JP2003533487A - 新しい薬剤組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
を保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン
、及び場合により1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とす
る、液体薬剤組成物に関する。この組成物は、赤血球新生に関連する疾患の予防
及び治療に特に有用である。
新生は、十分な赤血球を適正な組織の酸素供与のために利用可能にする、制御さ
れた生理学的機序である。天然ヒトエリトロポエチン(hEPO)は、腎臓にお
いて産生され、そして赤血球産生を刺激する液性の血漿因子である(Carnot, P
とDeflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432;Erslev, AJ (1953) Blood
8: 349;Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372;Jacobson, LO, Goldwasser, E,
Freid, W及びPlzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4)。天然EPOは、骨髄に
おける拘束された赤血球系始原細胞の分裂及び分化を刺激し、赤血球系前駆細胞
上の受容体に結合することによりその生物学的活性を発揮する(Krantz, BS (19
91) Blood 77: 419)。
Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, Jら (1986) Immunobiol. 72: 213-224)チ
ャイニーズハムスターの卵巣組織細胞(CHO細胞)に挿入され、かつ発現され
るクローン化ヒトEPO遺伝子の産物である。hEPOの主な完全にプロセッシ
ングを受けた形態の1次構造は、配列番号1に示されている。Cys7−Cys1 61 及びCys29−Cys33の間に2個のジスルフィド架橋が存在する。糖残基を
含まないEPOのポリペプチド鎖の分子量は、18,236Daである。未変性E
PO分子において、分子量の約40%は、タンパク質上のグリコシル化部位でタ
ンパク質をグリコシル化する、炭水化物基により占められている(Sasaki, H, B
othner, B, Dell, A及びFukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059)。
は、低いか又は不完全な赤血球産生を特徴とする血液障害の処置において有用で
ある。臨床的には、EPOは、慢性腎不全(CRF)患者における貧血の処置(
Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MRら (1987) NEJM 316: 73-78;Eschbach,
JW, Abdulhadi, MH, Browne, JKら (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992;Egrie
, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262
;Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, Dら (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-11
4)並びにAIDS及び化学療法を受ける癌患者(Danna, RP, Rudnick, SA, Abe
ls, RIの MB, Garnick編 Erythropoietin in Clinical Applications - An Inte
rnational Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.301-324)に
使用されている。
トに注射する前に復元しなければならないという不都合を有する。このため、医
療従事者による追加的な取扱いを必要とし、そしてこのことは、不便であり、か
つ製剤の誤った取扱いのリスクを負う; −これらは、ヒト血清アルブミンを添加物として含む。ヒト血清アルブミンは
、ヒト体液から誘導される製品であるため、アルブミン調剤には混入によるウイ
ルス感染のリスクが存在する。また、アレルギー反応も可能性がある; −現在市販されている全てのエリトロポエチン組成物は、高温、即ち、通常2
〜8℃の間である冷蔵庫温度より高い温度では不安定である。したがって、これ
らを、冷蔵庫(2〜8℃)内に貯蔵しなければならず、室温(およそ20℃)で
は貯蔵できない。このため、低温での貯蔵及び輸送により発生する費用がかかる
ことになり、また、薬物の取扱いにも不便を引き起こす。ここでいう不安定とは
、高温、例えば25℃での長期(即ち、数ヶ月、又は6ヶ月以上)の貯蔵が、タ
ンパク質の分解をもたらすことを意味する。ここでいう分解とは、高温(8℃超
)で優先的に起こることが知られている、タンパク質分子の物理変化(例えば、
凝集又は変性)及び化学変化(例えば、一般に化学結合の酸化又は修飾)を表現
する。タンパク質をその転移温度(融点とも呼ばれる)近く又はそれを超えてイ
ンキュベートすると、タンパク質のアンフォールディングが起こる、即ち、ポリ
ペプチドの本来の構造及び生物学的活性が失われる。転移温度は、タンパク質の
温度安定性に強く相関しており、そしてタンパク質の環境(例えば、pH、塩、イ
オン強度、緩衝剤など)に依存している。例えば、変性は、エリトロポエチン分
子の凝集、即ち、ダイマー(共有又は非共有結合)、高次凝集体そして更には微
粒子の形成をもたらす。これによって、薬物の効力が低下し、そしてヒトへの注
射後に有害な副作用を誘導することがある。
できる組成物を提供することである。
0のpHの緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により1つ以上の薬剤学
的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、薬剤組成物を提供することによ
って解決される。
2〜8℃)を超える温度、特に室温(即ち、25℃未満)そして更に高温、例え
ば、40℃でも、その安定性が改善されることが見い出された。このことは、長
期にわたり冷却することなく、活性の有意量を失うことなく、そして有意に分解
することなく、組成物を貯蔵できることを意味する。
れる種々の用語の意味と範囲を、例示及び定義するために述べられる。
有する無機アニオン、例えば、硫酸イオンSO4 2-、又はリン酸アニオン、即ち
、リン酸水素イオンHPO4 2-を意味する。多価の荷電無機アニオンは、対応す
る塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩及びこれらの混合物の形態で、及び/
又は緩衝剤、例えば、リン酸緩衝剤の形態で添加してよい。
液と混合できる溶液を意味する。塩化ナトリウム0.9%のような、血液と等張
性である溶液は、血清と同じ浸透圧を有しており、そしてこれらは、赤血球の膜
に影響を及ぼさない。一般に、血液と等張性である溶液は、約290mosm/kg
H2Oである。
、例えば、H2SO4を意味する。
の緩衝剤又は塩が、毒性の観点から許容しうることを意味する。
るか又は望ましい、医薬品中の成分を意味する。例えば、希釈剤は、注射すべき
薬物の溶解のための液体、例えば、水であってよい。
液体、例えば、水を意味する。
る物質、例えば、塩化ベンザルコニウム又はベンジルアルコールを意味する。
ドロキシル基のある任意の物質を意味する。多価アルコールは、ソルビトール、
マンニトール及びグリセロールのような化合物を含む。炭水化物は、例えば、シ
ョ糖又はトレハロースのような、ケト又はアルデヒド基を有してもよい環状分子
である。
髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を持
ち、かつヒトエリトロポエチン及び以下に定義される類似体よりなる群から選択
されるタンパク質を意味する。
用語は、後述されるような1〜3個のポリエチレン誘導体と共有結合しているエ
リトロポエチンタンパク質を意味する。
て、この目的は、液体薬剤組成物の投与を実現、支持又は促進することである。
の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷
電無機アニオン、及び場合により1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む
ことを特徴とする、液体薬剤組成物に関する。
。本発明の好ましい実施態様において、上記薬剤組成物は、等張性溶液である。
機強酸のアニオンから選択される。したがって、好ましいアニオンは、硫酸、リ
ン酸及びクエン酸イオン、好ましくは硫酸又はリン酸イオン、そして最も好まし
くは硫酸イオンからなる群から選択される。多価の荷電無機アニオンの濃度は、
10〜200mmol/lの間、例えば、硫酸アニオンでは10〜200mmol/lの間で
変化させることができる。
範囲、更に好ましくは6.0〜6.5の範囲、そして最も好ましくは約pH6.2
に維持するために使用すべき緩衝液は、有機又は無機酸の従来の緩衝液(例えば
、リン酸緩衝液、アルギニン/H2SO4/Na2SO4緩衝液、又は他の任意の薬
剤学的に許容しうる緩衝系)であってよい。好ましい実施態様において、本組成
物は、リン酸又はアルギニン/H2SO4/Na2SO4緩衝液、更に好ましくは1
0〜50mmol/lのリン酸緩衝液を含むことを特徴とする。当然ながら、これらの
緩衝系の組合せもまた、本発明の一部である。pH値は、それぞれ、対応する塩基
、例えば、リン酸緩衝系中のNaOH、及び対応する酸、例えば、アルギニン緩
衝系中の硫酸で調整することができる。
としてよい。これらの薬剤学的に許容しうる賦形剤は、薬剤学的に許容しうる塩
、希釈剤及び/又は溶媒及び/又は保存料など、例えば、張度剤(等張化剤)、
ポリオール類、酸化防止剤又は非イオン性界面活性剤から選択することができる
。これらの物質の例は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ソルビトール、マン
ニトール、グリセロール、サッカロース、トレハロース、アセチルシステイン、
ポリソルベート20、ポリソルベート80、又はプルロニックF68である。
ール、グリセロール、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択される
ポリオール(好ましくは、マンニトール)を含んでよい。ポリオールの濃度は、
1〜10%(w/v)の間で変化させることができる。
ルビン酸、好ましくはメチオニンである。酸化防止剤は、通常0.01〜0.5
%(w/v)の間の濃度、即ち、例えばメチオニンの場合には1〜20mMの濃度で
加えられる。
化剤を含むことを特徴としてよい。これらの化合物は、当該分野において知られ
ている;これらの剤の例は、塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムである。本発明
の好ましい実施態様において、本組成物は、等張性溶液である。上記組成物はま
た、ポリソルベート20、ポリソルベート80又はプルロニックF68、好まし
くはプルロニックF68のような、非イオン性界面活性剤を、例えば、1%(w/
v)以下、更に好ましくは0.1%(w/v)以下、例えば、0.001〜0.01
%(w/v)含んでもよい。
よい。
薬剤組成物の製造に特に有用である。「エリトロポエチン」又は「エリトロポエ
チンタンパク質」又は「EPO」という用語は、以下のとおりである:詳細には
、この用語は、糖タンパク質、例えば、(配列番号1)若しくは(配列番号2)
に記述されるアミノ酸配列、又は実質的にこれらと相同なアミノ酸配列を有して
おり、そしてその生物学的性質が、赤血球産生の刺激、並びに骨髄における拘束
された赤血球系始原細胞の分裂及び分化の刺激に関連する、例えば、ヒトエリト
ロポエチンを意味する。本明細書において使用されるとき、これらの用語は、例
えば、部位特異的突然変異により故意に、又は突然変異を通じて偶然に修飾され
たタンパク質を含む。これらの用語はまた、グリコシル化のための1〜6個の付
加部位を有する類似体、糖タンパク質のカルボキシル末端に少なくとも1個の追
加アミノ酸を有する類似体(ここで、追加アミノ酸は、少なくとも1個のグリコ
シル化部位を含む)、及び少なくとも1個のグリコシル化のための部位の転位を
含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。これらの用語は、天然及び組換えの両
方により産生されたヒトエリトロポエチンを含む。
周知である。エリトロポエチンとは、組織、タンパク質合成、天然又は組換え細
胞での細胞培養のような、任意の従来の供給源から得られるような、天然又は組
換えタンパク質、好ましくはヒトタンパク質を意味する。突然変異タンパク質又
は別の方法で修飾されたタンパク質のような、エリトロポエチンの活性を有する
任意のタンパク質が包含される。組換えEPOは、CHO−、BHK−又はHe
La細胞株における発現を介して、組換えDNA法により、又は内因性遺伝子活
性化により製造することができる。内因性遺伝子活性化によるものを含む、タン
パク質の発現は、当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,733,761
号、5,641,670号、及び5,733,746号、並びに国際公開第93/09222号、第94/12650
号、第95/31560号、第90/11354号、第91/06667号及び第91/09955号に開示されて
いるが、これらのそれぞれの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれ
る。エリトロポエチン糖タンパク質生成物の製造のための好ましいEPO種は、
ヒトEPO種である。更に好ましくは、EPO種は、配列番号1又は配列番号2
に記述されているアミノ酸配列、更に好ましくはアミノ酸配列:配列番号1を有
する、ヒトEPOである。
る、糖タンパク質類似体であってよい。1個以上のオリゴ糖基でのタンパク質の
グリコシル化は、ポリペプチド基本骨格に沿う特定の位置で起こり、タンパク質
安定性、分泌、細胞内局在、及び生物学的活性のような、タンパク質の物性に大
きく影響を及ぼす。グリコシル化は、通常2つのタイプがある。O結合オリゴ糖
は、セリン又はトレオニン残基に結合し、そしてN結合オリゴ糖は、アスパラギ
ン残基に結合する。N結合及びO結合両方のオリゴ糖上に見い出される1つのタ
イプのオリゴ糖は、N−アセチルノイラミン酸(シアル酸)であり、これは、9
個以上の炭素原子を含むアミノ糖のファミリーである。シアル酸は、通常N結合
及びO結合両方のオリゴ糖の末端残基であり、そしてこれは負電荷を持つため、
糖タンパク質に酸性の性質を与える。165個のアミノ酸を有するヒトエリトロ
ポエチンは、3個のN結合オリゴ糖鎖及び1個のO結合オリゴ糖鎖を含み、そし
てこれらは、糖タンパク質の全分子量の約40%を構成する。N結合グリコシル
化は、24、38、及び83位に位置するアスパラギン残基で起こり、そしてO
結合グリコシル化は、126位に位置するセリン残基で起こる。オリゴ糖鎖は、
末端シアル酸残基で修飾される。エリトロポエチンのシアル化は、肝結合タンパ
ク質による結合、及びこれに続くクリアランスを妨げるため、グリコシル化エリ
トロポエチンから全てのシアル酸残基を酵素的に除去すると、インビボ活性の消
失が起こるが、インビトロ活性は消失しない。
アミノ酸配列に1つ以上の変更を加えて、シアル酸結合のための部位の数を増加
させた、ヒトエリトロポエチンの類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は
、グリコシル化に利用可能な部位を増加させるか又は変える、アミノ酸残基の付
加、欠失、又は置換のある、部位特異的突然変異により生成することができる。
シアル酸のレベルがヒトエリトロポエチンに見い出されるそれよりも大きな糖タ
ンパク質類似体は、生物学的活性に必要な2次又は3次コンフォメーションを混
乱させない、グリコシル化部位を付加することにより生成される。本発明の糖タ
ンパク質はまた、通常N結合又はO結合部位に近接した1個以上のアミノ酸の置
換を伴う、グリコシル化部位で炭水化物結合のレベルが増加した類似体をも含む
。本発明の糖タンパク質はまた、エリトロポエチンのカルボキシル末端から伸長
する1個以上のアミノ酸を有しており、少なくとも1個の追加の炭水化物部位を
提供する類似体をも含む。本組成物のエリトロポエチンタンパク質はまた、少な
くとも1個のグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似
体をも含む。このようなグリコシル化部位の転位は、ヒトエリトロポエチンにお
ける1個以上のグリコシル化部位の欠失と1個以上の非天然グリコシル化部位の
付加を伴う。エリトロポエチン上に炭水化物鎖の数が増加し、そのためエリトロ
ポエチン分子当たりのシアル酸の数が増加すると、溶解度の増大、タンパク質分
解に対する抵抗性の増大、免疫原性の低下、血清半減期の増大、及び生物学的活
性の増大のような、有利な性質が与えられる。追加のグリコシル化部位を持つエ
リトロポエチン類似体は、更に詳細には1995年3月1日に公開されたElliot
のヨーロッパ特許出願第640,619号に開示されている。
により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を含むことを特徴とするエリトロ
ポエチン(これらに限定されない)のような、グリコシル化のための少なくとも
1個の追加部位を含むアミノ酸配列を持つエリトロポエチンタンパク質を含むこ
とを特徴とする:
により表示される対応する未修飾タンパク質(例えば、配列番号1又は配列番号
2のhEPO)の位置が、各上付の数の直前にあるアミノ酸に変更されているこ
とを意味する。
くとも1個の追加のアミノ酸を有する類似体であってもよい(ここで、追加のア
ミノ酸は、少なくとも1個のグリコシル化部位を含む)。追加のアミノ酸は、ヒ
ト絨毛性ゴナドドロピンのカルボキシル末端から誘導されるペプチド断片を含ん
でいてもよい。好ましくは、この糖タンパク質は、(a)カルボキシル末端から
伸長する、アミノ酸配列:Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln(配列番
号3)を有する、ヒトエリトロポエチン;(b)更にSer87 Asn88 Thr90 EPO
を含むことを特徴とする(a)における類似体;及び(c)更にAsn30 Thr32 Va
l87 Asn88 Thr90 EPOを含むことを特徴とする(a)における類似体よりなる
群から選択される類似体である。
部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体であってもよい。転位は、ヒトエ
リトロポエチンにおけるN結合炭水化物部位のいずれかの欠失、及びヒトエリト
ロポエチンのアミノ酸配列の88位のN結合炭水化物部位の付加を含むことを特
徴としてよい。好ましくは、この糖タンパク質は、Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 E
PO;Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO;及びGln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO
よりなる群から選択される類似体である。
のPEG化誘導体を含んでもよい。エリトロポエチンのPEG化誘導体及びその
製造法は、当該分野において知られており、例えば、EP-A-539,167、EP-A-605,9
63、WO 93/25212、WO 94/20069、WO 95/11924、米国特許第5,56号、EP-A-584,87
6、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、米国特許第5,359,030号及び5,681
,811号、米国特許第4,179,337号、日本特許、WO 98/32466、米国特許第5,324,65
0号に記載されている。PEG化エリトロポエチン種の好ましい実施態様は、後
述のような誘導体に当てはまる。
複合体は、少なくとも1個の遊離アミノ酸を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及
び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有する、上述のようなエ
リトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とし、そしてヒトエリトロポエチン
及びその類似体(1〜6個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも1個のグリ
コシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する)よ
りなる群から選択され;該エリトロポエチンは、式:−CO−(CH2)x−(O
CH2CH2)m−ORで示される「n」個のポリ(エチレングリコール)基に共
有結合しており、各ポリ(エチレングリコール)基の−CO(即ち、カルボニル
)は、該アミノ基の1個とアミド結合を形成する(ここで、Rは、低級アルキル
であり;xは、2又は3であり;mは、約450〜約900であり;nは、1〜
3であり、そしてn及びmは、複合体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し
引いた分子量が、20キロダルトン〜100キロダルトンであるように選択され
る)。本発明は更に、nが1である複合体の百分率が、組成物の全ての複合体の
少なくとも90パーセント、好ましくは少なくとも92パーセント、更に好まし
くは96パーセントである、本明細書に記載される複合体を含む薬剤組成物を提
供する。
生物学的活性を有する、本明細書に記載されるエリトロポエチンタンパク質の残
基(即ち、式(I)に示されるカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を含
まない)であり;そしてRは、低級アルキルであり;xは、2又は3であり;m
は、約450〜約900であり;nは、1〜3であり;そしてn及びmは、複合
体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し引いた分子量が、20キロダルトン
〜100キロダルトンであるように選択される〕により表される。
を有する、直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチ
ル、エチル及びイソプロピルを含む。本発明では、Rは、任意の低級アルキルで
ある。Rがメチルである複合体が好ましい。
(OCH2CH2)の数を表す。エチレンオキシドの単一のPEG(ポリエチレン
グリコール)サブユニットは、約44ダルトンの分子量を有する。即ち、複合体
の分子量(EPOの分子量を除く)は、「m」という数に依存する。本発明の複
合体において、「m」は、約450〜約900(約20kDa〜約40kDaの分子量
に対応する)、好ましくは約650〜約750(約30kDaの分子量に対応する
)である。mという数は、得られる本発明の複合体が、未修飾EPOに匹敵する
生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応する未修飾EPO
の活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分であろう。「約」
ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数の合
理的範囲に入ることを意味する。「m」という数は、エリトロポエチン糖タンパ
ク質に共有結合している各ポリ(エチレングリコール)基の分子量が、約20kD
a〜約40kDaであり、そして好ましくは約30kDaであるように選択される。
遊離アミノ基(リシンアミノ酸のε−アミノ基及び/又はアミノ末端アミノ基を
含む)にアミド結合を介して共有結合しているポリ(エチレングリコール)基の
数である。本発明の複合体は、EPOの1分子当たり、1個、2個、又は3個の
PEG基を有してよい。「n」は、1〜3の範囲の整数であり、好ましくは「n
」は、1又は2であり、そして更に好ましくは「n」は1である。上述の複合体
の好ましい複合体は、xが2であり、mが650〜750であり、nが1であり
、そしてRがメチルである、化合物を含むことを特徴とする。
糖タンパク質と縮合することにより、既知の重合性物質から製造することができ
る。xが3である、式(II)の化合物は、ポリ(エチレングリコール)のα−低
級アルコキシ、酪酸スクシンイミジルエステル(低級アルコキシ−PEG−SB
A)である。xが2である、式(II)の化合物は、ポリ(エチレングリコール)
のα−低級アルコキシ、プロピオン酸スクシンイミジルエステル(低級アルコキ
シ−PEG−SPA)である。活性化エステルをアミンと反応させてアミドを形
成する、任意の従来法を利用することができる。上述の反応において、例示され
るスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす脱離基である。タンパ
ク質との複合体を生成するための式(II)の化合物のようなスクシンイミジルエ
ステルの使用は、1997年9月30日発行の米国特許第5,672,662号(Harris
ら)に開示されている。
ン残基のε−アミノ基を含む。PEG化試薬を式(II)のSBA化合物と化合さ
せると、pH7.5、1:3のタンパク質:PEG比、及び20〜25℃の反応温
度で、モノ−、ジ−、及び痕跡量のトリ−PEG化種の混合物が生成したことが
判った。PEG化試薬が式(II)のSPA化合物であるとき、タンパク質:PE
G比が1:2であることを除いて同様の条件で、主としてモノ−PEG化種が生
成した。PEG化EPOは、混合物として、又はカチオン交換クロマトグラフィ
ーで分離した異なるPEG化種として投与することができる。反応条件(例えば
、試薬の比、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間など)を操作することにより
、異なるPEG化種の相対量を変化させることができる。
胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、
そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体(1〜6個のグリコシル化部位の付
加により修飾されたヒトエリトロポエチンの1次構造を有する)よりなる群から
選択される、上記と同義のエリトロポエチンタンパク質を含んでもよく;該糖タ
ンパク質は、1〜3個の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基と共有結
合しており、各ポリ(エチレングリコール)基は、リンカーである式:−C(O
)−X−S−Y−〔ここでリンカーのC(O)は該アミノ基の1個とアミド結合
を形成し、Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−CH2)k−であり、
kは、1〜10であり、Yは、下記式:
コール)残基の平均分子量は、約20キロダルトン〜約40キロダルトンであり
、そして複合体の分子量は、約51キロダルトン〜約175キロダルトンである
。
プロピルなどのような、1〜6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のアルキル基
を意味する。好ましいアルキルは、メチルである。Xは、−(CH2)k−又は−
CH2(O−CH2−CH2)k−であってよく、ここで、kは、1〜約10である
。好ましくは、kは、1〜約4であり、更に好ましくは、kは、1又は2である
。最も好ましくは、Xは、−(CH2)である〕により表されてもよい。
POに匹敵する生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応す
る未修飾EPOの活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分で
あろう。mは、PEG単位中のエチレンオキシド残基の数を表す。−(OCH2
CH2)−の単一のPEGサブユニットは、約44ダルトンの分子量を有する。
即ち、複合体の分子量(EPOの分子量を除く)は、mという数に依存する。「
約」ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数
の合理的範囲に入ることを意味する。mは、約450〜約900(20〜40kD
aの分子量に対応する)の範囲の整数であり、好ましくはmは、約550〜約8
00(約24〜35kDa)であり、そして最も好ましくはmは、約650〜約7
00(約29〜約31kDa)である。
合しているエリトロポエチンタンパク質中のリシンアミノ酸のε−アミノ基の数
である。本発明の複合体は、EPOの1分子当たり、1個、2個、又は3個のP
EG単位を有していてよい。nは、1〜3の範囲の整数であり、好ましくはnは
、1又は2であり、そして更に好ましくはnは、1である。
Rは、低級アルキルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−C
H2)k−であり、そしてPは、Xとのアミド結合を形成するアミノ基を含まない
エリトロポエチン糖タンパク質の残基である〕により表される。
ンアミノ酸のε−アミノ基を、式:Z−CO−X−S−Qにより表される二官能
性試薬と共有結合で反応させて、下記式:
質であり;nは、1〜3の範囲の整数であり;Zは、反応性基、例えば、カルボ
ン酸−NHSエステルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−
CH2)k−(ここで、kは、1〜約10である)であり;そしてQは、アルカノ
イル(例えば、アセチル)のような保護基である〕により表されるアミド結合を
持つ中間体を形成すること。
で反応させて、下記式:
の範囲の整数であり;Rは、低級アルキルであり;そしてYは、上記と同義であ
る〕により表されるエリトロポエチン糖タンパク質生成物を形成すること。
−アセチルチオプロピオナート又はN−スクシンイミジル−S−アセチルチオア
セタートであり、Zは、好ましくはN−ヒドロキシ−スクシンイミドであり、そ
して活性化ポリ(エチレングリコール)誘導体:W−〔OCH2CH2〕m−OR
は、好ましくはヨード−アセチル−メトキシ−PEG、メトキシ−PEG−ビニ
ルスルホン、及びメトキシ−PEG−マレイミドよりなる群から選択される。
ール基の共有結合(「活性化」)及び得られた活性化EPOとポリ(エチレング
リコール)(PEG)誘導体とのカップリングにより製造することができる。本
発明のPEG化EPOの製造のための第1工程は、EPOのNH2基を介しての
チオール基の共有結合形成を特徴とする。このEPOの活性化は、保護チオール
基と、活性エステル(例えば、スクシンイミジルエステル)、無水物、スルホン
酸のエステル、それぞれカルボン酸及びスルホン酸のハロゲン化物のような追加
の反応性基とを持つ二官能性試薬により実施される。チオール基は、当該分野に
おいて既知の基(例えば、アセチル基)により保護される。これらの二官能性試
薬は、アミド結合を形成することにより、リシンアミノ酸のε−アミノ基と反応
することができる。反応の第1工程は、以下に記述される:
の反応性基、例えば、下記式:
ル残基を有する二官能性試薬との反応により実施される。二官能性試薬は、異な
るスペーサー種、例えば、−(CH2)k−又は−CH2−(O−CH2−CH2−
)k−残基(ここで、kは、1〜約10、好ましくは1〜約4、そして更に好ま
しくは1又は2、そして最も好ましくは1である)を持っていてよい。
(SATP)、N−スクシンイミジル−S−アセチルチオアセタート(SATA
)又はアセチルチオアルキル−カルボン酸−NHS−エステル
オ)−(エトキシ)k−酢酸−NHS−エステルの前駆体は、DE-3924705に記載
されており、一方アセチルチオ化合物への誘導は、March, J., Advanced Organi
c Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376に記載されている。SATAは、市
販されている(モレキュラープローブス(Molecular Probes)、ユージーン、オ
レゴン州、米国及びピアース(Pierce)、ロックフォード、イリノイ州)。
ク質(EPO)濃度及びタンパク質/二官能性試薬比を調整することにより、選
択することができる。好ましくは、EPOは、EPO1分子当たり1〜5個のチ
オール基、更に好ましくはEPO分子当たり1.5〜3個のチオール基を共有結
合させることにより活性化される。これらの範囲は、EPOタンパク質集団全体
にわたるチオール基の統計的分布に関する。
のリン酸カリウム、50mMのNaCl(pH7.3)中で行われる。二官能性試薬
は、DMSO中に加えられる。反応の終了後、好ましくは30分後、反応は、リ
シンの添加により停止される。過剰の二官能性試薬は、当該分野において既知の
方法により、例えば、透析又はカラム濾過により分離される。EPOに付加した
チオール基の平均数は、例えば、Grasetti, D.R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Bio
chem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967)に記載されている光度測定法により求め
ることができる。
有結合のカップリングが行われる。適切なPEG誘導体は、約20〜約40kDa
、更に好ましくは約24〜約35kDa、そして最も好ましくは約30kDaの平均分
子量を持つ活性化PEG分子である。
M.ら, J. Bioconj. Chem. (1996) 7, page 363以下にPEG−ビニルスルホンに
関して報告されている。直鎖及び分岐鎖PEG種は、式(I)の化合物の製造に
適している。反応性PEG試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−PEG及
びメトキシ−PEG−ビニルスルホンである:
えば、Hermanson, G.T.のBioconjugate Techniques, Academic Press, San Dieg
o (1996) p.147-148に記載されている。
00;シアウォーターポリマー社(Shearwater Polymers, Inc.))のような(
アルコキシ−PEG−マレイミド)を用いて、マレイミドにより活性化される。
アルコキシ−PEG−マレイミドの構造は、下記式:
は下記式:
ば、10mMのリン酸カリウム、50mMのNaCl、2mMのEDTA(pH6.2)
中でのチオール保護基のインサイチューの開裂後に起こる。保護基の開裂は、例
えば、25℃、pH6.2で約90分間、DMSO中でヒドロキシルアミンにより
実施することができる。PEG修飾には、活性化EPO/アルコキシ−PEG−
マレイミドのモル比は、約1:3〜約1:6、そして好ましくは1:4であるべ
きである。反応は、システインの添加、及び残りのチオール(−SH)基とN−
メチルマレイミド又はジスルフィド結合を形成することができる他の適切な化合
物との反応により停止することができる。任意の残りの活性チオール基と、N−
メチルマレイミドのような保護基又は他の適切な保護基との反応のため、本発明
の複合体中のEPO糖タンパク質は、このような保護基を含んでいてもよい。一
般に、本明細書に記述される手順では、PEG−マレイミドと複合体形成しない
糖タンパク質上の活性化チオール基の数に依存して、異なる数の保護基により保
護された種々の数のチオールを有する分子の混合物が生成する。
クするのに使用されるとき、同じタイプの共有結合を形成するが、ジスルフィド
化合物は、分子間スルフィド/ジスルフィド交換反応において、ブロッキング試
薬のジスルフィド架橋カップリングをもたらす。この型のブロッキング反応に好
ましいブロッキング試薬は、酸化型グルタチオン(GSSG)、システイン及び
シスタミンである。システインでは、PEG化タンパク質に追加の正味の電荷は
導入されないが、ブロッキング試薬のGSSG又はシスタミンの使用により追加
の負又は正電荷が生じる。
の更なる精製は、当該分野において既知の方法、例えば、カラムクロマトグラフ
ィーにより行われる。
0%のモノ−PEG複合体、即ち、nが1である複合体を含み、実施例5に示さ
れるように製造することができる。通常、ジ−PEG複合体よりも高い活性を有
する傾向があるため、エリトロポエチン糖タンパク質のモノ−PEG複合体が望
ましい。モノ−PEG複合体の百分率、更にはモノ−及びジ−PEG種の比は、
溶出ピークの周りのより広い画分をプールしてモノ−PEGの百分率を低下させ
るか、又は狭い画分をプールして組成物中のモノ−PEGの百分率を増大させる
ことにより、制御することができる。約90パーセントのモノ−PEG複合体は
、収量と活性が良好に均衡している。時として、例えば、少なくとも92パーセ
ント又は少なくとも96%の複合体がモノ−PEG種(nは1に等しい)である
組成物が望まれることがある。本発明の実施態様において、nが1である複合体
の百分率は、90%〜96%である。
ポエチンタンパク質を含むことを特徴としてよい。好ましくは、本組成物は、1
ml当たり10〜1000μg、例えば、10、50、100、400、800又
は2500μgを含むことを特徴とする。
チンタンパク質、10〜200mmol/lの硫酸塩、10〜50mmol/lのリン酸塩(
pH6.0〜6.5)を含むことを特徴としてよい。この組成物はまた、20mM以
下のメチオニン、1〜5%のポリオール(w/v)、0.1%以下のプルロニック
F68(w/v)及び場合により1mM以下のCaCl2を含むことを特徴としてよい
。この組成物の一例は、1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチン
タンパク質、40mmol/lの硫酸塩、10mmol/lのリン酸塩、3%のマンニトール
(w/v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)(pH6
.2)を含むことを特徴とする。
000μgのエリトロポエチンタンパク質、10〜100mmol/lのNaCl、1
0〜50mmol/lのリン酸塩(pH6.0〜7.0)、場合により1〜5%(w/v)
のポリオールを含むことを特徴としてよい。更に、この組成物は、20mM以下の
メチオニン、0.1%以下のプルロニックF68(w/v)及び場合により7.5
μmol/lのCaCl2を含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、
1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタンパク質、100mmol
/lのNaCl、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)
、及び10mmol/lのリン酸塩(pH7.0)を含むことを特徴としてよい。
ク質、10〜50mmol/lのアルギニン(pH6〜pH6.5)、10〜100mmol/l
の硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、上記組成物に関する。更に、この組
成物は、20mM以下のメチオニン、0.1%以下のプルロニックF68(w/v)
、場合により1mmol/l以下のCaCl2及び場合により1〜5%(w/v)のポリオ
ールを含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、1ml当たり10
μg〜10000μgのエリトロポエチンタンパク質、40mmol/lのアルギニン(
pH6.2)、30mmol/lの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール(w/v)、10m
Mのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)及び場合により1mmol
/lのCaCl2を含むことを特徴としてよい。
好ましくは25〜2500μg/mlのエリトロポエチンと、 a)10mMのリン酸ナトリウム/カリウム、100mMのNaCl(pH7.0)
又は b)10mMのリン酸ナトリウム、120mMの硫酸ナトリウム(pH6.2)又は c)10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトー
ル(w/v)(pH6.2)又は d)10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトー
ル(w/v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)(pH
6.2)又は e)40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール(w/
v)(pH6.2)又は f)40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール(w/
v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)(pH6.2
) とを含むことを特徴とする組成物に関する。
又は2500μg/mlの量のエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする
。最も好ましい組成物は、10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム
、3%のマンニトール(w/v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニッ
クF68(w/v)(pH6.2)、又は40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリ
ウム、3%のマンニトール(w/v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロ
ニックF68(w/v)(pH6.2)のいずれかを含むことを特徴とする。
組成物に関する。本組成物は、溶媒、例えば水の添加により復元して液体溶液を
生成するか、又は例えば吸入装置若しくは経皮投与装置により直接適用すること
ができる。
場合により上記と同義の1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特
徴とする溶液と混合することを特徴とする、上述の組成物の製造方法を含むこと
を特徴とする。
た疾患の治療及び予防、及び/又は化学療法を受ける癌患者の治療に有用な医薬
の製造のための、上記と同義の組成物の使用に関する。これは、患者に上記と同
義の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、慢性腎不全(CRF)患者
における貧血、AIDS及び化学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び
予防のための方法を含む。
局所及び全身性の持続放出のための装置に関する。これは、例えば、ポリマー基
剤のマイクロ−又はナノ粒子のような、上述の組成物を含むことを特徴とする、
エリトロポエチンの制御放出を提供する任意の種類のインプラントであってよい
。上述の組成物はまた、充填済みシリンジとして、又は例えば、無針注射装置若
しくは吸入装置のような、他の任意の投与装置に入れて提供することができる。
きる。他方では、本発明の組成物は、液体又は固体のいずれかの形状で貯蔵する
ことができ、後で静脈内又は注射投与のために単位用量剤形に分割することがで
きる。したがって、本発明の液体組成物は、投与のための単回用量剤形としての
使用のために0.3mlという少量で与えることができる。他方では、特許請求さ
れる組成物の容量は、分配される前に一括投与剤形で貯蔵されるときに、60リ
ットルという多量であってもよい。その安定性の強化という観点から、本発明の
組成物は、後で医師、患者及び病院に分配するのに適した包装手段に配置される
ように、大きな容器で貯蔵することができる。
として投与できるシリンジのような従来の注射手段により投与することができる
。他方では、本発明の組成物は、本組成物を凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末の
いずれかとして含むアンプルを利用して、次にこれを注射の前に従来法で復元し
て、注射により投与することができる。他方では、本発明の組成物の安定性のた
め、組成物は、約0.3ml〜約10mlの本組成物を含むバイアルのような、単位
用量剤形に分配してもよい。更に、本発明の組成物は、点滴バッグを利用して静
脈内投与することができる。このようなバッグは、溶液が患者に投与される時間
に依存して、約20ml〜約500mlの溶液を含む。本発明では、本発明の液体溶
液を貯蔵容器に貯蔵することができ、そこから更に、医師、病院及び患者への分
配のための少量の投与剤形のパッケージに分割することができる。本発明の組成
物の安定性のため、これらの組成物は、投与前に長期にわたってこのような貯蔵
容器に貯蔵することができる。
の出発点としてのエリトロポエチンの製造法は、例えば、米国特許第5,547,933
号及び5,621,080号、EP-B 0,148,605、Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1984) 2708-2712、EP-B 0,205,564、EP-B 0,209,539及びEP-B 0,411,678更
にはLai, P.H.ら, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、及びSasaki, H.ら,
J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076に詳細に記載されている。治療用途の
エリトロポエチンは、組換え法により産生してもよい(EP-B 0,148,605、EP-B 0
,209,539及びEgrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J.ら, (1986) Immunobiol
. 72: 213-224)。
996年11月14日公開のBurgのWO 96/35718、及び1992年6月12日公
開のKochのヨーロッパ特許公開第513,738号に記載されている。上述の刊行物に
加えて、EPO遺伝子を含む組換えCHO細胞の無血清発酵を実施できることは
公知である。このような方法は、例えば、EP-A 0,513,738、EP-A 0,267,678に、
そして一般的な形でKawamoto, T.ら, Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453
、EP-A 0,248,656、Kowar, J.とFranek, F., Methods in Enzymology 421 (1986
) 277-292、Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51、EP-A 0,481,791、EP-
A 0,307,247、EP-A 0,343,635、WO 88/00967に報告されている。
C8カラムでの分取逆相HPLC及びゲル濾過クロマトグラフィーが、透析後の
無血清培養で産生したEPOの精製のために記載されている。これに関連して、
ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、S−セファロース・ファストフローでのイ
オン交換クロマトグラフィーに置き換えることができる。また、ブルー・トリス
アクリル(Blue Trisacryl)カラムでの色素クロマトグラフィーをイオン交換ク
ロマトグラフィーの前に行うことが提案されている。
90) 352-359に記載されている。しかしこのプロセスでは、EPOは、精製工程
の前に、トゥイーン(登録商標)20、フッ化フェニルメチルスルホニル、エチ
ルマレイミド、ペプスタチンA、硫酸銅及びオキサミド酸で処理される。199
6年11月14日公開のBurgのWO 96/35718を含む刊行物は、無血清発酵プロセ
スでのエリトロポエチン(EPOsf)の製造方法を開示している。
測定法により測定することができる。本発明の精製EPOタンパク質の生物学的
活性とは、ヒト患者に注射によりEPOタンパク質を投与すると、注射していな
い、即ち対照群の被験者に比べて、骨髄細胞からの網状赤血球及び赤血球の産生
が増大するというものである。本発明により入手及び精製される、EPOタンパ
ク質、又はその断片の生物学的活性は、Annableら, Bull. Wld. Hlth. Org. (19
72) 47: 99-112及びPharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997
(2)による方法によって試験することができる。EPOタンパク質の活性を測定
するための別の生物学的検定法である、正赤血球血マウス検定法は、実施例6に
記載されている。
を限定はしない)を参照することにより更に理解が深まる。
titute))に開示されている、ATCC CRL8695を使用できる)に由来
する、1バイアルのワーキング・セル・バンクを液体窒素貯蔵タンクのガス相か
ら取り出した。細胞をガラススピナーフラスコに移して、炭酸水素緩衝培地で加
湿CO2インキュベーター中で培養した。接種物調製及び発酵のために使用した
典型的な無血清培地は、1992年6月12日に公開のKochのヨーロッパ特許出
願513,738、又は1996年11月14日に公開のBurgのWO 96/35718に開示され
ており、例えば、培地としてDMEM/F12(例えば、JRHバイオサイエン
シーズ(JRH Biosciences)/ヘーズルトン・バイオロジックス(Hazleton Biol
ogics)、デンバー、米国、注文番号57−736)を、そして追加的に炭酸水
素ナトリウム、L−グルタミン、D−グルコース、組換えインスリン、亜セレン
酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄(II)、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、セリン、及び例えば、ポリビニルアルコールのような哺乳
動物細胞用の安定化剤、メチルセルロース、ポリデキストラン、ポリ(エチレン
グリコール)、プルロニックF68、血漿増量剤のポリジェリン(polygelin)
(ヘムアクセル(HEMACCEL)(登録商標))又はポリビニルピロリドン(WO 96/
35718)を含む。
求めた。これらの試験は、各分離工程で実施した。
1周の増殖周期を経させた。ガラススピナーフラスコ当たり約2lの培養物容量
が得られるまで、この手順を繰り返した。約12倍加後、1〜5リットルのこの
培養物が得られ、次にこれを10l接種物発酵槽のための接種物として使用した
。
物として使用することができた。
のための接種物として使用することができた。
0%の培養物を回収した)。残りの培養物に新鮮培地を補充して、次の回収まで
培養した。1回の生産運転は、最大10回の二次回収:9回の部分回収及び発酵
の最後の1回の全体回収からなる。回収は3〜4日毎に行った。
り出して、廃棄した。遠心分離工程のEPO含有上清をインライン濾過して、第
2の冷却容器に回収した。各回収物は、精製の間、別々に処理した。
日に公開のBurgのWO 96/35718に開示されている。精製プロセスを、以下に説明
する。
色素(Cibacron blue dye)を共有結合する、セファロースビーズよりなる。E
POは、多くの非タンパク質性混入物、幾つかのタンパク質性不純物及びPVA
よりもブルーセファロースに強く結合するため、この工程でEPOを濃縮するこ
とができる。ブルーセファロースカラムの溶出は、pHと同様に塩濃度を上昇させ
ることにより実施される。
て、平衡化緩衝液(塩化ナトリウム/カルシウム及び酢酸ナトリウム)で平衡化
した。酸性にして濾過した発酵槽上清を添加した。添加の終了後、カラムは、最
初に高濃度塩化ナトリウムを含む、平衡化緩衝液と類似した緩衝液で洗浄し、続
いてトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、トリス塩基緩衝液で溶出して、マ
スター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。
ル残基を共有結合でカップリングしている、ポリスチレン系マトリックスである
。EPOは、多くの不純物及びPVAよりもこのゲルに強く結合するため、イソ
プロパノールを含む緩衝液で溶出しなければならない。
し、トリス塩基緩衝液で洗浄して、イソプロパノールを含むトリス塩基緩衝液で
平衡化した。
度に調整して、カラムに添加した。次にカラムを、イソプロパノール濃度が上昇
した平衡化緩衝液で洗浄した。生成物は、溶出緩衝液(イソプロパノール含量が
高いトリス塩基緩衝液)で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分
で回収した。
グラフィー ヒドロキシアパタイトウルトロゲル(バイオセプラ(Biosepra))は、機械的
性質を改善するため、アガロースマトリックスに組み込まれた、ヒドロキシアパ
タイトよりなる。EPOは、ヒドロキシアパタイトに対して低い親和性を持ち、
このためタンパク質不純物よりも低いリン酸濃度で溶出され得る。
酸カリウム/塩化カルシウム緩衝液及びNaOH、続いてトリス塩基緩衝液で再
生した。次にこれを、少量のイソプロパノールと塩化ナトリウムを含むトリス塩
基緩衝液で平衡化した。
。続いてカラムを平衡化緩衝液、及びイソプロパノールと塩化ナトリウムを含ま
ないトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、低濃度のリン酸カリウムを含むト
リス塩基緩衝液で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収し
た。
カゲル粒子からなり、そしてその表面にC4−アルキル鎖を持つ。タンパク質性
不純物からのEPOの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、希
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配により実施した。
クC4シリカゲルを充填)を用いて実施した。ヒドロキシアパタイトウルトロゲ
ル溶出液は、トリフルオロ酢酸を加えて酸性にし、ヴァイダックC4カラムに添
加した。洗浄及び溶出のために、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を
使用した。画分を回収して、直ちにリン酸緩衝液で中和した。IPC限界内のE
PO画分をプールした。
ビーズの表面に共有結合したジエチルアミノエチル(DEAE)基からなる。D
EAE基へのEPOの結合には、イオン相互作用が介在する。アセトニトリル及
びトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質を
洗浄した後、低pHの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより痕跡不純物を除去
した。次にカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄して、イオン強度の高い緩衝液でE
POを溶出した。
〜10mgEPO/mlゲルの範囲のEPO添加量を確保するために調整した。カラ
ムを水及び平衡化緩衝液(リン酸ナトリウム/カリウム)で洗浄した。HPLC
溶出液のプール画分を添加して、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄した。次にカラム
を洗浄緩衝液(酢酸ナトリウム緩衝液)で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄し
た。次いで、溶出緩衝液(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム/カリウム)でE
POをカラムから溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収し
た。
薬物は、無菌濾過によりテフロン(登録商標)瓶に入れて、−70℃で貯蔵した
。
定すると均質であり、8個のアイソホームよりなる典型的なアイソホームパター
ンを示した。これは、正赤血球血マウス検定法により測定すると190,000
IU/mgの生物学的比活性であった。使用したPEG化試薬は、メトキシ−PEG
−SBAであったが、これは、Rが、メチルであり;xが、3であり;そしてm
が、650〜750(平均約680、約30kDaの平均分子量に対応する)であ
る、式(II)の化合物である。
1ml、5.48μmol)に、30kDaメトキシ−PEG−SBA 506mg(16
.5μmol)(シアウォーターポリマー社(Shearwater Polymers, Inc.)、ハン
ツヴィル、アラバマ州から入手)を含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.
5)10mlを加え、室温(20〜23℃)で2時間混合した。最終タンパク質濃
度は、5mg/mlであり、タンパク質:PEG試薬比は、1:3であった。2時間
後、氷酢酸でpHを4.5に調整することにより反応を停止させて、精製の準備が
できるまで−20℃で貯蔵した。
プロピルカチオン交換樹脂)約28mlをアミコン(AMICON)ガラスカラム(2.
2×7.5cm)に詰めて、20mMの酢酸緩衝液(pH4.5)で150ml/時の流
量で平衡化した。タンパク質30mgを含む反応混合物6ミリリットルを平衡化緩
衝液で5倍希釈して、カラムに適用した。非吸着物質を緩衝液で洗い流して、吸
着PEG複合体混合物をカラムから、平衡化緩衝液中の0.175MのNaCl
で溶出した。なおもカラムに残る未修飾EPOsfは750mMのNaClで溶出
した。カラムは、開始緩衝液中で再平衡化した。試料をSDS−PAGEにより
分析して、そのPEG化の程度を測定した。0.175MのNaCl溶出液は、
モノ−更にはジ−及び痕跡量のトリ−PEG化種を含んでいたが、一方750mM
のNaCl溶出液は、未修飾EPOsfを含んでいたことが判った。
出した精製複合体混合物を、緩衝液で4倍希釈して、カラムに再適用して、前述
のように洗浄した。ジ−PEG−EPOsf及びモノ−PEG−EPOsfを、
それぞれ0.1MのNaCl及び0.175MのNaClで別々にカラムから溶
出した。残りの未修飾EPOsfも全て溶出するために、750mMのNaClで
も溶出を実施した。
ムに適用した(≒0.5mgタンパク質/mlゲル)。カラムを洗浄して、吸着した
モノ−PEG−EPOsf、ジ−PEG−EPOsf及び未修飾EPOsfを前
セクションに記載されたように溶出した。
複合体形成することにより合成した。PEG−EPOsfは、アミド結合が生じ
る、EPOsfの第1級アミノ基と30kDaのPEG−酪酸のスクシンイミジル
エステル誘導体との間の反応から誘導した。
より測定すると、モノ−及びジ−PEG−EPOsfよりなり、そして未修飾E
POsfを含まなかった。複合体混合物は、23.4mg、即ち出発物質の78%
を占めた。モノ−及びジ−PEG−EPOsfのカチオン交換クロマトグラフィ
ーによる分離は、複合体混合物中のモノ−対ジ−PEG比が、ほぼ1:1である
ことを示した。反応の終了後、モノ:ジ:未修飾の個々の成分の比は、40:3
8:20(%)であった。総収量は、ほぼ定量的であった。
PEG−SPA(シアウォーターポリマー社(Shearwater Polymers, Inc.)、
ハンツヴィル、アラバマ州)と反応させた。反応は、1:2のタンパク質:試薬
比で実施して、精製法は、実施例2によった。主としてモノ−PEG化種が生成
した。
を開示する。条件を決定するために、ブロック化チオール基を含む異なる量の試
薬(ここではSATA又はSATP(10mg/mlまでDMSOに溶解))をEP
O溶液(ここでは、10mMのリン酸カリウム、50mMのNaCl(pH7.3)中
の5mg/mlのEPO 1ml)に加えた。反応物を約30分間撹拌(25℃)して
、1Mリシン溶液を10mMで加えることにより反応を停止させた。過剰量のSA
TA及びSATPは、10mMのリン酸カリウム、50mMのNaCl及び2mMのE
DTA(pH6.2)に対する透析によって除去した。ヒドロキシルアミンでの保
護アセチル基の除去後、EPOに共有結合したチオール基の数を、Grasetti, D.
R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, page 41-49 (1967)に
記載された方法によって、ジチオジピリジンで光度測定法により求めた。
定すると190,000IU/mg)を実施例4によりSATA(モル比:EPO/
SATA=1/5)で活性化した。共有結合したブロック化チオール基を有する
生じたEPO(「活性化EPO」)を、実施例4に記載されるように透析により
、N−ヒドロキシ−スクシンイミドのような副産物又は未反応SATAから分離
した。10mMのリン酸カリウム、50mMのNaCl、2mMのEDTA(pH6.2
)中の4.5mg/mlの活性化EPOの溶液を得た。
(MW30,000;シアウォーターポリマー社(Shearwater Polymers, Inc.
)、ハンツヴィル、(アラバマ州、米国))を活性化EPO95mgを含む上記溶
液(10mMのリン酸カリウム、50mMのNaCl、2mMのEDTA(pH6.2)
中に4.5mg/ml)に溶解した。溶液中の活性化EPOとメトキシ−PEG−マ
レイミドの間の得られたモル比は、1:4であった。1Mのヒドロキシルアミン
水溶液を30mM(pH6.2)まで上記溶液に加えることにより、活性化EPOの
共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。溶液の反応混合物中の得
られた活性化EPOは、遊離チオール(−SH)基を含んでいた。チオール基の
脱ブロッキング後直ちに、今や遊離チオール(−SH)基を含む活性化EPOと
メトキシ−PEG−マレイミドの間で90分間(撹拌、25℃)カップリング反
応を行った。カップリング反応は、0.2Mのシステイン水溶液を2mMまで反応
混合物に加えることにより停止させた。30分後、メトキシ−PEG−マレイミ
ドと反応しなかった活性化EPOの過剰な遊離チオール基を、DMSO中の0.
5MのN−メチルマレイミド溶液を5mMの濃度に達するまで加えることによりブ
ロックした。30分後、今やPEG化EPO種を含む得られた反応混合物を、1
0mMのリン酸カリウム(pH7.5)に対して≧15時間透析した。
施した:50mlのQ−セファロースffカラムを10mMのリン酸カリウム(pH7
.5)で平衡化した。工程B)で得られた反応混合物をカラムに添加した(流量
:1時間当たり3カラム容量(CV))。未反応メトキシ−PEG−マレイミド試
薬を分離するために、カラムを10mMのリン酸カリウム(pH7.5)5CVで洗浄
した。PEG化EPO種は、緩衝液A(10mMのリン酸カリウム(pH7.5))
5CV及び緩衝液B(10mMのリン酸カリウム、500mMのNaCl(pH7.5)
)5CVからなる上昇する塩勾配で、1時間当たり3CVの流量で溶出することによ
り分離した。NaCl勾配に基づいて、PEG化EPO種(トリ−、ジ−及びモ
ノ−PEG化EPO種)は最初に溶出し、続いて非PEG化EPO種を溶出した
。PEG化EPO種(トリ−、ジ−及びモノ−PEG化EPO種)を含む溶出液
の画分をプールして濾過した(0.2μmフィルターでの無菌濾過)。
SDS−PAAゲル(Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970))で評価したが、
同時にタンパク質濃度は、ベール−ランバートの法則(Beer-Lambert law)によ
り280nmで測定した。SDS−PAA電気泳動により求めたEPO種の見かけ
分子量は、約68kDa(モノ−PEG化EPO種)、約98kDa(ジ−PEG化E
PO種)、及び約128kDa(トリ−PEG化EPO種)であった。
ー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(スーパーデックス(Superdex)、
pg200;ファルマシア(Pharmacia))により達成することができる。トリ
−、ジ−及びモノ−PEG化種を含む溶出液のインビボの生物学的活性の測定は
、以下に記載される方法により実施した。
a Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))、そしてPh. Eur. BRPのエリ
トロポエチンのモノグラフにある方法である。試料をBSA−PBSで希釈した
。7〜15週齢の健常マウスに、非PEG化EPO、又は実施例2若しくは3か
らのトリ−、ジ−若しくはモノ−PEG化EPOを含む、EPO画分0.2mlを
皮下投与した。6日間にわたって、尾静脈の穿刺により血液を採取して、血液1
μlが0.15μmolのアクリジンオレンジ染色液1ml中に存在するように希釈し
た。染色時間は、3〜10分とした。網状赤血球の計数は、赤色蛍光ヒストグラ
ムの分析により、フローサイトメーターで微蛍光測定法で行った。網状赤血球の
数は、絶対数によって与えた(分析した血球30,000個当たり)。示したデ
ータでは、各群は1日当たりマウス5匹からなり、マウスは1回だけ採血させた
。
PEG(SBA)−EPO混合物(複合体10ng)、実施例2からのモノ−及び
ジ−PEG化EPO(複合体10ng)、実施例3からのPEG(SPA)−EP
O(複合体10ng)、及び緩衝液をマウスに投与した。結果は、表2に示した。
この結果は、未修飾EPO 25ngの投与に比較した、マウス1匹当たり同じ用
量(10ng)を用いての網状赤血球の量の有意な上昇及び最大網状赤血球数の変
化によって示される、PEG化EPO種の優れた活性及び半減期の延長を示して
いる。
EPOsf 100mg(5.48μmol)から出発して、1mMのHCl 3mlに
溶解した30kDaのPEG−SBA試薬329mg(10.96μmol)を加えた。
十分な100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を加えて、反応混合物の容
量を20mlにした。最終タンパク質濃度は、5mg/mlであり、タンパク質:PE
G試薬比は、1:2であった。反応混合物を周囲温度(20〜22℃)で2時間
混合した。2時間後、氷酢酸でpHを4.5に調整することにより反応を停止させ
、精製の準備ができるまで−20℃で凍結貯蔵した。
して、4.2×19cmカラムに詰めたSP−セファロースFF(スルホプロピル
カチオン交換樹脂)300mlに適用した。カラムは、同じ緩衝液で前もって平衡
化した。カラム流出液をギルソン(Gilson)UVモニターで280nmでモニター
して、キップとゾーネンの記録器(Kipp and Zonen recorder)で記録した。カ
ラムを平衡化緩衝液300ml、即ち1床容量で洗浄して、過剰な試薬、反応副産
物及びオリゴマーのPEG−EPOを除去した。続いて100mMのNaCl 2
床容量で洗浄して、ジ−PEG−EPOを除去した。次にモノ−PEG−EPO
を200mMのNaClで溶出した。モノ−PEG−EPOの溶出の間、タンパク
質ピークの最初の50mlを廃棄して、モノ−PEG−EPOを150ml画分とし
て回収した。カラムに残る未修飾EPOsfを750mMのNaClで溶出した。
全ての溶出緩衝液は、平衡化緩衝液中で製造した。溶出した試料は全て、SDS
−PAGEにより、及び高性能サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により
分析した。検出可能な未修飾EPOsfを含まなかった、150ml画分から得ら
れたモノ−PEG−EPOのプールは、次に≒4.5〜7.5mg/mlに濃縮して
、貯蔵緩衝液の10mMのリン酸カリウム、100mMのNaCl(pH7.5)中に
ダイアフィルトレーションにより加えた。濃縮/ダイアフィルトレーションは、
50kDaカットオフのミリポア・ペリコンXLバイオマックス50(Millipore P
ellicon XL Biomax 50)膜を取り付けたミリポア・ラブスケール(Millipore La
bscale)(登録商標)TFFシステムで周囲温度で実施した。濃縮モノ−PEG
−EPOは、無菌濾過して、−20℃で凍結貯蔵した。
PEG−EPOであり、検出可能な未修飾EPOsfはなく、そしておよそ25
%のジ−PEG−EPOであった。オリゴマー、及び非PEG化EPOsfが残
りのタンパク質を占めた。150ml画分から得られたモノ−PEG−EPOのプ
ールは、約90%のモノ−PEG−EPOと約10%のジ−PEG−EPOを含
んでいた。
走査熱量測定法)による分析 示差走査熱量測定法により測定される熱変性の転移温度が、タンパク質の熱安
定性に関する有効な指標であることは、一般に認められている。0.6〜1.2
mg/mlの間の濃度のエリトロポエチン又はPEG化エリトロポエチン溶液を、安
定化剤を含むか又は含まない種々の緩衝液中で、ナノ−DSC(Nano-DSC)(カ
ロリメトリック・サイエンシーズ・コーポレーション(Colorimetric Sciences
Corporation)、ユタ州、米国)によって2K/分の加熱速度で分析した。転移温
度の上昇は、タンパク質の熱安定性の上昇を示す。測定温度値は、絶対値として
理解すべきでなく、むしろ別の処方に対する個々の処方の安定性の差を表す。
エチンの熱変性のpH依存性を検討した。タンパク質試料は、30mMのNa2HP
O4、30mMのクエン酸ナトリウム、30mMのホウ酸中で分析した。図3は、約p
H6〜約pH9の間での最大転移温度のプラトーと、pH5.5より下での鋭い低下
を示した。このことは、最大熱安定性のための最適pHは、pH5.5より上である
ことを示す(図3)。
4は、熱安定性が、処方のイオン強度の上昇に伴い上昇することを示している。
適した緩衝剤又は添加剤は、硫酸、クエン酸又はリン酸塩であることが判る。現
在利用可能な処方において緩衝剤として使用されているグリシン(上記を参照の
こと)は、さほど適していなかった。
るが、一方リン酸塩は、pH7.5に比較してpH6.2ではあまり適していないこ
とを示している。このことは、硫酸塩が、低pHであっても熱安定性を高く保持す
ることを示す。この知見によって、pH6.0〜6.5の処方が、エリトロポエチ
ンの熱安定性に激しい消失のないことが見込める。
(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)による分析 エリトロポエチンタンパク質に及ぼす熱ストレスの作用を調査するために、異
なる処方中の試料を熱ストレス(80℃、20分)に曝露して、還元(試料緩衝
液中にDTTを含む)及び非還元(試料緩衝液中にDTTを含まない)条件下で
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
により分析した。この方法によって、共有結合の凝集体形成が検出できる。上に
略述されるように、凝集体形成は、タンパク質の主要な分解経路の1つであり、
よってタンパク質の製剤においては防止する必要がある。還元剤(例えば、DT
T)の非存在下で検出でき、かつ還元剤の存在下で検出できない凝集体は、恐ら
く熱ストレス下での誤ったジスルフィド架橋である酸化反応により形成される。
図7は、熱ストレス下での凝集のpH依存性を示す。この実験は、凝集体の形成が
、6.5より低いpHで抑制されることを明白に示した。pHが高いほど、凝集体の
量が高い。形成される凝集体の多くは、SDS−PAGEの間に試料を還元剤で
処理することにより減少させることができるが、このことは、熱ストレス下で形
成される凝集体の大部分がジスルフィド架橋したダイマー、オリゴマー及びもっ
と高次の凝集体であることを示唆している。ひとまとめにすると、このことは、
処方のpHをpH6.5以下に保持することにより、凝集体の形成を大部分防止でき
ることを示している。
PEG−EPO試料をSDS−PAGEにより分析した。タンパク質は銀で染色
した。レーン1:分子量標準。レーン2:pH5。レーン3:pH5、還元。レーン
4:pH6。レーン5:pH6、還元。レーン6:pH6.5。レーン7:pH6.5、
還元。レーン8:pH7。レーン9:pH7、還元。レーン10:PEG−EPO、
ストレスなし。
、酸化防止剤として1mg/mlのアセチルシステインを使用すると、熱ストレス下
の凝集体の形成が防止されることを示している。したがって、熱ストレス下の凝
集体形成を防止するために、低pH、例えばpH6.2で、例えばアセチルシステイ
ンのような酸化防止剤を使用することは有用である。
防止することができる。(上述のような)熱ストレス後のPEG−EPO試料を
SDS−PAGEにより分析した。タンパク質は銀で染色した。レーン1:PE
G−EPO、ストレスなし。レーン2:pH7.5、ストレス。レーン3:pH6.
2、ストレス。レーン4:pH6.2、ストレス、還元。レーン5:pH7.5、1
mg/mlアセチルシステイン、ストレス。レーン6:pH7.5、1mg/mlアセチルシ
ステイン、ストレス、還元。
定性 種々の処方中のPEG化EPOを幾つかの温度でインキュベートした。表示時
点で、試料を取り出し、逆相高性能クロマトグラフィー(rpHPLC)、高性
能サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)及びドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により安定性を評価した。表3
は、幾つかの温度での種々の処方中のPEG−EPOの安定性を比較している。
これらのデータは、タンパク質回収及び凝集に関して、本明細書に囲い込まれた
処方の優越性を明白に示している。
マンニトール、pH6.2。 処方C:10mMのリン酸ナトリウム、100mMのNaCl、pH7.0。 処方D:10mMのリン酸ナトリウム、120mMの硫酸ナトリウム、pH6.2。 処方E:40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール、
1mMのCaCl2、pH6.2。
する、酸化防止剤としてのメチオニン 種々の処方中のPEG化EPOを幾つかの温度でインキュベートした。6ヶ月
後、試料を取り出し、以下のように、メチオニン54の酸化の程度を測定した。
簡単に述べると、EPO試料をエンドプロテイナーゼのLysCで処理した。得
られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分離した。酸化したペプチドT
8(酸化したメチオニン54を含む)対ペプチドT8(酸化されていないメチオ
ニン54を含む)の比を計算した。データは、表4に要約した。
マンニトール、pH6.2。 処方C:10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3%(w/v)の
マンニトール、1mMのメチオニン、pH6.2。
mMの硫酸ナトリウム、3%(w/v)のマンニトール、pH6.2)が、メチオニン
54の酸化の程度に関して、他の処方(10mMのリン酸ナトリウム、100mMの
NaCl、pH7.0)よりも優れていることを明白に示した。処方に1又は10
mMのメチオニンを添加すると、メチオニン54の酸化が明らかに抑制された。し
たがって、メチオニンは酸化防止剤として作用して、EPOを安定化する。
の温度で6ヶ月間貯蔵後の最適化処方中のPEG−EPO試料のシアル酸含量を
標準法により分析した。これらのデータは、炭水化物構造の完全性が、本明細書
に記載される新しい処方でのタンパク質の貯蔵によって否定的な影響を受けない
ことを示している(図9)。
トール(pH6.2)中のPEG−EPOの貯蔵が、インビボの生物活性に否定的
な影響を及ぼさないことを試験するために、標準的マウスEPO検定法を行った
(実施例6を参照のこと)。表示される温度で、10mMのリン酸ナトリウム、4
0mMの硫酸ナトリウム、3%(w/v)のマンニトール(pH6.2)中で6ヶ月間
貯蔵したPEG−EPO試料は、新鮮標準品に比較して4、25及び30℃での
貯蔵後にインビボ活性の消失がないことを示した(図10)。
トール(pH6.2)中で高温で貯蔵後のPEG−EPO試料中の凝集体含量を分
析するために、6ヶ月後試料を取り出して、サイズ排除クロマトグラフィーによ
り分析した。
方中のPEG化EPOの安定性が証明された。図11は、サイズ排除クロマトグ
ラムのオーバーレイを示している。
トされている。
るが、一方リン酸塩は、pH7.5に比較してpH6.2ではあまり適切ではないこ
とを示す。このことは、硫酸塩が低pHであっても熱安定性を高く保持することを
示している。
−EPO試料をSDS−PAGEにより分析した。タンパク質を銀で染色した。
レーン1:分子量標準。レーン2:pH5。レーン3:pH5、還元。レーン4:pH
6。レーン5:pH6、還元。レーン6:pH6.5。レーン7:pH6.5、還元。
レーン8:pH7。レーン9:pH7、還元。レーン10:PEG−EPO、ストレ
スなし。
トレス下での凝集体の形成が防止されることを示す。熱ストレス(80℃、20
分)下のPEG−EPOの凝集:レーン1:pH7.5のPEG−EPO、ストレ
スなし;レーン2:pH7.5のPEG−EPO、ストレス;レーン3:pH6.2
のPEG−EPO、ストレス;レーン4:pH6.2のPEG−EPO、ストレス
、還元;レーン5:pH7.5のPEG−EPO、+1mg/mlのN−アセチル−シ
ステイン、ストレス;レーン6:pH7.5のPEG−EPO、+1mg/mlのN−
アセチル−システイン、ストレス、還元。
酸(NANA)含量。
ム、3%(w/v)のマンニトール(pH6.2)中で貯蔵後のPEG−EPO試料
のマウス生物活性検定。
)のマンニトール(pH6.2)中で貯蔵後のPEG−EPO試料のサイズ排除ク
ロマトグラムのオーバーレイ(下から上へ:緩衝液、出発物質、4℃、25℃、
30℃及び40℃)。
有する、請求項26〜28記載の組成物。
有する、請求項31記載の組成物。
グリコール)基とアミド結合を形成する、n個のアミノ基を含まない糖タンパク
質の残基である〕で示されるエリトロポエチンタンパク質を有する、請求項35
記載の組成物。
コール)残基の平均分子量が、約20キロダルトン〜約40キロダルトンであり
、そして複合体の分子量が、約51キロダルトン〜約175キロダルトンである
、請求項34記載の組成物。
、低級アルキルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−CH2
)k−であり、そしてPは、Xとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項
38記載の組成物。
、低級アルキルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−CH2
)k−であり、そしてPは、Xとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項
38記載の組成物。
Claims (60)
- 【請求項1】 エリトロポエチンタンパク質、約5.5〜約7.0の範囲に
溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機ア
ニオン、及び場合により1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特
徴とする、液体薬剤組成物。 - 【請求項2】 水性溶液である、請求項1記載の組成物。
- 【請求項3】 等張性溶液である、請求項1〜2記載の組成物。
- 【請求項4】 アニオンが、多価の荷電無機強酸のアニオンである、請求項
1〜3記載の組成物。 - 【請求項5】 アニオンが、硫酸、クエン酸又はリン酸イオンよりなる群か
ら選択される、請求項1〜4記載の組成物。 - 【請求項6】 アニオンが、硫酸アニオンである、請求項1〜5記載の組成
物。 - 【請求項7】 10〜200mmol/lの硫酸塩を含むことを特徴とする、請求
項6記載の組成物。 - 【請求項8】 pHが、5.8〜6.7である、請求項1〜7記載の組成物。
- 【請求項9】 pHが、6.0〜6.5である、請求項8記載の組成物。
- 【請求項10】 pHが、約6.2である、請求項9記載の組成物。
- 【請求項11】 緩衝液が、リン酸緩衝液又はアルギニン/H2SO4/Na2 SO4緩衝液よりなる群から選択される、請求項1〜10記載の組成物。
- 【請求項12】 緩衝液が、10〜50mmolのリン酸緩衝液である、請求項
11記載の組成物。 - 【請求項13】 組成物が、1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む
ことを特徴とする、請求項1〜12記載の組成物。 - 【請求項14】 1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤が、薬剤学的に許
容しうる塩、希釈剤、溶媒及び保存料よりなる群から選択される、請求項13記
載の組成物。 - 【請求項15】 薬剤学的に許容しうる賦形剤が、張度剤、ポリオール類、
酸化防止剤及び非イオン性界面活性剤よりなる群から選択される、請求項13及
び14記載の組成物。 - 【請求項16】 薬剤学的に許容しうる賦形剤が、ポリオールである、請求
項13〜15記載の組成物。 - 【請求項17】 ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、グリセロー
ル、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択される、請求項16記載
の組成物。 - 【請求項18】 ポリオールが、マンニトールである、請求項17記載の組
成物。 - 【請求項19】 酸化防止剤を含むことを特徴とする、請求項13〜18記
載の組成物。 - 【請求項20】 酸化防止剤が、メチオニンである、請求項19記載の組成
物。 - 【請求項21】 1mmol/l以下のCaCl2を含むことを特徴とする、請求
項13〜20記載の組成物。 - 【請求項22】 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート80、ポリソル
ベート20又はプルロニックF68である、請求項15〜22記載の組成物。 - 【請求項23】 非イオン性界面活性剤が、プルロニックF68である、請
求項22記載の組成物。 - 【請求項24】 組成物が、1%(w/v)以下の非イオン性界面活性剤を含
むことを特徴とする、請求項22又は23記載の組成物。 - 【請求項25】 組成物が、0.1%(w/v)以下の非イオン性界面活性剤
を含むことを特徴とする、請求項22〜24のいずれか1項記載の組成物。 - 【請求項26】 エリトロポエチンタンパク質が、ヒトエリトロポエチンで
ある、請求項1〜25記載の組成物。 - 【請求項27】 エリトロポエチンタンパク質が、内因性遺伝子活性化によ
り発現される、請求項26記載の組成物。 - 【請求項28】 エリトロポエチンタンパク質が、配列番号1又は配列番号
2のアミノ酸配列を有する、請求項26〜27記載の組成物。 - 【請求項29】 タンパク質が、1〜6個のグリコシル化部位の付加により
修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する、請求項26〜28記載の組成
物。 - 【請求項30】 エリトロポエチンタンパク質が、下記: 【表1】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
有する、請求項26〜28記載の組成物。 - 【請求項31】 ヒトエリトロポエチンの配列が、少なくとも1個のグリコ
シル化部位の転位により修飾される、請求項26〜30記載の組成物。 - 【請求項32】 転位が、ヒトエリトロポエチンのN結合グリコシル化部位
のいずれかの欠失と、ヒトエリトロポエチンの配列の88位でのN結合グリコシ
ル化部位の付加とを特徴とする、請求項31記載の組成物。 - 【請求項33】 糖タンパク質が、下記: 【表2】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
有する、請求項31記載の組成物。 - 【請求項34】 請求項のいずれか1項記載のエリトロポエチンタンパク質
が、PEG化されている、請求項26〜33記載の組成物。 - 【請求項35】 エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体
は、少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の
産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエチン
及びその類似体(1〜6個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも1個のグリ
コシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する)よ
りなる群から選択されるエリトロポエチン糖タンパク質を含むことを特徴とし;
該糖タンパク質は、式:−CO−(CH2)x−(OCH2CH2)m−ORの「n
」個のポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各ポリ(エチレング
リコール)基の−COは、該アミノ基の1個とのアミド結合を形成する(ここで
、Rは、低級アルキルであり;xは、2又は3であり;mは、約450〜約90
0であり;nは、1〜3であり、そしてn及びmは、複合体からエリトロポエチ
ン糖タンパク質を差し引いた分子量が、20キロダルトン〜100キロダルトン
であるように選択される)、請求項34記載の組成物。 - 【請求項36】 式(I): 【化1】 〔式中、m、n、x及びRは、上記と同義であり、そしてPは、ポリ(エチレン
グリコール)基とアミド結合を形成する、n個のアミノ基を含まない糖タンパク
質の残基である〕で示されるエリトロポエチンタンパク質を有する、請求項35
記載の組成物。 - 【請求項37】 式(I)において、xが、2であり、mが、650〜75
0であり、nが、1であり、そしてRが、メチルである、請求項36記載の組成
物。 - 【請求項38】 エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体
は、少なくとも1個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及び赤血
球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエ
チン及びその類似体(1〜6個のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒト
エリトロポエチンの1次構造を有する)よりなる群から選択されるエリトロポエ
チン糖タンパク質を含むことを特徴とし;該糖タンパク質は、1〜3個の低級ア
ルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各ポリ(エチレン
グリコール)基は、リンカーである式:−C(O)−X−S−Y−(ここで、リ
ンカーの−COは、該アミノ基の1個とのアミド結合を形成し、Xは、−(CH2 )k−又は−CH2(O−CH2−CH2)k−であり、kは、1〜10であり、Y
は、下記式: 【化2】 で示される)を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ(エチレングリ
コール)残基の平均分子量が、約20キロダルトン〜約40キロダルトンであり
、そして複合体の分子量が、約51キロダルトン〜約175キロダルトンである
、請求項34記載の組成物。 - 【請求項39】 下記式: 【化3】 〔式中、nは、1〜3の整数であり;mは、450〜900の整数であり;Rは
、低級アルキルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−CH2
)k−であり、そしてPは、Xとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される、請求項38記載の複合
体。 - 【請求項40】 下記式: 【化4】 〔式中、nは、1〜3の整数であり;mは、450〜900の整数であり;Rは
、低級アルキルであり;Xは、−(CH2)k−又は−CH2(O−CH2−CH2
)k−であり、そしてPは、Xとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される、請求項39記載の複合
体。 - 【請求項41】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質を含むことを特徴とする、請求項1〜40記載の組成物。 - 【請求項42】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、10〜200mmol/lの硫酸塩、及び10〜50mmol/lのリン酸塩(pH
6.0〜6.5)を含むことを特徴とする、請求項1〜41記載の組成物。 - 【請求項43】 20mM以下のメチオニン、1〜5%のポリオール(w/v)
、0.1%以下のプルロニックF68(w/v)及び場合により1mM以下のCaC
l2を含むことを特徴とする、請求項42記載の組成物。 - 【請求項44】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、40mmol/lの硫酸塩、10mmol/lのリン酸塩、3%のマンニトール(
w/v)、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(w/v)(pH6.
2)を含むことを特徴とする、請求項42又は43記載の組成物。 - 【請求項45】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、10〜100mmol/lのNaCl、10〜50mmol/lのリン酸塩(pH6
.0〜7.0)、場合により1〜5%のポリオールを含むことを特徴とする、請
求項1〜41記載の組成物。 - 【請求項46】 20mM以下のメチオニン、0.1%以下のプルロニックF
68及び場合により7.5μmol/lのCaCl2を含むことを特徴とする、請求項
45記載の組成物。 - 【請求項47】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、100mmol/lのNaCl、10mMのメチオニン、0.01%のプルロ
ニックF68、及び10mmol/lのリン酸塩(pH7.0)を含むことを特徴とする
、請求項45又は46記載の組成物。 - 【請求項48】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、10〜50mmol/lのアルギニン(pH6〜pH6.5)、10〜100mm
ol/lの硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項1〜41記載の組成物。 - 【請求項49】 20mM以下のメチオニン、0.1%以下のプルロニックF
68、場合により1mmol/l以下のCaCl2及び場合により1〜5%のポリオー
ル含むことを特徴とする、請求項48記載の組成物。 - 【請求項50】 1ml当たり10μg〜10000μgのエリトロポエチンタ
ンパク質、40mmol/lのアルギニン(pH6.2)、30mmol/lの硫酸ナトリウム
、3%のマンニトール、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68
及び場合により1mmol/lのCaCl2を含むことを特徴とする、請求項48又は
49記載の組成物。 - 【請求項51】 25〜2500μg/mlのエリトロポエチンと、 a)10mMのリン酸ナトリウム/カリウム、100mMのNaCl(pH7.0)
又は b)10mMのリン酸ナトリウム、120mMの硫酸ナトリウム(pH6.2)又は c)10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトー
ル(pH6.2)又は d)10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトー
ル、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(pH6.2)又は e)40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール(pH
6.2)又は f)40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマンニトール、1
0mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(pH6.2) とを含むことを特徴とする、請求項1〜41記載の組成物。 - 【請求項52】 エリトロポエチンの量が、50、100、400、800
又は2500μg/mlである、請求項1〜51記載の組成物。 - 【請求項53】 10mMのリン酸ナトリウム、40mMの硫酸ナトリウム、3
%のマンニトール、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(pH
6.2)を含むことを特徴とする、請求項52記載の組成物。 - 【請求項54】 40mMのアルギニン、30mMの硫酸ナトリウム、3%のマ
ンニトール、10mMのメチオニン、0.01%のプルロニックF68(pH6.2
)を含むことを特徴とする、請求項52記載の組成物。 - 【請求項55】 凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末である、請求項1〜54
記載の組成物。 - 【請求項56】 エリトロポエチンタンパク質を、多価の陰性荷電アニオン
及び場合により1つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする
溶液と混合することを特徴とする、請求項1〜54のいずれか1項記載の組成物
の製造方法。 - 【請求項57】 慢性腎不全(CRF)患者における貧血、AIDSに関連
した疾患の治療及び予防、及び/又は化学療法を受ける癌患者の治療に有用な医
薬の製造のための、請求項1〜54のいずれか1項記載の組成物の使用。 - 【請求項58】 慢性腎不全(CRF)患者における貧血、AIDS及び化
学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び予防のための方法であって、患
者に請求項1〜54のいずれか1項記載の組成物を投与する工程を特徴とする方
法。 - 【請求項59】 請求項1〜54のいずれか1項記載の組成物を含むことを
特徴とする、局所及び全身性の持続放出のための装置。 - 【請求項60】 本明細書に記載される発明。
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