ME00673B - Nova farmaceutska smjesa - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na tečnu farmaceutsku smešu koja se sastoji od eritropoetinskog proteina, višestruko naelektrisanog neorganskog anjona u farmaceutski prihvatljivom puferu koji je pogodan da održava pH rastvora u opsegu od oko 5,5 do oko 7,0 i opciono jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (inertnih punila). Ova smeša je naročito prikladna za profilaksu i terapiju bolesti koje su u vezi sa eritropoezom.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na tečnu farmaceutsku smešu koja se sastoji od eritropoetinskog proteina, višestruko naelektrisanog neorganskog anjona u farmaceutski prihvatljivom puferu koji je pogodan da održava pH rastvora u opsegu od oko 5, 5 do oko 7, 0 i opciono jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (inertnih punila). Ova smeša je naročito prikladna za profilaksu i terapiju bolesti koje su u vezi sa eritropoezom.

Eritropoeza je proizvodnja crvenih krvnih ćelija koja se vrši da se nadoknadi razaranje (destrukcija) ćelija. Eritropoeza je kontrolisan fiziološki mehanizam koji omogućava da bude dovoljno raspoloživih crvenih krvnih ćelija za odgovarajuću oksidaciju tkiva. Humani eritropoetin (hEPO) koji se nalazi u prirodi se proizvodi u bubregu i on je humoralni plazma faktor koji stimuliše proizvodnju crvenih krvnih ćelija (P. Carnot and C. Deflandre, C. R. Acad. Sci. 143 (1906) 432; A. J. Erslev, Blood 8 (1953) 349; K. R. Reissmann, Blood 5 (1950) 372;

L. G. Jacobson, E. Goldvvasser, W. Freid and L. F. Plzak, Nature 179 (1957) 6331-6334). Prirodni EPO stimuliše deobu i diferencijaciju predatih (izloženih) eritroidnih progenitora u koštanoj srži i ispoljava svoju biološku aktivnost vezivanjem za receptore na eritroidnim prekursorima (B. S. Krantz, Blood 77 (1991) 419).

Eritropoetin se proizvodio biosintetički uz primenu rekombinantne DNK tehnologije (J. C. Egrie, T. W. Strickland, J. Lane et al., Immunobiol. 72 (1986) 213224) i predstavlja proizvod kloniranog humanog EPO gena umetnutog i ekspresovanog u ćelijama tkiva jajnika kineskog hrčka (CHO ćelijama). Primarna struktura preovlađujućeg, potpuno prečišćenog (procesovanog) oblika hEPO je ilustrovana u SEQ ID N0: 1. Postoje dva disulfidna mosta između Cys7-Cys161 i Cys29-Cys33. Molekulska težina polipeptidnog lanca (niza) EPO bez šećernih delova molekula je 18. 236 Da. U intaktnom (nedirnutom) EPO molekulu, približno 40% od molekulske težine se računa za ugljenohidratne grupe koje glikoziluju ovaj protein na mestima glikozilovanja na proteinu (H. Sasaki, B.Bothner, A. Dell and M. Fukuda, J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059).

Pošto je humani eritropoetin bitan (suštinski) u formiranju crvenih krvnih ćelija, ovaj hormon je prikladan u terapiji krvnih poremećaja koji su okarakterisani malom ili defektnom proizvodnjom crvenih krvnih ćelija. Klinički se EPO upotrebljava u terapiji anemije kod pacijenata sa hroničnom renalnom (bubrežnom) insuficijencijom (CRF) (J. W. Eschbach, J. C. Egrie, M. R. Downing et al., NEJM 316 (1987) 73-78; J. W. Eschbach, M. H. Abdulhadi, J. K. Browne et al., Ann. Intern. Med. 111 (1989) 992; J. C. Egrie, J. W. Eschbach, T. McGuire, J. W. Adamson, Kidney Intl. 33 (1988) 262; V. S. Lim, R. L. Degowin, D. Zavala et al. t Ann. Intern. Med. 110 (1989) 108-114) i sa AIDS-om (sidom) i kod pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti hemoterapiji (R. P. Danna,

S. A. Rudnick, R. I. Abels, u knjizi M. B. Garnick, editor, Erythropoietin in Clinical Applications. An International Perspective, New York, NY, Marcel Dekker, 1990, str. 301324).

Poznate farmaceutske smeše imaju najmanje jedan od sledećih nedostataka:

- one su liofilizati. Pored komplikovanog postupka za proizvodnju, liofilizati imaju nedostatak da se moraju rekonstituisati pre ubrizgavanja injekcijom u ljude. Ovo čini neophodnim da se izvrši dodatno rukovanje od strane medicinskog personala koje je nepogodno i nosi rizik nekorektnog rukovanja ovim farmaceutskim proizvodom;

- one sadrže humani serum albumin kao aditiv. Kako je humani serum albumin proizvod koji potiče iz tečnosti ljudskog tela, postoji rizik (opasnost) od virusnih infekcija preko kontaminanata (zagađivača) u ovom preparatu albumina. Takođe su moguće alergijske reakcije;

- sve za sada komercijalno raspoložive eritropoetinske smeše su nestabilne pri povišenim temperaturama, tj., iznad temperature frižidera koja je obično između 2 i 8°C. Zbog toga se one moraju skladištiti u frižideru (2-8°C) i ne mogu se skladištiti pri sobnoj temperaturi (oko 20°C).

. Ovo vodi do povećanih troškova, koji su prouzrokovani skladištenjem i transportom pri niskoj temperaturi i takođe prouzrokuje nepogodnost u rukovanju sa ovim lekovitim proizvodom. U ovom kontekstu nestabilan znači da skladištenje pri povišenim temperaturama, npr., pri 25°C za produžen period vremena (tj., nekoliko meseci ili više od 6 meseci) vodi do degradacije ovog proteina. Degradacija u ovom kontekstu opisuje fizičke promene (npr., agregaciju ili denaturaciju) i hemijske promene (npr., oksidaciju ili modifikaciju hemijskih veza uopšte) proteinskog molekula za koje je poznato da se prvenstveno vrše pri povišenim temperaturama (iznad 8°C). Inkubiranje proteina blizu ili iznad njegove prelazne temperature (koja se takođe zove i temperatura topljenja) vodi do razvijanja (otvaranja) proteina, tj., gubi se nativna (prirodna) struktura i biološka aktivnost ovog polipeptida. Prelazna temperatura se nalazi u jakoj uzajamnoj korelaciji (vezi) sa temperaturom stabilnosti proteina i zavisi od okoline proteina (npr., od pH, soli, jonske jačine, puferske supstance, itd. ). Na primer, denaturisanje može voditi do agregacije eritropoetinskih molekula, tj., formiranja dimera (kovalentnih ili nekovalentnih), agregata višeg reda i čak partikulata. Ovo vodi do smanjene potencije leka i može indukovati nepoželjne sporedne efekte posle ubrizgavanja injekcijom u ljude.

Problem koji se nalazi u osnovi ovog pronalaska je otuda da se obezbedi smeša koja može da minimizira ili suzbije gore pomenute nedostatke.

Ovaj problem je rešen, prema ovom pronalasku, obezbeđivanjem farmaceutske smeše koja se sastoji od eritropoetinskog proteina, višestruko naelektrisanog neorganskog anjona u puferskom rastvoru vrednosti pH od oko 5, 5 do oko 7, 0 i opciono jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (inertnih punila).

Neočekivano je nađeno da formulisanje eritropoetina u ovoj smeši poboljšava njegovu stabilnost pri temperaturama iznad temperature frižidera (2-8°C), naročito pri sobnoj temperaturi (tj. ispod 25°C) i čak pri višim temperaturama, npr., pri 40°C. Ovo znači da se ova smeša može skladištiti bez hlađenja u toku produženog vremenskog perioda bez gubljenja znatnih količina aktivnosti i bez značajne degradacije.

Ukoliko nije drugačije naznačeno sledeće definicije su navedene da ilustruju i definišu značenje i opseg različitih termina koji se ovde upotrebljavaju da opišu ovaj pronalazak.

Termin "višestruko naelektrisan neorganski anjon" se odnosi na neorganski anjon koji ima dve ili više negativnih šarži (naelektrisanja) po jednom molekulu, npr., sulfatni SO42- ili fosfatni anjon, t j. hidrogen-fosfatni anjon HP042-. Ovaj višestruko naelektrisani neorganski anjon se može dodati u obliku odgovarajuće soli, npr., natrijumove soli, kalijumove soli i njihovih smeša i/ili u obliku puferske supstance, npr., u obliku fosfatnog pufera.

serum

Termin "izoosmotski ili izotoničan" se odnosi na rastvor koji se može mešati sa telesnim tečnostima bez delovanja na njihove sastojke. Rastvori koji su izotonični sa krvlju, kao što je 0, 9%-ni rastvor natrijum-hlorida, imaju isti osmotski pritisak kao

i ne deluju na membrane crvenih krvnih ćelija. Uopšte uzevši, rastvori koji su izotonični sa krvlju su oko 290 mosm/kg H20.

Termin "jaka neorganska kiselina" se odnosi na neorganske kiseline koje pokazuju 20 do 100%-nu disocijaciju u 1N rastvoru, npr., H2S04.

Termin "farmaceutski prihvatljiv" kao što se ovde upotrebljava označava da su pufer ili soli prihvatljivi sa aspekta (tačke gledišta) toksičnosti.

Termin "razblaživač" označava sastojak u nekom medicinskom preparatu koji nema farmakološku aktivnost ali je farmaceutski potreban (neophopdan) ili poželjan.

Na primer, razblaživač može biti tečnost za rastvaranje lekova koji se trebaju ubrizgati injekcijom, npr., voda.

Termin "rastvarači" se odnosi na tečnost koja drži drugu supstancu u rastvoru, tj. rastvara je, npr., voda.

Termin "konzervansi" se odnosi na supstancu koja je dodata farmaceutskoj smeši da spreči razvijanje bakterija, npr., benzalkonijum-hlorid ili benzil-alkohol.

Termin "poliol" se odnosi na bilo koju supstancu sa višestrukim (brojnim) hidroksilnim grupama, uključujući polihidroksilne alkohole i ugljene hidrate. Polihidroksilni alkoholi uključuju takva jedinjenja kao što su sorbitol, manitol i glicerol. Ugljeni hidrati su ciklični molekuli koji mogu imati keto ili aldehidnu grupu, kao što su, npr., saharoza ili trehaloza.

Termin "eritropoetin" ili "eritropoetinski protein" se odnosi na protein sa in vivo biološkom aktivnošću koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i odabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i dole definisanih analoga.

Termin "pegilovan eritropoetin (peg-EPO ili PEG-EPO)" se odnosi na eritropoetinski protein koji je kovalentno vezan sa jednim do tri polietilenska derivata kao što je dole opisano.

Termin "uređaj" označava spravu (uređaj) za specifičnu svrhu. U ovom pronalasku svrha je da omogući, potpomaže ili olakšava davanje ove tečne farmaceutske smeše.

Opis crteža

Slika 1: Primarna struktura humanog EPO (165 aminokiselina) (SEQ ID N0: 1).

Slika 2: Primarna struktura humanog EPO (166 aminokiselina) (SEQ ID KO: 2).

Slika 3: Uticaj pH na termičku stabilnost. Prelazna temperatura je data nasuprot pH.

Slika 4: Uticaj jonske jačine na termičku stabilnost. Prelazna temperatura je data nasuprot fosfatnoj koncentraciji.

Slika 5: Zavisnost termičke stabilnosti od puferske supstance.

Slika 6 pokazaje da je sulfat takođe pogodan pufer/aditiv pri niskim vrednostima pH (npr., pH 6, 2), dok je fosfat manje pogodan pri pH 6, 2 u poređenju sa pH 7, 5. Ovo pokazuje da sulfat održava visoku termičku stabilnost čak i pri niskim vrednostima pH.

Slika 7: Zavisnost peg-EPO agregacije od pH. Uzorci peg-EPO posle toplotnog udara (kao što je gore opisano) su analizirani pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojeni srebrom. Traka 1: standardna molekulska težina. Traka 2: pH 5. Traka 3: pH 5, redukovan. Traka 4: pH 6. Traka 5: pH 6, redukovan. Traka 6: pH 6, 5. Traka 7: pH 6, 5, redukovan. Traka 8: pH 7. Traka 9: pH 7, redukovan. Traka 10: peg-EPO, nije bio pod toplotnim udarom.

Slika 8 pokazuje da primena 1 mg/rnl acetilcisteina kao antioksidansa sprečava formiranje agregata pod toplotnim udarom. Agregacija peg-EPO pod toplotnim udarom (20 minuta na 80°C): traka 1: peg-EPO pri pH 7, 5, nije bio pod toplotnim udarom; traka 2: peg-EPO pri pH 7, 5, bio

pod toplotnim udarom; traka 3: peg-EPO pri pH 6, 2, bio

pod toplotnim udarom; traka 4: peg-EPO pri pH 6, 2, bio

pod toplotnim udarom, redukovan; traka 5: peg-EPO pri pH

7, 5, +1 mg/ml N-acetil-cisteina, bio pod toplotnim udarom; traka 6: peg-EPO pri pH 7, 5, +1 mg/ml N-acetil-cisteina, bio pod toplotnim udarom, redukovan.

Slika 9: Sadržaj sialne kiseline (NANA) uzoraka peg-EPO u novim formulacijama, koje su skladištene 6 meseci na različitim temperaturama.

Slika 10: Proba bioaktivnosti (kod miša) uzoraka peg-EPO posle skladištenja u 10 mM natrijum-fosfatu, 40

mM aatrijum-sulfatu, 3%-nom (tež. /zapr. ) manitolu, pH 6, 2 u toku 6 meseci na nekoliko temperatura.

Slika 11: Prekrivanje hromatograma (sa isključenjem po veličini) uzoraka peg-EPO koji su skladišteni u toku 6 meseci u 10 mM natrijum-fosfatu, 40 mM natrijum-sulfatu, 3%-nom (tež. /zapr. ) manitolu, pH 6, 2 (od dna do vrha: pufer, polazni materijal, 4°C, 25°C, 30°C i 40°C).

Detaljnije rečeno, ovaj pronalazak se odnosi na tečnu farmaceutsku smešu koja obuhvata eritropoetinski protein, višestruko naelektrisan neorganski anjon u farmaceutski prihvatljivom puferu koji je pogodan da održava pH rastvora u opcegu od oko 5, 5 do oko 7, 0 i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (inertnih punila).

U jednom pogodnom oličenju, ova smeša je tečni rastvor, npr., vodeni rastvor. U jednom pogodnom oličenju ovog pronalaska, gornje farmaceutske smeše su izotonični rastvori.

Anjon je pogodno odabran između anjona jakih neorganskih kiselina, kao što su H2S04, H3P04. ili limunske kiseline. Prema tome su pogodni anjoni odabrani iz grupe koja se sastoji od sulfata, fosfata i citrata, pogodno sulfata ili fosfata i najpogodnije sulfata. Koncentracija višestruko naelektrisanog neorganskog anjona može varirati između 10 i 200 mmol/1, npr., za sulfatni anjon između 10 i 200 mmol/1.

Puferi koje treba upotrebiti u ovom pronalasku da se održava pH u opsegu od oko 5, 5 do oko 7, 0, pogodno u opsegu od 5, 8 do 6, 7, pogodnije u opsegu od 6, 0 do 6, 5 i najpogodnije pri oko pH 6, 2, mogu biti uobičajeni puferi organskih ili neorganskih kiselina (npr., fosfatni pufer, pufer arginin/HaSCh/NazSCg ili bilo koji drugi farmaceutski prihvatljiv puferski sistem). U jednom pogodnom oličenju, smeša sadrži fosfatni pufer ili pufer arginin/H2S0«5/Na2S04, pogodnije 10-50 mmol/1 fosfatni pufer. Naravno, kombinacije ovih puferskih sistema su takođe deo ovog pronalaska. Vrednost pH se može podesiti sa odgovarajućom bazom, npr., sa NaOH u fosfatnom puferskom sistemu odnosno sa odgovarajućom kiselinom, npr., sumpornom kiselinom u argininskom puferskom sistemu.

Smeše ovog pronalaska mogu sadržati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Ovi farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti mogu biti odabrani između farmaceutski prihvatljivih soli, razblaživača i/ili rastvarača i/ili konzervanasa, itd., napr., sredstava za toničnost (sredstava za postizanje izotoničnosti), poliola, antioksidanasa ili nejonskih deterdženata. Primeri za ove supstance su natrijum-hlorid, kalcijum-hlorid, sorbitol, manitol, glicerol, saharoza, trehaloza, acetilcistein, polisorbat 20, polisorbat 80 ili pluronik F68.

U jednom pogodnom oličenju ovog pronalaska ove farmaceutske smeše mogu sadržati poliol odabran iz grupe koja se sastoji od manitola, sorbitola, glicerola, trehaloze i saharoze, pogodno manitola. Koncentracija poliola može varirati između 1 i 10% (tež. /zapr. ).

Primeri za antioksidanse su cistein, metionin, acetilcistein ili askorbinska kiselina, pogodno metionin. Antioksidansi se obično mogu dodati u koncentraciji

između 0, 01 i 0, 5% (tež. /zapr. ) ili, npr., u slučaju metionina u koncentraciji od 1-20 mM.

Takođe, gore opisane smeše opciono mogu sadržati sredstvo za postizanje izotoničnosti sa koncentracijom od oko 0, 01 do oko 0, 9% (tež. /tež. ). Ova jedinjenja su poznata u ovoj oblasti nauke i tehnike; primeri za ova sredstva su natrijum-hlorid ili natrijum-sulfat. U jednom pogodnom oličenju ovog pronalaska ove smeše su izotonični rastvori. Gornja smeša takođe može sadržati nejonski deterdžent kao što je polisorbat 20, polisorbat 80 ili pluronik F68, pogodno pluronik F68, npr., do 1% (tež. /zapr. ), pogodnije do 0, 1% (tež. /zapr. ), npr. 0, 001 do 0, 01% (tež. /zapr. ).

Gornja smeša takođe može sadržati dodatne soli, npr., do 1 mmol/1 CaCl2.

Ovaj pronalazak je naročito prikladan za dobivanje -(proizvodnju) farmaceutskih smeša koje sadrže

eritropoetin kao farmaceutski aktivan sastojak. Termin "eritropoetin" ili "eritropoetinski protein" ili "EPO" je sledeci: specifično se ovi termini odnose na neki glikoprotein, npr., humani eritropoetin, npr., koji ima aminokiselinsku sekvencu izloženu (datu) u (SEQ ID: 1) ili (SEQ ID: 2) ili tome suštinski homolognu aminokiselinsku sekvencu, čije se biološke osobine odnose na stimulaciju proizvodnje crvenih krvnih ćelija i stimulaciju deobe i diferencijacije predatih (izloženih) eritroidnih progenitora u koštanoj srži. Kao što se ovde koriste, ovi termini uključuju takve proteine koji su namerno (promišljeno) modifikovani, kao na primer, poziciono dirigovanom mutagenezom ili nehotično (slučajno) preko mutacija. Ovi termini takođe uključuju analoge koji imaju

od 1 do 6 dodatnih položaja za glikozilovanje, analoge koji imaju najmanje jednu dodatnu aminokiselinu na karboksi-terminalnom kraju ovog glikoproteina, pri čemu ova dodatna aminokiselina uključuje najmanje jedno mesto glikozilovanja i analoge koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja uključuje premeštanje najmanje jednog mesta za glikozilovanje. Ovi termini uključuju kako prirodni tako i rekombinantno proizvedeni humani eritropoetin.

Kao što je dole detaljnije izloženo, dobivanje (proizvodnja) i prečišćavanje EPO su dobro poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike. Eritropoetinom se označava prirodni ili rekombinantni protein, pogodno humani protein, kao što je dobiven iz bilo kojeg uobičajenog izvora kao što su tkiva, sinteza proteina, kultura ćelija sa prirodnim ili rekombinantnim ćelijama. Pri tome je obuhvaćen bilo koji protein koji ima aktivnost eritropoetina, kao što su muteini ili na drugi način modifikovani proteini. Rekombinantni EPO može biti dobiven preko ekspresije u CHO-, BHK- ili HeLa ćelijskim nizovima, pomoću rekombinantne DNK tehnologije ili pomoću endogenog genskog aktiviranja. Ekspresija proteina, uključujući ekspresiju pomoću endogenog genskog aktiviranja, dobro je poznata u ovoj oblasti nauke i tehnike i otkrivena je, na primer, u SAD patentima br. 5. 733. 761, 5. 641. 670 i 5. 733. 746 i u međunarodnim patentnim publikacijama br. W0 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 i WO 91/09955, čiji su sadržaji ovde inkorporirani referencom. Pogodne EPO vrste za dobivanje eritropoetinskih glikoproteinskih proizvoda su humane EPO vrste. Pogodnije, EPO vrsta je humani EPO koji ima aminokiselinsku sekvencu izloženu (datu) u SEQ ID N0: 1 ili SEQ ID NO: 2, pogodnije aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: l.

Dalje, eritropoetin može biti glikoproteinski analog koji ima 1-6 dodatnih mesta (položaja) za glikozilovanje. Glikozilovanje proteina, sa jednom ili više oligosaharidnih grupa, vrši se na specifičnim lokacijama duž kičme polipeptida i uveliko deluje na fizičke osobine proteina kao što su stabilnost, lučenje, subćelijska lokalizacija i biološka aktivnost proteina.

Glikozilovanje je obično dva tipa. O-vezani oligosaharidi su vezani za serinske ili treoninske ostatke a N-vezani oligosaharidi su vezani za asparaginske ostatke. Jedan tip oligosaharida koji je nađen kako na N-vezanim tako i na O-vezanim oligosaharidima je N-acetilneuraminska kiselina (sialna kiselina) koja spada u familiju (porodicu) aminošećera koji sadrže 9 ili više C-atoma. Sialna kiselina je obično terminalni ostatak kako na N-vezanim tako i na O-vezanim oligosaharidima i pošto nosi negativnu šaržu daje kiselinske osobine ovom glikoproteinu. Humani eritropoetin, koji ima 165 aminokiselina, sadrži tri N-vezana oligosaharidna lanca i jedan O-vezan oligosaharidni lanac koji obuhvataju oko 40% od ukupne molekulske težine ovog glikoproteina. N-vezano glikozilovanje se vrši na asparaginskim ostacima lnciranim na položajima 24, 38 i 83 a 0-vezano glikozilovanje se vrši na serinskom ostatku lociranom na položaju 126. Ovi oligosaharidni lanci su modifikovani sa terminalnim ostacima sialne kiseline. Enzimsko uklanjanje svih ostataka sialne kiseline iz glikozilovanog eritropoetina rezultuje u gubitku in vivo aktivnosti ali ne i in vitro aktivnosti zbog toga što sialilovanje eritropoetina sprečava njegovo vezivanje i naredno uklanjanje pomoću jetrenog vezivnog proteina.

Termin "eritropoetin" ove farmaceutske srneše uključuje analoge humanog eritropoetina sa jednom ili više izmena u aminokiselinskoj sekvenci humanog eritropoetina koje rezultuju u povećanju broja mesta za priključenje sialne kiseline. Ovi glikoproteinski analozi se mogu generisati pomoću poziciono dirigovane mutageneze koja ima dodavanja, izbacivanja ili supstitucije aminokiselinskih ostataka koja povećavaju ili menjaju broj mesta raspoloživih za glikozilovanje.

Glikoproteinski analozi koji imaju nivoe sialne kiseline veće od onih koji su nađeni u humanom eritropoetinu se generišu dodavanjem mesta za glikozilovanje koja ne narušavaju (remete) sekundarnu ili tercijarnu konformaciju potrebnu za biološku aktivnost.

Glikoproteini ovog pronalaska takođe uključuju analoge koji imaju povećane nivoe priključenja (prikopčavanja) ugljenih hidrata na mestu glikozilovanja koje obično obuhvata supstituciju jedne ili više aminokiselina u vrlo bliskom susedstvu prema N-vezivnom ili O-vezivnom položaju. Glikoproteini ovog pronalaska takođe uključuju analoge koji imaju jednu ili više aminokiselina koje se protežu od karboksi-terminalnog kraja eritropoetina i obezbeđuju (daju) najmanje jedan dodatni ugljenohidratni položaj. Eritropoetinski proteini ove srneše takođe uključuju analoge koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja uključuje premeštanje najmanje jednog mesta (položaja) za glikozilovanje. Takvo premeštanje mesta (položaja) glikozilovanja uključuje izbacivanje jednog ili više mesta glikozilovanja u humanom eritropoetinu i dodavanje jednog ili više mesta glikozilovanja koja se ne javljaju u prirodi. Povećavanje broja ugljenohidratnih lanaca na eritropoetinu i otuda povećavanje broja sialnih kiselina u odnosu na broj molekula eritropoetina može dati (preneti) pogodne osobine kao što su povećana

rastvorijivost, veća otpornost prema proteoiizi, smanjena imunogeničnost, povećan poluživot seruma i povećana biološka aktivnost. Analozi eritropoetina sa dodatnim mestima glikozilovanja su detaljnije izloženi u evropskoj patentnoj prijavi 640. 619, prema Elliotu, koja je publikovana 1. marta 1995.

U jednom pogodnom oličenju, farmaceutska smeša ovog pronalaska sadrži (obuhvata) eritropoetinske proteine sa aminokiselinskom sekvencom koja uključuje najmanje jedno dodatno mesto (položaj) za glikozilovanje kao što su, ali nije ograničena samo na njih, eritropoetini koji sadrže sekvencu humanog eritropoetina modifikovanu sa modifikacijom odabranom između sledećih modifikacija:

Način označavanja koji se ovde upotrebljava za modifikaciju aminokiselinske sekvence označava da su položaji odgovarajućeg nemodifikovanog proteina (npr., hEPO sa SEQ ID N0: 1 ili SEQ ID NO: 2) pokazani tako što su brojevi gornjeg indeksa promenjeni na aminokiseline koje odmah prethode odnosnim brojevima gornjeg indeksa.

Eritropoetinski protein takođe može biti analog koji ima najmanje jednu dodatnu aminokiselinu na karboksi-terminalnom kraju glikoproteina, pri čemu ova dodatna aminokiselina uključuje najmanje jedno mesto glikozilovanja. Ova dodatna aminokiselina može sadržati peptidni fragment koji se izvodi (potiče) iz karboksi-terminalnog kraja humanog horionskog gonadotropina. Pogodno, ovaj glikoprotein je analog odabran iz grupe koja se sastoji od a) humanog eritropoetina koji ima aminokiselinsku sekvencu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO: 3) koja se proteže iz karboksi-terminusa, b) analoga humanog eritropoetina a) koji dalje sadrži Ser87 Asn88 Thr90 EPO i c) analoga humanog eritropoetina a) koji dalje sadrži Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO.

Eritropoetinski protein takođe može biti analog koji ima aminokiselinsku sekvencu koja uključuje premeštanje najmanje jednog mesta za glikozilovanje. Ovo premeštanje može obuhvatati izbacivanje bilo kojih N-vezanih ugljeno-hidratnih mesta u humanom eritropoetinu i dodavanje jednog N-vezanog ugljenohidratnog mesta na položaju 88 aminokiselinske sekvence humanog eritropoetina. Pogodno, ovaj glikoprotein je analog odabran iz grupe koja se sastoji od Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO, Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO i Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.

Specifičnije, eritropoetinski protein ove farmaceutske smeše kao što je gore opisano takođe može uključivati njegove pegilovane derivate. Pegilovani derivati eritropoetina i njihovo dobivanje su poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike i opisani su, na primer, u EP-A-539. 167, EP-A-605. 963, W0 93/25212, W0 94/20069, WO 95/11924, SAD patentu br. 5. 56, EP-A-584. 876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, SAD patentima br. 5. 359. 030 i 5. 681. 811, SAD patentu br. 4. 179. 337, japanskom patentu WO 98/32466, SAD patentu br. 5. 324. 650. Jedno pogodno oličenje pegilovanih eritropoetinskih vrsta se odnosi na dole opisane derivate.

Prema tome se ovaj pronalazak takođe odnosi na eritropoetinski konjugat, pri čemu pomenuti konjugat obuhvata gore opisani eritropoetinski protein koji ima najmanje jednu slobodnu amino-grupu i koji Ima in vivo biološku aktivnost koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i koji je odabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih aualoga koji imaju sekvencu humanog eritropoetina modifikovanu dodavanjem 16 mesta glikozilovanja ili premeštanjem najmanje jednog mesta glikozilovanja; pri čemu je pomenuti eritropoetin kovalentno vezan za "n" poli(etilen-glikol)-nih grupa formule -CO- (CH2) x-(OCH2CH2) m-OR pri čemu -CO (tj., karbonil) svake poli(etilen-glikol)-ne grupe formira amidnu vezu sa jednom od pomenutih amino-grupa; pri čemu R označava niži alkil, x je 2 ili 3, m je od oko 450 do oko 900, n je od 1 do 3 i n i m su tako odabrani da razlika molekulske težine ovog konjugata i eritropoetinskog glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona. do 100 kilodaltona. Ovaj pronalazak dalje daje farmaceutske smeše koje sadrže ovde opisane konjugate u kojima procenat konjugata u kojima je n = 1 iznosi najmanje 90%, pogodno najmanje 92%, pogodnije 96% od svih konjugata ove smeše.

Specifičnije se gornji konjugati mogu predstaviti formulom (I)

pri čemu je P ostatak eritropoetinskog proteina kao što je ovde opisan (tj., bez amino-grupe ili amino-grupa koje formiraju amidnu vezu sa karbonilom prikazanim u formuli I), koji ima in vivo biološku aktivnost koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i pri čemu R označava niži alkil, x je 2 ili 3, m je od oko 450 do oko 900, n je od 1 do 3 i n i m su tako odabrani da razlika molekulske težine ovog konjugata i eritropoetinskog glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona.

Kao što se ovde upotrebljava termin "niži alkil" označava linearnu ili račvastu alkil-grupu koja ima 1-6 C-atoma. Primeri nižih alkil-grupa uključuju metil, etil i izopropil. Prema ovom pronalasku, R je niži alkil. Pogodni su konjugati u kojima R označava metil.

Simbol "m" označava broj etilenoksidnih ostataka (OCH2CH2) u poli(etilenoksid)-noj grupi. Jednostruka PEG (polietilenglikol)-na podjedinica etilenoksida ima molekulsku težinu od oko 44 daltona. Otuda molekulska

težina konjugata (isključujući molekulsku težinu EPO) zavisi od broja "m". U konjugatima ovog pronalaska "rn" je od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj težini od oko 20 kDa do oko 40 kDa), pogodno od oko 650 do oko 750 (što odgovara molekulskoj težini od oko 30 kDa). Broj m se tako odabira da rezultujući konjugat ovog pronalaska ima fiziološku aktivnost koja se može porediti sa nemodifikovanim EPO, pri čemu se ova' aktivnost može predstaviti kao ista, veća od ili kao frakcija odgovarajuće aktivnosti nemodifikovanog EPO. Molekulska težina od "oko" nekog broja označava da je unutar prihvatljivog opsega tog broja kao što je određeno pomoću uobičajenih analitičkih tehnika. Broj "m" se tako odabira da molekulska težina svake poli (etilenglikol)-ne grupe koja je kovalentno vezana za eritropoetinski glikoprotein iznosi od oko 20 kDa do oko 40 kDa i pogodno iznosi oko 30 kDa.

U konjugatima ovog pronalaska broj "n" je broj poli-(etilenglikol)-nih grupa koje su kovalentno vezane za slobodne amino-grupe (uključujući s-amino-grupe lizinske amino-kiseline i/ili amino-terminalnu amino-grupu) eritropoetinskog proteina preko amidnih veza. Konjugat ovog pronalaska može imati jednu, dve ili tri PEG grupe po molekulu EPO. "n" je ceo broj u opsegu od 1 do 3, pogodno "n" je 1 ili 2 i pogodnije "n" je 1. Pogodan konjugat gore opisanih konjugata obuhvata jedinjenja u kojima x iznosi 2, m je 650 do 750, n je 1 i R označava metil.

Jedinjenje formule (I) može se dobiti iz poznatog polimernog materijala:

u kojem Rim imaju gore opisano značenje, konclenzovanjem jedinjenja formule II sa eritropoetinskim glikoproteinom. Jedinjenja formule (II) u kojima x iznosi 3 su a-niži alkoksi, sukcinimidil-estri buterne kiseline poli(etilenglikola) (skraćeno niži alkoksi-PEG-SBA). Jedinjenja formule (II) u kojima x iznosi 2 su a-niži alkoksi, sukcinimidil-estri propionske kiseline poli(etilenglikola) (skraćeno niži alkoksi-PEG-SPA). Pri tome se'može koristiti bilo koji uobičajen postupak reagovanja aktiviranog estra sa aminom tako da se formira amid. U gore opisanoj reakciji primereni sukcinimiđil-estar je odlazeća grupa koja prouzrokuje formiranje amida. Primena sukcinimidil-estara kao što su jedinjenja formule II tako da se proizvedu konjugati sa proteinima je otkrivena u SAD patentu br. 5. 672. 662 koji je izdat (objavljen) 30. septembra 1997 (Harris et al).

Humani EPO sadrži 9 slobodnih amino-grupa, amino-terminalnu amino-grupu i ε-amino-grupe 8 lizinskih ostataka. Kada je reagens za pegilovanje kombinovan sa SBA jedinjenjem formule II, nađeno je da je pri pH 7, 5, odnosu protein: PEG od 1: 3 i pri reakcionoj temperaturi od 20-25°C, proizvedena smeša mono-, di- i tragova količina tri-pegilovanih vrsta. Kada je reagens za pegilovanje bio SPA jedinjenje formule II, pri sličnim uslovima osim što je odnos protein: PEG bio 1: 2, primarno je proizvedena mono-pegilovana vrsta. Pegilovan EPO se može davati kao smeša ili kao različite pegilovane vrste koje su odvojene pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije. Podešavanjem reakcionih uslova (npr., odnosa reagenasa, pH, temperature, koncentracije proteina, vremena trajanja reakcije, itd. ) mogu se varirati relativne količine različitih pegilovanih vrsta.

Gore opisane farmaceutske smeše takođe mogu sadržati gore definisan eritropoetinski protein koji ima najmanje jednu slobodnu amino-grupu i koji ima in vivo biološku aktivnost koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i koji je odabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji imaju primarnu strukturu humanog eritropoetina koja je rodifikovana dodavanjem 1-6 mesta glikozilovanja; pri čemu je pomenuti glikoprotein kovalentno vezan za 1-3 niži alkoksi-poli(etilen-glikol)-ne grupe, pri čemu je svaka poli(etilen-glikol)-na grupa kovalentno vezana za glikoprotein preko vezivača formule -C(0)-X-S-Y- pri čemu C(0) ovog vezivača formira amidnu vezu sa jednom od pomenutih amino-grupa, X označava -(CH2)k- Hi -CH2(0-CH2CH2)k-,t pri čemu k iznosi 1-10, Y označava

pri čemu je srednja molekulska težina svakog poli(etilen-glikol) -nog dela molekula od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona i molekulska težina ovog konjugata je od oko 51 kilodalton do oko 175 kilodaltona.

Ova eritropoetinska vrsta se takođe može predstaviti formulom (III)

u kojoj R može biti bilo koji niži alkil, kojim se označava linearna ili račvasta alkil-grupa koja ima 1-6 C-atoma kao što je metil, etil, izopropil, itd. Pogodna alkil-grupa je metil. X može biti -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)k- pri čemu k iznosi od 1 do oko 10. Pogodno k iznosi 1 do oko 4, još pogodnije k iznosi 1 ili 2. Najpogodnije X označava -(CH2).

U formuli III, Y označava

pogodno

pogodnije

U formuli (III), broj m se tako odabira da rezultujući konjugat formule (III) ima fiziološku aktivnost koja se može porediti sa fiziološkom aktivnošću nemodifikovanog EPO, pri čemu ova aktivnost može predstavljati istu, veću od ili frakciju odgovarajuće fiziološke aktivnosti nemodifikovanog EPO. m označava broj etilenoksidnih ostataka u PEG jedinici. Jednostruka PEG podjedinica -(OCH2-CH2)- ima molekulsku težinu od oko 44 daltona. Otuda molekulska težina konjugata (isključujući molekulsku težinu EPO) zavisi od broja m. Molekulska težina od "oko" nekog broja označava da je unutar prihvatljivog (prikladnog) opsega tog broja kao što je to određeno pomoću uobičajenih analitičkih tehnika, m je ceo broj u opsegu od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj težini od 20 do 40 kDa), pogodno m iznosi od oko 550 do oko 800 (oko 24 do 35 kDa) i najpogodnije m iznosi od oko 650 do oko 700 (oko 29 do oko 31 kDa).

U formuli (III) broj n je broj ε-amino-grupa lizinske amino-kiseline u eritropoetinskom proteinu koje su kovalentno vezane za PEG jedinicu preko amidne veze. Konjugat dat ovim pronalaskom može imati jednu, dve ili tri PEG jedinice po molekulu EPO. n je ceo broj u opsegu od 1 do 3, pogodno n iznosi 1 ili 2 i još pogodnije n je 1.

Pogodni eritropoetinski proteini formule (III) su predstavljeni formulama:

Najpogodniji eritropoetinski glikoproteinski produkti su predstavljeni formulom:

pri čemu u gornjim formulama n označava ceo broj od 1 do 3, m je ceo broj od 450 do 900, R je niži alkil, X označava -(CH2)k- ili -CH2 (0-CH2- CH2) k- i P je ostatak eritropoetinskog glikoproteina bez amino-grupe ili amino-grupa koje formiraju amidnu vezu sa X.

Drugi pogodni eritropoetinski glikoproteinski produkti su predstavljeni formulama:

Pogodniji eritropoetinski glikoproteinski produkti su-predstavijeni formulom:

Ovi eritropoetinski proteini se mogu dobiti

a) kovalentnim reagovanjem ε-amino-grupe lizinske aminokiseline eritropoetinskog proteina predstavljenog formulom P-[NH2]n sa bifunkcionalnim reagensom predstavljenim formulom Z-CO-X-S-Q, tako da se formira intermedijer sa amidnom vezom koji je predstavljen formulom

pri čemu P označava eritropoetinski protein bez amino-grupe koja formira amidnu vezu, n je ceo broj u opsegu od 1 do 3, Z je reaktivna grupa, npr., karboksilni-NHS-estar, X označava -(CH2)k- ili -CH2 (O-CH2-CH2)k-, pri čemu k iznosi od 1 do 10 i Q označava zaštitnu grupu, kao što je alkanoil-grupa, npr., acetil-grupa.

b) kovalentnim reagovanjem ovog intermedijera sa amidnom vezom iz stupnja a) sa aktiviranim poli(etilen-glikol)-nim derivatom predstavljenim formulom W-[OCH2CH2]m OR, tako da se formira eritropoetinski glikoproteinski proizvod koji je predstavljen formulom:

pri čemu W označava sulfhidrilni reaktivni oblik Y, m je ceo broj u opsegu od oko 450 do oko 900, R označava niži alkil i Y je definisan kao što je gore dato.

U ovom oličenju, bifunkcionalni reagens je pogodno N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat ili N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat, Z je pogodno N-hidroksi-sukcinimid i aktivirani poli (etilenglikol)-ni derivat W-[OCH2CH2]m-OR je pogodno odabran iz grupe koja se sastoji od jod-acetil-metoksi-PEG, metoksi-PEG-vinilsulfona i metoksi-PEG-rnaleinimida.

Detaljnije rečeno, eritropoetinski proteini formule (III) mogu se dobiti kovalrntnim vezivanjem tiolnih grupa za EPO ("aktiviranje") i kuplovanjem rezultujućeg aktiviranog EPO sa poli (etilenglikol)-nim (PEG) derivatom. Prvi stupanj za dobivanje pegilovanog EPO prema ovom pronalasku obuhvata kovalentno vezivanje tiolnih grupa preko NH2-grupa EPO. Ovo aktiviranje EPO se vrši sa bifunkcionalnim reagensima koji nose zaštićenu tiolnu grupu i dodatnu reaktivnu grupu, kao što su aktivni estri (npr., sukcinimidil-estar), anhidridi, estri sulfonskih kiselina, halogenidi karboksilnih kiselina odnosno sulfonskih kiselina. Tiolna grupa se štiti grupama koje su poznate u ovoj oblasti nauke i tehnike, npr., acetil-grupama. Ovi bifunkcionalni reagensi mogu da reaguju sa s-amino-grupama lizinskih amino-kiselina formiranjem amidne veze. Prvi stupanj ove reakcije je dole izložen:

pri čemu EPO, n i X imaju gore daćo značenje i Z označava reaktivnu grupu koja je poznata u ovoj oblasti nauke i tehnike, npr., N-hidroksi-sukcinimidni (NHS) supstituent formule

U jednom pogodnom oličenju aktiviranje e-amino-lizinskih grupa se vrši reakcijom sa bifunkcionalnim reagensima koji imaju sukcinimidil-deo molekula. Ovi bifunkcionalni reagensi mogu nositi različite vrste za razmicanje, npr., dc love molekula -(CH2)k- ili -CH2-(0-CH2-CH2)k-, u kojima k iznosi od 1 do oko 10, pogodno od 1 do oko 4 i pogodnije 1 ili 2 i najpogodnije 1. Primeri ovih reagenasa su N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat (SATP) i N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA)

NHS-estar acetiltioalkil-karboksilne kiseline, kao

NHS-estar 2-(acetiltio)-(etoksi)k-sirćetne kiseline

pri čemu je k definisano kao što je gore dato,

Dobivanje ovih bifunkcionalnih reagenasa je poznato u ovoj oblasti nauke i tehnike. Prekursori NHS-estara 2-(acetiltio)-(etoksi)k-sirćetne kiseline su opisani u DE-3924705, dok je derivatizaćija do acetiltio-jedinjenja opisana u knjizi J. March-a, Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, str. 375-376. SATA je komercijalno raspoloživo jedinjenja (Molecular Probes, Eugene, OR, SAD i Pierce, Rockford, IL, SAD).

Broj tiolnih grupa koje treba dodati EPO molekulu može se odabrati podešavanjem reakcionih parametara, tj., koncentracije proteina (EPO) i odnosa protein/bi-funkcionalni reagens. Pogodno se EPO aktivira kovalentnim vezivanjem 1-5 tiolnih grupa po molekulu EPO, pogodnije 1, 5-3 tiolne grupe po molekulu EPO. Ovi opsezi se odnose na statističku distribuciju ove tiolne grupe na populaciji EPO proteina.

Ova reakcija se vrši, na primer, u vodenom puferskom rastvoru, pH 6, 5-8, 0, npr. u 10 mM kalijum-fosfatu, 50 mM NaCl, pH 7, 3. Bifunkcionalni reagens se može dodati u DMSO. Posle kompletiranja reakcije, pogodno posle 30 minuta, reakcija se zaustavlja dodavanjem lizina. Višak bifunkcionalnog reagensa se može odvojiti pomoću metoda koje su dobro poznate u ovoj oblasti nauke i tehnike, npr., dijalizom ili filtriranjem preko kolone. Srednji broj tiolnih grupa koje su dodate EPO može se odrediti pomoću fotometrijskih metoda koje su opisane, na primer, u referenci D. R. Grasetti and J. F. Murray, J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49.

Gornju reakciju sledi kovalentno kuplovanje aktiviranog poli(etilenglikol)-nog (PEG) derivata. Pogodni PEG derivati su aktivirani PEG molekuli sa srednjom molekulskom težinom od oko 20 do oko 40 kDa, pogodnije od oko 24 do oko 35 kDa i najpogodnije oko 30 kDa.

Aktivirani PEG derivati su poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike i opisani su, na primer, u referenci M. Morpurgo et al., J. Bioconj. Chem. 7 (1996) str. 363 i dalje za PEG-vinilsulfon. Za dobivanje jedinjenja formule 1 pogodne su pravolančane (linearne) i račvaste PEG vrste. Primeri reaktivnih PEG reagenasa su jod-acetil-metoksi-PEG i metoksi-PEG-vinilsulfon:

Primena ovih jodom aktiviranih supstanci je poznata u ovoj oblasti nauke i tehnike i opisana je u radu G. T. Hermansona, u knjizi Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) str. 147-148.

Najpogodnije se PEG vrste aktiviraju pomoću maleinimida uz primenu (alkoksi-PEG-maleinimida), kao što je metoksi-PEG-maleinimid (MT 30. 000, Shearwater Polymers, Ine. ). Struktura alkoksi-PEG-maleinimida je sledeća:

pri čemu su R i m definisani kao što je gore dato, pogodno

Reakcija kuplovanja sa alkoksi-PEG-maleinimidom se vrši posle in situ odcepljenja tiolne zaštitne grupe u vodenom puferskom rastvoru, npr., 10 mM kalijum-fosfatu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6, 2. Odcepljenje zaštitne grupe se može vršiti, na primer, sa hidroksilaminom u DMSO pri 25°C, pH 6, 2 u toku oko 90 minuta. Za ovu PEG modifikaciju, molarni odnos aktivirani EPO/alkoksi-PEG-maleinimid trebao bi biti od oko 1: 3 do oko 1: 6 i pogodno 1: 4. Ova reakcija se može zaustaviti dodavanjem cisteina i reakcijom preostalih tiolnih (-SH) grupa sa N-metil-maleinimidom ili drugim odgovarajućim jedinjenjima koja mogu formirati disulfidne veze. Zbog ove reakcije bilo kojih preostalih aktivnih tiolnih grupa sa zaštitnom grupom kao što je N-metilmaleinimidna ili neka druga pogodna zaštitna grupa, u konjugatima ovog pronalaska EPO glikoproteini mogu sadržati takve zaštitne grupe. Uopšte rečeno, ovde opisan postupak će proizvesti smešu molekula koja ima varirajuće brojeve tiola zaštićenih različitim brojevima zaštitne grupe, u zavisnosti od broja aktiviranih tiolnih grupa na ovom glikoproteinu koje nisu bile konjugovane (vezane) za PEG-maleinimid.

Dok N-metilmaleinimid formira isti tip kovalentne veze kada se upotrebljava da blokira preostale tiolne grupe na pegilovanom proteinu, disulfidna jedinjenja će voditi u intermolekulskoj sulfid. /disulfid reakciji izmene do disulfidom premošćenog kuplovanja reagensa za blokiranje. Pogodni reagensi za blokiranje za taj tip reakcije blokiranja su oksidovan glutation (GSSG), cistein i cistamin. Dok se sa cisteinom ne uvodi dodatno neto naelektrisanje u pegilovan protein, upotreba reagenasa za blokiranje GSSG ili cistamina rezultuje u dodatnom negativnom ili pozitivnom naelektrisanju.

Dalje prečišćavanje jedinjenja formule (III), uključujući odvajanje mono-, di- i tri-pegilovanih EPO vrsta, može se vršiti pomoću metoda poznatih u ovoj oblasti nauke i tehnike, npr. hromatografijom na koloni.

Smeša koja obuhvata pegilovane derivate eritropoetina i koja pogodno sadrži najmanje 90% mono-PEG konjugata, tj. u kojem je n = 1, može se dobiti na način kao što je prikazano u primeru 5. Obično su mono-PEG konjugati eritropoetinskih glikoproteina poželjni zbog njihove tendencije da imaju višu aktivnost od di-PEG konjugata. Procenat mono-PEG konjugata kao i odnos mono-i di-PEG vrsta se može kontrolisati sjedinjavanjem širih frakcija oko eluacionog pika tako da se smanji procenat mono-PEG ili užih frakcija da se poveća procenat mono-PEG u ovoj smeši. Dobra ravnoteža prinosa i aktivnosti je oko 90% mono-PEG konjugata. Ponekad se mogu želeti smeše u kojima su, na primer, najmanje 92% ili najmanje 96% konjugata mono-PEG vrste (n = 1). U jednom oličenju ovog pronalaska procenat konjugata u kojima je n = 1 iznosi od 90% do 96%.

Smeše prema ovom pronalasku mogu sadržati 10 do 10. 000 pig eritropoetinskog proteina po ml kao što je gore definisano. Pogodno ove smeše sadrže 10 do 1000 μg, npr., 10, 50, 100, 400, 800 ili 2. 500 μg po ml.

Dalje, smeše prema ovom pronalasku mogu sadržati 10 μg do 10. 000 µg eritropoetinskog proteina po ml, 10-200 mmol/1 sulfata, 10-50 mmol/1 fosfata, pH 6, 0-6, 5. Ova smeša takođe može sadržati do 20 mM metionina, 1-5% (tež. /zapr. ) poliola, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono do 1 mM CaCl2. Jedan primer ove smeše sadrži 10 fig do 10. 000 jig eritropoetinskog proteina po ml, 40 mmol/1 sulfata, 10 mmol/1 fosfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

U jednom daljem oličenju ovog pronalaska, smeša prema ovom pronalasku može sadržati 10 µg do 10. 000 µg eritropoetinskog proteina po ml, 10-100 mmol/1 NaCl, 1050 mmol/1 fosfata, pH 6, 0-7, 0, opciono 1-5% (tež. /zapr. ) poliola. Dalje, ova smeša može sadržati do 20 mM metionina, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono 7, 5 pmol/1 CaCl2. Specifično, ova smeša može sadržati 10 ^g do 10. 000 µg eritropoetinskog proteina po ml, 100 mmol/1 NaCl, 10 mM metionina, do 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i 10 mmol/1 fosfata, pH 7, 0.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na gornju smešu koja sadrži 10 ^ig do 10. 000 µg eritropoetinskog proteina po ml, 10-50 mmol/1 arginina, pH 6 do pH 6, 5, 10-100 mmol/1 natrijum-sulfata. Pored toga, ova smeša može sadržati do 20 mM metionina, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68, opciono do 1 mmol/1 CaCl2 i opciono 1-5% (tež. /zapr. ) poliola. Specifično, ova smeša može sadržati 10 ng do 10. 000 µg eritropoetinskog proteina po ml, 40 mmol/1 arginina, pH 6, 2, 30 mmol/1 natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono 1 mmol/1 CaCl2.

Jedno pogodno oličenje ovog pronalaska se odnosi na smešu koja sadrži 10 do 10. 000 µg/ml eritropoetina, pogodno 25 do 2. 500 pg/ml eritropoetina i

a) 10 mM natrijum/kalijum-fosfata, 100 mM NaCl, pH 7, 0 ili

b) 10 mM natrijum-fosfata, 120 mM natrijum-sulfata, pH 6, 2 ili

c) 10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, pH 6, 2 ili

d) 10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2 ili

e) 40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, pH 6, 2 ili

f) 40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

U najpogodnijem oličenju, ove smeše sadrže količinu eritropoetinskog proteina od 50, 100, 400, 800 i 2. 500 pg/ml. Najpogodnije smeše sadrže ili 10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2 ili 40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

Smeše ovog pronalaska mogu biti u obliku sprejom osušenog praška.

Dalje se ovaj pronalazak odnosi na smešu koja je liofilizat ili sprejom osušen prašak smeša kao što je gore opisano. Ova smeša može biti rekonstituisana tako da formira tečni rastvor dodavanjem rastvarača, npr., vode, ili može biti aplicirana (primenjena) direktno, npr., pomoću uređaja za inhalaciju ili uređaja za transdermalnu aplikaciju (primenu).

Ovaj pronalazak takođe obuhvata postupak za proizvodnju smeše kao što je gore opisana koji obuhvata mešanje eritropoetinskog proteina sa rastvorom koji sadrži višestruko negativno naelektrisan anjon i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata kao što su gore definisani.

Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na primenu smeše kao što je gore opisana za proizvodnju lekova prikladnih za terapiju i sprečavanje bolesti koje su u uzajamnoj vezi (korelaciji) sa anemijom kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom (CRF), zatim kod pacijenata sa AIDS-om (sidom ) i/ili za terapiju pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti hemoterapiji. Ovo uključuje postupak za terapiju i sprečavanje bolesti koje obuhvataju anemiju kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom (CRF), AIDS-om (sidom) i kod pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti hemoterapiji. Ovaj postupak obuhvata stupanj davanja nekom pacijentu smeše kao što je gore definisana.

Dalje oličenje ovog pronalaska se odnosi na uređaje za- lokalno i sistemsko kontinuirano (neprekidno) oslobađanje koji sadrži smešu kao što je gore definisana. Ovo može biti bilo koja vrsta implantata koji obezbeđuje kontrolisano oslobađanje eritropoetina koji sadrži gore opisanu smešu, kao, npr., mikro- ili nanodeliće na bazi polimera. Gore opisana smeša takođe može biti data kao prethodno napunjen špric za ubrizgavanje injekcija ili u bilo kojem drugom uređaju za aplikaciju kao što je, npr., uređaj za ubrizgavanje injekcija bez igle ili uređaj za inhalaciju.

Smeša ovog pronalaska može biti prisutna kao jedinična doza za davanje pomoću injekcije ili za intravensko davanje. S druge strane, smeša ovog pronalaska može se skladištiti u tečnim ili čvrstim oblicima i potom deliti u jedinične oblike doziranja za intravensko davanje ili za davanje ubrizgavanjem pomoću injekcije. Otuda tečna smeša ovog pronalaska može biti prisutna u količinama tako malim kao što je 0, 3 ml za primenu u obliku jednostrukog oblika doziranja za davanje. S druge strane, zapremina ove zahtevane smeše može biti toliko velika kao 60 litara kada se skladišti pre raspodele u pakovanim oblicima doziranja. Sa aspekta njene pojačane stabilnosti, smeša ovog pronalaska može se skladištiti u velikim kontejnerima tako da se kasnije sipa u sredstvo za pakovanje koje je pogodno za distribuciju do lekara, pacijenata i bolnica.

Rastvor koji se može ubrizgati injekcijom dat ovim pronalaskom može se davati pomoću takvog uobičajenog sredstva za injekcije kao što su špricevi za ubrizgavanje injekcija koji uopšte omogućuju davanje od 0, 3 ml do 20 ml ove smeše kao jednostruke jedinične doze. S druge strane, smeša ovog pronalaska može se davati pomoću injekcije uz primenu ampula koje sadrže ovu smešu u obliku liofilizata ili sprejom osušenog praška koji se zatim rekonstituiše na uobičajen način pre davanja injekcije. S druge strane, kao posledica stabilnosti smeša ovog pronalaska, smeše se mogu deliti u jedinične oblike doziranja kao što su fiole koje sadrže od oko 0, 3 ml do oko 10 ml ove smeše. Pored toga, smeše ovog pronalaska mogu se davati intravenski uz primenu intravenskih kesica. Ove kesice sadrže od oko 20 ml do oko 500 ml rastvora u zavisnosti od perioda vremena u kojem treba davati ovaj rastvor pacijentu. Prema ovom pronalasku, tečni rastvori ovog pronalaska se mogu skladištiti u kontejnerima za skladištenje iz kojih se ovi dalje mogu odvajati u mala pakovanja dozirajućih oblika pogodnih za distribuciju lekarima, bolnicama i pacijentima. Zahvaljujući stabilnosti smeša ovog pronalaska, ove smeše se mogu skladištiti u takvim kontejnerima za skladištenje u toku dužih perioda vremena pre davanja.

Dobivanje eritropoetina kao sastojka za gore opisane smeše ili kao polazne tačke za dobivanje eritropoetinskih derivata kao što je gore opisano, detaljno se opisuje napr., u SAD patentima br. 5. 547. 933 i 5. 621. 080, EP-B 0 148 605, u referenci S. L. Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 i EP-B 0 411 678 kao i u referencama P. H. Lai et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, H. Sasaki et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. Eritropoetin za terapeutske primene se može proizvesti pomoću rekombinantnog načina (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 i referenca J. C. Egrie, T. W. Strickland, J. Lane et al., Immunobiol. 72 (1986) 213-224).

Postupci za ekspresiju i dobivanje eritropoetina u sredini bez seruma su opisani, na primer, u WO 96/35718, koji je pripisan Burgu i publikovan 14. novembra 1996 i u evropskoj patentnoj publikaciji br. 513. 738, koja je pripisana Kochu i publikovana 12. juna 1992. Pored gore pomenutih publikacija, poznato je da se može vršiti bezserumska fermentacija rekombinantnih CHO ćelija koje sadrže EPO gen. Takvi postupci su opisani, na primer, u EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 i u opštem obliku u referencama T. Kawamoto et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, J. Kowar and F. Franek, Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, B. Bavister, Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0481791, EP-A 0307247, EP-A 0343635, WO 88/00967.

U EP-A 0267678 su opisani jonoizmenjivačka hromatografija na S-sefarozi, preparativna HPLC sa reverznom fazom na C8 koloni i gelna hromatografija sa filtriranjem za prečišćavanje EPO koji je proizveden u kulturi bez seruma posle dijalize. U vezi sa ovim stupanj hromatografije sa gelnim filtriranjem se može zameniti jonoizmenjivačkom hromatografijom na S-sefarozi sa brzim protokom. Takođe se predlaže da se pre jonoizmenjivačke hromatografije vrši bojena hromatografija na koloni sa plavim trisakrilom.

Postupak za prečišćavanje rekombinantnih EPO je opisan u referenci I. Nobuo et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. U ovom postupku EPO se, međutim, tretira sa rastvorom Tweena® 20, fenilmetilsulfonil-fluorida, etilmaleinimida, pepstatina A, bakar-sulfata i oksaminske kiseline pre stupnjeva prečišćavanja. Neke publikacije, uključujući WO 96/35718, koja je pripisana Burgu i publikovana 14. novembra 1996, otkrivaju postupak za proizvodnju (dobivanje) eritropoetina u postupku fermentacije bez seruma (EPOsf).

Specifična aktivnost EPO ili EPO konjugata prema ovom pronalasku može se odrediti pomoću različitih proba koje su poznate u ovoj oblasti tehnike. Biološke aktivnosti prečišćenih EPO proteina datih ovim pronalaskom su takve da davanje ovih EPO proteina injekcijom humanim pacijentima rezultuje u povećanju proizvodnje retikulocita i crvenih krvnih ćelija pod dejstvom ćelija koštane srži u poređenju sa pacijentima koji nisu dobili injekcije ili sa kontrolnim grupama ovih subjekata. Biološka aktivnost ovih EPO proteina ili njihovih fragmenata, koji su dobiveni i prečišćeni prema ovom pronalasku može se testirati pomoću postupaka iz referenci Annable et al., Buli. Wld. Hlth. Org. 47 (1972) 99-112 i Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2). Druga biološka proba za određivanje aktivnosti EPO proteina, takozvana proba sa normocitemičnim mišem je opisana u primeru 6.

Ovaj pronalazak će se bolje razumeti ukazivanjem na sledeće primere koji ilustruju ovde opisan pronalazak ali ni u kojem slučaju ne ograničavaju njegov opseg.

PRIMERI

PRIMER 1

Fermentacija i prečišćavanje humanog EPO

a) Dobivanje i fermentacija inokulisane materije

Jedna fiola Working Cell Bank (banke za proizvodnju ćelija) koja potiče iz CHO ćelijskog niza (može se upotrebiti ATCC CRL8695, koji je otkriven u EP 411. 678 (Genetics Institute)) koja proizvodi EPO je uzeta iz gasne faze rezervoara za skladištenje sa tečnim azotom.

Ćelije su prenete u staklene kivete (bočice) za obrtanje i gajene (kultivisane) u sredini koja je puferisana sa bikarbonatom u vlažnom inkubatoru sa C02. Tipične sredine bez seruma koje se primenjuju za dobivanje i fermentaciju inokulisane materije su otkrivene u evropskoj patentnoj prijavi 513. 738, prenetoj Kochu i publikovanoj 12. juna 1992. godine ili W0 96/35718, prenetoj Burgu i publikovanoj 14. novembra 1996. godine, na primer, kao sredinu sadrže DMEM/F12 (npr., JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, SAD, narudžbenica br. 57-736) i dodatno natrijum-bikarbonat, L(+)-glutamin, D(+)-glukozu, rekombinantni insulin, natrijum-selenit, diaminobutan, hidrokortizon, gvoždje(II)-sulfat, asparagin, asparagin-sku kiselinu, serin i stabilizator za ćelije sisara kao što je, npr., polivinilalkohol, metilceluloza, polidekstran, poli(etilen-glikol), pluronik F68, ekspander (širilac) plazme poligelin (HEMACCEL®) ili polivinilpirolidon (W0 96/35718).

Kulture su mikroskopski kontrolisane na odsustvo kontaminirajućih mikroorganizama i određene su gustine ćelija. Ovi testovi su izvršeni pri svakom stupnju cepanja (delenja).

Posle početnog perioda razvoja, ćelijska kultura je razblažena sa svežom sredinom do početne ćelijske gustine i podvrgnuta drugom ciklusu razvoja. Ovaj postupak je ponavljan dok nije dobivena zapremina kulture od približno 2 1 po staklenoj kiveti (bočici) za obrtanje. Posle približno 12 dupliranja raspoloživo je 1 do 5 litara ove kulture koja je zatim primenjena kao inokulisana materija za posudu za fermentaciju inokulisane materije od 10 1.

Posle 3-5 dana, kultura u posudi za fermentaciju zapremine 10 1 može se primeniti kao inokulisana materija za posudu za fermentaciju inokulisane materije od 100 1.

Posle dodatnih 3-5 dana kultivisanja, kultura u posudi za fermentaciju zapremine 100 1 može se primeniti kao inokulisana materija za posudu za fermentaciju inokulisane materije od 1000 1.

b) Žetva i odvajanje ćelija

Primenjen je postupak ponovnog punjenja šaržom, tj., kada se dostigne željena ćelijska gustina, ubire se približno 80% kulture. Preostala kultura se ponovo dopuni sa svežom sredinom za kulturu i kultiviše do sledeće žetve (ubiranja). Jedan ciklus proizvodnje se sastoji od maksimalno 10 sukcesivnih žetvi: 9 parcijalnih žetvi i 1 celokupne žetve na kraju fermentacije. Žetva (ubiranje) se vrši svaka 3-4 dana.

Određena ubrana (požnjevena) zapremina se prenese u ohlađen sud. Ćelije se uklanjaju centrifugiranjem ili filtriranjem i odbacuju. Gornji bistri sloj tećnosti (iznad taloga) dobiven u stupnju centrifugiranja koji sadrži EPO filtrira se u nizu i sakuplja u drugom ohlađenom sudu. Svaka žetva (ubiranje) se vrši odvojeno u toku prečišćavanja.

Tipičan postupak za prečišćavanje EPO-proteina je objavljen u WO 96/35718, koja je preneta Burgu i publikovana 14. novembra 1996. godine. Ovaj postupak prečišćavanja se objašnjava na sledeći način: a) Hromatografii a sa plavom sefarozom

Plava sefaroza (Pharmacia) se sastoji od zrna sefaroze na čijoj površini je kovalentno vezana boja cibacron plavo. Kako se EPO jače vezuje za plavu sefarozu od najvećeg dela neproteinastih kontaminanata (zagađivača), u ovom stupnju se mogu obogatiti neke proteinaste nečistoće i PVA, EPO. Eluiranje kolone sa plavom sefarozom se vrši povećavanjem koncentracije soli kao i pH.

Kolona se puni sa 80-100 1 plave sefaroze, regeneriše sa NaOH i ekvilibriše (uravnotežava) sa puferom za uravnotežavanje (natrijum/kalcijum-hlorid i natrijum-acetat). Puni se zakiseljen i filtriran gornji bistri sloj izazivača fermentacije. Posle kompletiranja punjenja, kolona se ispira prvo sa puferom sličnim puferu za uravnotežavanje koji sadrži višu koncentraciju natrijum-hlorida i posle toga sa tris-baznim puferom. Proizvod se eluira sa tris-baznim puferom i sakuplja u jednoj frakciji prema matičnom profilu eluiranja.

b) Hromatografija sa butil-toyopearlom

Butil-toyopearl 650 C (foso Haas) je matrica na bazi polistirena na koju su kovalentno kuplovani alifatični butil-ostaci. Kako se EPO jače vezuje za ovaj gel od najvećeg dela nečistoća i PVA, ovaj se mora eluirati sa puferom koji sadrži izopropanol.

Kolona se pakuje sa 30-40 1 butil-toyopearla 650 C, regeneriše sa NaOH, ispira sa tris-baznim puferom i ekvilibriše (uravnotežava) sa tris-baznim puferom koji sadrži izopropanol.

Eluat sa plave sefaroze se podešava na koncentraciju izopropancia u puferu za uravnotežavanje kolone i puni na kolonu. Zatim se kolona ispira sa puferom za uravnotežavanje sa povećanom koncentracijom izopropanola. Proizvod se eluira sa puferom za eluiranje (tris-baznim puferom sa visokim sadržajem izopropanola) i sakuplja u jednoj frakciji prema matičnom profilu eluiranja.

c) Hromatografija sa hidroksiapatitnim ultrogelom

Hidroksiapatitni ultrogel (Biosepra) se sastoji od hidroksiapatita koji je inkorporiran u agaroznoj matrici da se poboljšaju mehaničke osobine. EPO ima mali afinitet prema hidroksiapatitu i otuda se može eluirati pri nižim fosfatnim koncentracijama nego proteinske nečistoće.

Kolona se puni sa 30-40 1 hidroksiapatitnog ultrogela i regeneriše sa puferom kalijum-fosfat/kalcijum-hlorid i NaOH a zatim sa tris-baznim puferom. Zatim se uravnotežava sa tris-baznim puferom koji sadrži malu količinu izopropanola i natrijum-hlorid.

Eluat iz hromatografije sa butil-toyopearlom koji sadrži EPO puni se na kolonu. Zatim se kolona ispira sa puferom za uravnotežavanje i tris-baznim puferom bez izopropanola i natrijum-hlorida. Proizvod se eluira sa tris-baznim puferom koji sadrži malu koncentraciju kalijum-fosfata i sakuplja u jednoj frakciji prema matičnom profilu eluiranja.

d) HPLC sa reverznom fazom na Vydac-u C4

RP-HPLC materijal Vydac C4 (Vydac) se sastoji od delića silikagela čija površina nosi C4-alkil-lance.

Odvajanje EPO od proteinastih nečistoća se bazira na razlici u jačini hidrofobnih interakcija. Eluiranje se vrši sa gradijentom acetonitrila u razblaženoj trifluor-sirćetnoj kiselini.

Preparativna HPLC se vrši uz primenu kolone od nerđajućeg čelika (koja je punjena sa 2, 8-3, 2 litra Vydac C4 silikagela). Eluat hromatografije sa hidroksiapatitnim ultrogelom se zakiseli dodavanjem trifluorsirćetne kiseline i puni na kolonu Vydac C4. Za ispiranje i eluiranje se upotrebljava gradijent acetonitrila u razblaženoj trifluorsirćetnoj kiselini. Frakcije se skupljaju i odmah neutrališu fosfatnim puferom.

Sjedinjene su EPO frakcije koje su unutar IPC granica.

e) Hromatografija sa DEAE sefarozom

Materijal DEAE sefaroza (Pharmacia) se sastoji od dietilaminoetil (DEAE)-grupa koje su kovalentno vezane za površinu zrna sefaroze. Vezivanje EPO za DEAE grupe je postignuto posredovanjem jonskih interakcija. Acetonitril i trifluorsirćetna kiselina prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Pošto su ove supstance isprane, nečistoće u tragovima su uklonjene ispiranjem kolone sa acetatnim puferom pri niskom pH. Zatim je kolona ispirana neutralnim fosfatnim puferom i EPO je eluiran puferom sa povećanom jonskom jačinom.

Kolona je pakovana sa DEAE sefarozom brzog protoka. Zapremina kolone se podešava da se osigura EPO punjenje u opsegu od 3-10 mg EPO/ml gela. Kolona se ispira vodom i puferom za uravnotežavanje (natrijum/kalijum-fosfatom). Sjedinjenne frakcije HPLC eluata su punjene na kolonu i ova se ispira puferom za uravnotežavanje,. Zatim se kolona ispira puferom za ispiranje (natrijumacetatnim puferom) čemu sledi ispiranje puferom za uravnotežavanje. Nakon toga se EPO eluira iz kolone sa puferom za eluiranje (natrijum-hloridom, natrij um/kalijum-fosfatom) i sakuplja u jednoj frakciji prema matičnom profilu eluiranj a.

Eluat iz kolone sa DEAE sefarozom se podešava na specifičnu provodijivost. Dobivena lekovita supstanca se sterilno filtrira u teflonske bočice i skladišti na -70°C.

PRIMER 2

Pegilovanje EPO sa mPEG-SBA

EPO koji je prečišćen prema postupku bez seruma iz primera 1 (EPOsf) je bio homogen kao što je određeno pomoću analitičkih metoda i pokazivao je tipični izoformski model koji se sastoji od 8 izooblika. On je imao specifičnu biološku aktivnost od 190. 000 IU/mg kao što je to određeno pomoću probe sa normocitemičnim mišem. Upotrebljen reagens za pegilovanje je bio metoksi-PEG-SBA, koji je jedinjenje formule II u kojoj R označava metil, x je 3 i m je od 650 do 750 (u prošeku oko 680, što odgovara srednjoj molekulskoj težini od oko 30 kDa).

Reakcija pegilovanja

U 100 mg EPOsf (9, 71 ml skladišnog rastvora EPOsf, koncentracije 10, 3 mg/ml, ukupno 5, 48 pmol) dodato je 10 ml 0, 1 M kalijum-fosfatnog pufera, pH 7, 5, koji sadrži 506 mg 30 kDa metoksi-PEG-SBA (16, 5 fimol) (koji je dobiven od firme Shearvvater Polymers, Ine., Huntsville, Alabama, SAD) i mešano 2 sata na sobnoj temperaturi (20-23°C). Finalna koncentracija proteina je bila 5 mg/ml i

odnos protein: PEG reagens je bio 1: 3. Posle 2 sata je reakcija zaustavljena podešavanjem pH vrednosti na 4, 5 pomoću glacijalne sirćetne kiseline i reakciona smeša je skladištena na -20°C dok ne bude spremna za prečišćavanje

Prečišćavanje

1. Smeša konjugata: Približno 28 ml SP-sefaroze FF (sulfo-propil katjonske izmenjivačke smole) je pakovano u staklenu kolonu AMICON (dimenzija 2, 2 x 7, 5 cm) i uravnoteženo sa 20 mM acetatnim puferom pH 4, 5 pri brzini protoka od 150 ml/h. 6 mi reakcione smeše koji sadrže 30 mg proteina je 5 puta razblaženo sa puferom za uravnotežavanje i naneto (aplicirano) na ovu kolonu. Neadsorbovani materijali su isprani sa puferom i odbačeni a adsorbovana smeša PEG konjugata je eluirana iz kolone sa 0, 175 M NaCl u puferu za uravnotežavanje. Nemodifikovan EPOsf koji je još ostao na koloni je eluiran sa 750 mM NaCl. Kolona je ponovo uravnotežena u polaznom puferu. Uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE i određen je njihov stepen pegilova-nja. Nađeno je da je eluat sa 0, 175 M NaCl sadržao mono- i di-pegilovane vrste kao i količine u tragovima tri-pegilovanih v’-sta, dok je eluat sa 750 mM NaCl sadržao nemodifikovan EPOsf.

2. Di-PEG i mono-PEG-EPOsf: Prečišćena smeša konjugata koja je eluirana iz kolone u prethodnom stupnju razblažena je 4 puta sa puferom i ponovo aplicirana (naneta) na kolonu i potom ispirana kao što je opisano. Di-PEG-EPOsf i mono-PEG-EPOsf su odvojeno

eluirani iz ove kolone sa 0, IM NaCl odnosno 0, 175 M NaCl. Eluiranje je takođe izvršeno sa 750 mM NaCl da se eluira bilo koji preostali nemodifikovan EPOsf.

Alternativno tome, reakciona smeša je razblažena 5 puta sa acetatnim puferom i aplicirana (naneta) na kolonu sa SP-sefarozom (~0, 5 mg proteina/ml gela). Kolona je ispirana i kao što je opisano u prethodnom odeljku eluirani su adsorbovani mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf i nemodifikovan EPOsf.

Rezultati

PEG-EPOsf je sintetizovan hemijskim konjugovanjem linearnog PEG molekula sa brojem srednje molekulske težine od 30 kDa. PEG-EPOsf je izveden iz reakcije između primarnih amino-grupa EPOsf i derivata sukcinimidil-estra 30 kDa PEG-buterne kiseline pri čemu je dobivena amidna veza.

Dobiveni rezultati su sumirani u Tabeli 1. Prečišćena smeša konjugata se sastojala od mono- i di-PEG-EPOsf i nije sadržala nemodifikovan EPOsf kao što je to određeno pomoću SDS-PAGE analize. Izračunato je da smeša konjugata sadrži 23, 4 mg ili 78% od polaznog materijala. Odvajanje pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije mono- i di-PEG-EPOsf je pokazalo da je odnos mono- prema di-PEG u smeši konjugata bio skoro 1: 1. Posle završetka ove reakcije, odnos pojedinačnih komponenata

mono: di: nemodifikovan je bio 40: 38: 20 (%). Ukupni prinos je bio skoro kvantitativan.

TABELA 1: Zbir rezultata pegilovanja EPOsf

PRIMER 3

Pegilovanje EPO sa mPEG-SPA

Jedan različit alikvot EPOsf koji je upotrebljen u rrimeru 2 reagovan je sa 30 kDa metoksi-SPA (Shearv/ater Polymers, Ine., Huntsville, Alabama, SAD). Reakcija je izvršena pri odnosu protein: reagens = 1: 2 i tehnike prečišćavanja su bile prema primeru 2. Primarno je proizvedena mono-pegilovana vrsta.

PRIMER 4

Kovalentno vezivanje tiolnih grupa za EPO

Ovaj primer otkriva određivanje reakcionih uslova za kovalentno vezivanje tiolnih grupa za EPO. Da se odrede ovi uslovi, dodate su različite količine reagensa koji sadrži blokiranu tiolnu grupu, ovde SATA ili SATP (koje su rastvorene u DMSO do 10 mg/ml) u rastvor EPO, ovde u 1 ml 5 mg/ml EPO u 10 mM kalijum-fosfata, 50 mM NaCl, pH 7, 3. Reakciona smeša je mešana oko 30 minuta (25°C) i reakcija je zaustavljena dodavanjem 1 M rastvora lizina pri 10 mM. Višak količina SATA i SATP je uklonjen dijalizom nasuprot 10 mM kalijum-fosfata, 50 mM NaCl i 2 mM EDTA, pH 6, 2. Posle uklanjanja zaštitne acetil-grupe sa hidroksilaminom, broj tiolnih grupa koje su kovalentno

vezane za EPO je određen fotometrijski sa ditiodipiridinom prema metodi koju su opisali D. R. Grasetti i J. F. Murray, u J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49.

Dole je prikazan broj kovalentno vezanih tiolnih grupa po jednom molekulu EPO.

PRIMER 5

Modifikacija aktiviranog EPO sa metoksi-PEG-maleinimidom

A) Aktiviranje EPO

100 mg EPO koji je proizveden prema primeru 1 (190. 000 IU/mg kao što je to određeno pomoću probe sa norocitemičnim mišem) je aktivirano sa SATA (molarni odnos: EPO/SATA = 1/5) prema primeru 2. Dobiveni EPO "aktiviran EPO") koji nosi kovalentno vezane blokirane tiolne grupe je odvojen od sporednih proizvoda kao što su N-hidroksi-sukcinimid ili nereagovan SATA pomoću dijalize kao što je opisano u primeru 1. Dobiven je rastvor od 4, 5 mg/ml aktiviranog EPO u 10 mM kalijum-fosfata, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6, 2.

B) Pegilovanje aktiviranog EPO

380 mg metoksi-PEG-maleinimida koji ima gore ilustrovanu "najpogodniju" strukturu (MT 30. 000; Shearvvater Polymers, Ine., Huntsville, Alabama, SAD) je rastvoreno u gornjem rastvoru koji sadrži 95 mg aktiviranog EPO (4, 5 mg/ml u 10 mM kalijum-fosfata, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6, 2). Dobiveni molarni odnos između aktiviranog EPO i metoksi-PEG-maleinimida u ovom rastvoru je bio 1: 4. Dodavanjem 1 M vodenog rastvora hidroksil-amina do 30 mM, pH 6, 2 u gornji rastvor, deblokirane su kovalentno vezane blokirane tiolne grupe aktiviranog EPO. Dobiveni aktivirani EPO u reakcionoj smeši ovog rastvora je sadržao slobodne tiolne (-SH) grupe. Deblokiranje ovih tiolnih (-SH) grupe je odmah praćeno reakcijom kuplovanja između aktiviranog EPO koji sada sadrži slobodne tiolne (-SH) grupe i metoksi-PEG-maleinimida u toku 90 minuta (mešanje, 25°C). Reakcija kuplovanja je zaustavljena dodavanjem 0, 2 M vodenog rastvora cisteina do 2 mM u reakcionu smešu. Posle 30 minuta je višak slobodnih tiolnih grupa aktiviranog EPO koji nije reagovao sa metoksi-PEG-maleinimidom blokiran dodavanjem 0, 5 M rastvora N-metilmaleinimida u DMSO da se postigne koncentracija od 5 mM. Posle 30 minuta, dobivena reakciona smeša koja sada sadrži pegilovane EPO vrste je dijalizirana nasuprot 10 mM kalijum-fosfata, pH 7, 5 u toku >15 sati.

C) Prečišćavanje pegilovanih EPO vrsta

Za odvajanje pegilovanih EPO vrsta iz reakcione smeše je izvršen sledeći postupak prečišćavanja: Kolona sa- 50 ml Q-sefaroze ff je uravnotežena sa 10 mM kalijum-fosfatom, pH 7, 5. Reakciona smeša koja je dobivena u B) je punjena na ovu kolonu (brzina protoka: 3 zapremine kolone (ZK) na sat). U cilju odvajanja neproregovanog -reagensa metoksi-PEG-maleinimida kolona je ispirana sa 5 ZK 10 mM kalijum-fosfata, pH 7, 5. Pegilovane EPO vrste su odvojene eluiranjem sa povećavajučim gradijentom soli koji se sastoji od 5 ZK pufera A (10 mM kalijum-fosfata, pH 7, 5) i 5 ZK pufera B (10 mM kalijum-fosfata, 500 mM NaCl, pH 7, 5) sa brzinom protoka od 3 ZK na sat. Na bazi NaCl gradijenta, pegilovane EPO vrste (tri-, bi- i mono-pegilovane EPO vrste) su prve eluirane a sledile su ih nepegilovane EPO vrste. Frakcije ovog eluata koje sadrže pegilovane EPO vrste (tri-, bi- i mono-pegilovane EPO vrste) su sjedinjene i filtrirane (sterilno filtriranje sa filtrom od 0, 2 µm).

Sadržaj i čistoća tri-, bi- i mono-pegilovanih EPO vrsta su procenjeni na Coomassie-obojenim SDS-PAA gelovima (Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685) dok su koncentracije proteina merene pri 280 nm prema Beer-Lambertovom zakonu. Prividne molekulske težine EPO vrsta koje su određene SAD-PAA elektroforezom su bile oko 68 kDa (mono-pegilovana EPO vrsta), oko 98 kDa (di-pegilovana EPO vrsta) i oko 128 kDa (tri-pegilovana EPO vrsta).

Dalje odvajanje ovih tri-, di- i mono-pegilovanih EPO vrsta se može postići hromatografijom, npr., hromatografijom sa isključenjem po veličini (Superdex, pg 200, Pharmacia). Određivanje in vivo biološke aktivnosti eluata koji sadrže tri-, di- i mono-pegilovane EPO vrste je izvršeno pomoću dole opisanog postupka.

PRIMER 6

In vivo biološka aktivnost pegilovanog 2P0 određena pomoću probe sa normocitemičnim mišem

Biološka proba sa normocitemičnim mišem je poznata u ovoj oblasti nauke i tehnike {Pharm. Europa Spec. Issue Erytropoietin BRP Bio 1997(2)) i prema jednoj metodi u monografiji o eritropoetinu iz Ph. Eur. BRP. Uzorci su razblaženi sa BSA-PBS. Normalno zdravim miševima, starim 7-15 nedelja, je dato s. c. 0, 2 ml EPO-frakcije koja sadrži nepegilovan EPO ili tri-, di- i mono-pegilovan EPO iz primera 2 ili 3. U toku perioda od 6 dana, krv je izvučena punkcijom repne vene i tako razblažena da je 1 pil krvi bio prisutan u 1 ml 0, 15 j-imol rastvora za bojenje sa akridin-oranžom. Vreme bojenja je bilo 3-10 minuta. Brojanja retikulocita su izvršena mikrofluorometrijski u protočnom citometru pomoću analize histograma sa crvenom fluorescencijom. Brojanja retikulocita su data u termovima apsolutnih brojeva (na 30. 000 analiziranih krvnih ćelija). Za date vrednosti, svaka grupa se sastojala od 5 miševa na dan i ovi miševi su iskrvarili samo jedanput.

U odvojenim eksperimentima, miševima su dati jednostruka doza nemodifikovanog EPO (25 ng EPO), smeša PEG(SBA)-EPO iz primera 2 (10 ng konjugata), mono- i di-pegilovani EPO iz primera 2 (10 ng konjugata), PEG(SPA)-EPO iz primera 3 (10 ng konjugata) i puferski rastvor. Dobiveni rezultati su prikazani na Tabeli 2. Ovi rezultati pokazuju bolju aktivnost i produžen poluživot pegilovanih EPO vrsta što je pokazano znatno povećanim količinama retikulocita i pomeranjem maksimuma broja retikulocita uz primenu iste doze po jednom mišu (10 ng) u poređenju sa dozom od 25 ng za nemodifikovan EPO.

TABELA 2

PRIMER 7

Dobivanje preovle lujućeg mono-PEG-EPO

Reakcija pegilovanja

Polazeći od 100 mg (5, 48 |imol) EPOsf u 100 mM kalijum-fosfatnog pufera, pH 7, 5, koji je dobiven prema primeru 1, dodato je 339 mg (10, 96 μmol) rsagensa 30 kDa PEG-SBA koji je rastvoren u 3 ml lmM HC1. Dodato je dovoljno 100 mM kalijum-fosfatnog pufera, pH 7, 5, da se zapremina reakcione smeše dovede do 20 ml. Krajnja koncentracija proteina je bila 5 mg/ml i odnos protein: PEG reagens je bio 1: 2. Reakciona smeša je mešana 2 sata na temperaturi okoline (20-22°C). Posle 2 sata je reakcija zaustavljena podešavanjem pH vrednosti na 4, 5 pomoću glacijalne sirćetne kiseline i reakciona smeša je skladištena zamrznuta na -20°C dok ne bude spremna za prečišćavanj e.

Prečišćavanje

Reakciona smeša iz prethodnog stupnja je razblažena u odnosu 1: 5 sa 10 mM natrijum-acetatom, pH 4, 5 i aplicirana (naneta) na 300 ml SP-sefaroze FF (sulfopropil katjonske izmenjivačke smole) koja je pakovana u kolonu sa dimenzijama od 4, 2 x 19 cm. Ova kolona je prethodno uravnotežena sa istim puferom. Efluenti (tečnosti koje ističu) iz kolone su kontrolisani (mereni) pri 280 nm pomoću Gilsonovog UV monitora i registrovani pomoću rekordera Kipp-a i Zonen-a. Kolona je ispirana sa 300 ml ili jednom zapreminom (sloja kolone) pufera za uravnoteženje da se uklone višak reagenasa, sporedni proizvodi reakcije i oligomerni PEG-EPO. Ovome je sledilo ispiranje sa 2 zapremine (sloja kolone) 100 mM NaCl da se ukloni di-PEG-EPO. Mono-PEG-EPO je zatim eluiran sa 200 mM NaCl. U toku eluiranja mono-PEG-EPO, odbačeno je prvih 50 ml proteinskog pika i mono-PEG-EPO je sakupljen kao frakcija od 150 ml. Nemodifikovan EPOsf koji je preostao na koloni je eluiran sa 750 mM NaCl. Svi puferi za eluiranje su napravljeni u puferu za uravnotežavanje. Svi eluirani uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE i pomoću hromatografije sa isključenjem po veličini sa visokim performansama (SEC). Sjedinjen pul mono-PEG-EPO, koji je dobiven iz frakcije od 150 ml, koji nije sadržao nemodifikovan EPOsf koji se može detektovati, zatim je koncentrovan do ~4, 5-7, 5 mg/ml i dija-filtriran u pufer za skladištenje, 10 mM kalijum-fosfat, 100 mM NaCl, pH 7, 5. Koncentrovanje/dija-filtriranje je izvršeno sa sistemom Millipore Labscale™ TFF koji je podešen sa granicom propuštanja od 50 kDa membrane Millipore Pellicon XL Biomax 50 pri temperaturi okoline. Koncentrovan mono-PEG-EPO je sterilno filtriran i skladišten zamrznut na -20°C.

Pegilovano je približno 75% EPOsf. Posle prečišćavanja je ukupni prinos bio -30% mono-PEG-EPO sa količinom nemodifikovanog EPOsf koja se ne može detektovati i oko 25% di-PEG-EPO. Oligomeri i nepegilovan EPOsf su obračunati kao preostali protein. Sjedinjen pul mono-PEG-EPO koji je dobiven iz frakcije od 150 ml sadržao je približno 90% mono-PEG-EPO i približno 10% di-PEG-EPO.

PRIMER 8

Termostabilnost EPO i pegilovanog EPO u različitim formulacijama: analiza pomoću DSC (diferencijalne skenirajuće kalorimetrije)

Opšte je prihvaćeno da prelazna temperatura termičke denaturacije koja je izmerena diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom predstavlja validni indikator za termostabilnost proteina. Rastvori eritropoetina ili pegilovanog eritropoetina sa koncentracijama između 0, 6 i 1, 2 mg/ml su analizirani u različitim puferima sa ili tez stabilizatora pomoću Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corporation, Utah, SAD) pri brzini zagrevanja od 2 K/min. Povišenje prelazne temperature pokazuje povećanje termičke stabilnosti ovog proteina. Izmerene vrednosti temperature se ne mogu podrazumevati kao apsolutne vrednosti već pre predstavljaju razlike u stabilnosti pojedinačnih formulacija relativno jedna prema drugoj.

U cilju definisanja optimalne pH vrednosti ove formulacije, proučavana je zavisnost pH od termičke denaturacije pegilovanog eritropoetina u opsegu pH između 4 i 9. Uzorci proteina su analizirani u 30 mM Na2HP04, 30 mM natrijum-citratu, 30 mM boratu. Slika 3 pokazuje plato maksimalne prelazne temperature između oko pH 6 do oko pH 9 i oštar pad ispod pH 5, 5. Ovo pokazuje da optimalna vrednost pH za maksimalnu termičku stabilnost leži iznad pH 5, 5 (Slika 3).

U cilju ispitivanja efekta jonske jačine, određena je zavisnost koncentracije fosfata od termičke denaturacije. Slika 4 pokazuje da se termička stabilnost povećava sa povećanjem jonske jačine ove formulacije.

Uticaj puferske supstance je takođe ispitivan pomoću DSC. Iz slike 5 se može videti da su najpogodniji puferi ili aditivi za visoku termičku stabilnost sulfat, citrat ili fosfat. Nađeno je da glicin koji je upotrebljen kao pufer u sada raspoloživim formulacijama (videti gore) nije vrlo pogodan.

Slika 6 pokazuje da je sulfat takođe pogodan pufer/aditiv pri niskom pH (npr., pH 6, 2), dok je fosfat manje pogodan pri pH 6, 2 u poređenju sa pH 7, 5. Ovo pokazuje da sulfat održava visoku toplotnu stabilnost čak i pri niskom pH. Ovaj nalaz dozvoljava formulaciju pri pH između 6, 0 i 6, 5, bez ozbiljnih gubitaka u toplotnoj stabilnosti eritropoetina.

PRIMER 9

Agregacija EPO i peg-EPO pod toplotnim udarom: analiza pomoću SDS-PAGE (elektroforeze sa natrijum-dodecil-sulfat-poliakrilamidnim gelom)

U cilju ispitivanja efekta toplotnog udara na eritropoetinski protein, uzorci u različitim formulacijama su izloženi toplotnom udaru (20 minuta na 80°C) i analizirani pomoću elektroforeze sa natrijum-dodecil-sulfat-poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) pod redukujućim (sa DTT u uzorku pufera) i neredukujučim (bez. DTT u uzorku pufera) uslovima. Ovaj postupak omogućava detekciju formiranja kovalentnog agregata. Kao što je gore izloženo, formiranje agregata je jedan od glavnih puteva degradacije proteina i otuda bi se trebalo sprečiti u farmaceutskim formulacijama proteina. Pod toplotnim udarom će se nekorektnim disulfidnim premošćavanjem i oksidacionom reakcijom sa velikom verovatnoćom formirati agregati koji se mogu detektovati u odsustvu redukcionog agensa (npr., DTT) i koji se ne mogu detektovati u prisustvu redukcionog agensa. Slika 5 pokazuje zavisnost pH od agregacije pod toplotnim udarom. Ovaj eksperiment jasno pokazuje da se formiranje agregata suzbija pri pH ispod 6, 5. Što je viši pH, to je veća količina agregacije. Najveći deo agregata koji se formiraju može se redukovati tretiranjem uzoraka sa redukcionim sredstvom u toku SDS-PAGE, što sugeriše da su veliki deo ovih agregata koji se formiraju pod toplotnim udarom ustvari disulfidom-premošćeni dimeri, oligomeri i agregati višeg reda. Uzeto zajedno, ovo pokazuje da se formiranje agregata može sprečiti do velikog stupnja održavanjem vrednosti pH formulacije pri ili ispod pH 6, 5.

Slika 7: Zavisnost peg-EPO agregacije od pH. Posle toplotnog udara (kao što je gore opisano) uzorci peg-EPO su analizirani pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojeni srebrom. Traka 1: standardna molekulska težina. Traka 2: pH 5. Traka 3: pH 5, redukovan. Traka 4: pH 6. Traka 5: pH 6, redukovan. Traka 6: pH 6, 5. Traka 7: pH 6, 5, redukovan. Traka 8: pH 7. Traka 9: pH 7, redukovan. Traka 10-: peg-EPO, nije bio pod toplotnim udarom.

Formiranje agregata se takođe može sprečiti primenom antioksidanasa. Slika 8 pokazuje da primena 1 mg/ml acetilcisteina kao antioksidansa sprečava formiranje agregata pod toplotnim udarom. Zbog toga je prikladno da se primeni neki antioksidans, kao npr., acetilcistein pri niskom pH, npr., pH 6, 2, da se spreči formiranje agregata pod toplotnim udarom.

Slika 6: Agregacija peg-EPO se može sprečiti pomoću pH 6, 2 i/ili acetilcisteinom. Posle toplotnog udara (kao što je gore opisano) uzorci peg-EPO su analizirani pomoću SDS-PAGE. Proteini su obojeni srebrom. Traka 1: peg-EPO, nije bio pod toplotnim udarom. Traka 2: pH 7, 5, bio pod toplotnim udarom. Traka 3: pH 6, 2, bio pod toplotnim.. udarom. Traka 4: pH 6, 2, bio pod toplotnim udarom, redukovan. Traka 5: pH 7, 5, 1 mg/ml acetilcisteina, bio pod toplotnim udarom. Traka 6: pH 7, 5, 1 mg/ml acetilcisteina, bio pod toplotnim udarom, redukovan.

PRIMER 9

Stabilnost peg-EPO u različitim formulacijama pri 4, 25, 30 i 40°C

Pegilovan EPO u različitim formulacijama je inkubiran pri različitim temperaturama. Pri označenim vremenskim tačkama su uzeti uzorci i stabilnost je procenjena pomoću tečne hromatografije sa visokim performansama sa reverznom fazom (rpHPLC), hromatografije sa visokim performansama uz isključenje po veličini (SEC) i elektroforeze sa natrijum-dodecil-sulfat-poliakril-amidnim gelom (SDS-PAGE). Tabela 3 poredi stabilnost peg-EPO u različitim formulacijama pri nekoliko temperatura. Ovi podaci jasno pokazuju superiornost ovde priloženih formulacija u pogledu povraćaja proteina i agregacije.

TABELA 3: Stabilnost peg-EPO u različitim formulacijama pri nekoliko temperatura

‘formulacije su:

formulacija A: 10 mM natrijum-fosfat, 100 mM natrijum-hlorid, pH 7, 5,

formulacija B: 10 mM natrijum-fosfat, 40 mM natrijum-sulfat, 3%-ni (tež. /zapr. ) manitol, pH 6, 2,

formulacija C: 10 mM natrijum-fosfat, 100 mM NaCl, pH 7, 0,

formulacija D: 10 mM natrijum-fosfat, 120 mM natrijum-sulfat, pH 6, 2,

formulacija E: 40 mM arginin, 30 mM natrijum-sulfat, 3%-ni (tež. /zapr. ) manitol, 1 mM CaCl2, pH 6, 2.

PRIMER 11

Cptimizovane formulacije suzbijaju oksidaciju metionina54 u EPO proteinu, metionin kao antioksidans

Pegilovan EPO u različitim formulacijama se inkubira pri nekoliko temperatura. Posle 6 meseci su uzeti uzorci i određen je stepen oksidacije metionina54 na sledeći način. Ukratko rečeno, EPO uzorci se tretiraju sa endo-proteinazom LysC. Rezultujući peptidi se odvoje pomoću hromatografije sa reverznom fazom. Izračuna se odnos oksidovanog peptida T8 (koji sadrži oksidovan metionin54) prema peptidu T8 (koji sadrži neoksidovan metionin54). Dobiveni podaci su sumirani na Tabeli 4.

TABELA 4: Stepen oksidacije EPO proteina u različitim formulacijama sa metioninom54 posle 6 meseci pri ukazanim temperaturama

‘formulacije su dole navedene:

formulacija A: 10 mM natrijum-fosfat, 100 mM natrijum-hlorid, pH 7, 0,

formulacija B: 10 mM natrijum-fosfat, 40 mM natrijum-sulfat, 3%-ni (tež. /zapr. ) manitol, pH 6, 2,

formulacija C: 10 mM natrijum-fosfat, 40 mM natrijum-

sulfat, 3%-ni (tež. /zapr. ) manitol, 1 mM metionin, pH 6, 2.

Ovi podaci jasno pokazuju da je pogodna formulacija ovog pronalaska (10 mM natrijum-fosfat, 40 mM natrijum-sulfat, 3%-ni (tež. /zapr. ) manitol, pH 6, 2) bolja od drugih formulacija, kao što je 10 mM natrijum-fosfat, 100 mM 'NaCl, pH 7, 0, u pogledu stepena oksidacije metionina54. Dodavanje 1 ili 10 mM metionina u ovu formulaciju očigledno suzbija oksidaciju metionina54. Otuda metionin deluje kao antioksidans i stabilizuje EPO.

PRIMER 12

Sadržaj sialne kiseline u uzorcima peg-EPO u različitim formulacijama

U cilju analiziranja integriteta ugljenohidratne strukture peg-EPO glikoproteina, uz primenu standardnih tehnika je analiziran sadržaj sialne kiseline u peg-EPO uzorcima u optimiziranim formulacijama posle skladištenja u toku 6 meseci pri različitim temperaturama. Ovi podaci pokazuju da na integritet ugljenohidratne strukture nije negativno uticalo skladištenje proteina u ovde opisanim novim formulacijama (Slika 9).

PRIMER 13

Bioaktivnost pegilovanog EPO posle skladištenja pri povišenoj temperaturi u toku produženih vremenskih perioda

U cilju dokazivanja da skladištenje peg-EPO u 10 mM natrijum-fosfatu, 40 mM natrijum-sulfatu, 3%-nom (tež. /zapr. ) manitolu, pH 6, 2, ne utiče negativno na bioaktivnost in vivo, izvršena je standardna EPO proba kod miša (videti primer 6). Uzorci peg-EPO koji su skladišteni u toku 6 meseci u 10 mM natrijum-fosfatu, 40 mM natrijum-sulfatu, 3%-nom (tež. /zapr. ) manitolu, pH 6, 2, pri ukazanim temperaturama nisu pokazali gubitak in vivo aktivnosti posle skladištenja pri 4°C, 25 C i 30 C u poređenju sa svežim referentnim standardom (Slika 10).

PRIMER 14

Sadržaj agregata u peg-EPO posle skladištenja pri povišenoj temperaturi u toku 6 meseci

U cilju analiziranja sadržaja agregata u peg-EPO uzorcima posle skladištenja pri povišenoj temperaturi u 10 mM natrijum-fosfatu, 40 mM natrijum-sulfatu, 3%-nom (tež. /zapr. ) manitolu, pH 6, 2, posle 6 meseci su uzeti uzorci i analizirani pomoću hromatografije sa isključenjem po veličini.

Pri temperaturama od 4°C, 25°C i 30°C nisu se mogli detektovati agregati što dokazuje stabilnost pegilovanog EPO u gore pomenutim formulacijama. Slika 11 pokazuje prekrivanje hromatograma sa isključenjem po veličini.

Claims (59)

1.    Tečna farmaceutska smeša koja se sastoji od eritropoetinskog proteina, višestruko naelektrisanog neorganskog anjona u farmaceutski prihvatljivom puferu koji je pogodan da održava pH rastvora u opsegu od oko 5, 5 do oko 7, 0 i opciono jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (inertnih punila).

2.    Smeša prema zahtevu 1, naznačena time, što je vodeni rastvor.

3.    Smeša prema zahtevima 1-2, naznačena time, što je izotonični rastvor.

4.    Smeša prema zahtevima 1-3, naznačena time, što je anjon ustvari anjon višestruko naelektrisane jake neorganske kiseline.

5.    Smeša prema zahtevima 1-4, naznačena time, što je anjon odabran iz grupe koja se sascoji od sulfata, citrata i fosfata.

6.    Smeša prema zahtevima 1-5, naznačena time, što je anjon sulfatni anjon.

7.    Smeša prema zahtevu 6, naznačena time, što sadrži 10 do 200 mmol/1 sulfata.

8.    Smeša prema zahtevima 1-7, naznačena time, što pH iznosi 5, 8-6, 7.

9.    Smeša prema zahtevu 8, naznačena time, što pH iznosi 6, 0-6, 5.

10.    Smeša prema zahtevu 9, naznačena time, što pH iznosi oko 6, 2.

11.    Smeša prema zahtevima 1-10, naznačena time, što je pufer odabran iz grupe koja se sastoji od fosfatnog pufera ili pufera arginin/H2SO4/Na2SO4/i.

12.    Smeša prema zahtevu 11, naznačena time, što je pufer ustvari 10-50 mmol fosfatni pufer.

13.    Smeša prema zahtevima 1-12, naznačena time, što ova smeša sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.

14.    Smeša prema zahtevu 13, naznačena time, što su jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata odabrani iz grupe koja se sastoji od farmaceutski prihvatljivih soli, razblaživača, rastvarača i konzervanasa.

15.    Smeša prema zahtevima 13 i 14, naznačena time, što su farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti odabrani iz grupe koja se sastoji od sredstava za toničnost, poliola, antioksidanasa i nejonskih deterdženata.

16.    Smeša prema zahtevima 13-15, naznačena time, što je farmaceutski prihvatljiv ekscipijent poliol.

17.    Smeša prema zahtevu 16, naznačena time, što je poliol odabran iz grupe koja se sastoji manitola, sorbitola, glicerola, trehaloze i saharoze.

18.    Smeša prema zahtevu 17, naznačena time, što je poliol manitol.

19.    Smeša prema zahtevima 13-18, naznačena time, što sadrži antioksidans.

20.    Smeša prema zahtevu 19, naznačena time, što je antioksidans metionin.

21.    Smeša prema zahtevima 13-20, naznačena time, što sadrži do 1 mmol/1 CaCl2.

22.    Smeša prema zahtevima 15-21, naznačena time, što je nejonski deterdžent polisorbat 80, polisorbat 20 ili pluronik F68.

23.    Smeša prema zahtevu 22, naznačena time, što je nejonski deterdžent pluronik F68.

24.    Smeša prema zahtevima 22 ili 23, naznačena time, što ova smeša sadrži do 1% (tež. /zapr. ) nejonskog deterdženta.

25.    Smeša prema bilo kojem od zahteva 22-24, naznačena time, što ova smeša sadrži do 0, 1% (tež. /zapr. ) nejonskog deterdženta.

26.    Smeša prema zahtevima 1-25, naznačena time, što je eritropoetinski protein humani eritropoetin.

27.    Smeša prema zahtevu 26, naznačena time, što je eritropoetinski protein ekspresovan endogenim genskim aktiviranjem.

28.    Smeša prema zahtevima 26-27, naznačena time, što eritropoetinski protein ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2.

29.    Smeša prema zahtevima 26-28, naznačena time, što protein ima sekvencu humanog eritropoetina koja je modifikovana dodavanjem 1-6 mesta glikozilovanja.

30.    Smeša prema zahtevima 26-28, naznačena time, što eritropoetinski protein ima sekvencu humanog eritropoetina koja je modifikovana modifikacijom odabranom iz grupe koja se sastoji od: Asn30Thr32, Asn51Thr53, Asn57Thr59, Asn69, Asn69Thr71, Ser68Asn69Thr71, Val87Asn8JThr90, Ser87Asn88fhr90, Ser87Asn88Gly89Thr90, Ser87Asn88Thr90Thr92, Ser87Asn88Thr90Ala162, Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90, Asn30Thr32Val87Asn88Thr90, Asn89Ile90Thr91, Ser87Asn89Ile90Thr91, Asn136Thr138, Asn138Thr140, Thr125 i Pro124Thr125.

31.    Smeša prema zahtevima 26-30, naznačena time, što je sekvenca humanog eritropoetina modifikovana premeštanjem najmanje jednog mesta glikozilovanja.

32.    Smeša prema zahtevu 31, naznačena time, što premeštanje obuhvata izbacivanje bilo kojeg od N-vezanih mesta glikozilovanja u humanom eritropoetinu i dodavanje jednog N-vezanog mesta glikozilovanja na položaju 88 ove sekvence humanog eritropoetina.

33.    Smeša prema zahtevu 31, naznačena time, što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina koja je modifikovana modifikacijom odabranom iz grupe koja se sastoji od: Gln24 Ser87 Asn88 Thr90, Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 i Gln83 Ser87 Asn88 Thr90.

34.    Smeša prema zahtevima 26-33, naznačena time, što je pegilovan eritropoetinski protein kao što je definisan u bilo kojem od zahteva.

35.    Smeša prema zahtevu 34, naznačena time, što je eritropoetinski protein ustvari konjugat, pri čemu pomenuti konjugat obuhvata eritropoetinski protein koji ima najmanje jednu slobodnu amino-grupu i koji ima in vivo biološku aktivnost koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i što je odabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji imaju sekvencu humanog eritropoetina modifikovanu dodavanjem 1-6 mesta glikozilovanja ili premeštanjem najmanje jednog mesta glikozilovanja; pri čemu je pomenuti eritropoetin kovalentno vezan za "n" poli(etilenglikol)-nih grupa formule -C0-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR pri čemu -CO svake poli(etilenglikol)-ne grupe formira amidnu vezu sa jednom od pomenutih amino-grupa; pri čemu R označava niži alkil, x je 2 ili 3, m je od oko 450 do oko 900, n je od 1 do 3 i n i m su tako odabrani da razlika molekulske težine konjugata i eritropoetinskog glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona.

36. Smeša prema zahtevu 35, naznačena time, što je eritropoetinski protein formule: pri čemu su m, n, x i R definisani kao što je gore dato i P je ostatak glikoproteina bez n amino-grupa koje formiraju amidne veze sa poli(etilenglikol)-nim grupama.

37.    Smeša prema zahtevu 36, naznačena time, što u formuli (I) x je 2, m je 650-750, n je 1 i R označava metil.

38.    Smeša prema zahtevu 34', naznačena time, što je eritropoetinski protein konjugat, pri čemu pomenuti konjugat obuhvata eritropoetinski protein koji ima najmanje jednu slobodnu amino-grupu i koji ima in vivo biološku aktivnost koja prouzrokuje da ćelije koštane srži povećavaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija i što je odabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji imaju primarnu strukturu humanog eritropoetina modifikovanu dodavanjem 1-6 mesta glikozilovanja; pri čemu je pomenuti glikoprotein kovalentno vezan za 1-3 niži alkoksi-poli(etilenglikol)-ne grupe, pri čemu je svaka poli(etilenglikol)-na grupa kovalentno vezana za glikoprotein preko (via) vezivača formule -C(0)-X-S-Y-pri čemu C(0) ovog vezivača formira amidnu vezu sa jednom od pomenutih amino-grupa, X označava -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)k-, pri čemu k iznosi 1-10, Y označava pri čemu je srednja molekulska težina svakog poli(etilenglikol) -nog dela molekula od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona i molekulska težina ovog konjugata je od oko 51 kilodalton do oko 175 kilodaltona.

39. Konjugat prema zahtevu 38 formule u kojoj n označava ceo broj od 1 do 3, m je ceo broj od 450 do 900, R je niži alkil, X označava -(CH2)k- ili -CH2 (0-CH2-CH2)k- i P je ostatak eritropoetinskog glikoproteina bez amino-grupe ili amino-grupa koje formiraju amidnu vezu sa X.

40. Konjugat prema zahtevu 39 formule u kojoj n označava ceo broj od 1 do 3, m je ceo broj od 450 do 900, R je niži alkil, X označava -(CH2)k- ili -CH2 (O-CH2-CH2)k- i P je ostatak eritropoetinskog glikoproteina bez amino-grupe ili amino-grupa koje formiraju amidnu vezu sa X.

41. Smeša prema zahtevima 1-40, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10. 000 μg eritropoetinskog proteina na ml.

42. Smeša prema zahtevima 1-41, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10. 000 μg eritropoetinskog proteina na ml, 10-200 mmol/1 sulfata i 10-50 mmol/1 fosfata, pH 6, 0 6, 5.

43.    Smeša prema zahtevu 42, naznačena time, što sadrži do 20 mM metionina, 1-5% (tež. /zapr. ) pcliola, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono do 1 mM CaCl2.

44.    Smeša prema zahtevu 42 ili 43, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10.000 μg eritropoetinskog proteina na ml, 40 mmol/1 sulfata, 10 mmol/1 fosfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

45.    Smeša prema zahtevima 1-41, naznačena time, što sadrži 10 (ig do 10. 000 jig eritropoetinskog proteina na ml, 10-100 mmol/1 NaCl, 10-50 mmol/1 fosfata, pH 6, 0-7, 0 i opciono 1-5% (tež. /zapr. ) poliola.

46.    Smeša prema zahtevu 45, naznačena time, što sadrži do 20 mM metionina, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono do 7, 5 μmol/l CaCl2-

47.    Smeša prema zahtevu 45 ili 46, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10.000 μg eritropoetinskog proteina na ml, 100 mmol/1 NaCl, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i 10 mmol/1 fosfata, pH 7, 0.

48.    Smeša prema zahtevima 1-41, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10.000 μq eritropoetinskog proteina na ml, 10-50 mmol/1 arginina, pH 6 do pH 6, 5, 10-100 mmol/1 natrijum-sulfata.

49.    Smeša prema zahtevu 48, naznačena time, što sadrži do 20 mM metionina, do 0, 1% (tež. /zapr. ) pluronika F68, opciono do 1 mmol/1 CaCl2 i opciono 1-5% (tež. /zapr. ) poliola.

50. Smeša prema zahtevima 48 ili 49, naznačena time, što sadrži 10 μg do 10.000 μg eritropoetinskog proteina na ml, 40 mmol/1 arginina, pH 6, 2, 30 mmol/1 natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68 i opciono 1 mmol/1 CaCl2-

51. Smeša prema zahtevima 1-41, naznačena time, što sadrži 25 do 2. 500 μg/ml eritropoetina i a) 10 mM natrijum/kalijum-fosfata, 100 mM NaCl, pH 7, 0 ili b) 10 mM natrijum-fosfata, 120 mM natrijum-sulfata, pH 6, 2 ili c)    10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, pH 6, 2 ili d)    10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2 ili e)    40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, pH 6, 2 ili f)    40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

52.    Smeša prema zahtevima 1-51, naznačena time, što je količina eritropoetina 50, 100, 400, 800 ili 2. 500 μg/ml.

53.    Smeša prema zahtevu 52, naznačena time, što sadrži 10 mM natrijum-fosfata, 40 mM natrijum-sulfata, 3 (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr. ) pluronika F68, pH 6, 2.

54. Smeša prema zahtevu 52, naznačena time, što sadrži 40 mM arginina, 30 mM natrijum-sulfata, 3% (tež. /zapr. ) manitola, 10 mM metionina, 0, 01% (tež. /zapr.) pluronika F68, pH 6, 2.

55. Smeša prema zahtevima 1-54, naznačena time, što je liofilizat ili sprejom osušen prašak.

56. Postupak za proizvodnju smeše prema bilo kojem od zahteva 1-54, naznačen time, što obuhvata mešanje eritropoetinskog proteina sa rastvorom koji sadrži višestruko negativno naelektrisan anjon i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata.

57.    Primena smeše prema bilo kojem od zahteva 1-54 za proizvodnju lekova prikladnih za terapiju i sprečavanje bolesti koje su u vezi sa anemijom kod pacijenata sa hroničnom insuficijencijom bubrega (CRF), sidom i/ili za terapiju pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti hemoterapiji.

58.    Postupak za terapiju i sprečavanje bolesti koje uključuju anemiju kod pacijenata sa hroničnom insuficijencijom bubrega (CRF), sidom i kod pacijenata sa kancerom koji su podvrgnuti hemoterapiji, naznačen time, što obuhvata stupanj davanja pacijentu smeše kao što je zahtevana u bilo kojem od zahteva 1-54.

59.    Uređaj za lokalno i sistemsko oslobađanje koji sadrži smešu prema bilo kojem od zahteva 1-54.