KR20140093966A - 각막을 위한 봉합가능한 혼성체 초다공성 수화젤 인공각막이식 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 각막 재생(cornea regeneration)을 위한 혼성체 초다공성 수화젤 골격(hybrid superporous hydrogel scaffold) 및 이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 혼성체 수화젤은 콜라겐과 혼합된 초다공성 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) (poly(2-hydroxyethyl methacrylate); PHEMA) 및 폴리(메틸메타크릴레이트) (poly(2-hydroxyethyl methacrylate); PMMA) 공중합체로 구성되어 있다. 상기 혼성체 골격은 봉합가능한 혼성체 각막 이식(suturable hybrid corneal implant) 또는 인공각막이식(keratoprosthesis)으로서 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 본 명세서에서 자체의 전체에 참조로 포함된 2011, 10월 28일에 파일된 미국 특허 적용 시리얼 번호 13/284,301에 우선권을 청구한다.
각막은 광선(light rays)이 눈으로 들어오기 전에 굴절 및 여과시키는 무혈관(avascular)이고 시각적으로 투명한 조직이다. 뚜렷한 각막은 뚜렷한 시력을 위해서 필수적이다. 상기 각막은 하기의 부상, 퇴화 또는 감염으로 불투명해질 수 있다. 상기 시력 나눔 협력단(Vision Share Consortium)은 세계적으로 1000만 환자 이상이 각막실명(corneal blindness)으로 고통받고 있다고 평가한다(Carlsson, et al. (2003) Curr . Opin . Ophthalmol . 14(4):192-7). 최적표준치료(gold standard treatment)는 신선하게 기증된 시신 인간 각막을 사용한 각막의 수술적 대체이다. 현재, 복잡하지 않은 첫번째 이식(graft)이 수행된 비혈관(nonvascularized) "저위험" 환자(Council on Scientific Affairs (1988) JAMA 259:719; The Collaborative Corneal Transplantation Research Group. (1992) Arch. Ophthalmol . 110:1392)에 있어서 90% 많큼 높은 2년 성공비율을 갖는 약 40,000 각막이식이 미국에서 매년 수행되고 있다(Eye Bank Association of America. Statistical report 2000). 그러나, 저위험 각막 이식의 성공은 최대 국소 및 전체 면역 억제일지라도, 거부비율이 50-70%까지 증가할 수 있는 소위 "고위험" 환자에 각막이식을 둔 결과와 선명하게 대조된다(Mader & Stulting (1991) Ophthalmol. Clin . North Am . 4:411; Foulks & Sanfilippo (1982) Am . J. Ophthalmol. 94(5):622-9). Immune-rejection still remains the leading cause of corneal transplant failure (Ing, et al. (1998) Ophthalmology 105(10):1855-65). 면역-거부(Immune-rejection)는 아직까지 각막 이식 실패의 원인으로 남아있다(Ing, et al. (1998) Ophthalmology 105(10):1855-65). 면역거부의 위험요인은 이전의 이식(graft) 거부, 각막의 혈관신생(corneal vascularization), 및 어린 나이를 포함한다. 이러한 "고위험" 환자는 통상적으로 반복되는 수술을 하게 되어 결과적으로 과도한 고통, 비용 및 제한된 자원의 사용을 초래한다. 예를 들면, 각막질환을 갖고 태어나는 아기가 거부에 굴복 될 때까지 3-6 개월 지속하는 각각의 이식으로 성인에 도달할 때까지 15-20 각막 이식을 하는 것은 드문 일이 아니다. 따라서, 이러한 고위험 환자들에게 거부를 피해가는 선택가능한 치료를 위한 분명한 필요가 있다(Coster & Williams (2003) Eye 17(8):996-1002).
인공 각막 또는 인공각막이식은 각막 대체를 위한 미충족 욕구(unmet need)를 만나기 위해 디자인되었다. 인공각막의 주요 장점은 면역거부가 없다는 것이다. 두 개의 인공 각막은 이식(transplantation), 보스톤 인공각막이식(Boston Keratoprosthesis (KPro) ) 및 알파코(AlphaCor)를 할 수 있다. 보스톤 KPro는 생물적분가능한 스커트가 시력적으로 뚜렷한 동공(core)을 둘러싼 현대 동공-및-스커트(core-and-skirt) 디자인을 개척했다(Chirila & Crawford (1996) Gesnerus 53(3-4):236-42). 후에 알파코는 보스톤 KPro의 강도와 연관된 문제를 피하기 위하여 부드러운 중합체(polymer)를 활용하여 상기 디자인을 변형하였다. 모든 장치는 높은 유지 비율을 가진다: 알파코는 6 개월 후에 92%를 보고했고(Hicks, et al. (2006) 각막 25(9):1034-42), 보스톤 KPro는 8.5 개월 후에 95%를 나타냈다(Zerbe, et al. (2006) Ophthalmology 113(10):1779.e1,1779.e7). 그러나, 결국은 녹기(melting), 압출(extrusion), 및 거부(rejection)를 초래하는 안정적 숙주통합의 부족으로 인하여 아무것도 넓게 받아들여지지 않았다 (Chirila (2001) Biomaterials 22(24):3311-7). 추가적으로, 전방 표면상의 상피화(epithelialization)의 부족은 비보호되고 감염되기 쉬운 눈을 만든다(Myung, et al. (2007) Biomed . Micro 장치s 9:911-922). 또한, 다른 디자인은 이상적인 인공각막이식, 예를 들면, 숙주 통합, 대량수송(mass transport), 조직 상피화 또는 신경분포(innervations)를 위한 하나 이상의 필수적인 파라미터를 부르는 것에 실패했다. 불충분한 인공각막이식 디자인은 압출, 조직괴사, 증가된 안구 내의 압력 또는 감염을 초래할 수 있다.
상기 제한을 극복하기 위해서, 폴리테트라플루로에틸렌(polytetrafluroethylene), 폴리-우레탄(poly-urethane), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(poly(2-hydroxyethyl methacrylate))(Carlsson, et al. (2003) supra), 및 폴리(에틸렌글리콜)(poly(ethylene glycol))(Myung, et al. (2007) supra)를 포함하는 다른 다공성 중합체를 조사하였다. 상기 기공이 숙주로부터 이식체로 세포 내 이동을 위한 물리적 경로를 제공하는 반면에, 이들은 세포 외 메트릭스를 부착, 생존 및 분비하는 세포를 위한 생물학적 신호를 제공하지 않는다. 세포가 2차원(2-D)맥락에 비해 3 차원(3-D)에 존재하는 세포 외 신호에 다르게 반응하는 것은 명백하다. 세포 부착(cell adhesion)은 공기-기질 접점(interface)에 의해 만들어진 인공 극성(polarity)으로 인하여 2-D에서 크게 변경된다. 3-D 세포 외 환경은 골격을 공학 기술화(engineering)하는 조직(tissue)의 성공에 기여하는 핵심 성분이다. 그러나 골격을 공학 기술화하는 3-D 조직을 지지하는 증거에도 불구하고, 확산 능력에 의해 크게 제한된다. 따라서, 다공성 시스템은 구성체에 걸쳐 영양 및 폐기물 교환을 용이하게 하는 것이 필요하다(Karande, et al. (2004) Ann . Biomed . Eng. 32(12):1728-43; Karageorgiou & Kaplan (2005) Biomaterials 26(27):5474-91). 기공은 또한 숙주 세포 통합을 위한 도관(conduits)으로서 제공할 수 있는 이식 후 장점이 있다. 혈관(blood vessels) 및 뉴런(neurons)을 포함하는 주변조직(surrounding tissue)은 조직 내에서 구성체를 추가적으로 시멘팅(cementing)하는 서로 연결된 기공 네트워크를 경유하여 골격으로 이동할 수 있다.
많은 방법이 열, 부착, 빛 또는 몰드를 사용하여 염 침출(salt leaching), 냉동건조(freeze drying), 및 레이어리소그래피(layer lithography)에 의한 층을 포함하는 3-D 다공성 골격을 공학 기술화하는 것에 사용되어 왔다. 이러한 방법들은 많은 장점이 있지만, 주요 결점은 상호연결된 기공을 얻는데 어려움, 독성 부산물, 세포를 결합시키는 어려움 또는 긴 공정 시간을 포함한다(Tsang & Bhatia (2004) Adv. Drug Deliv . Rev . 56(11):1635-4).
미국 특허 번호 6,960,617은 개선된 탄력 및 기계적 내구력(strength)을 갖는 수화젤의 용도를 설명한다. 상기 수화젤은 초다공성이고 중합체 사슬의 네트워크를 형성하는데 사용되었다. 상기 특허는 중합체의 기능 또는 생체적합성을 개선하기 위하여 임의의 다른 화합물을 수화젤과 혼합하는 것을 가르치거나 제시하지 않는다.
뚜렷한 층에서 몇가지 세포 타입의 결합을 요구하기 때문에 각막 조직 공학은 도전중이다. 상피(epithelium)는 편평상피세포(squamous epithelial cell)로 구성된 각막의 가장 바깥쪽의 층(outermost layer)이다. 상피의 주요 기능은 눈으로 들어오는 외부 물질을 차단하고 각막을 위하여 산소 및 영양을 흡수한다. 보우맨스 층(Bowman's layer)은 기질(stroma)로부터 상피를 분리하는 콜라겐 무세포 시트(acellular sheet)이다. 보우맨'스 층(Bowman's layer)에 위치한 기질은 물, 콜라겐 및 각막세포로 구성되어 있고, 혈관이 결여되어 있다. 기질 밑에 , 내피(endothelium)로부터 기질을 분리하는 다른 무세포 층, 데스세메트'스 멤브린(Descemet's membrane)이 놓여 있다. 내피는 각막의 수화 레버(hydration lever)를 조절하는 펌프로서 작용하는 가장 안쪽의 층이다.
콜라겐 메트릭스는 세포 성장 및 분화를 지지한다(Sun, et al. (2004) 조직 Eng. 10(9-10):1548-57; Yoneno, et al. (2005) J. Biomed . Mater . Res . A 75(3):733-41; Reyes & Garcia (2004) J. Biomed . Mater . Res . A 69(4):591-600). 콜라겐은 인간 세포 외 메트릭스의 자연 성분이고 포유동물 조직에서 가장 풍부한 단백질이다. 추가적으로, 콜라겐은 비독성, 생분해성 및 비싸지 않다. 세포 외 메트릭스 (ECM) 단백질로서, 콜라겐은 세포 부착의 인테그린(integrin) 결합 부위의 어레이를 제공한다. 이는 자체의 기계적 및 생물학적 특성을 매개하는 세포와 ECM 사이의 2가지 줄기의 소통을 하게 한다(Pampaloni, et al. (2007) Nat . Rev . Mol . 세포 Biol . 8(10):839-45). 불행히도, 시험관 내에서 만들어진 콜라겐 젤은 자체의 약한 기계적 성질에 대해 오랫동안 비평받아 왔다. 콜라겐의 기계적 안정성을 증가시키기 위하여, 화학 교차 또는 탈수가 시도되어 왔다(Drury & Mooney (2003) Biomaterials 24(24):4337-51). 그러나, 상기 방법은 종종 세포에게 독성이 있고 메트릭스 내에서 3-D 피막형성(encapsulation)을 방지한다.
생합성 메트릭스의 많은 다양한 타입은 다른 것에 의해서 설명되었다. 예를 들면, 미국 2004/0048796은 의학 및 수술 적용을 위해서 콜라겐 생구조물(collgen biofabric)의 사용을 가르친다. 콜라겐 생구조물은 양막(amniotic) 멤브린 탈세포화(decellularizing)에 의해, 태반 멤브린(placental membrane) 바람직하게는 인간으로부터 제조된다. 미국 2006/0083773는 각막 대체 또는 증가시키기에 디자인된 인공 각막 이식을 개시한다. 개시된 이식은 생체적합적 중합체로 구성된 이중 네트워크 수화젤로부터 제조되었고, 네트워크 중합체의 적어도 하나는 친수성 중합체에 기반하고, 상기 이식은 이중 네트워크 수화젤의 표면에 공유결합으로 링크된 생체분자(biomolecules)를 촉진하는 상피화를 가진다. 또한, 이식은 부착된 세포로 영양의 경로를 허락하는 생리적 확산 계수이다. 미국 2006/0246113은 합성 중합체 및 생중합체화학적 교차에 의해 형성된 수화젤로 구성된 생합성 메트릭스의 사용을 가르친다. EP 1 741 457는 또한 합성 중합체 및 생중합체 교차에 의해 형성된 수화젤을 포함하는 생합성 메트릭스를 개시한다. 그러나, 이전 기술에서 설명된 메트릭스의 아무것도 각막 대체 수술에서 사용을 위하여 충분한 강도 및 생체적합성을 갖는 각막 이식 물질을 생성하는 것에 성공적으로 사용되지 못했다. 각막 대체 수술에서 사용될 수 있는 물질의 필요가 남아있다.
본 발명은 초다공성 수화젤 공중합체를 포함하는 각막 재생을 위한 혼성체 골격에 관한 것이고, 상기 초다공성 수화젤 공중합체는 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) (poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(PHEMA) 및 폴리(메틸메타크릴레이트) (poly(methyl methacrylate))(PMMA), 및 상기 초다공성 수화젤 공중합의 기공에 있는 콜라겐을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 PHEMA-PMMA 공중합체, 및 상기 PHEMA-PMMA 공중합체의 기공에 있는 콜라겐을 포함하는 봉합가능한 혼성체 임플란트에 관한 것이다. 일실시형태에 있어서, 상기 봉합가능한 혼성체 임플란트는 각막으로 이식을 위한 동공-스커트(core-skirt) 인공각막이식의 스커트를 형성한다.
본 발명의 다른 목적은 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 형성하기 위하여, 수용액에서 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate), 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate) 및 디메틸포름아미드(diemthylformamide)를 혼합하여 봉합가능한 혼성체 임플란트를 생성하는 단계; 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 냉각시키는 단계; 콜라겐-수화젤 용액을 형성하기 위하여 냉각된 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액에 콜라겐을 첨가하는 단계; 및 봉합가능한 혼성체 임플란트를 만들기 위하여 37℃에서 콜라겐-수화젤 용액을 배양하는 단계를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 형성하기 위하여, 용액에서, 메틸메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(PETA) 및 디메틸포름아미드(DMF)를 혼합하여 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 DMF는 PHEMA-PMMA 공중합체의 가교를 촉진하는 젤 용액 및 PETA로 MMA 및 HEMA의 용해를 촉진한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 용액은 10% v/v 농도에서 메틸메타크릴레이트, 45% v/v 농도에서 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 5 mg의 PETA, 2 mg 암모늄퍼설페이트(ammonium persulfate), 10 ㎕ N,N, N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, 6% v/v 농도에서 DMF, 및 22% 탈이온수를 포함한다.
도 1은 본 발명의 중합체상에서 테스트한 인장 견고성(인장 강도)의 결과를 나타낸다. 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체, 다공성 PHEMA-PEGDA 공중합체 및 다공성 PEGDA 중합체는 테스팅에서 비교되었다. 모든 물질은 자체의 수화상태에서 테스트되었다. PHEMA-PMMA 공중합체는 PHEMA-PEGDA의 공중합체뿐만 아니라 PEGDA 중합체와 비교하여 현저히 더 큰 인장 강도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 중합체에서 테스팅한 인장 강도의 결과를 나타낸다. 다공성 염 프로겐 PHEMA-PMMA 공중합체, 다공성 가스-거품발생된 PHEMA-PMMA 공중합체, 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체 및 다공성 PEGDA 중합체는 테스팅에서 비교되었다. 모든 물질은 자체의 수화상태에서 테스트되었다.
도 3은 본 발명의 중합체의 최적 투명도를 나타낸다. PMMA (3.5, 7, 14, or 21%)의 다양한 양을 갖는 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체가 분석되었다. 가스 또는 소듐 바이카보네이트(염 구조체)로 생성되는 구조체를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 중합체에서 테스팅한 인장 강도의 결과를 나타낸다. 다공성 염 프로겐 PHEMA-PMMA 공중합체, 다공성 가스-거품발생된 PHEMA-PMMA 공중합체, 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체 및 다공성 PEGDA 중합체는 테스팅에서 비교되었다. 모든 물질은 자체의 수화상태에서 테스트되었다.
도 3은 본 발명의 중합체의 최적 투명도를 나타낸다. PMMA (3.5, 7, 14, or 21%)의 다양한 양을 갖는 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체가 분석되었다. 가스 또는 소듐 바이카보네이트(염 구조체)로 생성되는 구조체를 나타낸다.
본 발명은 SPH의 전체적인 기계적 증식을 유지하는 반면에, 세포 내증식을 장려하는 3-D 세포 부착을 완성하기 위한 방법을 제공하기 위하여 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) 또는 PHEMA-기반, 또는 선택적으로 폴리(메틸메타크릴리에트)(poly(methyl methacrylate)) 또는 PMMA-기반 초다공성 수화젤 (SPH)에 꼬여있는(intertwined) 콜라겐으로 구성된 혼성체 골격에 관한 것이다. 상기 골격을 이용하여, 본 발명은 또한 봉합가능한 혼성체 임플란트를 포함한다. 상기 봉합가능한 혼성체 임플란트는 PHEMA-PMMA 공중합체 및 콜라겐으로 구성되어 있다. 상기 혼성체 임플란트는 숙주 통합 및 생체 내 대량운반의 촉진을 제공하고 각막 이식을 위한 동공-스커트 인공각막이식(core-skirt keratoprosthesis)에서 스커트로서 사용될 수 있다. 상기 각막 이식을 위한 스커트-동공 인공각막이식 모델은 동공은 시력을 허가하고 반면에 스커트는 안정적 숙주 통합(host integration)을 용이하게 하는 것이다. 또한 본 발명은 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 형성하기 위해서 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate(MMA)), 2-하이드록시에틸(메타크릴레이트)(2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)), 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate)및 디메틸포름아미드(diemthylformamide)수용액에서 혼합하는 단계; 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 냉각시키는 단계; 콜라겐-수화젤 용액을 형성하기 위하여 냉각된 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액에 콜라겐을 첨가하는 단계; 및 봉합가능한 혼성체 임플란트를 제조하기 위하여 37℃에서 콜라겐-수화젤 용액을 배양하는 단계를 포함하는 봉합가능한 혼성체 임플란트를 생성하는 방법을 제공한다.
현재 활용가능한 인공각막이식 스커트(keratoprosthetic skirt)는 장기간 이식 사용과 완전한 시야 모두를 얻고 유지하기 위한 충분한 숙주 통합을 제공하는데 실패하였다. 예를 들면, 하나의 보철물(prosthesis)에서, 골-치아(osteo-odonto) 인공각막이식(OOKP), 자가 치아로부터 만들어진 박판(wafer)에 의해 둘러싸인 PMMA의 중심 동공은 62%의 평균 총 10년 해부학적 생존율을 나타냈으나, 단지 제한된 시력 분야를 제공했다(Griffith, et al. (2005) In Essentials in Ophthalmology: 각막 and External Eye Disease, Chapter 3. T. Rheinhard (ed). Springer; Jun, et al. (2010) In 각막 and External Eye Disease : Essentials in Ophthalmology, Chapter 10. Weinreb and Krieglstein (eds.), pp. 137-144). 충분한 숙주 통합과 완전한 시야를 제공하는 데 실패한 장치의 또 다른 예는 PMMA 시력과 폴리우레탄(polyurethane) 이거나 폴리프로필렌(polypropylene)으로 만들어진 스커트로 구성된 서울타입 인공각막이식이다. 상기 장치의 사용은 68 개월에서 66.7%의 해부학적 유지율 결과를 나타냈다. 상기 모든 장치들은 스커트의 전체 노출을 이끄는 각막 용융(melt)을 유도했다. 원하는 질의 모두가 부족한 장치의 또 다른 예는 자체의 중심 시력 성분에서 폴리(에틸렌글리콜)(poly(ethylene glycol)) 및 폴리(아크릴산(poly(acrylic acid)) (PEG/PAA)의 혼성체 네트워크로 구성된 스탠포드(Stanford) 인공각막이식이다. 상기 보철물은 동물모델에서 6 주까지 잘 견디었다(Griffith, et al. (2005) In Essentials in Ophthalmology : Corea and External Eye Disease, Chapter 3. T. Rheinhard (ed). Springer); 그러나, 숙주 통합의 증거가 없었다. PHEMA-기반 인공각막이식, 알파코르(Alphacor)는 현재 임상 사용을 위해 승인되었다(Griffith, et al. et al. (2005) supra; Jun, et al. (2010) supra). 2년째에 알파코르(Alphacor) 유지는 62% 까지로 보고되었고 수술 후 메드록시프로제스테론(medroxyprogesterone (MPG))의 국소사용은 가장 빈번한 합병증인 각막 기질 용융과 거의 연관되어 있지 않음을 발견하였다(Gomaa (2010) Clin . Exp . Ophthalmol. 38:211-224). 그러나, 다른 알파코르 합병증은 재인공판(retroprosthetic) 멤브린 형성, 시력 손상, 및 약한 생물통합(biointegration)을 포함하였다(Sheardown (2008) In Regenerative Medicine in the Cornea, pp. 1060-1071). 추가적으로, 봉합을 잡는 알파코르의 무능력에 기인한 벌어진 상처(wound dehiscence)는 전임상 시도동안에 실패의 보편적인 모드였다(Hicks, (1997) Austral . NZ J. Ophthalmol. 25:S50-S52). 마지막으로, 3-14 KPa 범위내의 인장 모듈(tensile modulus)은 인공각막이식 디자인의 바람직한 형성에 사용되는, 에틸렌디메타크릴레이트(ethylene dimethacrylate (EDMA))를 포함하는, 다양한 가교제를 사용하여 제조된 PHEMA 스폰지를 위해 관찰되었다(US Patent No. 5,458,819; Lou (2000) J. Mater . Sci . 11:319-325). 존재하는 인공각막이식 디자인 및 생체 내 사용을 갖는 문제에 있어서, 새로운 디자인이 필요하다. 상기 문제를 언급하는데 있어서, 본 발명은 조직 발달 및 스커트의 통합을 숙주의 안구조직으로 유도하는 봉합을 잡고 세포 이동을 촉진하도록 디자인된 혼성체 구조체(콜라겐 타입 I 주입을 갖는 다공성 PHEMA-PMMA)이다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(PEGDA)-기반 초다공성 수화젤 (SPH)에서 서로얽힌 콜라겐으로 구성된 혼성체 골격의 사용을 처음 조사하여 개발되었다. 본 발명은 SPH의 전체 기계적 강도를 유지하는 동안에, 또한 세포 내증식을 장려하는 3-D 세포 부착을 완성하기 위한 방법을 제공하는 다른 SPH 중합체의 사용을 포함한다. 상기 혼성체 골격은 SPH를 탈수화한 후, 물질 사이에 공유 결합 또는 밀접한 상호작용 없이 혼성체 골격을 제조하는 콜라겐-세포 용액에서 재팽창하여 생성된다. 상기 방법은 콜라겐 및 PEGDA 중합체 사슬의 친밀하게 얽혀 제조된 골격과 비교하여 더 나은 3-D 세포 부착 결과를 초래했다. 세포는 콜라겐의 일부 내에 완전히 내장되어 있고 SPH의 벽에 노출되어 있디 않기 때문에, 정확한 조절 또는 일치된 기공 크기가 불필요하다. 추가적으로 세포는 섭취 및 젤형성(gelation) 전에 PEGDA-기반 골격에서 콜라겐 내에 내장되어 있기 때문에, 상기 방법은 3-D 환경을 만들고 비자연 세포 극성(unnatural cell polarity)을 회피한다.
본 발명의 방법에 의해 생성되는 골격은 강한 대다수 성질을 가지나 자연적 3-D 세포 부착 성질을 갖는다. 특정 젤 사용에 상관없이, 즉석 혼성체 골격(instant hybrid scaffold)의 자연 및 합성 젤은 비부착 방법으로 비공유결합에서 얽혀있다. 상기 관련에서, 혼성체 골격의 콜라겐은 초다공성 수화젤의 벽에 부착되지 않고, 따라서 콜라겐 젤을 수축하게 한다. 그것으로서, 콜라겐 내에 내장되어 있는 세포는 콜라겐 젤의 3-D에서 잠겨있고 초다공성 수화젤의 벽에 노출되지 않는다. 콜라겐은 세포 부착, 유지, 및 내증식을 증가시키는 반면에, 혼성체의 전체 역학(기계학)은 콜라겐에 의존하지 않고 초다공성 수화젤을 크게 닮는다. 따라서, 상기 혼성체 초다공성 수화젤은 기계적 안정성 및 서로 연결된 기공을 제공하고 반면에 3-D 콜라겐 메트릭스는 3-D 부착 결합 부위를 제공한다. 초기의 혼성체 골격이 콜라겐 및 PEGDA로 구성되어 있는 반면에, 상기 다용도 방법은 특정 조직 타입에 적절하도록 많은 다른 자연적 및 합성 물질을 포함하는 것에 적용될 수 있다. 실제로, 즉석 혼성체 골격은 원하는 적용상에 기반하는 파종 전처리가 있거나 없이 효과적으로 사용되도록 예측되었다
실험은 본 발명의 혼성체 골격이 생체 내에서 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 입증하기 위해서 PEGDA-기반 혼성체와 같이 수행되었다. 상기 실험에서, 두 마리 래트(rat)를 혼성체 골격(SPH 및 콜라겐)이나 또는 콜라겐(혼성체 없음)없이 수화젤 골격을 포함하는 인공 각막으로 이식하였다. 혼성체 골격을 사용해서 생성된 신규 천연 인공각막은 이식의 혼성체 스커트(바깥부분) 일부와 연관되어 있다. 따라서, 이식의 중심 일부가 명확성을 유지하는 반면에, 말초 스커트는 안구 조직과 통합을 장려하기 위해 디자인되었다. 각막 이식의 상기 타입의 생체 내 통합 정도를 테스트하기 위해서, 말초 스커트를 래트 각막으로 이식하였고 2 주 후에 관찰하였다. 이식 실험은 이식의 성질에 의존한 차이를 나타냈다. 혼성체 물질 (SPH 및 콜라겐)을 포함하는 말초 스커트를 갖는 이식은 2 주 후에 안구에서 덜 눈에 띄었다. 혼성체 스커트 이식은 잘 받아들여졌고 생체적합적 이었다. 추가적으로, 혼성체 스커트 이식이 콜라겐 없는 이식과 비교하여 안구 조직 주변과 더 잘 통합되었다는 결과를 나타냈다.
선택적 제제(formulation)에서, 본 발명은 PHEMA-PMMA 공중합체로 구성된 초다공성 수화젤이다. 상기 공중합체는 PEGDA-기반 초다공성 수화젤과 비교하여 인공각막이식으로 결합될 때 예상치 못한 개선된 성질을 갖는 것을 나타냈다. 또한, 본 발명은 인공각막이식으로서 적용을 위하여 초다공성 수화젤을 형성하는 신규 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 상기 초다공성 수화젤은 PHEMA-PMMA 혼성체 공중합체로서 제제화된다. 본 발명의 방법은 젤 용액을 형성하기 위해서 메틸메타크릴리에트(methyl methacrylate(MMA)), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)), 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate (PETA)), 암모늄펄설페이트(ammonium persulfate), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)), 디메틸포름아미드(dimethylformamide (DMF)), 및 탈이온수 혼합을 포함한다. 젤 용액에서 PETA의 사용은 원하는 강도와 기계적 성질을 갖는 젤을 생성하는 PHEMA-PMMA 공중합체의 가교를 제공하고, 즉석 발명의 초다공성 수화젤을 형성하는 방법의 PHEMA-PMMA신규 특징이다. 젤 용액에서 PHEMA-PMMA를 용해하기 위한 DMF 사용은 PHEMA-PMMA 공중합체의 중요한 특징인 대기공(large pore)을 파괴하지 않는 반면에 PHEMA and PMMA의 용해를 제공하기 때문에 본 발명의 초다공성 수화젤 형성 방법의 또 다른 신규한 특징이다. 중합(polymerization)하는 동안에 교반은 대기공(large pore) 형성을 유도하는 핵심 스텝이다. 상기 기공은 한계온도(threshold temperature)까지 혼합액을 교반하여 더 크게 할 수 있다. 일단 한계온도가 도달하게 되면, 본 발명의 방법으로부터 만들어진 젤 용액은 각막의 굴곡을 흉내내는 콘택트렌즈-모양의 몰드(mold)로 놓기에 충분히 유연한 점도(점착성)를 발달시킨다. 일단 젤이 생성되면, 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체에서 상호침투 콜라겐 네트워크 형성은 수 용액에서 PHEMA-PMMA의 느린 팽창으로 인해 36 시간까지 걸릴 수 있다. 일단 PHEMA-PMMA 공중합체가 콜라겐 용액에서 완전히 팽창되면, 구조체는 이식을 위한 봉합가능한 혼성체 인공각막이식이다. 즉석 발명의 공중합체의 적절성(suturability)은 다른 물질 상의 중요한 진보이다. PHEMA-PMMA 공중합체가 탈이온수 및 인산염완충식염수(PBS)와 같은 용액에서 기계적으로 안정적이라는 것을 나타내고, 반면에 공중합체는 보통의 힘을 갖는 물질 상에 당기기에 충분히 탄력적이라는 것을 나타내는 실험을 수행하였다. 더욱이, 본 발명의 혼성체 봉합가능한 인공각막이식의 콜라겐 네트워크는 숙주로부터 구조체로 세포의 이동을 용이하게 한다. 단일클론의 항-콜라겐 타입 I 항체로 염색을 통하여 조사했을 때, 콜라겐 섬유질은 PHEMA-PMMA 이식의 기공 내에 형성되어 있는 것을 나타냈다. 죽은 세포(에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1)) 대비하여 살아있는 세포(칼세인-AM(calcein-AM) 염색)를 식별하기 위하여 염색하였을 때, 봉합가능한 혼성체 인공각막이식으로 세포 이동은 명백한 증거이다.
다른 중합체와 비교하여 PHEMA-PMMA 공중합체의 인장 강도를 조사하기 위하여 실험을 수행하였다. 모든 물질을 수화(hydrated) 상태에서 테스트하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PHEMA-PMMA 중합체의 인장 강도는 PEGDA 중합체보다 2 배 강도 큰 인장 강도를 가진다. 물질 강도에 관하여 상기 발견에 기반하여, PEGDA 중합체(MW 10K - MW 700)는 성공적으로 봉합할 수 없는 세포 내증식 수용하기 위한 다공성을 만들 수 있는 부드러운 물질이다. PHEMA-EGDA 공중합체는 PEGDA보다 더욱 기계적으로 안정적이나, 또한 적절성(suturability)을 위한 내구력(strength)이 부족하다; 상기 물질은 구부릴 수 있고 파열 없이 늘일 수 있다. 반대로, PHEMA-PMMA 공중합체는 보통 내지 중간(moderate-to-mildly)의 강력한 인장하에서 온전성을 유지하고, 또한 바늘 삽입 및 후속의 힘의 적용에 따른 파열을 견딘다. 따라서, 본 발명의 PHEMA-PMMA 공중합체는 안정적 숙주 통합을 할 수 있는 봉합가능한 인공각막이식을 제공한다.
따라서, 본 발명의 구조체에 박아 넣어진 콜라겐 타입 I 네트워크를 갖는 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체는 매우 개선된 인공 각막 (인공각막이식)을 나타냈다. 본 발명은 기존의 인공 각막, 예를 들면, 보철의 봉합을 허가하는 세포 이동/숙주 통합 및 구조적/기계적 안정성에 의해 만나지 않는 두 가지 주요 기준을 만족한다. 데이타는 본 발명의 혼성체 인공각막이식이 세포 내증식을 촉진하고 봉합 및 이식을 위해 필요한 인장 강도(tensile strength)를 또한 나타냈다. 그 결과로서, 본 발명은 전체 두께 각막 대체 수술을 지지할 수 있는 신규한 인공각막이식을 제공한다. 따라서, 본 발명은 초다공성 수화젤의 기공으로 콜라겐 및 세포가 혼합된 콜라겐 및 세포로 구성된 혼성체 골격과 이를 생성하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 초다공성 수화젤 메트릭스는 약 100 nm 및 약 300 ㎛ 사이의 평균 지름 크기의 내부 연결된 다수의 대기공(macropores)의 존재에 기인한 상당한 물의 양을 흡수하는 능력이 있는 반고체 3차원 구조를 나타낸다. 초다공성 수화젤은 본 명세서에서 개시된 것처럼, 예를 들면, 동시 중합을 위해 최적화된 거품 반응, 또는 당업계에서 알려진 임의 다른 적절한 방법으로 생성될 수 있다. 숙련된 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 대기공의 크기는, 예를 들면, 용매의 성질 또는 젤이 형성되는 용매 및/또는 중합 개시제 또는 촉매제의 양을 포함하는 다수의 요인에 의존할 수 있다.
"초다공성(Superporous)" 은 물질의 섭취로서의 범위에서 메트릭스가 용액에서 팽창은 확산보다는 모세관 현상에 기반한다는 의미로 의도되고(Gemeinhart, et al. (2000) J. Biomater . Sci . Polym . Ed . 11(12):1371-80; Gemeinhart, et al. (2001) J. Biomed . Mater . Res . 55(1):54-62), 즉석 초다공성 수화젤은 골격 메트릭스의 기공 내에, 세포 및 단백질과 같은 다양한 녹기쉬운 물질과 빠르게 혼합할 수 있다. 초다공성 수화젤을 물 또는 다른 생물학적 유동체에 두었을 때 용해없이, 팽창하는 중합체로 구성되어 있다. 수화젤은 일반적으로 많은 양의 유동체를 흡수할 수 있고, 평형상태에서 통상적으로 60 -90% 유동체 및 단지 10-30% 중합체로 구성되어 있다. 수화젤은 교차결합된 중합체 네트워크의 고유 생체적합성 때문에 특히 유용하다(Hill-West, et al. (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:5967-5971). 수화젤 생체적합성은 친수성 및 생물학적 유동체의 많은 양을 흡입하는 능력에 기여할 수 있다(Brannon-Peppas. 제조 and Characterization of Cross - linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology, Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Amsterdam, pp 45-66; Peppas and Mikos. 제조 방법s and 구조 of 수화젤 s in 수화젤 s in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, FL, pp 1-27). 또한, 수화젤은 자연에 생존하는 세포외 메트릭스를 밀접하게 닮았다(Ratner and Hoffman. Synthetic 수화젤 s for Biomedical Applications in 수화젤 s for Medical and Related Applications, Andrade, Ed. 1976, American 화학 Society: Washington, DC, pp 1-36).
본 발명의 수화젤 메트릭스는 합성으로 생성되고 친수성이나 필수적으로 물에 녹지 않는 친수성 중합체로 구성되어 있다. 본 발명의 연습에서 사용될 수 있는 합성 친수성 중합체의 예로는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol (PEG)); 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene); 폴리메틸렌글리콜(polymethylene glycol); 폴리트리메틸렌글리콜(polytrimethylene glycols); 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidones); 폴리(이크릴산)(poly(acrylic acid)); 폴리(이타콘산)(poly(itaconic acid)); 폴리(메타크릴산)(poly(methacrylic acid)); 폴리(하니드록시프로필아크릴아미드)(poly(hydroxypropyl acrylamide) (HPMA)); 폴리글루타메이트(polyglutamate), 폴리리신(polylysine), 폴리아스파르테이트(polyaspartate), 폴리세린(polyserine), 폴리쓰레오닌(polythreonine), 폴리시스테인(polycysteine)과 같은 폴리(펩티드)(poly(peptides)); 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 중합체(polyoxyethylene-polyoxypropylene block polymers); 및 공중합체(coplolymer), 및 이의 유도체 및 혼합물이 있다. 아가로즈(agarose), 키토산(chitosan), 및 알기네이트(alginate)와 같은 자연 해양 생중합체가 본 발명에 의해 받아들여진 반면에, 일부 실시형태에서, 친수성 메트릭스는 단백질, 스타치(starch), 셀루로오스, 헤파린(heparin), 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 자연적으로 일어나는 중합체가 아니다. 바람직한 실시형태에서, 수화젤 메트릭스는 폴리(메타크릴산)(poly(methacrylic acid)) 중합체이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 폴리(메타크릴산)중합체는 PHEMA-PMMA 공중합체이다.
비록 다른 합성 친수성 중합체와 선택된 생중합체가 본 발명의 친수성 메트릭스를 형성하는 연결(connection)에 사용될 수 있지만, 중합체는 용해를 방지하기 위하여 물리적 또는 화학적으로 가교된 생체적합적이고 친수성이어야만 한다. 특히 적절한 중합체는 독성, 항원성(antigenicity), 면역원성(immunogenicity)이 부족하기 때문에 생물학적으로 활성 분자의 변형에 광범위하게 사용된 것을 포함하고; 넓은 범위의 용해도를 가지고; 일반적으로 비생분해성이고 인간을 포함한 대부분의 살아있는 생물체로부터 쉽게 배출된다.
폴리(에틸렌글리콜)디아크릴레이트(PEGDA) 및 폴리(메타크릴산)(poly(methacrylic acid))수화젤은 많은 생물의학 적용에 넓게 받아들여졌다(Peppas, et al. (1999) J. Controlled Release 62:81-87). 상기 수화젤은 친수성, 생체적합성, 비독성이고 대분할구(macromer) 길이에 따른 다양한 메쉬(mesh0크기를 나타낸다. 본 명세서의 예로써, PEGDA 및 폴리(메타크릴산)으로부터 생성되는 초다공성 수화젤은 세포에 독성이 없고 가스 거품 생성 방법을 사용하여 쉽게 생성될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 수화젤은 생체 내 이상적 투명을 이들에게 표현하여 시력적으로 께끗하다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태는 PHEMA 및 PMMA와 같은 PEGDA 또는 폴리(메타크릴산)중합체로 생성된 초다공성 수화젤을 포용한다.
본 발명의 초다공성 수화젤은 메트릭스가 결합된 후에 가교할 수 있는 소듐알지네이트(sodium alginate), 펙틴(pectin), 키토산 또는 (폴리비닐)알코올과 같은 가교된 친수성제(hydrophilic agent)를 결합시켜 높은 기계적 강도를 소유하도록 추가적으로 변형될 수 있다(Omidian, et al. (2006) Macromol. Biosci. 6:703-10). 또한, 수화젤은 PLA, PLGA 또는 PGA 중합체를 결합시켜 생체 내 분해로 만들 수 있다. 추가적으로, 초다공성 수화젤은 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 또는 예를 들면, 세포 부착 및 증식을 촉진시킬 수 있는 표면 변형을 위한 RGD로 변형될 수 있다(Heungsoo Shin (2003) Biomaterials 24:4353-4364; Hwang, et al. (2006) Tissue Eng . 12:2695-706). 실제로, 분자 중량 변화, 차단구조, 분해성 연결장치, 및 교차모드는 강도, 탄력성,및 즉석 수화젤의 분해성 성질에 영향을 줄 수 있다(Nguyen & West (2002) Biomaterials 23(22):4307-14; Ifkovits & Burkick (2007) 조직 Eng . 13(10):2369-2385).
초다공성 수화젤은 다양한 단백질(예: 콜라겐) 또는 치료제와 같은 화합물을 공유결합으로 부착하기 위한 기능적 기(functional groups)로 또한 변형될 수 있다. 메트릭스와 연결될 수 있는 치료제는 진통제(analgesics), 미취제(anesthetics), 항진균제(antifungals), 항생제(antibiotics), 항염증제(anti-inflammatories), 구충제(anthelmintics), 해독제(antidotes), 제토제(antiemetics), 항히스타민제(antihistamines), 혈압강하제(antihypertensives), 항말라리아제(antimalarials), 항균제(antimicrobials), 항정신병제(antipsychotics), 해열제(antipyretics), 방부제(antiseptics), 항관절염제(antiarthritics), 항결핵성제(antituberculotics), 진해제(antitussives), 항바이러스제(antivirals), 심장약물(cardioactive drugs), 설사제(cathartics), 화학요법제(chemotherapeutic agents), 착색 또는 형광 화상제(a colored or fluorescent imaging agent), 코르티코이드(corticoids)(예: 스테로이드(steroid)), 항우울제(antidepressants), 억제제(depressants), 진단보조(diagnostic aids), 이뇨제(diuretics), 효소(enzymes), 거담제(expectorants), 호르몬(hormones), 최면제(hypnotics), 미네랄(minerals), 영양보조제(nutritional supplements), 부교감신경흥분제(parasympathomimetics), 칼륨 보조제(potassium supplements), 방사선 민감제(radiation sensitizers), 방사선 동위원소(a radioisotope), 진정제(sedatives), 설폰아미드(sulfonamides), 자극제(stimulants), 교감신경성약(sympathomimetics), 신경안정제(tranquilizers), 비뇨 항감염제(urinary anti-infectives), 혈관수축신경제(vasoconstrictors), 혈관확장 신경제(vasodilators), 비타민제(vitamins), 크산틴 유도체(xanthine derivatives) 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 또한 치료제는 다른 작은 유기 분자, 자연적으로 분리된 독립체(entities) 또는 이의 유사체, 유기금속제(organometallic agents), 킬레이트된 금속(chelated matals) 또는 금속 염(metal salts), 펩티드 기반 약물, 또는 비-펩티드 수용체 표적 또는 결합제일 수 있다. 상기 메트릭스에 치료제의 연결은 단백질 분해효소(protease) 민감 링커 또는 다른 생분해성 연결장치를 경유하여 될 수 있다는 것이 고려되었다.
기능적 기에 추가적으로, 즉석 수화젤의 중합체는 처리된 대상으로부터 메트릭스 중합체의 제거를 용이하게 하는 조절된 생분해성을 위한 수단을 또한 포함한다. 예를 들면, 수화젤은 변형에 의해 빠른 비율로 생분해 되도록 할 수 있다(Sawhney, et al. (1994) J. Biomed . Mater . Res . 28:831-838). 수화젤은 생분해성 가교제 결합에 의해서 또는 생분해성 공중합체 활용에 의해서 생분해성이 될 수 있다(Sawhney, et al. (1993) Macromolecules 26:581-587; Park, et al. Bioderadable Hydrogels for Drug Delivery. 1993, Lancaster, PA: Technomic Pub. ix, 252; Watanabe, et al. (2002) Biomaterials 23:4041-4048; Yamini, et al. (1997) J. Macromol . Sci . A34:2461-2470). 예를 들면, 공중합체를 차단하고, 특별히 플라스민(plasmin) 또는 거친 콜라게네이즈(crude collagenases)에 의하여 분해되는 텔레킬릭(telechelic) 생분해성은 가교된 수화젤에서 사용되어 왔다(West, et al. (1999) Macromolecules, 32:241-244). 연장 및 비율 또는 분해는 이식부위에서 메트릭스의 제한되는 축적에 사용된 특정 분해 기전에 의해 조절된다.
지적된 바와 같이, 본 발명의 수화젤은 가스 거품 생성 방법에 의해 생성될수 있고, 여기서, 수화젤 전구용액은 제조되고 거품제는 거품을 생성하기 위해 첨가되는데, 거품은 분산된 다수의 대기공(macropores)을 갖는 메트릭스를 형성하기 위해서 젤화하거나 또는 중합한다. 전구 용액은 초다공성 수화젤 구조를 생성하기 위해 조합되지만, 거품형성과 수화젤의 젤 또는 중합을 용이하게 하는 거품제가 부족한 성분의 혼합물로서 정의된다. 본 발명의 전구용액은 친수성 중합체(a hydrophilic polymer), 개시제(an initiator), 및 거품 안정제를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 적절한 친수성 중합체를 본 명세서에서 개시한다. 적절한 개시제(initiator)는 예를 들면, APS/TEMED를 포함하고, 적절한 거품 안정제는 PLURONIC F-127과 같은 차단 공중합체가 될 수 있다. 거품제는 화학적 또는 물리적 거품제가 될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 거품제는 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate)와 같은 염(salt)이다. 다른 실시형태에서 상기 거품제는 가스, 예를 들면, 압축공기(compressed air) 또는 질소이다. 가스 거품 방법에서 다른 거품제의 사용은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 초다공성 수화젤 생성 방법에 따라서, 초다공성 수화젤 메트릭스는 탈수된다. 상기 수화젤 메트릭스는 임의 적절한 화학적 및/또는 물리적 수단에 의하여 탈수될 수 있다. 예를 들면, 탈수는 알코올 혼합(예: 에탄올) 및 건조제(dehydrator)를 사용하여 얻을 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 형성하기 위하여 메틸메타크릴레이트(MMA), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate(PETA)), 및 디메틸포름아미드(DMF) 용액에서 혼합을 포함하는 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 생성하는 방법이고, 여기서, DMF는 젤 용액으로 MMA 및 HEMA의 용해를 촉진하고 PETA는 PHEMA-PMMA 공중합체의 가교를 촉진한다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 10% v/v의 MMA, 45% v/v HEMA, 5 mg PETA, 2 mg 암모늄펄설페이트(ammonium persulfate), 10 ㎕ N,N, N', N'-테트라메틸에틸렌디아민(N,N, N', N'-tetramethylethylenediamine(TEMED)), 6% v/v DMF, 및 22% 탈이온수 혼합을 포함한다.
거기에 박아 넣어진 세포가 있거나 또는 없이 관심 분자(예: 콜라겐)를 결합시키기 위하여, 상기 수화젤 메트릭스는 세포가 있거나 또는 없는 관심 분자를 포함하는 용액에서 재팽창되거나 재탈수된다. 초다공성 수화젤 메트릭스의 기공으로 결합될수 분자는 비타민(vitamins) 및 다른 영양 보충제(nutritional supplements); 글리코단벡질(glycoproteins (예: 콜라겐); 파이브로넥틴(fibronectin); 펩티드(peptides) 및 단백질; 탄수화물(carbohydrates)(모두 단순 및/또는 복합체); 프로테오글리칸(proteoglycans); 항원(antigens); 올리고핵산염(oligonucleotides)(센스 및/또는 안티센스 DNA 및/또는 RNA); 항체(예를 들면, 감염제, 종양, 약물 또는 호르몬으로); 및 유전자 치료제를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 확실한 실시형태에서, 상기 관심분자는 콜라겐이다. 특정 실시형태에서, 상기 콜라겐은 타입 I 콜라겐이다. 바람직하게, 상기 관심분자는 생물학적으로 호환되는 용액, 예를 들면, 생체 내에서 비독성인 용액이다. 적절한 용액은 물, 식염수(saline), 버퍼 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
타입 I 콜라겐은 신체의 가장 풍부한 콜라겐이다. 콜라겐은 상처조직, 힘줄(tendons), 및 골의 유기 부분에 존재한다. 타입 II 콜라겐은 관절연골(articular cartilage)의 성분이고 타입 IX 콜라겐과 결합에서 발견되며, 반면에 타입 III 콜라겐은 육아조직(granulation tissue)의 콜라겐이고, 거친 타입 I 콜라겐이 합성되기 전에 젊은 섬유아세포(young fibroblasts)에 의해 빠르게 생성된다. 타입 XII 콜라겐은 타입 I 및 III 콜라겐과 상호작용으로 발견된다. 타입 IV 콜라겐은 기저 라미나(basal lamina)의 부분이다. 타입 V 및 타입 VI 콜라겐은 대부분 세포간 조직(interstitial tissue)의 성분이고 타입 I 콜라겐과 연관되어 있다. 타입 VII 콜라겐은 타입 VIII 콜라겐과 마찬가지로 상피(epithelia)의 성분이다. 타입 X 콜라겐은 비대성(hypertrophic)이고 광물화 연골의 부분이며, 반면에 타입 XI 콜라겐은 연골의 성분이다. 따라서, 이식 부위 및 의도된 치료 결과에 의존하여 하나 이상의 콜라겐은 초다공성 수화젤 메트릭스의 기공으로 결합할 수 있다. 콜라겐은 산(예: 비트로젠(Vitrogen); ANGIOTECH® Biomaterials, Palo Alto, CA)에 녹은 펩신(pepsin)-용해된 콜라겐으로서 용액에서 얻어질 수 있다. 상기 콜라겐은 중화(예: NaOH로 pH 7.0 내지 pH 7.4로)될 수 있고 직접적으로 초다공성 수화젤 메트릭스로 결합될 수 있거나 관심세포와 혼합되고 초다공성 수화젤 메트릭스로 결합될 수 있다. 상기 콜라겐은 거기에 현탁된 세포와 함께 원섬유형성(fibrillogenesis)(예: CO2 존재 또는 부재에서 24℃ 내지 37℃에서)을 경유하여 고형화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 타입 I 콜라겐은 본 발명의 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤의 기공으로 혼합된다. 상기는 콜라겐을 냉각된 PHEMA-PMMA 수화젤 용액(약 2-8℃)으로 첨가하여 완성되고, 여기서, 상기 용액은 콜라겐 흡수 과정에 걸쳐서 냉각되도록 남는다. 일단 상기 콜라겐이 PHEMA-PMMA 용액으로 혼합되면, 콜라겐 용액은 세포 배양기에서 1 시간 동안 37℃에서 배양된다. 얻어진 생성물은 봉합가능한 혼성체 임플란트 또는 봉합가능한 혼성체 인공각막이식이다.
세포가 즉석 초다공성 수화젤로 혼합되기를 원할 때, 상기 세포는 용액이 수화젤을 재팽창 또는 재수화에 사용되기 전 또는 후에 관심 분자를 포함한 용액과 결합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 수화젤이 재챙창하기 전에 용액으로 첨가될 수 있다. 본 발명에서 특히 서용한 세포 타입은 줄기 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 내피(endothelial) 세포, 중간엽(중간엽) 세포, 인슐린-생성 췌도(insulin-producing islet)세포, 간세포(hepatocytes), 근육세포(myocytes), 신경세포(neurons), 연골세포(chondrocytes), 피부세포, 골수(bone marrow) 세포, 등을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 세포는 즉석 혼성체 초다공성 수화젤을 받는 대상의 관점에서 자연발생(autogenic), 동종이계(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 일 수 있다. 세포는 생체검사 샘플로부터 분리되거나 또는 종래의 방법을 사용하여 줄기 세포의 분화 및 확장에 의해 발생될 수 있다. 수화젤 메트릭스의 기공으로 혼합된 것에 추가적으로, 일부 실시형태는 예를 들면, 중화전에 수화젤 전구 용액으로 세포를 첨가하여, 수화젤 자체내의 세포의 피막형성(encapsulation)을 포괄한다. 수화젤 메트릭스 및 수화젤 기공 내에 피막형성된 세포는 같거나 다를 수 있다. 예를 들면, 상기는 수화젤 메트릭스에서 줄기 세포를 피막형성할 수 있고 기공 등에서 성장 또는 분화 요소를 생성할 수 있는 세포를 피막형성할 수 있다.
혼성체 초다공성 수화젤의 기공으로 혼합된 세포에 추가적으로, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 세포 타입을 갖는 혼성체 초다공성 수화젤 메트릭스의 하나 이상의 표면을 코팅하는 것을 받아들인다. 특히, 본 발명은 콜라겐 층을 경유하여 혼성체 수화젤 메트릭스의 표면에 상피세포를 붙이는 것을 받아들인다. 추가적으로, 본 발명은 하나 이상의 시력적으로 뚜렷한 대분할구(macromers)로 가득한 혼성체 수화젤에서 중심 동공의 포함을 받아들인다. 본 발명의 목적을 위하여, 대분할구(macromer)는 200 nm 내지 1000 nm의 파장 범위에서 빛을 전송시켰을때 시력적으로 뚜렷하고 1 이상의 반사지수(reflective index), 더욱 바람직하게는 1.3 이상의 반사지수를 가진다. 적절한 대분할구는 예를 들면, 본 명세서에 개시된 친수성 중합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 시력적으로 뚜렷한 대분할구는 PEGDA이다.
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 성분 및 제작방법은 세포에 비독성이고 초다공성 수화젤의 기공 내에 세포의 혼합을 가능하게 한다. 상기 수화젤은 신체 기관의 다치거나 손상된 기능적 대체에서 유지 및 성장하는 세포를 위해서 생물학적 골격으로서 적용을 찾는다. 특정 실시형태에서, 즉석 혼성체 초다공성 수화젤은 의학 적용에 사용을 위하여 다양하게 형성된 이식의 제조에서 사용된다. 장점으로, 상기 초다공성 수화젤은 재생을 용이하게 하기 위하여 손상되거나 다친 부위에 세포를 제공하도록 디자인된다. 따라서, 즉석 조성물은 대상에게 국부적인 세포운반을 제공하는 것이 유용하다. 상기 운반은 예를 들면, 조직 재생 또는 대체에서 상처치유(wound healing)를 촉진하도록 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 수화젤은 모델 기관 시스템으로서, 또는 세포 팽창에서 사용을 위하여, 약물 테스트를 위한 조직 공학기술 또는 재생 의학에 사용된다,
본 발명의 특정 실시형태에서, 상기 즉석 혼성체 초다공성 수화젤은 인공 각막의 제조에서 사용된다. 이러한 관점에서, 특정 실시형태는 초다공성 수화젤의 기공으로 콜라겐 및 각막 섬유아세포의 혼합을 받아들인다.
적용에 따라, 본 발명의 초다공성 수화젤은 약학적 조성물에서 독립 또는 약학적으로 허용가능한 담체의 혼합물에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용을 위한 적절한 제제(formulations)는 레밍턴(Remington)에서 발견되었다: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. 담체의 예로는 예를 들면, 물, 식염수(saline), 버퍼 등을 포함한다. 상기 조성물은 pH 조정 및 완충화제(buffering agents), 긴장성 조절제(tonicity adjusting agents), 습윤제(wetting agents), 세척제(detergent) 등과 같은 대략적 생리학적 조건에 요구되기 때문에 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예를 들면, 운반되고자 하는 세포의 부위와 치료되는 질환 또는 증상에 따라서 국소, 피하이식(subcutaneous implantation) 또는 근육 내 이식을 포함하는, 투여의 임의 적당한 방식을 위하여 제제화될 수 있다.
혼성체 초다공성 골격을 생성하는 본 발명의 방법은 간단하고, 값싸고, 다목적이다. 따라서, 이것은 근육 및 부드러운 조직 적용을 포함하는 많은 조직 공학 적용에 응용될 수 있다. 예를 들면, 각막 재생에 추가적으로, 혼성체 초다공성 수소(hydrogen)는 골 조직 공학에 사용될 수 있다. 실제로, 많은 변형이 특정 조직을 위하여 그것에 맞추기 위해서 개시된 수화젤에 만들어질 수 있다. 가수분해 연결장치(hydrolytic linkages)는 시간이 흐르면서 생긴 생성물에 의한 분해할 수 있고 비독성을 제조하기 위해서 SPH 내에 혼합될 수 있다. 약물 또는 분자는 조절된 방출 상황을 위하여 SPH 내에 로드(load)될 수 있다. 천연 및 합성 물질 모두는 특별히 원하는 성질을 생성하기 위하여 변경될 수 있다. 예를 들면, PEGDA-기반 중합체는 봉합을 포함하여 인장력(tensile forces)을 견뎌낼 수 없다. 그러나, 본 발명의 PHEMA-PMMA 공중합체는 봉합을 위한 충분한 인장력을 소유한다. 따라서, 기술을 가진 자는 원하는 성질에 기반한 본 발명의 초다공성 수화젤을 선택할 것이다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 아주 상세히 설명한다.
실시예
1: 물질 및 방법
세포배양. 2 가지 세포 타입, 줄기 세포 및 수임세포(committed cell)를 분석하였다. 인간 중간엽 줄기 세포(MSCs)를 15% 소태아혈청(FBS), 1% L-글루타민, 및 1% 항생제를 포함하는 깁코의 α-최소필수배지(Gibco's α-Minimal Essential Medium)(L-글루타민 첨가, 리보뉴클레오시드(ribonucleosides) 미첨가, 데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleosides) 미첨가)에서 유지하였다. HT-1080 인간 섬유육종(섬유육종) 세포주를 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입하였다. 섬유아세포를 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 항생제/항진균제가 보충된 둘베스코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))에 담궜다. 폐기물을 제거하고 신선한 영양소를 공급하기 위해서 배지를 2 내지 3일 마다 바꾸어 주었다. 세포를 5% CO2 및 95% 공기 존재하에서 37℃에서 유지하였다. 세포를 75-80% 융합(confluent)의 단층이 형성될 때까지 조직 배양 플라스크에서 3x103 세포s/cm2 의 밀도에서 분주하였다. 세포를 0.25 ㎎/㎖ 트립신으로 5 분 동안 배양하여 계대(passages)하였고 상기 밀도로 재분주 하였다. 본 실험에서 사용된 모든 세포는 3 과 6 계대 사이에 있다. 본 명세서에서 서술된 상기 방법은 다른 세포타입으로 연장될 수 있다. 세포를 이식 전에 골격으로 로드(load)하거나 이식 후 골격으로 이동되도록 조장할 수 있다.
콜라겐 젤 제조. 래트 꼬리 콜라겐 타입 I(BD Biosciences, San Diego, CA)를 0.1 N NaOH, 10X 행크스 발란스드 설트(Hank's Balanced Salt 용액(HBSS)), 및 3:2:1:1의 부피 비율에서 0.1 N 아세트산과 혼합하였다. 상기를 1 mg/㎖의 농도에서 중성 pH 콜라겐 용액을 제조하였다. 만약 세포 분주(seeding)를 원한다면, 세포를 3-D 네트워크에서 둘러싸도록 하기 위해서 1 백만 세포/㎖의 농도에서 콜라겐 용액에서 현탁한다. 상기 용액에서 흠뻑 젖은 탈수된 SPH를 기공 내에서 세포 및 콜라겐의 섭취를 하게 한다. 콜라겐 젤형성을 30 분 동안 37℃에서 가온하여 시작하였다. 만약 세포로 분주ㅈ저전처리(pre-seeding)를 원하지 않는다면, SPH를 세포없이 콜라겐 용액에 적신다. 다시 젤형성을 30 분 동안 37℃에서 가온하여 발생시킨다.
초다공성 PEGDA 수화젤 제작. 20% (w/v) PEGDA 용액(500 ㎕)을 하기 시약과 혼합하였다: 10% PLURONIC PF-127의 60 ㎕, 20% TEMED (tetramethylethylenediamine)의 30 ㎕, 아크릴산의 20 ㎕ 및 APS (ammonium persulfate)의 23 ㎕. 최종농도를 탈이온수 첨가를 경유하여 1 ㎖로 조정하였다. 상기 용액을 37℃에서 2 분 동안 가열하였다. 후속으로, 200 mg의 소듐바이오카보네이트(sodium bicarbonate)를 다공성 구조를 초래하는 거품생성 반응을 만드는 용액에서 혼합하였다. 소듐바이오카보네이트의 양은 기공 설계에서 차이를 만드는 100 내지 300 mg으로 다양할 수 있다. SPHs를 반응하지 않은 소듐바이오카보네이트 결정체(crystals)를 제거하기 위하여 물에 린스하였다. 기공의 붕괴를 방지하기 위하여, 골격을 에탄올을 밤새처리하여 탈수화하였다. 골격을 45 분 동안 식품 탈수기(food dehydrator)에서 추가적으로 탈수화하였다. 잘린 면을 멸균하기 위하여, 20분 동안 UV 광선하에서 배치하였다.
초다공성 PHEMA - PMMA 수화젤 공중합체 제작. 다공성 PHEMA-PMMA 공중합체를 제조하기 위해 사용된 젤 용액은 하기를 포함한다: 10% v/v 메틸메타크릴레이트(methyl methacrylate(MMA) (Aldrich M55909)), 45% v/v 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate(HEMA) (Aldrich 525464)), 5 mg 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate (PETA)), 2 mg APS, 10 mL TEMED, 6% v/v 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 및 22% 탈이온수. 츄잉검에 비유되는 점착성이 얻어질 때까지 젤을 혼합하였다. 다음, 젤을 몰드로 삽입하였다. 생성물을 24시간 동안 건열로 37℃에서 중합시켰다. 하기의 중합화에서, 젤을 1 주일까지 탈이온수에서 린스하였다. 장기간 저장을 위하여, 물로 린스된 젤을 하루 동안 건열로 37℃에서 건조시켰다.
기공 형성. 다공성 PHEMA 골격을 제조하기 위하여 PHEMA 스폰지(US 5,458,819)를 개발하여 왔다. 용해된 단량체(단량체)로서 단계(phase) 분리로부터 초래된 다공성 PHEMA 스폰지는 중합체가 되고 용액에서 빠졌다. PHEMA-PMMA 구조체를 위하여, 디메틸포름아미드(dimethylformamide (DMF)) 및 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate)를 MMA 및 HEMA 단량체의 혼합에 첨가했다. DMF는 PHEMA-PMMA 중합체를 용해를 용이하게 하는데 중요한 과정임을 발견하였다. DMF의 잘못된 사용은 기공의 파괴를 유도한다. 가교제로서 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트의 사용은 원하는 기계적 성질을 갖는 PHEMA-PMMA 가교를 허용하는 것에서 유일하다. 중합화가 발생하는 동안에 교반은 큰 기공의 형성을 유도하는 다른 핵심 스텝이었다. 젤-같은 용액은 당밀(molasses)에 비유되는 점착성을 발달시키고 각막의 굴곡을 흉내내는 콘택트 렌즈-형태 몰드(contact lens-shaped mold)로 배치될 수 있도록 충분히 유연하다.
혼성체 봉합가능한 임플란트의 제조. 다공성 PHEMA-PMMA에서 내부-관통 콜라겐 네트워크를 형성하는 과정은 수 용액에서 PHEMA-PMMA의 느린 팽창 때문에 36 시간까지 걸릴 수 있다. 첫째로, 중합체 구조체를 30 분 동안에 자외선하에서 멸균하였다. BD 바이오사이언스 프로토콜에 따라서 래트 콜라겐 타입 I(BD Bioscience)을 사용하여 콜라겐 젤 (1-5 ㎎/㎖)을 만들 수 있다. 인간 콜라겐은 쉽게 혼합되고 1-5 mg/㎖의 농도의 콜라겐은 세포 분주 및 부착을 지지하는 것을 나타냈다. 콜라겐 젤 용액을 냉각되고 탈수된 PHEMA-PMMA에 첨가하였다. 냉각온도를 유지하기 위하여 시료 및 얼음 팩을 덮었다. PHEMA-PMMA 시료는 콜라겐 흡수 과정 전반에 걸쳐, 약 2-8 ℃로 냉각을 유지해야만 한다. PHEMA-PMMA가 콜라겐 용액에서 완전히 팽창한 후에, 콜라겐 젤을 제조하기 위하여, 현재 봉합가능한 혼성체 임플란트로 언급된 구조체를 세포배양기에서 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다.
기공 설계 및 팽창 측정. 주사전자현미경(scanning electron microscope)을 SPH의 기공 설계를 사진찍는데 사용하였다. 다양한 양의 소듐바이오카보네이트로 만들어진 SPH를 이미지화 하였다. 큰 부피로의 빠른 팽창은 상기 적용을 위한 중요한 특성이다. 팽창 비율, Q를 팽창된 SPH 질량을 탈수화된 SPH의 질량과 비교하여 결정하였다. 다양한 기공크기의 탈수화된 구조체를 저어고 20분 동안 물에 담구었다. 모든 SPH를 공기거품(bubble)을 제거하기 위하여 3 분 동안 1000 rpm에서 원심분리 하였다. SPH를 체(sieve)로 긴장시켜서 초과의 물을 제거하고 무게를 쟀다. 상기 질량은 자체의 수화젤 구조에서뿐만 아니라 기공에서도 축적된 물을 나타낸다. 후속적으로, 수화젤 구조에서 물을 유지하나 기공에서 물을 제거하기 위하여 SPH를 부드럽게 짜고 블랏(blotted)하였다. 팽창된 무게를 초기 무게로 나누어, 두 가지 팽창 비율, Q총 물 & Q수화젤 물을 얻었다.
Q총 물 = 무게총 물/무게탈수됨
Q수화젤 물 = 무게수화젤 물/무게탈수됨
세포 염색. 콜라겐 없는 SPH 구조체를 3-D 섬유아세포 골격으로서 사용하였다. 세포를 상기에서 설명한 바와 같이 로드하였고 24 및 48 시간 동안 배양하였다. 세포 부착 및 유지를 시각화하기 위하여 초점 접착키트(focal adhesion kit)(Chemicon, Temecula, CA)를 사용하였다. 로다민 팔로딘(Rhodamine phalloidin)은 미세섬유(microfilaments)를 붉은색으로 염색하고 DAPI는 핵을 푸른색으로 염색하였다. 라이브/데드 생존율 키트(live/dead viability kit)(Molecular Probes, Eugene, OR)를 사멸된(붉은색)에 대비하여 살아있는(녹색) 세포를 나타내기 위하여 사용하였다. BIO-RAD 동일초점 현미경(confocal microscope)을 각각의 상기 구조를 이미지하기 위하여 사용하였다.
세포 이동. 세포로 분주 전처리를 원하지 않는 경우에, 혼성체 골격은 골격으로 세포 이동에 바람직한지 여부를 결정하게 된다. 콜라겐을 갖고 없는 무세포 내 SPH 골격을 세포의 단층 꼭대기에 놓았다. 골격으로의 세포이동을 3 주 이상 모니터하였다. 세포를 라이브/데드 생존율로 염색하고 동일초점 현미경으로 시각화하였다.
압축측정. SPH 골격의 압축(Compressive) 모듈을 압축 테스팅하여 결정하였다. 물이 부푼 SPHs를 (미끄럼을 방지하기 위하여)VELCRO로 선을 그은 2 조각의 유리 사이에 샌드위치하였고 콜라겐으로 부푼 SPHs와 비교하였다. 증가하는 무게를 꼭대기에 놓여졌고 각각의 SPH가 견딘 긴장(strain)의 양을 기록했다. 스트레스 대 긴장(strain) 곡선을 플롯하여 압축 모듈의 예상을 결정하였다.
중심 시력 수화젤 합성. 5% (w/v)의 PEGDA를 멸균 PBS에서 혼합하여 수화젤 용액을 제조하였다. 광개시제(photoinitiator), IGRACURE 2959 (CIBA, Tarrytown, NY)을 0.025% w/v의 최종농도를 위해서 PEGDA 용액에 첨가하였다. 세포 생존률을 광개시제, UV선 노출, 및 PEGDA 농도에 대한 응답으로 평가하였다. IGRACURE 2959은 포유동물 세포에 적어도 독성 광개시제였다. 0.03% (w/v) 이하의 농도를 최적으로 간주하였다(Williams, et al. (2005) Biomaterials 26(11):1211-8). UV 선(365 nm, 4 mW)에서 10분 동안 상기 용액을 놓아두는 것은 뚜렷한, 중합된 젤을 제조했다. 상기 젤을 신선한 PBS에 담가서 반응하지 않은 단량체 및 개시제를 제거하였다.
실시예
2: 팽창 비율
pH 중성화한 후에 콜라겐은 빠르게 젤화가 시작되기 때문에, SPH 전반에 걸쳐 균일한 분포를 용이하게 하게 하기 위해서 SPH로 즉시 업로드(upload)가 필요하다. SPH 제작 방법은 서로 연결된 매크로사이즈된(macrosized) 기공을 제조했기 때문에, 팽창이 1분 만에 일어난다. 콜라겐 용액에 SPH를 담그는 것은 모세관 형성으로 자연 물질이 기공으로 쉽고 빠르게 들어가게 한다. 따라서, 세포로 분주 전처리를 원하는 경우에, 세포를 섭취 바로 전에 콜라겐 용액에 현탁할 수 있다. 팽창을 서로 연결된 기공의 정도 및 크기에 의해 결정하였다. 및100, 200, and 300 mg의 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate)로 제조된 세 가지 SPHs에서 기공 구조의 SEM 분석은 2 가지 타입의 기공, 각각의 SPHs에서 크기 및 모양에서 비슷한 것처럼 보이는 큰 기공과 연결 경로를 형성하는 작은 기공을 드러냈다. 소듐바이카보네이트의 양을 증가시키는 것은 증가된 다수의 연결 기공을 초래했다. 상기는 기공 설계에서 차이는 팽창 비율에서 차이의 원인이 됨을 나타냈다. 팽창 비율, Q를 다양한 기공 크기의 SPH를 위하여 결정하였다(예: 100더 말은, 200 또는 300 mg 소듐바이카보네이트를 사용하여). 상기 분석은 더 많은 소듐바이카보네이트가 사용되면서 Q총 물 이 증가함을 나타냈다. 그러나, Q수화젤 물은 다른 기공 크기에 눈에 띄는 차이를 가지지 않았다. 상기는 소듐바이카보네이트의 양을 다르게 하는 것이 기공 구조를 변경시키지만, 각각의 SPH에서 수화젤 양은 동일하게 남아음을 나타냈다. 상기 현상은 수화젤 구조 자체 내에서 분자를 로드(load)하는 것이 바람직할 수 있는 적용을 위한 노트(note)에 중요하다. 추가적으로, 100 주위를 매도는 QTotal 물 은 SPH가 건조 무게에 약 100 배를 결합시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 세포 증식 또는 세포외 메트릭스(ECM) 생성물에 기인한 무게에 잇어서 증가한 임의 장기간은 장기간 안정성에게 장벽이어서는 안 된다.
SPH로 빠른 섭취는 세포손상을 발생시키지 않는다. 실제로, 세포 로딩 후 1일에 수행된 라이브/데드 생존율 염색은 MSC 세포가 살아있고 펼쳐져 있음을 알 수 있다. 칼세인 AM(Calcein AM)은 살아있는 세포의 세포 멤브린을 건너서 녹색으로 형광을 내고 반면에 에티듐 동종이합체(ethidium homodimer)은 단지 죽어있는 세포로 들어가서 붉은색을 형광시킨다. 최소 죽은 세포를 발견하였다. 상기 결과는 상기 방법이 외부 힘의 사용을 요구하지 않고 세포 생존을 절충하는 세포 로딩의 효과적이고 능률적 방법이었다.
좁은 범위의 작은 기공 크기가 골격 내의 3-D 세포 행동에 필수적임이 제시되어 왔던 반면에, 본 명세서의 결과는 SPH 혼성체 기술이 3-D 세포 부착 관점에서 기공 크기 또는 모양의 정확한 조절을 위한 필요를 제거하는 것을 나타낸다. 상기 즉석 방법은 비공유결합(covalent binding)에서 유일하고 골격물질 사이의 친밀한 접촉의 부재가 SPH를 지지하는 것으로부터 세포 내 미세환경을 분리시킨다. 콜라겐의 존재에도 불구하고 세포가 PEGDA와 접촉되었을 때, 세포는 펼쳐질 수 없다. 따라서, 2 가지 물질의 공간적(spatial) 및 일시적(temporal) 분리는 최적의 세포 행동을 위해 필요하다.
그러나, 기공 구조, 모양 및 크기의 SEM 이미지에서 증명된 바와 같이, SPH-콜라겐 젤에서 세포형태 및 부착의 관찰은 순수 3-D 콜라겐 이미지에 유사함을 나타냈다. 상기 이유로 인해, 세포가 SPH를 접촉하지 않기 때문에 SPH 기공 구조는 세포 행동에 있어서 요인이 아니다. 혼성체 메트릭스에서 세포는 콜라겐의(collagenous) 일부에 단지 묻혀있는 것으로 보인다. 기공이 균일한 분포 및 효과적 영양 및 낭비 확산을 확실히 하기 위해 서로 연결되어 있는 한, 즉석 혼성체 초다공성 수화젤은 자연 3-D 세포 미세환경을 제조하기 위한 다른 시스템의 엄중한 요구를 요구하지 않는다. 따라서, 본 발명의 혼성체 수화젤은 더욱 편리하고, 공학적으로 조작된 구조체에 의하여 부과되는 일치(uniformity)가 일반적으로 부족한 자연적으로 살아있는 시스템을 더 잘 흉내 낸다.
실시예
3: 부착 염색(
Adhesion
staining)
미리 분주된(preseeded) 골격에서, 콜라겐이 3-D 및 스트레스 섬유질 형성에서 섬유아세포 펄쳐짐(spreading)을 권장하는 것이 관찰되었다. 콜라겐 없는 골격은 골격에 부착할 수 없는 둥근(roun) 세포를 가두고 군집한다. PEGDA는 본질적으로 부착에 저항력이 있다. 따라서, 비-콜라겐의 골격에서 ECM 세포 결합부위의 부족은 둥근 형태(morphology)의 원인이 되는 것으로 추정된다. 48시간 후, 콜라겐 없는 골격은 완전히 무세포(acellular)였다. 부착하는 것이 아무것도 없는 세포는 골격으로 이동하고 조직 배양 플레이트 바닥에 부착하는 경향이 있다.
반대로, 콜라겐이 로드된 골격은 골격 내에서 세포 유지를 나타냈고 세포는 플레이트 바닥에 거의 부착하지 않았다. 수화젤 기공 내의 콜라겐은 3-D 방식으로 세포 펼쳐짐(spreading) 및 유지(retension)를 크게 증강시켰다. 미세섬유(microfilament) 스트레스 섬유질이 확실하게 관찰되었고, 이는 세포부착이 초점 부착의 형성을 유도하는, 콜라겐에서 활용가능한 인테그린 결합 부위에 의해 매개 되는 것을 나타낸다. 각막 섬유아세포는 콜라겐에 결합할 수 있는 다양한 β1 페밀리 인테그린을 표현하는 것으로 나타내어 왔다. 콜라겐 없는 골격에서, β1-인테그린은 세포 주위에 균일하게 분포되어 있다. 그러나, 콜라겐으로 채워진 골격에서, β1-인테그린은 초점부착 부위에서 끼어들고 군집화되었다. β1-인테그린에 대한 항체의 첨가는 콜라겐 상의 부착 및 펼쳐짐으로부터 세포를 방지하였다.
기공의 콜라겐에 박혀있을 때 세포 펼쳐짐 및 유지(retension)를 증가시키는 것에 추가적으로, 또한 상기 혼성체 골격은 개방 기공 구조 및 콜라겐 결합 덕분으로 골격으로 인근세포(surrounding cell) 이동을 증강시키는 것을 나타냈다. 콜라겐이 있고 없는 무세포 SPH 골격을 섬유아세포의 단층의 꼭대기에 놓았다. 3 주 이상, 콜라겐이 있는 골격으로 엄청난 세포 내 내증식이 관찰되었다. 콜라겐이 없는 골격은 무세포로 남아있다. 상기는 기공 단독이 세포 내 내증식(ingrowth)을 위해 충분하지 않고, 콜라겐의 혼합이 이상적 조직 공학기술로 된 골격으로서의 상기 골격을 크게 증강시킴을 나타냈다. 숙주세포가 골격으로 이동할 수 있고 인근조직으로 강한 결합을 형성할 수 있게 하기 위해서 좋은 세포 내증식은 생체 내 이식을 위해 필수적이다. 또한, 상기는 이식의 장기간 생존을 위해 필수적일 수 있는 신경 및 혈관 내증식을 위한 도관(conduit)이다.
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4: 기계적 측정
압축 모듈을 결정하기 위한 압축 테스트는 SPH가 비다공성 PEGDA 단독보다 현저히 더욱 압축인 것을 나타냈다. 콜라겐 없는 SPH를 위한 평균 압축 모듈은 1 kPa이었다. 비다공성 PEGDA와 비교하였을 때, SPH는 더 높은 압축 힘을 견딜 수 있는 것으로 관찰되었다. 상기는 이식이 높은 압축 힘에 투여되는 상황에서 중요할 수 있다. SPH에서 콜라겐의 첨가는 대량 계수(bulk modulus)상에 상당한 영향을 가지지 않는다. 따라서, 즉석 혼성체 수화젤은 단지 더욱 부드러운 콜라겐 미세환경에 노출되어 있기 때문에 묻혀있는 세포를 상기 조건으로 투여없이도, 종합적으로 높은 압축계수를 유지할 수 있다.
또한, 기계적 측정을 다공성 PHEMA-PMMA 혼성체 골격의 강도를 테스트하기 위해서 수행하였다. 탈수화된 다공성 PHEMA-PMMA 구조체를 주문 디자인된 테스팅 장치를 사용하여 장력(tension)을 테스트하였다(Test Resources, Shakopee, MN). 장력에서 75 g의 힘(0.735 N)을 위한 피로가 등급된(fatigue-rated) 로드 세포를 사용하여 시료를 테스트하였다. 적용된 힘은 교정무게(calibration weights)를 사용하여 교정하였다(Rice Lake Weighing System, Fisher Scientific). 힘의 측정을 벤도르'스 100LM 소프트웨어에 의해 관찰하였고 보고하였다. 1% 보다 적은 에러를 0.3 내지 0.735 N 범위에서 관찰하였다. 각각의 시료를 0.1 Hz의 긴장 비율(strain rate)에서 30 사이클을 테스트하였다. 5% 긴장은 전 조건(pre-condition) 시료에 사용되었다. 탄력 계수를 20% 긴장을 사용하여 계산하였다. 시료를 150% 까지의 긴장을 사용하여 파열(rupture)하기 위해서 측정하였다. 스트레스는 적용된 힘을 시료의 단면영역(cross sectional area)에 의한 테스팅 기계의 로드 생산으로 나누어 컴퓨터화하였다(스트레스=힘/영역(Stress = Force/Area)). 탄력 계수를 스트레스 대 긴장 곡선(stress vs. strain curve)의 직선 일부의 기울기 결정에 의해 평가하였다. 표준편차(Standard deviation)를 탄력 계수를 에러를 결정하는데 사용하였다.
PHEMA-PMMA의 추가적 분석을 수행하였고, 가스-거품생성된 PHEMA-PMMA의 기계적 성질을, 예를 들면, PHEMA-PMMA가 가스 거품생성제로서 소듐바이카보네이트로 생성되는 것과 같은 염 포로겐(salt porogen) PHEMA-PMMA과 비교하였다. 상기 분석 결과를 표1에 나타냈다.
| 성질 | 염 포로겐 PHEMA-PMMA |
가스-거품생성된 PHEMA-PMMA |
| 탄력 계수 (E, kPa) | 398±68 | 3557±536* |
| 최종 인장강도 (UTS, kPa) | 143±9 | 273±31* |
| 파열에서 긴장(Strain at Rupture) (%) | 84±15 | 113±29 |
긴장 비율 =0.2 mm/s
*T-테스트 당 통계상 유의 (α= 0.5).
가스-거품생성된 PHEMA-PMMA, 염 포로겐 PHEMA-PMMA 또는 PHEMA-PMMA로 구성된 스커트의 기계적 성질의 유사한 분석을 수행하였다. 상기 분석의 결과를 표 2 및 도 2에 나타냈다.
| 성질 | 염 포로겐 PHEMA-PMMA | 가스-거품생성된 PHEMA-PMMA |
PHEMA-PMMA |
| E (kPa) | 678±72 | 4081±808* | 299±10 |
| UTS (kPa) | 125±25 | 263±66 | 147±7 |
| 파열에서 긴장 (%) | 44±3 | 64±9 | 94±4 |
긴장 비율 =0.2 mm/s
*ANOVA 당 통계상 유의 (α= 0.5).
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5: 시력의 성질
인공 각막의 중심 시력은 뚜렷해야만 하고 적절한 반사지수를 가진다. 인공 각막의 중심 동공에서 PEGDA의 사용을 나타내기 위하여, 5% PEGDA의 양적 및 질적 분석을 수행하였다. 질적 분석을 위하여, 덮개 수화젤(overlying hydrogel)이 있거나 없이, 쓰여진 문자를 보았다. 중심 동공의 광선 전달 및 반사 지수와 같은 시력 성질을 각각 자외선-시각 분광 광도계(UV-Vis spectrophotometer) 및 굴절계(refractometer)를 사용하여 결정하였다. 광선 투과(light transmittance)의 퍼센트를 200 nm 내지 1000 nm 파징 범위에서 PBS와 관련하여 측정하였다. 모든 측정은 3회씩 하였다. 중심 시력의 반사 지수를 굴절계를 이용하여 측정하였다.
상기 분석 결과는 5% 수화젤이 중심 시력으로서 사용을 위한 우수한 시력의 성질을 산출함을 나타냈다. 예를 들면, 덮개 수화젤(overlying hydrogel)이 있거나 없이, 쓰여진 문자의 투명성을 유사한 방법으로 관찰하였다. 자외선-시각 분광 광도계를 사용한 양적 연구는 넓은 범위의 파장에 걸쳐 높은 광선 투과를 밝혔다. 예를 들면, 550 nm에서 평균 투명도는 90%이었다. 추가적으로, 반사지수는 자연 각막, 1.37보다 단지 약간 적은 약 1.34 (~5 브릭스)이었다.
유사한 분석을 다양한 양의 PMMA을 가지고, PHEMA-PMMA 구조체를 위하여 수행하였다. 상기 구조체의 시력 투명도를 결정하였고 결과를 도 3에 나타냈다.
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6: 인공 각막 제작
자연 각막 설계에 기반하여, 혼성체 수화젤 메트릭스의 전방 표면을 상피의 보호 및 영양 흡수하는 질(qualities)을 재생하기 위한 숙주 상피화를 장려하기 위해서 상피세포로 코팅하였다. 상피 아래에, 보우맨'스 층과 유사하게, 비다공성 PEGDA의 얇은 층을 기질(stroma) 밑으로부터 상피를 분리하는데 사용하였다. PEGDA는 세포결합을 단념시키고 국소된 세포 타입을 유지한다. 기질 스커트 내에, 콜라겐 및 세포는 PEGDA, 적절한 모양 및 수화 정도를 유지하는 많은 양의 물을 고정할 수 있는 수화젤에 의해 둘러싸여 있다. 혼성체 초다공성 스커트는 세포 접착 부위의 기공 및 부착을 통하여 최대 숙주 세포 통합을 하도록 디자인되었다. 중심 동공은 시력 투명도를 유지하기 위하여 콜라겐 없이 보존하였다.
생분해성, 다공성, 세포-기반, 조직-공학기술된 각막의 생성을 현재 완성하였다. 인공 각막과 같은 생성에서 첫 번째 단계로서, SPH 디스크(disc)를 섬유아세포-콜라겐 용액에 담갔다. 대조군으로서, SPHs를 콜라겐 없는 세포 용액에 또한 담갔다. 용액에 침수는 SPH의 빠른 팽창 및 기공 네트워크 내의 콜라겐 및 세포 섭취를 일으킨다. 그 다음 콜라겐 섬유질을 열젤화하였다(thermogelled). 결과는 기계적으로 안정적 수화젤에 걸친 콜라겐의 미세환경이었다. 중심 구멍은 5 mm 원형절제기(trephine)로 깎아 만들었다. 중심 구멍을 비다공성, 시력적으로 뚜렷한 PEGDA 매크로머 용액으로 채웠다. 비다공성 PEGDA 용액은 즉각 주변으로 확산되고 SPH의 표면의 바닥 표면을 따라서 퍼지고 전방 표면 상의 비다공성 PEGDA의 얇은 층을 비축하였다. 비다공성 PEGDA를 상기 불규칙 모양으로 광중합(photopolymerize)하였다. 상피세포가 꼭대기 표면 상에 증식을 위하여 부착될 수 있도록 전방 표면은 콜라겐으로 변형될 수 있다.
혼성체 수화젤의 표면을 상피화하기 위하여, 설포-SANPAH(sulfo-SANPAH (PierceNet))와 같은 물 수용성 헤테로이작용성(heterobifunctional) 가교제를 PEGDA의 표면에 콜라겐 타입 I을 부착하도록 사용할 수 있다. 페닐아지드(phenyl azide) 기를 광반응적으로(photoreactively) PEGDA로 삽입하는 반면에 N-하이드록시숙신이미드 기(N-hydroxysuccinimide group)를 콜라겐 단백질에 부착한다. 공유결합된 콜라겐 존재는 다광자 현미경(multiphoton microscope)을 사용하여 두 번째 조화적인 발생(second harmonic generation)으로 이미지 될 수 있다. 기질과 비교하여, 표면상의 콜라겐은 얇은 층(농도의 1/10)이 될 것이다. 상기 콜라겐의 얇은 층은 예를 들면, 중간 필라멘트(intermediate filament) 케라틴-3 및 케라틴-12(keratin-3 및 keratin-12)발현에 의해 결정됨으로써 각막상피세포의 성장을 지지하는 것으로 기대된다. 얇은 층은 투명성(clarity)을 유지하는 반면에 충분한 세포 부착을 위해 최적화될 수 있는 것으로 생각되었다. 콜라겐 층의 투명성은 자외선-시각 분광 광도계를 경유하여 평가될 수 있다.
각막 상피 배양은 수술시간에 약 3x2 mm의 래빗 윤부(limbal) 조직으로부터 얻을 수 있다. 상기 조직은 기저 멤브린을 파괴하기 위하여 4℃에서 밤사이 동안 디스파제(dispase)(10 mg/ml)로 처리되었다. 상피시트를 벗기고 37℃에서 5-10분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 소화(digeste)시켰다. 세포를 세척하고 각질세포(keratinocyte) 혈청 없는 배지(KSFM, Invitrogen)에서 재현탁하고 콜라겐으로 코팅된 조직 배양 플레이트에 분주하였다. 세포가 80% 융합도(confluency)에 도달할 때, 상피 세포를 트립신화하고 혼성체 골격에 분주하였다.
5 가지의 주요 힘은 콘택트 렌즈 상에서 행동하는 것으로 나타내어 왔다(예: 기압, 렌즈 뒤 눈물 필름(postlens tear film)의 정수압(hydrostatic pressure), 렌즈 앞 눈물 필름의 표면 긴장(surface tension), 렌즈 무게 및 눈꺼풀(lid) 힘)(Leonardi, et al. (2004) Invest . Ophthalmol . Vis . Sci. 45(9):3113-7). 따라서, 인공 각막은 이식 후의 유사한 힘에 노출될 것으로 추정할 수 있다. 상기 근거에 기반하여, 초다공성 혼성체 골격의 기계적 성질의 평가를 결정할 수 있다. 예를 들면, 영'스 계수(Young's modulus)는 원자 힘 현미경(atomic force microscope (AFM)) 및 허르츠(Hertz's model) 모델을 사용하여 측정할 수 있다.
영'스 계수는 허르츠(Hertz's model)을 사용하여 계산하였다.
여기서, F는 압입 힘(indenting force); R은 비드 반지름(bead radius)에 부착되고; δ은 압입(indentation), δ<<R 라고 가정; E 은 영'스 계수이고, υ는 프와송 비(Poisson ratio) (압축할 수 없는 시료(incompressible sample)를 위한 0.5 )이고; k 는 캔틸레버(cantilever's) 스프링 상수(spring constant)이고, 및 d는 캔틸레버 굴절(cantilever's deflection)이다. 상기 모델은 동종(homogeneous), 등방성(isotropi), 반무한(semi-infinite) 탄력물질을 추정한다. 또한, 표면은 편평해야만 하고, 원뿔형(conical) 또는 구면의(spherical) 팁을 사용해야만 하고, 압입(inenter) 물질은 시료보다 더욱 뻣뻣(stiffer)해야만 한다.
인간 기증자 각막의 영'스 계수는 1.3 MPa (Wollensak, et al. (2003) J. Cataract. Refract . Surg . 29(9):1780-5)로서 보고되었다. 인공 각막의 개인 성분의 영'스 계수를 측정하였고 5% PEGDA 젤에 대하여 2 MPa 및 1 mg/㎖ 콜라겐 젤에 대하여 로 ~1 kPa로 발견되었다. 그러나, 전체 기계적 성질에 대한 콜라겐의 기여는 최소인 것으로 기대된다.
추가적으로, 혼성체 골격의 전단계수(shear modulus)를 탄성영상(elastography)을 사용하여 결정하였다. 탄성영상은 물질을 통하여 전자기파(electromagnetic wave)를 전파하여 기계적 성질을 측정하는 기술에 기반한 자기공명(magnetic resonance)이다(Zerbe, et al. (2006) supra). 상기 시스템은 부드러운 조직의 기계적 측정을 위해 이상적이고 AFM 측정을 보완한다. 상기 비파괴적인 3D 이미징 기술은 조직구조 및 생존율의 직접적 지적인 물의 확산을 또한 측정할 수 있다. 세포가 팽창하거나 세포 멤브린이 파열될 때, 예를 들면, 물의 확산은 물질적 장벽이 거의 없기 때문에 더욱 빠르다.
실시예
7: 다공성
PHEMA
-
PMMA
혼성체 골격으로 세포 이동
다공성 PHEMA-PMMA 혼성체 골격의 세포 이동 및 세포 생존율을 시판되는 라이브/데드 세포 분석을 사용하여 테스트하였다. 세포 이동 연구를 위하여, 콜라겐이 없고 및 있는 무세포 다공성 PHEMA-PMMA 골격을 섬유아세포의 단층이 꼭대기에 배치하였다. 배양시간의 기간을 미리 결정한 후에, 상기 골격을 제거하였고 골격에 있는 세포를 분석하였다. 내부침투한 콜라겐 네트워크가 골격으로 공학기술되지않은 대조군 실험에서, 세포는 발견되지 않았다. 상기는 골격으로 세포이동이 부족함을 나타낸다. 반대로, 내부침투한 콜라겐 네트워크가 골격으로 공학기술화 되었을 때, 세포 이동에 대한 강한 증거를 쉽게 얻었다. 골격으로 이동된 세포뿐만 아니라, 또한 살아있는 세포가 염색되는데, 이는 골격으로 이동하고 생존을 위해 콜라겐 네트워크에 부착하기 위하여 세포를 유도하여 다공성 PHEMA-PMAA 혼성체 골격의 생물활성을 분명히 나타낸다. 골격으로 이동된 세포는 조직통합을 위한 결정적 마커로서 역할을 하는 자체의 세포 외 메트릭스를 구성하기 위하여 필요한 단백질 및 다른 분자를 분비하는 것을 예상된다.
생체 내 세포 이동을 나타내기 위하여, PHEMA-PMMA 구조체를 마우스에 피하에 이식하였다. 서로 연결된 기공은 탈수된 PHEMA-PMMA의 SEM 이미지에서 쉽게 명백하지 않다. 그러나, 구조의 신체로의 소량의 세포 내증식이 마우스 피부 아래에서 이식 8일 동안 관찰되었다. 상기는 추가적 기공이 많은 양의 세포 내증식을 유도하는 것을 나타낸다.
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8: 동물 모델에서 인공 각막의 생체적합성
래빗 모델에서 생체 내 생체적합성을 숙주-보철 통합, 상피화, 안정성 및 인공각막의 투명성의 정도를 평가하는데 사용하였다. 콜라겐 및 섬유아세포를 갖는 다공성 스커트를 분주 전처리는 통합의 비율 및 정도를 현저히 증강할 것이고 임플란트의 장기간 안정성을 유도할 것이다.
인공 각막을 이식하기 전 첫 번째 스텝은 래빗으로부터 자가 각막 섬유아세포를 얻는 것이다. 상기는 말초 각막으로부터 작은 각막 생체검사를 통하여 행하여졌다. 그 다음 각막 생체검사 조직은 37℃에서 밤사이 동안 1 mg/㎖의 콜라겐에서 소화되었다. 세포를 세척한 후 10% FCS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 4 mM L-글루타민 및 1% 항생제 용액(Invitrogen-GIBCO)이 보충된 DMEM에서 분주하였다. 배양에서 10-14일의 기간 후에, 섬유아세포를 트립신화하고 콜라겐 용액에서 분산시키고 인공 각막의 초다공성 스커트로 혼합하였다.
인공 각막, 섬유아세포로 분주하거나 분주하지 않거나(대조군), 2 단계 절차로 래빗 각막으로 수술 이식되었다. 첫 번째 단계에서, 인공 각막을 보호용 피부판으로서 래빗의 전방 각막을 보존하는 부분 두께 대체로서 이식하였다. 특별히, 모리아 마이크로케라톰(Moria microkeratome) (LASIK 피부판을 만들기 위해서 디자인 됨)을 사용해서 약 10 mm 지름의 130 ㎛ 피부판(flap)을 제조하였다. 상기는 효과적으로 각막을 수평으로 자른다(slice). 노출된 각막의 뒷면을 8 mm 천공기(trephine)를 사용하여 천공하였고 4 mm 동공 및 2 mm 스커트로 구성된 각막이식을 가로막힌 10-0 나일론 봉합을 사용하여 제자리에서 봉합하였다. 대조군 래빗은 동일한 임플란트를 받았으나 임의 세포없이 스커트에서 박아넣었다. 전방 피부판을 임플란트의 꼭대기에 다시 놓고 가로막힌 분해할 수 있는 10-0 바이크릴(vicryl) 봉합을 사용하여 말초 각막에 봉합하였다.
2 단계에서, 임플란트의 뚜렷한 존(zone)을 커버하는 전방 피부판의 일부를 제거하였고 인공 각막은 전체-두께 대체로서 기능하였다. 상기 단계의 절차를 위한 근거는 통합이 발생하는 시간을 허가하는 동안에 각막의 온전함을 유지하는 것이다. 특별히, 초기 이식 후 2개월에 동물을 수술실로 돌아오게 하였다. 래빗을 일반적 마취(anesthesia)하에서 놓아두었고 임플란트의 뚜렷한 존(zone)을 커버하는 중심 4 mm의 전방 피부판을 천공하였고 제거하였다.
수술 후 첫 번째 일주일(week) 동안 그런 다음 용해(melting), 수용성 누출(aqueous leakage), 압출(extrusion), 감염(infection), 재인공판(retroprosthetic) 멤브린 형성, 망막박리(retinal detachment), 또는 증식유리체망막병(proliferative vitreoretinopathy)과 같은 합병증 증거를 위해 일주일 당 2-3차례씩 각각의 래빗에 매일 후속이 수행될 것이다. 시험은 각막이 시력적으로 뚜렷한지를 확신하게 히는 틈새등생체현미경(slit lamp biomicroscopy), 및 온전함 및 장벽 기능에 접근하기 위한 소듐 플로오레신(sodium fluorescein) 염색을 포함할 것이다. 안구내(Intraocular) 압력 측정은 임플란트가 눈방수 흐름(aqueous humor flow)에 방해되는지를 결정하는 것을 또한 받아들인다. 간접적 검안경 검사(ophthalmoscopy)는 뒷쪽 부분(posterior segment)을 조사하기 위해 사용된다. 모든 동물은 단기간 결과를 결정하기 위한 6 주 동안 그런 다음 장기간 연구를 위해 6 개월 동안까지 따르게 된다.
인공 각막의 생체 통합(bio-integration) 및 생체적합성(bio-compatibility)은 1 주, 2 주, 6 주, 3 개월, 및 6 개월에 조직학적으로 평가될 것이다. 래빗 3쌍(하나는 실험군 및 하나는 대조군)은 각각의 시간 포인트에서 조직병리학(histopathology)을 위해 사용될 것이다. 안구는 동공에 대한 상피화, 스커트로 섬유아세포 내증식, 장치 주변에 캡슐 형성의 정도를 평가하기 위해 일상적 조직학적 및 면역-염색에 적용을 받을 것이다. 평활근 엑틴(smooth muscle actin)에 대한 면역염색은 초다공성 스커트의 섬유아세포를 식별하기 위해 사용될 것이다. 임플란트로 섬유아세포 침투의 수 및 범위는 주변으로부터 중심으로 시작하는 시리얼 섹션(serial sections)을 사용하여 마스크한 관찰자에 의해 등급될 것이다. 콜라겐 타입 I의 발현, β-인테그린 및 국소 부착 복합체는 마찬가지로 평가될 것이다. 결과는 2 개의 군 사이에서 비교될 것이다.
인공 각막의 통합은 종래의 방법에 따라서 기계적으로 테스트될 것이다(Lee, et al. (2000) Arch . Ophthalmol . 118(12):1673-8). 상기 측정은 안락사(euthanasia)후에 제핵되는(enucleated) 온전한 안구에서 수행될 것이다. 안구내(Intraocular) 압력은 점차적으로 내부에 증가될 것이고 누출되기 시작하는 숙주-보철물에서 압력은 기록될 것이다. 상기 측정은 6주에서 시작하여, 다음 3개월, 및 6개월에서 각각의 시간포인트에 대하여 3 쌍의 안구(하나의 안구, 하나의 실험군)에서 행해질 것이다.
임의 보철물 장치에 관해서, 2차 조직 괴사 또는 압출을 갖는 비통합(non-integration)의 가능성이 있다. 세포로 미리 분주된 구조체는 현저히 통합을 증강할 것이 고려된다. 통합을 촉진하는 대안적 계획은 섬유혈관(fibrovascular) 내증식을 촉진하는 TGF-beta와 같은 지연된 방출 성장요인을 갖는 스커트를 묻기(embedding)을 포함한다. 다른 잠재적 문제는 특히 동공 뒤에 있는 장치 주위에 멤브린 형성이다(Hicks & Hamilton (2005) 각막 24(6):692-8). 임상 세팅에서, 상기 멤브린은 YAG 레이저에 의해 통상적으로 제거되나, 표면 변형을 위한 추가 계획은 멤브린 형성을 억제하는데 또한 사용될 수 있다.
Claims (6)
- 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) (poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(PHEMA) 및 폴리(메틸메타크릴레이트) (poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(PMMA), 및 초다공성 수화젤 공중합체(superporous hydrogel copolymer)의 기공에 있는 콜라겐을 포함하는 초다공성 수화젤 공중합체를 포함하는 각막 재생(cornea regeneration)을 위한 혼성체 골격(hybrid scaffold).
- PHEMA-PMMA 공중합체, 및 상기 PHEMA-PMMA 공중합체의 기공에 있는 콜라겐을 포함하는 봉합가능한 혼성체 임플란트(suturable hybrid implant).
- 제1항에 있어서, 상기 임플란트는 각막(cornea)으로 이식을 위한 핵심-스커트 인공각막이식(core-skirt keratoprosthesis)의 스커트를 형성하는 봉합가능한 혼성체 임플란트.
- 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 형성하기 위하여 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate), 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(pentaerythritol tetraacrylate), 및 디메틸포름아미드(diemthylformamide) 수용액에서 혼합하는 단계; 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액을 냉각시키는 단계; 콜라겐-수화젤 용액을 형성하기 위하여 냉각된 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤 용액에 콜라겐을 첨가하는 단계; 및 봉합가능한 혼성체 임플란트를 제조하기 위하여 37℃에서 콜라겐-수화젤 용액을 배양하는 단계를 포함하는 제2항의 봉합가능한 혼성체 임플란트를 생성하는 방법.
- 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 형성하기 위하여 메틸메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 탈이온수, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트(PETA), 및 디메틸포름아미드(DMF) 용액을 혼합하는 것을 포함하고, 상기 PETA는 PHEMA-PMMA의 공중합체의 가교를 촉진하고, DMF는 젤 용액으로 MMA와 HEMA의 용해를 촉진하는 초다공성 PHEMA-PMMA 수화젤을 생성하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 용액은 메틸메타크릴레이트가 10% v/v의 농도, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트가 45% v/v의 농도, PETA의 5 mg, 2 mg 암모늄 펄설페이트(ammonium persulfate), 10 ㎕ N,N, N', N'-테트라메틸에틸렌디아민(N,N, N', N'-tetramethylethylenediamine), 6% v/v의 농도의 DMF, 및 22% 탈이온수를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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