PL219131B1

PL219131B1 - Ciekła kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie

Info

Publication number: PL219131B1
Application number: PL361341A
Authority: PL
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2015-03-31
Also published as: ES2237574T3; CA2408685C; PE20020050A1; BR0110914A; EP1311285A2; ME00673B; TWI288644B; WO2001087329A8; HUP0302114A2; DE60109625T2; NO330934B1; UY26704A1; CZ20024005A3; IL152659A; DK1311285T4; CZ304855B6; MXPA02011303A; HK1056683A1; MEP90708A; KR20030001509A

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy ciekłej kompozycji farmaceutycznej, sposobu jej wytwarzania oraz jej zastosowania. Kompozycja ta jest szczególne użyteczna w profilaktyce i leczeniu chorób związanych z erytropoezą.

Erytropoeza jest procesem wytwarzania erytrocytów, który równoważy proces niszczenia komórek. Erytropoeza jest kontrolowanym mechanizmem fizjologicznym zapewniającym dostępność erytrocytów w ilości wystarczającej do odpowiedniego natlenienia tkanek. Naturalnie występująca ludzka erytropoetyna (hEPO) jest wytwarzana w nerkach i jest humoralnym czynnikiem osoczowym stymulującym wytwarzanie erytrocytów (Carnot, P i Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W i Plzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4). Naturalnie występująca EPO stymuluje podziały i różnicowanie zaangażowanych prekursorów erytroidowych w szpiku kostnym i wywiera działanie biologiczne przez wiązanie się z receptorami na prekursorach erytroidowych (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).

Erytropoetynę wytwarza się drogą biosyntezy z użyciem metod rekombinacji DNA (Egrie, JC,

Strickland, TW, Lane, J i inni (198 6) Immunobiol. 72: 213-224) i jest ona produktem sklonowanego ludzkiego genu EPO wstawionego do komórek tkanki jajnika chomika chińskiego (komórek CHO) i ulegającego w nich ekspresji. Podstawową strukturę dominującej, całkowicie przetworzonej postaci hEPO przedstawiono w SEQ ID NO:1. Występują w niej dwa mostki disulfidowe, pomiędzy 7 161 29 33

Cys⁷-Cys¹⁶¹ i Cys²⁹-Cys³³. Masa cząsteczkowa łańcucha polipeptydowego EPO bez grup cukrowych wynosi 18236 Da. W nienaruszonej cząsteczce EPO około 40% masy cząsteczkowej stanowią grupy węglowodanowe glikozylujące białko w miejscach glikozylacji białka (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A i Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Ze względu na to, że ludzka erytropoetyna jest niezbędna do tworzenia erytrocytów, hormon ten jest użyteczny w leczeniu zaburzeń charakteryzujących się niskim lub zaburzonym wytwarzaniem erytrocytów. Klinicznie EPO stosuje się w leczeniu niedokrwistości u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR i inni (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK i inni (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D i inni (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) oraz u pacjentów z AIDS i u pacjentów z rakiem poddawanych chemioterapii (Danna, RF, Rudnick, SA, Abels, RI, w: MB, Garnick, red., Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective, New York, NY: Marcel Dekker; 1990: str. 301-324).

W WO9640073 opisano kompozycję zawierającą stabilną erytropoetynę nie podlegającą agregacji do przedłużonego uwalniania w organizmie, oraz sposób jej wytwarzania.

W US5661125A ujawniono stabilne kompozycje erytropoetyny, zawierające silne środki konserwujące i izotoniczne, oraz czynniki buforujące.

W WO98/05363A2 ujawniono kompozycje zawierające polipeptydy związane N-końcem z rozpuszczalnym w wodzie polimerem do leczenia stanów związanych z anemią.

Znane kompozycje farmaceutyczne wykazują co najmniej jedną z poniższych niedogodności:

- są one liofilizatami. Oprócz skomplikowanej procedury wytwarzania, liofilizaty mają taką wadę, że trzeba je roztworzyć przed wstrzyknięciem ludziom. Powoduje to konieczność dodatkowej manipulacji przez personel medyczny, co jest niewygodne i wprowadza ryzyko nieodpowiedniej manipulacji produktem farmaceutycznym;

- zawierają one jako dodatek albuminę surowicy ludzkiej. Ze względu na to, że albumina surowicy jest produktem pochodzącym z ludzkich płynów ustrojowych, występuje zagrożenie zakażeń wirusowych przez zanieczyszczenia w preparacie albuminy. Poza tym możliwe są reakcje alergiczne;

- wszystkie obecnie dostępne w handlu kompozycje erytropoetyny są nietrwałe w podwyższonej temperaturze, tj. powyżej temperatury w lodówce, która zazwyczaj wynosi 2 - 8°C. Zatem trzeba je przechowywać w lodówce (2 - 8°C) i nie można ich przechowywać w temperaturze pokojowej (około 20°C). Powoduje to wzrost kosztów ze względu na konieczność przechowywania i transportu w niskiej temperaturze, a także niedogodność przy manipulowaniu produktem leczniczym. Nietrwały w tym znaczeniu oznacza, że przechowywanie w podwyższonej temperaturze, np. w 25°C przez dłuższy okres czasu (tj. przez kilka miesięcy lub dłużej niż 6 miesięcy) prowadzi do degradacji białka. Degradacja w tym znaczeniu obejmuje zmiany fizyczne (np. agregację lub denaturację) oraz zmiany chemiczne (np. utlenienie lub ogólnie modyfikacje wiązań chemicznych) cząsteczki białka, odnośnie których wiadomo, że zachodzą najłatwiej w podwyższonej temperaturze (powyżej 8°C). Inkubacja białka

PL 219 131 B1 w temperaturze w pobliżu lub powyżej temperatury przejścia (która jest także nazywana temperaturą topnienia) prowadzi do rozfałdowania białka, czyli utraty struktury i aktywności biologicznej polipeptydu. Temperatura przejścia jest silnie skorelowana z trwałością temperaturową białka i zależy od środowiska białka (np. pH, soli, siły jonowej, substancji buforującej itd.). Przykładowo denaturacja może prowadzić do agregacji cząsteczek erytropoetyny, czyli tworzenia dimerów (kowalencyjnych lub niekowalencyjnych), agregatów wyższego rzędu, a nawet cząstek. Prowadzi to do obniżenia siły działania leku i może wywołać niepożądane skutki uboczne po wstrzyknięciu ludziom.

Zatem problemem leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie kompozycji, która może zminimalizować lub ograniczyć wyżej wymienione niedogodności.

Wynalazek dotyczy ciekłej kompozycji farmaceutycznej, która zawiera białko pegilowaną ludzką erytropoetynę, wielokrotnie naładowany anion nieorganiczny w farmaceutycznie dopuszczalnym buforze odpowiednim do utrzymywania pH roztworu w zakresie 5,5 - 7,0 oraz ewentualnie jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, przy czym ta ciekła kompozycja jest w postaci roztworu wodnego i jest trwała w temperaturze pokojowej, a anion stanowi anion siarczanowy w stężeniu 10 - 200 mmoli siarczanu/litr.

Korzystna jest kompozycja, która jest w postaci roztworu izotonicznego.

Korzystna jest kompozycja, której pH wynosi 5,8 - 6,7.

Korzystna jest kompozycja, której pH wynosi 6,0 - 6,5.

Korzystna jest kompozycja, której pH wynosi około 6,2.

Korzystna jest kompozycja, w której bufor jest wybrany z grupy obejmującej bufor fosforanowy i arginina/H2SO4/Na2SO4.

Korzystna jest kompozycja, w której bufor stanowi bufor fosforanowy w ilości 10 - 50 mmoli/litr.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek.

Korzystna jest kompozycja, w której jedna lub większa liczba farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek jest wybrana z grupy obejmującej farmaceutycznie dopuszczalne sole, rozcieńczalniki, rozpuszczalniki i środki konserwujące.

Korzystna jest kompozycja, w której farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki są wybrane z grupy obejmującej środki tonizujące, poliole, przeciwutleniacze i niejonowe detergenty.

Korzystna jest kompozycja, w której farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę stanowi poliol.

Korzystna jest kompozycja, w której poliol jest wybrany z grupy obejmującej mannit, sorbit, glicerynę, trehalozę i sacharozę.

Korzystna jest kompozycja, w której poliol stanowi mannit.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera przeciwutleniacz.

Korzystna jest kompozycja, w której przeciwutleniacz stanowi metionina.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 1mmola CaCl2/litr.

Korzystna jest kompozycja, w której niejonowy detergent stanowi polisorbat 80, polisorbat 20 lub pluronic F68.

Korzystna jest kompozycja, w której niejonowy detergent stanowi pluronic F68.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 1% (wag./obj.) niejonowego detergenta.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 0,1% (wag./obj.) niejonowego detergenta.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem, który to koniugat zawiera glikoproteinę ludzką erytropoetynę, przy czym ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z „n” ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) o wzorze -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, a grupa -CO każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych; R oznacza niższy alkil, x oznacza 2 lub 3; m oznacza około 450 - 900, n oznacza 1 - 3; oraz n i m są dobrane tak, że masa cząsteczkowa koniugatu minus glikoproteina erytropoetyna wynosi 20 - 100 kDa.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera białko erytropoetynę o wzorze:

P-[NH-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) w którym m, n, x i R mają wyżej podane znaczenie, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez n grup(y) aminowej(ych) tworzącej(ych) wiązanie(a) amidowe z ugrupowaniem(ami) poli(glikolu etylenowego).

Korzystna jest kompozycja, która zawiera białko erytropoetynę o wzorze (I), w którym x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza I, a R oznacza metyl.

PL 219 131 B1

Korzystna jest kompozycja, która zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem, który to koniugat zawiera glikoproteinę ludzką erytropoetynę, przy czym ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 3 ugrupowaniami niższego alkoksy-poli(glikolu etylenowego), a każde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie związane z glikoproteiną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych, X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, k oznacza 1 - 10, Y oznacza

przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi około 20 - 40 kDa, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi około 51 - 175 kDa.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X.

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; na oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)]k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 10 - 200 mmoli siarczanu/litr i 10 - 50 mmoli fosforanu/litr, o pH 6,0 - 6,5.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 50 lub 400 ąg pegilowanej erytropoetyny/ml, 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu i 1 mM metioninę, pH 6,2.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 20 mM metioniny, 1 - 5% poliolu (wag./obj.), do 0,1% pluronic F68 (wag./obj.) i ewentualnie do 1 mM CaCl2.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli siarczanu/litr, 10 mmoli fosforanu/litr, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 10 - 100 mmoli NaCl/litr, 10 - 50 mmoli fosforanu/litr, pH 6,0 - 7, ewentualnie 1 - 5% poliolu.

PL 219 131 B1

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 20 mM metioniny, do 0,1% pluronic F68 i ewentualnie do 7,5 μmola CaCl₂/litr.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 100 mmoli NaCl/litr, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 i 10 mmoli fosforanu/litr, pH 7,0.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 10 - 50 mmoli argininy/litr, pH 6 - pH 6,5, 10 - 100 mmoli siarczanu sodu/litr.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera do 20 mM metioniny, do 0,1% pluronic F68, ewentualnie do 1 mmola CaCl2/litr i ewentualnie 1 - 5% poliolu.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli argininy/litr, pH 6,2, 30 mmoli siarczanu sodu/litr, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 i ewentualnie 1 mmol CaCl2/litr.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 25 - 2500 μg białka erytropoetyny/ml oraz

a) 10 mM fosforan sodu, 120 mM siarczan sodu, pH 6,2, albo

b) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, pH 6,2, albo

c) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2, albo

d) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, pH 6,2, albo

e) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2.

Korzystna jest kompozycja, w której ilość erytropoetyny wynosi 50, 100, 400, 800 lub 2500 μg/ml.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2.

Korzystna jest kompozycja, która zawiera 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2.

Korzystna jest kompozycja, w której białko erytropoetyna ma sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania kompozycji zdefiniowanej powyżej, polegającego na tym, że miesza się białko pegilowaną ludzką erytropoetynę z roztworem zawierającym wielokrotnie ujemnie naładowany anion i ewentualnie jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek i doprowadza się do pH 5,5 - 7,0 z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnego buforu.

Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji zdefiniowanej powyżej do wytwarzania leków użytecznych w leczeniu i profilaktyce chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS i/lub w leczeniu pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że formułowanie erytropoetyny w tę kompozycję poprawia jej trwałość w temperaturze powyżej tem peratury w lodówce (2 - 8°C), zwłaszcza w temperaturze pokojowej (czyli poniżej 25°C), a nawet w wyższej temperaturze, np. w 40°C. Oznacza to, że kompozycje można przechowywać bez chłodzenia przez dłuższy okres czasu, bez znaczącej utraty aktywności i bez znaczącej degradacji.

W przypadkach gdy nie wskazano inaczej, poniższe definicje podano dla zilustrowa nia i zdefiniowania znaczenia i zakresu różnych określeń stosowanych do opisania wynalazku.

Określenie „wielokrotnie naładowany anion nieorganiczny” oznacza anion nieorganiczny

2mający dwa lub większą liczbę ładunków ujemnych na cząsteczkę, np. anion siarczanowy SO4^2-

2lub fosforanowy, czyli wodorofosforanowy HPO4^2-. Wielokrotnie naładowany anion nieorganiczny można dodać w postaci jego odpowiedniej soli, np. soli sodowej, soli potasowej i ich mieszanin i/lub w postaci substancji buforującej , np. buforu fosforanowego.

Określenie „izoosmolarny lub izotoniczny” oznacza roztwór, który można zmieszać z płynami ustrojowymi bez wpływu na ich składniki. Roztwory, które są izotoniczne z krwią, takie jak 0,9% chlorek sodu, mają takie same ciśnienie osmotyczne jak surowica i nie wpływają na błony erytrocytów.

PL 219 131 B1

Ogólnie roztwory izotoniczne z krwią to roztwory o około 290 mosm/kg H2O.

Określenie „mocny kwas nieorganiczny oznacza kwasy nieorganiczne wykazujące 20 - 100% dysocjacji w 1N roztworze, np. H₂SO₄.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” stosowane w tym opisie oznacza, że bufor lub sole są dopuszczalne pod względem toksyczności.

Określenie „rozcieńczalnik” oznacza składnik w preparacie leczniczym, który nie wykazuje aktywności farmaceutycznej, ale jest farmaceutycznie potrzebny lub wymagany. Przykładowo rozcieńczalnikiem może być ciecz do rozcieńczen ia wstrzykiwanego leku (leków), np. woda.

Określenie „rozpuszczalniki” oznacza ciecz utrzymującą inną substancję w roztworze, czyli ją rozpuszczającą, np. wodę.

Określenie „środki konserwujące” dotyczy substancji dodanej do kompozycji farmaceutycznej w celu przeciwdziałania wzrostowi bakterii, np. chlorku benzalkonium lub alkoholu benzylowego.

Określenie „poliol” oznacza jakąkolwiek substancję z wieloma grupami hydroksylowymi, włącznie z alkoholami wielowodorotlenowymi i węglowodanami. Do alkoholi wielowodorotlenowych należą takie związki jak sorbit, mannit i gliceryna. Węglowodany są cyklicznymi cząsteczkami, które mogą zawierać grupę ketonową lub aldehydową, jak np. sacharoza lub trehaloza.

Określenie „erytropoetyna” lub „białko erytropoetyna” oznacza białko o aktywności biologicznej in vivo powodującej zwiększenie produkcji retyku locytów i erytrocytów przez komórki szpiku kostnego, wybrane z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę oraz jej analogi, zdefiniowane poniżej.

Określenie „PEG-ilowana erytropoetyna (Peg-EPO lub PEG-EPO)” oznacza białko erytropoetynę, które jest kowalencyjnie połączone z 1 - 3 ugrupowaniami pochodnych polietylenu, jak to opisano poniżej.

Określenie „urządzenie” oznacza wyrób służący do określonego celu. Zgodnie z wynalazkiem celem jest umożliwienie, podtrzymanie lub ułatwienie podawania ciekłej kompozycji farmaceutycznej.

Opis rysunków

Fig. 1: Podstawowa struktura ludzkiej EPO (165 aminokwasów) (SEQ ID NO:1).

Fig. 2: Podstawowa struktura ludzkiej EPO (166 aminokwasów) (SEQ ID NO:2).

Fig. 3: Wpływ pH na trwałość temperaturową. Temperatura przejścia w funkcji pH.

Fig. 4: Wpływ siły jonowej na trwałość temperaturową. Temperatura przejścia w funkcji stężenia fosforanu.

Fig. 5: Zależność trwałości temperaturowej od substancji buforującej.

Fig. 6: pokazuje, że siarczan jest także odpowiednim buforem/dodatkiem przy niskich wartościach pH (np. pH 6,2), podczas gdy fosforan jest mniej odpowiedni przy pH 6,2 niż przy pH 7,5. Pokazuje to, że siarczan utrzymuje trwałość temperaturową na wysokim poziomie, nawet przy niskim pH.

Fig. 7: Zależność agregacji peg-EPO od pH. Próbki peg-EPO po stresie cieplnym (jak opisano poniżej) analizowano metodą SDS-PAGE. Białka wybarwiono srebrem. Ścieżka 1; wzorzec masy cząsteczkowej. Ścieżka 2; pH 5. Ścieżka 3: pH 5, próbka zredukowana. Ścieżka 4: pH 6. Ścieżka 5: pH 6, próbka zredukowana. Ścieżka 6: pH 6,5. Ścieżka 7: pH 6,5, próbka zredukowana. Ścieżka 8: pH 7. Ścieżka 9: pH 7, próbka zredukowana. Ścieżka 10: peg-EPO, bez stresu.

Fig. 8 pokazuje, że stosowanie 1 mg/ml acetylocysteiny jako przeciwutleniacza zapobiega powstawaniu agregatów podczas stresu cieplnego. Agregacja pegEPO podczas stresu cieplnego (20 minut w 80°C): Ścieżka 1: pegEPO w pH 7,5, bez stresu. Ścieżka 2: pegEPO w pH 7,5, stres. Ścieżka 3: pegEPO przy pH 6,2, stres. Ścieżka 4: pegEPO przy pH 6,2, stres, próbka zredukowana. Ścieżka 5: pegEPO przy pH 7,5, +1 mg/ml N-acetylocysteiny, stres. Ścieżka 6: pegEPO przy pH 7,5, + 1,15 mg/ml N-acetylocysteiny, stres, próbka zredukowana.

Fig. 9: zawartość kwasu sjalowego (NANA) w próbkach pegEPO w nowych preparatach, przechowywanych przez 6 miesięcy w różnych temperaturach.

Fig. 10: Mysi test aktywności biologicznej próbek peg-EPO po przechowywaniu w 10 mM fosforanie sodu, 40 mM siarczanie sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2 przez 6 miesięcy w różnych temperaturach.

PL 219 131 B1

Fig. 11: Chromatogram z wykluczeniem wielkości próbek peg-EPO przechowywanych przez 6 miesięcy w 10 mM fosforanie sodu, 40 mM siarczanie sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2 (od dołu do góry: bufor, materiał wyjściowy, 4°C, 25°C, 30°C i 40°C).

Bufory stosowane zgodnie z wynalazkiem do utrzymania pH w zakresie około 5,5 - 7,0, korzystnie 5,8 - 6,7, korzystniej 6,0 - 6,5 a najkorzystniej pH około 6,2, mogą być typowymi buforami z kwasów organicznych lub nieorganicznych (np. bufor fosforanowy, bufor arginin a/H2SO4/Na2SO4 lub jakikolwiek inny dopuszczalny farmaceutycznie układ buforujący). W korzystnej postaci kompozycja zawiera bufor fosforanowy lub bufor arginina/H2SO4/Na2SO4, korzystniej bufor fosforanowy, 10 - 50 mmol/litr. Oczywiście połączenia tych układów buforujących również można stosować zgodnie z wynalazkiem. Wartość pH można nastawić z użyciem odpowiedniej zasady, np. NaOH w układzie buforu fosforanowego, oraz odpowiedniego kwasu np. kwasu siarkowego w układzie buforu argininowego.

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek. Taka farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka może być wybrana spośród farmaceutycznie dopuszczalnych soli, rozcieńczalników i/lub rozpuszczalników i/lub środków konserwujących itd., np. środków tonizujących (środków nadających izotoniczność), polioli, przeciwutleniaczy lub niejonowych detergentów. Przykładami takich substancji są chlorek sodu, chlorek wapnia, sorbit, mannit, gliceryna, sacharoza, trehaloza, acetylocysteina, polisorbat 20, polisorbat 80 lub pluronic F68.

W korzystnej postaci wynalazku kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać poliol wybrany z grupy obejmującej mannit, sorbit, glicerynę, trehalozę i sacharozę, korzystnie mannit. Stężenie poliolu może wynosić 1 - 10% (wag./obj.).

Przykładami przeciwutleniaczy są cysteina, metionina, acetylocysteina lub kwas askorbinowy, korzystnie metionina. Przeciwutleniacze można zazwyczaj dodawać w stężeniu 0,01 - 0,5% (wag./o bj.) lub, np. w przypadku metioniny, w stężeniu 1 - 20 mM.

Opisane powyżej kompozycje mogą także dodatkowo zawierać środek nadający izotoniczność w stężeniu około 0,01 - 0,9% wag. Związki takie są znane; przykładami takich środków są chlorek sodu lub siarczan sodu. W korzystnej postaci wynalazku kompozycje są roztworami izotonicznymi. Powyższa kompozycja może także zawierać detergent niejonowy, jak polisorbat 20, polisorbat 80 lub pluronic F68, korzystnie pluronic F68, np. w stężeniu do 1% (wag./obj.), korzystniej do 0,1% (wag./obj.), np. 0,001 - 0,01% (wag./obj.).

Powyższa kompozycja może także zawierać dodatkowe sole, np. do 1 mmola/litr CaCl2.

Wynalazek jest szczególnie użyteczny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających erytropoetynę jako substancję farmaceutycznie czynną. Określenia „erytropoetyna lub „białko erytropoetyna” lub „EPO oznaczają: szczególnie określenia dotyczące glikoproteiny, np. ludzkiej erytropoetyny, np. mającej sekwencję aminokwasów przedstawioną (SEQ ID NO: 1) lub (SEQ ID NO: 2) lub sekwencję aminokwasów zasadniczo homologiczną do nich, których właściwości biologiczne odnoszą się do stymulacji wytwarzania erytrocytów oraz stymulacji podziału i różnicowania zaangażowanych prekursorów erytroidalnych w szpiku kostnym. Stosowane tu określenia białek obejmują takie białka zmodyfikowane celowo, np. przez ukierunkowaną mutagenezę oraz przypadkowo na drodze mutacji. Określenia te obejmują także analogi zawierające 1 - 6 dodatkowych miejsc glikozylacji, analogi o co najmniej jednym aminokwasie przyłączonym do końca karboksylowego glikoproteiny, przy czym dodatkowe aminokwasy zawierają co najmniej jedno miejsce glikozylacji, oraz analogi o sekwencji aminokwasów zawierającej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Określenia te obejmują zarówno naturalną, jak i zrekombinowaną ludzką erytropoetynę.

Jak opisano szczegółowo poniżej, wytwarzanie i oczyszczanie EPO są dobrze znane. Erytropoetyna stanowi naturalne lub zrekombinowane białko, korzystnie ludzkie, które można uzyskiwać z jakiegokolwiek znanego źródła, takiego jak tkanki, drogą syntezy białek, hodowli komórkowej naturalnych lub zrekombinowanych komórek. Wynalazek obejmuje dowolne białko o aktywności erytropoetyny, takie jak białko zmutowane lub w inny sposób zmodyfikowane. Zrekombin owaną EPO można wytwarzać drogą ekspresji w liniach komórkowych CHO-, BHK- lub HeLa-, z zastosowaniem metod rekombinacji DNA lub drogą aktywacji endogennych genów. Ekspresja białek, w tym ekspresja przez aktywację endogennych genów, jest dobrze znana i ujawniona np. w opisach patentowych US nr 5733761, 5641670 i 5733746 oraz w międzynarodowych publikacjach patentowych nr WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667

PL 219 131 B1 i WO 91/09955. Korzystnymi gatunkami EPO do wytwarzania produktów stanowiących glikoproteinę erytropoetynę są ludzkie gatunki EPO. Korzystniej gatunkiem EPO jest ludzka EPO o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2, korzystniej o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

Ponadto erytropoetynę może stanowić analog glikoproteiny mający 1-6 dodatkowych miejsc glikozylacji. Glikozylacja białka, przez jedną lub większą liczbą grup oligosacharydowych, zachodzi w specyficznych miejscach szkieletu polipeptydowego i w dużym stopniu wpływa na właściwości fizyczne białka, takie jak trwałość, wydzielanie, lokalizacja wewnątrzkomórkowa i aktywność biologiczna białka. Glikozylacja może być zazwyczaj dwóch typów. O-przyłączone oligosacharydy są przyłączone do reszt seryny lub treoniny, a N-przyłączone oligosacharydy są przyłączone do reszt asparaginy. Jednym z typów oligosacharydów w przypadku zarówno na N-przyłączonych, jak i O-przyłączonych oligosacharydów jest kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sjalowy), który obejmuje rodzinę aminocukrów zawierających 9 lub większą liczbę atomów węgla. Kwas sjalowy stanowi zazwyczaj końcową resztę zarówno w N-przyłączonych, jak i w O-przyłączonych oligosacharydach oraz, ze względu na to, że ma ładunek ujemny, nadaje glikoproteinie właściwości kwasowe. Ludzka erytropoetyna, mająca 165 aminokwasów, zawiera trzy N-przyłączone i jeden O-przyłączony łańcuchy oligosacharydowe, które stanowią około 40% całkowitej masy cząsteczkowej glikoproteiny. N-przyłączająca glikozylacja zachodzi przy resztach asparaginy zlokalizowanych w pozycjach 24, 38 i 83, a O-przyłączająca glikozylacja zachodzi przy reszcie seryny zlokalizowanej w pozycji 126. Łańcuchy oligosacharydowe są zmodyfikowane końcowymi resztami kwasu sjalowego. Enzymatyczne usunięcie wszystkich reszt kwasu sjalowego z glikozylowanej erytropoetyny powoduje utratę aktywności in vivo, ale nie aktywności in vitro, ze względu na to, że sjalilowanie erytropoetyny zapobiega jej wiązaniu i późniejszemu klirensowi przez wątrobowe białko wiążące.

Określenie „erytropoetyna w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku obejmuje analogi ludzkiej erytropoetyny z jedną lub większą liczbą zmian w sekwencji aminokwasów ludzkiej erytropoetyny, prowadzących do wzrostu liczby miejsc przyłączenia kwasu sjalowego. Te analogi glikoproteinowe można wytworzyć przez ukierunkowaną mutagenezę i zawierają one addycje, delecje lub substytucje reszt aminokwasowych, które zwiększają liczbę lub zmieniają miejsca dostępne dla glikozyIacji. Analogi glikoproteinowe o poziomie kwasu sjalowego większym w porównaniu z występującym w ludzkiej erytropoetynie wytwarza się przez dodanie miejsc glikozylacji, które nie zaburzają drugorzędowej lub trzeciorzędowej konformacji wymaganej do aktywności biologicznej. Glikoproteiny według wynalazku obejmują także analogi o zwiększonym poziomie przyłączenia węglowodanów w miejscu glikozylacji, co zazwyczaj obejmuje podstawienie jednego lub większej liczby aminokwasów w pobliżu miejsca N-przyłączania lub O-przyłączania. Glikoproteiny według wynalazku obejmują także analogi zawierające jeden lub większą liczbę aminokwasów dodatkowo na C-końcu erytropoetyny, które dostarczają co najmniej jedno dodatkowe miejsce dla węglowodanu. Białka erytropoetyny w kompozycji według wynalazku obejmują także analogi zawierające sekwencję aminokwasów, która zawiera przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Takie przegrupowanie miejsca glikozylacji obejmuje delecję jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji ludzkiej erytropoetyny oraz addycję jednego lub większej liczby nie występujących naturalnie miejsc glikozyIacji. Zwiększanie liczby łańcuchów węglowodanowych w erytropoetynie, a zatem liczby kwasów sjalowych w cząsteczce erytropoetyny, może nadać korzystne właściwości, takie jak zwiększona rozpuszczalność, zwiększona odporność na proteolizę, zmniejszona immunogenność, dłuższy okres półtrwania w surowicy oraz zwiększona aktywność biologiczna. Analogi erytropoetyny z dodatkowymi miejscami glikozylacji ujawniono bardziej szczegółowo w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 640619, Elliot, z 1 marca 1995 r.

W korzystnej postaci, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera białka erytropoetyny o sekwencji aminokwasów zawierającej co najmniej jedno dodatkowe miejsce glikozylacji, takie jak, ale nie tylko, erytropoetyny zawierające sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez modyfikację wybraną z poniższych:

Asn³⁰Thr³² ch co

32

Asn⁶⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

71

PL 219 131 B1

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸

Asn ⁹⁰Thr⁹¹;

Asn⁸⁹lle Thr¹³⁸;

_Asn ¹³⁸Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵ oraz _Pro ¹²⁴Thr¹²⁵.

Zapis stosowany tu dla modyfikacji sekwencji aminokwasów oznacza, że pozycja (pozycje) odpowiedniego niemodyfikowanego białka (np. hEPO o SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2) wskazana liczbą (liczbami) w indeksie górnym została zmieniona na aminokwas (aminokwasy), bezpośrednio poprzedzające odpowiednią liczbę (liczby) w indeksie górnym.

Białko erytropoetyna może być także analogiem mającym co najmniej jeden aminokwas na końcu karboksylowym glikoproteiny, przy czym dodatkowy aminokwas zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji. Dodatkowy aminokwas może stanowić fragment peptydowy pochodzący z końca karboksylowego ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej. Korzystnie glikoproteina jest analogiem wybranym z grupy obejmującej (a) ludzką erytropoetynę mającą sekwencję aminokwasów Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO: 3), przyłączoną do końca karboksylowego; (b) analog (a) zawierający ponadto Ser⁸⁷Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; oraz (c) analog (a) zawierający ponadto Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Białko erytropoetyna może być także analogiem o sekwencji aminokwasów obejmującej przegrupowania co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Przegrupowanie może obejmować delecję któregokolwiek z miejsc N-przyłączania węglowodanu w ludzkiej erytropoetynie oraz addycję miejsca

N-przyłączania węglowodanu w pozycji 88 sekwencji aminokwasów ludzkiej erytropoetyny. Korzystnie ft7 ftft QD ft7 glikoproteina jest analogiem wybranym z grupy obejmującej Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸ Ser⁸⁷Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO i Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

W szczególności białko erytropoetyna w kompozycji farmaceutycznej opisanej powyżej może także zawierać jego PEG-ilowane pochodne. PEG-ilowane pochodne erytropoetyny i ich wytwarzanie są znane i opisane np. w EP-A-539167, EP-A-605963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, w opisie patentowym US nr 556, EP-A-584876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, opisach patentowych US nr 5359030 i 5681811, opisie patentowym US nr 4179337, japońskim opisie patentowym, WO 98/32466, opisie patentowym US nr 5324650. Korzystne postacie PEG-ilowanych rodzajów erytropoetyny odnoszą się do pochodnych opisanych poniżej.

Tak więc wynalazek dotyczy koniugatu erytropoetyny, który to koniugat zawiera białko erytropoetynę, jak opisano powyżej, zawierające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazujące aktywność biologiczną in vivo wywoływania wzrostu wytwarzania przez komórki szpiku kości retykulocytów i erytrocytów, wybrane z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę oraz jej analogi, które mają sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji lub przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji; która to erytropoetyna jest kowalencyjnie związana z „n” ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) o wzorze -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, przy czym -CO (czyli karbonyl) każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych; R oznacza niższy alkil, x oznacza 2 lub 3; m oznacza 450 - 900, n oznacza 1 - 3; a n i m są wybrane tak, że masa cząsteczkowa (koniugat - glikoproteina erytropoetyna) wynosi 20 100 kDa. Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznych zawierających opisane tu koniugaty, przy czym udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1 wynosi co najmniej 90%, korzystnie 92%, korzystniej 96% wszystkich koniugatów w kompozycji.

W szczególności powyższe PEG-ilowane koniugaty można przedstawić wzorem (I)

P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I)

PL 219 131 B1 gdzie P oznacza białko erytropoetynę jak opisano powyżej (czyli bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z karbonylem przedstawionym we wzorze I), wykazującą aktywność biologiczną in vivo powodującą zwiększanie produkcji retykulocytów i erytrocytów przez komórki szpiku kości; gdzie R oznacza niższy alkil; x oznacza 2 lub 3; m oznacza 450 - 900, n oznacza 1 - 3, a n i m są wybrane tak, że masa cząsteczkowa (koniugat - glikoproteina erytropoetyna) wynosi 20 - 100 kDa.

Stosowane tu określenie „niższy alkil” oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1 - 6 atomach węgla. Przykłady grup niższych alkili to metyl, etyl i izopropyl. Zgodnie z wynalazkiem, R oznacza dowolny niższy alkil. Korzystne są koniugaty, w których R oznacza metyl.

Symbol „m” oznacza liczbę grup tlenku etylenu (OCH2CH2) w ugrupowaniu poli(tlenku etylenu). Pojedyncza podjednostka PEG (glikolu polietylenowego) ma masę cząsteczkową około 44 Da. Zatem masa cząsteczkowa koniugatu (z wyłączeniem masy cząsteczkowej EPO) zależy od liczby „m”. W koniugatach według wynalazku „m” oznacza około 450 - 900 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 20 - 40 kDa), korzystnie około 650 - 750 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 30 kDa). Liczba m jest wybrana tak, że powstały koniugat według wynalazku ma aktywność fizjologiczną porównywalną z niemodyfikowaną EPO, która to aktywność może być taka sama, wyższa lub stanowić część odpowiedniej aktywności niemodyfikowanej EPO. Masa cząsteczkowa „około” pewnej liczby oznacza, że znajduje się ona w rozsądnych granicach blisko tej liczby, oznaczonej znanymi metodami analitycznymi. Liczba „m” jest wybrana tak, że masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) kowalencyjnie połączonego z glikoproteiną erytropoetyną wynosi około 20 - 40 kDa, a korzystnie około 30 kDa.

W koniugatach według wynalazku liczba „n” oznacza liczbę ugrupowań poli(glikolu etylenowego) kowalencyjnie związanych z wolnymi grupami aminowymi (w tym z grupami ε-aminowymi aminokwasu lizyny i/lub grupą aminową końca aminowego) białka erytropoetyny przez wiązanie (wiązania) amidowe. Koniugat według wynalazku może zawierać jedno, dwa lub trzy ugrupowania PEG na cząsteczkę EPO. „n” oznacza liczbę całkowitą 1 - 3, korzystnie „n” oznacza 1 lub 2, a jeszcze korzystniej „n” oznacza 1. Korzystne koniugaty spośród koniugatów opisanych powyżej stanowią związki, w których x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza 1, a R oznacza metyl.

Związek o wzorze (I) można wytwarzać ze znanego związku polimerowego:

gdzie R i m mają wyżej podane znaczenie, drogą kondensacji związku o wzorze II z glikoproteiną erytropoetyną. Związki o wzorze (II), w którym x oznacza 3, są estrami sukcynoimidylowymi kwasu α-niższo-alkoksy-polioksyetylenomasłowego (niższo-alkoksy-PEG-SBA). Związki o wzorze (II), w którym x oznacza 2, są estrami sukcynoimidylowymi kwasu a-niższo-alkoksy-polioksyetylenopropionowego (niższo-alkoksy-PEG-SPA). Można stosować dowolny znany sposób prowadzenia reakcji aktywowanego estru z aminą, z wytworzeniem amidu. W reakcji opisanej powyżej przykładowe ugrupowanie estru sukcynoimidylowego jest grupą odszczepiającą się, powodującą powstanie amidu. Zastosowanie estrów sukcynoimidylowych, takich jak związki o wzorze II, do wytwarzania koniugatów z białkami, ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5672662, z 30 września 1997 r. (Harris i inni).

Ludzka EPO zawiera 9 wolnych grup aminowych, N-końcową grupę aminową i 8 grup ε-aminowych reszt lizyny. Gdy reagent PEG-ilujący połączono ze związkiem SBA o wzorze II, stwierdzono, że przy pH 7,5, stosunku białko:PEG wynoszącym 1:3 i temperaturze reakcji 20-25°C, wytworzono mieszaninę mono-, di- i śladowych ilości tri-PEG-ilowanych produktów. Gdy odreagentem PEG-ilującym był związek SPA o wzorze II, w podobnych warunkach, z wyjątkiem tego, że stosunek białko:PEG wynosił 1:2, wytworzono głównie mono-PEG-ilowane produkty. PEG-ilowaną EPO można podawać jako mieszaninę lub w postaci różnych PEG-ilowanych produktów oddzielonych metodą chromatografii kationowymiennej. Poprzez dobór warunków reakcji (np. stosunku reagentów, pH, temperatury, stężenia białka, czasu reakcji itd.), można zmieniać względne ilości różnych PEG-ilowanych produktów.

PL 219 131 B1

Kompozycje farmaceutyczne opisane powyżej mogą także zawierać białko erytropoetynę, zdefiniowane powyżej, zawierające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazujące aktywność biologiczną in vivo wywoływania wzrostu wytwarzania przez komórki szpiku kości retykulocytów i erytrocytów, wybrane z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi, które wykazują pierwszorzędową strukturę ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji; przy czym ta glikoproteina jest kowalencyjnie połączona z 1 - 3 ugrupowaniami niższego-alkoksypoli(glikolu etylenowego), a każde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie związane z glikoproteiną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych, X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k, k - oznacza 1 - 10, Y oznacza

Rodzaje erytropoetyny można także przedstawić wzorem (III)

P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III) gdzie R może oznaczać dowolny niższy alkil, który stanowi liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1-6 atomach węgla, taką jak metyl, etyl, izopropyl itd. Korzystnym alkilem jest metyl. X może oznaczać -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, gdzie k oznacza od 1 do około 10. Korzystnie k oznacza od 1 do około 4, korzystniej k oznacza 1 lub 2. Najkorzystniej X oznacza -(CH2).

We wzorze 1, Y oznacza

PL 219 131 B1

korzystnie

We wzorze (III), liczba m jest wybrana tak, że powstały koniugat o wzorze (III) ma aktywność fizjologiczną porównywalną z niemodyfikowaną EPO, przy czym ta aktywność może być taka sama, wyższa lub stanowić część odpowiedniej aktywności niemodyfikowanej EPO. Liczba m oznacza liczbę ugrupowań tlenku etylenu w jednostce PEG. Pojedyncza podjednostka PEG -(OCH2CH2)- ma masę cząsteczkową około 44 daltonów. Zatem masa cząsteczkowa koniugatu (bez masy cząsteczkowej EPO) zależy od liczby m. Masa cząsteczkowa „około” konkretnej liczby oznacza, że jest ona rozsądnie bliska tej liczbie, oznaczonej znanymi metodami analitycznymi. Liczba m oznacza liczbę całkowitą około 450 - 900 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 20 - 40 kDa), korzystnie około 550 - 800 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 24 - 35 kDa), a najkorzystniej m oznacza około 650 - 700 (około 29 - 31 kDa).

We wzorze (III), liczba n oznacza liczbę grup ε-aminowych aminokwasu lizyny w białku erytropoetynie, kowalencyjnie związanych z jednostką PEG wiązaniem amidowym. Koniugat według wynalazku może zawierać jedną, dwie lub trzy jednostki PEG na cząsteczkę EPO. Liczba n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3, korzystnie n oznacza 1 lub 2, a najkorzystniej n oznacza 1.

Korzystne białka erytropoetyny o wzorze (III) są określone wzorami:

PL 219 131 B1

Najkorzystniejsze glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorem:

przy czym w powyższym wzorze n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez grup(y) aminowych(ej) tworzących(ej) wiązanie amidowe z X.

Inne korzystne glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorami:

Korzystniejsze glikoproteinowe produkty erytropoetynowe są określone wzorem:

Te białka erytropoetyny można wytwarzać drogą:

(a) poddawania grupy ε-aminowej aminokwasu lizyny białka erytropoetyny o wzorze P-[NH₂]_nreakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z dwufunkcyjnym reagentem o wzorze Z-CO-X-S-Q, z wytworzeniem związku pośredniego z wiązaniem amidowym, o wzorze:

P-[NH-CO-X-S-Q]n w którym P oznacza białko erytropoetynę bez grupy aminowej tworzącej wiązanie amidowe, n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; Z oznacza grupę reaktywną, np. ugrupowanie estru karboksylowego NHS; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, gdzie k oznacza od 1 do około 10, a Q oznacza grupę zabezpieczającą, taką jak alkanoil, np. acetyl.

(b) poddawania związku pośredniego z wiązaniem amidowym z etapu (a) reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z aktywowaną pochodną poli(glikolu etylenowego) o wzorze W-[OCH2CH2]m-OR, z wytworzeniem glikoproteinowego produktu erytropoetynowego ο wzorze:

PL 219 131 B1

w którym W oznacza postać Y reagującą z grupą sulfhydrylową; m oznacza liczbę całkowitą około 450 - 900; R oznacza niższy alkil, a Y ma wyżej podane znaczenie.

W tej postaci wynalazku dwufunkcyjnym reagentem jest korzystnie S-acetylotiopropionianem N-sukcynoimidylu lub S-acetylotiooctanem N-sukcynoimidylu, Z korzystnie oznacza N-hydroksysukcynoimid, a zaktywowana pochodna poli(glikolu etylenowego) W-[OCH2CH2]m-OR jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej jodoacetylometoksy-PEG, metoksy-PEG-winylosulfon i metoksy-PEGmaleimid.

W szczególności białka erytropoetyny o wzorze (III) można wytworzyć przez kowalencyjne przyłączenie grup tiolowych do EPO („aktywację) oraz sprzęganie powstałej zaktywowanej EPO z pochodną poli(glikolu etylenowego) (PEG). Pierwszy etap wytwarzania PEG-ilowanej EPO według wynalazku polega na kowalencyjnym przyłączeniu grup tiolowych przez grupy NH2- w EPO. Aktywację tę prowadzi się z użyciem dwufun kcyj nych reagentów z zabezpieczoną grupą tiolową i dodatkową grupą reaktywną, taką jak odpowiednio ugrupowania aktywnych estrów (np. estru sukcynoimidylowego), bezwodników, estrów kwasów sulfonowych, halogenków kwasów karboksylowych i kwasów sulfonowych. Grupa tiolowa jest zabezpieczona znanymi grupami, np. grupami acetylowymi. Te reagenty dwufunkcyjne mogą reagować z grupami ξ-aminowymi aminokwasów lizyny, tworząc wiązanie amidowe.

Pierwszy etap reakcji przedstawiono poniżej:

EPO, n i X mają wyżej podane znaczenie, a Z oznacza znaną reaktywną grupę, np. podstawnik N-hydroksysukcynoimidowy (NHS) o wzorze:

W korzystnej postaci wynalazku aktywację grup ε-aminowych lizyny prowadzi się drogą reakcji z dwufunkcyjnym reagentem mającym grupę sukcynoimidylową. Reagenty dwufunkcyjne mogą zawierać różnego rodzaju łączniki rozdzielające, np. ugrupowania -(CH2)k- lub -CH2-(O-CH2-CH2-)k-, gdzie k oznacza od 1 do około 10, korzystnie od 1 do około 4, i korzystniej 1 lub 2, a najkorzystniej 1. Przykładami takich reagentów są S-acetylotiopropionian N-sukcynoimidylu (SATP) i S-acetylotioctan N-sukcynoimidylu (SATA)

PL 219 131 B1 ester NHS kwasu acetylotioalkilokarboksylowego, taki jak

ester NHS kwasu 2-(acetylotio)-(etoksy)k-octowego, gdzie k ma wyżej podane znaczenie.

Wytwarzanie reagentów dwufunkcyjnych jest znane. Prekursory estrów NHS kwasu 2-(acetylotio)(etoksy)k-octowego opisano w DE-3924705, natomiast wytwarzanie pochodnych związku acetylotiolowego opisał March, J. Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA jest dostępny w handlu (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL).

Liczbę grup tiolowych przyłączanych do cząsteczki EPO można wybrać ustalając parametry reakcji, czyli stężenie białka (EPO) i stosunek białko/reagent dwufunkcyjny. Korzystnie EPO jest aktywowana przez kowalencyjne połączenie z 1 - 5 grupami tiolowymi/cząsteczkę EPO, korzystniej

1,5 - 3 grupami tiolowymi/cząsteczkę EPO. Zakresy te odnoszą się do statystycznego rozmieszczenia grup tiolowych w całej populacji białka EPO.

Reakcję prowadzi się np. w wodnym roztworze buforowym, pH 6,5 - 8,0, np. w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, pH 7,3. Reagent dwufunkcyjny można dodać w DMSO. Po zakończeniu reakcji, korzystnie po 30 minutach, reakcję przerywa się przez dodanie lizyny. Nadmiar reagenta dwufunkcyjnego można oddzielić znanymi sposobami, np. przez dializę lub filtrację kolumnową. Średnią liczbę grup tiolowych przyłączonych do EPO można określić metodami fotometrycznymi opisanymi np. w Grasetti, D.R. i Murray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41 - 49 (1967).

Po powyższej reakcji prowadzi się kowalencyjne sprzęganie zaktywowanej pochodnej poli(glikolu etylenowego) (PEG). Odpowiednimi pochodnymi PEG są zaktywowane cząsteczki PEG o średniej masie cząsteczkowej około 20 - 40 kDa, korzystniej około 24 - 35 kDa, a najkorzystniej około 30 kDa.

Zaktywowane pochodne PEG są znane i opisano je np. w Morpurgo, M. i inni J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 i następne, w odniesieniu do PEG-winylosulfonu. Do wytwarzania związków o wzorze I nadają się PEG o łańcuchach liniowych lub rozgałęzionych. Przykłady reaktywnych reagentów PEG to jodoacetylometoksy-PEG i metoksy-PEG-winylosulfon:

Stosowanie tych jodo-aktywowanych substancji jest znane i opisane, np. Hermanson, G. T. w Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) str. 147-148.

PL 219 131 B1

Najkorzystniej cząsteczki PEG aktywuje się maleimidem stosując (alkoksy-PEG-maleimid), taki jak metoksy-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Struktura alkoksy-PEG-maleimidu jest następująca:

gdzie R i m mają wyżej podane znaczenie, korzystnie

Reakcja sprzęgania z alkoksy-PEG-maleimidem zachodzi po odszczepieniu in situ grupy zabezpieczającej grupę tiolową w wodnym roztworze buforowym, np. 10 mM fosforan potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. Reakcję odszczepiania grupy zabezpieczającej można prowadzić np. za pomocą hydroksyloaminy w DMSO w 25°C, pH 6,2, przez około 90 minut. Dla modyfikacji PEG stosunek molowy aktywowanego EPO/alkoksy-PEG-maleimidu powinien wynosić około 1:3 - 1:6, korzystnie 1:4. Reakcję można przerwać przez dodanie cysteiny i przereagowanie pozostałych grup tiolowych (-SH) z N-metylomaleimidem lub innymi odpowiednimi związkami zdolnymi do tworzenia wiązań disulfidowych. Ze względu na reakcję jakichkolwiek pozostałych aktywnych grup tiolowych z grupami zabezpieczającymi, takimi jak ugrupowanie N-metylomaleimidu, lub inną odpowiednią grupą zabezpieczająca, glikoproteiny EPO w koniugatach według wynalazku mogą zawierać takie grupy zabezpieczające. Ogólnie w wyniku opisanej tu procedury otrzymuje się mieszaninę cząsteczek o różnej liczbie grup tiolowych zabezpieczonych przez różną liczbę grup zabezpieczających, zależnie od liczby zaktywowanych grup tiolowych glikoproteiny, które nie zostały sprzężone z PEG-maleimidem.

N-Metylomaleimid tworzy taki sam typ wiązań kowalencyjnych gdy stosuje się go do blokowania pozostałych grup tiolowych PEG-ilowanego białka, natomiast w związkach disulfidowych będzie zachodzić wewnątrzcząsteczkowa reakcja wymiany sulfid/disulfid, prowadząca do sprzęgania przez mostki disulfidowe reagenta blokującego. Korzystne reagenty blokujące dla tego typu reakcji blokowania to utleniony glutation (GSSG), cysteina i cystamina. Podczas gdy z cysteiną nie wprowadza się do PEG-ilowanego białka dodatkowego ładunku, to w przypadku stosowania takich reagentów blokujących, jak GSSG lub cystamina, zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni lub ujemny.

Dalsze oczyszczanie związków o wzorze (III), w tym rozdział mono-, di- i tri-PEG-ilowanych EPO, można prowadzić znanymi sposobami np. metodą chromatografii kolumnowej.

Kompozycję zawierającą PEG-ilowane pochodne erytropoetyny, korzystnie zawierającą co najmniej 90% koniugatów mono-PEG, tj. takich w których n oznacza 1, można wytwarzać w sposób opisany w przykładzie 5. Zwykle pożądane są koniugaty mono-FEG glikoprotein erytropoetyn, gdyż zazwyczaj wykazują one wyższą aktywność niż koniugaty di-PEG. Udział procentowy koniugatów mono-PEG, a także stosunek mono- do di-PEG można regulować przez połączenie szerszych frakcji wokół wyeluowanego piku dla zmniejszenia udziału procentowego mono-PEG, albo połączenie węższych frakcji dla zwiększenia udziału procentowego mono-PEG w kompozycji. Około 90% koniugatów mono-PEG to ilość zapewniająca rozsądną wydajność i aktywność. Czasami mogą być wymagane kompozycje, w których np. co najmniej 92% lub co najmniej 96% koniugatów stanowią mono-PEG (n oznacza 1). W postaci wynalazku udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi 90 - 96%.

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie kompozycje zawierają 10 - 1000 μg, np. 10, 50, 100, 400, 800 lub 2500 μg/ml.

PL 219 131 B1

Ponadto kompozycje według wynalazku mogą zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny na ml, 10 - 200 mmoli/litr siarczanu, 10 - 50 mmoli/litr fosforanu, pH 6,0 - 6,5. Ta kompozycja może także zawierać metioninę (do 20 mM), 1 - 5% poIiolu (wag./obj.), do 0,1% pluronic F68 (wag./obj.) oraz dodatkowo do 1 mM CaCl₂. Przykładowo taka kompozycja zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli/litr siarczanu, 10 mmoli/litr fosforanu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.

W kolejnej postaci wynalazku, kompozycja może zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 10-100 mmoli/litr NaCl, 10 - 50 mmoli/litr fosforanu, pH 6,0 - 6,5, ewentualnie 1 - 5% (wag./obj.) poliolu. Ponadto, ta kompozycja może także zawierać metioninę (do 20 mM), do 0,1% pluronic F68 (wag./obj.) oraz ewentualnie do 7,5 ąmola/litr CaCl₂. Konkretnie, kompozycja może zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 100 mmoli/litr NaCl, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.) oraz 10 mmoli/litr fosforan, pH 7,0.

Wynalazek dotyczy także powyższej kompozycji zawierającej 10 - 10000 μg białka erytropoetyny na ml, 10 - 50 mmoli/litr argininy, pH 6 - pH 6,5, 10 - 100 mmoli/litr siarczanu sodu. Dodatkowo ta kompozycja może zawierać metioninę (do 20 mM), do 0,1% pluronic F68 (wag./obj.), ewentualnie do 1 mmola/litr CaCl2 oraz ewentualnie 1 - 5% (wag./obj.) poliolu. Konkretnie, kompozycja ta może zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli/litr argininy, pH 6,2, 30 mmoli/litr siarczanu sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.) oraz ewentualnie 1 mmol/litr CaCl2.

Korzystna postać wynalazku dotyczy kompozycji zawierających 10 - 10000 μg/ml erytropoetyny, korzystnie 25 - 2500 μg/ml erytropoetyny, oraz

a) 10 mM fosforan sodu, 120 mM siarczan sodu, pH 6,2, albo

b) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), pH 6,2, albo

c) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę,

0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2, albo

d) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), pH 6,2, albo

e) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.

W najkorzystniejszej postaci kompozycje zawierają białko erytropoetynę w ilości 50, 100, 400, 800 lub 2500 ąg/ml. Najkorzystniejsze kompozycje zawierają 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2 lub 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.

Kompozycje według wynalazku mogą być w postaci proszku suszonego rozpryskowo.

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji w postaci liofilizowanej lub suszonego rozpryskowo proszku kompozycji opisanych powyżej. Kompozycję można roztworzyć z wytworzeniem ciekłego roztworu przez dodanie rozpuszczalnika, np. wody lub stosować bezpośrednio, np. z użyciem urządzenia do inhalacji lub urządzenia do podawania przezskórnego.

Wynalazek także obejmuje sposób wytwarzania kompozycji opisanej powyżej, polegający na zmieszaniu białka erytropoetyny z roztworem zawierającym wielokrotnie ujemnie naładowany anion i ewentualnie jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, zdefiniowanych powyżej.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji opisanej powyżej do wytwarzania leków użytecznych do leczenia i profilaktyki chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS i/lub do leczenia pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii. Obejmuje to sposób leczenia i profilaktyki chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS oraz pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii, obejmujący etap podawania pacjentowi kompozycji zdefiniowanej powyżej.

Wynalazek umożliwia stosowanie urządzeń do miejscowego i ogólnoustrojowego przedłużonego uwalniania, zawierających kompozycję zdefiniowaną powyżej. Mogą one być dowolnym rodzajem implantu umożliwiającego kontrolowane uwalnianie erytropoetyny zawartej w kompozycji opisanej powyżej, np. w postaci opartych na polimerach mikro- i nanocząstkach. Kompozycję opisaną powyżej

PL 219 131 B1 można także dostarczać w postaci wstępnie napełnionych strzykawek lub jakiegokolwiek innego urządzenia do podawania, jak np. bezigłowego urządzenia do iniekcji lub urządzenia do inhalacji.

Kompozycja według wynalazku może być w jednostkowych postaciach dawkowanych do iniekcji lub podawania dożylnego. Z drugiej strony, kompozycje według wynalazku można przechowywać w postaci ciekłej lub stałej, a następnie dzielić na jednostkowe postacie dawkowane do podawania dożylnego lub w zastrzykach. Zatem ciekłe kompozycje według wynalazku mogą być obecne w ilościach tak małych jak 0,3 ml, do stosowania w postaci pojedynczej dawki do podawania. Z drugiej strony, objętość zastrzeganej kompozycji może wynosić nawet 60 litrów, gdy jest przechowywana przed podzieleniem do pakowanych postaci dawek. Z uwagi na jej zwiększoną trwałość, kompozycję według wynalazku można przechowywać w dużych pojemnikach, tak aby potem umieścić w materiałach opakowaniowych odpowiednich do dystrybucji wśród lekarzy, pacjentów i szpitali.

Roztwór według wynalazku do iniekcji można podawać z użyciem takich znanych środków do iniekcji jak strzykawki, które ogólnie umożliwiają podawanie 0,3 - 20 ml tej kompozycji w jednostkowej dawce. Z drugiej strony, kompozycje według wynalazku można podawać drogą iniekcji stosując ampułki zawierające tą kompozycję w postaci zliofilizowanej lub proszku suszonego rozpryskowo, który następnie roztwarza się w znany sposób przed wstrzyknięciem. Z drugiej strony, ze względu na trwałość kompozycji według wynalazku, kompozycję można rozdzielić na porcje stanowiące jednostkowe dawki, np. do fiolek zawierające około 0,3 - 10 ml kompozycji. Ponadto kompozycje według wynalazku można podawać dożylnie stosując dożylne woreczki. Woreczki te zawierają około 20 - 500 ml roztworu zależnie od okresu, w którym roztwór ma być podawany pacjentowi. Zgodnie z wynalazkiem, ciekły roztwór według wynalazku można przechowywać w pojemnikach do przechowywania, z których może on być dalej podzielony na opakowania małych dawek do dystrybucji wśród lekarzy, pacjentów i szpitali. Ze względu na trwałość kompozycji według wynalazku, kompozycje te można przechować w takich pojemnikach do przechowywania przez długi okres czasu przed podaniem.

Wytwarzanie erytropoetyny jako składnika kompozycji opisanych powyżej oraz jako składnika wyjściowego do wytwarzania pochodnych erytropoetyny opisanych powyżej opisano szczegółowo np. w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5547933 i 5621080, EP-B 0148605, Huang, S.L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0205564, EP-B 0209539 i EP-B 0411678, a także w Lai, P.H. i inni, J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, Sasaki, H. i inni, J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Erytropoetynę do zastosowań terapeutycznych można wytworzyć metodami rekombinacji (EP-B 0148605, EP-B 0209539 i Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. i inni (1986) Immunobiol. 72: 213-224).

Sposoby ekspresji i wytwarzania erytropoetyny w pożywce wolnej od surowicy opisano np. w WO 96/35718, Burg, z 14 listopada 1996 r., oraz w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 513738, Koch, z 12 czerwca 1992 r. Dodatkowo oprócz publikacji wymienionych powyżej wiadomo, że można przeprowadzić fermentację w wolnej od surowicy pożywce zrekombinowanych komórek CHO zawierających gen EPO. Takie sposoby opisano np. w EP-A 0513738, EP-A 0267678 oraz w ogólnej postaci w Kawamoto, T. i inni. Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0248656, Kowar, J. i Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0481791, EP-A 0307247, EP-A 0343635, WO 88/00967.

W EP-A 0267678 do oczyszczania EPO wytworzonej w hodowlach wolnych od surowicy po dializie zastosowano chromatografię jonowymienną na S-Sepharose, preparatywną HPLC w kolumnie C8 z odwróconymi fazami oraz chromatografię z filtracją żelową. W tym sposobie etap chromatografii z filtracją żelową można zastąpić chromatografią jonowymienną na S-Sepharose z szybkim przepływem. Proponuje się także przeprowadzenie chromatografii z barwnikiem w kolumnie Blue Trisacryl przed chromatografią jonowymienną.

Sposób oczyszczania zrekombinowanej EPO opisano w Nobuo, I. i inni J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Zgodnie z tym sposobem przed etapami oczyszczania EPO poddaje się jednak działaniu roztworu Tween® 20, fluorku fenylometylosulfonylu, etylomaleimidu, pepstatyny A, siarczanu miedzi i kwasu oksamowego. W publikacjach, w tym WO 96/35718, Burg, z 14 listopada 1996 r., ujawniono sposób wytwarzania erytropoetyny drogą procesu fermentacji w pożywce wolnej od surowicy (EPOsf).

Specyficzną aktywność EPO lub koniugatów EPO według wynalazku można określić na podstawie różnych znanych testów. Aktywność biologiczna oczyszczonych białek EPO według wynaIazku jest taka, że podanie białka EPO w zastrzykach ludziom powoduje zwiększenie produkcji retykulocytów i erytrocytów w komórkach szpiku kostnego w porównaniu z pacjentami, którym ich nie podawano, lub pacjentami z grup kontrolnych. Aktywność biologiczną białek EPO lub ich fragmentów,

PL 219 131 B1 otrzymanych i oczyszczonych zgodnie z wynalazkiem, można przebadać metodami według Annable i inni, Bull. Wid. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 oraz Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Inny sposób określania aktywności białka EPO, test normocytemiczny na myszach, opisano w przykładzie 6.

Wynalazek zostanie lepiej zrozumiany po zapoznaniu się z poniższymi przykładami.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Fermentacja i oczyszczanie ludzkiej EPO

a) Wytwarzanie i fermentacja materiału inokulacyjnego

Z Working Cell Bank, z gazowej fazy w zbiorniku do przechowywania w ciekłym azocie, pobrano jedną fiolkę zawierającą linię komórkową CHO produkującą EPO (można stosować ATCC CRL8695, ujawnioną w EP 411678 (Genetics Institute)). Komórki przeniesiono do szklanych butelek do wirowania i hodowano w pożywce buforowanej wodorowęglanem w inkubatorze w atmosferze wilgotnego CO2. Standardowa pożywka, wolna od surowicy, stosowana do wytwarzania i fermentacji materiału inokulacyjnego, ujawniona w europejskim zgłoszeniu patentowym 513738, Koch, 12 czerwca 1992 r. lub WO 96/35718, Burg, 14 listopada 1996 r., zawiera np. jako pożywkę DMEM/F12 (np. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, zamówienie nr 57-736) i dodatkowo wodorowęglan sodu, L+glutaminę, D+glukozę, zrekombinowaną insulinę, selenin sodu, diaminobutan, hydrokortyzon, siarczan żelaza(II), asparaginę, kwas asparaginowy, serynę i stabilizator komórek ssaczych, taki jak np. polialkohol winylowy, metyloceluloza, polidekstran, glikol polioksyetylenowy, pluronic F68, środek zwiększający objętość osocza poligelinę (HEMACCEL®) lub poliwinylopirolidon (WO 96/35718).

Pod mikroskopem sprawdzono czy hodowle nie zawierają mikroorganizmów zanieczyszczających je oraz określono gęstość komórek. Testy te przeprowadzano po każdym etapie podziału.

Po okresie początkowego wzrostu hodowlę rozcieńczono świeżą pożywką do wyjściowej gęstości komórek i poddano jeszcze jednemu cyklowi wzrostu. Procedurę powtarzano do momentu otrzymania objętości około 2 litrów hodowli na każde szklane naczynie do wirowania. Po około 12 powtórzeniach uzyskano 1 - 5 litrów hodowli, której następnie użyto jako materiału inokulacyjnego w 10 litrowym fermentorze inokulacyjnym.

Po 3 - 5 dniach, hodowlę z 10 litrowego fermentora można zastosować jako materiał inokulacyjny w 100 litrowym fermenterze inokulacyjnym.

Po 3 - 5 dniach hodowli, hodowlę ze 100 litrowego fermentatora można zastosować jako materiał inokulacyjny w 1000 litrowym fermentorze produkcyjnym.

b) Zbieranie hodowli i oddzielanie komórek

Zastosowano proces periodycznego powtórnego uzupełniania, czyli gdy hodowla osiągała wymaganą gęstość, zbierano około 80% hodowli. Pozostałą część hodowli uzupełniano świeżą pożywką i hodowano do czasu następnego zbioru. Jeden etap produkcyjny składał się z maksymalnie 10 następujących po sobie zbiorów: 9 częściowych zbiorów i 1 całkowitego zbioru pod koniec fermentacji. Zbieranie wykonywano co 3 - 4 dni.

Określoną objętość zbioru przenoszono do chłodzonego naczynia. Komórki usuwano przez wirowanie lub filtrację i odrzucano. Supernatant otrzymany po wirowaniu, zawierający EPO, kolejno filtrowano i zbierano w drugim chłodzonym naczyniu. Każdy ze zbiorów podczas oczyszczania poddawano obróbce osobno.

Typowy sposób oczyszczania białka EPO ujawniono w WO 96/35718, Burg, 14 listopada 1996 r. Proces oczyszczania objaśniono poniżej.

a) Chromatografia na Blue Sepharose

Blue Sepharose (Pharmacia) składa się z ziaren Sepharose, które mają na powierzchni kowalencyjnie związany barwnik błękit Cibacron. Ze względu na to, że EPO wiąże się z Blue Sepharose silniej niż większość niebiałkowych zanieczyszczeń, niektóre białkowe zanieczyszczenia i PVA, EPO można w tym etapie wzbogacić. Elucję z kolumny Blue Sepharose prowadzi się zwiększając stężenie soli, a także pH.

Kolumnę wypełniono 80 - 100 litrami Blue Sepharose, zregenerowanej z użyciem NaOH i doprowadzono do stanu równowagi buforem do równoważenia (chlorek sodu/wapnia i octan sodu). Wprowadzono zakwaszony i przefiltrowany supernatant fermentacyjny. Po zakończeniu wprowadzania kolumnę przemyto najpierw buforem podobnym do buforu do równoważenia, o wyższym stężeniu chlorku sodu, a następnie buforem Tris-zasada. Produkt wyeluowano buforem Tris-zasada i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.

PL 219 131 B1

b) Chromatografia na Butyl Toyopearl

Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) to złoże polistyrenowe z kowalencyjnie związanymi alifatycznymi grupami butylowymi. EPO wiąże się z żelem mocniej niż większość zanieczyszczeń i PVA, tak więc należy ją eluować buforem zawierającym izopropanol.

Kolumnę wypełniono 30 - 40 I złoża Butyl Toyopearl 650 C, zregenerowanego NaOH, przemyto buforem Tris-zasada i równoważono buforem Tris-zasada zawierającym izopropanol.

Eluat z Blue Sepharose doprowadzono z użyciem izopropanolu do osiągnięcia jego stężenia w buforze do równoważenia kolumny i wprowadzono do kolumny. Następnie kolumnę przemyto buforem do równoważenia, o wzrastającym stężeniu izopropanoIu. Produkt wymyto buforem do elucji (bufor Tris-zasada o dużej zawartości izopropanolu) i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.

c) Chromatografia na hydroksyapatycie Ultrogel

Hydroksyapatyt Ultrogel (Biosepra) to hydroksyapatyt włączony w matrycę agarozową dla polepszenia właściwości mechanicznych. EPO ma niskie powinowactwo do hydroksyapatytu, a zatem może być wyeluowana przy niższym stężeniu fosforanu niż inne zanieczyszczenia białkowe.

Kolumnę wypełniono 30 - 40 litrami hydroksyapatytu Ultrogel i zregenerowano buforem fosforan potasu/chlorek wapnia i NaOH, a następnie buforem Tris-zasada. Następnie kolumnę równoważono buforem Tris-zasada o niskim stężeniu izopropanolu i chlorku sodu.

Eluat z chromatografii Butyl Toyopearl zawierający EPO wprowadzono do kolumny. Następnie kolumnę przemyto buforem do równoważenia i buforem Tris-zasada bez izopropanolu i chlorku sodu. Produkt wyeluowano buforem Tris-zasada o niskim stężeniu fosforanu potasu i zebrano w jedną frakcję, zgodnie z wzorcowym profilem elucji.

d) HPLC Vydac C4 z odwróconymi fazami

Złoże RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) składa się z cząstek żelu krzemionkowego, mających na powierzchni przyłączone łańcuchy alkilowe CA. Oddzielanie EPO od białkowych zanieczyszczeń jest oparte na różnicach siły oddziaływań hydrofobowych. Białko eluuje się gradientowo z użyciem acetonitrylu w rozcieńczonym kwasie trifluorooctowym.

Preparatywną HPLC prowadzono z użyciem kolumny ze stali nierdzewnej (wypełnionej 2,8 3,2 litra żelu krzemionkowego Vydac C4). Eluat ze złoża hydroksyapatytu Ultrogel zakwaszono dodawszy kwasu trifIuorooctowego i wprowadzono do kolumny Vydac C4. Do przemywania i elucji gradientowej stosowano roztwory acetonitrylu w rozcieńczonym kwasie trifluorooctowym. Frakcje zbierano i od razu zobojętniano buforem fosforanowym. Połączono frakcje EPO pozostające w zakresach IPC.

e) Chromatografia na DEAE Sepharose

Złoże DEAE Sepharose (Pharmacia) zawiera grupy dietyloaminoetylowe (DEAE) kowalencyjnie związane z powierzchnią ziaren Sepharose. W wiązaniu EPO z grupami DEAE biorą udział oddziaływania jonowe. Acetonitryl i kwas trifIuorooctowy przepływają przez kolumnę bez zatrzymywania. Po wyeluowaniu tych substancji usuwa się śladowe zanieczyszczenia przemywając kolumnę buforem octanowym o niskim pH. Kolumnę przemywa się obojętnym buforem fosforanowym, a EPO eluuje się buforem o zwiększonej sile jonowej.

Kolumnę wypełniono DEAE Sepharose do szybkiego przepływu. Objętość kolumny ustalono tak, żeby umożliwić wprowadzenie EPO w zakresie 3 - 10 mg EPO/ml żelu. Kolumnę przemyto wodą i buforem do równoważenia (fosforan sodu/potasu). Wprowadzono połączone frakcje eluatu z HPLC i kolumnę przemyto buforem do równoważenia. Następnie kolumnę przemyto buforem do przemywania (bufor z octanu sodu), po czym przemyto buforem do równoważenia. Następnie EPO wyeluowano z kolumny buforem do elucji (chlorek sodu, fosforan sodu/potasu) i zebrano w jedną frakcję zgodnie z wzorcowym profilem elucji.

Eluat z kolumny DEAE Sepharose doprowadzono do określonego przewodnictwa. Otrzymaną substancję leczniczą wyjałowiono przez filtrację do butelek Teflon i przechowywano w -70°C.

P r z y k ł a d 2. PEG-ilacja EPO z użyciem mPEG-SBA

EPO oczyszczona według procedury z użyciem pożywki wolnej od surowicy z przykładu 1 (EPOsf) była homogeniczna, co stwierdzono metodami analitycznymi i wykazywała typowy układ izoform składający się z ośmiu izoform. Jej specyficzna aktywność biologiczna wynosiła 190000 lU/mg, co określono w normocytemicznym teście na myszach. Zastosowanym reagentem PEG-ilującym był metoksyPEG-SBA, który jest związkiem o wzorze II, w którym R oznacza metyl; x oznacza 3; a m oznacza 650 - 750 (średnio około 680, co odpowiada średniej masie cząsteczkowej około 30 kDa).

PL 219 131 B1

Reakcja PEG-ilacji

Do 100 mg EPOsf (9,71 ml z roztworu podstawowego EPOsf o stężeniu 10,3 mg/ml, 5,48 gmol) dodano 10 ml 0,1 M buforu z fosforanu potasu, pH, 7,5 zawierającego 506 mg metoksy-PEG-SBA o 30 kDa (16,5 gmola) (otrzymanego z Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) i całość mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (20-23°C). Końcowe stężenie białka wynosiło 5 mg/ml, a stosunek białko:odczynnik PEG wynosił 1:3. Po dwóch godzinach reakcję przerwano doprowadziwszy pH do 4,5 za pomocą lodowatego kwasu octowego i całość przechowywano w -20°C, do czasu gotowości do oczyszczania.

Oczyszczanie

1. Mieszanina koniugatów: około 28 ml SP-SEPHAROSE FF (sulfopropylowa żywica kationowymienna) umieszczono w szklanej kolumnie AMICON (2,2x7,5 cm) i doprowadzono do równowagi z użyciem 20 mM buforu octanowego, pH, 4,5 przy przepływie 150 ml/h. 6 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 30 mg białka rozcieńczono pięciokrotnie buforem do równoważenia i wprowadzono do kolumny. Niezaadsorbowaną substancję wyeluowano buforem, a zaadsorbowaną mieszaninę koniugatów PEG wyeluowano z kolumny z użyciem 0,175 mM NaCl w buforze do równoważenia. Niemodyfikowaną EPOsf nadal pozostającą w kolumnie wyeluowano 750 mM NaCl. Kolumnę ponownie doprowadzono do stanu równowagi z wyjściowym buforem. Próbki analizowano metodą SDS-PAGE i określono stopień ich PEG-ilacji. Stwierdzono, że eluat 0,175 M NaCl zawierał koniugaty mono-, a także di- oraz śladowe ilości tri-PEG-ilowanych koniugatów, podczas gdy eluat 750 mM NaCl zawierał niemodyfikowaną EPOsf.

2. Di-PEG i Mono-PEG-EPOsf: Oczyszczoną mieszaninę koniugatów z kolumny w poprzednim etapie rozcieńczono czterokrotnie buforem, ponownie wprowadzono do kolumny i przemyto w sposób opisany powyżej. Di-PEG-EPOsf i mono-PEG-EPOsf oddzielnie wyeluowano z kolumny odpowiednio 0,1 M NaCl i 0,175 M NaCl. Elucję także przeprowadzono z użyciem 750 mM NaCl, w celu wymycia pozostałej niemodyfikowanej EPOsf.

Alternatywnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono pięciokrotnie buforem octanowym i wprowadzono do kolumny SP-Sepharose (około 0,5 mg białka/ml żelu). Kolumnę przemyto i zaadsorbowane mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf i niemodyfikowaną EPOsf wyeluowano jak opisano w poprzedniej części.

Wyniki

PEG-EPOsf zsyntetyzowano przez chemiczne sprzęganie z liniową cząsteczką PEG o średniej masie cząsteczkowej 30 kDa. PEG-EPOsf pochodziła z reakcji pomiędzy pierwszorzędowymi grupami aminowymi EPOsf i pochodną estru sukcynoimidylowego 30 kDa PEG-kwasu masłowego, z utworzeniem wiązania amidowego.

Wyniki podano w tabeli 1. Oczyszczona mieszanina koniugatów zawierała mono- i di-PEGEPOsf i była wolna od niemodyfikowanej EPOsf, co ustalono na podstawie analizy SDS-PAGE. Mieszanina koniugatów zawierała 23,4 mg lub 78% substancji wyjściowej. Rozdział mono- i di-PEGEPOsf metodą chromatografii kationowymiennej wykazał, że stosunek mono- do di-PEG w mieszaninie koniugatów wynosił prawie 1:1. Po zakończeniu reakcji stosunek poszczególnych składników Mono: Di: Niemodyfikowana wynosił 40: 38: 20 (%). Całkowita wydajność była prawie ilościowa.

T a b e l a 1

Zestawienie wyników PEG-ilacji EPOsf

Próbka	Białko (mg)	Wydajność (%)
Rxn. Miesz.	30	100
Mono-	12,0	40
Di-	11,4	38
Niemodyfikowana	6,0	20
Mieszanina koniugatów	23,4	78

P r z y k ł a d 3. PEG-ilacja EPO z użyciem mPEG-SPA

Inną porcję EPOsf użytej w przykładzie 2 poddano reakcji z 30 kDa metoksy-PEG-SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Reakcję przeprowadzono przy stosunku białko:reagent

PL 219 131 B1 wynoszącym 1:2 i oczyszczono metodami według przykładu 2. Wytworzono głównie mono-PEG-ilowane koniugaty.

P r z y k ł a d 4. Kowalencyjne łączenie grup tiolowych z EPO

Przykład ujawnia ustalanie warunków reakcji kowalencyjnego wiązania grup tiolowych z EPO. W celu ustalenia warunków różne ilości reagentów zawierających zablokowane grupy tiolowe, w danym przypadku SATA lub SATP (rozpuszczone w DMSO, 10 mg/ml) dodano do roztworu EPO, w danym przypadku do 1 ml EPO w stężeniu 5 mg/ml, w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, pH

7,3. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez około 30 minut (25°C) i reakcję przerwano przez dodanie 1 M roztworu lizyny do osiągnięcia stężenia 10 mM. Nadmiar SATA i SATP usunięto przez dializę wobec 10 mM fosforanu potasu, 50 mM NaCl i 2 mM EDTA, pH 6,2. Po usunięciu zabezpieczającej grupy acetylowej za pomocą hydroksyloaminy, fotometrycznie określono liczbę grup tiolowych kowalencyjnie związanych z EPO za pomocą ditiodipyrydyny, według metody opisanej przez Grasetti, D.R. i Murray, J. F. W J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, str. 41-49 (1967).

Liczbę grup tiolowych kowalencyjnie związanych z cząsteczką EPO przedstawiono poniżej.

Stosunek molowy EPO:SATA lub SATP	Mole grup tiolowych/mol EPO
EPO:SATA = 1:3	1,5
EPO:SATA = 1:5	2,4
EPO:SATA = 1:6	3,2
EPO:SATP = 1:3	1,3
EPO:SATP = 1:4	2,5
EPO:SATP = 1:6	3,7

P r z y k ł a d 5. Modyfikacja aktywowanej EPO metoksy-PEG-maleimidem

A) Aktywacja EPO

EPO (100 mg) wytworzoną według przykładu 1 (190000 lU/mg, jak określono w normocytemicznym teście na myszach) zaktywowano z użyciem SATA (stosunek molowy: EPO/SATA = 1/5) według przykładu 2. Powstałą EPO („aktywowaną EPO”), zawierającą kowalencyjnie przyłączone zablokowane grupy tiolowe oddzielono od produktów ubocznych, takich jak N-hydroksysukcynoimid lub nieprzereagowany SATA, drogą dializy, jak opisano w przykładzie 1. Otrzymano roztwór 4,5 mg/ml aktywowanej EPO w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2.

B) PEG-ilacja aktywowanej EPO:

W powyższym roztworze zawierającym 95 mg aktywowanej EPO (4,5 mg/ml w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2) rozpuszczono 380 mg metoksy-PEG-maleimidu o „najkorzystniejszej strukturze zilustrowanej powyżej (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)). Otrzymano roztwór o stosunku molowym zaktywowanej EPO do metoksyPEG-maIeimidu wynoszący 1:4. W wyniku dodania do powyższego roztworu 1M wodnego roztworu hydroksyloaminy do stężenia 30 mM, pH 6,2, odblokowano kowalencyjnie związane zablokowane grupy tiolowe zaktywowanej EPO. Powstała zaktywowana EPO w mieszaninie reakcyjnej zawierała wolne grupy tiolowe (-SH). Po odblokowaniu grup tiolowych natychmiast zaszła reakcja sprzęgania pomiędzy zaktywowaną EPO zawierającą teraz wolne grupy tiolowe (-SH), a metoksy-PEGmaleimidem przez 90 minut (mieszanie, 25°C). Reakcję sprzęgania przerwano przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 0,2 M wodnego roztworu cysteiny do stężenia 2 mM. Po 30 minutach nadmiar wolnych grup tiolowych zaktywowanej EPO, które nie przereagowały z metoksy-PEG-maleimidem, zablokowano przez dodanie 0,5 M roztworu N-metylomaleimidu w DMSO do stężenia 5 mM. Po 30 minutach powstałą mieszaninę reakcyjną zawierającą teraz PEG-ilowaną EPO poddano dializie wobec 10 mM fosforanu sodu, pH 7,5, przez >15 godzin.

C) Oczyszczanie PEG-ilowanych pochodnych EPO:

W celu oczyszczenia PEG-ilowanych EPO z mieszaniny reakcyjnej, wykonano następujące czynności: 50 ml kolumnę Q-Sepharose ff zrównoważono 10 mM fosforanem potasu, pH 7,5. Mieszaninę reakcyjną otrzymaną w etapie B) wprowadzono do kolumny (szybkość przepływu: 3 objętości kolumny (CV) na godzinę). W celu oddzielenia nieprzereagowanego reagenta metoksy-PEG-maleimidowego kolumnę przemyto 5 CV 10 mM fosforanu potasu, pH 7,5. PEG-ilowane pochodne EPO

PL 219 131 B1 rozdzielono przez przemywanie roztworami o wzrastającym gradiencie soli, zawierającymi 5 CV buforu A (10 mM fosforan potasu, pH 7,5) i 5 CV buforu B (10 mM fosforan potasu, 500 mM NaCl, pH 7,5) przy przepływie 3 CV na godzinę. W oparciu o gradient NaCl, PEG-ilowane rodzaje EPO (tri-, bii mono-PEG-ilowane EPO) zostały wyeluowane najpierw, a następnie zostały wyeluowane nie-PEG-ilowane EPO. Frakcję eluatu z kolumny zawierającą PEG-ilowane pochodne EPO (tri-, di- i monoPEG-ilowane EPO) zebrano i przesączono (filtracja sterylizacyjna przez filtr 0,2 μm).

Zawartość oraz czystość tri-, di- i mono-PEG-ilowanych EPO określono na barwionych Coomassie żelach SDS-PAA (Laemmli. Nature 227, 680-685 (1970)), a stężenia białka określono przy 280 nm, zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Pozorna masa cząsteczkowa różnych rodzajów EPO określona metodą elektroforezy SDS-PAA wynosiła około 68 kDa (monoPEG-ilowana EPO), około 98 kDa (di-PEG-ilowana EPO) i około 128 kDa (tri-PEG-ilowana EPO).

Dalsze rozdzielenie tri-, di i mono-PEG-ilowanych EPO można osiągnąć metodą chromatografii, np. chromatografii z wykluczeniem wielkości (Superdex, pg 200; Pharmacia). Aktywność biologiczną in vivo eluatu zawierającego tri- di- i mono-PEG-ilowaną EPO określono według metody opisanej poniżej.

P r z y k ł a d 6. Aktywność in vivo PEG-ilowanej EPO określona w teście normocytemicznym na myszach

Biologiczny test normocytemiczny na myszach jest znany (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)), a sposób jest opisany w monografii dotyczącej erytropoetyny, Ph. Eur. BRP. Próbki rozcieńczono z użyciem BSA-PBS. Normalnym zdrowym myszom, w wieku 7 - 15 tygodni, podano podskórnie 0,2 ml frakcji EPO zawierającej niepegilowaną EPO lub tri-, di- albo mono-PEGilowaną EPO z przykładu 2 lub 3. Przez okres 6 dni pobierano krew przez nakłucie żyły ogonowej i rozcieńczano tak, aby 1 μl krwi znajdował się w 1 ml roztworu wybarwiającego z 0,15 μmola oranżu akrydynowego. Czas wybarwiania wynosił 3 - 10 minut. Retykulocyty policzono mikrofluorometrycznie w cytometrze przepływowym analizując histogram czerwonej fIuorescencji. Ilość retykulocytów podano w postaci liczb bezwzględnych (na 30000 analizowanych komórek krwi). W przedstawionych danych każda grupa składała się z 5 myszy na dzień, i od każdej myszy pobierano krew tylko raz.

Myszom podano niemodyfikowaną EPO (25 ng EPO), mieszaninę PEG(SBA)-EPO z przykładu 2 (10 ng koniugatu), mono- i di- PEG-ilowane EPO z przykładu 2 (10 ng koniugatu), PEG(SPA)-EPO z przykładu 3 (10 ng koniugatu) oraz roztwór buforowy. Wyniki poddano w tabeli 2. Wyniki wykazują wyższą aktywność oraz dłuższy okres półtrwania PEG-ilowanych EPO, co wskazuje znacznie podwyższona liczba retykulocytów i przesunięcie maksymalnego zliczenia retykulocytów przy użyciu takiej samej dawki na mysz (10 ng) w porównaniu do dawki 25 ng niemodyfikowanej EPO.

T a b e l a 2

	EPO (niemodyfikowana)	30 kDa SPA PEG	Mono 30K SBA	Di 30K SBA	Mieszanina koniugatów PEG-EPO SBA	Bufor kontrolny
72 h	1000	1393	1411	994	1328	857
96 h	500	1406	1501	926	1338	697
120 h	około 200	1100	1182	791	944	701
144 h	około 0	535	607	665	660	708

P r z y k ł a d 7. Wytwarzanie mieszaniny składającej się głównie z mono-PEG-EPO

Reakcja PEG-ilacji

Do 100 mg (5,48 μmol) EPOsf w 100 mM buforze z fosforanu potasu, pH 7,5, wytworzonej według przykładu 1, dodano 329 mg (10,96 ąmol) reagenta 30 kDa PEG-SBA rozpuszczonego w 3 ml 1 mM HCl. Następnie dodano wystarczającą ilość 100 mM buforu z fosforanu potasu, pH 7,5, aby doprowadzić objętość mieszaniny reakcyjnej do 20 ml. Końcowe stężenie białka wynosiło 5 mg/ml, a stosunek białko: reagent PEG wynosił 1:2. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze otoczenia (20 - 22°C). Po dwu godzinach reakcję przerwano doprowadziwszy pH do 4,5 lodowatym kwasem octowym i przechowywano zamrożoną mieszaninę w -20°C, do czasu gotowości do oczyszczania.

Oczyszczanie

Mieszaninę reakcyjną z poprzedniego etapu rozcieńczono 1:5 10 mM octanem sodu, pH 4,5 i naniesiono na 300 ml SP-Sepharose FF (sulfopropylowe złoże kationowymienne) umieszczoną

PL 219 131 B1 w kolumnie 4,2x19 cm. Kolumnę uprzednio zrównoważono z użyciem takiego samego buforu. Eluat z kolumny monitorowano przy 280 nm za pomocą monitora Gilson UV i rejestrowano za pomocą rejestratora Kipp and Zonen. Kolumnę przemyto 300 ml, co odpowiadało jednej objętości złoża, buforu do równoważenia dla usunięcia nadmiaru reagentów, produktów ubocznych reakcji i oligomerycznych PEG-EPO. Następnie kolumnę przemyto 100 mM NaCl w ilości odpowiadającej dwóm objętościom złoża, dla usunięcia di-PEG-EPO. Następnie mono-PEG-EPO wyeluowano z użyciem 200 mM NaCl. Podczas elucji mono-PEG-EPO, pierwsze 50 ml piku białka odrzucono i mono-PEG-EPO zebrano w 150 ml frakcji. Niemodyfikowaną EPOsf pozostającą w kolumnie wyeluowano 750 mM NaCl. Wszystkie bufory do elucji przygotowano w buforze do równoważenia. Wszystkie wyeluowane próbki zanalizowano metodami SDS-PAGE i wysokosprawnej chromatografii z wykluczeniem wielkości (SEC). Następnie pulę mono-PEG-EPO uzyskaną z 150 ml frakcji, która nie zawierała wykrywalnych ilości niemodyfikowanej EPOsf, zatężono do około 4,5-7,5 mg/ml i poddano diafiltracji do buforu do przechowywania, 10 mM fosforan potasu, 100 mM NaCl, pH 7,5. Zatężanie/diafiltrację przeprowadzono w układzie Millipore Labscale™ TFF System wyposażonym w błonę Millipore Pellicon XL Biomax 50 odcinającą 50 kDa. w temperaturze otoczenia. Zatężoną mono-PEG-EPO wyjałowiono przez przesączenie i przechowywano zamrożoną w -20°C.

Około 75% EPOsf było PEG-ilowane. Po oczyszczaniu, całkowita wydajność wynosiła około 30% mono-PEG-EPO z niewykrywalną niemodyfikowaną EPOsf i około 25% di-PEG-EPO. Oligomery i niePEG-ilowana EPOsf stanowiły pozostałe białko. Pula mono-PEG-EPO uzyskana z 150 ml frakcji zawierała około 90% mono-PEG-EPO i około 10% di-PEG-EPO.

P r z y k ł a d 8. Termostabilność EPO i PEG-ilowanej EPO w różnych preparatach: Analiza metodą DSC (różnicowej kalorymetrii skaningowej)

Ogólnie przyjmuje się, że temperatura przejścia denaturacji termicznej mierzona metodą różnicowej kalorymetrii skaningowej jest wiarygodnym wskaźnikiem termostabilności białek. Roztwory erytropoetyny lub PEG-ilowanej erytropoetyny o stężeniu 0,6 - 1,2 mg/ml analizowano w różnych buforach z dodatkiem lub bez dodatku stabilizatorów z zastosowaniem Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, USA) przy szybkości ogrzewania 2 K/min. Wzrost temperatury przejścia wskazuje wzrost termostabilności białka. Zmierzonych wartości temperatury nie powinno uważać się za wartości absolutne, ale raczej odpowiadają one różnicom w stabilności poszczególnych preparatów względem innych.

W celu określenia optymalnego pH preparatów zbadano zależność termicznej denaturacji PEGilowanej erytropoetyny od pH w zakresie 4 - 9. Próbki białka analizowano w 30 mM Na2HPO4, 30 mM cytrynianie sodu, 30 mM boranie. Fig. 1 przedstawia plateau maksymalnej temperatury przejścia w zakresie około pH 6 - 9 oraz ostre obniżenie jej poniżej pH 5,5. Oznacza to, że optymalne pH dla maksymalnej trwałości termicznej znajduje się powyżej pH 5,5. (fig. 3).

W celu zbadania wpływu siły jonowej określono zależność denaturacji termicznej od stężenia fosforanu. Fig. 4 pokazuje, że termostabilność wzrasta wraz ze wzrostem siły jonowej preparatu.

Zbadano także metodą DSC wpływ substancji buforującej. Z fig. 5 wynika, że buforami lub dodatkami najbardziej odpowiednimi dla wysokiej termostabilności są siarczan, cytrynian lub fosforan. Glicyna, która jest stosowana jako bufor w obecnie dostępnych preparatach (patrz wyżej) nie jest odpowiednia.

Fig. 6 pokazuje, że siarczan jest także odpowiednim buforem/dodatkiem przy niskim pH (np. pH 6,2), podczas gdy fosforan jest mniej odpowiedni przy pH 6,2 w porównaniu do pH 7,5. Wskazuje to, że siarczan pozwala dobrze utrzymywać termostabilność, nawet przy niskim pH. Umożliwia to wytwarzanie preparatów o niskim pH 6,0 - 6,5, bez istotnego pogorszenia termostabilności erytropoetyny.

P r z y k ł a d 9. Agregacja EPO i peg-EPO w warunkach stresu termicznego: Analiza SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu).

Aby zbadać wpływ stresu cieplnego na białko erytropoetynę, próbki różnych preparatów wystawiono na działanie stresu cieplnego (20 min 80°C) i analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) w warunkach redukujących (z DTT w buforze do próbek) oraz nieredukujących (bez DTT w buforze do próbek). Metoda ta pozwala wykryć powstawanie kowalencyjnych agregatów. Jak opisano powyżej, powstawanie agregatów jest jedną z głównych przyczyn degradacji białek, a zatem powinno się mu zapobiegać w farmaceutycznych preparatach białek. Agregaty wykrywalne w warunkach bez środka redukującego (np. DTT) oraz niewykrywalne w obecności środka redukującego z największym prawdopodobieństwem powstały w wyniku utworzenia nieprawidłowych mostków disulfidowych, reakcji utlenienia, w stresie cieplnym.

PL 219 131 B1

Fig. 5 pokazuje zależność od pH agregacji w stresie cieplnym. Doświadczenie to wyraźnie pokazuje, że powstawanie agregatów jest hamowane przy pH poniżej 6,5. Im wyższe pH, tym większy stopień agregacji. Większość powstałych agregatów można zredukować przez podziałanie na próbki środkiem redukującym podczas SDS-PAGE, co sugeruje, że duża część agregatów powstałych w warunkach stresu cieplnego stanowią połączone mostkami disulfidowymi dimery, oligomery i agregaty wyższego rzędu. Biorąc to razem pod uwagę, oznacza to, że powstawaniu agregatów można w dużym stopniu zapobiegać przez utrzymywanie pH preparatu w lub poniżej pH 6,5.

Fig. 7: Zależność agregacji peg-EPO od pH. Próbki pegEPO po stresie cieplnym (jak opisano powyżej) analizowano metodą SDS-PAGE. Białka wybarwiono srebrem. Ścieżka 1: wzorzec masy cząsteczkowej. Ścieżka 2; pH 5. Ścieżka 3; pH 5, próbka zredukowana. Ścieżka 4: pH 6. Ścieżka 5: pH 6, próbka zredukowana. Ścieżka 6: pH 6,5. Ścieżka 7: pH 6,5, próbka zredukowana. Ścieżka 8: pH 7. Ścieżka 9; pH 7, próbka zredukowana. Ścieżka 10: peg-EPO, bez stresu.

Powstawaniu agregatów można także zapobiegać dzięki użyciu przeciwutleniaczy. Fig. 8 pokazuje, że użycie 1 mg/ml acetylocysteiny jako przeciwutleniacza zapobiega powstawaniu agregatów w warunkach stresu cieplnego. Zatem, aby zapobiec tworzeniu się agregatów w warunkach stresu cieplnego korzystne może być stosowanie przeciwutleniacza, takiego jak np. acetylocysteina przy niskim pH, np. pH 6,2.

Fig. 8: Agregacji peg-EPO można zapobiegać przez ustalenie pH 6,2 i/lub za pomocą acetylocysteiny. Próbki peg-EPO po stresie cieplnym (jak opisano powyżej) analizowano metodą SDS-PAGE. Białka wybarwiono srebrem. Ścieżka 1: peg-EPO, bez stresu. Ścieżka 2: pH 7,5, ze stresem. Ścieżka 3: pH 6,2, ze stresem. Ścieżka 4: pH 6,2, ze stresem, próbka zredukowana. 5 Ścieżka 5: pH 7,5, 1 mg/ml acetylocysteiny, ze stresem. Ścieżka 6: pH 7,5, 1 mg/ml acetylocysteiny, ze stresem, próbka zredukowana.

P r z y k ł a d 10. Trwałość peg-EPO w różnych preparatach w 4, 25, 30 i 40°C

PEG-ilowaną EPO w różnych preparatach inkubowano w kilku temperaturach. We wskazanych punktach czasowych pobierano próbki i badano trwałość metodą wysokosprawnej chromatografii z odwróconymi fazami (rpHPLC), wysokosprawnej chromatografii z wykluczeniem wielkości (SEC) oraz elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). W tabeli 3 porównano trwałość peg-EPO w różnych preparatach w kilku temperaturach. Dane te wyraźnie wykazują wyższość opisanych tutaj preparatów pod względem odzysku białka i agregacji.

T a b e l a 3

Trwałość peg-EPO w różnych preparatach w kilku temperaturach

		Odzysk po sześciu miesiącach (%) w	Agregacja w 30°C wykrywalna (+/-)
Preparat*	pegEPO (pg/ml)	4°C	25°C	30°C	40°C
A	10	92	91	n.w.	39	n.w.
B	50	97	98	97	78	-
C	50	95	79	79	52	+
E	50	103	102	100	87	-
A	100	96	97	n.w.	50	n.w.
B	400	101	101	101	77	-
C	400	100	94	90	56	+
D	400	98	96	93	73	-
E	400	99	98	100	66	-

* Jako preparaty stosowano:

preparat A: 10 mM fosforan sodu, 100 mM chlorek sodu, pH 7,5.

preparat B: 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2.

preparat C: 10 mM fosforan sodu, 100 mM NaCl, pH 7,0.

preparat D: 10 mM fosforan sodu, 120 mM siarczan sodu, pH 6,2 preparat E: 40 mM arginina, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 1 mM CaCl2, pH 6,2.

PL 219 131 B1

P r z y k ł a d 11. Optymalizowane preparaty hamują utlenianie metioniny54 w białku EPO, metionina jako przeciwutleniacz

PEG-ilowaną EPO w różnych preparatach inkubowano w kilku temperaturach. Po sześciu miesiącach pobrano próbki i określono stopień utlenienia metioniny54 w następujący sposób. W skrócie, próbki EPO poddano działaniu endo-proteinazy LysC. Powstałe peptydy rozdzielono metodą chromatografii z odwróconymi fazami. Obliczono stosunek peptydu T8 utlenionego (zawierającego utlenioną metioninę54) do peptydu T8 (zawierającego nieutlenioną metioninę). Dane przedstawiono w tabeli 4.

T a b e l a 4

Stopień utlenienia metioniny54 białka EPO w różnych preparatach po sześciu miesiącach we wskazanej temperaturze

		Ilość utlenionej metioniny54 (%)
Preparat	PegEPO ^g/ml)	4°C	25°C	30°C	40°C
A	400	2,00	15,89	24,89	37,89
B	400	2,33	6,55	12,88	30,24
C	400	2,51	2,95	5,99	14,4
A	50	5,37	21,36	30,62	48,05
B	50	3,44	13,38	16,59	30,83
C	50	4,41	5,52	10,01	15,62

* preparaty wymieniono poniżej preparat A: 10 mM fosforan sodu, 100 mM chlorek sodu, pH 7,0 preparat B: 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2.

preparat C: 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, 1 mM metionina, pH 6,2.

Dane te wyraźnie pokazują, że korzystny preparat według wynalazku (10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2) ma lepsze właściwości niż inne preparaty, takie jak 10 mM fosforan sodu, 100 mM NaCl, pH 7,0, odnośnie stopnia utlenienia metioniny54. Dodanie 1 lub 10 mM metioniny do preparatu wyraźnie hamuje utlenianie metioniny54. Zatem metionina działa jako przeciwutleniacz i stabilizuje EPO.

P r z y k ł a d 12. Zawartość kwasu sjalowego w próbkach peg-EPO w różnych preparatach.

W celu zanalizowania integralności struktury węglowodanowej glikoproteiny peg-EPO analizowano zawartość kwasu sjaIowego w próbkach peg-EPO w optymalizowanych preparatach po przechowywaniu przez 6 miesięcy w różnych temperaturach z zastosowaniem znanych metod. Dane te wykazują, że nie stwierdzono ujemnego wpływu przechowywania białka w nowym preparacie tutaj opisanym na integralność struktury węglowodanowej (fig. 9).

P r z y k ł a d 13. Bioaktywność PEG-ilowanej EPO po przechowywaniu w podwyższonej temperaturze przez dłuższy okres czasu.

W celu potwierdzenia, że przechowywanie peg-EPO w buforze 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2, nie wpływa ujemnie na bioaktywność in vivo, przeprowadzono standardowy test mysi EPO (patrz przykład 6). Próbki peg-EPO przechowywane przez 6 miesięcy w buforze 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2, we wskazanych temperaturach, nie wykazywały utraty aktywności in vivo po przechowywaniu w 4, 25 i 30°C w porównaniu ze świeżym wzorcem (fig. 10).

P r z y k ł a d 14. Zawartość agregatu peg-EPO po przechowywaniu w podwyższonej temperaturze przez sześć miesięcy.

W celu zanalizowania zawartości agregatów w próbkach peg-EPO po przechowywaniu w podwyższonej temperaturze w buforze 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu, pH 6,2, po sześciu miesiącach próbki analizowano metodą chromatografii z wykluczeniem wielkości.

Nie wykryto żadnych agregatów w próbkach przechowywanych w 4, 25 i 30°C, co potwierdziło trwałość PEG-ilowanej EPO w wymienionych powyżej preparatach.

Fig. 11 przedstawia zestawione chromatogramy z chromatografii z wykluczeniem wielkości.

PL 219 131 B1

Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulica: 124 Grenzacherstrasse (C) Miasto: Bazylea (E) Kraj: Szwajcaria (F) Kod pocztowy(ZIP): CH-4070 (G) Telefon: (61) 688 11 11 (H) Telefax: (61) 688 13 95 (I) Telex: 962 292 hlr ch (ii) Tytuł wynalazku: Nowa kompozycja farmaceutyczna (iii) Liczba sekwencji: 2 (iv) Sposób odczytu komputerowego:

(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: WORD (D) Oprogramowanie: Patentln Release 2.0 <170> Patentln Wersja 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala 1

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Glu.

Ala

Lys 20

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile 25

Thr

Gly

Cys

Ala 30

Glu

His

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr 40

Val

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala 50

Trp

Lys

Arg

Met

Glu 55

Val

Gly

Gin

Ala 60

Val

Glu

Val

Trp

Gin 65

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu 70

Ser

Glu

Ala

Val

Leu 75

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu 80

Leu

Val

Asn

Ser

Ser 85

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro 90

Leu

Gin

Leu

His

Val 95

Asp

Lys

Ala

Val

Ser 100

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 105

Thr

Leu

Arg 110

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin 115

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser 120

Pro

Asp

Ala

Ala 125

Ser

Ala

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

PL 219 131 B1

130 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg	135 Gly Lys
145	150
Cys	Arg	Thr Gly Asp 165
<210> 2
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala	Pro	Pro Arg Leu	Ile	Cys Asp
1		5
Leu	Glu	Ala Lys Glu	Ala	Glu Asn
		20
Cys	Ser	Leu Asn Glu	Asn	Ile Thr
		35		40
Tyr	Ala	Trp Lys Arg	Met	Glu Val
	50			55
Gin	Gly	Leu Ala Leu	Leu	Ser Glu
65			70
Leu	Val	Asn Ser Ser	Gin	Pro Trp
		85
Lys	Ala	Val Ser Gly	Leu	Arg Ser
		100
Gly	Ala	Gin Lys Glu	Ala	Ile Ser
		115		120
Pro	Leu	Arg Thr Ile	Thr	Ala Aso
	130			135
Tyr	Ser	Asn Phe Leu	Arg	Gly Lys
145			150
Cys	Arg	Thr Gly Asp	Arg
		165

140

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 155 160

Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
	10	15
Ile 25	Thr	Thr	Gly	Cys	Ala 30	Glu	His
Val	Pro	Asp	Thr	Lys	Val	Asn	Phe

Gly	Gin	Gin	Ala 60	Val	Glu	Val	Trp
Ala	Val	Leu 75	Arg	Gly	Gin	Ala	Leu 80
Glu	Pro 90	Leu	Gin	Leu	His	Val 95	Asp
Leu	Thr	Thr	Leu	Leu	Arg	Ala	Leu

105 110

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 125

Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 140

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 155 160

PL 219 131 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Ciekła kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera białko pegilowaną ludzką erytropoetynę, wielokrotnie naładowany anion nieorganiczny w farmaceutycznie dopuszczalnym buforze odpowiednim do utrzymywania pH roztworu w zakresie 5,5 - 7,0 oraz ewentualnie jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, przy czym ta ciekła kompozycja jest w postaci roztworu wodnego i jest trwała w temperaturze pokojowej, a anion stanowi anion siarczanowy w stężeniu 10 - 200 mmoli siarczanu/litr.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest w postaci roztworu izotonicznego.
3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że pH wynosi 5,8 - 6,7.
4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że pH wynosi 6,0 - 6,5.
5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że pH wynosi około 6,2.
6. Kompozycja według zastrz. 1 - 5, znamienna tym, że bufor jest wybrany z grupy obejmującej bufor fosforanowy i arginina/H2SO4/Na2SO4.
7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor fosforanowy w ilości 10 - 50 mmoli/litr.
8. Kompozycja według zastrz. 1 - 7, znamienna tym, że zawiera jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek.
9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jedna lub większa liczba farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek jest wybrana z grupy obejmującej farmaceutycznie dopuszczalne sole, rozcieńczalniki, rozpuszczalniki i środki konserwujące.
10. Kompozycja według zastrz. 8 albo 9, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki są wybrane z grupy obejmującej środki tonizujące, poliole, przeciwutleniacze i niejonowe detergenty.
11. Kompozycja według zastrz. 8 - 10, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę stanowi poliol.
12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że poliol jest wybrany z grupy obejmującej mannit, sorbit, glicerynę, trehalozę i sacharozę.
13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że poliol stanowi mannit.
14. Kompozycja według zastrz. 8 - 13, znamienna tym, że zawiera przeciwutleniacz.
15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że przeciwutleniacz stanowi metionina.
16. Kompozycja według zastrz. 8 - 15, znamienna tym, że zawiera do 1 mmola CaCl2/litr.
17. Kompozycja według zastrz. 10 - 16, znamienna tym, że niejonowy detergent stanowi polisorbat 80, polisorbat 20 lub pluronic F68.
18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że niejonowy detergent stanowi pluronic F68.
19. Kompozycja według zastrz. 17 albo 18, znamienna tym, że zawiera do 1% (wag./obj.) niejonowego detergenta.
20. Kompozycja według zastrz. 17 - 19, znamienna tym, że zawiera do 0,1% (wag./obj.) niejonowego detergenta.
21. Kompozycja według zastrz. 1 - 20, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem, który to koniugat zawiera glikoproteinę ludzką erytropoetynę, przy czym ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z „n” ugrupowaniami poli(glikolu etylenowego) o wzorze -CO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR, a grupa -CO każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych; R oznacza niższy alkil, x oznacza 2 lub 3; m oznacza około 450 - 900, n oznacza 1 - 3; oraz n i m są dobrane tak, że masa cząsteczkowa koniugatu minus glikoproteina erytropoetyna wynosi 20 - 100 kDa.
22. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę o wzorze:

P-[NH-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) w którym m, n, x i R mają wyżej podane znaczenie, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez n grup(y) aminowej(ych) tworzącej(ych) wiązanie(a) amidowe z ugrupowaniem(ami) poli(glikolu etylenowego).
23. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę o wzorze (I), w którym x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza 1, a R oznacza metyl.

PL 219 131 B1
24. Kompozycja według zastrz. 1 - 20, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem, który to koniugat zawiera glikoproteinę ludzką erytropoetynę, przy czym ta glikoproteina jest kowalencyjnie związana z 1 - 3 ugrupowaniami niższego-alkoksy-poli(glikolu etylenowego), a każde ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) jest kowalencyjnie związane z glikoproteiną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, którego grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych, X oznacza -(CH₂)k- lub -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k, k oznacza 1 - 10, Y oznacza przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania poli(glikolu etylenowego) wynosi około 20 - 40 kDa, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi około 51 - 175 kDa.
25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)k, -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X.
26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera białko erytropoetynę, które jest koniugatem o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę glikoproteiny erytropoetyny bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X.
27. Kompozycja według zastrz. 1 - 26, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 gg białka erytropoetyny/ml.
28. Kompozycja według zastrz. 1 - 27, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 10 - 200 mmoli siarczanu/litr i 10 - 50 mmoli fosforanu/litr, o pH 6,0 - 6,5.
29. Kompozycja według zastrz. 1 - 15, znamienna tym, że zawiera 50 lub 400 μg pegilowanej erytropoetyny/ml, 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% (wag./obj.) mannitu i 1 mM metioninę, pH 6,2.
30. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że zawiera do 20 mM metioniny, 1 - 5% poliolu (wag./obj.), do 0,1% pluronic F68 (wag./obj.) i ewentualnie do 1 mM CaCl2.

PL 219 131 B1
31. Kompozycja według zastrz. 28 albo 30, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 pg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli siarczanu/litr, 10 mmoli fosforanu/litr, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.
32. Kompozycja według zastrz. 1 - 27, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 pg białka erytropoetyny/ml, 10 - 100 mmoli NaCl/litr, 10 - 50 mmoli fosforanu/litr, pH 6,0 - 7, ewentualnie 1 - 5% poliolu.
33. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że zawiera do 20 mM metioniny, do 0,1% pluronic F68 i ewentualnie do 7,5 pmola CaCl2/litr.
34. Kompozycja według zastrz. 32 albo 33, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 pg białka erytropoetyny/ml, 100 mmoli NaCl/litr, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 i 10 mmoli fosforanu/litr, pH 7,0.
35. Kompozycja według zastrz. 1 - 27, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 pg białka erytropoetyny/ml, 10 - 50 mmoli argininy/litr, pH 6 - pH 6,5, 10 - 100 mmoli siarczanu sodu/litr.
36. Kompozycja według zastrz. 35, znamienna tym, że zawiera do 20 mM metioniny, do 0,1% pluronic F68, ewentualnie do 1 mmola CaCl2/litr i ewentualnie 1 - 5% poliolu.
37. Kompozycja według zastrz. 35 albo 36, znamienna tym, że zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli argininy/litr, pH 6,2, 30 mmoli siarczanu sodu/litr, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68 i ewentualnie 1 mmol CaCl2/litr.
38. Kompozycja według zastrz. 1 - 27, znamienna tym, że zawiera 25 - 2500 pg białka erytropoetyny/ml oraz

a) 10 mM fosforan sodu, 120 mM siarczan sodu, pH 6,2, albo

b) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, pH 6,2, albo

c) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2, albo

d) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, pH 6,2, albo

e) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic

F68, pH 6,2.
39. Kompozycja według zastrz. 1 - 38, znamienna tym, że ilość erytropoetyny wynosi 50, 100, 400, 800 lub 2500 pg/ml.
40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że zawiera 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2.
41. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że zawiera 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu, 10 mM metioninę, 0,01% pluronic F68, pH 6,2.
42. Kompozycja według zastrz. 1 - 41, znamienna tym, że białko erytropoetyna ma sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
43. Sposób wytwarzania kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 - 42, znamienny tym, że miesza się białko pegilowaną ludzką erytropoetynę z roztworem zawierającym wielokrotnie ujemnie naładowany anion i ewentualnie jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek i doprowadza się do pH 5,5 - 7,0 z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnego buforu.
44. Zastosowanie kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 - 42 do wytwarzania leków użytecznych w leczeniu i profilaktyce chorób związanych z niedokrwistością u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (CRF), AIDS i/lub w leczeniu pacjentów z rakiem, poddawanych chemioterapii.