JP2003533487A - 新しい薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、液体薬剤組成物に関する。この組成物は、赤血球新生に関連する疾患の予防及び治療に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に溶液pH
を保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機アニオン
、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とす
る、液体薬剤組成物に関する。この組成物は、赤血球新生に関連する疾患の予防
及び治療に特に有用である。

【０００２】 赤血球新生は、細胞破壊を補うために存在する、赤血球の産生である。赤血球
新生は、十分な赤血球を適正な組織の酸素供与のために利用可能にする、制御さ
れた生理学的機序である。天然ヒトエリトロポエチン（ｈＥＰＯ）は、腎臓にお
いて産生され、そして赤血球産生を刺激する液性の血漿因子である（Carnot, P
とDeflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432；Erslev, AJ (1953) Blood
8: 349；Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372；Jacobson, LO, Goldwasser, E,
Freid, W及びPlzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4）。天然ＥＰＯは、骨髄に
おける拘束された赤血球系始原細胞の分裂及び分化を刺激し、赤血球系前駆細胞
上の受容体に結合することによりその生物学的活性を発揮する（Krantz, BS (19
91) Blood 77: 419）。

【０００３】 エリトロポエチンは、組換えＤＮＡ法を用いて生合成により製造されており（
Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, Jら (1986) Immunobiol. 72: 213-224）チ
ャイニーズハムスターの卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）に挿入され、かつ発現され
るクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ｈＥＰＯの主な完全にプロセッシ
ングを受けた形態の１次構造は、配列番号１に示されている。Ｃｙｓ⁷−Ｃｙｓ^{1 61} 及びＣｙｓ²⁹−Ｃｙｓ³³の間に２個のジスルフィド架橋が存在する。糖残基を
含まないＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は、１８，２３６Daである。未変性Ｅ
ＰＯ分子において、分子量の約４０％は、タンパク質上のグリコシル化部位でタ
ンパク質をグリコシル化する、炭水化物基により占められている（Sasaki, H, B
othner, B, Dell, A及びFukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059）。

【０００４】 ヒトエリトロポエチンは、赤血球形成において必須であるため、このホルモン
は、低いか又は不完全な赤血球産生を特徴とする血液障害の処置において有用で
ある。臨床的には、ＥＰＯは、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血の処置（
Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MRら (1987) NEJM 316: 73-78；Eschbach,
JW, Abdulhadi, MH, Browne, JKら (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992；Egrie
, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262
；Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, Dら (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-11
4）並びにＡＩＤＳ及び化学療法を受ける癌患者（Danna, RP, Rudnick, SA, Abe
ls, RIの MB, Garnick編 Erythropoietin in Clinical Applications - An Inte
rnational Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.301-324）に
使用されている。

【０００５】 既知の薬剤組成物は、以下の不都合の少なくとも１つを有する： −これらは、凍結乾燥品である。複雑な製造手順のほかに、凍結乾燥品は、ヒ
トに注射する前に復元しなければならないという不都合を有する。このため、医
療従事者による追加的な取扱いを必要とし、そしてこのことは、不便であり、か
つ製剤の誤った取扱いのリスクを負う； −これらは、ヒト血清アルブミンを添加物として含む。ヒト血清アルブミンは
、ヒト体液から誘導される製品であるため、アルブミン調剤には混入によるウイ
ルス感染のリスクが存在する。また、アレルギー反応も可能性がある； −現在市販されている全てのエリトロポエチン組成物は、高温、即ち、通常２
〜８℃の間である冷蔵庫温度より高い温度では不安定である。したがって、これ
らを、冷蔵庫（２〜８℃）内に貯蔵しなければならず、室温（およそ２０℃）で
は貯蔵できない。このため、低温での貯蔵及び輸送により発生する費用がかかる
ことになり、また、薬物の取扱いにも不便を引き起こす。ここでいう不安定とは
、高温、例えば２５℃での長期（即ち、数ヶ月、又は６ヶ月以上）の貯蔵が、タ
ンパク質の分解をもたらすことを意味する。ここでいう分解とは、高温（８℃超
）で優先的に起こることが知られている、タンパク質分子の物理変化（例えば、
凝集又は変性）及び化学変化（例えば、一般に化学結合の酸化又は修飾）を表現
する。タンパク質をその転移温度（融点とも呼ばれる）近く又はそれを超えてイ
ンキュベートすると、タンパク質のアンフォールディングが起こる、即ち、ポリ
ペプチドの本来の構造及び生物学的活性が失われる。転移温度は、タンパク質の
温度安定性に強く相関しており、そしてタンパク質の環境（例えば、pH、塩、イ
オン強度、緩衝剤など）に依存している。例えば、変性は、エリトロポエチン分
子の凝集、即ち、ダイマー（共有又は非共有結合）、高次凝集体そして更には微
粒子の形成をもたらす。これによって、薬物の効力が低下し、そしてヒトへの注
射後に有害な副作用を誘導することがある。

【０００６】 よって本発明の基調をなす問題は、上述の不都合を最小化又は抑制することが
できる組成物を提供することである。

【０００７】 この問題は、本発明により、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．
０のpHの緩衝液中の多価の荷電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学
的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする、薬剤組成物を提供することによ
って解決される。

【０００８】 驚くべきことに、エリトロポエチンをこの組成物に処方すると、冷蔵庫温度（
２〜８℃）を超える温度、特に室温（即ち、２５℃未満）そして更に高温、例え
ば、４０℃でも、その安定性が改善されることが見い出された。このことは、長
期にわたり冷却することなく、活性の有意量を失うことなく、そして有意に分解
することなく、組成物を貯蔵できることを意味する。

【０００９】 他に記載がなければ、以下の定義は、本明細書の発明を記述するために使用さ
れる種々の用語の意味と範囲を、例示及び定義するために述べられる。

【００１０】 「多価の荷電無機アニオン」という用語は、１分子当たり２個以上の負電荷を
有する無機アニオン、例えば、硫酸イオンＳＯ₄ ^2-、又はリン酸アニオン、即ち
、リン酸水素イオンＨＰＯ₄ ^2-を意味する。多価の荷電無機アニオンは、対応す
る塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩及びこれらの混合物の形態で、及び／
又は緩衝剤、例えば、リン酸緩衝剤の形態で添加してよい。

【００１１】 「等浸透性又は等張性」という用語は、その成分に影響を及ぼすことなく、体
液と混合できる溶液を意味する。塩化ナトリウム０．９％のような、血液と等張
性である溶液は、血清と同じ浸透圧を有しており、そしてこれらは、赤血球の膜
に影響を及ぼさない。一般に、血液と等張性である溶液は、約２９０mosm/kg
Ｈ₂Ｏである。

【００１２】 「無機強酸」という用語は、１Ｎ溶液中で２０〜１００％の解離を示す無機酸
、例えば、Ｈ₂ＳＯ₄を意味する。

【００１３】 本明細書において使用されるとき「薬剤学的に許容しうる」という用語は、そ
の緩衝剤又は塩が、毒性の観点から許容しうることを意味する。

【００１４】 「希釈剤」という用語は、薬理学的活性を欠いているが、製剤学的に必要であ
るか又は望ましい、医薬品中の成分を意味する。例えば、希釈剤は、注射すべき
薬物の溶解のための液体、例えば、水であってよい。

【００１５】 「溶媒」という用語は、別の物質を溶液中に保持する、即ち、それを溶解する
液体、例えば、水を意味する。

【００１６】 「保存料」という用語は、細菌増殖を防止するために、薬剤組成物に加えられ
る物質、例えば、塩化ベンザルコニウム又はベンジルアルコールを意味する。

【００１７】 「ポリオール」という用語は、多価アルコール及び炭水化物を含む、複数のヒ
ドロキシル基のある任意の物質を意味する。多価アルコールは、ソルビトール、
マンニトール及びグリセロールのような化合物を含む。炭水化物は、例えば、シ
ョ糖又はトレハロースのような、ケト又はアルデヒド基を有してもよい環状分子
である。

【００１８】 「エリトロポエチン」又は「エリトロポエチンタンパク質」という用語は、骨
髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を持
ち、かつヒトエリトロポエチン及び以下に定義される類似体よりなる群から選択
されるタンパク質を意味する。

【００１９】 「ＰＥＧ化エリトロポエチン（Ｐｅｇ−ＥＰＯ又はＰＥＧ−ＥＰＯ）」という
用語は、後述されるような１〜３個のポリエチレン誘導体と共有結合しているエ
リトロポエチンタンパク質を意味する。

【００２０】 「装置」という用語は、特定の目的のための考案品を意味する。本発明におい
て、この目的は、液体薬剤組成物の投与を実現、支持又は促進することである。

【００２１】 更に詳細には、本発明は、エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０
の範囲に溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷
電無機アニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む
ことを特徴とする、液体薬剤組成物に関する。

【００２２】 好ましい実施態様において、本組成物は、液体の溶液、例えば水性溶液である
。本発明の好ましい実施態様において、上記薬剤組成物は、等張性溶液である。

【００２３】 このアニオンは、好ましくは、Ｈ₂ＳＯ₄、Ｈ₃ＰＯ₄又はクエン酸のような、無
機強酸のアニオンから選択される。したがって、好ましいアニオンは、硫酸、リ
ン酸及びクエン酸イオン、好ましくは硫酸又はリン酸イオン、そして最も好まし
くは硫酸イオンからなる群から選択される。多価の荷電無機アニオンの濃度は、
１０〜２００mmol/lの間、例えば、硫酸アニオンでは１０〜２００mmol/lの間で
変化させることができる。

【００２４】 本発明においてpHを約５．５〜約７．０の範囲、好ましくは５．８〜６．７の
範囲、更に好ましくは６．０〜６．５の範囲、そして最も好ましくは約pH６．２
に維持するために使用すべき緩衝液は、有機又は無機酸の従来の緩衝液（例えば
、リン酸緩衝液、アルギニン／Ｈ₂ＳＯ₄／Ｎａ₂ＳＯ₄緩衝液、又は他の任意の薬
剤学的に許容しうる緩衝系）であってよい。好ましい実施態様において、本組成
物は、リン酸又はアルギニン／Ｈ₂ＳＯ₄／Ｎａ₂ＳＯ₄緩衝液、更に好ましくは１
０〜５０mmol/lのリン酸緩衝液を含むことを特徴とする。当然ながら、これらの
緩衝系の組合せもまた、本発明の一部である。pH値は、それぞれ、対応する塩基
、例えば、リン酸緩衝系中のＮａＯＨ、及び対応する酸、例えば、アルギニン緩
衝系中の硫酸で調整することができる。

【００２５】 本発明の組成物は、１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴
としてよい。これらの薬剤学的に許容しうる賦形剤は、薬剤学的に許容しうる塩
、希釈剤及び／又は溶媒及び／又は保存料など、例えば、張度剤（等張化剤）、
ポリオール類、酸化防止剤又は非イオン性界面活性剤から選択することができる
。これらの物質の例は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ソルビトール、マン
ニトール、グリセロール、サッカロース、トレハロース、アセチルシステイン、
ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、又はプルロニックＦ６８である。

【００２６】 本発明の好ましい実施態様において、薬剤組成物は、マンニトール、ソルビト
ール、グリセロール、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択される
ポリオール（好ましくは、マンニトール）を含んでよい。ポリオールの濃度は、
１〜１０％（w/v）の間で変化させることができる。

【００２７】 酸化防止剤の例は、システイン、メチオニン、アセチルシステイン又はアスコ
ルビン酸、好ましくはメチオニンである。酸化防止剤は、通常０．０１〜０．５
％（w/v）の間の濃度、即ち、例えばメチオニンの場合には１〜２０mMの濃度で
加えられる。

【００２８】 また、上述の組成物は、場合により、約０．０１〜約０．９％（w/w）の等張
化剤を含むことを特徴としてよい。これらの化合物は、当該分野において知られ
ている；これらの剤の例は、塩化ナトリウム又は硫酸ナトリウムである。本発明
の好ましい実施態様において、本組成物は、等張性溶液である。上記組成物はま
た、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０又はプルロニックＦ６８、好まし
くはプルロニックＦ６８のような、非イオン性界面活性剤を、例えば、１％（w/
v）以下、更に好ましくは０．１％（w/v）以下、例えば、０．００１〜０．０１
％（w/v）含んでもよい。

【００２９】 上記組成物はまた、追加の塩、例えば、１mmol/l以下のＣａＣｌ₂を含んでも
よい。

【００３０】 本発明は、薬剤学的活性成分としてエリトロポエチンを含むことを特徴とする
薬剤組成物の製造に特に有用である。「エリトロポエチン」又は「エリトロポエ
チンタンパク質」又は「ＥＰＯ」という用語は、以下のとおりである：詳細には
、この用語は、糖タンパク質、例えば、（配列番号１）若しくは（配列番号２）
に記述されるアミノ酸配列、又は実質的にこれらと相同なアミノ酸配列を有して
おり、そしてその生物学的性質が、赤血球産生の刺激、並びに骨髄における拘束
された赤血球系始原細胞の分裂及び分化の刺激に関連する、例えば、ヒトエリト
ロポエチンを意味する。本明細書において使用されるとき、これらの用語は、例
えば、部位特異的突然変異により故意に、又は突然変異を通じて偶然に修飾され
たタンパク質を含む。これらの用語はまた、グリコシル化のための１〜６個の付
加部位を有する類似体、糖タンパク質のカルボキシル末端に少なくとも１個の追
加アミノ酸を有する類似体（ここで、追加アミノ酸は、少なくとも１個のグリコ
シル化部位を含む）、及び少なくとも１個のグリコシル化のための部位の転位を
含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。これらの用語は、天然及び組換えの両
方により産生されたヒトエリトロポエチンを含む。

【００３１】 以下に詳細に述べられるように、ＥＰＯの製造及び精製は、当該分野において
周知である。エリトロポエチンとは、組織、タンパク質合成、天然又は組換え細
胞での細胞培養のような、任意の従来の供給源から得られるような、天然又は組
換えタンパク質、好ましくはヒトタンパク質を意味する。突然変異タンパク質又
は別の方法で修飾されたタンパク質のような、エリトロポエチンの活性を有する
任意のタンパク質が包含される。組換えＥＰＯは、ＣＨＯ−、ＢＨＫ−又はＨｅ
Ｌａ細胞株における発現を介して、組換えＤＮＡ法により、又は内因性遺伝子活
性化により製造することができる。内因性遺伝子活性化によるものを含む、タン
パク質の発現は、当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,733,761
号、5,641,670号、及び5,733,746号、並びに国際公開第93/09222号、第94/12650
号、第95/31560号、第90/11354号、第91/06667号及び第91/09955号に開示されて
いるが、これらのそれぞれの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれ
る。エリトロポエチン糖タンパク質生成物の製造のための好ましいＥＰＯ種は、
ヒトＥＰＯ種である。更に好ましくは、ＥＰＯ種は、配列番号１又は配列番号２
に記述されているアミノ酸配列、更に好ましくはアミノ酸配列：配列番号１を有
する、ヒトＥＰＯである。

【００３２】 更に、エリトロポエチンは、グリコシル化のための１〜６個の付加部位を有す
る、糖タンパク質類似体であってよい。１個以上のオリゴ糖基でのタンパク質の
グリコシル化は、ポリペプチド基本骨格に沿う特定の位置で起こり、タンパク質
安定性、分泌、細胞内局在、及び生物学的活性のような、タンパク質の物性に大
きく影響を及ぼす。グリコシル化は、通常２つのタイプがある。Ｏ結合オリゴ糖
は、セリン又はトレオニン残基に結合し、そしてＮ結合オリゴ糖は、アスパラギ
ン残基に結合する。Ｎ結合及びＯ結合両方のオリゴ糖上に見い出される１つのタ
イプのオリゴ糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）であり、これは、９
個以上の炭素原子を含むアミノ糖のファミリーである。シアル酸は、通常Ｎ結合
及びＯ結合両方のオリゴ糖の末端残基であり、そしてこれは負電荷を持つため、
糖タンパク質に酸性の性質を与える。１６５個のアミノ酸を有するヒトエリトロ
ポエチンは、３個のＮ結合オリゴ糖鎖及び１個のＯ結合オリゴ糖鎖を含み、そし
てこれらは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を構成する。Ｎ結合グリコシル
化は、２４、３８、及び８３位に位置するアスパラギン残基で起こり、そしてＯ
結合グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基で起こる。オリゴ糖鎖は、
末端シアル酸残基で修飾される。エリトロポエチンのシアル化は、肝結合タンパ
ク質による結合、及びこれに続くクリアランスを妨げるため、グリコシル化エリ
トロポエチンから全てのシアル酸残基を酵素的に除去すると、インビボ活性の消
失が起こるが、インビトロ活性は消失しない。

【００３３】 本薬剤組成物の「エリトロポエチン」という用語は、ヒトエリトロポエチンの
アミノ酸配列に１つ以上の変更を加えて、シアル酸結合のための部位の数を増加
させた、ヒトエリトロポエチンの類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は
、グリコシル化に利用可能な部位を増加させるか又は変える、アミノ酸残基の付
加、欠失、又は置換のある、部位特異的突然変異により生成することができる。
シアル酸のレベルがヒトエリトロポエチンに見い出されるそれよりも大きな糖タ
ンパク質類似体は、生物学的活性に必要な２次又は３次コンフォメーションを混
乱させない、グリコシル化部位を付加することにより生成される。本発明の糖タ
ンパク質はまた、通常Ｎ結合又はＯ結合部位に近接した１個以上のアミノ酸の置
換を伴う、グリコシル化部位で炭水化物結合のレベルが増加した類似体をも含む
。本発明の糖タンパク質はまた、エリトロポエチンのカルボキシル末端から伸長
する１個以上のアミノ酸を有しており、少なくとも１個の追加の炭水化物部位を
提供する類似体をも含む。本組成物のエリトロポエチンタンパク質はまた、少な
くとも１個のグリコシル化のための部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似
体をも含む。このようなグリコシル化部位の転位は、ヒトエリトロポエチンにお
ける１個以上のグリコシル化部位の欠失と１個以上の非天然グリコシル化部位の
付加を伴う。エリトロポエチン上に炭水化物鎖の数が増加し、そのためエリトロ
ポエチン分子当たりのシアル酸の数が増加すると、溶解度の増大、タンパク質分
解に対する抵抗性の増大、免疫原性の低下、血清半減期の増大、及び生物学的活
性の増大のような、有利な性質が与えられる。追加のグリコシル化部位を持つエ
リトロポエチン類似体は、更に詳細には１９９５年３月１日に公開されたElliot
のヨーロッパ特許出願第640,619号に開示されている。

【００３４】 好ましい実施態様において、本発明の薬剤組成物は、下記から選択される修飾
により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を含むことを特徴とするエリトロ
ポエチン（これらに限定されない）のような、グリコシル化のための少なくとも
１個の追加部位を含むアミノ酸配列を持つエリトロポエチンタンパク質を含むこ
とを特徴とする：

【００３５】

【表３】

【００３６】 アミノ酸配列の修飾のための本明細書において使用される表記法は、上付の数
により表示される対応する未修飾タンパク質（例えば、配列番号１又は配列番号
２のｈＥＰＯ）の位置が、各上付の数の直前にあるアミノ酸に変更されているこ
とを意味する。

【００３７】 エリトロポエチンタンパク質はまた、糖タンパク質のカルボキシル末端に少な
くとも１個の追加のアミノ酸を有する類似体であってもよい（ここで、追加のア
ミノ酸は、少なくとも１個のグリコシル化部位を含む）。追加のアミノ酸は、ヒ
ト絨毛性ゴナドドロピンのカルボキシル末端から誘導されるペプチド断片を含ん
でいてもよい。好ましくは、この糖タンパク質は、（ａ）カルボキシル末端から
伸長する、アミノ酸配列：Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln（配列番
号３）を有する、ヒトエリトロポエチン；（ｂ）更にSer⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ＥＰＯ
を含むことを特徴とする（ａ）における類似体；及び（ｃ）更にAsn³⁰ Thr³² Va
l⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ＥＰＯを含むことを特徴とする（ａ）における類似体よりなる
群から選択される類似体である。

【００３８】 エリトロポエチンタンパク質はまた、少なくとも１個のグリコシル化のための
部位の転位を含むアミノ酸配列を有する類似体であってもよい。転位は、ヒトエ
リトロポエチンにおけるＮ結合炭水化物部位のいずれかの欠失、及びヒトエリト
ロポエチンのアミノ酸配列の８８位のＮ結合炭水化物部位の付加を含むことを特
徴としてよい。好ましくは、この糖タンパク質は、Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ Ｅ
ＰＯ；Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ＥＰＯ；及びGln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ＥＰＯ
よりなる群から選択される類似体である。

【００３９】 更に詳細には、上述の本薬剤組成物のエリトロポエチンタンパク質はまた、そ
のＰＥＧ化誘導体を含んでもよい。エリトロポエチンのＰＥＧ化誘導体及びその
製造法は、当該分野において知られており、例えば、EP-A-539,167、EP-A-605,9
63、WO 93/25212、WO 94/20069、WO 95/11924、米国特許第5,56号、EP-A-584,87
6、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、米国特許第5,359,030号及び5,681
,811号、米国特許第4,179,337号、日本特許、WO 98/32466、米国特許第5,324,65
0号に記載されている。ＰＥＧ化エリトロポエチン種の好ましい実施態様は、後
述のような誘導体に当てはまる。

【００４０】 したがって、本発明はまた、エリトロポエチン複合体に関するものであり、該
複合体は、少なくとも１個の遊離アミノ酸を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及
び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有する、上述のようなエ
リトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とし、そしてヒトエリトロポエチン
及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも１個のグリ
コシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する）よ
りなる群から選択され；該エリトロポエチンは、式：−ＣＯ−（ＣＨ₂）_x−（Ｏ
ＣＨ₂ＣＨ₂）_m−ＯＲで示される「ｎ」個のポリ（エチレングリコール）基に共
有結合しており、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル
）は、該アミノ基の１個とアミド結合を形成する（ここで、Ｒは、低級アルキル
であり；ｘは、２又は３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜
３であり、そしてｎ及びｍは、複合体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し
引いた分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトンであるように選択され
る）。本発明は更に、ｎが１である複合体の百分率が、組成物の全ての複合体の
少なくとも９０パーセント、好ましくは少なくとも９２パーセント、更に好まし
くは９６パーセントである、本明細書に記載される複合体を含む薬剤組成物を提
供する。

【００４１】 更に具体的には、上記複合体は、式（Ｉ）：

【００４２】

【化５】

【００４３】 〔式中、Ｐは、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの
生物学的活性を有する、本明細書に記載されるエリトロポエチンタンパク質の残
基（即ち、式（Ｉ）に示されるカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を含
まない）であり；そしてＲは、低級アルキルであり；ｘは、２又は３であり；ｍ
は、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり；そしてｎ及びｍは、複合
体からエリトロポエチン糖タンパク質を差し引いた分子量が、２０キロダルトン
〜１００キロダルトンであるように選択される〕により表される。

【００４４】 本明細書において使用されるとき、「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子
を有する、直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチ
ル、エチル及びイソプロピルを含む。本発明では、Ｒは、任意の低級アルキルで
ある。Ｒがメチルである複合体が好ましい。

【００４５】 「ｍ」という記号は、ポリ（エチレンオキシド）基中のエチレンオキシド残基
（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）の数を表す。エチレンオキシドの単一のＰＥＧ（ポリエチレン
グリコール）サブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。即ち、複合体
の分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、「ｍ」という数に依存する。本発明の複
合体において、「ｍ」は、約４５０〜約９００（約２０kDa〜約４０kDaの分子量
に対応する）、好ましくは約６５０〜約７５０（約３０kDaの分子量に対応する
）である。ｍという数は、得られる本発明の複合体が、未修飾ＥＰＯに匹敵する
生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応する未修飾ＥＰＯ
の活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分であろう。「約」
ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数の合
理的範囲に入ることを意味する。「ｍ」という数は、エリトロポエチン糖タンパ
ク質に共有結合している各ポリ（エチレングリコール）基の分子量が、約２０kD
a〜約４０kDaであり、そして好ましくは約３０kDaであるように選択される。

【００４６】 本発明の複合体において、「ｎ」という数は、エリトロポエチンタンパク質の
遊離アミノ基（リシンアミノ酸のε−アミノ基及び／又はアミノ末端アミノ基を
含む）にアミド結合を介して共有結合しているポリ（エチレングリコール）基の
数である。本発明の複合体は、ＥＰＯの１分子当たり、１個、２個、又は３個の
ＰＥＧ基を有してよい。「ｎ」は、１〜３の範囲の整数であり、好ましくは「ｎ
」は、１又は２であり、そして更に好ましくは「ｎ」は１である。上述の複合体
の好ましい複合体は、ｘが２であり、ｍが６５０〜７５０であり、ｎが１であり
、そしてＲがメチルである、化合物を含むことを特徴とする。

【００４７】 式（Ｉ）の化合物は、式（II）：

【００４８】

【化６】

【００４９】 〔式中、Ｒ及びｍは、上記と同義である〕で示される化合物をエリトロポエチン
糖タンパク質と縮合することにより、既知の重合性物質から製造することができ
る。ｘが３である、式（II）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低
級アルコキシ、酪酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢ
Ａ）である。ｘが２である、式（II）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）
のα−低級アルコキシ、プロピオン酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキ
シ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）である。活性化エステルをアミンと反応させてアミドを形
成する、任意の従来法を利用することができる。上述の反応において、例示され
るスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす脱離基である。タンパ
ク質との複合体を生成するための式（II）の化合物のようなスクシンイミジルエ
ステルの使用は、１９９７年９月３０日発行の米国特許第5,672,662号（Harris
ら）に開示されている。

【００５０】 ヒトＥＰＯは、９個の遊離アミノ基：アミノ末端アミノ基に加えて８個のリシ
ン残基のε−アミノ基を含む。ＰＥＧ化試薬を式（II）のＳＢＡ化合物と化合さ
せると、pH７．５、１：３のタンパク質：ＰＥＧ比、及び２０〜２５℃の反応温
度で、モノ−、ジ−、及び痕跡量のトリ−ＰＥＧ化種の混合物が生成したことが
判った。ＰＥＧ化試薬が式（II）のＳＰＡ化合物であるとき、タンパク質：ＰＥ
Ｇ比が１：２であることを除いて同様の条件で、主としてモノ−ＰＥＧ化種が生
成した。ＰＥＧ化ＥＰＯは、混合物として、又はカチオン交換クロマトグラフィ
ーで分離した異なるＰＥＧ化種として投与することができる。反応条件（例えば
、試薬の比、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間など）を操作することにより
、異なるＰＥＧ化種の相対量を変化させることができる。

【００５１】 上述の薬剤組成物はまた、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細
胞に網状赤血球及び赤血球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、
そしてヒトエリトロポエチン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付
加により修飾されたヒトエリトロポエチンの１次構造を有する）よりなる群から
選択される、上記と同義のエリトロポエチンタンパク質を含んでもよく；該糖タ
ンパク質は、１〜３個の低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基と共有結
合しており、各ポリ（エチレングリコール）基は、リンカーである式：−Ｃ（Ｏ
）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−〔ここでリンカーのＣ（Ｏ）は該アミノ基の１個とアミド結合
を形成し、Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_k−であり、
ｋは、１〜１０であり、Ｙは、下記式：

【００５２】

【化７】

【００５３】 で示される〕を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ（エチレングリ
コール）残基の平均分子量は、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり
、そして複合体の分子量は、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである
。

【００５４】 このエリトロポエチン種はまた、式（III）：

【００５５】

【化８】

【００５６】 〔式中、Ｒは、任意の低級アルキルであってよく、そしてメチル、エチル、イソ
プロピルなどのような、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のアルキル基
を意味する。好ましいアルキルは、メチルである。Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−
ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_k−であってよく、ここで、ｋは、１〜約１０である
。好ましくは、ｋは、１〜約４であり、更に好ましくは、ｋは、１又は２である
。最も好ましくは、Ｘは、−（ＣＨ₂）である〕により表されてもよい。

【００５７】 式（III）において、Ｙは、下記式：

【００５８】

【化９】

【００５９】 で示され、好ましくは下記式：

【００６０】

【化１０】

【００６１】 で示され、更に好ましくは下記式：

【００６２】

【化１１】

【００６３】 で示される。

【００６４】 式（III）において、ｍという数は、得られる式（III）の複合体が、未修飾Ｅ
ＰＯに匹敵する生理学的活性を有するように選択されるが、この活性は、対応す
る未修飾ＥＰＯの活性と同じであるか、これより大きいか、又はこれの一部分で
あろう。ｍは、ＰＥＧ単位中のエチレンオキシド残基の数を表す。−（ＯＣＨ₂
ＣＨ₂）−の単一のＰＥＧサブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。
即ち、複合体の分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、ｍという数に依存する。「
約」ある数の分子量とは、従来の分析法により求められるとき、分子量がこの数
の合理的範囲に入ることを意味する。ｍは、約４５０〜約９００（２０〜４０kD
aの分子量に対応する）の範囲の整数であり、好ましくはｍは、約５５０〜約８
００（約２４〜３５kDa）であり、そして最も好ましくはｍは、約６５０〜約７
００（約２９〜約３１kDa）である。

【００６５】 式（III）において、ｎという数は、ＰＥＧ単位にアミド結合を介して共有結
合しているエリトロポエチンタンパク質中のリシンアミノ酸のε−アミノ基の数
である。本発明の複合体は、ＥＰＯの１分子当たり、１個、２個、又は３個のＰ
ＥＧ単位を有していてよい。ｎは、１〜３の範囲の整数であり、好ましくはｎは
、１又は２であり、そして更に好ましくはｎは、１である。

【００６６】 式（III）の好ましいエリトロポエチンタンパク質は、下記式：

【００６７】

【化１２】

【００６８】 により表される。

【００６９】 最も好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：

【００７０】

【化１３】

【００７１】 〔上記式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；
Ｒは、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−Ｃ
Ｈ₂）_k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まない
エリトロポエチン糖タンパク質の残基である〕により表される。

【００７２】 他の好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：

【００７３】

【化１４】

【００７４】 により表される。

【００７５】 更に好ましいエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、下記式：

【００７６】

【化１５】

【００７７】 により表される。

【００７８】 これらのエリトロポエチンタンパク質は、以下により製造することができる： （ａ）式：Ｐ−〔ＮＨ₂〕_nにより表されるエリトロポエチンタンパク質のリシ
ンアミノ酸のε−アミノ基を、式：Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑにより表される二官能
性試薬と共有結合で反応させて、下記式：

【００７９】

【化１６】

【００８０】 〔式中、Ｐは、アミド結合を形成するアミノ基を除くエリトロポエチンタンパク
質であり；ｎは、１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、反応性基、例えば、カルボ
ン酸−ＮＨＳエステルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−
ＣＨ₂）_k−（ここで、ｋは、１〜約１０である）であり；そしてＱは、アルカノ
イル（例えば、アセチル）のような保護基である〕により表されるアミド結合を
持つ中間体を形成すること。

【００８１】 （ｂ）工程（ａ）からのアミド結合を持つ中間体を、式：Ｗ−〔ＯＣＨ₂ＣＨ₂ 〕_m−ＯＲにより表される活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と共有結合
で反応させて、下記式：

【００８２】

【化１７】

【００８３】 〔式中、Ｗは、スルフヒドリル反応性型のＹであり；ｍは、約４５０〜約９００
の範囲の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；そしてＹは、上記と同義であ
る〕により表されるエリトロポエチン糖タンパク質生成物を形成すること。

【００８４】 本実施態様において、二官能性試薬は、好ましくはＮ−スクシンイミジル−Ｓ
−アセチルチオプロピオナート又はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオア
セタートであり、Ｚは、好ましくはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドであり、そ
して活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体：Ｗ−〔ＯＣＨ₂ＣＨ₂〕_m−ＯＲ
は、好ましくはヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニ
ルスルホン、及びメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドよりなる群から選択される。

【００８５】 更に詳細には、式（III）のエリトロポエチンタンパク質は、ＥＰＯへのチオ
ール基の共有結合（「活性化」）及び得られた活性化ＥＰＯとポリ（エチレング
リコール）（ＰＥＧ）誘導体とのカップリングにより製造することができる。本
発明のＰＥＧ化ＥＰＯの製造のための第１工程は、ＥＰＯのＮＨ₂基を介しての
チオール基の共有結合形成を特徴とする。このＥＰＯの活性化は、保護チオール
基と、活性エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）、無水物、スルホン
酸のエステル、それぞれカルボン酸及びスルホン酸のハロゲン化物のような追加
の反応性基とを持つ二官能性試薬により実施される。チオール基は、当該分野に
おいて既知の基（例えば、アセチル基）により保護される。これらの二官能性試
薬は、アミド結合を形成することにより、リシンアミノ酸のε−アミノ基と反応
することができる。反応の第１工程は、以下に記述される：

【００８６】

【化１８】

【００８７】 ＥＰＯ、ｎ及びＸは、上記と同義であり、そしてＺは、当該分野において既知
の反応性基、例えば、下記式：

【００８８】

【化１９】

【００８９】 で示されるＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）置換基である。

【００９０】 好ましい実施態様において、リシンε−アミノ基の活性化は、スクシンイミジ
ル残基を有する二官能性試薬との反応により実施される。二官能性試薬は、異な
るスペーサー種、例えば、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−
）_k−残基（ここで、ｋは、１〜約１０、好ましくは１〜約４、そして更に好ま
しくは１又は２、そして最も好ましくは１である）を持っていてよい。

【００９１】

【化２０】

【００９２】 これらの試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート
（ＳＡＴＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ
）又はアセチルチオアルキル−カルボン酸−ＮＨＳ−エステル

【化２１】

【００９３】 〔ここで、ｋは、上記と同義である〕である。

【００９４】 二官能性試薬の製造法は、当該分野において知られている。２−（アセチルチ
オ）−（エトキシ）_k−酢酸−ＮＨＳ−エステルの前駆体は、DE-3924705に記載
されており、一方アセチルチオ化合物への誘導は、March, J., Advanced Organi
c Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376に記載されている。ＳＡＴＡは、市
販されている（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オ
レゴン州、米国及びピアース（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）。

【００９５】 ＥＰＯ分子に付加すべきチオール基の数は、反応パラメーター、即ち、タンパ
ク質（ＥＰＯ）濃度及びタンパク質／二官能性試薬比を調整することにより、選
択することができる。好ましくは、ＥＰＯは、ＥＰＯ１分子当たり１〜５個のチ
オール基、更に好ましくはＥＰＯ分子当たり１．５〜３個のチオール基を共有結
合させることにより活性化される。これらの範囲は、ＥＰＯタンパク質集団全体
にわたるチオール基の統計的分布に関する。

【００９６】 この反応は、例えば、水性緩衝液（pH６．５〜８．０）中で、例えば、１０mM
のリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ（pH７．３）中で行われる。二官能性試薬
は、ＤＭＳＯ中に加えられる。反応の終了後、好ましくは３０分後、反応は、リ
シンの添加により停止される。過剰の二官能性試薬は、当該分野において既知の
方法により、例えば、透析又はカラム濾過により分離される。ＥＰＯに付加した
チオール基の平均数は、例えば、Grasetti, D.R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Bio
chem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967)に記載されている光度測定法により求め
ることができる。

【００９７】 上記反応に続いて、活性化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体の共
有結合のカップリングが行われる。適切なＰＥＧ誘導体は、約２０〜約４０kDa
、更に好ましくは約２４〜約３５kDa、そして最も好ましくは約３０kDaの平均分
子量を持つ活性化ＰＥＧ分子である。

【００９８】 活性化ＰＥＧ誘導体は、当該分野において知られており、例えば、Morpurgo,
M.ら, J. Bioconj. Chem. (1996) 7, page 363以下にＰＥＧ−ビニルスルホンに
関して報告されている。直鎖及び分岐鎖ＰＥＧ種は、式（Ｉ）の化合物の製造に
適している。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ及
びメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである：

【００９９】

【化２２】

【０１００】 これらのヨード活性化物質の使用は、当該分野において既知であり、そして例
えば、Hermanson, G.T.のBioconjugate Techniques, Academic Press, San Dieg
o (1996) p.147-148に記載されている。

【０１０１】 最も好ましくは、ＰＥＧ種は、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ ３００
００；シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.））のような（
アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミド）を用いて、マレイミドにより活性化される。
アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドの構造は、下記式：

【０１０２】

【化２３】

【０１０３】 〔ここで、Ｒ及びｍは、上記と同義である〕で示されるとおりであり、好ましく
は下記式：

【０１０４】

【化２４】

【０１０５】 で示される。

【０１０６】 アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドとのカップリング反応は、水性緩衝液、例え
ば、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）
中でのチオール保護基のインサイチューの開裂後に起こる。保護基の開裂は、例
えば、２５℃、pH６．２で約９０分間、ＤＭＳＯ中でヒドロキシルアミンにより
実施することができる。ＰＥＧ修飾には、活性化ＥＰＯ／アルコキシ−ＰＥＧ−
マレイミドのモル比は、約１：３〜約１：６、そして好ましくは１：４であるべ
きである。反応は、システインの添加、及び残りのチオール（−ＳＨ）基とＮ−
メチルマレイミド又はジスルフィド結合を形成することができる他の適切な化合
物との反応により停止することができる。任意の残りの活性チオール基と、Ｎ−
メチルマレイミドのような保護基又は他の適切な保護基との反応のため、本発明
の複合体中のＥＰＯ糖タンパク質は、このような保護基を含んでいてもよい。一
般に、本明細書に記述される手順では、ＰＥＧ−マレイミドと複合体形成しない
糖タンパク質上の活性化チオール基の数に依存して、異なる数の保護基により保
護された種々の数のチオールを有する分子の混合物が生成する。

【０１０７】 Ｎ−メチルマレイミドは、ＰＥＧ化タンパク質上の残りのチオール基をブロッ
クするのに使用されるとき、同じタイプの共有結合を形成するが、ジスルフィド
化合物は、分子間スルフィド／ジスルフィド交換反応において、ブロッキング試
薬のジスルフィド架橋カップリングをもたらす。この型のブロッキング反応に好
ましいブロッキング試薬は、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、システイン及び
シスタミンである。システインでは、ＰＥＧ化タンパク質に追加の正味の電荷は
導入されないが、ブロッキング試薬のＧＳＳＧ又はシスタミンの使用により追加
の負又は正電荷が生じる。

【０１０８】 モノ−、ジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の分離を含む、式（III）の化合物
の更なる精製は、当該分野において既知の方法、例えば、カラムクロマトグラフ
ィーにより行われる。

【０１０９】 ＰＥＧ化エリトロポエチン誘導体を含む組成物は、好ましくは、少なくとも９
０％のモノ−ＰＥＧ複合体、即ち、ｎが１である複合体を含み、実施例５に示さ
れるように製造することができる。通常、ジ−ＰＥＧ複合体よりも高い活性を有
する傾向があるため、エリトロポエチン糖タンパク質のモノ−ＰＥＧ複合体が望
ましい。モノ−ＰＥＧ複合体の百分率、更にはモノ−及びジ−ＰＥＧ種の比は、
溶出ピークの周りのより広い画分をプールしてモノ−ＰＥＧの百分率を低下させ
るか、又は狭い画分をプールして組成物中のモノ−ＰＥＧの百分率を増大させる
ことにより、制御することができる。約９０パーセントのモノ−ＰＥＧ複合体は
、収量と活性が良好に均衡している。時として、例えば、少なくとも９２パーセ
ント又は少なくとも９６％の複合体がモノ−ＰＥＧ種（ｎは１に等しい）である
組成物が望まれることがある。本発明の実施態様において、ｎが１である複合体
の百分率は、９０％〜９６％である。

【０１１０】 本発明の組成物は、上述のように１ml当たり１０〜１００００μgのエリトロ
ポエチンタンパク質を含むことを特徴としてよい。好ましくは、本組成物は、１
ml当たり１０〜１０００μg、例えば、１０、５０、１００、４００、８００又
は２５００μgを含むことを特徴とする。

【０１１１】 更に、本発明の組成物は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエ
チンタンパク質、１０〜２００mmol/lの硫酸塩、１０〜５０mmol/lのリン酸塩（
pH６．０〜６．５）を含むことを特徴としてよい。この組成物はまた、２０mM以
下のメチオニン、１〜５％のポリオール（w/v）、０．１％以下のプルロニック
Ｆ６８（w/v）及び場合により１mM以下のＣａＣｌ₂を含むことを特徴としてよい
。この組成物の一例は、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチン
タンパク質、４０mmol/lの硫酸塩、１０mmol/lのリン酸塩、３％のマンニトール
（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）（pH６
．２）を含むことを特徴とする。

【０１１２】 本発明の更に別の実施態様において、本組成物は、１ml当たり１０μg〜１０
０００μgのエリトロポエチンタンパク質、１０〜１００mmol/lのＮａＣｌ、１
０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６．０〜７．０）、場合により１〜５％（w/v）
のポリオールを含むことを特徴としてよい。更に、この組成物は、２０mM以下の
メチオニン、０．１％以下のプルロニックＦ６８（w/v）及び場合により７．５
μmol/lのＣａＣｌ₂を含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、
１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、１００mmol
/lのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）
、及び１０mmol/lのリン酸塩（pH７．０）を含むことを特徴としてよい。

【０１１３】 本発明はまた、１ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパ
ク質、１０〜５０mmol/lのアルギニン（pH６〜pH６．５）、１０〜１００mmol/l
の硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、上記組成物に関する。更に、この組
成物は、２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のプルロニックＦ６８（w/v）
、場合により１mmol/l以下のＣａＣｌ₂及び場合により１〜５％（w/v）のポリオ
ールを含むことを特徴としてよい。具体的には、この組成物は、１ml当たり１０
μg〜１００００μgのエリトロポエチンタンパク質、４０mmol/lのアルギニン（
pH６．２）、３０mmol/lの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/v）、１０m
Mのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）及び場合により１mmol
/lのＣａＣｌ₂を含むことを特徴としてよい。

【０１１４】 本発明の好ましい実施態様は、１０〜１００００μg/mlのエリトロポエチン、
好ましくは２５〜２５００μg/mlのエリトロポエチンと、 ａ）１０mMのリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．０）
又は ｂ）１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム（pH６．２）又は ｃ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトー
ル（w/v）（pH６．２）又は ｄ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトー
ル（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）（pH
６．２）又は ｅ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/
v）（pH６．２）又は ｆ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（w/
v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）（pH６．２
） とを含むことを特徴とする組成物に関する。

【０１１５】 最も好ましい実施態様において、本組成物は、５０、１００、４００、８００
又は２５００μg/mlの量のエリトロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする
。最も好ましい組成物は、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム
、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニッ
クＦ６８（w/v）（pH６．２）、又は４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリ
ウム、３％のマンニトール（w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロ
ニックＦ６８（w/v）（pH６．２）のいずれかを含むことを特徴とする。

【０１１６】 本発明の組成物は、スプレー乾燥粉末の形状であってよい。

【０１１７】 更に本発明は、上述のような組成物の凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末である
組成物に関する。本組成物は、溶媒、例えば水の添加により復元して液体溶液を
生成するか、又は例えば吸入装置若しくは経皮投与装置により直接適用すること
ができる。

【０１１８】 本発明はまた、エリトロポエチンタンパク質を、多価の陰性荷電アニオン及び
場合により上記と同義の１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特
徴とする溶液と混合することを特徴とする、上述の組成物の製造方法を含むこと
を特徴とする。

【０１１９】 更に、本発明は、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳに関連し
た疾患の治療及び予防、及び／又は化学療法を受ける癌患者の治療に有用な医薬
の製造のための、上記と同義の組成物の使用に関する。これは、患者に上記と同
義の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者
における貧血、ＡＩＤＳ及び化学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び
予防のための方法を含む。

【０１２０】 本発明の更に別の実施態様は、上記と同義の組成物を含むことを特徴とする、
局所及び全身性の持続放出のための装置に関する。これは、例えば、ポリマー基
剤のマイクロ−又はナノ粒子のような、上述の組成物を含むことを特徴とする、
エリトロポエチンの制御放出を提供する任意の種類のインプラントであってよい
。上述の組成物はまた、充填済みシリンジとして、又は例えば、無針注射装置若
しくは吸入装置のような、他の任意の投与装置に入れて提供することができる。

【０１２１】 本発明の組成物は、注射用又は静脈内投与用の単位用量として与えることがで
きる。他方では、本発明の組成物は、液体又は固体のいずれかの形状で貯蔵する
ことができ、後で静脈内又は注射投与のために単位用量剤形に分割することがで
きる。したがって、本発明の液体組成物は、投与のための単回用量剤形としての
使用のために０．３mlという少量で与えることができる。他方では、特許請求さ
れる組成物の容量は、分配される前に一括投与剤形で貯蔵されるときに、６０リ
ットルという多量であってもよい。その安定性の強化という観点から、本発明の
組成物は、後で医師、患者及び病院に分配するのに適した包装手段に配置される
ように、大きな容器で貯蔵することができる。

【０１２２】 本発明の注射用溶液を、一般に０．３ml〜２０mlの本組成物を単回の単位用量
として投与できるシリンジのような従来の注射手段により投与することができる
。他方では、本発明の組成物は、本組成物を凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末の
いずれかとして含むアンプルを利用して、次にこれを注射の前に従来法で復元し
て、注射により投与することができる。他方では、本発明の組成物の安定性のた
め、組成物は、約０．３ml〜約１０mlの本組成物を含むバイアルのような、単位
用量剤形に分配してもよい。更に、本発明の組成物は、点滴バッグを利用して静
脈内投与することができる。このようなバッグは、溶液が患者に投与される時間
に依存して、約２０ml〜約５００mlの溶液を含む。本発明では、本発明の液体溶
液を貯蔵容器に貯蔵することができ、そこから更に、医師、病院及び患者への分
配のための少量の投与剤形のパッケージに分割することができる。本発明の組成
物の安定性のため、これらの組成物は、投与前に長期にわたってこのような貯蔵
容器に貯蔵することができる。

【０１２３】 上述の組成物のための成分として、又は上述のエリトロポエチン誘導体の製造
の出発点としてのエリトロポエチンの製造法は、例えば、米国特許第5,547,933
号及び5,621,080号、EP-B 0,148,605、Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1984) 2708-2712、EP-B 0,205,564、EP-B 0,209,539及びEP-B 0,411,678更
にはLai, P.H.ら, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121、及びSasaki, H.ら,
J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076に詳細に記載されている。治療用途の
エリトロポエチンは、組換え法により産生してもよい（EP-B 0,148,605、EP-B 0
,209,539及びEgrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J.ら, (1986) Immunobiol
. 72: 213-224）。

【０１２４】 無血清培地でのエリトロポエチンの発現及び製造のための方法は、例えば、１
９９６年１１月１４日公開のBurgのWO 96/35718、及び１９９２年６月１２日公
開のKochのヨーロッパ特許公開第513,738号に記載されている。上述の刊行物に
加えて、ＥＰＯ遺伝子を含む組換えＣＨＯ細胞の無血清発酵を実施できることは
公知である。このような方法は、例えば、EP-A 0,513,738、EP-A 0,267,678に、
そして一般的な形でKawamoto, T.ら, Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453
、EP-A 0,248,656、Kowar, J.とFranek, F., Methods in Enzymology 421 (1986
) 277-292、Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51、EP-A 0,481,791、EP-
A 0,307,247、EP-A 0,343,635、WO 88/00967に報告されている。

【０１２５】 EP-A 0,267,678では、Ｓ−セファロースでのイオン交換クロマトグラフィー、
Ｃ₈カラムでの分取逆相ＨＰＬＣ及びゲル濾過クロマトグラフィーが、透析後の
無血清培養で産生したＥＰＯの精製のために記載されている。これに関連して、
ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、Ｓ−セファロース・ファストフローでのイ
オン交換クロマトグラフィーに置き換えることができる。また、ブルー・トリス
アクリル（Blue Trisacryl）カラムでの色素クロマトグラフィーをイオン交換ク
ロマトグラフィーの前に行うことが提案されている。

【０１２６】 組換えＥＰＯの精製のためのプロセスは、Nobuo, I.ら, J. Biochem. 107 (19
90) 352-359に記載されている。しかしこのプロセスでは、ＥＰＯは、精製工程
の前に、トゥイーン（登録商標）２０、フッ化フェニルメチルスルホニル、エチ
ルマレイミド、ペプスタチンＡ、硫酸銅及びオキサミド酸で処理される。１９９
６年１１月１４日公開のBurgのWO 96/35718を含む刊行物は、無血清発酵プロセ
スでのエリトロポエチン（ＥＰＯｓｆ）の製造方法を開示している。

【０１２７】 本発明のＥＰＯ又はＥＰＯ複合体の比活性は、当該分野において既知の種々の
測定法により測定することができる。本発明の精製ＥＰＯタンパク質の生物学的
活性とは、ヒト患者に注射によりＥＰＯタンパク質を投与すると、注射していな
い、即ち対照群の被験者に比べて、骨髄細胞からの網状赤血球及び赤血球の産生
が増大するというものである。本発明により入手及び精製される、ＥＰＯタンパ
ク質、又はその断片の生物学的活性は、Annableら, Bull. Wld. Hlth. Org. (19
72) 47: 99-112及びPharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997
(2)による方法によって試験することができる。ＥＰＯタンパク質の活性を測定
するための別の生物学的検定法である、正赤血球血マウス検定法は、実施例６に
記載されている。

【０１２８】 本発明は、以下の実施例（本明細書に記述されている発明を例示するが、これ
を限定はしない）を参照することにより更に理解が深まる。

【０１２９】 実施例 実施例１：ヒトＥＰＯの発酵及び精製 ａ）接種物調製及び発酵 ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞株（EP 411,678（ジェネティクス研究所（Genetics Ins
titute））に開示されている、ＡＴＣＣ ＣＲＬ８６９５を使用できる）に由来
する、１バイアルのワーキング・セル・バンクを液体窒素貯蔵タンクのガス相か
ら取り出した。細胞をガラススピナーフラスコに移して、炭酸水素緩衝培地で加
湿ＣＯ₂インキュベーター中で培養した。接種物調製及び発酵のために使用した
典型的な無血清培地は、１９９２年６月１２日に公開のKochのヨーロッパ特許出
願513,738、又は１９９６年１１月１４日に公開のBurgのWO 96/35718に開示され
ており、例えば、培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２（例えば、ＪＲＨバイオサイエン
シーズ（JRH Biosciences）／ヘーズルトン・バイオロジックス（Hazleton Biol
ogics）、デンバー、米国、注文番号５７−７３６）を、そして追加的に炭酸水
素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルコース、組換えインスリン、亜セレン
酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄（II）、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、セリン、及び例えば、ポリビニルアルコールのような哺乳
動物細胞用の安定化剤、メチルセルロース、ポリデキストラン、ポリ（エチレン
グリコール）、プルロニックＦ６８、血漿増量剤のポリジェリン（polygelin）
（ヘムアクセル（HEMACCEL）（登録商標））又はポリビニルピロリドン（WO 96/
35718）を含む。

【０１３０】 培養物は、混入微生物が存在しないことを顕微鏡で照合し、そして細胞密度を
求めた。これらの試験は、各分離工程で実施した。

【０１３１】 初期増殖期の後、細胞培養物は、新鮮培地で開始細胞密度まで希釈して、もう
１周の増殖周期を経させた。ガラススピナーフラスコ当たり約２ｌの培養物容量
が得られるまで、この手順を繰り返した。約１２倍加後、１〜５リットルのこの
培養物が得られ、次にこれを１０ｌ接種物発酵槽のための接種物として使用した
。

【０１３２】 ３〜５日後、１０ｌ発酵槽中の培養物は、１００ｌ接種物発酵槽のための接種
物として使用することができた。

【０１３３】 更に３〜５日の培養後、１００ｌ発酵槽中の培養物は、１０００ｌ生産発酵槽
のための接種物として使用することができた。

【０１３４】 ｂ）回収及び細胞分離 バッチ再供給プロセスを使用した（即ち、所望の細胞密度に達したとき、約８
０％の培養物を回収した）。残りの培養物に新鮮培地を補充して、次の回収まで
培養した。１回の生産運転は、最大１０回の二次回収：９回の部分回収及び発酵
の最後の１回の全体回収からなる。回収は３〜４日毎に行った。

【０１３５】 測定した回収容量は、冷却容器に移した。細胞は、遠心分離又は濾過により取
り出して、廃棄した。遠心分離工程のＥＰＯ含有上清をインライン濾過して、第
２の冷却容器に回収した。各回収物は、精製の間、別々に処理した。

【０１３６】 ＥＰＯタンパク質の精製のための典型的なプロセスは、１９９６年１１月１４
日に公開のBurgのWO 96/35718に開示されている。精製プロセスを、以下に説明
する。

【０１３７】 ａ）ブルーセファロースクロマトグラフィー ブルーセファロース（ファルマシア（Pharmacia））は、表面にチバクロン青
色素（Cibacron blue dye）を共有結合する、セファロースビーズよりなる。Ｅ
ＰＯは、多くの非タンパク質性混入物、幾つかのタンパク質性不純物及びＰＶＡ
よりもブルーセファロースに強く結合するため、この工程でＥＰＯを濃縮するこ
とができる。ブルーセファロースカラムの溶出は、pHと同様に塩濃度を上昇させ
ることにより実施される。

【０１３８】 カラムに８０〜１００ｌのブルーセファロースを充填し、ＮａＯＨで再生させ
て、平衡化緩衝液（塩化ナトリウム／カルシウム及び酢酸ナトリウム）で平衡化
した。酸性にして濾過した発酵槽上清を添加した。添加の終了後、カラムは、最
初に高濃度塩化ナトリウムを含む、平衡化緩衝液と類似した緩衝液で洗浄し、続
いてトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、トリス塩基緩衝液で溶出して、マ
スター溶出プロフィールにより単一画分で回収した。

【０１３９】 ｂ）ブチルトヨパール（Butyl Toyopearl）クロマトグラフィー ブチルトヨパール６５０Ｃ（トーソーハース（Toso Haas））は、脂肪族ブチ
ル残基を共有結合でカップリングしている、ポリスチレン系マトリックスである
。ＥＰＯは、多くの不純物及びＰＶＡよりもこのゲルに強く結合するため、イソ
プロパノールを含む緩衝液で溶出しなければならない。

【０１４０】 カラムに３０〜４０ｌのブチルトヨパール６５０Ｃを詰めて、ＮａＯＨで再生
し、トリス塩基緩衝液で洗浄して、イソプロパノールを含むトリス塩基緩衝液で
平衡化した。

【０１４１】 ブルーセファロース溶出液は、カラム平衡化緩衝液中のイソプロパノールの濃
度に調整して、カラムに添加した。次にカラムを、イソプロパノール濃度が上昇
した平衡化緩衝液で洗浄した。生成物は、溶出緩衝液（イソプロパノール含量が
高いトリス塩基緩衝液）で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分
で回収した。

【０１４２】 ｃ）ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）クロマト
グラフィー ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（バイオセプラ（Biosepra））は、機械的
性質を改善するため、アガロースマトリックスに組み込まれた、ヒドロキシアパ
タイトよりなる。ＥＰＯは、ヒドロキシアパタイトに対して低い親和性を持ち、
このためタンパク質不純物よりも低いリン酸濃度で溶出され得る。

【０１４３】 カラムに３０〜４０ｌのヒドロキシアパタイトウルトロゲルを充填して、リン
酸カリウム／塩化カルシウム緩衝液及びＮａＯＨ、続いてトリス塩基緩衝液で再
生した。次にこれを、少量のイソプロパノールと塩化ナトリウムを含むトリス塩
基緩衝液で平衡化した。

【０１４４】 ブチルトヨパールクロマトグラフィーのＥＰＯ含有溶出液をカラムに添加した
。続いてカラムを平衡化緩衝液、及びイソプロパノールと塩化ナトリウムを含ま
ないトリス塩基緩衝液で洗浄した。生成物は、低濃度のリン酸カリウムを含むト
リス塩基緩衝液で溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収し
た。

【０１４５】 ｄ）ヴァイダック（Vydac）Ｃ４での逆相ＨＰＬＣ ＲＰ−ＨＰＬＣ材料のヴァイダックＣ４（ヴァイダック（Vydac））は、シリ
カゲル粒子からなり、そしてその表面にＣ４−アルキル鎖を持つ。タンパク質性
不純物からのＥＰＯの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、希
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配により実施した。

【０１４６】 分取ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８〜３．２リットルのヴァイダッ
クＣ４シリカゲルを充填）を用いて実施した。ヒドロキシアパタイトウルトロゲ
ル溶出液は、トリフルオロ酢酸を加えて酸性にし、ヴァイダックＣ４カラムに添
加した。洗浄及び溶出のために、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を
使用した。画分を回収して、直ちにリン酸緩衝液で中和した。ＩＰＣ限界内のＥ
ＰＯ画分をプールした。

【０１４７】 ｅ）ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア（Pharmacia））材料は、セファロース
ビーズの表面に共有結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。Ｄ
ＥＡＥ基へのＥＰＯの結合には、イオン相互作用が介在する。アセトニトリル及
びトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質を
洗浄した後、低pHの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより痕跡不純物を除去
した。次にカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄して、イオン強度の高い緩衝液でＥ
ＰＯを溶出した。

【０１４８】 カラムにＤＥＡＥセファロースファストフローを充填した。カラム容量は、３
〜１０mgＥＰＯ/mlゲルの範囲のＥＰＯ添加量を確保するために調整した。カラ
ムを水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）で洗浄した。ＨＰＬＣ
溶出液のプール画分を添加して、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄した。次にカラム
を洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄し
た。次いで、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）でＥ
ＰＯをカラムから溶出して、マスター溶出プロフィールにより単一画分で回収し
た。

【０１４９】 ＤＥＡＥセファロースカラムの溶出液は、特定の導電率に調整した。得られた
薬物は、無菌濾過によりテフロン（登録商標）瓶に入れて、−７０℃で貯蔵した
。

【０１５０】 実施例２：ｍＰＥＧ−ＳＢＡによるＥＰＯのＰＥＧ化 実施例１の無血清法により精製したＥＰＯ（ＥＰＯｓｆ）は、分析法により測
定すると均質であり、８個のアイソホームよりなる典型的なアイソホームパター
ンを示した。これは、正赤血球血マウス検定法により測定すると１９０，０００
IU/mgの生物学的比活性であった。使用したＰＥＧ化試薬は、メトキシ−ＰＥＧ
−ＳＢＡであったが、これは、Ｒが、メチルであり；ｘが、３であり；そしてｍ
が、６５０〜７５０（平均約６８０、約３０kDaの平均分子量に対応する）であ
る、式（II）の化合物である。

【０１５１】 ＰＥＧ化反応 ＥＰＯｓｆ １００ミリグラム（１０．３mg/ml ＥＰＯｓｆストック９．７
１ml、５．４８μmol）に、３０kDaメトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ ５０６mg（１６
．５μmol）（シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）、ハン
ツヴィル、アラバマ州から入手）を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH７．
５）１０mlを加え、室温（２０〜２３℃）で２時間混合した。最終タンパク質濃
度は、５mg/mlであり、タンパク質：ＰＥＧ試薬比は、１：３であった。２時間
後、氷酢酸でpHを４．５に調整することにより反応を停止させて、精製の準備が
できるまで−２０℃で貯蔵した。

【０１５２】 精製 １．複合体混合物：ＳＰ−セファロースＦＦ（SP-SEPHAROSE FF）（スルホ−
プロピルカチオン交換樹脂）約２８mlをアミコン（AMICON）ガラスカラム（２．
２×７．５cm）に詰めて、２０mMの酢酸緩衝液（pH４．５）で１５０ml/時の流
量で平衡化した。タンパク質３０mgを含む反応混合物６ミリリットルを平衡化緩
衝液で５倍希釈して、カラムに適用した。非吸着物質を緩衝液で洗い流して、吸
着ＰＥＧ複合体混合物をカラムから、平衡化緩衝液中の０．１７５ＭのＮａＣｌ
で溶出した。なおもカラムに残る未修飾ＥＰＯｓｆは７５０mMのＮａＣｌで溶出
した。カラムは、開始緩衝液中で再平衡化した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析して、そのＰＥＧ化の程度を測定した。０．１７５ＭのＮａＣｌ溶出液は、
モノ−更にはジ−及び痕跡量のトリ−ＰＥＧ化種を含んでいたが、一方７５０mM
のＮａＣｌ溶出液は、未修飾ＥＰＯｓｆを含んでいたことが判った。

【０１５３】 ２．ジ−ＰＥＧ及びモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ：前工程においてカラムから溶
出した精製複合体混合物を、緩衝液で４倍希釈して、カラムに再適用して、前述
のように洗浄した。ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ及びモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆを、
それぞれ０．１ＭのＮａＣｌ及び０．１７５ＭのＮａＣｌで別々にカラムから溶
出した。残りの未修飾ＥＰＯｓｆも全て溶出するために、７５０mMのＮａＣｌで
も溶出を実施した。

【０１５４】 あるいは、反応混合物を酢酸緩衝液で５倍希釈して、ＳＰ−セファロースカラ
ムに適用した（≒０．５mgタンパク質/mlゲル）。カラムを洗浄して、吸着した
モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ、ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆ及び未修飾ＥＰＯｓｆを前
セクションに記載されたように溶出した。

【０１５５】 結果 ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、数平均分子量３０kDaの直鎖状ＰＥＧ分子を化学的に
複合体形成することにより合成した。ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆは、アミド結合が生じ
る、ＥＰＯｓｆの第１級アミノ基と３０kDaのＰＥＧ−酪酸のスクシンイミジル
エステル誘導体との間の反応から誘導した。

【０１５６】 結果は、表１に要約した。精製した複合体混合物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に
より測定すると、モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆよりなり、そして未修飾Ｅ
ＰＯｓｆを含まなかった。複合体混合物は、２３．４mg、即ち出発物質の７８％
を占めた。モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＥＰＯｓｆのカチオン交換クロマトグラフィ
ーによる分離は、複合体混合物中のモノ−対ジ−ＰＥＧ比が、ほぼ１：１である
ことを示した。反応の終了後、モノ：ジ：未修飾の個々の成分の比は、４０：３
８：２０（％）であった。総収量は、ほぼ定量的であった。

【０１５７】

【表４】

【０１５８】 実施例３：ｍＰＥＧ−ＳＰＡによるＥＰＯのＰＥＧ化 実施例２で使用したＥＰＯｓｆの異なるアリコートを、３０kDaのメトキシ−
ＰＥＧ−ＳＰＡ（シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）、
ハンツヴィル、アラバマ州）と反応させた。反応は、１：２のタンパク質：試薬
比で実施して、精製法は、実施例２によった。主としてモノ−ＰＥＧ化種が生成
した。

【０１５９】 実施例４：ＥＰＯへのチオール基の共有結合形成 この実施例は、ＥＰＯへのチオール基の共有結合形成のための反応条件の決定
を開示する。条件を決定するために、ブロック化チオール基を含む異なる量の試
薬（ここではＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ（１０mg/mlまでＤＭＳＯに溶解））をＥＰ
Ｏ溶液（ここでは、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ（pH７．３）中
の５mg/mlのＥＰＯ １ml）に加えた。反応物を約３０分間撹拌（２５℃）して
、１Ｍリシン溶液を１０mMで加えることにより反応を停止させた。過剰量のＳＡ
ＴＡ及びＳＡＴＰは、１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ及び２mMのＥ
ＤＴＡ（pH６．２）に対する透析によって除去した。ヒドロキシルアミンでの保
護アセチル基の除去後、ＥＰＯに共有結合したチオール基の数を、Grasetti, D.
R.とMurray, J.F.のJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, page 41-49 (1967)に
記載された方法によって、ジチオジピリジンで光度測定法により求めた。

【０１６０】 ＥＰＯ１分子当たり共有結合したチオール基の数を以下に示した。

【０１６１】

【表５】

【０１６２】 実施例５：メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドによる活性化ＥＰＯの修飾 Ａ）ＥＰＯの活性化： 実施例１により産生したＥＰＯ １００mg（正赤血球血マウス検定法により測
定すると１９０，０００IU/mg）を実施例４によりＳＡＴＡ（モル比：ＥＰＯ／
ＳＡＴＡ＝１／５）で活性化した。共有結合したブロック化チオール基を有する
生じたＥＰＯ（「活性化ＥＰＯ」）を、実施例４に記載されるように透析により
、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドのような副産物又は未反応ＳＡＴＡから分離
した。１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２
）中の４．５mg/mlの活性化ＥＰＯの溶液を得た。

【０１６３】 Ｂ）活性化ＥＰＯのＰＥＧ化： 上述の「最も好ましい」構造を有するメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド３８０mg
（ＭＷ３０，０００；シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.
）、ハンツヴィル、（アラバマ州、米国））を活性化ＥＰＯ９５mgを含む上記溶
液（１０mMのリン酸カリウム、５０mMのＮａＣｌ、２mMのＥＤＴＡ（pH６．２）
中に４．５mg/ml）に溶解した。溶液中の活性化ＥＰＯとメトキシ−ＰＥＧ−マ
レイミドの間の得られたモル比は、１：４であった。１Ｍのヒドロキシルアミン
水溶液を３０mM（pH６．２）まで上記溶液に加えることにより、活性化ＥＰＯの
共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。溶液の反応混合物中の得
られた活性化ＥＰＯは、遊離チオール（−ＳＨ）基を含んでいた。チオール基の
脱ブロッキング後直ちに、今や遊離チオール（−ＳＨ）基を含む活性化ＥＰＯと
メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドの間で９０分間（撹拌、２５℃）カップリング反
応を行った。カップリング反応は、０．２Ｍのシステイン水溶液を２mMまで反応
混合物に加えることにより停止させた。３０分後、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミ
ドと反応しなかった活性化ＥＰＯの過剰な遊離チオール基を、ＤＭＳＯ中の０．
５ＭのＮ−メチルマレイミド溶液を５mMの濃度に達するまで加えることによりブ
ロックした。３０分後、今やＰＥＧ化ＥＰＯ種を含む得られた反応混合物を、１
０mMのリン酸カリウム（pH７．５）に対して≧１５時間透析した。

【０１６４】 Ｃ）ＰＥＧ化ＥＰＯ種の精製： 反応混合物からのＰＥＧ化ＥＰＯ種の分離のために、以下の精製プロセスを実
施した：５０mlのＱ−セファロースｆｆカラムを１０mMのリン酸カリウム（pH７
．５）で平衡化した。工程Ｂ）で得られた反応混合物をカラムに添加した（流量
：１時間当たり３カラム容量（CV））。未反応メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド試
薬を分離するために、カラムを１０mMのリン酸カリウム（pH７．５）５CVで洗浄
した。ＰＥＧ化ＥＰＯ種は、緩衝液Ａ（１０mMのリン酸カリウム（pH７．５））
５CV及び緩衝液Ｂ（１０mMのリン酸カリウム、５００mMのＮａＣｌ（pH７．５）
）５CVからなる上昇する塩勾配で、１時間当たり３CVの流量で溶出することによ
り分離した。ＮａＣｌ勾配に基づいて、ＰＥＧ化ＥＰＯ種（トリ−、ジ−及びモ
ノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）は最初に溶出し、続いて非ＰＥＧ化ＥＰＯ種を溶出した
。ＰＥＧ化ＥＰＯ種（トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）を含む溶出液
の画分をプールして濾過した（０．２μmフィルターでの無菌濾過）。

【０１６５】 トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の含量及び純度は、クーマシー染色
ＳＤＳ−ＰＡＡゲル（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）で評価したが、
同時にタンパク質濃度は、ベール−ランバートの法則（Beer-Lambert law）によ
り２８０nmで測定した。ＳＤＳ−ＰＡＡ電気泳動により求めたＥＰＯ種の見かけ
分子量は、約６８kDa（モノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）、約９８kDa（ジ−ＰＥＧ化Ｅ
ＰＯ種）、及び約１２８kDa（トリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）であった。

【０１６６】 トリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の更なる分離は、クロマトグラフィ
ー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス（Superdex）、
ｐｇ２００；ファルマシア（Pharmacia））により達成することができる。トリ
−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ化種を含む溶出液のインビボの生物学的活性の測定は
、以下に記載される方法により実施した。

【０１６７】 実施例６：正赤血球血マウス検定法により求めたＰＥＧ化ＥＰＯのインビボ活性 正赤血球血マウス生物検定法は、当該分野において既知であり（Pharm. Europ
a Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)）、そしてPh. Eur. BRPのエリ
トロポエチンのモノグラフにある方法である。試料をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した
。７〜１５週齢の健常マウスに、非ＰＥＧ化ＥＰＯ、又は実施例２若しくは３か
らのトリ−、ジ−若しくはモノ−ＰＥＧ化ＥＰＯを含む、ＥＰＯ画分０．２mlを
皮下投与した。６日間にわたって、尾静脈の穿刺により血液を採取して、血液１
μlが０．１５μmolのアクリジンオレンジ染色液１ml中に存在するように希釈し
た。染色時間は、３〜１０分とした。網状赤血球の計数は、赤色蛍光ヒストグラ
ムの分析により、フローサイトメーターで微蛍光測定法で行った。網状赤血球の
数は、絶対数によって与えた（分析した血球３０，０００個当たり）。示したデ
ータでは、各群は１日当たりマウス５匹からなり、マウスは１回だけ採血させた
。

【０１６８】 別々の実験で、単回用量の未修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ ２５ng）、実施例２からの
ＰＥＧ（ＳＢＡ）−ＥＰＯ混合物（複合体１０ng）、実施例２からのモノ−及び
ジ−ＰＥＧ化ＥＰＯ（複合体１０ng）、実施例３からのＰＥＧ（ＳＰＡ）−ＥＰ
Ｏ（複合体１０ng）、及び緩衝液をマウスに投与した。結果は、表２に示した。
この結果は、未修飾ＥＰＯ ２５ngの投与に比較した、マウス１匹当たり同じ用
量（１０ng）を用いての網状赤血球の量の有意な上昇及び最大網状赤血球数の変
化によって示される、ＰＥＧ化ＥＰＯ種の優れた活性及び半減期の延長を示して
いる。

【０１６９】

【表６】

【０１７０】 実施例７：大部分モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯの調製 ＰＥＧ化反応 実施例１により調製した、１００mMのリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）中の
ＥＰＯｓｆ １００mg（５．４８μmol）から出発して、１mMのＨＣｌ ３mlに
溶解した３０kDaのＰＥＧ−ＳＢＡ試薬３２９mg（１０．９６μmol）を加えた。
十分な１００mMのリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）を加えて、反応混合物の容
量を２０mlにした。最終タンパク質濃度は、５mg/mlであり、タンパク質：ＰＥ
Ｇ試薬比は、１：２であった。反応混合物を周囲温度（２０〜２２℃）で２時間
混合した。２時間後、氷酢酸でpHを４．５に調整することにより反応を停止させ
、精製の準備ができるまで−２０℃で凍結貯蔵した。

【０１７１】 精製 前工程からの反応混合物を１０mMの酢酸ナトリウム（pH４．５）で１：５希釈
して、４．２×１９cmカラムに詰めたＳＰ−セファロースＦＦ（スルホプロピル
カチオン交換樹脂）３００mlに適用した。カラムは、同じ緩衝液で前もって平衡
化した。カラム流出液をギルソン（Gilson）ＵＶモニターで２８０nmでモニター
して、キップとゾーネンの記録器（Kipp and Zonen recorder）で記録した。カ
ラムを平衡化緩衝液３００ml、即ち１床容量で洗浄して、過剰な試薬、反応副産
物及びオリゴマーのＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。続いて１００mMのＮａＣｌ ２
床容量で洗浄して、ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。次にモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯ
を２００mMのＮａＣｌで溶出した。モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯの溶出の間、タンパク
質ピークの最初の５０mlを廃棄して、モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを１５０ml画分とし
て回収した。カラムに残る未修飾ＥＰＯｓｆを７５０mMのＮａＣｌで溶出した。
全ての溶出緩衝液は、平衡化緩衝液中で製造した。溶出した試料は全て、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより、及び高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により
分析した。検出可能な未修飾ＥＰＯｓｆを含まなかった、１５０ml画分から得ら
れたモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯのプールは、次に≒４．５〜７．５mg/mlに濃縮して
、貯蔵緩衝液の１０mMのリン酸カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．５）中に
ダイアフィルトレーションにより加えた。濃縮／ダイアフィルトレーションは、
５０kDaカットオフのミリポア・ペリコンＸＬバイオマックス５０（Millipore P
ellicon XL Biomax 50）膜を取り付けたミリポア・ラブスケール（Millipore La
bscale）（登録商標）ＴＦＦシステムで周囲温度で実施した。濃縮モノ−ＰＥＧ
−ＥＰＯは、無菌濾過して、−２０℃で凍結貯蔵した。

【０１７２】 約７５％のＥＰＯｓｆがＰＥＧ化した。精製後、全収率は、≒３０％のモノ−
ＰＥＧ−ＥＰＯであり、検出可能な未修飾ＥＰＯｓｆはなく、そしておよそ２５
％のジ−ＰＥＧ−ＥＰＯであった。オリゴマー、及び非ＰＥＧ化ＥＰＯｓｆが残
りのタンパク質を占めた。１５０ml画分から得られたモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯのプ
ールは、約９０％のモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯと約１０％のジ−ＰＥＧ−ＥＰＯを含
んでいた。

【０１７３】 実施例８：種々の処方中のＥＰＯ及びＰＥＧ化ＥＰＯの熱安定性：ＤＳＣ（示差
走査熱量測定法）による分析 示差走査熱量測定法により測定される熱変性の転移温度が、タンパク質の熱安
定性に関する有効な指標であることは、一般に認められている。０．６〜１．２
mg/mlの間の濃度のエリトロポエチン又はＰＥＧ化エリトロポエチン溶液を、安
定化剤を含むか又は含まない種々の緩衝液中で、ナノ−ＤＳＣ（Nano-DSC）（カ
ロリメトリック・サイエンシーズ・コーポレーション（Colorimetric Sciences
Corporation）、ユタ州、米国）によって２K/分の加熱速度で分析した。転移温
度の上昇は、タンパク質の熱安定性の上昇を示す。測定温度値は、絶対値として
理解すべきでなく、むしろ別の処方に対する個々の処方の安定性の差を表す。

【０１７４】 処方の最適pHを規定するために、４〜９の範囲において、ＰＥＧ化エリトロポ
エチンの熱変性のpH依存性を検討した。タンパク質試料は、３０mMのＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄、３０mMのクエン酸ナトリウム、３０mMのホウ酸中で分析した。図３は、約p
H６〜約pH９の間での最大転移温度のプラトーと、pH５．５より下での鋭い低下
を示した。このことは、最大熱安定性のための最適pHは、pH５．５より上である
ことを示す（図３）。

【０１７５】 イオン強度の作用を調査するために、熱変性のリン酸濃度依存性を求めた。図
４は、熱安定性が、処方のイオン強度の上昇に伴い上昇することを示している。

【０１７６】 緩衝剤の影響もＤＳＣにより調査した。図５から、高い熱安定性のために最も
適した緩衝剤又は添加剤は、硫酸、クエン酸又はリン酸塩であることが判る。現
在利用可能な処方において緩衝剤として使用されているグリシン（上記を参照の
こと）は、さほど適していなかった。

【０１７７】 図６は、硫酸塩は、低pH（例えば、pH６．２）でも適切な緩衝剤／添加剤であ
るが、一方リン酸塩は、pH７．５に比較してpH６．２ではあまり適していないこ
とを示している。このことは、硫酸塩が、低pHであっても熱安定性を高く保持す
ることを示す。この知見によって、pH６．０〜６．５の処方が、エリトロポエチ
ンの熱安定性に激しい消失のないことが見込める。

【０１７８】 実施例９：熱ストレス下のＥＰＯ及びＰＥＧ−ＥＰＯの凝集：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析 エリトロポエチンタンパク質に及ぼす熱ストレスの作用を調査するために、異
なる処方中の試料を熱ストレス（８０℃、２０分）に曝露して、還元（試料緩衝
液中にＤＴＴを含む）及び非還元（試料緩衝液中にＤＴＴを含まない）条件下で
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
により分析した。この方法によって、共有結合の凝集体形成が検出できる。上に
略述されるように、凝集体形成は、タンパク質の主要な分解経路の１つであり、
よってタンパク質の製剤においては防止する必要がある。還元剤（例えば、ＤＴ
Ｔ）の非存在下で検出でき、かつ還元剤の存在下で検出できない凝集体は、恐ら
く熱ストレス下での誤ったジスルフィド架橋である酸化反応により形成される。
図７は、熱ストレス下での凝集のpH依存性を示す。この実験は、凝集体の形成が
、６．５より低いpHで抑制されることを明白に示した。pHが高いほど、凝集体の
量が高い。形成される凝集体の多くは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に試料を還元剤で
処理することにより減少させることができるが、このことは、熱ストレス下で形
成される凝集体の大部分がジスルフィド架橋したダイマー、オリゴマー及びもっ
と高次の凝集体であることを示唆している。ひとまとめにすると、このことは、
処方のpHをpH６．５以下に保持することにより、凝集体の形成を大部分防止でき
ることを示している。

【０１７９】 図７：pHへのＰＥＧ−ＥＰＯ凝集の依存性。（上述のような）熱ストレス後の
ＰＥＧ−ＥＰＯ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質は銀で染色
した。レーン１：分子量標準。レーン２：pH５。レーン３：pH５、還元。レーン
４：pH６。レーン５：pH６、還元。レーン６：pH６．５。レーン７：pH６．５、
還元。レーン８：pH７。レーン９：pH７、還元。レーン１０：ＰＥＧ−ＥＰＯ、
ストレスなし。

【０１８０】 凝集体の形成はまた、酸化防止剤の使用により防止することができる。図８は
、酸化防止剤として１mg/mlのアセチルシステインを使用すると、熱ストレス下
の凝集体の形成が防止されることを示している。したがって、熱ストレス下の凝
集体形成を防止するために、低pH、例えばpH６．２で、例えばアセチルシステイ
ンのような酸化防止剤を使用することは有用である。

【０１８１】 図８：ＰＥＧ−ＥＰＯ凝集は、pH６．２及び／又はアセチルシステインにより
防止することができる。（上述のような）熱ストレス後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質は銀で染色した。レーン１：ＰＥ
Ｇ−ＥＰＯ、ストレスなし。レーン２：pH７．５、ストレス。レーン３：pH６．
２、ストレス。レーン４：pH６．２、ストレス、還元。レーン５：pH７．５、１
mg/mlアセチルシステイン、ストレス。レーン６：pH７．５、１mg/mlアセチルシ
ステイン、ストレス、還元。

【０１８２】 実施例１０：４、２５、３０及び４０℃での種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯの安
定性 種々の処方中のＰＥＧ化ＥＰＯを幾つかの温度でインキュベートした。表示時
点で、試料を取り出し、逆相高性能クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）、高性
能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により安定性を評価した。表３
は、幾つかの温度での種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯの安定性を比較している。
これらのデータは、タンパク質回収及び凝集に関して、本明細書に囲い込まれた
処方の優越性を明白に示している。

【０１８３】

【表７】

【０１８４】 *処方は、下記である： 処方Ａ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mM塩化ナトリウム、pH７．５。 処方Ｂ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）の
マンニトール、pH６．２。 処方Ｃ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMのＮａＣｌ、pH７．０。 処方Ｄ：１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム、pH６．２。 処方Ｅ：４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、
１mMのＣａＣｌ₂、pH６．２。

【０１８５】 実施例１１：最適処方はＥＰＯタンパク質におけるメチオニン５４の酸化を抑制
する、酸化防止剤としてのメチオニン 種々の処方中のＰＥＧ化ＥＰＯを幾つかの温度でインキュベートした。６ヶ月
後、試料を取り出し、以下のように、メチオニン５４の酸化の程度を測定した。
簡単に述べると、ＥＰＯ試料をエンドプロテイナーゼのＬｙｓＣで処理した。得
られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分離した。酸化したペプチドＴ
８（酸化したメチオニン５４を含む）対ペプチドＴ８（酸化されていないメチオ
ニン５４を含む）の比を計算した。データは、表４に要約した。

【０１８６】

【表８】

【０１８７】 *処方は以下に列挙される。 処方Ａ：１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMの塩化ナトリウム、pH７．０。 処方Ｂ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）の
マンニトール、pH６．２。 処方Ｃ：１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）の
マンニトール、１mMのメチオニン、pH６．２。

【０１８８】 これらのデータは、本発明の好ましい処方（１０mMのリン酸ナトリウム、４０
mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール、pH６．２）が、メチオニン
５４の酸化の程度に関して、他の処方（１０mMのリン酸ナトリウム、１００mMの
ＮａＣｌ、pH７．０）よりも優れていることを明白に示した。処方に１又は１０
mMのメチオニンを添加すると、メチオニン５４の酸化が明らかに抑制された。し
たがって、メチオニンは酸化防止剤として作用して、ＥＰＯを安定化する。

【０１８９】 実施例１２：種々の処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル酸含量 ＰＥＧ−ＥＰＯ糖タンパク質の炭水化物構造の完全性を分析するために、種々
の温度で６ヶ月間貯蔵後の最適化処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル酸含量を
標準法により分析した。これらのデータは、炭水化物構造の完全性が、本明細書
に記載される新しい処方でのタンパク質の貯蔵によって否定的な影響を受けない
ことを示している（図９）。

【０１９０】 実施例１３：長期間高温で貯蔵後のＰＥＧ化ＥＰＯの生物活性 １０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニ
トール（pH６．２）中のＰＥＧ−ＥＰＯの貯蔵が、インビボの生物活性に否定的
な影響を及ぼさないことを試験するために、標準的マウスＥＰＯ検定法を行った
（実施例６を参照のこと）。表示される温度で、１０mMのリン酸ナトリウム、４
０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で６ヶ月間
貯蔵したＰＥＧ−ＥＰＯ試料は、新鮮標準品に比較して４、２５及び３０℃での
貯蔵後にインビボ活性の消失がないことを示した（図１０）。

【０１９１】 実施例１４：高温で６ヶ月間貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯの凝集体含量 １０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v）のマンニ
トール（pH６．２）中で高温で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料中の凝集体含量を分
析するために、６ヶ月後試料を取り出して、サイズ排除クロマトグラフィーによ
り分析した。

【０１９２】 ４、２５及び３０℃で凝集体は検出されなかったが、このことにより上述の処
方中のＰＥＧ化ＥＰＯの安定性が証明された。図１１は、サイズ排除クロマトグ
ラムのオーバーレイを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＥＰＯの１次構造（１６５個のアミノ酸）（配列番号１）

【図２】 ヒトＥＰＯの１次構造（１６６個のアミノ酸）（配列番号２）

【図３】 熱安定性に及ぼすpHの影響。転移温度がpHに対してプロットされている。

【図４】 熱安定性に及ぼすイオン強度の影響。転移温度がリン酸塩濃度に対してプロッ
トされている。

【図５】 緩衝剤への熱安定性の依存。

【図６】 図６は、硫酸塩は、低pH（例えば、pH６．２）でも適切な緩衝剤／添加剤であ
るが、一方リン酸塩は、pH７．５に比較してpH６．２ではあまり適切ではないこ
とを示す。このことは、硫酸塩が低pHであっても熱安定性を高く保持することを
示している。

【図７】 pHへのＰＥＧ−ＥＰＯ凝集の依存性。（上述のような）熱ストレス後のＰＥＧ
−ＥＰＯ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を銀で染色した。
レーン１：分子量標準。レーン２：pH５。レーン３：pH５、還元。レーン４：pH
６。レーン５：pH６、還元。レーン６：pH６．５。レーン７：pH６．５、還元。
レーン８：pH７。レーン９：pH７、還元。レーン１０：ＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレ
スなし。

【図８】 図８は、酸化防止剤として１mg/mlのアセチルシステインを使用すると、熱ス
トレス下での凝集体の形成が防止されることを示す。熱ストレス（８０℃、２０
分）下のＰＥＧ−ＥＰＯの凝集：レーン１：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレ
スなし；レーン２：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス；レーン３：pH６．２
のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス；レーン４：pH６．２のＰＥＧ−ＥＰＯ、ストレス
、還元；レーン５：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、＋１mg/mlのＮ−アセチル−シ
ステイン、ストレス；レーン６：pH７．５のＰＥＧ−ＥＰＯ、＋１mg/mlのＮ−
アセチル−システイン、ストレス、還元。

【図９】 種々の温度で６ヶ月間貯蔵した、新しい処方中のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のシアル
酸（ＮＡＮＡ）含量。

【図１０】 幾つかの温度で６ヶ月間、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウ
ム、３％（w/v）のマンニトール（pH６．２）中で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料
のマウス生物活性検定。

【図１１】 ６ヶ月間、１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％（w/v
）のマンニトール（pH６．２）中で貯蔵後のＰＥＧ−ＥＰＯ試料のサイズ排除ク
ロマトグラムのオーバーレイ（下から上へ：緩衝液、出発物質、４℃、２５℃、
３０℃及び４０℃）。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１１月１４日（２００２．１１．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【表１】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
有する、請求項２６〜２８記載の組成物。

【表２】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
有する、請求項３１記載の組成物。

【化１】 〔式中、ｍ、ｎ、ｘ及びＲは、上記と同義であり、そしてＰは、ポリ（エチレン
グリコール）基とアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を含まない糖タンパク
質の残基である〕で示されるエリトロポエチンタンパク質を有する、請求項３５
記載の組成物。

【化２】 で示される）を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ（エチレングリ
コール）残基の平均分子量が、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり
、そして複合体の分子量が、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである
、請求項３４記載の組成物。

【化３】 〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは
、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂
）_k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項
３８記載の組成物。

【化４】 〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは
、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂
）_k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される複合体を有する、請求項
３８記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/20 Ａ６１Ｋ 47/34 47/34 Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 7/06 13/12 13/12 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/505 Ｃ０７Ｋ 14/505 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＣ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C076 AA12 BB11 DD24Z DD26Z DD38A DD55S EE23A FF31 FF63 GG45 4C084 AA02 AA03 AA07 BA22 BA34 CA53 CA59 DB56 MA05 MA17 MA66 NA03 NA12 ZA551 ZA811 ZB261 ZC551 4H045 AA10 AA30 BA10 BA51 BA57 DA13 EA24 FA51 FA60 GA21

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エリトロポエチンタンパク質、約５．５〜約７．０の範囲に
   溶液pHを保持するのに適した薬剤学的に許容しうる緩衝液中の多価の荷電無機ア
   ニオン、及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特
   徴とする、液体薬剤組成物。
2. 【請求項２】 水性溶液である、請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 等張性溶液である、請求項１〜２記載の組成物。
4. 【請求項４】 アニオンが、多価の荷電無機強酸のアニオンである、請求項
   １〜３記載の組成物。
5. 【請求項５】 アニオンが、硫酸、クエン酸又はリン酸イオンよりなる群か
   ら選択される、請求項１〜４記載の組成物。
6. 【請求項６】 アニオンが、硫酸アニオンである、請求項１〜５記載の組成
   物。
7. 【請求項７】 １０〜２００mmol/lの硫酸塩を含むことを特徴とする、請求
   項６記載の組成物。
8. 【請求項８】 pHが、５．８〜６．７である、請求項１〜７記載の組成物。
9. 【請求項９】 pHが、６．０〜６．５である、請求項８記載の組成物。
10. 【請求項１０】 pHが、約６．２である、請求項９記載の組成物。
11. 【請求項１１】 緩衝液が、リン酸緩衝液又はアルギニン／Ｈ₂ＳＯ₄／Ｎａ₂ ＳＯ₄緩衝液よりなる群から選択される、請求項１〜１０記載の組成物。
12. 【請求項１２】 緩衝液が、１０〜５０mmolのリン酸緩衝液である、請求項
    １１記載の組成物。
13. 【請求項１３】 組成物が、１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１２記載の組成物。
14. 【請求項１４】 １つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤が、薬剤学的に許
    容しうる塩、希釈剤、溶媒及び保存料よりなる群から選択される、請求項１３記
    載の組成物。
15. 【請求項１５】 薬剤学的に許容しうる賦形剤が、張度剤、ポリオール類、
    酸化防止剤及び非イオン性界面活性剤よりなる群から選択される、請求項１３及
    び１４記載の組成物。
16. 【請求項１６】 薬剤学的に許容しうる賦形剤が、ポリオールである、請求
    項１３〜１５記載の組成物。
17. 【請求項１７】 ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、グリセロー
    ル、トレハロース及びサッカロースよりなる群から選択される、請求項１６記載
    の組成物。
18. 【請求項１８】 ポリオールが、マンニトールである、請求項１７記載の組
    成物。
19. 【請求項１９】 酸化防止剤を含むことを特徴とする、請求項１３〜１８記
    載の組成物。
20. 【請求項２０】 酸化防止剤が、メチオニンである、請求項１９記載の組成
    物。
21. 【請求項２１】 １mmol/l以下のＣａＣｌ₂を含むことを特徴とする、請求
    項１３〜２０記載の組成物。
22. 【請求項２２】 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０、ポリソル
    ベート２０又はプルロニックＦ６８である、請求項１５〜２２記載の組成物。
23. 【請求項２３】 非イオン性界面活性剤が、プルロニックＦ６８である、請
    求項２２記載の組成物。
24. 【請求項２４】 組成物が、１％（w/v）以下の非イオン性界面活性剤を含
    むことを特徴とする、請求項２２又は２３記載の組成物。
25. 【請求項２５】 組成物が、０．１％（w/v）以下の非イオン性界面活性剤
    を含むことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の組成物。
26. 【請求項２６】 エリトロポエチンタンパク質が、ヒトエリトロポエチンで
    ある、請求項１〜２５記載の組成物。
27. 【請求項２７】 エリトロポエチンタンパク質が、内因性遺伝子活性化によ
    り発現される、請求項２６記載の組成物。
28. 【請求項２８】 エリトロポエチンタンパク質が、配列番号１又は配列番号
    ２のアミノ酸配列を有する、請求項２６〜２７記載の組成物。
29. 【請求項２９】 タンパク質が、１〜６個のグリコシル化部位の付加により
    修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する、請求項２６〜２８記載の組成
    物。
30. 【請求項３０】 エリトロポエチンタンパク質が、下記： 【表１】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
    有する、請求項２６〜２８記載の組成物。
31. 【請求項３１】 ヒトエリトロポエチンの配列が、少なくとも１個のグリコ
    シル化部位の転位により修飾される、請求項２６〜３０記載の組成物。
32. 【請求項３２】 転位が、ヒトエリトロポエチンのＮ結合グリコシル化部位
    のいずれかの欠失と、ヒトエリトロポエチンの配列の８８位でのＮ結合グリコシ
    ル化部位の付加とを特徴とする、請求項３１記載の組成物。
33. 【請求項３３】 糖タンパク質が、下記： 【表２】 よりなる群から選択される修飾により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を
    有する、請求項３１記載の組成物。
34. 【請求項３４】 請求項のいずれか１項記載のエリトロポエチンタンパク質
    が、ＰＥＧ化されている、請求項２６〜３３記載の組成物。
35. 【請求項３５】 エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体
    は、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の
    産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエチン
    及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加又は少なくとも１個のグリ
    コシル化部位の転位により修飾されたヒトエリトロポエチンの配列を有する）よ
    りなる群から選択されるエリトロポエチン糖タンパク質を含むことを特徴とし；
    該糖タンパク質は、式：−ＣＯ−（ＣＨ₂）_x−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_m−ＯＲの「ｎ
    」個のポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており、各ポリ（エチレング
    リコール）基の−ＣＯは、該アミノ基の１個とのアミド結合を形成する（ここで
    、Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２又は３であり；ｍは、約４５０〜約９０
    ０であり；ｎは、１〜３であり、そしてｎ及びｍは、複合体からエリトロポエチ
    ン糖タンパク質を差し引いた分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトン
    であるように選択される）、請求項３４記載の組成物。
36. 【請求項３６】 式（Ｉ）： 【化１】 〔式中、ｍ、ｎ、ｘ及びＲは、上記と同義であり、そしてＰは、ポリ（エチレン
    グリコール）基とアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を含まない糖タンパク
    質の残基である〕で示されるエリトロポエチンタンパク質を有する、請求項３５
    記載の組成物。
37. 【請求項３７】 式（Ｉ）において、ｘが、２であり、ｍが、６５０〜７５
    ０であり、ｎが、１であり、そしてＲが、メチルである、請求項３６記載の組成
    物。
38. 【請求項３８】 エリトロポエチンタンパク質が、複合体であり、該複合体
    は、少なくとも１個の遊離アミノ基を有し、かつ骨髄細胞に網状赤血球及び赤血
    球の産生を増大させるインビボの生物学的活性を有し、そしてヒトエリトロポエ
    チン及びその類似体（１〜６個のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒト
    エリトロポエチンの１次構造を有する）よりなる群から選択されるエリトロポエ
    チン糖タンパク質を含むことを特徴とし；該糖タンパク質は、１〜３個の低級ア
    ルコキシポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており、各ポリ（エチレン
    グリコール）基は、リンカーである式：−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ここで、リ
    ンカーの−ＣＯは、該アミノ基の１個とのアミド結合を形成し、Ｘは、−（ＣＨ₂ ）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_k−であり、ｋは、１〜１０であり、Ｙ
    は、下記式： 【化２】 で示される）を介して糖タンパク質に共有結合しており、各ポリ（エチレングリ
    コール）残基の平均分子量が、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり
    、そして複合体の分子量が、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである
    、請求項３４記載の組成物。
39. 【請求項３９】 下記式： 【化３】 〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは
    、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂
    ）_k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
    リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される、請求項３８記載の複合
    体。
40. 【請求項４０】 下記式： 【化４】 〔式中、ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり；Ｒは
    、低級アルキルであり；Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂
    ）_k−であり、そしてＰは、Ｘとのアミド結合を形成するアミノ基を含まないエ
    リトロポエチン糖タンパク質の残基である〕で示される、請求項３９記載の複合
    体。
41. 【請求項４１】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜４０記載の組成物。
42. 【請求項４２】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、１０〜２００mmol/lの硫酸塩、及び１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH
    ６．０〜６．５）を含むことを特徴とする、請求項１〜４１記載の組成物。
43. 【請求項４３】 ２０mM以下のメチオニン、１〜５％のポリオール（w/v）
    、０．１％以下のプルロニックＦ６８（w/v）及び場合により１mM以下のＣａＣ
    ｌ₂を含むことを特徴とする、請求項４２記載の組成物。
44. 【請求項４４】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、４０mmol/lの硫酸塩、１０mmol/lのリン酸塩、３％のマンニトール（
    w/v）、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（w/v）（pH６．
    ２）を含むことを特徴とする、請求項４２又は４３記載の組成物。
45. 【請求項４５】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、１０〜１００mmol/lのＮａＣｌ、１０〜５０mmol/lのリン酸塩（pH６
    ．０〜７．０）、場合により１〜５％のポリオールを含むことを特徴とする、請
    求項１〜４１記載の組成物。
46. 【請求項４６】 ２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のプルロニックＦ
    ６８及び場合により７．５μmol/lのＣａＣｌ₂を含むことを特徴とする、請求項
    ４５記載の組成物。
47. 【請求項４７】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、１００mmol/lのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロ
    ニックＦ６８、及び１０mmol/lのリン酸塩（pH７．０）を含むことを特徴とする
    、請求項４５又は４６記載の組成物。
48. 【請求項４８】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、１０〜５０mmol/lのアルギニン（pH６〜pH６．５）、１０〜１００mm
    ol/lの硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜４１記載の組成物。
49. 【請求項４９】 ２０mM以下のメチオニン、０．１％以下のプルロニックＦ
    ６８、場合により１mmol/l以下のＣａＣｌ₂及び場合により１〜５％のポリオー
    ル含むことを特徴とする、請求項４８記載の組成物。
50. 【請求項５０】 １ml当たり１０μg〜１００００μgのエリトロポエチンタ
    ンパク質、４０mmol/lのアルギニン（pH６．２）、３０mmol/lの硫酸ナトリウム
    、３％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８
    及び場合により１mmol/lのＣａＣｌ₂を含むことを特徴とする、請求項４８又は
    ４９記載の組成物。
51. 【請求項５１】 ２５〜２５００μg/mlのエリトロポエチンと、 ａ）１０mMのリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMのＮａＣｌ（pH７．０）
    又は ｂ）１０mMのリン酸ナトリウム、１２０mMの硫酸ナトリウム（pH６．２）又は ｃ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトー
    ル（pH６．２）又は ｄ）１０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトー
    ル、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（pH６．２）又は ｅ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール（pH
    ６．２）又は ｆ）４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマンニトール、１
    ０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（pH６．２） とを含むことを特徴とする、請求項１〜４１記載の組成物。
52. 【請求項５２】 エリトロポエチンの量が、５０、１００、４００、８００
    又は２５００μg/mlである、請求項１〜５１記載の組成物。
53. 【請求項５３】 １０mMのリン酸ナトリウム、４０mMの硫酸ナトリウム、３
    ％のマンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（pH
    ６．２）を含むことを特徴とする、請求項５２記載の組成物。
54. 【請求項５４】 ４０mMのアルギニン、３０mMの硫酸ナトリウム、３％のマ
    ンニトール、１０mMのメチオニン、０．０１％のプルロニックＦ６８（pH６．２
    ）を含むことを特徴とする、請求項５２記載の組成物。
55. 【請求項５５】 凍結乾燥品又はスプレー乾燥粉末である、請求項１〜５４
    記載の組成物。
56. 【請求項５６】 エリトロポエチンタンパク質を、多価の陰性荷電アニオン
    及び場合により１つ以上の薬剤学的に許容しうる賦形剤を含むことを特徴とする
    溶液と混合することを特徴とする、請求項１〜５４のいずれか１項記載の組成物
    の製造方法。
57. 【請求項５７】 慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳに関連
    した疾患の治療及び予防、及び／又は化学療法を受ける癌患者の治療に有用な医
    薬の製造のための、請求項１〜５４のいずれか１項記載の組成物の使用。
58. 【請求項５８】 慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳ及び化
    学療法を受ける癌患者に付随する疾患の治療及び予防のための方法であって、患
    者に請求項１〜５４のいずれか１項記載の組成物を投与する工程を特徴とする方
    法。
59. 【請求項５９】 請求項１〜５４のいずれか１項記載の組成物を含むことを
    特徴とする、局所及び全身性の持続放出のための装置。
60. 【請求項６０】 本明細書に記載される発明。