JP2007512351A - GlycoPEG化エリスロポエチン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、各々その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により援用されている2003年11月24日付けの米国仮特許出願第60/524,989号明細書;2004年3月22日付けの米国仮特許出願第60/555,504号明細書;2004年7月23日付けの米国仮特許出願第60/590,573号明細書;2004年7月29日付けの米国仮特許出願第60/592,744号明細書;2004年9月29日付けの米国仮特許出願第60/614,518号明細書;および米国仮特許出願第60/623,387号明細書に基づく優先権を主張するものである。
エリスロポエチン(EPO)は、赤血球の産生を刺激するべく造血幹細胞に作用する腎臓および肝臓によって産生されるサイトカインである。該タンパク質は2つの形態で存在し、その1つは165アミノ酸ペプチドであり、もう1つは166アミノ酸ペプチドである。166アミノ酸ペプチドは、166アミノ酸ペプチドがC末端の最も端に付加的なアルギニンを有するという点を除いて、165アミノ酸ペプチドと同じ配列を有する。成熟165アミノ酸ペプチドは、3つのN−グリコシル化部位(Asn−24、Asn−38およびAsn−83)および1つのO−グリコシル化部位(Ser−126)を含む34kDの糖タンパク質であり、一部の変異体は、5つのN連結されたグリコシル化部位を含む「過グリコシル化」されたものである。
現在、1つ以上のポリ(エチレン)グリコール部分によるエリスロポエチン(EPO)の制御された修飾が、改善された薬物動態をもつ新規のEPO誘導体を提供することが発見されている。さらに、本発明の修飾されたEPOペプチドを高い信頼性で生産するための費用効果性の高い方法が発見され開発されてきた。
の部分を含むエリスロポエチンペプチドにおいて、式中
Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択されるメンバーであり;Gは、R1−L−および−C(O)(C1−C6)アルキルから選択されるメンバーであり;R1は、直鎖または分岐ポリ(エチレングリコール)残基を含む部分である、選択されるメンバーを含む部分であり、かつ;Lが結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり;かくして、DがOHであるときGがR1−L−であり、Gが−C(O)(C1−C6)アルキルであるときDがR1−L−NH−である、エリスロポエチンペプチドを提供している。一実施形態においては、L−R1は
という式を有し、式中aは0〜20の整数である。もう1つの実施形態においては、R1は、
から選択されるメンバーである構造を有し;式中eおよびfは1〜2500から独立して選択される整数であり、qは1〜20の整数である。その他の実施形態においては、R1は、
から選択されるメンバーである構造を有し;式中e、fおよびf’は1〜2500から独立して選択される整数であり、qおよびq’は1〜20から独立して選択される整数である。
から選択されるメンバーである構造を有し、式中;e、fおよびf’は1〜2500から独立して選択される整数であり;q、q’およびq’’は、1〜20から独立して選択される整数である。その他の実施形態においては、R1は、
から選択されるメンバーである構造を有し、eおよびfは1〜2500から独立して選択される整数である。
という式に従い、式中アミノ酸が前記ペプチドのアミノ酸残基である部分を含んでいる。一部の実施形態では、アミノ酸残基はセリン、トレオニンまたはチロシンから選択されるメンバーである。好ましい実施形態においては、該アミノ酸残基は、配列番号:1の126位にあるセリンである。
という式を有する少なくとも1つの部分を含み、式中、tが0または1に等しい整数であるエリスロポエチンペプチドを提供する。かくしてこの実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は2分岐構造のいずれかの分岐上に発生し得る。
に従った式を有する少なくとも1つの部分を含むエリスロポエチンペプチドを提供している。この実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は、3分岐構造のいずれかの形態の分岐のうちのいずれかの1つ以上のものの上で発生し得る。
という式を有する少なくとも1つの部分を含むエリスロポエチンペプチドを提供する。この実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は、4分岐構造の分岐のうちいずれかの1つ以上のものの上で発生し得る。
という部分を含むPEG化エリスロポエチンの製造方法において、式中R1は、直鎖または分岐ポリ(エチレングリコール)残基を含む部分であり、Lは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである方法を提供する。該方法は、
というグリコシル部分を含む基質エリスロポエチンペプチドを、
という式をもつPEG−シアル酸供与体部分およびトランスファに適した条件下で前記グリコシル部分のGal上に前記PEG−シアル酸を転移する酵素と接触させる工程を含む。一実施形態においては、エリスロポエチンペプチドは適切な宿主内で発現される。一実施形態においては、宿主は哺乳類細胞であり、もう1つの実施形態では宿主細胞は昆虫細胞である。
略語
PEG、ポリ(エチレングリコール);PPG、ポリ(プロピレンングリコール);Ara、アラビノシル;Fru、フルクトシル;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N−アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N−アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、マンノサミニルアセタート;Xyl、キシロシル;およびNeuAc、シアリル(N−アセチルノイラミル);M6P、マンノース−6−ホスファート。
別段の定義のないかぎり、本書で使用されている全ての技術的および科学的用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順および本書で使用されている用語は、周知でかつ当該技術において普通に利用されているものである。核酸およびペプチド合成のためには、標準的技術が使用される。技術および手順は一般に当該技術分野における従来の方法および本書全体にわたり提供されているさまざまな一般的参考文献に従って実施される(一般に、本明細書に参照により援用されているサンブルック(Sambrook)ら、「MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL」、第2版(1989年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照のこと)。以下で記述されている有機合成および分析化学における実験室手順および本書で使用される用語は、当該技術分野において利用されている周知のものである。化学合成および化学分析のためには、標準的な技術またはそれを、修正したものが使用される。
エリスロポエチン(EPO)は、赤血球合成の主要調節因子として役立つ糖タンパク質である。エリスロポエチンは、腎臓の中で産生され、骨髄の中で前駆体細胞を刺激してそれらを成熟赤血球へと分割、分化させることによって作用する。EPOは165または166アミノ酸の糖タンパク質として存在し得る。166アミノ酸変異体は、タンパク質のC末端に付加的なアルギニン残基が存在することにより165アミノ酸変異体と識別される。
第1の態様においては、本発明は選択される修飾基とEPOペプチドの間の抱合体を提供する。
上述の通り、本発明は、修飾基を担持する糖類、これらの種の活性化された類似体、およびペプチドおよび脂質といったような種と本発明の修飾型糖類の間で形成された抱合体を提供する。
本発明は、修飾型糖、修飾型糖ヌクレオチドおよび修飾型糖の抱合体を提供する。本発明の修飾型糖化合物においては、糖部分は好ましくは糖類、デオキシ−糖類、アミノ−糖類またはN−アシル−糖類である。「糖類」およびその等価物、「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」という用語は、単量体、2量体、オリゴマーおよびポリマーを意味する。糖部分は同様に、修飾基で官能化される。修飾基は、標準的に、糖上のアミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、例えば一級ヒドロキシル部分との抱合を通して、糖部分に抱合される。一実施形態例においては、修飾基は、その反応性誘導体とアミンの反応を通して形成されるアミド、ウレタンまたは尿素などを通して、糖上にアミン部分を通して付着させられる。
という式をもつ修飾型糖アミン[なお式中Gはグリコシル部分、Lは結合またはリンカーそしてR1は修飾基である]を提供する。結合の例としては、例えばNH2、SHまたはOHといったグリコシル部分上の反応基と修飾基上の相補的反応性をもつ基の間で形成される結合がある。かくして、結合の例としてはNHR1、OR1、SR1などが含まれる。例えばR1がカルボン酸部分を含む場合、この部分を活性化し、グリコシル残基の上のNH2部分とカップリングさせNHC(O)R1という構造をもつ結合を付与することができる。同様にして、OHおよびSH基を対応するエーテルまたはチオエーテル誘導体に転換することも可能である。
NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、
NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、
NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、
NHC(O)(CH2)aNHR1、
NH(CH2)aNHR1、およびNHR1である化合物を提供する。これらの式においては、指標のa、bおよびdは独立して0〜20、好ましくは1〜5の整数の中から独立して選択されている。指標cは1〜2500の整数である。
当業者であれば、上述の化合物の例の中のシアル酸部分を、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、そのN−アセチル誘導体などを含む(ただしこれらに限定されるわけではない)任意のその他のアミノ−糖類で置換えることができるということを認識するだろう。
という式を有し、ここでR3〜R5およびR7は、H、OH、C(O)CH3、NHおよびNHC(O)CH3から独立して選択されるメンバーである。R6は上述の通りのOR1、NHR1またはL−R1である。
[なお式中L−R1は上述の通りであり、L1−R1は修飾基に結合されたリンカーを表わす。Lの場合と同様、L1に従ったリンカー種の例には結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が含まれる。これらの実施形態に従った修飾型糖ヌクレオチド化合物の例が図1および図2に記されている。
この式中、R1、L1およびL2は以上で記述した通りである。
という式を有し、ここでラジカルは上述の通りである。当業者であれば、上述の修飾されたサッカリル部分を同じく2、3、4または5個の炭素原子に抱合させることができる、ということを認識するであろう。
が含まれ、ここでR基およびLは上述の通りの部分を表わす。指標「y」は0、1または2である。
水溶性ポリマー
数多くの水溶性ポリマーは、当業者にとって既知のものであり、又本発明を実施する上で有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖類(例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ(シアル酸)、ヘパラン、ヘパリンなど);ポリ(アミノ酸)、例えばポリ(アスパラギン酸)およびポリ(グルタミン酸);核酸;合成ポリマー(例えばポリ(アクリル酸)、ポリ(エステル)、例えばポリ(エチレングリコール);ペプチド、タンパク質などといったような種を包含する。本発明は、ポリマーが抱合体の残りのものを付着させることのできる箇所を含んでいなければならないということを唯一の限定として、あらゆる水溶性ポリマーで実施可能である。
という式をもつものが含まれ(ただしこれらに限定されるわけではない)、式中R8はH、OH、NH2、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、例えばアセタール、OHC−、H2N−(CH2)q−、HS−(CH2)q、または−(CH2)qC(Y)Z1である。指標「e」は1〜2500の整数を表わす。指標b、dおよびqは独立して0〜20の整数を表わす。記号ZおよびZ1は独立してOH、NH2、遊離基、例えばイミダゾール、p−ニトロフェニル、HOBT、テトラゾール、ハロゲン化物、S−R9、活性化されたエステルのアルコール部分;−(CH2)pC(Y1)V、または−(CH2)pU(CH2)sC(Y1)vを表わす。記号Yは、H(2)、=O、=S、=N−R10を表わす。記号X、Y、Y1、A1およびUは独立して部分O、S、N−R11を表わす。記号VはOH、NH2、ハロゲン、S−R12、活性化されたエステルのアルコール成分、活性化されたアミドのアミン成分、糖−ヌクレオチドおよびタンパク質を表わす。記号p、q、sおよびvは0〜20の整数から独立して選択されるメンバーである。記号R9、R10、R11およびR12は独立してH、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換のヘテロアリールを表わす。
という式により記述されるものを含み(ただしこれらに限定されるわけではない)、式中R8およびR8’は上述のR8について定義された基から独立して選択されるメンバーである。A1およびA2は、以上でA1について定義されている基から独立して選択されるメンバーである。指標e、f、oおよびqは上述の通りである。ZおよびYは上述の通りである。X1およびX1’はS、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNHおよびNHC(O)O、OC(O)NHから独立して選択されるメンバーである。
という式を有し、式中e、fおよびf’は1〜2500の独立して選択される整数であり、q、q’およびq’’は1〜20の独立して選択される整数である。
が含まれるがこれらに限定されるわけではない。これらのおよびその他の種で活性化されるPEG分子および活性化されたPEGの製造方法が国際公開第04/083259号パンフレットの中に記されている。
なお式中、XaはOまたはS、rは1〜5の整数、指標eおよびfは独立して選択される1〜2500の整数である。
なお式中、X4は0または1つの結合である。
以上で論述しているものと類似のもう1つの実施形態においては、修飾型糖は水溶性ポリマーではなく非水溶性ポリマーを含んでいる。本発明の抱合体は単数または複数の非水溶性ポリマーを含んでいてもよい。本発明のこの実施形態は、制御された形で治療用ペプチドを送達するためのビヒクルとしての抱合体の使用によって例示されている。ポリマー薬物送達系が、当該技術分野において知られている。例えばダン(Dunn)ら、編「POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS」、ACS Symposium Series第469巻、American Chemical Society、ワシントンD.C.1991年を参照のこと。当業者であれば、本発明の抱合体に対し実質的にあらゆる既知の薬物送達系を応用することができるということがわかるだろう。
上述の抱合体に加えて、本発明はこれらの抱合体およびその他の抱合体を調製するための方法を提供している。さらに、本発明は、疾病を発生するリスクの高い対象または疾病をもつ対照に対して本発明の抱合体を投与することにより疾病状態を予防し、治ゆし改善する方法を提供する。
一般に、糖部分または糖部分リンカーカセットおよびPEGまたはPEGリンカーカセット基は、標準的に連結プロセスにより新しい有機官能基または非反応性種へと変換される反応基を使用することで互いに連結される。糖反応性官能基は、糖部分上の任意の位置にある。本発明を実施するのに有用な反応基および反応クラスは一般に、生物抱合体化学の技術分野において周知のものである。反応性糖部分と共に利用可能な現在好まれている反応クラスは、比較的穏やかな条件で進行するものである。これらには、求核置換反応(アシルハロゲン化物、活性エステルとアミンおよびアルコールの反応)、求電子置換反応(例えばエナミン反応)および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合に対する付加(例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらのおよびその他の有用な反応が例えばマーチ(March)、「ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY」、第3版、John Wiley & Sons、New York、1985年;ハーマンソン(Hermanson)、「BIOCONJUGATE TECHNIQUES」、Academic Press、San Diego、1996年;およびフィーネイ(Feeney)ら、「MODIFICATION OF PROTEINS;dvances in Chemistry Series」、第198巻、American Chemical Society、Washington、D.C.、1982年の中で論述されている。
(a)N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシベンズトリアゾルエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む(ただしこれらに限定されるわけではない)カルボキシル基およびさまざまな誘導体;
(b)例えばエステル、エーテル、アルデヒドなどに転換され得るヒドロキシル基;
(c)例えばアミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルバニオンまたはアルオキシドイオンといったような求核基でハロゲン化物が後に変位させられて、ハロゲン原子の官能基における新しい基の共有結合を結果としてもたらす可能性のあるハロアルキル基;
(d)例えばマレイミド基といったようなディールス−アルダー反応に関与する能力をもつ求ジエン基;
(e)例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムといったようなカルボニル誘導体の形成を介してまたは、グリニャール付加またはアルキルリチウム付加といった機序を介して後続する誘導体化が可能となるようなアルデヒドまたはケトン基;
(f)例えばスルホンアミドを形成するべくアミンと後に反応するためのハロゲン化スルホニル基;
(g)例えばジスルフィドに転換されるかまたはハロゲン化アシルと反応し得るチオール基;
(h)例えばアシル化、アルキル化または酸化可能であるアミンまたはスルフヒドリル基;
(i)例えば付加環化、アシル化、マイケル付加を受け得るアルケン;
(j)例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応し得るエポキシド。
スキーム1
なお式中、Xは、各RがR1〜R5から独立して選択されるメンバーであるものとして好ましくは−O−、−N(H)−、−S、CH2−および−N(R)2から選択される連結基である。記号Y、Z、AおよびBは各々Xの同一性について上述された群の中から選択される基を表わす。X、Y、Z、AおよびBは、各々独立して選択され、従ってこれらは同じでも異なるものでもあり得る。記号R1、R2、R3、R4およびR5は、H、PEG部分、治療用部分、生体分子またはその他の部分を表わす。代替的には、これらの記号は、PEG部分、治療用部分、生体分子またはその他の部分に結合されるリンカーを表わす。
本発明の方法において使用するための修飾型糖の調製には、糖残基に対するPEG部分の付着そして好ましくはグリコシルトランスフェラーゼのための基質である安定した付加体の形成が含まれる。かくして、例えばPEGおよび糖を抱合するために架橋剤とPEGおよび糖部分の反応により形成されるものといったリンカーを使用することが往々にして好まれる。炭水化物部分に修飾基を付着させるために使用可能な2官能性化合物の例には、2官能性ポリ(エチレングリコール)、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。その他の分子に炭水化物を連結させるための一般的なアプローチが文献の中で既知である。例えばリー(Lee)ら、Biochemistry、第28号、1856頁(1989年);バチア(Bhatia)ら、Anal.Biochem.第178号、408頁(1989年);ジャンダ(Janda)ら、J.Am.Chem.Soc.第112号、8886頁(1990年)およびベドナルスキ(Bednarski)ら、国際公開第92/18135号パンフレットを参照のこと。以下の論述においては、反応基は、発生基の修飾型糖の糖部分上で良性であるものとして処理される。論述の焦点は例示を明確にすることにある。当業者であれば、該論述が修飾基上の反応基に関わるものであることを認識するだろう。
1 アミノ反応基
1つの好ましい実施形態においては、架橋剤上の部位はアミノ反応基である。アミノ反応基の限定的な意味のない有用な例としては、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、イミドエステル、イソシアナート、アシルハライド、アリールアジド、p−ニトロフェニルエステル、アルデヒドおよび塩化スルホニルが含まれる。
もう1つの好ましい実施形態においては、該部位はスルフヒドリル反応基である。スルフヒドリル反応基の限定的意味のない例としては、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルスルフィドおよびチオフタルイミドが含まれる。
もう1つの実施形態においては、カルボキシル反応性試薬として、水および有機溶媒の両方において可溶であるカルボジイミドが使用される。これらの化合物は、遊離カルボキシル基と反応して、偽尿素を形成し、これは次に利用可能なアミンにカップリングしてアミド連結を生成することができ、カルボジイミドでカルボキシル基を修飾する方法を教示している(ヤマダ(Yamada)ら、Biochemistry、第20号、4836〜4842頁、1981年)。
部位特異的反応性部分の使用に加えて、本発明は、糖を修飾基に連結するための非特異的反応基の使用について考慮している。
1.一級アミンとの反応性をもつホモ2官能性架橋剤
アミン反応性架橋剤の合成、特性および利用分野については文献中で商業的に記述されている(架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと)。数多くの試薬が利用可能である(例えばピアース・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Company)、Rockford、イリノイ州;シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Company)、St.Louis、ミズーリ州;モレキュラー・プローブ(Molecular Probes、Inc.)、Eugene、オレゴン州)。
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている(架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと)。数多くの試薬が市販されている(例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Rockford、イリノイ州;シグマ・ケミカル・カンパニー、St.Louis、ミズーリ州;モレキュラー・プローブ社、Eugene、オレゴン州)。
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている(架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと)。いくつかの試薬が市販されている(例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Rockford、イリノイ州;シグマ・ケミカル・カンパニー、St.Louis、ミズーリ州;モレキュラー・プローブ社、Eugene、オレゴン州)。
1.ピリジルジスルフィド部分を伴うアミノ反応性ヘテロ2官能性試薬
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている(架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと)。これらの試薬の数多くが市販されている(例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Rockford、イリノイ州;シグマ・ケミカル・カンパニー、St.Louis、ミズーリ州;モレキュラー・プローブ、Eugene、オレゴン州)。
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献に記述されている。マレイミド部分およびアミノ反応性NHSエステルを伴うヘテロ2官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、スクシンイミジルマレイミジルアセタート(AMAS)、スクシンイミジル3−マレイミジルプロピオナート(BMPS)、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)N−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−GMBS)、スクシンイミジル6−マレイミジルヘキサノアート(EMCS)、スクシンイミジル3−マレイミジルベンゾアート(SMB)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラート(スルホ−SMCC)、スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(SMPB)、およびスルホスクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(スルホ−SMPB)が含まれる。
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献に記述されている。ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性NHSエステルを伴うヘテロ2官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、N−スクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート(SIAB)、スルホスクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート(スルホ−SIAB)、スクシンイミジル−6−(ヨードアセチル)アミノヘキサノアート(SIAX)、スクシンイミジル6−(6−((ヨードアセチル)−アミノ)ヘキサノイルアミノ)ヘキサノアート(SIAXX)、スクシンイミジル−6−(((4−(ヨードアセチル)−アミノ)−メチル)−シクロヘキサン−1−カルボニル)アミノヘキサノアート(SIACX)およびスクシンイミジル−4((ヨードアセチル)−アミノ)メチルシクロヘキサン−1−カルボキシラート(SIAC)が含まれる。
さらにもう1つの実施形態においては、リンカー基には糖残基から修飾基を放出するために分割可能な基が備わっている。数多くの分割可能基が当該技術分野において知られている。例えばユング(Jung)ら、Biochem.Biophys.Acta、第761号、152〜162頁(1983年);ジョーシ(Joshi)ら、J.Biol.Chem.第265号、14518〜14525頁(1990年);ザルリング(Zarling)ら、J.Immunol.第124号、913〜920頁(1980年);ブイザール(Bouizar)ら、Eur.J.Biochem.第155号、141〜147頁(1986年);パーク(Park)ら、J.Biol.Chem.第261号、205〜210頁(1986年);ブローニング(Browning)ら、J.Immunol.第143号、1859〜1867頁(1989年)を参照のこと。その上、ピアースといったような供給業者から広範囲の分割可能な2官能性(ホモおよびヘテロ2官能性の両方)リンカー基が市販されている。
PEG修飾型糖は、抱合を媒介するため適切な酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに対し抱合される。好ましくは、修飾されたドナー糖、酵素およびアクセプタペプチドの濃度は、アクセプタが消費されるまでグリコシル化が続行するような形で選択される。以下で論述される考慮事項は、シアリルトランスフェラーゼという状況下で記されているもののその他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に全般的に適用可能である。
糖トランスファ
アシル連結型抱合体の形成という状況下で上述した酵素に加えて、抱合体および出発基質(例えばペプチド、脂質)のグリコシル化パターンを、その他の酵素を利用する方法により精緻化し、トリムバックまたはその他の形で修飾することができる。アクセプタに糖ドナーを転移する酵素を使用してペプチドおよび脂質を作り出す方法がディフリー(De Frees)の2003年4月17日に公開された国際公開第03/031464A2号パンフレット中で詳細に論述されている。当該方法において有用な選択される酵素の簡単な要約を以下に記す。
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質に対するまたは成長するオリゴ糖類の非還元末端に対する、活性化された糖(ドナーNDP−糖)の段階的な付加を触媒する。N連結型糖ペプチドが、enブロックトランスファとそれに続くコアのトリミングにおいて、トランスフェラーゼおよび脂質連結型オリゴ糖類ドナーDol−PP−NAG2Glc3Man9を介して合成される。この場合、「コア」糖類の性質はその後の付着と幾分か異なっている。非常に数多くのグリコシルトランスフェラーゼが当該技術分野において知られている。
一部の実施形態においては、本発明の方法において使用されるグリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者にとって既知のものである。フコシルトランスフェラーゼの例としては、L−フコースをGDP−フコースからアクセプタ糖のヒドロキシ位まで転移する酵素がある。非ヌクレオチド糖をアクセプタに転移するフコシルトランスフェラーゼも同様に、本発明において有用である。
もう1つの実施形態群においては、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(E.C.No.2.4.1.151、例えばダブコウスキー(Dabkowski)ら、Transplant Proc.第25号、2921頁(1993年)およびヤマモト(Yamamoto)ら、Nature、第345号、229〜233頁(1990年)、ウシ((GenBank j04989、ジョジアス(Joziasse)ら、J.Biol.Chem.第264号、14290〜14297頁(1989年))、マウス(GenBank m26925、ラルセン(Larsen)ら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、第86号、8227〜8231頁(1989年))、ブタ(GenBank L36152;ストラーハン(Strahan)ら、Immunogenetics、第41号、101〜105頁(1995年)参照)。もう1つの適切なα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型B抗原(EC2.4.1.37、ヤマモト(Yamamoto)ら、J.Biol.Chem.第265号、1146〜1151頁(1990年)(ヒト))の合成に関与するものである。さらにもう1つのガラクトシルトランスフェラーゼの例は、コアGal−T1である。
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え型細胞および反応混合物において有用であるグリコシルトランスフェラーゼのもう1つのタイプである。組換え型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は同様に、シアリルトランスフェラーゼのためのシアル酸供与体であるCMPシアル酸を産生することになる。本発明において使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ST3GalIII(例えばラットまたはヒトST3GalIII)、ST3GalIV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalII、ST6GalNAcI、ST6GalNAcIIおよびST6GalNAcIII(本書で使用されるシアリルトランスフェラーゼの学名は、ツジ(Tsuji)ら、Glycobiology6、v〜xiv(1996年)で記述されている通りである)が含まれる。α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)と呼ばれるα(2,3)シアリルトランスフェラーゼの一例は、シアル酸をGalβ1→3Glc2糖類またはグリコシドの非還元末端Galまで転移する。ファン・デン・イェンデン(Van den Eijnden)ら、J.Biol.Chem.第256号、3159頁(1981年)、ワインスタイン(Weinstein)ら、J.Biol.Chem.第257号、13845頁(1982年)およびウェン(Wen)ら、J.Biol.Chem.第267号、21011頁(1992年)を参照のこと。もう1つのα2,3−シアリルトランスフェラーゼの例(EC2.4.99.4)は、シアル酸を2糖類またはグリコシドの非還元末端Galへと転移する。リーリック(Rearick)ら、J.Biol.Chem.第254号、4444頁(1979年)およびギレスピー(Gillespie)ら、J.Biol.Chem.第267号、21004頁(1992年)を参照のこと。さらなる酵素例にはGal−β−1,4−GlcNAcα−2,6シアリルトランスフェラーゼが含まれる(クロサワ(Kurosawa)ら、Eur.J.Biochem.第219号、375〜381頁(1994年)を参照のこと)。
N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは本発明を実施する上で、特にペプチドのO連結型グリコシル化部位のアミノ酸にGalNAc部分を結合させるために有用である。適切なN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼにはα(1,3)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(ナガタ(Nagata)ら、J.Biol.Chem.第267号、12082〜12089頁(1992年)およびスミスら、J.Biol.Chem.第269号、15162頁(1994年))およびポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(ホーマ(Homa)ら、J.Biol.Chem.第268号、12609頁(1993年))が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
もう1つの実施形態においては、本発明の方法において利用される酵素は、細胞結合したグリコシルトランスフェラーゼである。数多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られている(例えば米国特許第5,032,519号明細書を参照)ものの、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と会合した場合に膜結合形態をしている。これまでに研究された膜結合酵素の多くは、固有のタンパク質であると考えられている。すなわち、これらは音波処理により膜から放出されず、可溶化のために洗浄剤を必要としない。表面グリコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物および無脊椎動物細胞の表面上で同定されてきており、これらの表面トランスフェラーゼが生理学的条件下で触媒活動を維持することも認識されてきた。しかしながら、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼのより広く認められている機能は、細胞内認識についてのものである(ロス(Roth)、「MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA」、1990年)。
本発明は同様に、例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラゲネンおよび関連する化合物といった硫酸化多糖を含む硫酸化分子を内含するペプチドを生産するための方法をも提供する。適切なスルホトランスフェラーゼには、例えばコンドロイチン−6−スルホトランスフェラーゼ(フクタ(Fukuta)ら、J.Biol.Chem.第270号、18575−18580頁(1995年)に記述されたニワトリのcDNA;GenBank登録番号D49915)、グルコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ1(ディクソン(Dixon)ら、Genomics、第26号、239〜241頁(1995年);UL−18198)およびグルコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ2(オレラナ(Orellana)ら、J.Biol.Chem.第269号、2270〜2276頁(1994年)およびエリクソン(Eriksson)ら、J.Biol.Chem.第269号、10438〜10443頁(1994年)中に記述されたマウスのcDNA;GenBank登録番号U2304中に記述されたヒトのcDNA)が含まれる。
本発明は、同様に野生型および突然変異体のグリコシダーゼの使用をも包含している。ガラクトシルアクセプタ分子にα−グリコシルフッ化物を結合することを通して、突然変異体β−ガラクトシダーゼ酵素が2糖類の形成を触媒することが実証されてきた((ウィザーズ(Withers)、2001年9月4日付けの米国特許第6,284,494号明細書))。本発明において有用であるその他のグリコシダーゼには、例えばβ−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−N−アセチルグルコサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ/シアリダーゼが含まれる。
本発明は同様に、固体および/または可溶性支持体の上に固定化されている酵素の使用をも提供している。1つの実施形態例においては、本発明の方法に従って無傷のグリコシルリンカーを介してPEGに抱合されるグリコシルトランスフェラーゼが提供されている。PEGリンカー酵素抱合体は任意選択で固体支持体に付着されている。本発明の方法における固体支持型酵素の使用は、反応混合物の練成および反応生成物の精製を単純化し、同様に酵素の容易な回収をも可能にする。グリコシルトランスフェラーゼ抱合体は、本発明の方法において利用される。酵素および支持体のその他の組合せは、当業者には明白であろう。
その他の実施形態例においては、本発明の方法は、所望の糖ペプチド抱合体の合成に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば付属酵素の触媒活性ドメインに接合されているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインで構成され得る。付属酵素触媒ドメインは、例えばグリコシルトランスフェラーゼのためのドナーであるヌクレオチド糖の形成における1工程の触媒として作用するかまたは、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応の触媒として作用することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに枠内で接合させることが可能である。このとき結果として得られる融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成のみならず、アクセプタ分子への糖部分のトランスファを触媒することができる。融合タンパク質は、1つの発現可能なヌクレオチド配列内に連結される2つ以上のサイクル酵素であり得る。その他の実施形態においては、融合タンパク質は、2つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含んでいる。例えば5,641,668号明細書を参照のこと。本発明の修飾型糖ペプチドは、さまざまな適切な融合タンパク質を利用して、容易に設計および製造され得る(例えば、1999年6月24日付けで国際公開第99/31224号パンフレットとして公開されたPCT特許出願PCT/CA98/01180号明細書を参照のこと)。
上述のプロセスによって産生される生成物は、精製せずに使用可能である。しかしながら、通常は該生成物を回収することが好まれる。薄層または厚層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたは膜ろ過といったようなグリコシル化糖類の回収のための周知の技術を使用することができる。以下でおよび本書で引用されている文献内で論述されているように、回収のためには膜ろ過、より好ましくは逆浸透膜を利用したもの、または1つ以上のカラムクロマトグラフィ技術を使用することが好ましい。例えば、グリコシルトランスフェラーゼといったようなタンパク質を除去するために、膜が約3000〜約10,000の分子量カットオフを有する膜ろ過を使用することができる。このとき、塩を除去しかつ/または生成糖類を精製するためにナノろ過または逆浸透を使用することができる(例えば国際公開第98/15581号パンフレットを参照のこと)。ナノフィルタ膜は、使用される膜に応じて約100〜約2000ダルトンよりも大きい非荷電性溶質を保持するものの一価の塩を通す逆浸透膜クラスのものである。かくして標準的な利用分野においては、本発明の方法により調製された糖類は膜内に保持されることになり、汚染性塩は通過することになる。
もう1つの態様においては、本発明は薬学組成物を提供する。薬学組成物は、薬学的に受容可能な希釈剤および、非天然発生PEG部分、治療用部分または生体分子およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間の共有結合による抱合体を内含する。ポリマー、治療用部分または生体分子は、ペプチドおよびポリマー、治療用部分または生体分子の間に介在するしその両方に共有結合によって連結された無傷のグリコシル連結基を介してペプチドに抱合される。
UDP−GalNAc−6’−CHOの調製
1mMのCuSO4溶液(20mL)および25mMのNaH2PO4溶液(pH6.0;20mL)の中にUDP−GalNAc(200mg、0.30mmoles)を溶解させた。その後ガラクトースオキシダーゼ(240U;240μL)およびカタラーゼ(13000U;130μL)を添加し、酸素が充填されたバルーンを反応系に備えつけ、7日間室温で攪拌した。反応混合物をその後ろ過し(スピンカートリッジ;MWCO5K)、ろ液(約40mL)を、必要となるまで4℃で保管した。TLC(シリカ;EtOH/水(7/2);Rf=0.77;アニスアルデヒド染色液で可視化)。
実施例2
UDP−GalNAc−6’−NH2の調製
0℃で以上からのUDP−GalNAc−6’−CHO溶液(2mLまたは約20mg)に対して、酢酸アンモニウム(15mg、0.194mmoles)およびNaBH3CN(1MのTHF溶液;0.17mL、0.17mmoles)を添加し、一晩室温まで暖めた。水を伴うG−10カラムを通して反応液をろ過し、生成物を収集した。適切な画分を凍結乾燥させ、凍結状態で保管した。TLC(シリカ:エタノール/水(7/2);Rf=0.72;ニンヒドリン試薬で可視化)。
UDP−GalNAc−6−NHCO(CH2)2−O−PEG−OMe(1KDa)の調製
DMF(6mL)とピリジン(1.2mL)中に、ガラクトサミニル−1−ホスファート−2−NHCO(CH2)2−O−PEG−OMe(1KDa)(58mg、0.045mmoles)を溶解させた。その後、UMP−モルホリダート(60mg、0.15mmoles)を添加し、48時間70℃で、結果としての混合物を攪拌した。反応混合物を通して窒素をバブリングさせることにより、溶媒を除去し、逆相クロマトグラフィにより残渣を精製した(C−18シリカ、10〜80%の間の階段勾配、メタノール/水)。所望の画分を収集し、減圧下で乾燥させて50mg(70%)の白色固体を生成した。TLC(シリカ、プロパノール/H2O/NH4OH、(30/20/2)、Rf=0.54)。MS(MALDI):計測値、1485、1529、1618、1706。
アルゴン下で無水エタノール(20L)中のL−システイン(93.7mg、0.75mmol)溶液に対し、水酸化カリウム(84.2mg、1.5mmol、粉末として)を添加した。混合物を30分間室温で攪拌し、次に、2時間にわたり複数の分量で分子質量20キロダルトン(Ts:1.0g、0.05mmol)のmPEG−O−トシラートを添加した。混合物を5日間室温で攪拌し、回転蒸発により濃縮した。残渣を水(30mL)で希釈し、室温で2時間攪拌して、いずれかの余剰の20キロダルトンmPEG−O−トシラートを破壊する。その後溶液を酢酸で中和し、pHをpH5.0に調整し、逆相クロマトグラフィ(C−18シリカ)カラム上に装てんした。メタノール/水の勾配でカラムを溶出させ(生成物は約70%のメタノールで溶出する)、生成物溶出を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を収集し水(500mL)で希釈した。この溶液をクロマトグラフィ(イオン交換、XK50Q、BIG Beads、300ml、水酸化物形態;水対水/酢酸−0.75Nの勾配)に付し、適切な画分のpHを酢酸で6.0まで低下させた。このとき、この溶液を逆相カラム(C−18シリカ)上で捕捉し、上述の通りのメタノール/水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水中で再溶解させ、凍結乾燥して453mg(44%)の白色固体を得た(1)。化合物の構造データは以下の通りであった;1H−NMR(500MHz;D2O)δ2.83(t、2H、O−C−CH 2−S)、3.05(q、1H、S−CHH−CHN)、3.18(q、1H、(q、1H、S−CHH−CHN)、3.38(s、3H、CH 3O)、3.7(t、OCH 2CH 2O)、3.95(q、1H、CHN)。生成物の純度をSDSPAGEによって確認した。
溶液が塩基性になるまで無水CH2Cl2(30mL)中に溶解した化合物1の溶液(440mg、22μmol)に対して、トリエチルアミン(約0.5mL)を滴下にて添加した。室温で1時間にわたり、複数の分量で、CH2Cl2(20mL)中の20キロダルトンのmPEG−O−p−ニトロフェニルカルボナート(660mg、33μmol)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(3.6mg、30.8μmol)の溶液を添加した。24時間にわたり、室温で反応混合物を攪拌した。その後回転蒸発により溶媒を除去し、水(100mL)中に残渣を溶解させ、1.0NのNaOHで9.5にpHを調整した。塩基性溶液を2時間室温で攪拌し、その後pH7.0まで酢酸で中和した。その後、溶液を逆相クロマトグラフィ(C−18シリカ)カラム上に装てんした。メタノール/水の勾配でカラムを溶出させ(生成物は約70%のメタノールで溶出する)、生成物溶出を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を収集し水(500mL)で希釈した。この溶液をクロマトグラフィ(イオン交換、XK50Q、BIG Beads、300ml、水酸化物形態;水対水/酢酸−0.75Nの勾配)に付し、適切な画分のpHを酢酸で6.0まで低下させた。このとき、この溶液を逆相カラム(C−18シリカ)上で捕捉し、上述の通りのメタノール/水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水中で再溶解させ、凍結乾燥して575mg(70%)の白色固体を得た(2)。化合物の構造データは以下の通りであった:1H−NMR(500MHz;D2O)δ2.83(t、2H、O−C−CH 2−S)、2.95(t、2H、O−C−CH 2−S)、3.12(q、1H、S−CHH−CHN)、3.39(s、3H、CH 3O)、3.71(t、OCH 2CH 2O)。生成物の純度をSDSPAGEによって確認した。
UDP−GalNAc−6−NHCO(CH2)2−O−PEG−OMe(1KDa)の調製
DMF(6mL)とピリジン(1.2mL)中に、ガラクトサミニル−1−ホスファート−2−NHCO(CH2)2−O−PEG−OMe(1キロダルトン)(58mg、0.045mmoles)を溶解させた。その後、UMP−モルホリダート(60mg、0.15mmoles)を添加し、48時間70℃で、結果としての混合物を攪拌した。反応混合物を通して窒素をバブリングさせることにより、溶媒を除去し、逆相クロマトグラフィにより残渣を精製した(C−18シリカ、10〜80%の間の階段勾配、メタノール/水)。所望の画分を収集し、減圧下で乾燥させて50mg(70%)の白色固体を生成した。TLC(シリカ、プロパノール/H2O/NH4OH、(30/20/2)、Rf=0.54)。MS(MALDI):計測値、1485、1529、1618、1706。
GnT1およびGalT1のワンポット内反応
6.1. ワンポット内反応
150mMのNaCl、5mMのUDP−GlcNAc、5mMのUDP−Gal、5mMのMnCl2、0.02%のアジ化ナトリウム、30mU/mLの精製GlcNAcトランスフェラーゼ−1および200mU/mLの精製ガラクトーストランスフェラーゼ−1を含有するpH6.5のMESまたはpH7.5のトリスHCl100mMの中でEPO(1mg/mL)を16時間32℃でインキュベートすることによって、ワンポットGlcNAcトランスフェラーゼ−1およびガラクトーストランスフェラーゼ−1反応を実施した。
5mL/分の流速で150mMのNaClを含有するpH6.5のMES緩衝液100mM中でスーパーデックス75カラムを平衡化した。工程6.1(上述)からのEPO生成物をカラム上に装てんし、平衡化緩衝液で溶出した。溶出液を280nmの吸収度および伝導度について監視した。プールされたどのピーク画分がEPOを含有し、さらなる実験において使用されるかを判定するのにSDS−PAGEを使用した。
150mMのNaCl、0.5mMのCMP−N−アセチル−ノイラミン酸−20キロダルトン−PEG、0.02%のアジ化ナトリウムおよび200mU/mLの精製済みST3Gal−IIIを含有するpH6.5のMESまたはpH7.5のトリスHCl100mM中で1mg/mLにEPO−Gal(以上の工程6.2からのもの)を16時間32℃でインキュベートすることにより、ST3GalIII反応を実施した。
GnT1、GalT1およびST3GalIII(CMP−NAN−20KPEGを使用)ワンポット内反応
pH6.5のMES緩衝液100mM中で糖ヌクレオチドおよびCMP−N−アセチル−ノイラミン酸−20KdPEGを伴う500mU/mLのST3GalIII、200mU/mLのガラクトーストランスフェラーゼ−1および30mU/mLのGlcNAcトランスフェラーゼ−1と共にEPO(1mg/mL)をインキュベートし、SDS−PAGEを用いて分析した。2段階酵素再編成反応中で得られた結果と同様に、1ポット3酵素調製物の中にPEG化されたEPOの3つのバンドが見られる。
2分岐PEG−EPOの産生
8.1 rEPOに対するGlcNAcの添加
pH7.2で0.1Mのトリス、0.15MのNaCl、5mMのMnCl2および0.02%のアジ化ナトリウム中のバキュロウイルス(1mg/mL)内で発現された組換え型EPOを、24時間32℃で3mMのUSP−GlcNAc、50mU/mgのGlcNAcトランスフェラーゼ−1および50mU/mgのGlcNAcトランスフェラーゼ−IIと共にインキュベートした。
3mMのUDP−Galおよび0.2U/mgのガラクトーストランスフェラーゼ−1を、工程8.1(上述)のGlcNAc標識されたペプチドに添加した。混合物を32℃で36時間インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水中のスーパーデックス75カラム上のゲルろ過クロマトグラフィによりガラクトシル化された生成物を単離した。精製された生成物を1mg/mLまで濃縮した。
pH7.2の0.1Mのトリス、0.1MのNaCl中の工程8.2(上述)からのガラクトシル化された生成物(1mg/mL)を、200mU/mgのST3GalIIIおよび0.5mMのCMPシアル酸またはCMP−シアル酸−PEG(ここでPEGは5キロダルトン、10キロダルトンまたは20キロダルトンの分子質量をもつ)と共に24時間32℃でインキュベートした。
CST−IIによるN連結型30K PEG化
CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞(5mg、0.166μmol、5ml)中で発現された状態でグリコシル化されたEPOを濃縮し、トリス緩衝液(50mMのトリス、0.15MのNaCl、0.001MのCaCl2+0.005%のNaN3)で最終体積5mlとなるまで緩衝液を交換した。次に、CMP−シアル酸−PEG(30キロダルトン、25mg、0.833μmol;30KダルトンCMP−シアル酸−PEGの構造については図3Bを参照)、0.25mLの100mMのMnCl20.25mlおよびCampylobacter jejumiからの二官能性シアリルトランスフェラーゼ(1.4U/mL、0.5ml、0.7U)を添加した。結果としての混合物を48時間32℃で揺動させた。
以下の実施例はST3GalIIIを用いてO連結型40キロダルトンPEG連結型EPOを調製するための方法を例示している。
この工程において、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)内で成長させられたEPOを脱シアリル化した。GlcNAc−Gal連結は、以下の工程10.2における修飾型シアル酸PEGのトランスファのためのアクセプタとして役立つ。
この工程では、O−シアリルトランスフェラーゼを用いて、上述の工程10.1からの脱シアリル化されたEPOへと修飾型シアル酸−PEG部分を転移する。
プロセスのこの工程においては、修飾型シアル酸残基を担持しないグリコシル構造の末端にシアル酸を添加した。
この実施例においては、ELISA検定を用いて、静脈内投与されたCHO由来のEPO(概略的表示が図5に示されている)およびCHO由来のEPOのGlycoPEG化変異体の薬物動態プロファイルを比較した。
1ウェルあたり100μLの割合で、96ウェルの平板中にヒトEPOに対する捕捉抗体を送り出した。平板を平板密封テープでカバーし、37℃で2時間インキュベートした。0.2%のTween−20(TBST)を含有するトリス−緩衝生理食塩水で2回洗浄することにより、捕捉抗体を平板から除去した。三回目の洗浄の後、平板に対し3%の牛乳遮断溶液(TBSTプラス3%の牛乳)を添加し、平板を平板密封テープでカバーし一晩4℃でインキュベートした。
各々の試験試料を希釈させ、希釈された試料を100μL/ウェルの割合でELISA平板内に送り出した。その後、平板を平板密封テープでカバーし、4℃で一晩インキュベートした。
午前中に、ラット血清試料を除去し、平板をTBSTで3回洗浄した。ユーロピウムで予め標識されゲルろ過カラムを通して精製された検出抗体、マウス抗−EPOを、ELISA平板に適用した。100rpmの攪拌下で1時間、平板を室温にてインキュベートした。
11.4a 標準線形回帰の生成
標準線形回帰曲線および等式を生成するために、各平板からの標準タンパク質由来のユーロピウム計数を使用した。等式を用いてユーロピウム計数を各試料ウェルについての等価EPO数量に転換した。
結果は、図6に示されている。検出の限界は非PEG化EPOについて約0.4ng/mL、30キロダルトンと40キロダルトンの両方のPEG化EPOについて約0.8ng/mLである。
この実施例では、ELISA検定を用いて、皮下投与されたCHO由来のエリスロポエチン(EPO)、過グリコシル化非GlycoPEG化EPO、昆虫細胞成長型GlycoPEG化EPOおよびCHO細胞由来のGlycoPEG化EPOの薬物動態プロファイルを、ELISA検定を用いて判定した。
皮下(S.C.)注入の後、等価のI.V.(静脈内)注入の場合に見られたものと比較して、循環内のEPOの量は低下した。S.C.注入したEPOタンパク質の血漿濃度を標準的に、注入から30分〜48時間の間で検出した。
これらの実験の結果は図8に示されている。図8は、各EPO変異体グループについての注入時間=0時後の異なる時点におけるラット血清試料中のng/mL単位のEPOの平均量および標準偏差を示す。検出限界は非PEG化EPOおよびPEG化EPOについて約0.3ng/mLである。
昆虫細胞内で成長させられた10KのPEG化EPO変異体は、注入から24〜36時間後の時間範囲でCmaxに達する。一方、40キロダルトンのPEG化CHO−EPO変異体は、注入後40〜60時間でCmaxに達する。さらに、現行の注入済み用量で注入後96時間で、PEG化された変異体がかなりのレベルで存在した。
40キロダルトンのPEG化されたCHO−EPO>昆虫細胞内で成長させられた10KのPEG化EPO変異体>過グリコシル化CHO−EPO>>非PEG化CHO−EPO。
2つの非PEG化EPO変異体(AおよびB)の相対的活性を、培養中のEPOレセプタ担持TF1細胞の増殖の刺激に関して、2つのGlycoPEG化変異体(30キロダルトンおよび40キロダルトンのPEG)および過グリコシル化PEGに対し比較した。この検定におけるGlycoPEG化EPOペプチドの活性は、過グリコシル化EPO変異体と類似である。
さまざまな濃度の未PEG化EPO(AおよびB)とGlycoPEG化30キロダルトンおよび40キロダルトンPEG変異体による組換え型キメラEPOレセプタに対する同位体標識されたEPOの結合の阻害。レセプタ親和性(Ki)は、未PEG化EPOおよびGlycoPEG化変異体について類似している。
Claims (34)
- 前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項9に記載のペプチド。
- 配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項10に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸残基が配列番号:1の126位のセリンである、請求項11に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項13に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸残基が、N24、N38、N83およびそれらの組合せから選択されるメンバーであるアスパラギン残基である、請求項14に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸残基がアルギニン残基である、請求項16に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸残基が、N24、N38、N83およびそれらの組合せから選択されるメンバーであるアスパラギン残基である、請求項17に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項20に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸残基が、N24、N38、N83およびそれらの組合せから選択されるメンバーであるアスパラギン残基である、請求項21に記載のペプチド。
- 生物活性を有するエリスロポエチンペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 赤血球産生活性を有する、請求項23に記載のペプチド。
- 基本的に赤血球産生活性を有しない、請求項24に記載のペプチド。
- 組織保護作用を有する、請求項25に記載のペプチド。
- 工程(a)の前に、
(b)適切な宿主中で前記基質エリスロポエチンペプチドを発現させる工程、をさらに含む、請求項27に記載の方法。 - 前記宿主が昆虫細胞および哺乳類細胞から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記昆虫細胞がヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞系列である、請求項29に記載の方法。
- 治療を必要とする対象の健康状態を治療する方法であって、前記健康状態が前記対象における赤血球産生の低下を特徴とし、前記対象における前記健康状態を改善させるのに有効な量の請求項1に記載のペプチドを、該対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記哺乳動物に対し請求項1に記載のペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物の体内での赤血球産生を増強させる方法。
- 治療を必要とする対象の組織傷害を治療する方法であって、前記傷害が虚血、外傷性障害、炎症または毒性物質との接触の結果としてもたらされた損傷を特徴とし、前記対象における組織傷害に付随する損傷を改善するのに有効な量の請求項1に記載のエリスロポエチンペプチドを、該対象に投与する工程を含む、方法。
- 請求項1に記載のエリスロポエチンペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬製剤。
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