용액에서 동결건조된 그룹은 상기 그룹이 비드화 공정 직후, 희석 및 동결건조 전 하였던 바와 동일한 느낌 및 취급가능성을 가졌다. 유동학적 특성은, 동결건조에 앞서 비드화된 겔보다 22% 더 높은 탄성률 및, 초기 예비-비드화 겔의 90%의 저장 탄성률을 갖는 그룹과, 또한 사실상 동일하였다 (도 13a). PBS 완충액에서 희석된 그룹은 또한 주사기 속에 쉽게 흡인되었고 수크로스-트레할로스 그룹과 유사하게 거동되었지만 동결건조에 앞서 비드화된 겔보다 154% 더 높았던 그리고 초기, 예비-비드화된 탄성률보다 87% 더 높았던 상승된 저장 탄성률을 가졌다. 이것은, 입자가 별개의 비드로서 잔류하였어도, 일부 미세구조 변화가 PBS 그룹에서 여전히 발생중이었음을 나타낸다.
비드 크기조정
비드 크기는 비드화 공정에서 사용된 스크린의 메시 크기를 가변시킴으로써 가변되었다.
수득한 비드가 주사기 바늘의 내부 직경보다 더 작게 크기조정되는 적어도 하나의 치수를 가질 필요가 있기 때문에, 250 ㎛ 초과 개구부를 가진 비드 스크린은 배제되었다. 진피 충전재 적용에 흔히 사용된 바늘은, 260 ㎛ 내지 160 ㎛의 내부 직경을 가진, 25-게이지 내지 30-게이지 범위이다. 더 작은 비드는 90-㎛ 개구부를 가진 스크린을 통해 시도되었지만, 작은 메시 크기는 복합 겔 미세건축물을 붕괴시켰고; 90-㎛ 개구부 크기는 개별 섬유의 다수의 길이보다 더 작았으며, 이는 균질의 겔-섬유 복합재료로 절단되는 대신에, 섬유 및 겔이 서로 분리되게 야기하였다. 90-㎛ 스크린을 이용한 가공은 특성규명을 위한 재료를 충분히 생산하지 않았다. 250-㎛ 및 150-㎛ 스크린에 의해 생산된 비드 (도 13b)는, 진피 충전재에 적절한, 도 13a에서 처럼 형성된 비드와 유사한 유동학적 특성, 특히 저장 탄성률 및 tan 델타를 가진 겔을 생산하였다.
Tan 델타
tan 델타는 유동학적 손실 탄성률이 저장 탄성률로 나누어진 것으로, 더 낮은 tan 델타 수가 "액체형" 재료와 대조적으로 더욱 "고체형"에 해당함을 의미한다. 상기 기재된 공정 샘플 (비드화 전, 250-㎛ 비드, 150-㎛ 비드)에 대한 tan 델타는 도 13c에서 도시된다. 도 13d에서 예시된 추세에서 보여진 바와 같이, 진피 충전 산업은 경시적으로 더 낮은 tan 델타 값 쪽으로 추세화되어 왔다. 이것은, 피부 결손부 충전에 대하여 더 양호한 리프팅 용량을 갖는, 더욱 고체형 느낌을 향하는 추세이다. 섬유-하이드로겔 복합 재료는 더 양호한 리프팅 용량 쪽으로 그 추세를 발전시키고 심지어 비드화 공정 후 그 특질을 유지한다. tan 델타 데이터는, Ares G2 유량계에서 1-10% 진폭으로부터 tan 델타 값을 평균화하는, 0.1-10% 진폭으로부터 1Hz에 진폭 스위프 동안 수득되었다. 복합재료 값은 도13c에서 도시된 150-㎛ 비드 그룹에서 나온다.
실시예 15. 복합 비드의 물리화학 특성규명
크기 분포의 결정
복합 비드의 직경은 공초점 현미경 이미지 하에서 입자의 최장 축을 따라 측정되었다. 분석은 51개의 입자를 카운팅하여 수행되었다. 입자의 히스토그램 (도 14a)는 209.41 ± 62.27 μm로서 평균 비드 크기를 제공한다. 도 14b는 입자 내에서 최장 축을 측정함으로써 크기 ~75 μm, ~150 μm 및 ~200 μm의 비드의 공초점 현미경 이미지를 증명한다.
추가 특성규명된 비드 크기 분포는 더욱 일관된 측정에 대하여 에지 검출을 사용할 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 벌크 복합재료를 가공하는데 사용된 상이한 메시 크기 체는 비드 크기에 대하여 상이한 히스토그램에 산출할 수 있다.
대안적 구현예에서, SEM (주사형 전자 현미경검사)는 복합 비드를 이미지화하는데 사용된다. 하이드로겔 또는 섬유의 염색은 이미지화 공정 동안 필요해질 수 있다.
복합 비드의 크기에 기반된 주사가능성 사정
Good Manufacturing Practice (GMP) 롯트로부터 과잉 겔은 비드 크기에 따라 주사가능성을 사정하기 위해 재가공되었다. 간단히, 겔은 10cc 주사기에 충전되었고 한정된 메시 개방 치수 (25mm Sartorius 필터 홀더에서 배치된, McMaster Carr제 25mm 스테인레스 강 메시)를 가진 스테인레스 강 메시 스크린에 겔을 통과시킴으로써 미립자화되었다. 겔은 250 μm 그 다음 150 μm 스크린에 통과되었다. 이러한 겔은 그 다음 1cc BD 폴리카보네이트 주사기에 장입되어 "150 μm" 그룹을 구성하였다. 롯트의 나머지는 그 다음 추가의 75 메시 스크린에 3회 통과되었고 1cc BD 폴리카보네이트 주사기에 장입되어 "75 μm" 그룹을 형성하였다. 장입된 주사기는 그 다음 MTS Criterion 43 기계 테스터에 부착된 주사기 정착물 (Instron)에 장입되었다. 겔은 1mm/초의 크로스헤드 스피드로 27게이지 바늘 (1/2" 길이, BD)를 통해 주사기 밖으로 주사되었다. 대표적 변위 곡선은 도 14c에서 도시된다. 150 μm 및 75 μm 그룹 양쪽은 허용가능한 주사 프로파일을 초래하였다. 프로파일은 양쪽 그룹이 27 게이지 바늘의 210 μm 내부 직경보다 작은 겔 비드를 생산하기 때문에 유사하다.
섬유 길이 분포의 결정
하이드로겔 재료 도처에 분산된 섬유의 길이 분포는 ImageJ를 사용하는 대조 광 현미경검사 이미지에서 보여진 섬유의 측정을 통해 결정되었다 (도 14d, e). 대안적 방법으로서, SEM (주사형 전자 현미경검사)는 섬유의 길이 분포를 결정하는데 사용될 수 있다.
섬유에서 및 하이드로겔에서 기능적 그룹의 정성적 및 정량적 특성규명 (화학적 기능성)
플라스마 처리 후 섬유에서 -COOH 그룹의 특성규명은 Toluidine Blue (TBO) 검정을 사용하여 수행되었다. 마이크로플레이트 리더: BioTeck Synergy 2는 검정을 평가하는데 사용되었다. 후속되는 프로토콜의 단계는 아래 기재된다:
· 0.8cm 직경 펀치를 사용하여 아크릴산-변형된 섬유 시트의 4개 조각을 펀칭한다
· 펀칭된 섬유 시트를 24-웰 플레이트에 배치한다
· 섬유 시트를 1mL의 0.1 mM NaOH로 2회 세정한다
· 0.1 mM NaOH내 0.5 mM 톨루이딘 블루 O (TBO) 용액을 제조한다
· 1 mL의 0.5 mM TBO 용액을 각 웰에 첨가한다
· 플레이트를 진탕기에서 200 rpm으로 배치하고 실온에서 12 시간 동안 방치한다
· 반응 완충액을 흡입 제거한다
· 섬유 시트를 0.1 mM NaOH로 세정한다
· 1 mL의 50 % (v/v) 아세트산을 각 웰에 첨가한다
· 플레이트를 진탕기에서 200 rpm으로 실온에서 30 분 동안 배치한다
· 100 μL의 상청액을 96 웰 플레이트에 이송한다
표준으로서 50 % (v/v) 아세트산내 TBO를 가진 마이크로플레이트 리더를 사용하여 633 nm에서 측정한다. 이들 예에서 사용된 섬유로 보여진 전형적 값은 70~100 nmol/cm2의 COOH 밀도이다.
말레이미드 (MAL) 그룹을 첨가하기 위해 EDC-NHS 화합물로 변형시킨 후, 엘만(Ellman) 검정은 수행되어 소비된 티올 그룹을 측정하였다. 마이크로플레이트 리더: BioTeck Synergy 2는 검정을 평가하는데 사용되었다. 후속되는 프로토콜의 단계는 아래 기재된다:
· 반응 완충액: 1mM EDTA를 함유하는, 0.1M 인산나트륨, pH 8.0을 제조한다
· 반응 완충액에서 4 mg/mL의 엘만 시약을 제조한다
· 반응 완충액에서 0.5 mM 아세틸 시스테인 용액을 제조한다
· 0.8 cm의 직경을 가진 말레이미드-변형된 섬유 시트의 4개 조각을 펀칭한다
· 섬유 시트를 24-웰 플레이트에 둔다
· 섬유 시트를 1mL의 반응 완충액으로 세정한다
· 0.5 mL의 0.5 mM 아세틸 시스테인 용액을 각 웰에 첨가한다
· 플레이트를 진탕기에서 200 rpm으로 실온에서 4 시간 동안 배치한다
· 20 μL의 상청액을 96-웰 플레이트에 이송한다
· 이것을 50 회 반응 완충액에서 희석시킴으로써 엘만 반응 용액을 제조한다
· 200 μL의 엘만 반응 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다
마지막으로, 96-웰 플레이트를 진탕기에서 200 rpm으로 15 분 동안 배치하고 표준으로서 반응 완충액에서 아세틸 시스테인과 마이크로플레이트 리더를 사용하여 412 nm에서 측정한다. 그 다음, 소비된 티올을 계산하고 MAL 밀도를 수득한다. 이들 예에서 사용된 섬유로 보여진 전형적 값은 70~100 nmol/cm2의 MAL 밀도이다.
변형된 히알루론산의 아크릴화 정도의 정량화 및 아크릴화의 화학적 정성화는 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 (Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy)를 사용하여 수행되었다. 20mg의 HA-Ac는, 2 시간 동안 60℃에 초음파처리를 통해 용해된, 직접적으로 NMR 튜브에서 800mg (D2O) 산화중수소에 첨가되었다. 그 다음, 취득된 스펙트럼은 400 MHz에서 1H NMR로 Varian NMR 시스템 분광계에서 분석되었다. 수득한 곡선은 Varian 소프트웨어, Fourier 변환, 기준선 변동 보정, 위상화, 1HNMR에 대한 통합화 및 기준선 평준화를 사용하여 가공되었다.
6 ppm에서 상응하는 3개의 피크는 통합되었고 2 ppm에서 통합된 값으로 분할되었다. 2 ppm에서 통합된 값은 3으로 설정되었다. 6ppm에서 3개의 피크는 아크릴레이트 그룹에서 탄소와 회합된 3개의 수소 (존재하는 아크릴레이트 그룹당 예상된 3개의 총 수소)와 상응한다. 2ppm 피크는, 히알루론산의 각 반복 유닛에서 존재하는, 아세틸 그룹과 회합된 수소에 상응한다 (반복 유닛당 3개). 치환의 정도는 따라서 아크릴레이트 그룹을 가진 HA 반복 유닛의 분획을 제공하기 위해 2ppm 피크의 통합된 면적에 의해 분할된 3개의 6 ppm 피크의 합계 통합된 면적이다. 아크릴화 정도 백분율은 100% 곱셈으로 백분율로 전환된 그 분수이다.
실시예 16. 토끼의 피하 공간 속에 생체내 줄기 세포 전달
토끼 연구에서, 실시예 9에서 랫트 연구의 것과 유사한 피하 주사는 수행되었다. 200 μl의 3 일 배양된 LS-14/hMSC 마이크로비드는 25G 바늘을 통해 주사되었다. 시험된 그룹들 중 하나는 등쪽에 칼라(collar) 영역 아래 지방 패드 속에 주사되었다. 토끼는 조직 수확을 위하여 POD30에 희생되었다. 조직학적 분석은 30 일에 토끼 지방 패드에서 강건한 조직 및 세포성 침윤 (도 15a), 및 30 일에 토끼 피하 공간에서 중간정도 조직 및 세포성 침윤 (도 15b)를 보여준다.
실시예 17. 시험관내 지방 이식편 생존을 향상시키기 위한 섬유-하이드로겔 복합재료
본 예에서 개시된 연구의 목적은 유동적 분석을 통해 인간 지방 조직과 조합된 경우 섬유-하이드로겔 복합재료의 기계적 특성을 특성규명하는 것이다. 유동학은 유동 및 변형의 연구이고 인가된 힘에 반응하여 물체의 소성 유동을 측정한다. 저장 탄성률 (G')는 재료가 얼마나 탄력성인지, 또는, 다시 말해서, 전단력에 반응하여 얼마나 변형가능한지의 측정이다. 더 높은 저장 탄성률은 변형력 또는 전단력에 대한 물체의 증가된 저항성을 반영할 것이다. 이러한 개념이 임상적 의미에서 적용되는 경우, 저장 탄성률이 더 높을수록, 조직이 기계력에 2차적인 변형 또는 외상에 덜 취약하다는 것이 추론된다.
시험관내 세포 배양 연구에서 나노섬유-하이드로겔 복합재료의 첨가 유무에 따른 지방 조직 생존은, 생체내 모델 내에서 이것을 나중에 이식하기 위하여, 비교되었다. 나노섬유-하이드로겔 복합재료는 함께 조합된 경우 지방흡인제의 저장 탄성률을 증가, 세포 배양 연구에서 지방흡인제 단독과 비교된 경우 등가 지방 조직 생존을 초래, 그리고 지방흡인제와 조합된 경우 균질하게 통합하는 것으로 예상된다.
지방흡인제와 조합된 섬유-하이드로겔 복합재료 (복합재료-지방흡인제)의 제조
지방흡인제는 비-흡연자이었던 그리고 35 미만 체질량 지수를 가졌던 18세 내지 70세의 여성들로부터 수득되었다. 출혈 장애, HIV, 진성 당뇨병, 및 지방위축증 장애를 가진 환자는 본 연구에서 배제되었다. 본 연구 내내 수득된 지방흡인제는 리볼브(Revolve) 시스템 (http://hcp.revolvefatgrafting.com)을 사용하여 미립자로 가공되었고, 이는 락테이트화된 링거액으로 3회 세정되어 오일 및 결합 조직을 제거하였다.
지방흡인제, 하이드로겔, 및 복합재료의 상이한 비는 조합되었고 (표 5) 24 시간의 기간 동안 140 μL 실리콘 금형에서 겔화하게 되었다. 샘플은 이 시간 동안 38℃ 인큐베이터에서 배치되었다.
Figure pct00010
지방흡인제와 조합된 섬유-하이드로겔 복합재료 (복합재료-지방흡인제)에 대한 유동학적 연구
동적 유동학 시험은 0.8-1.2 mm 범위의 갭 크기를 가진 8-밀리미터 (mm) 톱니 평행 플레이트가 있는 G2 아레스(Ares) 유량계를 사용하여 수행되었다 (도 16a). 각 그룹은 적어도 4개의 샘플을 가졌고 모든 그룹은 2명의 상이한 환자로부터 지방흡인제를 사용하여 2회 시험되었다.
각 샘플 그룹에 대하여 평균 저장 탄성률은 도 16b에서 도시된다. 75% 지방흡인제 및 25% 복합재료 (25C)의 비는, 395.2 Pa (SD 112.1)의 G'를 가진, 가장 높은 저장 탄성률을 초래하였다. 100% 지방흡인제 (100F)는 361.8 Pa (sd 75.3)의 평균 값을 가진 두번째로 높은 저장 탄성률을 가졌다. 50% 복합재료 및 50% 지방흡인제 (50C)의 평균 저장 탄성률은 208.7 (SD 45.4)이었다. 50% 하이드로겔 및 50% 지방흡인제 (50H), 100% 복합재료 (100C), 및 100% 하이드로겔 (100H)의 저장 탄성률은 80.3 (17.4), 94.6 (16.3), 32.7 (12.3) Pa 각각이었다. 75% 지방흡인제 및 25% 복합재료의 비를 예외로, 모든 그룹의 평균 저장 탄성률은 100% 지방흡인제의 것과 상당히 상이하였다 (도 16b).
유동학 데이터는 75% 지방흡인제 및 25% 복합재료 비의 조합이 모든 시험된 그룹의 가장 높은 저장 탄성률 (G')를 초래한다는 것을 증명한다. 이러한 특정 그룹은 가장 높은 G' 생산을 위하여 최적 비인 것처럼 보인다. 100% 지방흡인제와 75% 지방흡인제 및 25% 복합재료 사이의 차이는 통계상 유의미하지 않아, 이러한 비가 천연 지방의 유동학적 특성을 모방한다는 것을 제안한다. 이것이 예상되는 것은 복합 재료의 G'가 지방흡인제의 것보다 훨씬 더 낮기 때문이고, 복합 재료의 첨가는 전체적 G'의 감소를 초래할 것이다. 하지만, 이러한 비는 지방 조직과 나노섬유-하이드로겔 복합재료 사이 가교의 이상적 양을 허용하는 것처럼 보여, 전체적으로 재료의 증가된 강도를 초래한다. 이것이 중요한 것은 저장 탄성률이 얼마나 많은 재료가 변형에 저항할 수 있는지의 측정이기 때문이고, 이상적 조직 스캐폴드는 천연 지방 조직과 유사한 특성/강도를 가질 것이다. 더 높은 저장 탄성률로, 지방흡인제/복합재료 조합은 변형가능성이 적고 따라서 더 강하고 전단력에 덜 취약하다. 이전의 조사는 이것이 시험관내 더 적은 지방분해 및 더 많은 지방세포 생존으로 해석한다는 것을 증명하였다 {Luan, Anna, 등, Plastic and Reconstructive Surgery, vol. 140, no. 3, 2017, pp. 517-524}. 그러므로 비교적 높은 저장 탄성률로 지방-복합재료 조합을 갖는다는 것이 개선된 지방세포 및 지방 이식편 생존을 초래한다는 것은 합리적으로 추론될 수 있다.
세포 생존 검정
지방흡인제 및 복합재료의 상이한 비는 조합되었고 7 일의 기간 동안 10% 태아 소 혈청이 있는 둘베코 변형 이글 배지 및 1:1000 페니실린/스트렙토마이신 성장 배지에서 배양되었다 (표 6). 이들 비는, 이들이 상이한 실험 그룹으로서 미래 생체내 실험에서 사용될 가능성이 가장 높기 때문에, 선택되었다. 성장 배지는 최소로 또는 알라마 블루 시약이 세포 배지에 첨가된 때마다 매 2 일 변화되었다. 알라마 블루 검정은 0, 1, 2, 3, 및 7 일째에 세포 생존의 상대량을 정량화하는데 사용되었다.
세포 배양 결과 (도 16c)는 알라마 블루 시험을 사용하여 7 일의 기간 동안 세포 생존능을 증명한다. 지방흡인제와 비교하여, 모든 다른 그룹은 생존하는 세포의 상당히 더 높은 백분율을 가졌다 (p 값 < 0.05).
Figure pct00011
세포 배양의 결과는 개시된 나노섬유-하이드로겔 복합재료의 첨가가 양성임 그리고 지방 세포 생존에 유해하지 않음을 제안한다. 100% 지방흡인제를 함유하는 그룹과 비교하여, 모든 그룹은 상당히 더 높은 세포 생존을 갖는다 (모든 그룹에 걸쳐서 p < 0.001). 우리의 조직 스캐폴드는 생존을 위하여 세포 배양 배지 접근으로부터 지방세포를 방해하지 않고; 사실상, 세포 생존을 향상시키는 것처럼 보인다. 이것은 샘플을 둘러싸는 지질 층을 갖는, 따라서 세포 배지 접근으로부터 지방세포를 방해하는 100% 지방흡인제 그룹에 의해 야기될 수 있다. 전체적으로, 생체내 모델 속에 이식되면, 우리의 복합재료가 장기 생존에 요구된 혈관생성적 성장 인자에의 지방세포 접근을 금지하지 않을 것은 추론될 수 있다.
세포성 수준에서 복합재료 통합을 분석하기 위한 면역조직화학 (IHC)
면역조직화학 (IHC)는 세포성 수준에서 지방세포 형태론 및 복합재료 통합화를 분석하기 위해 수행되었다. IHC 샘플은 4% w/v 파라포름알데하이드에서 먼저 고정되었고, 그 다음 10%, 20%, 및 30% w/v 수크로스, 각각을 점차적으로 사용하여 탈수되었다. 이들은 그 다음 최적 컷팅 온도 화합물로 냉동되었고 절개당 20 μm로 절개되었다. 각 샘플은, 지방세포에 대하여 확고부동한 마커인, 페리리핀 항체로 염색되었다. 이미지는 공촛점 현미경검사를 사용하여 취득되었고, 그 다음 ZEN 소프트웨어를 사용하여 가공되었다. 기술 통계 뿐만 아니라 매개변수 및 비-매개변수 방법은 데이터를 분석하는데 사용되었다. 통계 분석은 스타타(Stata)®13 (StataCorp, College Station, Texas)를 사용하여 수행되었다. 도 16d는 페리리핀에 대하여 IHC 염색을 사용하는 세포성 수준에서 인간 지방 조직과 우리의 나노섬유 조직 스캐폴드의 통합화를 증명한다. 복합재료, 뿐만 아니라 100% 지방흡인제를 함유하는 양쪽 그룹은 염색되었다. 우리의 IHC 분석에 기반하여, 복합재료 내에서 나노섬유는 지방흡인제 조직과 양호하게 통합하였다 (도 16d).
우리의 복합 재료가 지방 조직을 모방하고, 지방흡인제와 조합된 경우 높은 저장 탄성률을 갖고 (따라서 전단력으로부터 이것을 보호하고), 세포성 수준에서 지방흡인제와 양호하게 통합하는 것은 증명되었다. 이들 아이디어를 조합하여, 우리의 나노섬유-하이드로겔 복합재료는 자가 지방 이식을 증대하기 위한 생존가능한 조직 스캐폴드이다. 이러한 개념을 실행하기 위해, 이식된 우리의 복합재료 및 지방흡인제의 조합은 쥣과 모델 속에 이식되어 실시예 17에서 부피 유지, 조직 통합화, 및 생체내 혈관신생에 대하여 사정하였다.
실시예 18. 생체내 지방 이식편 부피 유지를 개선하기 위한 그리고 혈관 내부성장을 유도하기 위한 섬유-하이드로겔 복합재료
우리는 우리의 신규 나노섬유-하이드로겔 복합재료가 지방 이식 절차에서 천연 지방흡인제에 대한 부속물로서 작용할 수 있다는 것을 목표한다. 이전의 목표에서, 우리는 나노섬유-하이드로겔 복합재료가 천연 지방 조직과 기계적 강도 면에서 유사하고 생체적합성인 것을 증명하였다. 우리는 복합 재료가 증가된 부피 유지 및 혈관신생을 촉진시킴으로써 지방 이식 성과를 개선할 수 있다는 것을 가정한다.
지방흡인제와 조합된 섬유-하이드로겔 복합재료 (복합재료-지방흡인제)의 제조
지방흡인제는 리볼브 시스템을 사용하여 자가 지방 이식을 경험하는 18세 내지 70세의 여성들로부터 수득되었다. 참가자들은 비-흡연자들이었고 35 미만의 체질량 지수를 가졌다. 출혈 장애, HIV, 진성 당뇨병, 및 지방위축증 장애를 가진 환자는 본 연구에서 배제되었다. 지방흡인제, 복합재료, 및 하이드로겔의 다양한 비는 조합되었고 3 시간 동안 38℃ 인큐베이터에서 1 cc 주사기로 겔화하게 되었다 (표 7).
Figure pct00012
MRI 부피측정 분석 및 형태 유지
이소플루란계 마취 후, Foxn1nu는, 마우스당 2 주사의 총계에 대하여, 500 μL의 재료로 어느 한쪽 옆구리에 주사되었다. 주사는 16 게이지 뭉툭한 끝 캐뉼러를 사용하여 수행되었다. 마우스는 각 그룹에서 13마리 마우스의 총계에 대하여 표 7에 따라 5개 그룹으로 분할되었다. MRI는 수술후 일수 (POD) 2, 28, 56, 및 84에서 수행되었다. 부피측정 분석 및 형태 유지 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하는 맹검된 조사자에 의해 수행되었다 (도 17a). 형태 유지는 POD 2, 28, 56, 및 84에서 이식편의 최대 높이를 사정 그리고 높이에서 백분율 변화를 계산함으로써 측정되었다 (도 17b). 모든 그룹은 POD 2와 비교하여 POD 84에서 상당히 감소된 부피 유지를 나타냈다 (도 17a). 100% 지방흡인제 그룹이 POD 28에 더 높은 부피 유지를 초기에 증명하였던 반면, 25% 복합재료 및 75% 지방흡인제로 주사된 그룹은 POD 84에 부피 유지의 가장 높은 정도를 증명하였다. 복합재료를 함유하는 양쪽 그룹이 유지의 가장 높은 비율을 표시하였기 때문에, 이것은 복합재료가 지방 이식편 흡수의 비율 감소에서 역할을 한다는 것을 제안한다. 100% 복합재료로 주사된 그룹은 모든 시점에서 가장 불량한 부피 유지를 일관되게 증명하여서, 복합재료 단독이 지방 조직에 대하여 충분한 대체로서 작용하지 않고 지방 이식에 대한 지원 부속물로서 작용할 수 있을 뿐임을 증명한다.
형태 유지의 면에서, 25C 및 100F 그룹은 POD 84에 최대 높이에서 최소 변화를 증명하였다 (도 17b). 참고로서 100% 지방흡인제 그룹을 사용하여, 모든 그룹은 25C 지방흡인제 그룹을 제외한 최대 이식편 높이의 상당히 감소된 백분율을 표시하였다. 나노섬유-하이드로겔 복합재료의 효과는 형태 유지에 관하여 또한 조사되었다. 전체적 부피 유지가 상이한 그룹 또는 심지어 시점에 걸쳐서 유사할 수 있는 반면, 이식편이 이의 본래, 의도된 형태를 유지할 수 있다는 것이 또한 중요하다. 이식편은 경시적으로 평평해질 수 있지만 유사한 전체적 부피를 여전히 유지한다. 이러한 이유로, 우리는 형태 유지를 위한 마커로서 최대 이식편 높이를 이용하는 쪽을 채택하였다. 한 시점부터 다음의 시점까지, 모든 그룹은, 100F 및 25C 그룹을 예외로, 최대 이식편 높이에서 상당한 감소를 증명하였다 (도 17b). 이것은 25% 복합재료 대 75% 지방흡인제 비로 우리의 복합 재료 및 지방흡인제 조합이 향상된 부피 유지를 촉진시킨다는 것 뿐만 아니라, 복합재료가, 이로한 비로, 지방의 본래 가장 중요한 형태를 보강하는 역할을 한다는 것을 제안한다. 이것이 재료의 기능에 중요한 것은, 자가 지방 이식의 주 목적이 연조직 결손부에 대하여 충전재로서 작용한다는 것이기 때문이다. 이것은 미용적으로 민감한 부위 예컨대 안면 및 가슴에서 특히 중요해지고 여기에서 이식편의 적절한 형태 유지는 만족스런 심미적 결과에 필수적이다.
지방세포 형태론 및 혈관 내부성장을 분석하기 위한 면역조직화학 (IHC)
본 예에서 상기 기재된 마우스는 면역조직화학 (IHC) 목적으로 3개의 상이한 시점: POD 7, 28, 및 84에 희생되었다. IHC는 수행되어 지방세포 형태론 및 혈관 내부성장을 분석하였다. 샘플은 4% w/v 파라포름알데하이드에서 고정되었고, 그 다음 10%, 20%, 및 30% w/v 수크로스, 각각을 점차적으로 사용하여 탈수되었다. 이들은 그 다음 최적 컷팅 온도 화합물로 냉동되었고 절개당 20 μm로 절개되었다. 각 샘플은 지방세포 및 혈관, 각각에 대하여 확고부동한 마커인, 페리리핀 항체 및 CD 31에 대하여 염색되었다. 이미지는 공촛점 현미경검사를 사용하여 취득되었고, 그 다음 ZEN 소프트웨어를 사용하여 가공되었다. 기술 통계 뿐만 아니라 매개변수 및 비-매개변수 방법은 데이터를 분석하는데 사용되었다. 통계 분석은 스타타®13 (StataCorp, College Station, Texas)를 사용하여 수행되었다.
도 17c-d는 상이한 수술후 시점에 페리리핀에 대하여 우리의 IHC 염색을 증명한다. CD31에 대하여 염색은 또한 수행되었고 도 17e-f에서 보여졌다. POD7에 페리리핀에 대하여 IHC 염색은 모든 그룹에 걸쳐 보존된 지방세포 형태론을 증명한다 (도 17c). POD28 이미지 (도 17d)를 사정하여, 우리는 25C 그룹이 다른 그룹과 비교된 경우 가장 완전하게 보존된 지방세포 구조를 갖는다는 것을 볼 수 있다. 우리는 또한 우리의 섬유가 또한 생체내 셋팅에서 균질적으로 분산하고 조직과 양호하게 통합한다는 것을 볼 수 있다.
CD31 염색에 대하여 IHC 결과는 경시적으로 혈관질에서 변화를 명확하게 증명한다. POD 7에서, 제한된 혈관화는 모든 그룹에 걸쳐 관찰된다 (도 17e). 하지만, 이 시점에서 다른 그룹에 대해 비교된 경우 25C 그룹 내에서 존재하는 적어도 미미하게 더 큰, 더 강건한 혈관이 있는 것처럼 보였다. POD2 이미지를 POD28 이미지와 비교하는 경우 (도 17f), 우리는 그룹들 중에서 상당한 차이를 가시화할 수 있다. 복합재료를 함유하는 모든 그룹 (25C, 50C, 및 100C)는 POD28 시점에서 상당히 발전된 혈관을 갖는다. 대조로, 100F 및 50H 그룹은 CD 31에 대하여 강건한 염색을 보여주지 않아서, 혈관신생의 열악한 비율을 제안한다. 충분한 혈액 공급은 이식편 생존에 필수적이고, 이는 복합재료-함유 그룹이 부피 유지의 최고 비율을 갖는 이유를 설명하는데 도울 수 있다.
마이크로필(MicroFil) 관류 3-D 재구성
마우스 맥관구조의 마이크로필 관류는 전산화 단층촬영 (CT) 스캔을 사용하여 이식편의 미세혈관을 사정하기 위해 그룹당 1 마우스로 수행되었다. 간단히, 마우스는 방혈되었고 우심방에서 절개술을 통해 헤파린화된 식염수로 관류되었다. 마이크로필 실리콘 고무 주사 화합물은 그 다음 마우스를 통해 관류되었다. 이식편 표본은 그 다음 제거되었고 CT 스캔을 통해 이미지화되었다. VivoQuant 소프트웨어는 이식편 맥관구조의 3-D 재구성을 수행하는데 그리고 혈관 대 이식편 조직의 비를 전산화하는데 사용되었다. 재구성된 맥관구조는 도 17g에서 증명된다. 총 이식편 부피와 비교하여 이식편 맥관구조의 백분율은 VivoQuant 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 100F는 혈관 대 이식편 부피의 최저 비를 가졌던 반면, 25C는 최고를 증명하였다. 그룹당 및 시점당 1마리의 대표적 마우스에 대하여 마이크로필 관류 이어서 VivoQuant 분석을 수행함으로써, 가능한 우리의 이식편 내에서 혈관화의 가장 편견없는 보고로 우리의 관찰을 확인하는 것이 목표이었다. 도 17g에서 도시된 3D 이미지가 상당히 놀라운 것은, 복합재료를 함유하는 이식편이 100F 또는 50H 이식편보다 극적으로 더욱 양호하게 혈관화되는 것을 우리가 명확하게 볼 수 있기 때문이다. 25C는 총 이식편 부피에 대해 혈관의 최고 백분율을 가져서, 다른 표본과 비교하여 혈관질의 우수한 수준을 나타낸다.
미래 연구에서, 기존의 생체내 프로토콜에 대한 사소한 변형이 심지어 더욱 놀라운 결과를 산출할 수 있다. 예를 들어, IHC 분석에서, 전-재생성 및 전-염증성 항체 염색은 우리의 스캐폴드의 면역조절 성능을 밝히는데 사용될 수 있다. 추가적으로, Ki-67 또는 브로모데옥시우리딘(Bromodeoxyuridine) (BrdU) 염색은 우리의 이식편 내에서 새로운 세포성 증식을 사정하는데 적용될 수 있다. 마지막으로, MicroFil 관류 및 VivoQuant를 사용하여 혈관의 정량화 및 3-D 가시화는 누드 마우스로부터 더 많은 수 및 다양한 조직 표본으로 용이하게 반복될 수 있다. 지방 이식편 보강 또는 재생에 대한 대안적 접근법은 또한 라핀(lapine) 또는 돼지 동물 모델 내에서 탐구될 수 있고, 이는 더 큰 기존의 지방 침착물 또는 지방 패드 내에서 연조직 결손부 속에 우리의 복합재료의 적용을 허용할 수 있다.
실시예 19. 지방흡인제와 조합된 복합 비드의 제조 (복합 비드-지방흡인제)
복합 비드-지방흡인제 샘플은 지방 이식 프로토콜을 향상, 혈관 내부성장을 유도, 그리고 생체내 지방 이식편 부피 유지를 개선하기 위해 제조된다.
지방흡인제는 리볼브 시스템을 사용하여 자가 지방 이식을 경험하는 18세 내지 70세의 여성들로부터 수득된다. 참가자들은 비-흡연자이고 35 미만의 체질량 지수를 가졌다. 출혈 장애, HIV, 진성 당뇨병 및 지방위축증 장애를 가진 환자는 본 연구에서 배제되었다. 지방흡인제, 복합 비드, 및 하이드로겔의 다양한 비는 조합되어 시험관내 및 생체내 연구에 시험된다 (표 8). 비드화된 복합재료가, 제자리-반응하는 복합재료에서 발생하는 것처럼, 지방흡인제 입자 속에 그리고 주위에 진정한 상호관통 네트워크를 형성할 수 없는 반면, 유동학적 데이터에서 낮은 tan 델타 값 (비드화 후 < 0.10) 및 생체내 보여진 형태 유지에서 보여진 바와 같이, 비드가 서로에 강력하게 부착하는 방식으로 인해 비드는 응집성 겔을 형성하는 능력을 보유한다. 복합재료의 섬유성 성분은 또한 개별 비드들 사이 부착 및 얽힘을 증가시키기 위해 벨크로(Velcro)처럼 작용할 수 있다. 비드들 사이 응집을 유지하기 위한 능력은, 부피 비 및 비드/지방흡인제 입자 크기가 개별 비드들 사이 다중 접촉 점을 허용하는 한, 복합 비드-지방흡인제 혼합물의 응집성 구조를 유지한다.
복합 비드 및 지방흡인제의 조합은 2개의 상이한 임상적 필요를 설명하는데 사용될 수 있다. 첫째로, 환자는 (특히 소아 환자에게서) 이용가능한 공여자 지방의 충분한 양을 가질 수 없다. 복합 비드를 지방흡인제에 편입하는 것은 재구성을 위하여 이용가능한 부피의 양을 늘리는 작용을 할 수 있는 반면, 지방흡인제는 혈관재형성 및 리모델링에 대하여 생물학적 단서를 제공한다. 50:50 지방-복합재료 내지 미량의 지방흡인제를 가진 거의 총 복합 비드의 이러한 비. 둘째로, 지방 이식의 임상적 성과는 이식술화된 지방의 불량 생존에 의해 제한된다. 복합 비드는 99:1 지방 대 복합재료 내지 50:50 지방 대 복합재료의 비로 편입되어 구조적 지원, 접착성 단서, 면역보호, 및 추가의 이익을 제공하여 이식술화된 지방의 생존 및 형태 유지를 개선할 수 있다.
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복합 비드와 지방흡인제의 혼합
복합 비드 및 지방흡인제는 몇몇 상이한 방식으로 혼합/조합될 수 있다. 이들 프로토콜에 대하여 핵심은 지방을 "최소한으로 조작"하기 위해 지방 및 복합재료를 조합하는 것이다. 하나의 방식은 복합 비드가 있는 5cc, 10cc 또는 20 cc 주사기를 가공된 지방을 가진 5-cc, 10-cc 또는 20-cc 주사기에 루어(luer)-루어 연결기를 통해 연결하고, 그 다음 주사기들 사이 재료를 혼합하는 것이다. 이러한 작업흐름은 본 분야에서 작업하는 외과의에 일상적이다. 또 다른 방식은 1-cc, 5-cc, 또는 10-cc 주사기내 비드 그리고 (흡인된 지방 원심분리로부터) 기질-혈관-분획을 갖는 것이다. 이들 경우에, 비드는 제조의 몇분 내에 사용되어야 하는 OR에서 지방과 혼합될 것이다.
대안적 방식은 수 일 (1 일, 3 일, 5 일, 7 일) 동안 교반하면서 배지에서 복합 비드와 지방흡인제를 혼합하는 것이다. 이러한 프로토콜은 내인성 세포가 또한 도 10e에서 도시된 바와 같이 비드에서 증식하였던 줄기 세포와 유사한 비드를 리모델링하고 성장하게 할 수 있다.
복합 비드-지방흡인제는 대상체에서 작제물로 처리 전 번식 동안 37℃에, 그 다음 4℃에 빙상에서 일정 시간 동안 유지되어야 한다. 세포성 수준에서 복합재료 통합화를 분석하기 위해 유동학적 시험, 세포 생존 검정, 및 면역조직화학 (IHC)를 추구하는 프로토콜은 상기 실시예 18의 것과 유사하다. 또한, 본 실시예 19에서 설계된 생체내 실험은 비드-지방흡인제의 비가 더 양호한 결과로 산출하는 지를 결정하기 위해 복합 비드-지방흡인제 샘플로 반복된다.
실시예 20. 복합 비드의 안정성 결정
개시된 복합 비드의 안정성을 평가하기 위해, 유동학적 연구는 마이크로비드 상에서 다양한 시점에 수행되어 기계적 안정성을 결정한다. 4 ℃에 수화된 형태로, 마이크로비드는 6 개월 동안 안정한 것으로 결정되었다.
구조적 통합성을 결정하기 위한 유동학적 시험 (전단 탄성률)은 비드의 수화된 형태, 및 탈수된 형태로 1 개월, 3 개월, 6 개월, 9 개월, 12 개월 및 24 개월에 실온에서 수행된다. 상이한 하이드로겔 분자량, 아크릴화 정도, 섬유 농도, 말레이미드 정도, 및 가교 밀도를 가진 다양한 복합 비드는 그들의 안정성에 대하여 시험된다.
세포-씨딩된 비드에 관하여, 이들이 주사에 준비된 시점까지 이들은 37℃에서 배지와 보관되어야 한다. 세포-씨딩의 타이밍은, 더 오랜 시간 동안 배양이 더 많은 세포 증식을 허용할 것이기 때문에, 주사와 양호하게 조정되어야 한다.
상기 실시예들에서 기재된 바와 같이, 비드화된 제형은 임상적으로 관련한 27- 내지 31-게이지 또는 16- 내지 31-게이지 바늘을 통해 쉽게 주사가능하게 되고 제자리 겔화 원형에 대해 몇몇 개선을 제공한다. 비드화된 제형은 개선된 사용 용이성을 위하여 단일 주사기 전달 시스템을 가능하게 한다. 훨씬 더 큰 표면적으로, 동결건조된 비드는 더욱 빨리 재수화하고, 그래서 광범위한 2-주사기 혼합은 더 이상 필요하지 않을 것이다. 비드화된 제형은 더 높은 농도의 히알루론산, 나노섬유, 및 가교제를 제형에서 사용되도록 한다. 이전에, 최대 농도는 점도 및 주사력에 의해 지배되었다. 특수화된 비드로 이동함으로써, 구성물질 농도는 더 이상 속도 제한성이 아니고 팀은 추가로 강직성을 변형시킬 수 있고 내구성을 향상시킬 수 있다. 비드화된 제형은 향상된 안정성을 가능하게 한다. 복합재료의 예비-반응된, 비드화된 형태는 미반응된 형태보다 온도, 습도, 및 광 변형에 대해 훨씬 더 강건하고, 여러 나라간 선적 후 특성의 변화를 갖지 않는다. 마지막으로, 비드화된 제형은 향상된 세포 및 조직 전달 스캐폴드를 제공한다.
등가물
본 명세서에 기재된 상세한 예 및 구현예가 실례적 목적으로만 예로써 주어지고, 본 발명에 제한되도록 결코 고려되지 않는 것이 이해된다. 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화는 당업자에게 제안될 것이고 본원의 정신 및 범위 내에 포함되고 첨부된 청구항들의 범위 내에 고려된다. 예를 들어, 구성성분의 상대적 양은 원하는 효과를 최적화하기 위해 가변될 수 있고, 추가의 구성성분은 첨가될 수 있고/거나, 유사한 구성성분은 기재된 하나 이상의 구성성분에 대하여 치환될 수 있다. 본 발명의 시스템, 방법, 및 공정과 연관된 추가의 유리한 특성 및 기능성은 첨부된 청구항들로부터 분명해질 것이다. 더욱이, 당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을, 일상 실험만을 사용하여 인정할 것이거나, 규명할 수 있다. 이와 같은 등가물은 하기 청구항들에 의해 포괄되기 위한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY <120> NANOFIBER-HYDROGEL COMPOSITES FOR CELL AND TISSUE DELIVERY <130> 048317-555001WO <140> PCT/US2019/031636 <141> 2019-05-09 <150> 62/669,287 <151> 2018-05-09 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Cys Cys Arg Arg Ile Lys Val Ala Val Trp Leu Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (38)

  1. 연조직 기기로서,
    생물학적 활성 재료 그리고 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크와 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하되, 여기서 상기 생물학적 활성 재료는 상기 비구형 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 상기 생물학적 활성 재료는 상기 비구형 마이크로비드와 작동가능하게 회합되거나, 또는 이들의 조합이고,
    상기 마이크로비드의 평균 크기가 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내인, 연조직 기기.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로비드가 예비-반응되는, 기기.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 마이크로비드가 적어도 약 6 개월 실온에서 실질적으로 안정한, 기기.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 상기 연조직 기기가 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식되거나 주사될 수 있는, 기기.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로비드가 실질적으로 비-염증성인, 기기.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 성장 인자, 사이토카인, 항체, 세포, 조직, 조직 담체, 또는 조직-결합 모이어티, 핵산, 세포 담체, 또는 세포-결합 모이어티, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 기기.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 세포-결합 모이어티 또는 조직-결합 모이어티가 펩타이드, 항체, 단백질, 압타머, 올리고당류, 또는 생물학적 재료를 포함하는, 기기.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 지방 세포, 자가 지방 세포, 동종 세포, 유전자 변형 동종 세포, 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유전자 변형 줄기 세포, 유전자 변형 동종 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 및 유전자 변형 저면역원성 만능 줄기 세포, 지방 조직으로부터의 간질 혈관 분획, 이의 유도체, 또는 이들의 조합의 집단을 포함하는, 기기.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 상기 기기 내에 또는 그에 근접하게 내구성있게 존재할 수 있는 세포의 집단을 포함하는, 기기.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 지방 간질 혈관 분획을 포함하는, 기기.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 재료가 지방 조직을 포함하는, 기기.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 지방 조직이 지방흡인제인, 기기.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 지방 조직이 자가성인, 기기.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 연조직 기기가 37℃에서 안정한, 기기.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연조직 기기가 대상체의 표적 조직 속에 투여에 앞서 1 시간, 2 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간, 또는 10 시간의 기간 동안 40℃에서 유지되는, 기기.
  16. 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 기기의 제조를 위한 키트로서, 상기 키트가 하기: (i) 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단을 포함하는 약 1cc 내지 약 20cc 또는 20cc 초과의 주사기 부피를 갖는 주사기; 및 (ii) 상기 지방흡인제를 포함하는 약 1cc 내지 약 20cc 또는 20cc 초과 주사기 부피를 갖는 주사기를 포함하되, 상기 2개의 주사기가 루어 연결기를 통해 서로와 연결할 수 있고, 이로 인해 상기 지방흡인제가 상기 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 상기 지방흡인제가 상기 마이크로비드와 작동가능하게 회합되는, 키트.
  17. 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 기기의 제조 방법으로서, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 7 일 동안 적당한 매질에서 상기 지방흡인제 및 상기 마이크로비드를 혼합시키는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 대상체의 표적 조직 속에 투여를 위하여 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 기기의 제조를 위한 키트로서, 상기 키트가 (i) 동결건조된 마이크로비드를 포함하는 주사기; (ii) 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체를 포함하는 바이알로서, 여기서 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체는 상기 바이알로부터 상기 주사기 속에 인출될 수 있고, 이로 인해 상기 동결건조된 마이크로비드는 재수화되는 것인 바이알; 및 (iii) 상기 지방흡인제를 포함하는 주사기를 포함하고, 2개의 주사기가 루어 연결기를 통해 서로와 연결할 수 있고, 이로 인해 상기 지방흡인제가 상기 수화된 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 상기 지방흡인제가 상기 수화된 마이크로비드와 작동가능하게 회합되는, 키트.
  19. 인간 대상체에서 지방 이식 방법으로서, 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단 그리고 지방 조직을 포함하는 연조직 기기를 조직 또는 조직 결손부 속에 주사 또는 이식하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 활성 재료가 상기 비구형 마이크로비드 내에서 작동가능하게 캡슐화되거나 또는 상기 생물학적 활성 재료가 상기 비구형 마이크로비드와 작동가능하게 회합되거나, 또는 이들의 조합이고,
    상기 마이크로비드의 평균 크기가 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고,
    상기 마이크로비드가 예비-반응되고,
    상기 마이크로비드가 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고,
    상기 생물학적 활성 재료가 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 상기 연조직 기기가 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식되거나 또는 주사될 수 있는, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 기공을 포함하는, 기기.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 기공의 적어도 한 서브셋이 상기 마이크로비드 도처에 배치될 수 있어서 이로써 대상체에서 존재하는 표적 조직 속에 이식 또는 주사된 경우 조직 성장 및 세포 침윤을 촉진시키는, 기기.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 복수의 기공이 cm2 당 50개 기공 이상의 면밀도를 포함하고, 기공의 적어도 약 80%가 약 5 마이크론 이상의 평균 크기를 갖는, 기기.
  23. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능화된 히알루론산이 아크릴화된 히알루론산을 포함하고, 상기 가교 제제가 티올화된 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 이의 유도체를 포함하는, 기기.
  24. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능화된 히알루론산이 티올화된 히알루론산을 포함하고, 상기 가교 제제가 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA), 또는 이의 유도체를 포함하는, 기기.
  25. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리카프로락톤 섬유가 전기방사된 섬유를 포함하는, 기기.
  26. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리카프로락톤 섬유의 직경이 약 100 나노미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위내인, 기기.
  27. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로비드가 약 50 Pa 내지 약 2500 Pa의 평균 저장 탄성률을 갖는, 기기.
  28. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기가 대상체의 표적 조직 속에 진피 또는 피하 투여를 위하여 이식가능한 또는 주사가능한 기기로서 제형화되는, 기기.
  29. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 기기의 약 0.1mL 내지 약 20 mL를 포함하는 주사기를 포함하는 키트로서, 상기 마이크로비드가 대상체의 표적 조직 속으로 주사에 준비되는 i) 실질적으로 탈수된 비드 또는 ii) 수화된 비드로서 제형화되는, 키트.
  30. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 기기를 포함하는 제형으로서, 상기 마이크로비드가 동결건조되어 탈수된 마이크로비드를 형성하고, 상기 탈수된 마이크로비드가 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체를 사용한 재구성에 적합하여 대상체의 표적 조직 속에 투여에 앞서 (중량 기준으로 측정된 경우) 손실된 수괴를 실질적으로 대체하여 이로써 손실된 수괴가 대체된 경우, 상기 재구성 유체내 상기 마이크로비드의 농도가 동결건조 전 마이크로비드의 농도와 동일한 또는 실질적으로 동일한, 제형.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 탈수된 마이크로비드가 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 투여하기에 앞서 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체에 의한 재구성시에 이의 비드화된 형태를 보유 또는 재취득하는, 제형.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 탈수된 마이크로비드가 적어도 약 12 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정한, 제형.
  33. 대상체의 표적 조직 속에 즉시 투여를 위하여 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 기기의 제조를 위한 키트로서, 상기 키트가 마이크로비드를 함유하는 바이알을 포함하고, 상기 마이크로비드가 동결건조되었고 분말 케이크로 형성되었으며, 상기 동결건조된 분말 케이크가 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체에 의해 재구성될 수 있는, 키트.
  34. 대상체의 표적 조직 속에 즉시 주사를 위하여 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 기기의 제조를 위한 키트로서, 상기 키트가 (i) 동결건조된 겔 비드로서 제형화된 마이크로비드를 포함하는 주사기; 및 (ii) 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체를 포함하는 바이알을 포함하되, 물, 식염 용액 또는 적합한 재구성 유체가 상기 바이알로부터 상기 주사기 속에 인출될 수 있고, 이로 인해 동결건조된 마이크로비드가 재수화되는, 키트.
  35. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자, 혈관신생을 자극시키는 화합물, 면역조절제, 염증의 억제제, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하는, 기기.
  36. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 효과, 혈관화 효과, 항-혈관화 효과, 항-염증성 효과, 항-박테리아 효과, 항히스타민 효과, 또는 이들의 조합을 갖는 화합물을 추가로 포함하는, 기기.
  37. 제 1 항 내지 제 15 항 또는 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 가공된 조직 세포외 기질을 추가로 포함하고, 상기 가공된 조직 세포외 기질이 지방 조직에서 유래가능한, 기기.
  38. 외상, 외과 수술, 또는 연령관련 질환, 장애 또는 병태에서 비롯하는 조직 결손부의 감소 또는 반전 혹은 미용적 절차 또는 재구성적 절차의 수행 방법으로서, 약 200 마이크로미터 미만의 평균 길이를 갖는 복수의 폴리카프로락톤 섬유에 공유결합된 기능화된 히알루론산 네트워크, 및 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 농도로 존재하는 가교 제제를 포함하는 실질적으로 비구형 마이크로비드의 집단 내에서 작동가능하게 캡슐화된 생물학적 활성 재료를 포함하는 연조직 기기를 상기 조직 및/또는 상기 조직 결손부 속에 주사하는 단계를 포함하고,
    상기 마이크로비드의 평균 크기가 최장 치수를 따라 약 50 마이크로미터 내지 약 300 마이크로미터의 범위내이고,
    상기 마이크로비드가 예비-반응되고,
    상기 마이크로비드가 적어도 약 6 개월 동안 실온에서 실질적으로 안정하고,
    상기 생물학적 활성 재료가 대상체에서 i) 숙주 세포 침윤의 동원, ii) 조직 성장의 촉진, iii) 및/또는 세포 또는 조직 재생 중 적어도 하나를 할 수 있고, 상기 연조직 기기가 그것을 필요로 하는 대상체의 표적 조직 속에 이식될 수 있거나 또는 주사될 수 있는, 방법.
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