PL176272B1 - Analogi sialilowe Le jako inhibitory adhezji komórkowej - Google Patents

Abstract

1. Analog sialilowy Le* o wzorze I w którym Z oznacza wodór, C 1 -C6 acyl lub a Y jest wybrany z grupy obejmujacej: C(O), SO 2, HNC(O), OC(O) i SC(O); R 1 jest wybrany z grupy obejmujacej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-C1 -C 3-alkilen, w którym aryl ma jeden piecio- lub szescioczlonowy pierscien aromatyczny, skondensowane pierscienie aromatyczne piecio/szescio-czlonowy, lub dwa skondensowane szescioczlonowe pierscienie aromatyczne, które to pierscienie sa wybrane z grupy obejmujacej: pierscienie hydrokarbylowy, monooksahy- drokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspo­ mniany aryl, majacy podstawnik wybrany z grupy obejmujacej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, C 1 -C1 8-alkil, C 1 -C1 8-alkoksy, amino, mono-C1 -C1 8 -alkilamino, di-C1 -C1 8 -alkilamino, benzylamino, C 1 -C1 8 -alkilbenzylamino, C 1 -C1 8-tioalkil i C 1 -C1 8 -alkilkarboksamido, lub R 1 Y oznacza alliloksykarbonyl lub chloroacetyl; R2 jest wybrany z grupy obejmujacej: wodór, C 1 -C1 8-hydrokarbyl o prostym lancuchu, rozgalezionym lancuchu lub cykliczny, C 1 -C6-alkilo-C1 -C 5-alkileno-? -karboksylan, (?-tri-(C1 -C4-alkilo/fenylo)-sililo-C2-C4-alkilen, monosacharyd i disacharyd; lub O R2 lacznie tworza karbaminian C 1 -C1 8-hydrokarbylu o prostym lancuchu, rozgalezionym lancuchu lub cykliczny; R3 oznacza wodór lub C 1 - C6,-acyl; R4 oznacza wodór, C 1 -C6-alkil lub benzyl; R5 jest wybrany z grupy obejmujacej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i C 1 -C6-acyl; R7 oznacza metyl lub hydroksymetyl; 1 X jest wybrany z grupy obejmujacej: C 1 -C6-acyloksy, C 2-C6-hydroksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec i azydo. PL PL PL PL

Description

Dziedzina, do której należy wynalazek

Niniejszy wynalazek dotyczy związków, które inhibitują adhezję komórkową, a zwłaszcza odnosi się do związków analogów sialilu Lewis^x (sialU Le^x łub SLe^x), które inhibitują adhezję komórkową za pośrednictwem selektyny, kompozycji je zawierających i sposobów ich stosowania oraz sposobów wytwarzania tych analogów.

Stan techniki

Naczyniowe komórki śródbłonkowe oraz płytki krwi odgrywają kluczową rolę w szeregu reakcjach biologicznych przez selektywne wiązanie pewnych komórek, np. fagocytowych leukocytów, w strumieniu krwi. Np., komórki śródbłonkowe preferencyjnie wiążą monocyty i granulocyty przed ich migracją w reakcji zapalnej przez ściankę naczyń krwionośnych oraz do otaczającej tkanki.

Znane jest, że pewne związki wyzwalające zapalenie działają bezpośrednio na śródbłonek naczyniowy, sprzyjając adhezji leukocytów do ścianki naczyniowej. Następnie komórki przemieszczają się przez ścianki i do powierzchni urazów lub infekcji.

Uważa się również, że adhezja komórkowa do śródblonka naczyniowego wiąże się z przerzutami nowotworu. Cyrkulujące komórki nowotworowe wykorzystują widocznie normalne mechanizmy zapalne organizmu i wiążą się do obszarów ścianek naczyniowych krwi, gdzie jest aktywowany śródbłonek.

Płytki krwi są również związane z podobnymi reakcjami. Znane jest, że płytki aktywują się podczas zapoczątkowania hemostazy i podlegają zasadniczym morfologicznym, biochemicznym i funkcjonalnym zmianom (np. szybkiej egzocytozie granulek lub degranulacji), w trakcie których błona granulki alfa płytki ulega fuzji z zewnętrzną błoną osocza. W wyniku tego, ulegają ekspresji proteiny nowej powierzchni komórki i nadają one aktywowanej płytce nowe funkcje, takie jak zdolność do wiązania zarówno innych aktywowanych płytek jak i innych komórek. Aktywowane płytki są rekrutowane do wzrastających skrzeplin, lub szybko znikają z krwioobiegu. Znanejest, że aktywowane płytki wiążą się do leukocytów fagocytowych, w tym monocytów i neutrofili. Przykłady procesów patologicznych i innych procesów biologicznych, o których sądzi się, że przebiegają za pośrednictwem tego procesu obejmują: miażdżycę tętnic, krzepnięcie krwi oraz zapalenie.

Ostatnia praca pokazała, że wyspecjalizowane receptory powierzchni komórki na komórkach śródbłonkowych i płytkach, oznaczane jako E-selektyna (cząsteczka 1 śródbłonkowej adhezji leukocytu; ELAM-1) oraz P-sełektyna (proteina 140 błony granulki; GP-140), odpowiednio, są związane z rozpoznawaniem różnych cyrkulujących komórek przez śródbłonek i płytki. Np. wykazano, że E-selektyna pośredniczy w śródbłonkowej adhezji leukocytów, co jest pierwszym etapie w przypadku wielu reakcji zapalnych. W szczególności, E-selektyna wiąże ludzkie neutrofile, monocyty, eozynofile, pewne T-limfocyty [Graber i in.„ J. Immunol., 145:819 (1990)], komórki NK oraz linię komórkową promielocytową HL-60.

E-sełektyna jest indywidualnie ekspresjonowana na naczyniowych komórkach śródbłonkowych [Bevilacqua et al., Science, 243:1160-1165 (1989) i Hession et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1673-1677 (1990)]. Wykazano, że ten receptorjest indukowany przez zapalne cytokiny, takie jak interleukin Ιβ (IL-Ιβ) i faktor martwicy nowotworowej a (T N Fa), jak również bakteryjną endotoksynę (lipopolisacharyd) [Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:92389242 (1987)]. Te związki zwiększają cechującą się różnokształtnością jąder komórkowych adhezję leukocytów (neutrofil), oraz monocytów [Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84-9238-9242 (1987)].

P-sdektyna (znana również jako G P-140 i PADGEM) jest obecna na powierzchni płytek i komórek śródbłonkowych, gdzie pośredniczy w oddziaływaniach płytka-leukocyt i śródblonek-leukocyt, [Geng et al., Naturę, 343:757-760 (1990)]. Zatem, np., wiadomo, że aktywowane płytki, które ekspressonują P-setektynę najej powierzchni wiążą się do monocytów i neutrofilów [Jungi et al., Blood, 67:629-636 (1986), i także wiążą linie komórkowe monocytopodobne np.

176 272

HL-60 i U937 [Jungi et al., Blood, 67:629-636 (1986); Silverstein et al., J. Clin. Invest., 79:867-874(1987)].

P-selektyna jest proteiną alfa granulki błony o masie cząsteczkowej 140 000, która jest ekspresjonowana na powierzchni aktywowanych płytek do stymulacji płytki i wydzieleniu granulki [Hsu-Lin et al., J. Clin. Chem., 259:9121-9126 (1984); Stenberg et al., J. Cell Biol., 101:880-886 (1985); Berman et al., J. Clin. Invest., 78:130-137 (1986)]. Stwierdzono także, że jest w megakariocytach [Beckstead et al., Blood, 67:285-293 (1986)], i w komórkach śródbłonkowych [Mc Ever et al., Blood, 70:335a (1987)] w ciałkach Weibel-Palade [Bonfanti et al., Blood, 73:1109-1112 (1989)]. Furie et al., Opis patentowy USA nr 4,783,330, opisuje przeciwciała monoklonałne reaktywne z P-sdektyną.

Trzeci receptor jest receptorem naprowadzania limfocytów antygenem MEL-14 lub jego ludzkim odpowiednikiem LAM-1 (L-selektyna) (Gallatin et al., Nature, 304:30-34 (1983); Siegellman et al., Science, 243:1165-1172 (1989); Rosen, Cell Biology, 1:^13:919 (1989); i Lasky et al., Celi, 56:1045-1055 (1989)]. Uważa się, że oprócz naprowadzania limfocytów, antygen MEL-14/LAM-1 na początku działa przy wiązaniu neutrofilu do śródbłonka.

Określenie sei^ektyna zasugerowano dla ogólnej klasy receptorów, która obejmuje: E-selektynę (ELAM-1), P-seeektynę (G P-140) i L-sdektynę (MEL-14), ze względu na ich domenę lektynopodobną i selektywny charakter ich funkcji adhezywnych. Budowę i funkcję receptorów selektyny wyjaśniono przez klonowanie i ekspresję pełnej długości cDNA kodującego każdy z powyższych receptorów [Bevilacqua et al., Science, 243:1160-1165 (1989), (ELAMI-1); Geng et al., Nature, 343:757-760 (1990), (G P-140); i Lasky et al., Celi, 55:10451055 (1989), (antygen MEL-14)].

Pozakomórkowa część selektyn może być podzielona na trzy segmenty oparte na homologiach do uprzednio opisanych protein. Obszar N-końcowy (około 120 aminokwasów) jest pokrewny rodzinie protein lektyny typu C ssaków jak opisał Drickamer, J. Biol. Chem., 263:9557-9560 (1988), i indukuje receptor CD23 o niskim powinowactwie IgE. Następny jest segment polipeptydowy, który ma sekwencję pokrewną do protein, zawierających motyw faktora wzrostu naskórkowego (EGF). Na koniec, po domenie 'EGF znajduje się jeden lub więcej powtarzalnych motywów tandemowych o około 60 aminokwasach każdy, pokrewnych znalezionym w rodzinie uzupełniających protein regulacyjnych.

Opis patentowy USA nr 5 079 353 i opis patentowy nr 5 296 594 z tego samego działu podają syntezę i zastosowanie antygenów sialilu Le^x i sialilu Le^a, które są obecne w tkankach rakowych, i są ligandami uprzednio opisanych receptorów selektyny. Opis patentowy USA nr 5 143 712 podaje iteracje wiązania między różnymi receptorami, takimi jak ELAM-1 (E-selektyna) i ligandami, takimi jak sialil LeX, jak również ligandami, zawierającymi mnogość jednostek N-acdyIlaktozaminy (Lac NAc) wraz z końcową grupą siałilową i jedną lub więcej grup fukozylowych związanych z częścią Glc N Ac jednostki Lac N Ac.

Opublikowane międzynarodowe zgłoszenia WO 91/19501 i WO 91/19502 ujawniają, że oligosacharyd, zawierający struktury pentameryczne i heksameryczne podane niżej inhibitowały selektywne wiązanie komórkowe między komórkami, zawierającymi ligand (poniżej) i tymi zawierającymi receptor selektyny, i że badane penta- i heksasacharydy dały lepsze inhibitowanie niż SLeX.

NeuAca2->3Gal3 1 ->4(Fucal ->3)GlcNAce1,3Gaie-;

NeuAca2->3Gal31->4(Fucoc1 --^GlcNAceLSGaliaMGlc-; oraz

NeuAca2->3Gal31->4(Fuca1 ->3)GlcNAc = SLeX

Streszczenie wynalazku.

Niniejszy wynalazek rozpatruje związek analog sialilu LeX (SLeX), który inhibituje adhezję komórek ekspressonujących SLeX na swoich powierzchniach do receptora selektyny, związek przejściowy w syntezie inhibitora, jak również sposób wytwarzania związku przejściowego i kompozycję, zawierającą inhibitor.

Rozpatrywany związek odpowiada wzorowi

176 272

w którym Z oznacza wodór, Ci-C6-acyl lub

Yjest wybrany z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(0),0C(0) i SC(O);

R jest wybrany z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-C3-alkilen, w którym aryl ma jeden pięcio- lub sześccoczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowane pierścienie aromatyczne pięcio/sześcio-członowy, lub dwa skondensowane sześccoczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej pierścienie: hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Ci-alkil, CiCi--alkoksy, amino, mono-Ci-Cis-^kliamirn^di-Ci-Cis-allkiamino, benzylamino, Ci-Ci--alkilbenzylamino, Ci-Cn-tioalkil i Ci-Cis-alkUkarboksamido, lub

R-Y oznacza alliloksykarbonyl lub chloroacetyl;

R² jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, Ci-Cn-hydrokarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, Ci-Cs-alkilo-Ci-Cs-alkileno-m-kuboksylan, m-tri--CiC 4-alkiło/fenylo)-sililo-C2-C4-^lkilen, monosacharyd i disacharyd;

lub OR2 łącznie tworzą karbaminian Ci-Cn-hydrokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

R³ oznacza wodór lub Ci-C6-acyl; r4 oznacza wodór, Ci-C6-alikil lub benzyl;

R⁵ jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i Ci-Cs-acyl;

R⁷ oznacza metyl (CH3) lub hydroksymetyl (CH2OH); i

X jest wybrany z grupy obejmującej: Ci-Cs-acytoksy, C2-C6-hydroksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec i azydo.

Y oznacza korzystnie karbonyl [C(O)].

W przypadku j ednej grupy inhibitorów, r2 oznacza korzystnie monosacharyd, a zwłaszcza Ci-Cii-alkćioglikozyd monosacharydu, R7 oznacza metyl, Z oznacza niezabezpieczoną grupę fuko, X oznacza hydroksyl, a R-Y oznacza grupę inną niż alliloksykarbonyl lub chloroacetyl. Związek przejściowy dla inhibitora może mieć dowolną z podanych grup R, przy czym r3, r4 i r5 korzystnie są inne niż wodór.

Szczególnie korzystny inhibitor odpowiada wzorowi:

i76 272 i3

w którym R1 jest taki jak powyżej, a R1 Y oznacza grupę inną niż alliloksykarbonyl lub chloroacetyl, X jest taki jak powyżej i korzystnie inny niż Ci-C6-acyloksy i Ci-Có-hydroksylacyloksy, a R 2 i Rsą takie jak omówiono powyżej. W jednym wykonaniu, r2 oznacza korzystnie fragment inny niż mono- lub disacharyd. Grupa benzylowa R² jest tu szczególnie korzystna.

Inna grupa szczególnie korzystnych inhibitorów odpowiada wzorowi:

w którym R¹ jest taki jak powyżej oprócz tego, że alliloksykarbonyl i chloroacetyl jako grupy RiY są wykluczone, X jest taki jak powyżej i korzystnie inny niż C-Cg-acyloksy i Ci-C6-'i\+^iro^'^;^ła(^c^'loksy, r7 jest taki jak poprzednio, a R² oznacza mono- lub disacharyd.

Rozpatrywana jest również kompozycja farmaceutyczna. Ta kompozycja farmaceutyczna obejmuje farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik z rozpuszczoną lub dyspergowaną w nim inhibitującą adhezję komórkową ilością związku o wzorze:

w którym Y jest wybrane z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O),OC(O) i SC(O);

R¹ jest takie jak określono uprzednio, i jest korzystnie wybrane z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-tR-aakilen, w którym aryl jest wybrany z grupy obejmującej: furyl, tienyl, fenyl, naftyl, pirydyl, pirazynyl, benzofuranyl, isobenzofuranyl, benzo-[b lub c]-tienyl, pirymidynyl, pirydazynyl, chinolinyl, isochinolinyl, chinoksalinyl, naftyridinyl, ftalazynyl i chinazolinyl, a podstawiony aryl jest to uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Cis-aUkl, Ci-Ci--aakoksy, amino, mono-Ci-Cl8-alkilamino, di-Ci-Cii-aUkiaminobenzylamino i Ci-Ci-andlobenzylamino;

R2 jest wybrane z grupy obejmującej: wodór, Ci-Ci-hydrokarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, ω-karboksylan-Ci-C6-allάlo-Ci-C5-alkylenu, ω--π-(^C4-alkilo/fenylo)-sililo-C2-C4-alkilen, monosacharyd i disacharyd;

176 272 lub OR² łącznie tworzą Ci-Ci--karbaminian hydrokarbylu o prostym łańcuchu, o rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

R⁷ oznacza metyl (CH3) lub hydroksymetyl (CH₂OH); a

X jest wybrany z grupy obejmującej: Ci-Cć-acyloksy, C2-C6-hydtOksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec lub azydo.

Wyżej podane preferencje dla inhibitora są zachowane dla kompozycji farmaceutycznej.

Dalej jest rozpatrywany sposób wytwarzania soli laktozoamoniowej. Sposób ten obejmuje etapy:

(a) domieszanie do laktulozy aminy pierwszorzędowej, która jest monopodstawioną pochodną amoniaku, której atom azotu jest związany z usuwalną na drodze redukcji grupą blokującą, taką jak benzylamina, by utworzyć mieszaninę reakcyjną. Pierwszorzędowa amina służy zarówno jako reagent i rozpuszczalnik lub pierwszorzędowy rozpuszczalnik, i jest obecna w ilości takiej, że stanowi to od około 2 do około -0 razy więcej niż wynosi ilość moli laktulozy, korzystnie około 4- do około 8-krotnego nadmiaru molowego.

(b) Mieszanina reakcyjnajest utrzymywana w temperaturze od około -0°C do około 60°C, i korzystnie od około temperatury pokojowej do około 50°C, przez okres czasu wystarczający dla utworzenia odpowiedniego N-glikozydu laktulozy. Ten czas utrzymywania może się zmieniać od około 2 do około 7 dni, gdy są pożądane maksymalne wydajności.

(c) Utworzony N-glikozyd laktulozy jest poddawany reakcji z ilością - aż do równoważnej - kwasu karboksylowego o wartości pKa około 2,5 do około 5,0 w rozpuszczalniku -Ci-C,3-alkoholu, takim jak metanol, w temperaturze około -0°C do około 30°C, by przekształcić N-glikozyd laktulozy w sól laktozoamoniową z zablokowaną aminą z usuwalną na drodze redukcji grupą blokującą związaną z aminą. N-Glikozyd laktulozy może być obecny w ilości od około 0,- M do około poziomu nasycenia; i (d) Grupa blokującajest następnie usuwana na drodze redukcji, takjak przez hydrogenolizę ze wspomnianej soli laktozoamoniowej z zablokowaną aminą by utworzyć sól laktozoamoniową. Korzystnie ta sól jest wydzielana.

Nazewnictwo użyte do opisu ugrupowań oligosacharydowych niniejszego wynalazku jest zgodne z nazewnictwem konwencjonalnym. Stosowane są standardowe skróty dla indywidualnych monosacharydów. Np. 2-N-kretylogklkozamina jest oznaczana jako GlcNAc, 2-N-acetylogalaktozamina - jako GalNAc, fukoza - Fuc, fruktoza - Fru, galaktoza - Gal, glukoza - Glc, a mannoza - Man. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie cukry oprócz fukozy (L-izomer) są D-izomerami w cyklicznej konfiguracji (np. piranoza lub furanoza). Dwa anomery cyklicznych form są oznaczane przez a i β.

Monosacharydy są zasadniczo połączone wiązaniami glikozydowymi, by utworzyć oligoi polisacharydy. Orientacja wiązania względem płaszczyzny pierścieni jest wskazana przez a i β. Konkretne atomy węgla tworzące wiązanie między dwoma monosacharydami są także oznaczone. Zatem, wiązanie glikozydowe (3 między C-- galaktozy i C-4 glukozy jest oznaczone przez Gaei->4Glc. Dla cukrów D (np. D-GlcNAc, D-Gal, D-NeuAc i D-Man) oznaczenie a oznacza hydroksyl przyłączony do C-i (C-2 w NeuAc), który jest poniżej płaszczyzny pierścienia, β - powyżej pierścienia. W przypadku L-fukozy, oznaczenia a oznacza hydroksyl powyżej pierścienia, a β - poniżej.

Szczegółowy opis wynalazku

A. Związłk

Niniejszy wynalazek rozpatruje związek analog SLe^x o wzorze stnikturaanym A, poniżej, którego wzór strukturalny obejmuje związek pentasacharydowy o Wzorze I, któryjest analogiem sialilu Le^x, jak również ich prekursorów penta- i tetrasacharydowych o Wzorach II i III, odpowiednio. Związek o Wzorze strukturalnym I inhibituje adhezję komórkową, za pośrednictwem receptora powierzchni komórki selektyny.

I76 272

I5

to przypadku jest określony związek o Wzorze III, lub a-L-ukozyl, którego grupy hydroksylowe są wolne lub zablokowane grupą zabezpieczającą (benzyl lub Ci-Có-acyl), tym samym określając związek o Wzorze I lub II, zależnie od konkretnych grup R³, R4 i R5 (R³ j;

Y jest wybrane z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

R 3jest wybrane z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-Cs-andlen, w którym aryl ma jeden pierścień aromatyczny pięcio- lub sześdoczłonowy, skondensowane pierścienie pięcio/sześcioczlonowe, lub dwa skondensowane pierścienie sześcioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej pierścienie: hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl to uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Cn-aUdl, Ci-Cn-aakoksy, amino, mono-C|-Cl1-alldlamino, di-C|-Cl1-alkliamino, benzylamino, C|-Cι1-alkiiobenzylamino, Ci-Ci 8--^^ i C|-Cl1-alkilkarboksamido, lub

RiY oznacza alliloksykarbonył lub chloroacetyl;

r2 jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, Ci-Cn-hydrokarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, C|-C6aakilo-C|-C5-takilencaω-karboksylan, ω-π-ΟC4-alkilo/fenylo)-sililo-C2-C4-alkilen, monosacharyd i disacharyd;

I6

I76 272 lub OR2 łącznie tworzą karbaminian Ci-Ci--hydrokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

R³ oznacza wodór lub C--C6-acyl;

R⁴ oznacza wodór, Ci-Cć-alkil lub benzyl;

R⁵jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i Ci-C6-acyl;

R⁷ oznacza metyl (CH3) lub hydroksymetyl (CH2OH); i

X jest wybrany z grupy obejmującej: CiC6-aa\doksy, C2-Ce-hydroksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec i azydo.

Jak wyżej zaznaczono, Y może być jedną z pewnej liczby grup. Gdy Y oznacza C(O), R ¹ Y oznacza podstawnik acylu, tak że amid jest utworzony z atomem azotu aminy sacharydu. Gdy

Y oznacza SO2, R-Y tworzy podstawnik sulfonylowy, tak że sulfonamid jest utworzony z a_;omem azotu aminy sacharydu. Gdy Y oznacza hNC(O), R¹ Y tworzy podstawnik aminokarbonylowy tak, że podstawnik mocznika jest tworzony z tym atomem azotu sacharydu. Podstawnik uretanowy jest tworzony z azotem aminy sacharydu, gdzie Y oznacza oksykarbonyl, OC(O), podczas gdy tiouretan jest tworzony, gdy Y oznacza tiokarbonyl, SC(O). Grupa Y oznacza korzystnie karbonyl [C(O)].

R*Y może także oznaczać alliloksykarbonyl lub chloroacetyl. Alliloksykarbonyl jako R-Y jest szczególnie korzystny dla związku o Wzorze III, ponieważ daje grupę R- którą łatwo zamienić. Alliloksykarbonyl lub chloroacetyl jako R-Y jest obecny jedynie w związku o Wzorze HI, i jest nieobecny w związku o którymkolwiek ze Wzorów I, II, A, B lub .C (Wzory B i C pokazano poniżej).

Jak omawiano uprzednio, R- może oznaczać aryl lub podstawiony aryl. Rozpatrywane aryle są takimi, które zawierają aromatyczny pierścień pięcio- lub sześcioczłonowy, skondensowane pierścienie pięcio- i sześcio--pięcio/sześcio-)-członowy lub dwa skondensowane aromatyczne pierścienie sześcioczłonowe i obejmują hydrokarbyle, takie jak fenyl i naftyl, jak również hydrokarbyle, zawierające tlen, lub siarkę, lub jeden lub dwa atomy azotu, które zamieniają atomy węgla w pierścieniu (mono- lub diazahydrokarbyl). Przykładowe aryle obejmują: furyl, tienyl, pirydyl, pirazynyl, benzofuranyl (benzo[b]furyl), izobenzofuranyl, (benzo[c]furyl), benzotienyl (benzo[b]tienyl), izobenzotienyl (benzo[c]tienyl), pirymidynyl, pirydazynyl, chinolinyl, izochinoil, chinoksalinyl,_fnaftyridinyl, ftalazinyl i chinazolinyl. Każdy z tych aryli może być niepodstawiony, lub każdy może mieć podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, C--C- --nikn, Ci-Cu-aakoksy, amino, mono-Ci-Cig-aaknamino, di-Ci Ci-aaknamino, Ci-Cl--alkiibenzyloammo i C--Cl--alki]karboksamido.

Powyższe niepodstawione i podstawione aryle R- są dobrze znane według stanu techniki, i każdy może być związany z atomem azotu sacharydu przy użyciu dobrze znanych metod chemii. Poniższe omówienie będzie zatem się koncentrować na grupach arylohydrokarbylowych, fenylu i naftylu, jako przykładowych dla grupy, przy czym należy rozumieć, że inne wymienione aryle i podstawione aryle R- mogą być użyte przy zasadniczo podobnych metodach chemicznych.

Gdy R- oznacza fenyl, może być użyty chlorek benzoilu lub bezwodnik benzoesowy, by utworzyć korzystne wiązanie amidowe. Halogenek benzenesulfonylu, taki jak chlorek benzenesulfonylu może podobnie być użyty, gdy Y oznacza SO2. Isocyjanian fenylu jest użyty, gdy

Y oznacza HNC(O). Chloromrówczan fenylu jest użyty, gdy Y oznacza OC(O), podczas gdy chlorotiomrówczan fenylu jest użyty, gdy Y oznacza SC(O).

Specyficznie rozpatrywane grupy - podstawione fenyle R- obejmują takie, w których podstawnik może być podstawiony w dowolnej pozycji pierścienia, przy czym korzystne są pozycje meta i para. Monopodstawione grupy fenylowe R- są korzystne w stosunku do grup dwupodstawionych.

Rozpatrywane podstawniki w postaci chlorowca obejmują: fluoro, chloro, bromo i jodo, z p-fluorofenylem, m-chlorofenylem, ιη-(κ^εηνΐοπ), p-bromofenylern i p-fluorofenylem jako przykładami. Są także rozpatrywane dichlorowcopodstawione fenyle R-, takie jak: 3,4-dichlorofenyl, 3.5-dichlorofenyl, 2-chloro-4-aluorofenyl i 3-bromo-4-aluorofenyL

176 272

Przykładowe C-Cig-alkile obecnejako podstawniki fenylu z R¹ obejmują: alkile o prostym i rozgałęzionym łańcuchu, takie jak: metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t-butyl, pentyl, heksyl, oktyl, nonyl, decyl,' dodecyl, tetradecyl, heksadecyl i oktadecyl. C1-Ci2-alkile są korzystne, zwłaszcza C1—-alk ile, a najbardziej - metyl. Przykładowe korzystne grupy R ‘ obeimują o-, m- i p-tolil (metylofenyl) i p-t-butylofenyl, jak również 3,4-dimetylofenyl i 3,5-dimetylofenyl.

Przykładowe Ci-Cl8-alkokjy są eterami, zawieraiącymi C1-Ci8-0kil, lub szczególnie korzystny C1-C6-alkil. Korzystne jest -u metoksy. Przykładowe korzystne grupy R¹ obejmują o-, m- i p-anzyi (metoksyfenyl), jak również 3,4-dimetoksyfenyl i 3,5-dimetoksyfenyl.

Nitrofenyl Ri jest łatwy do wytworzenia przez acylowanie przy użyciu chlorku 3- lub 4-nitrobenzoilu. Acylowanie chlorkiem 3,4- i 3,5-dinitrobenzoilu daje odpowiednie grupy 3,4i 3,5-dinitrofenyl jako r1 Tworzenie amidu przy użyciu chlorku 3- lub 4^^ifl^^^io:mei^;^lbei^:zoilu podobnie daje grupy 3- lub 4-1:riifuorometylfenyl jako r1 Podstawiony fenyl Ri może także zawierać podstawnik amino, mono-Cl-Cl8-alkiiammo, di-Cl-Clr-alkitamino, benzyloamino, C1-Ci8-alldibenzytamino lub Cl-Cl8-allklkarboksamido, w którym podstawniki C1 -Cn-alkil są takie jak omówiono uprzednio.

Aminofenyle R^r najłatwiej wytwarza się z odpowiednich omawianych uprzednio nitrofenyli R1 przez redukcję katalityczną grupy nitro po utworzeniu wiązania amidowego, jak omawiano uprzednio. Zatem, np., zastosowanie chlorku 3- lub 4-nitrobenzoilu, by utworzyć wiązanie amidowe, po redukcji palladem na węglu tworzy odpowiedni 3- lub 4-aminofenyl jako r1 Podobne zastosowanie chlorku 3,4- lub 3,5-ditt^i'^i^<^l^^i^^<^;ilu daje po redukcji odpowiedni 3,4lub 3,5-diaminofenyl (R1).

Kilka kwasów di-Cl-C6-alkitaminoUenzoe.jowych, takich jak kwas 4-di etyl aminobenzoesowy i 3- i 4-dimetytammobenzoesowy jest dostępne w handlu i może być użyte, by utworzyć odpowiedni halogenek lub bezwodnik benzoilu dla otrzymania amidu, zawierającego r1 Pozostałe kwasy ϋ--31-3ΐ1^Πά1 aminobenzoesowe i związki o dwóch grupach dialkilamino mogą być wytworzone przy użyciu dobrze znanych metod alkilowania z odpowiednich kwasów aminobenzoesowych lub diaminobenzoesowych, które są także dostępne w handlu.

Mono-C1-Ci8-alldiaminofenyljako R1 może być wytworzony z odpowiedniego halogenku mono-C1-Ci8-allkiairanobenzoilu, którego pozostała wartościowość azotu jest blokowana przez łatwo usuwalną grupę blokującą, taką jak t-Roc, która może być usunięta kwasem lub benzyl, który może być usunięty przez uwodornienie, o ile jest to pożądane, przy użyciu palladu na węglu. Zatem, acylowanie może mieć miejsce przy użyciu chlorku N-benzylo-N-propylaminobenzoilu, z usuniętym B-benzylem przez katalityczne uwodornienie, by uzyskać monoC1-Ci8-alkiiaminofenyl R1. Oczywiście, benzyl nie musi być usuwany, dając tym samym C1 -C18-blkilbunzy tarnino.

Każdy z wyżej omawianych podstawników fenylu lub podstawionego fenylu może być wytworzony przez dobrze znaną reakcję tworzenia amidu. W przykładowej reakcji, odpowiedni halogenek lub bezwodnik benzoilu, taki jak chlorek p-fi^(^i^<^l^^i^;^<^^lu lub bezwodnik benzoesowy reaguje z niezabezpieczoną grupą aminową poza tym zabezpieczonego sacharydu, jak to zilustrowano szczegółowo poniżej. Zarówno 1- i 2-naftyl są rozpatrywane jako r1 przy czym 2-naftyl jest .szczególnie korzystny. Te związki mogą być także wytworzone przy użyciu standardowej technologii tworzenia amidów jak wyżej, takiej jak przez reakcję chlorku 2-naftolu z aminą odpowiedniego sacharydu, jak omawiano powyżej.

Należy rozumieć, że podobne podstawniki są obecne na grupach arylowych oksa-, tiaaza- i diazahydrokarbylowych. Np. można wykorzystać dowolny z dwóch chlorków kwasu furanokarbok^ylowego, dwóch chlorków tiofenokarboksylu, trzech chlorków pirydynokarboksylu, chlorek kwasu chinaldynowego, chlorek kwasu 3-chinolinekarboksylowego, chlorku 2--dhnoksaloilu itp., by przeprowadzić reakcję acylowania.

Podobnie, gdy Y oznacza SO2, stosuje się odpowiedni halogenek sulfonylu. Np., można wykorzystać chlorek benzenosulfonylu, chlorek toluenosulfonylu, chlorek 8-chinolinosulfonylu, chlorek 1 - lub 2-naftalenosulfonylu, itp., by utworzyć sulfonamid.

Gdy Y oznacza HNC(O), izocyjanian odpowiedni do uprzednio opisanego kwasu karboksylowego jest dogodnym reagentem. Takie pochodne mogą być łatwo wytworzone z halogenku

176 272 kwasowego przez reakcję z azydkiem, by utworzyć azydek acylu, który podlega przegrupowaniu Curtiusa, by utworzyć izocyjanian po ogrzewaniu.

Gdy Y oznacza OC(O) lub SC(O), aryl podstawiony hydroksylem lub merkapto jako R jest poddawany reakcji z fosgenem, by utworzyć chloromrówczan lub chlorotiomrówczan, który może reagować z aminą sacharydu, by utworzyć wiązanie uretanu lub tiouretanu z R .

Fenylo-Ci-C3-alkilen jako R^r jest Ci-C3-alkilenem, któryjest sam podstawiony fenylem, korzystnie na końcowym węglu hydrokarbylu. Ten κ'ΟίΟ) zawiera zatem pierścień fenylu połączony z łańcuchem 2-4 atomów węgla. Przykładowe CCOjR¹ alkileny obejmują 2-fenyloacetoil, 3-fenylopropionyl i 4-fenylobutanoil [ÓCH2C(O), (j)CH2CH2C(O) i φ (CH2)3C(O) , odpowiednio, gdzie φ=fenył]. Te związki mogą być wytworzone przez reakcję odpowiedniego halogenku lub bezwodnika z aminą sacharydową jak wyżej. Redukcja katalityczna przy użyciu wodoru i katalizatora - palladu na węglu, może być stosowana, by utworzyć nasycone alkileny z nienasyconych łańcuchów hydrokarbylowych; nasycone łańcuchy hydrokarbylowe są korzystne.

Grupa R² tworzy β-glikozyd z układem pierścienia sacharydu. To wiązanie glikozydowe może być utworzone z prostego Ci-Cis-dkoholu hydrokarbylowego, z estru kwasu ω-hydroksykarboksylogo, z ω-hydroksylowanego sililowanego alkilu, lub z mono- lub disacharydu, lub OR² łącznie tworzą karbaminian Ci-Ci s-hycirokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny. Ci-Cć-hydrokarbyl, taki jak etyl, benzyl lub monosacharyd, taki jak 3-galaktozyl, jest szczególnie korzystny. R² może także oznaczać wodór.

Przykładowe grupy R² utworzone z prostych prekursorów alkoholi obejmują Ci-Cis-hydrokarbyle o prostym łańcuchu, o łańcuchu rozgałęzionym lub cykliczne.

Przykładami takich grup są uprzednio opisane C i-GT,-alkile, które są korzystne, j ak również ich nienasycone odpowiedniki, takie jak allil, 3-butenyl, 2-but-3-enyl, i but-3-ynyl, jak również dłuższe hydrokarbyle, takie jak benzyl, 4-met.ylocyklohcksyl. dekahydronaftyl, nonyl, decyl· (kapryl), dodecyl (lauryl), dodec-7-enyl, mirystyl, palmityl, stearyl, oleił, linoleil, linolenyl i rycynoleil.

Karbaminian Ci-Cis-hydrokarbylu jest wytworzony przez reakcję izocyjanianu odpowiedającego uprzednio omawianemu C[-Cix-hydrokarbylowi z hydroksylem redukującego końca cukru. Np., 1 -hydroksyl końcowej jednostki glukozylowej może być poddany reakcji z etylizocyjanianem, by utworzyć odpowiedni karbaminian etylu (uretan). Grupa karbonylową karbaminianu nie jest ujęta w liczbie atomów węgla hydrokarlrylu.

w-Karboksylan-Ci-Cć-alkilo Ci-Cs-alldlenu jako Roznacza ester Ci-C6-alkilowy-C2-C6kwasu ω-karboksylowego. Takie estry są wytwarzane z prekursora estrów kwasu hydroksykarboksylowego, których hydroksyle są wykorzystywane, by utworzyć wiązanie glikozydowe.

Przykładowe estry ω-hydroksykarboksylanowe obejmują: 2-hydroksyoctan metylu, 3hydroksypropionian etylu, 4-hydroksymaśIan t-butylu, 5-hydroksywalerianian heksylu i 6-hydroksykapronian metylu. Zatem, hydroksyl i karboksyl są na końcach łańcucha i są rozdzielone przez 1-5 grup metylenowych. Korzystny jest 6-hydroksykapronian metylu. m-tri-(Ci-C4-alkil/fenyl)-sililo-C2-C4-alkil jako R² jest utworzony z odpowiedniego alkoholu prekursora, którego podstawiony silił jest na końcu (pozycja ω) łańcucha przeciwnym do hydroksylu.

Dobrze znane jest według stanu techniki, że podstawione silile mogą obejmować wiele kombinacji Ci-C4-alkilów i fenylów, takichjak tri-Ci-Ce-idkil, di-Ci-C4-alkilofenyl, Ci-C4-alkilodifenyl i trifenyl. Przykładowe podstawione silile obejmują: trimetylosilil, trifenylosilil, di-tbutylometylosilil, dimetylofenylosilil, t-butylodiienylosilil itp. Przykładowe mono- i disacharydy obejmują 3- i 4-glukozyl (3/4 Gic), 3- i 4-galaktozyl (3/4 Gal), a szczególnie korzystny jest 3-galaktozyl, 3- i 4-N-acetyloglukozyl (3/4 Gic N Ac), 2-, 3, 4- i 6-mannozyl (2/3/4/6 Man), i 3- i 6-N-acetylogalaktozyl (3/6 Gal N Ac) i Galpl-->4 GlcNAc. Monosacharyd może sam tworzyć wiązanie glikozydowe z grupą, R⁶, które obejmuje wszystko z wyjątkiem sacharydu grupy R². Zatem, R⁶ oznacza R² inne niż mono- lub disacharyd.

Wzór strukturalny szczególnie korzystnego związku o wzorze A o redukującej grupie końcowej 3GalpOR⁶ pokazano poniżej we wzorze strukturalnym B, w którym X, Y, Z i R^1;, R⁶ i R⁷ są takie jak uprzednio określono.

176 272

Szszególnie korzystnym związkiem o Wzorze B jest inhibitor adhezji komórkowej o strukturze podanej przez Wzór C, poniżej, w którym X, Y, R1 R⁶ i R⁷ są takie jak uprzednio ujawniono.

6

Wiązanie β-gllkozylowe utworzone z grupą R lub R może być wytworzone za pomocą dobrze znanych reakcji chemii organicznej z sacharydami i innymi prekursorami grupy R² (R.6), jak przez reakcję 1 -halosacharydu z hydroksylem żądanego alkoholu prekursora grupy r2 (r6) w obecności węglanu srebra (Ag2CO3) lub trifluorometanosulfonianu srebra, jak również za pomocą środków enzymatycznych, jak w przypadku transferazy glikozylowej dla sacharydów. Rozpatrywaną grupą r3 może być: wodór lub Cr^6-acyl, który jest częścią estru kwasu Cι-C6-aaylokta-boksylowego. C1-C6-acyl jest korzystny dla związku o Wzorze II. Przykładowe C1-C6-acyle obejmują: formyl, acetyl, propionyl, butanoil, isobutanoil, pentanoil i heksanoil. Korzystny jest acetyl. Acylowanie hydroksyli sacharydu jest dobrze znane i może być wykonane przy użyciu odpowiedniego halogenku lub bezwodnika kwasowego.

Rozpatrywana grupa R⁴ o Wzorze A może stanowić: wodór, C1-C6-aakil, jak omawiano uprzednio w przypadku takich grup alkilowych, lub benzyl. Grupa R4 wraz z jej związanym atomem tlenu tworzy alkoholową część estru. Korzystny jest metyl. Ester r4 może być utworzony standardowymi środkami przed dodaniem grupy kwasu stalowego, po utworzeniu sialilowanego sacharydu przy użyciu reagenta, takiego jak diazometan, lub przez reakcję laktonu z odpowiednim alkoholem jak omówiono w związku ze Schematem 2, poniżej.

Grupą r4 związku o Wzorze III może być: proton, C1 -<Ζ26^-11^il lub benzyl; korzystny jest C1-C6-iakil. Gdy r4 jest obecne jako proton, należy rozumieć, że proton może zastąpiony przez farmaceutycznie dopuszczalny kation (M), taki jak amon, sód, potas, wapń, magnez itp. Proton lub inny kation jako R⁴ jest w typowym przypadku nie ukazywany we wzorach w niniejszym tekście, takich jak Wzory I i C, ponieważ kwas sialilokarboksylowy jest zwykle zjonizowany przy fizjologicznych wartościach pH około 7,2-7,4, przy których jest stosowany inhibitor o Wzorach I lub C. Zatem, sialilokarboksyl jest często ukazywany w niniejszym tekście jako karboksylan.

Grupa R⁵ oznacza wodór, benzyl, metoksybenzyl (korzystny jest 3- lub 4-metokjybenzyl), dimetoksybenzyl, taki jak 3,4- lub 3,5-dimetokjybenzyl, lub Ci-C6-acyl, jak omawiano uprzednio. Benzyl jest zwykle stosowany, gdy grupa fukozylowa jest dodana wskutek syntezy organicznej.

Grupy r3 R⁴ i r5 inne niż wodór są grupami zabezpieczaaącymi, stosowanymi podczas syntezy związków pośrednich, takich jak związki o Wzorach B, II i III, powyżej. Gdy R)=R=R5=H (wodór), związek o Wzorze II staje się związkiem o Wzorze I, podczas gdy związek o Wzorze

176 272

B staje się związkiem o wzorze C, gdy Z oznacza fuko. Podobnie, gdy Z oznacza fuko i R3=R4=R⁵=wodór, związek o Wzorze A staje się związkiem o Wzorze I.

Podstawnikiem X może być Ci -Cs-acy yoksy; tzn.: Ci-Cs-acyloester prekursora hydroksylu w tej pozycji, O—Cs-hydroksylacyloksy, hydroksyl, chlorowiec, jak omawiano uprzednio, lub azydo. Przykładowe C-Cs-acyle już omawiano, a Ci-Cs-acytaksy oznacza Ci-Cs-azyl, który później obejmuje dodatkowy atom tlenu związany z karbonylowym atomem węgla grupy acylowej. C2-C6-Hydroksylacyloksy jest wyżej omawianym Cl-Cs-acyloksy, który dalej obejmuje podstawnik hydroksylu. Przykładowe C2-C6-hydroksylacyloksy obejmują: hydroksyoctan, mleczan, 3-hydroksymaślan, 2-hydroksyizowalerian i 2-hydroksykapronian. Podstawnik X jest zwykle inny niż Cl-C6-aaytaksy lub C2-C6-hydroksylacyloksy, jeśli zarówno sialilowanie i fukozylowanie nie są przeprowadzane enzymatycznie, jak to jest omawiane poniżej.

, Syntezę pochodnych kwasu siatawego, zawierających podstawnik X ujawniono w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu WO 92/16640, opublikowanym 1 października, 1992. Zastosowanie tych związków do sialilowania sacharydów jest także ujawnione w tej publikacji.

Grupa r7 jest to metyl lub hydroksymetyl, tak, że wraz z przedstawionym karbonylem grupa [C(O)] r7 tworzy N-acetyl lub N-hydroksyicetyl. Pochodne kwasu siatawego, zawierające dowolną spośród R.7 mogą być użyte w enzymatycznym sialilowaniu, jak opisano w niniejszym zgłoszeniu.

Szczególnie korzystne związki inhibitory o wzorach strukturalnych I i C zilustrowano poniżej, wraz z ich numerami związków; tzn., Związki 17, 30-38, i 43-51.

I76 272

2i

I76 272

B. Synteza związków.

Uprzednio opisany związek - analog SLe^x można otrzymać licznymi sposobami. Jak wykazano na podstawie przytoczonych tutaj przykładów, syntezę można zrealizować w sposób całkowicie enzymatyczny, można zastosować wyłącznie techniki chemii organicznej lub wykorzystać technikę mieszaną obejmującą syntezę organiczną i enzymatyczną.

Jeden ze sposobów rozróżnienia syntezy organicznej od syntezy enzymatycznej to obecność jednego lub większej liczby enzymów w opartym na wodzie środowisku reakcji (synteza enzymatyczna), w przeciwieństwie do pozbawionego enzymów środowiska reakcji, które jest całkowicie wolne od wody i zawiera rozpuszczalnik organiczny taki jak: acetonitryl, metanol, etanol, dimetyloformamid (DMF), dimetylosulfotlenek (DMSO), benzen, aceton, dichlorometan, tetrahydrofuran (THF) itp. (synteza organiczna).

Niezależnie od tego, która z tych metod jest wykorzystywana, sacharydy obejmujące laktozaminę, galaktozę i glukozaminę musza być połączone razem w pewnym punkcie syntezy. W pewnym stopniu zaskakujące jest, że wiązanie laktozaminy Gaiei-4GlcN jest także jednym z bardziej, trudnych wiązań do utworzenia w trakcie syntezy rozważanego związku.

Laktozamina jest związkiem opisanym w literaturze, lecz nie jest łatwo dostępna. Niemniej, laktozamina lub jej pochodna są dobrą substancją wyjściową w syntezie rozważanego związku.

Chociaż laktozamina nie jest związkiem łatwo dostępnym, laktuloza, tj. ketoza, która nie zawiera grupy aminowej, ale zawiera wiązanie Gaiei->4Fru odnoszące się do laktozy i laktozaminy, jest dostępna handlowo. Laktuloza z utworzonymjuż wiązaniem Gla[5i->4 jest substancją wyjściową wjednej z rozważanych dróg syntezy laktozaminy. Synteza laktozaminy (związek 3) w formie soli addycyjnej kwasu jest przedstawiona poniżej w sposób ogólny i szczegółowy na schematach i i IA, odpowiednio, jak również synteza peracetylo-N-ffahmidolaktozaminy (związek 5) i chlorku peracetylo-N-aιalimidolaktozaminy β (związek 6). Związki numerowane na obydwu schematach są tymi samymi związkami.

Schemat 1

Laktuloza

MeOH

AICI₃

H₂ Pd/C

HO OH ♦HzFTN

OAc

O •Cl ch₂ch₂ nr^br^b

I76 272

Schemat 1A

1) PhthO (4),

2) (Ac)₂O

Zatem, laktuloza w re^k^^i z pierwszorzędową aminą, która s^^^a^i^owi pochodną amoniaku, w której nom azotu łączy się z łatwą do usunięcia na drodze redukcji grupą blokuj ącą (benzyloamina) i którajestjednocześnie reagentem i rozpuszczalnikiem reakcji, tworzy odpowiedni N-glikozyd, N-bernzyloglikozyd laktulozy (Bn=benzyl; związek i). W reakcji związku - w środowisku metanolu z nieomal stcchiometryczną ilością kwasu karboksylowego o pKa od około 2,5 do około 5,0 (lodowaty kwas octowy) powstaje octan N-benzylolaktuzoamoniówy (związek 2) z wydajnością 50-55%. Octan laktuzoamoniowy (związek 3) otrzymano na drodze uwodornienia wymienionego roztworu metanolowego w obecności palladu na węglu (Pd/C).

Wiadomo, że w miejsce benzyloaminy można stosować inne blokowane aminy z łatwo usuwalną na drodze redukcji grupą blokującą. Np. mono- i dimetoksybenzyloaminy można rozpatrywać jako pochodne amoniaku zablokowanego usuwalnymi na drodze redukcji grupami, z których po reakcji z sacharydem grupy mono- i dimetoksybenzylowe mogą być usunięte poprzez uwodornienie. Podobnie można stosować alliloaminę, której blokująca grupa allilowa jest usuwana w reakcji z poli(metylohydiOsilanem) (PMSH) w obecności kompleksu palladu z tetrakistrifenylofosfiną [PtlCPPh/})©] w THF jako rozpuszczalniku.

Zatem, chociaż grupa benzylowa (Schemat i A) występuje jako R^A na Schemacie -, należy rozumieć, żejako R^A może być stosowana grupa monometoksybenzylowa, dimetoksybenzylowa lub allilowa.

Powyższa dyskusja i reakcje pokazane na Schematach - i iA ilustrują proces otrzymywania laktozaminy lub soli laktozoamoniowej z laktulozy. Zgodnie z tym procesem mieszanina reakcyjna tworzy się po zmieszaniu laktulozy z pierwszorzędową aminą, która jest monopodstawioną pochodną amoniaku i w której nom azotu jest połączony z grupą blokującą łatwo usuwalną na drodze redukcji. Blokowana pochodna amoniaku stanowi w tym procesie jednocześnie reagent i rozpuszczalnik.

Stosuje się od 2 do około -O-krotnego nadmiaru molowego, w stosunku do liczby moli laktulozy, blokowanej pochodnej amoniaku (lub pierwszorzędowej aminy). Korzystnie stosuje się od około 4- do około 8-krotnego nadmiaru molowego pierwszorzędowej aminy.

17s 272

Jak uprzednio zaznaczono, rozważa się pierwszorzędowe aminy, zawierające inne grupy blokujące usuwalne na drodze redukcji. Zatem, alliloamina i p-metoksybenzytoamina były z powodzeniem stosowane do utworzenia N-gbkozydu laktulozy, i przekształcane do odpowiedniej N-podstawionej laktozoaminy.

Tak powstała mieszanina reakcyjna jest utrzymywana w temperaturze od około 10 do około s0°C przez okres czasu wystarczający do utworzenia odpowiedniego N-glikozydu laktulozy, tj. przez okres czasu, w którym amina pierwszorzędowa zastąpi grupę 2-hydroksylową laktulozy. Korzystna jest temperatura w przedziale od temperatury otoczenia (około 20°C) do około 50°C.

Czas utrzymywania jest funkcją szeregu zmiennych, takich jak: nadmiar molowy aminy pierwszorzędowej, temperatura utrzymywania oraz żądana ilość N-glikozydu laktulozy, i może on zmieniać się od 8 godzin, w przypadku gdy żądanajest niewielka ilość produktu, do 2 tygodni, w przypadku niskiej temperatury i małych ilości pierwszorzędowej aminy. Na przykład, gdy stosowano od 4 do 7,5-krotny nadmiar molowy pierwszorzędowej aminy (w tym przypadku, benzyloaminy,), reakcja zakończyła się po czasie utrzymywania wynoszącym 7 dni w temperaturze pokojowej, jednak mniej niż 50% przereagowania osiągnięto w tych samych warunkach przy zastosowaniu 2-krotnego nadmiaru molowego benzyloaminy. Jeżeli temperaturę utrzymywania podniesiono do 50°C, reakcja z 4-krolnym nadmiarem aminy zakończyła się po 2 dniach (48 godz.) podczas gdy temperatura reakcji równa 70°C spowodowała rozkład.

Obecność katalizatora typu kwasu Lewisa, takiego jak: chlorek cynku, iriflιorometanosulfonian cynku lub hifluorometanosulfonian magnezu, w środowisku reakcji zwiększyła szybkość reakcji w ten sposób, że reakcja z 7,5-kcotnym nadmiarem molowym benzyloaminy w temperaturze pokojowej bez katalizatora zakończyła się po 7 dniach, natomiast w obecności katalizatora -po 2 dniach (48 godz.). Podobny wynik uzyskano stosującjako katalizator kwas tnfluorooctowy, który jest korzystny.

Laktuloza nie rozpuszcza się w alkoholach, w tym w metanolu. Laktuloza rozpuszcza się w gorącym DMF i pozostaje w roztworze po ochłodzeniu. Zarówno metanol jak i DMF mogą być stosowane jako współrozpuszczalniki z pierwszorzędową aminą, w przypadku gdy obecny jest wyżej omówiony katalizator. Np. gdy współrozpuszczalnikiem był metanol, reakcja nie zaszła zarówno w temperaturze pokojowej jak i w 50°C; gdy zastosowano chlorek cynku jako katalizator, 4-krotny nadmiar molowy benzyloaminy oraz metanol jako współrozpuszczalnik reakcja zakończyła się po 48 godz. w temperaturze pokojowej.

N-glikozyd laktulozy, otrzymany w sposób omówiony powyżej, jest higroskopijny i dlatego jest stosowany wkrótce po otrzymaniu. N-glikozyd poddaje się reakcji z kwasem karboksylowym w ilości od około 0,1 równoważnika do ilości równoważnikowych (dla uzyskania najlepszej wydajności), którego pKi wynosi od około 2,5 do około 5,0, w alkoholu C1-C3 jako rozpuszczalniku i w temperaturze od około 10 do około 30°C. N-glikozyd laktulozy ulega przekształceniu w sól laktozoamoniową, w której grupa aminowa jest zablokowana przez wspomnianą wyżej grupę blokującą usuwalną na drodze redukcji, tzn. blokowana aminą sól laktozoamoniowa ma usuwalną na drodze redukcji grupę blokującą związaną z atomem azotu aminowego.

Użyty kwas karboksylowy może należeć do grupy kwasów dobrze znanych według stanu techniki, takich jak: octowy (pKi = 4,7s), propionowy (pKi = 4,88), masłowy (pKi = 4,82), chlorooctowy (pKi = 2,80), metoksyoctowy (pKi = 3,52). itp. Korzystnie stosuje się lodowaty kwas octowy. Przykładowe alkohole C1-C3 obejmują metanol, który jest korzystny, etanol, propanol i izo-propanol. Korzystnie temperaturą reakcji jest temperatura pokojowa.

Stężenie N-glikozydu laktulozy może zmieniać się w zakresie od 0,1 M do znacznego nasycenia. W typowym przypadku stosuje się stężenia od około 0,5 do około 1,5 M w rozpuszczalniku.

Następnie usuwa się grupę blokującą usuwalną na drodze redukcji. Uwodornienie w obecności katalizatora palladowego jest korzystnym procesem dla usuwania grupy blokującej, szczególnie wtedy gdy stosuje się benzyloaminę lub metoksybenzyloaminę. PmHS i Pd(PPh3)4 są stosowane wtedy, gdy pierwszorzędową aminą jest alliloamina.

176 272

Wspomniana wyżej redukcja może zachodzić w dowolnym odpowiednim dla pochodnej laktozoamoniowej rozpuszczalniku. Np. uwodornienie można prowadzić w zakwaszonej wodzie lub C1-C3-aakoholu jak podano wyżej. PHMS i Pd(PPh3)4 są w typowym przypadku stosowane w THF lub podobnym rozpuszczalniku.

Otrzymana w ten sposób sól laktozoamoniowa jest zasadniczo wydzielana po syntezie, chociaż wydzielanie nie jest konieczne i zależy od stosowanego rozpuszczalnika i zastosowania produktu. Jeżeli pożądanejest wydzielenie soli laktozoamoniowej, której anion ma postać anionu kwasu stosowanego w procesie redukcji, wydzielenie można uzyskać znanymi metodami, ' takimi jak chromatografia lub wytrącanie. Wolna laktozoamina może być otrzymana z soli metodą chromatografii jonowymiennej lub przez neutralizację, a następnie ekstrakcję wolnej zasady odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym.

Roztwór metanolowy związku 3, lub inny odpowiedni roztwór, powstający w wyniku reakcji uwodornienia poddano następnie reakcji z bezwodnikiem ftalowym (PhthO) w obecności katalizatora zasadowego, takiego jak Na2CO3, tak by utworzyć N-ftdiunid półkwasu, związek 4. Po utworzeniu odpowiedniego amidu półkwasu, np. związku 4, usunięto reaktywny rozpuszczalnik, taki jak metanol. Następnie grupy hydroksylowe disacharydu peracdydowano i zamknięto pierścień ftalimidu, otrzymując z wydajnością ponad 10% w przeliczeniu na substancję wyjściową pera(^<^^ft^dlo^vany (Ac) ftalimidowy związek 5.

Rozważa się również dodatkową metodę syntezy soli laktozoamoniowej.

W tym sposobie laktulozę poddaje się reakcji w autoklawie ze stali nierdzewnej z równomolową ilością octanu amonu w ciekłym amoniaku jako rozpuszczalniku, przy czym ciekły amoniak wprowadza się do autoklawu schłodzony do -78°C. Utworzoną mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury od 0°C do około 80°C i utrzymuje przez okres od około 5 godzin do około 5 dni, w zależności od stosowanej temperatury i żądanego stopnia konwersji. W reakcji tej powstaje aminoglikozyd laktulozy.

Po usunięciu amoniaku i octanu amonu, przy czym ostatni z wymienionych związków jest w typowym sposobie usuwany w warunkach obniżonego ciśnienia, powstający wolny od amoniaku produkt poddaje się reakcji z kwasem karboksylowym, jak opisano uprzednio i otrzymuje się sól laktozoamoniową, np. związek 3. Sól laktozoamoniową przeprowadza się następnie w związek 5 w sposób omówiony uprzednio. β-anomer związku 5 wydzielono z całkowitą wydajnością równą 3,8% podczas pierwszej krystalizacji, przy czym w pierwszym etapie reakcji temperatura reakcji wynosiła 35°C, a czas reakcji 24 godz.

Jakkolwiek wydajność związku 5 była mniejsza w tym sposobie otrzymywania w porównaniu z uprzednio omówionym procesem, sposób ten pozwala uniknąć etapu redukcyjnego usuwania grupy blokującej aminę występującego w uprzednio omówionym procesie. Stosowany do redukcji katalizator, zawierający pallad jest najdroższym reagentem występującym w tej syntezie. Wiadomo ponadto, że ciekły amoniak stosowany jako rozpuszczalnik może być zastąpiony metanolowym roztworem amoniaku, co pozwala uniknąć konieczności stosowania autoklawu.

Na schemacie 1 pokazano, że fragment aminy w związku 5 jest związany z grupami R^B, które łącznie z pokazanym atomem azotu' tworzą cykliczny C4-C8-imid, taki jak podany przykładowo w związku 5 ftalimid (Phth). Wiadomo, że bezwodnik bursztynowy, bezwodnik maleinowy, bezwodniki mono- i dimetylobursztynowe oraz bezwodnik cytrakonowy mogą być również stosowane do utworzenia podobnych imidów, tak by grupy R^B razem z atomem azotu tworzyły odpowiedni imid. Cykliczny imid utworzony przez grupę -NRBrB stanowi grupę, zabezpieczającą aminę, którajest stabilna w warunkach, w których usuwa się grupy O-acylowe, lecz może być łatwo usunięta w reakcji z hydrazyną Wiadomo ponadto, że nie jest konieczne stosowanie bezwodnika, który może być zastąpiony przez halogenek kwasowy monoestru alkilowego CrCf, kwasu dikarboksylowego, taki jak chlorekmetylowoftaloilowy.

Związek 5 pokazano jako β-anomer. Powstaje również α-octan, przy czym wydajność żądanego β-octanu można podwoić przez zatężenie do piany cieczy macierzystej, z której uzyskuje się związek 5, powtórne rozpuszczenie w DMF, a następnie reakcję z octanem hydrazyniowym, który rozszczepia grupę octanową i powoduje tworzenie anomeru β-OH. Po wydzieleniu produktu reakcjijedną z typowych technik ekstrakcyjnych i wysuszeniu, wysuszony

I76 272 produkt rozpuszcza się w pirydynie, a roztwór pirydynowy poddaje się reakcji z nadmiarem bezwodnika octowego. W wyniku kolejnej ekstrakcji uzyskuje się dodatkowo związek 5 z wydajnością 8,3% wydajności całkowitej. Związek 5 uzyskano z wydajnością końcową równą 18,7%, w przeliczeniu na substancje wyjściowe.

W reakcji związku 5 z AlCb w dichlorometanie w temperaturze pokojowej otrzymuje się faktycznie z wydajnością ilościową związek 6.

Schemat 2, przedstawiony w dalszym ciągu opisu, ilustruje przekształcenie związku 6, β-chlorku peracetylo-N-atrlinπdolaktozaminy w całkowicie zabezpieczony sialilowany tetrasacharyd, związek i3. I tak, związek 6 w etapie a poddano reakcji w temperaturze otoczenia w czasie 2 godz. ze związkiem 9, którego syntezę omówiono w przykładach, w obecności sit molekularnych, kolidyny i trifluorometanosulfonianu srebra, stosując dichlorometan jako rozpuszczalnik, co doprowadziło do otrzymania odpowiedniego trisacharydu. Całkowicie zabezpieczony trisacharyd poddano najpierw w etapie b działaniu 80% wodnego roztworu kwasu octowego w czasie 2 godz. w temperaturze 80°C, tak by usunąć benzylidenową grupę zabezpieczającą w pozycjach 4 i 6 końcowej jednostki Gal. W etapie c wydzielony, częściowo odbezpieczony trisacharyd reagował w temperaturze wrzenia z hydratem hydrazyny w czasie I7 godz., tak by usunąć grupy ftalimidową i acetylową i utworzyć całkowicie odbezpieczony trisacharyd. W reakcji odbezpieczonego trisacharydu z pirowęglanem diallilowym w rozpuszczalniku o składzie metanol:woda (5:-), otrzymano w etapie d związek I0, w którym AL jest grupą allilokarbamoilową.

W przypadku, gdy r2 nie jest glikozydem jak opisano w syntezie przedstawionej na schemacie 2, lecz korzystnie grupą hydrokarbylową C1--C18 taką jak grupa benzylowa, etapy glikozylacji a i b pomija się, otrzymując tetrasacharydy o wzorach A, I lub II, w których r2 jest różny od mono- lub disacharydu.

Związek -0 poddano następnie w etapie e enzymatycznemu sialilowaniu w buforze wodnym za pomocą α-(2,3)-aialllotransferazy (EC 2,4,99,6) i grupy innych enzymów. Reakcję kontrolowano metodą TLC w czasie I0-I2 dni w temperaturze otoczenia; stwierdzono, że w tym czasie więcej niż 95% związku -0 uległo zużyciu i otrzymano związek ii.

Związek i i wydzielono w postaci gęstego syropu, który dwukrotnie poddawano współodparowaniu z pirydyną, a następnie w czasie 20 godz. przetrzymywano pod zmniejszonym ciśnieniem. Odwodniony w ten sposób produkt rozpuszczono powtórnie w pirydynie, do której dodano katalityczne ilości 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) oraz bezwodnik octowy. W ciągu następnych 44 godz., w etapie f, dodano dwie porcje bezwodnika octowego, co zakończyło reakcję acetylacji i powstawania laktonu z sialilowanymi grupami karboksylowymi i sacharydowymi grupami hydroksylowymi. Następnie do wydzielonego produktu dodano metanol, tak by utworzyć ester sialilowometylowy, po czym dodano bezwodnik octowy w celu acetylowania uwolnionych grup hydroksylowych i utworzenia w etapie g całkowicie zabezpieczonego związku 12.

Powinno być oczywiste, że związki -- i i2 są związkami o wzorach strukturalnych A i

III. Dla przykładu w związku -2 Z oznacza C--<C6-^i^^l (acetyl), X oznacza grupę C--C6-acyloksy (acetoksy), r2 oznacza fragment 3GaieO-etyl, r3 oznacza acetyl, r4 oznacza metyl i R1 oznacza grupę alliloksy. Powinno być równie oczywiste, że wspomniane wyżej inne grupy X w związku o dowohiych wzorach strukkuridnych mogą być w dogodny sposób wprowadzone w etapie sialilowania. Jeżeli pożądane jest, aby podstawniki X jednostki sialilowej, którymi sąCi-C6-acyloksy lub Ci -C6-hydroksyacylokty, obecne były w inhibitorze o wzorach strukturalnych I lub C, korzystne jest, gdy związek -0 (lub disacharyd bez grupy 3GaipOR2) jestperacetylowany, grupa alliloksykarb:^i^oilowa (AL) związku I0 jest usuwana jak w etapie h, i zastąpiona przez jedną z grup acylowych R¹ z pierścieniem fenylowym, jak w etapie c na schemacie 3. Cząsteczka jest następnie odbezpieczana i enzymatycznie sialilowana oraz fukozylowana w sposób omówiony w dalszej części opisu. Dla innych grup R^M lub podobnych związków o wzorach strukturalnych A, B lub Π, można zastąpić 3Galp glikozyd R² w związku 9. czynnik acetylujący w etapach f i g oraz alkoholestryfikujący w etapie f.

Γ76272

Wydzielony i wysuszony związek I2 poddano działaniu w etapie h polimetylohydrosiloksanu (PMHS) w bezwodnym THF w temperaturze pokojowej, a następnie tetrakistrifenylofosfiny [Pd(PPh₃)4] w czasie I8 godz., co pozwoliło uzyskać związek I3 z wydajnością 87%.

Schemat 2

I76 272

Schemat 3, zamieszczony w dalszej części opisu, przedstawiajedną z pozostających syntez dla zilustrowania otrzymywania inhibitora-związku -7 o wzorach strukturalnych I i C. W etapie a reakcja związku -3 z jednym równoważnikiem lodowatego kwasu octowego w wodnym metanolu, w czasie 48 godz. i w temperaturze 50°C powoduje s^l^^ł^t^-wną deacylację grupy Glc 3-hydroksylowej, co daje w wyniku związek I4 z wydajnością 65%.

W etapie b związek i 4 jest następnie s^ici^^_y^vvnie benzoilowany z wydajnością 83%, w reakcji z chlorkiem benzoilu w dichlorometanie w obecności stałego dwuwęglanu sodu w temperaturze pokojowej i w czasie 24 godz., tworząc związek -5. Alternatywne grupy Rzwiązku o wzorach strukturalnych A, I, II i III są wprowadzane w tym etapie lub w analogicznym etapie, w którym r2 nie jest jednostką sacharydu.

Chemiczną fukozylację organiczną zrealizowano w etapie c przedstawionym ma schemacie 3 przez zmieszanie związku I5 z fluorkiem tri-O-kanzylofukozylowym w obecności sit molekularnych i teJt^^(^t^t/!^<^¹^'^^<^^:^'nika w dichlorometanie, a następnie ochłodzenie do -20°C i dodanie w tej temperaturze chlorku cynawego i nadchloranu srebra. Po wolnym ogrzaniu mieszaniny do temperatury pokojowej i mieszaniu w czasie 24 godz. otrzymuje się z wydajnością 77% związek -6.

Związek I6 jest zatem związkiem o wzorach strukturalnych A i B, w którym Z oznacza zablokowany grupę fukozylową, jak również związkiem o wzorze II. Zastosowanie alternatywnych grup R^? pozwala uzyskać pozostałe związki o tych wzorach strukturalnych w połączeniu z uprzednio omawianymi grupami X i R^M.

O-benzylowe grupy blokujące, R⁵, występujące w fukozylowej jednostce sacharydu usunięto w etapie d przez uwodornienie z wykorzystaniem wodorotlenku palladu na węglu [Pd(OH)2/C] i metanolu jako rozpuszczalnika. Grupy O-benzylowe zostały całkowicie usunięte w czasie i godz. w temperaturze pokojowej. Po filtracji i zatężeniu związku debenzylowanego otrzymano olej, który powtórnie rozpuszczono w mieszaninie metanohwoda (4:i), dodając w etapie e sproszkowany metanolan sodu. Po i6 godz. reakcji w temperaturze pokojowej otrzymano inhibitor - związek -7, z wydajnością 72%.

Jeżeli R5jest Ci-Ce-acylem, etap uwodornienia niejest stosowany i Ci-Ce-acyl jako R5jest usuwany wraz z grupami Ri R⁴. Zastosowanie C-jako r5 i uniknięcie etapu uwodornienia, dostarcza również drogi syntezy grup R- zawierających grupę nitrową.

Schemat 3

b

I76 272

Jeżeli grupa r2 jest mono- lub disacharydem, to stosuje się odpowiedni blokowany monolub disacharyd, taki jak związek 9 na schemacie 2. Na przykład laktoza, Ci-Ci-gllkozyd laktozy lub melibioza mogą być przeprowadzone w zabezpieczone (blokowane) pochodne benzylidyny podobne do tych w związku 9 i stosowane następnie w etapie sprzęgania a na schemacie 2, a tworzący się produkt może być stosowany w kolejnych następujących po sobie etapach na schematach 2 i 3.

Należy rozumieć, że laktozamina i jej pochodne można otrzymać innymi metodami, które są dobrze znane fachowcom. Należy również rozumieć, że trisacharydowy związek I0 można otrzymać metodą enzymatyczną z 3-O-(2-N-allhoksykarbonylo-2-aminca2-deoksy-β-D-glikoplranozyloFe-D-gaalakozydu etylowego, stosując transferazę utydyno-5^/aiilbsfor;uwgHkakozyl0wą i UDPGal, oraz inne odpowiednie enzymy postępując zgodnie ze znanymi procedurami. Podobnie, związek 11 można fukozylować enzymatycznie, stosując transferazę fukozylową (FT), taką jak transferazę fukozylową V,jak również donor cukru nukleotydowego GDP-fukozę, i inne enzymy przydatne w regeneracji GDh^-fukozy, przy zastosowaniu znanych procedur. Oczywiście, niewielkie zmiany w pokazanych schematach reakcyjnych są konieczne, gdy występują te zmiany w syntezie, lecz te zmiany mieszczą się w ramach umiejętności typowego pracownika z dziedziny techniki.

176 272

Jeszcze jedna pożyteczna procedura syntetyczna jest pokazana na schemacie 4, poniżej. W tym sposobie, .siub.sttincją wyjściowąjest wolna zasada, związek 14a, związku 14 na schemacie 3.

Schem&t4

OH

176 272

Zatem, związek 14a poddano reakcji w etapie a z niewielkim nadmiarem chlorku karbobenzoksylu (CBZ-Cl) w dichlorometanie w obecności wodorowęglanu sodu, następnie po 18 godz. dodano następną taką samą ilość CBZ-Cl, otrzymując w wyniku związek 39 z zabezpieczoną grupą aminową, z wydajnością równą 65%. Etap b zaznaczony na schemacie 4 jest zasadniczo takim samym etapem glikozylowania jak etap c na schemacie 3, w którym związek 40 tworzy się z wydajnością 73% oraz dodatkowo odzyskuje się 17% wyjściowego związku 39.

Fukozylowaną wolną aminę, związek 41, otrzymano następnie z wydajnością 96% w etapie c przez reakcję we wrzącym etanolu z 10% roztworem Pd-C w mrówczanie amonowym. Wolna amina związku 41 została następnie w etapie d poddana reakcji z chlorkiem acylowym (YR¹) w dichlorometanie w obecności wodorowęglanu węglanu sodu, w wyniku czego otrzymano z wysoką wydajnością odpowiedni hydroksy-blokowany związek N-acylowany, w tym wypadku pochodną 3,5-dichlorobenzamidu, tj. związek 42.

Struktury kilku szczególnie korzystnych inhibitorów, związków 17, 30-38 i 43-51 były już pokazane. Związki 30-33 otrzymano z ich odpowiednich prekursorów, związków 26-29, w sposób jak to opisano na schemacie 3 dla przeprowadzenia związku 16 w związek 17. Związki 34-38 i 51 otrzymano sposobami analogicznymi do tych przedstawionych na schemacie 3. Związki 43-49 otrzymano w podobny sposób, stosując ogólne podejście przedstawione na schemacie 4. Związek 50 otrzymano według sposobu przedstawionego na schemacie 3, stosując redukcję według schematu 4, etap c. Są to związki o wzorze strakturalnym I, jak również o wzorze A.

C. Metody badania inhibitowania adhezji komórkowej.

Dostępne i znane specjalistom z dziedziny techniki są liczne bezpośrednie i pośrednie sposoby skriningu in vitro inhibitorów oddziaływań rece-ptor-lgand. Np. można kreślić zdolność inhibitowania adhezji komórek noszących SLeX do komórek ekspresjonujących konkretną selektynę.

17s 272

Jak omawiano powyżej, sklonowano kilka genów receptora selektyny, i zatem geny te można wstawić i ekspresjonować w bardzo różnorodnych komórkach, takich jak komórki COS, komórki CHO, komórki ludzkiej nerki transformowane adenowirusem, takie jak stosowane w niniejszym zgłoszeniu, i podobne, tak że w badaniach można użyć rekombinacyjny receptor selektyny, taki jak rELAM (rekombinacyjny ELAM), jak opisano poniżej. Ponadto, komórki, które zwykle nie ą SLeX są zdolne do ulegania trans formacji za pomocą jednego lub większej liczby genów glikozylotransferazy, które nadają transformowanym komórkom zdolność syntetyzowania ligandu. [Patrz, np., Lowe et al., Celi, s3:475-484 (1990)]. W pewnych próbach związek lub czynnik-inhibitor jest inkubowany przy użyciu komórek noszących SLeX i aktywowanych komórek ekspre.sjonujących selektyny powierzchni komórki lub rekombinacyjną selektynę unieruchomioną na powierzchni stałej. Inhibitowanie adhezji komórkowej można następnie określić przez wykrycie znacznika związanego z powierzchnią po odpowiednich przemywaniach.

W typowym przypadku, badania in vitro rozpatrywanego związku-analogu SLeX są próbami kompetycyjnymi, które wykrywają zdolność rozpatrywanego związku do kompetycyjnego inhibitowania wiązania selektyny do komórek, zawierających SLeX Komórki, zawierające selektynę są w typowym przypadku aktywowanymi płytkami krwi lub aktywowanymi komórkami śródbłonkowymi z rekombinowaną jako przydatną, podczas gdy komórki noszące

SLeX są zwykle neutrofilami lub komórkami HL-sCf

Inne formaty prób wiążą się z wykrywaniem obecności lub nieobecności różnych zmian fizjologicznych w komórkach noszących ligand SLeX lub noszących selektynę, uzyskiwanych w wyniku oddziaływania. Przykłady odpowiednich prób obejmują: pomiar zmian aktywności transkry^pcyjnej indukowanej przez wiązanie (zob. np. publikacja PCT nr 3712820), wykrywanie różnych efektów pozakomórkowych, w których pośredniczy komórka (zob. np. publikacja PCT nr 90/00503) i wykrywanie zmian w potencjale membranowym poszczególnych komórek (zob. np. opis patentowy USA nr 4 343 782), które wszystkie załączono do niniejszego tekstu jako odsyłacz.

Alternatywnie, można wykryć zmiany konformacyjne w izolowanych receptorach lub ligandach; zob. opis patentowy UsA nr 4 859 s09, załączony do niniejszego tekstu jako odsyłacz. Ponadto, można związać komórki ekspresjonujące SLeX do selektyny związanej ze stałym podłożem, poddać lizji związane komórki i wykonać próbę na białko, które mogło być jedynie w związanych komórkach.

Każdy składnik próby, w tym ligand, receptor selektyny lub związek SLeX można związać do powierzchni stałej. Według stanu techniki znanych jest wiele sposobów unieruchamiania biomolekuł na powierzchniach stałych. Np. powierzchnia stała może być membraną (np. nitroceluloza), naczynkiem do mikromiareczkowania (np. PCW lub polistyren) lub kulką. Żądany składnik może być związany kowalencyjnie lub dołączony niekowalencyjnie przez wiązanie niespecyficzne. Szeroki zakres polimerów organicznych i nieorganicznych, zarówno naturalnych jak i syntetycznych, można zastosować jako materiał powierzchni stałej.

Przykładowe polimery obejmują; polietylen, polipropylen, pob(4-meiylobuie'n), polistyren, polimetakrylan, poli(tereftalan etylenu), rayon, nylon, (poli(maślan winylu), silikony, poliformaldehyd, celulozę, octan celulozy, nitrocelulozę itp. Inne materiały, które można zastosować obejmują: papier, szkła, ceramikę, metaloidy, materiały półprzewodnikowe, cermety itp. Ponadto objęte są substancje, które tworzą żele, takie jak białka, np. żelatyny, lipopolisacharydy, krzemiany, agaroza i poliakrylamidy lub polimery, które tworzą szereg faz wodnych, takie jak dekstrany, glikole poli(alkilenowe) (alkileny o 2 do 3 atomach węgla) lub substancje powierzchniowo czynne np. związki amfifilowe, takie jak fosfolipidy, sole alkiloamoniowe o długim łańcuchu (12-24 atomy węgla) itp.

W przypadku, gdy powierzchnia .stała jest porowata, można .stosować różne wielkości porów w zależności od charakteru układu.

Przy przygotowaniu powierzchni, można zastosować różne materiały, zwłaszczalaminaty, by uzyskać różne właściwości. Np. powłoki białkowe, takie jak żelatyna, można zastosować dla uniknięcia wiązania niespecyficznego, ułatwienia sprzężenia kowalencyjnego, poprawy wykrywania sygnału itp.

I76 272

Jeśli pożądane jest wiązanie kowalencyjne między związkiem i powierzchnią, powierzchnia jest zwykle wielofunkcyjna lub zdolna do wielofunkcyjności. Grupy funkcyjne, które mogą być obecne na powierzchni i użyte do wiązania obejmują kwasy karboksylowe, aldehydy, grupy aminowe, grupy cyjanowe, grupy etylenianowe, grupy hydroksylowe, grupy merkapto itp. Sposób wiązania szerokiego zakresu związków do różnorodnych powierzchni jest dobrze znany i obficie ilustrowany w literaturze. Zob. np. Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (I978), i Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245, 3059 (I970) załączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze.

Oprócz wiązania kowalencyjnego, można użyć różnych sposobów niekowalencyjnego wiązania składników próby. Wiązanie niekowalencyjne jest w typowym przypadku niespecyficzną absorpcją związku do powierzchni. W typowym przypadku, powierzchnia jest blokowana przy użyciu drugiego składnika, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu znaczonych składników próby. Alternatywnie, powierzchnia jest tak skonstruowana, by wiązała niespecyficznie jeden składnik, lecz nie wiązała znacząco drugiego. Np. powierzchnia nosząca lektynę, taką jak konkanawalina A wiąże związek zawierający węglowodan, lecz nie znaczone białko, które nie ma glikolizacji.

Różne powierzchnie stałe dla stosowania do niekowalencyjnego dołączenia składników próby omówiono w opisach patentowych USA nr 4 447 576 oraz 4 254 082, załączonych do niniejszego tekstu jako odsyłacze.

Uprzednio wspomniane znakowanie może być sprzężone bezpośrednio lub pośrednio z żądanym składnikiem próby według sposobów dobrze znanych według stanu tet^łaniki, lub może być białkiem endogennym do komórek wiążących. Można użyć szerokiego zakresu znaczników. Składnik może być znakowany którymkolwiek z kilku sposobów.. Najczęstszym sposobem wykrywaniajest użycie autoradiografii ze związkami znakowanymi ³H, ^l25I, o, c lub ^P itp.

Wybór izotopu radioaktywnego zależy od preferencji badawczych wskutek łatwości syntezy, zmieniającej się stabilności i okresów' półtrwania wybranych izotopów. Inne nieradioaktywne znaczniki obejmują ligandy, które wiążą się do znakowanych przeciwciał, fluoroforów, środków chemiluminescencyjnych, enzymów i przeciwciał, które mogą służyć jako człony pary specyficznie wiążącej dla znakowanego ligandu. Wybór znacznika zależy od wymaganej czułości, łatwości sprzęgania ze związkiem, wymogów trwałości i dostępnego sprzętu.

Znaczniki nieradioaktywne są często dołączane za pomocą środków pośrednich. Zasadniczo, cząsteczka ligandu (np. biotyna)jest wiązana kowalencyjnie do cząsteczki. Następnie ligand wiąże się z cząsteczką antyligandu (np. streptawidyną), która jest inherentnie wykrywalna lub kowalencyjnie związana z układem sygnału, takimjak wykrywalny enzym, związek fluorescencyjny, lub związek chemiluminescencyjny. Ligandy i antyłigandy można zmieniać w szerokim zakresie. Gdy ligand ma naturalny antyligand, np. biotynę, tyroksynę i kortyzol, można go użyć w połączeniu ze znakowanymi, występującymi naturalnie antyligandami.

Alternatywnie, jakikolwiek związek haptenowy lub antygenowy można użyć w połączeniu z przeciwciałem.

Uprzednio wspomniany znacznik może być również enzymem lub innym białkiem obecnym w komórce, której adhezję należy inhibitować. Ilość tego enzymu może być zatem użyta jako znacznik dla określenia ilości wiązania. Myeloperoksydaza jest jednym z takich białek . obecnych w komórkach HL-60, które są przydatne jako znacznik w badaniach inhibitowania wiązania opisywanych poniżej.

Cząsteczki SLeX można również sprzęgać bezpośrednio ze związkami wytwarzającymi sygnał np. przez sprzęganie z enzymem lub fluoroforem. W pierwszym rzędzie przydatnymi enzymami w charakterze znaczników sąhydrolazy, zwłaszcza fosfatazy, esterazy i glikozydazy, lub oksydoreduktazy, zwłaszcza peroksydazy. Związki fluorescencyjne obejmują fluoresceinę i jej pochodne, rodaninę i jej pochodne, dansyl, umbeliferon itp. Związki chemiluminescencyjne obejmują lucyferynę i 2,3-dihydroftalazynodiony np. luminol. Odnośnie przeglądu różnych układów wytwarzających sygnał, które mogą być użyte, zob. opis patentowy USA nr 4 39i 904, załączony do niniejszego tekstu jako odsyłacz.

D. Kompozycje farmaceutyczne.

176 272

Rozpatruje się również kompozycję farmaceutyczną, zawierającą omawiany związ.ek-analog SLeX rozpuszczony lub dyspergowany w farmaceutycznie dopu^^^i^c^^idnym nośniku, lub rozcieńczalniku. Kompozycja taka zawiera inhibitującą adhezję komórki ilość uprzednio omawianego, rozpatrywanego związku-analogu SLeX.

Rozpatrywaną kompozycję farmaceutyczną można użyć do blokowania lub inhibitowania adhezji komórkowej związanej z pewną liczbą zakłóceń. Np. szereg zaburzeń typu zapalnego wiąże się z eks^rt^t^^i^ono^t^^^^iymi w naczyniowych śródbłonkowych komórkach i płytkach. Określenie zapalenie stosuje się w niniejszym tekście do reakcji zarówno specyficznych jak i niespecyficznych układów obronnych. Specyficzna reakcja obronna układu jest specyficzną reakcją układu immunologicznego na antygen.

Przykładowe specyficzne reakcje układu obronnego obejmują odpowiedź przeciwciała, takie jak wirusy oraz nadwrażliwość opóźniona. Niespecyficzna reakcja układu obronnego jest reakcją zapalną za pośrednictwem leukocytów zasadniczo niezdolnych do pamięci immunologicznej. Komórki takie obejmują makrofagi, eozynofile i neutrofile. Przykłady niespecyficznych reakcji obejmują bezpośredni obrzęk wskutek żądła pszczoły i zbiór leukocytów PMN w miejscach infekcji bakteryjnej (np. infiltraty płucne w bakteryjnym zapaleniu płuc i tworzenie ropy w ropieniach).

Inne zaburzenia, które można leczyć obejmują np. reumatoidalne zapalenie stawów, uszkodzenie tkanki po niedokrwieniu za pośrednictwem leukocytów (uraz reperfuzyjny), uraz lub wstrząs odmrożeniowy, ostry uraz płucny za pośrednictwem leukocytów (np. zespół zaburzeń oddechowych dorosłych), astma, wstrząs urazowy, wstrząs septyczny, nephritis, oraz ostre i chroniczne zapalenie, w tym zapalenie skóry atopowe, łuszczyca, zapalna choroba jelit. Można również leczyć różne patologie związane z pośrednictwem leukocytów, takie jak miażdżyca tętnic i wykrzepianie. Ponadto, przerzuty nowotworu można inhibitować lub im zapobiegać przez inhibitowanie adhezji cyrkulujących komórek rakowych. Przykłądy obejmują raka okrężnicy i czerniak.

Przykładowo, uraz reperfuzyjny, jest szczególnie wrażliwy na działanie rozpatrywanej kompozycji farmaceutycznej. Kompozycja, która inhibituje oddziaływanie P-selektyna-]igand może być szczególnie przydatna w leczeniu lub zapobieganiu urazu reperfuzyjnego. Rozpatrywaną kompozycję farmaceutyczną można stosować profilaktycznie przed operacjami serca dla lepszego leczenia pooperacyjnego.

Ponieważ P-setektynajest przechowywana w ciałkach Weibel-Palade płytek krwi i komórek śródbłonkowych i jest uwalniania po aktywowaniu przez trombinę, by pośredniczyć w adhezji neutrofilów i monocytów, inhibitory oddziaływania P-sclektynaalgand mogą być szczególnie przydatne przy minimalizacji uszkodzeń tkanki, które często towarzyszą zaburzeniom trombotycznym. Np., inhibitory mogą mieć wartość terapeutyczną u chorych, którzy ostatnio przebyli wylew, zawał mięśnia sercowego, głęboką zakrzepicę żył, zator tętnicy płucnej itp. Związki te są szczególnie przydatne w terapii pretrombolitycznej.

Rozpatrywana kompozycja znajduje szczególne zastosowanie w leczeniu wtórnych efektów wstrząsu septycznego lub rozsianej s^r^e^oliny wewnątrznaczyniowej (DIC). Migracja leukocytów do tkanek podczas szoku septycznego lub DIC często powoduje destrukcję tkanki patologicznej. Ponadto, chorzy ci mogą mieć rozpowszechnioną skrzeplinę mikrocyrkulacyjną i rozsiewać zapalenie. Kompozycja terapeutyczna według niniejszego zgłoszenia inhibituje migrację leukocytów w tych miejscach i łagodzi uszkodzenie tkanki.

Inhibitor oddziaływania selektym-Hgand komórkowego SLeX jest również przydatny w leczeniu szoku traumatycznego i ostrego uszkodzenia tkanki związanego z nim. Ponieważ selektyny odgrywają rolę w uzupełnianiu leukocytów w miejscach urazu, zwłaszcza E-selektyna w przypadkach ostrego urazu i zapalenia, jej inhibitory mogą być podawane lokalnie lub systemowo, by kontrolować uszkodzenie tkanki związane z takimi urazami. Ponadto, wskutek specyficzności takich inhibitorów dla miejsc zapalenia, np. gdzie są ekjpresjonowane receptory ELAM-1, kompozycje te mogą być bardziej skuteczne i powodujące mniej powikłań w porównaniu z trądycyynymi środkami przeciwzapalnymi.

Zatem niniejszy wynalazek dostarcza też kompozycję farmaceutyczną, którą można użyć w leczeniu wspomnianych uprzednio stanów chorobowych. Rozpatrywana kompozycja farmaI76 272 ceutyczna obejmuje uprzednio opisany związek-analog SLe^x, który inhibituje oddziaływanie między ligandem komórkowego SLe^x i receptorem selektyny, który to związekjest rozpuszczony lub dyspergowany w dopuszczalnym farmaceutycznie rozcieńczalniku. Rozpatrywana kompozycja farmaceutyczna nadaje się do stosowania w szeregu systemach podawania leków. Krótki przegląd obecnych metod podawania leków zawarto w: Langer, Science, 249:-527-33 (i990).

W świetle złożoności reakcji zapalnej u ssaków, specjalista z łatwością dojdzie do wniosku, że rozpatrywana kompozycja farmaceutyczna może ponadto obejmować inne składniki, o których wiadomo, że interferują z funkcjonowaniem innych cząsteczek adhezji komórkowej. Np., uważa się, że składniki rodziny integryny cząsteczek adhezyjnych odgrywają rolę w wynaczynieniu leukocytów w miejscach infekcji. Przegląd adhezji międzykomórkowej, w tym receptorów selektyny, i ich roli-funkcji immunologicznej zawarto w: Springer, Nature, 346,425-434 (-990). Ponadto, pomyślne leczenie przy użyciu rozpatrywanej kompozycji farmaceutycznej można również określić przez stan rozwoju leczonego stanu chorobowego. Ponieważ różne cząsteczki adhezyjne mogą być regulowane w górę lub w dół w odpowiedzi na różnorodne czynniki w trakcie choroby lub stanu chorobowego, specjalista dojdzie do wniosku, że różne kompozycje farmaceutyczne mogą być wymagane do leczenia różnych stanów zapalnych.

W przypadku kompozycji farmaceutycznej obejmującej związek-analog SLeX, który wiąże się z receptorami selektyny i inhiaituje wiązanie do niego przez komórki, zawierające ligand SLeX, dawka związku zmienia się zgodnie z np. konkretnym związkiem, sposobem podawania, konkretną chorobą leczoną i jej ostrością, ogólnego zdrowia i stanu chorego oraz oceny przepisującego lekarza. Np. w leczeniu urazu reperuzyjnego, dawka rozpatrywanego związkuanalogu SLeXjest w zakresie od około 50 pg do I0 000 mg/dzień dla chorego o wadze 70 kg. W idealnym przypadku, podawanie lecznicze powinno się rozpocząć jak najszybciej po zawale mięśnia sercowego lub innym urazie. Kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona dla podawania pozajelitowego, miejscowego, doustnego lub lokalnego, takiego jak w aerozolu lub transdeirnalne, profilaktycznie i/lub leczniczo. Kompozycję farmaceutyczną można podawać w rozmaitych formach dawekjednostkowych zależnych od sposobu podawania. Np., formy dawek jednostkowych odpowiednie dla podawania doustnego obejmują proszek, tabletki, pigułki, kapsułki i drażetki.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna jest podawana dożylnie. Zatem wynalazek ten daje kompozycję dla dożylnego podawania obejmującą roztwór rozpatrywanego związku-analogu SLeX rozpuszczonego lub dyspergowanego w farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalniku (nośniku), korzystnie nośniku wodnym. Można zastosować szereg nośników wodnych np. wodę, wodę buforowaną, solankę 0,4%. Kompozycje te można steiryizować dobrze znanymi konwencjonalnymi sposobami st^i^y^izacji lub mogą być steryhiie filtrowane. Uzyskiwane roztwory wodne mogą być pakowane bezpośrednio do użytku lub mogą być liofilizowane, przy czym liofilizowany preparat jest przed podawaniem łączony ze sterylnym roztworem wodnym. Kompozycja może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze wymagane dla przybliżenia warunków fizjologicznych, takie jak środki dopasowujące pH i buforujące, środki dostosowujące toniczność roztworu, środki zwilżające itp. np. octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, monolaurynian sorbitanu, oleinian trietanoloamny itp.

Stężenie stosowanego związku-analogu SLeX zwykle wynosi lub wynosi co najmniej około -% aż do 10-30% wag. i jest dobierane w pierwszym rzędzie na podstawie objętości, lepkości płynów itp. odpowiednio do konkretnego wybranego trybu podawania. Jak opisano powyżej, składniki kompozycji można podawać poprzez preparaty liposomowe.

Zatem, typowa kompozycja farmaceutyczna dla podawania dożylnego może zawierać do 250 ml steiylnego roztworu Ringera i 25 mg związku-analogu SLeX. Faktyczne sposoby wytwarzania związków podawanych pozajelitowo są znane lub oczywiste dla specjalistów z dziedziny techniki i są opisane szczegółowo np. w: Remington's Pharmaceutical Sciences, I7 wyd., Mack Publishing Company, Easton, PA (-985), załączonym do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz.

I76272

W przypadku kompozycji w ciele stałym, można użyć konwencjonalne nietoksyczne rozcieńczalniki stałe (nośniki), które obejmują np. substancje klasy farmaceutycznej, takie jak: mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharyna sodowa, talk, celuloza, glukoza, sacharoza, węglan magnezu itp. W przypadku podawania doustnego, farmaceutycznie dopuszczalna nietoksyczna kompozycja jest tworzona przez włączenie dowolnej z normalnie stosowanych zarobek, takich jak nośniki uprzednio wymienione, oraz zasadniczo i 0-95% składnika aktywnego, tzn. uprzednio opisanego związku-analogu SLeX korzystnie około 20% (zob. Remington's, powyżej).

W przypadku podawania w postaci aerozolu, rozpatrywany związ.ek-analog SLe^x jest korzystnie dostarczany w postaci delikatnie rozdrobnionej wraz ze środkiem powierzchniowo czynnym i propelantem. Typowe udziały procentowe związku analogu SLeX wynoszą od około 0,5 do około 30% wag. i korzystnie około - do około i0% wag. Środek powierzchniowo czynny musi oczywiście być nietoksyczny, a korzystnie - rozpuszczalny w propelancie. Przykładami takich środków są estry lub częściowe estry kwasów tłuszczowych, zawierających od 6 do 22 atomów węgla, takich jak kapronowy, kaprylowy, laurynowy, palmitynowy, stearynowy, linolowy, linolenowy, olesterowy i oleinowy z alifatycznym alkoholem wielowodorotlenowym lub jego cykliczny bezwodnik, taki jak np. glikol etylenowy, glicerol, erytritol, arabitol, mannitol, sorbitol, bezwodniki heksytolu wyprowadzone z sorbitolu, oraz pochodne estrowe polioksyetylenu i polioksypropylenu.

Można również zastosować estry mieszane, takie jak glicerydy mieszane lub naturalne. Środek powierzchniowo czynny może stanowić około 0,1 do około 20% wag. kompozycji, a korzystnie około 0,25 do około 5%. Kompozycjajest zwykle bilansowana za pomocą propelanta. Propelanty upłynniane są w typowym przypadku gazami w warunkach otoczenia i są kondensowane pod ciśnieniem. Spośród odpowiednich upłynnionych propelantów należy wymienić niższe alkany, zawierające do 5 atomów węgla, takie jak butan i propan, i korzystnie fluorowane lub fluorochlorowane alkany. Można stosować również mieszaniny powyższych składników. Przy wytwarzaniu aerozolu, pojemnik wyposażony w odpowiedni zawór jest napełniany odpowiednim propelantem, zawierającym subtelnie rozdrobnione związki i środek powierzchniowo czynny. Składniki są zatem utrzymywane pod podwyższonym ciśnieniem do chwili uwolnienia wskutek działania zaworu.

Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca związek-analog SLeX może być podawana profilaktycznie i/lub leczniczo. W zastosowaniach leczniczych, kompozycja jest podawana choremu już cierpiącemu na chorobę, jak opisano powyżej, w ilości wystarczającej do inhibttowania wiązania między komórkami eksprestoπującymi selektynę i neutrifile; tzn. wyleczenie lub co najmniej częściowe zahamowanie symptomów choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednia do uzyskania tego jest określona jako dawka terapeutycznie skuteczna lub ilość inhibitująca adhezję komórkową. Ilości skuteczne dla tego zastosowania zależą od ciężkości choroby i wagi oraz ogólnego stanu chorego, lecz zasadniczo sięgają od około 0,5 mg do około -0 000 mg związku-analogu SLeX na dzień dla chorego o wadze 70 kg, przy najczęściej stosowanych dawkach od około 5 mg do około 2 000 mg związku/dzień.

W zastosowaniach profilaktycznych kompozycja, zawierająca rozpatrywany związek jest podawana choremu podatnemu na chorobę lub któremu w inny sposób grozi konkretna choroba. Taka ilość jest określona jako dawka profilaktycznie skuteczna i jest również ilością wystarczającą do inhibitowania adhezji (wiązania) komórek, zawierających SLeX do selektyny. W tym zastosowaniu, dokładne ilości znów zależą od stanu zdrowia i wagi chorego, lecz zasadniczo sięgają od około 0,5 mg do około 5 000 mg na chorego o wadze 70 kg, częściej od około 5 mg do około 2 000 mg na chorego o wadze 70 kg.

Inny sposób oceny ilości inhibitującej adhezję rozpatrywanego związku-analogu SLeX polega na porównaniu inhibitowania wiązania przez związek-analog SLeX i przez sam SLeX. Dogodnym sposobem porównania jest użycie IC50 (stężenie niezbędne do inhibitowania wiązania o połowę) dwóch porównywanych materiałów, i odnieść użytą ilość do ilości SLeX i ilości związku-analogu SLeX, która jest wielokrotnością wartości IC50 dla tego związku.

W typowym przypadku, dla związku, którego IC50 wynosi około jedną-dziesiątą wartości dla samego SLeX, gdy użyje się dziesięciokrotną ilość molową SLeX daje to przydatną ilość

176 272 inhibitującą adhezję, komórkową. Korzystnie, ilość ta stanowi czterokrotną wielkość ilości SLeX. Zwłaszcza, ilość równa wartości dla SLeX Najkorzystniej, jak to jest w przypadku większości związków-anologów SLeX opisanych w tym zgłoszeniu, użyta ilość jest mniejsza niż ilość użytego SLeX, to jest około jedna druga do około jednej dziesiątej ilości moli samego SLeX.

Pojedyncze lub wielokrotne podawanie kompozycji można przeprowadzić przy poziomach i schemacie dawek wybranych przez lekarza prowadzącego leczenie. W każdym razie, kompozycje farmaceutyczne powinny dostarczyć ilość związku analogu SLeX wystarczającą do skutecznego leczenia chorego.

Związki mogą również znaleźć zastosowanie jako odczynniki diagnostyczne. Np. związki znaczone można .stosować do umiejscawiania obszarów zapalenia lub przerzutów nowotworów ^{J r r} P5 14 u chorego podejrzanego o zapalenie. Do tego zastosowania, związki można znakować Μ, C lub trytem.

Przykład 1. N-benzyloglikozyd laktulozy (Związek 1).

Trój szyjną kolbę okrągłodenną (500 ml) zanurzono w łaźni z lodem i załadowano laktulozę (23,9 g, 69,8 mmoli) i benzylaminę (109 ml, 526 mmoli, 7,5 równoważn.). Następnie kolbę zamknięto i mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego. Łaźnię z lodem pozostawiono do topnienia lodu i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do powolnego ogrzania do temperatury pokojowej. Rozpuszczenie substancji stałej nastąpiło w ciągu kilku godzin i mieszanina reakcyjna zabarwiła się na żółto. TLC (chromatografię cienkowarstwową) (60:50:15 CHCl3:MeOH:15 mM CaCL) można użyć do monitorowania postępu reakcji (laktuloza Rf = 0,45, produkt Rf = 0,75, wizualizacja za pomocą orcinolu).

Reakcja przebiegała powoli i okazało się, że przebiegła całkowicie w ciągu 5-7 dni. Gdy stwierdzono, że reakcja przebiegała całkowicie, mieszadełko usunięto z kolby, w kolbie zainstalowano głowicowe mieszadło mechaniczne i kolbę zanurzono w łaźni z lodem. Następnie dodano heksan (250 ml) do kolby i mieszaninę mieszano intensywnie przez około 60 sekund. Mieszanie następnie przerwano i mieszaninę pozostawiono do rozdziału na dwie odrębne warstwy (Rozdział ten trwa od 15 minut do jednej godz.). Wtedy górną warstwę heksan/benzylamina usunięto przez rurkę za pomocą ssania. Ekstrakcję benzylaminy powtórzono jeszcze dwukrotnie przy użyciu heksanu (porcje 250 ml), a następnie przeprowadzono jeszcze trzykrotnie przy użyciu porcji 250 ml eteru dietylowego (wszystkie ekstrakcje wykonano na lodzie).

Po wykonaniu tych ekstrakcji pozostała lepka bladożółta pozostałość. Substancję tę rozpuszczono w etanolu (300 ml) i przeniesiono do 2-itrowej jednoszyjnej kolby okrągłodennej. Żółty roztwór zatężono przez odparowanie rotacyjne do gęstego syropu. Następnie aceton (czysty do analizy) (1000 ml) szybko mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego w 0°C, i na roztwór następnie powoli działano przy użyciu syropu etanolowego. Gdy powoli dodawano syrop, zaczął się tworzyć mleczny biały osad. Po zakończeniu dodawania, kolbę zamknięto i przechowano przez noc w zamrażarce w -20°C (około 18 godz.). Po wyjęciu z zamrażarki, pojawiła się zbita biała substancja stała na dnie kolby, a ciecz nad osadem była klarowna i żółta. Następnie roztwór zdekantowano i z surowego stałego Związku 1 usunięto resztkowy aceton przy użyciu wysokiej próżni. Produkt (Związek 1) jest bardzo nietrwałą substancją stalą, którą użyto bezpośrednio w następnej reakcji.

Przykład 2. N-benzylolaktozamina, sól addycyjna z kwasem octowym (Związek 2).

Surowy produkt (Związek 1) z powyższego przykładu (30,1 g, 69,8 mmoli, teoretycznie) rozpuszczono w 1000 ml metanolu (czysty do analizy) i mieszano w temperaturze pokojowej. Następnie dodano kwas octowy lodowaty (4 ml, 70 mmoli) i kolbę zamknięto. Bladożółtą mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej i monitorowano za pomocą TLC w tym samym układzie rozpuszczalnikowym, jak opisano powyżej. Produkt - Związek 2 pojawił się przy Rf =0,65 (resztkową laktulozę dało się zauważyć za pomocą TLC od początku tej reakcji, lecz nie wydaje się, by jej ilość wzrosła zasadniczo w miarę postępu reakcji). Gdy stwierdzono za pomocą TLC, że Związek 1 był całkowicie zużyty (24-48 godz.), 100 |±L wyjęto z mieszaniny reakcyjnej i odparowano w strumieniu argonu. Żółtą pozostałość następnie rozpuszczono w CD3OD i odparowano ponownie do żółtej pozostałości. Pozostałość następnie rozpuszczono w D 2O i zanalizowano za pomocą ¹ H-NMR.

17s 272

Ten surowy roztwór Związku 2 użyto następnie w następnej reakcji. W celu obliczenia wydajności, małą część znanej objętości można usunąć z mieszaniny reakcyjnej, zatężyć do suchości, rozpuścić w H2O, doprowadzić do pH >10 i poddać chromatografii przy użyciu chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z odwróconymi fazami najpierw wymywając przy użyciu H2O, a następnie przy użyciu 2:1 H2O:MeOH. Typowe wydajności z laktulozy wyniosły 50-55%.

(300 MHz, δ w ppm względem HOD): 7,44 (m, 5H), 5,49 (d, J=3 Hz, 1H), 5,05 (d, J=8 Hz, 1H), 4,39 (d, J=7 Hz, 1H), 4,38 (d, J=8 Hz, 2H), 4,35 (d, J=7 Hz, 1H), 4,10-3,5 (m,

11H), 3,24 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 3,00 (dd, J=8 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,87 (s, 3H).

Przykład 3. Laktozamina, sól addycyjna z kwasem octowym (Związek 3).

2d1trowąkolbę, zawierającą surowy kwaśny metanolowy roztwór Związku 2 z poprzedniej reakcji wyposażono w kran trójdrożny i przeprowadzono trzykrotnie przez cykl argonu/próżni/czyszczeniaprzy użyciu butli argonu i instalacji próżniowej. Kolbę otworzono i dodano 10%> pallad na węglu (7,4·g, s,98 mmoli). Kolbę następnie powtórnie ·wyposażono w kran trójdrożny i przeprowadzono trzykrotnie przez cykl próżni/czyszczenia przy użyciu gazowego wodoru. Następnie mieszaninę reakcyjną utrzymywano w atmosferze wodoru przy użyciu butli. Reakcję monitorowano ściśle za pomocą TLC (Rf produktu = 0,2). Gdy zużyto materiał wyjściowy, pobrano —10 μ1 próbkę, umieszczono w rurce Eppendorf, odwirowano w mikrowirówce, klarowną ciecz nad osadem usunięto i użyto do przygotowania próbki NMR, jak w przypadku ostatniej reakcji. Gdy NMR pokazał całkowity zanik Związku 2, zawiesinę przesączono przez wkładkę z celitu na spiekanym lejku szklanym o średniej porowatości przy użyciu metanolu. Klarowny żółty roztwór następnie zatężono przez odparowanie rotacyjne do 140 ml w 500 ml kolbie okrągłodennej i użyto surowy produkt w następnej reakcji.

Związek 3: ^JH-NMR (300 MHz, δ w ppm względem HOD): 5,40 (d, J=3 Hz, 1H), 4,90 (d, J=8 Hz, 1H), 4,41 (d, J=8 Hz, 1H), 4,00-3,5 (m, 11H), 3,28 (dd, J=3 Hz, J=8 Hz, 1H), 2,98 (dd, J=7 Hz, J=8 Hz, 1H).

Przykład 4. 2-Deoksy-2-(2'-kίakoksy)-benzamido-4-O-β-D-gllaktop iranozylo-βD-glukopiranozyd(Związek4)i 1,3,6-tri-O-aceeylo-2-deoksy-2-afalimido-4-O-(2,3,4,6-tetra-0aceΛy1o-β-D-galaktopiranozy1o)-β-D-alllkopiranoz.yd (Związek 5).

Surowy kwaśny metanolowy roztwór Związku 3 rozcieńczono przy użyciu 14 ml H2O i działano przy użyciu węglanu sodu (29,7 g, 280 mmoli), a następnie bezwodnika ftalowego (20,7 g, 140 mmoli). Reakcję obserwowano starannie, ponieważ początkowo występowało pewne spienienie. Po czterech godz., reakcja została zakończona i zawiesinę przesączono przez lejek ze spiekanego szkła, by usunąć resztkowy materiał oparty na ftalanie i węglanie sodu. Przesącz następnie zatężono do pasty najpierw przez odparowanie rotacyjne, a następnie pod wysoką próżnią uzyskując Związek 4. Usunięcie śladowych ilości metanolu i H2O pozostałych w materiale jest sprawą zasadniczą, by uniknąć reakcji ubocznej przy użyciu bezwodnika octowego w następującej po tej reakcji acetylacji.

Gdy stwierdzono, że substancja jest dostatecznie sucha, dodano pirydynę (212 ml), a następnie bezwodnik octowy (10s ml, 1,12 mola). Mieszaninę początkowo wytrząsano ręcznie, by ułatwić rozpuszczanie, lecz po wystąpieniu początkowej egzotermy, rozpuszczanie przebiegało bez problemu; następnie użyto mieszadło magnetyczne. Po mieszaniu przez noc (około 18 godz.), TLC w 20:1 CHCtyMeOH wskazało na przewagę jednej głównej plamy aktywnej W, wspólnej z plamą autentycznego Związku 5. Roztwór ochłodzono do 0°C, podziałano na roztwór 32 mli^O, i mieszano przez 15 min., by shydrolizować nadmiar bezwodnika octowego. Roztwór następnie rozcieńczono do 1000 ml przy użyciu dichlorometanu i przemyto (3 x 1000 ml) przy użyciu 2N HCl, (3 x 1000 ml) przy użyciu nasyconego NaHC03, i (1 x 1000 ml) przy użyciu nasyconego NaCl. Roztwór organiczny następnie osuszono (MlgSO.f), przesączono i zatężono do surowego produktu. Następnie wykonano Ή-NMR w CDCI3, który wskazał na mieszaninę α- i β-anomerów około 1:1. Ten surowy produkt rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu (około 30 ml) i wykrystalizowano w czasie rzędu minut. Po pozostawieniu w temperaturze pokojowej przez kilka godz., ciało stałe zebrano przez sączenie i wypłukano przy użyciu lodowatego metanolu. Po wysuszeniu produktu na powietrzu, zebrano czysty Związek 5 (5,s g, 10,4%) jako biały proszek.

I76 272 (300 MHz, δ w ppm względem CHCb): 7,90-7,70 (m, 4H), 6,50 (d, J=8 Hz, 1H), 5,83 (dd, J=i0 Hz, J=8 Hz, 1H), 5,36 (d, J=3,5 Hz, 1H), 5,i5 (dd, J=8 Hz, J=10,5 Hz, IH), 4,97 (dd, J=10 Hz, J=3,5 Hz, IH), 4,56-3,83 (m, 9H), 2,204,90 (7s, 2IH).

Przykład 5. Przemiana 1,3,6-tri-O-acetylo-2-deoksy-2-fallmldo-4-O-(2,3,4,6-tetraO-acetylo- β-D-galaktopiranozylo)-β-D-al^ukopiranozyd do Związku 5.

Roztwór macierzysty zawierający α-octan z omawianej powyżej kryst;^dizacji Związku 5 zatężono do piany i rozpuszczono w dMf (110 ml). Roztwór ten mieszano w atmosferze argonu w 55°C. Następnie dodano octan hydrazyniowy (9,5 g, I04 mmole). Po I5 min. TLC (20:i CHCb:MeOH) wskazało na całkowity zanik materiału wyjściowego i pojawienie się plamy o nieco niższym Ri. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i rozcieńczono do I000 ml przy użyciu octanu etylu. Roztwór następnie przemyto (2xi000 ml) przy użyciu H2O i (ixi000 ml) przy użyciu nasyconego NaCl. Fazy organiczne osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono.

Surowy zatężony produkt rozpuszczono w pirydynie (50 ml) i podziałano nań przy użyciu bezwodnika octowego (25 ml). Po mieszaniu przez noc (około i8 godz.), TLC w 20:1 CHCb:MeOH wskazało na przewagę jednej głównej plamy aktywnej W, występującej razem z plamą autentycznego Związku 5. Roztwór ochłodzono do zera °C, działano przy użyciu 7,5 ml H2O, i mieszano przez I5 min. by shydrolizować nadmiar bezwodnika octowego. Roztwór rozcieńczono do 250 ml przy użyciu dichlorometanu i przemyto przy użyciu 2N HCl (3x250 ml) przy użyciu nasyconego NaHCCb (3x250 ml), i przy użyciu nasyconego NaCl (ix250 ml). Roztwór organiczny osuszono (MgSO 4), przesączono, i zatężono do surowego produktu. Surowy produkt następnie rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu i ponownie nastąpiła krystalizacja. Po kilku godz., stały Związek 5 wyodrębnionojak poprzednio, uzyskując drugi rzut produktu (4,4 g, 8,3%) jako biały proszek. Całkowita wydajność Związku 5 dla dwóch rzutów: i 8,7%, I0 g.

Przykład 5A. Alternatywne wytworzenie Związku 5 z laktulozy.

A. Związek i A - aminoglikozyd laktulozy.

Autoklaw (300 ml; stal nierdzewna; z mieszadłem) zawierający laktulozę (i7,i g, 50 mmoli), i octan amonu (3,85 g, 50 mmoli) ochłodzono do -78°C i dodano 80 ml ciekłego amoniaku. Autoklaw uszczelniono i pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej, mieszając. Gdy autoklaw osiągnął temperaturę pokojową, umieszczono go w łaźni olejowej i ogrzano do 35°C przez 24 godz. Następnie autoklaw ochłodzono do temperatury pokojowej i starannie odpowietrzono do atmosfery. Po rozproszeniu całości amoniaku, około dwie godz., cały autoklaw umieszczono w próżniowym eksykatorze zawierającym pięciotlenek fosforu i starannie umieszczono pod wysoką próżnią. Po utrzymywaniu pod wysoką próżnią przez noc, zawartość autoklawu stała się bladożółtą pianą. Związek był całkiem higroskopowy i został szybko usunięty z autoklawu i umieszczony w uszczelnionym słoju. Surowy materiał użyto w następnej reakcji.

B. Octan laktozaminy (Związek 2A).

Aminoglikozyd laktulozy (Związek 10) (3,41 g, 10 mmol) rozpuszczono w 100 ml bezwodnego metanolu i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu. Następnie dodano kwas octowy lodowaty (572 ul, 10 mmoli). Po 24 godz. żółty roztw'ór zatężono do piany, co do której okazało się, że zawiera sól addycyjną laktozaminy z kwasem octowym jako mieszaninę α i β anomerów 1:1. Stwierdzono dwa inne produkty, za które uważa się anomery α i β galaktopiranozylu mannozaminy. Produkt surowy użyto w następnej reakcji.

Następnie Związek 5 wytworzono ze Związku 2A, przy użyciu surowego materiału otrzymanego w etapie B, powyżej, stosując procedury Przykładu 4 przy skali około 1/74/10. Aceton stanowił około jednej-trzeciej rozpuszczalnika użytego do półkwasu ftalamidu. Ostatecznie wytworzony ftalimid peracetylu (Związek 5) wytworzono z wydajnością 3,8% opartą na laktulozie, bez drugiego rzutu kryształów.

Przykład 6. I-chl()ro-3,6-dl-O-acelylo-2-deoksy-2-alalimido-4-O--2,3,4,6-tetra-Ot acetylo-β-D-galaktopiranozylo)-β-D-allkopiranozyd (Związek 6).

Anomeryczny octan (Związek 5) (3,3 g, 4,3 mmole) mieszano w 43 ml suchego CH2Cb w atmosferze argonu w temperaturze pokojowej. Następnie dodano trójchlorek glinu (2,9 g, 21,5 mmoli) jako ciało stałe. Po 40 min., mieszaninę opłukano w lejku rozdzielającym do objętości

I76 272

400 ml w -:i CH2Cl2:H₂O. Mieszaninę wytrząsano, usunięto fazę wodną, i roztwór organiczny przemyto 2x200 ml przy użyciu H₂O i 3x200 ml przy użyciu nasyconego roztworu NaHCO3. Następnie klarowny bladożółty roztwór osuszono (MgSO4), przesączono i zatężono do bladożółtego proszku (3,2 g, -0096). Materiał ten następnie użyto dla kondensacji w Przykładzie 7.

Przykład 7. Etylo-β-D-kallrkopiranozyd (Związek 7).

Roztwór bromku 2,3,4,6-tetra-O-kretylogaraktozylu (2,5 kg) w dichlorometanie (4 l) dodawano z szybkością 20-25 ml/min do reaktora załadowanego węglanem srebra (3,-3 kg, i - ,4 moli), sitami molekularnymi 4A (2,37 kg), dichlorometanem (I61), i bezwodnym etanolem (4,0 l). Podtrzymywano intensywne mieszanie reagentów. Dwie godz. po całkowitym dodaniu roztworu bromku, TLC na żelu krzemionkowym rozwinięty przy użyciu układu: heksan:octan etylu -:i nie wykazywał obecności bromku. Wtedy mieszaninę rea^O<cyjną przesączono przez wkładkę z celitu (i kg), i przesącz odparowano w 30-35°C pod próżnią, uzyskując brązowy olej (-,95 kg). Olej suszono pod próżnią przez i7 godz.

‘H-Nt^lR (CDCb) δ: 5,36 (-H, d, J,4=3,7Hz, H-4), 5,-7 (IH, dd, J₂.3=ii, 0 Hz , H-2) , 4,99(-H, dd, H-3), 4,46(iH, d, J-2=8,3 Hz, H-i),2,-5,2,05,2,^, I,95(i2H, 4s, OAc), i,2-(3H, t, OCH2CH3).

Surowy galaktopiranozyd etylowo-tetraacdylowy (-,95 kg) rozpuszczono w bezwodnym metanolu (--71) i dodano kroplami 25% roztwór metanolanu sodu w metanolu (90 ml). Roztwór mieszano przez jedną godz., po którym to czasie TLC na żelu krzemionkowym rozwinięta przy użyciu układu: octan etylu : metanol (2:1) nie wykazała obecności materiału wyjściowego. Produkt miał Rf=0,6. Roztwór zneutralizowano przez dodanie żywicy Amberlite IR-i20 (H+) (0,6 kg) mieszając. Przy pH roztworu 6-7, żywicę usunięto przez sączenie i przesącz odparowano pod próżnią, uzyskując bladożółtą substancję stałą. Tę substancję stałą rozpuszczono we wrzącym etanolu (i- l). Uzyskany roztwór pozostawiono do ochłodzenia do 25°C, a następnie ochłodzono do zera °C, uzyskując biały osad. Sączenie tej substancji stałej dało β-D-galrktopk ranozyd etylu, Związek 7 (0,85i kg).

'H-NMR (D2O) δ: 4,38 (-H, d, Ji,2=8, 0Hz, H-i), 3,89 (-H, bd, J34=3,7Hz, H-4), i,2 (3H, t, OCH2CH3).

Przykład 8. 4,6-O-benzylideno-β-D-garίdctopiranozyd etylu (Związek 8).

etylu, Związek 7 (0,85i kg, 4,09 moli) załadowano do kolby rotovap (20 l) z kwasem toluenosulfonowym (-,5 g, 7,9 mmoli). Kolbę wyparki przymocowano do wyparki i acetal dimetylowy benzaldehydu (i,23 l, 8,i8 mol) dodano przez zasysanie. Kolbę z mieszaniną poddawano rotowaniu przez cztery godz. W czasie między 30 a 40 min. po dodaniu acetalu, otrzymano niemal całkowity roztwór, a następnie szybko pojawił się ciężki osad. Rotowanie kolby kontynuowano przez cztery godz., po którym to czasie triety Laminę (-,5 ml) dodano, by zneutralizować mieszaninę reakcyjną. Przyłożono próżnię i rozpuszczalnik usunięto, uzyskując stałą masę. Heksan (6 l) załadowano do kolby i kolbę z mieszaniną rotowano przez 0,5 godz. Uzyskaną substancję stałą przesączono i przemyto na filtrze przy użyciu heksan : eter etylowy -:i (2 l). Tak otrzymaną białą substancję stałą osuszono pod próżnią przez -7 godz., uzyskując czysty 4,6-O-benzylideno-β-D-gal;d:topiranozyd etylu, Związek 8 (i,0 kg, 3,38 moli) z wydajnością 83%.

¹ H-NmR (CDCI3) δ: 7,53(2H, m, aromaty), 7,37(3H, m, aromaty), 5,57(iH, s, CHPh), 4,29(iH, d, Ji,2=7, 0 Hz, H-i) , 4,2i-lH, d, J₃,4=3,27Hz, H^),, i,29(3H, t, OCH2CH3).

Przykład 9. 2-O-beIrexHL-4,6-O-benzylideno-β-D-galaatopiranozyd etylu (Związek 9).

4,6-O-benzylideno-β-D-garaktopiranozyd etylu, Związek 8 (0,924 kg, 3,i2 moli) umieszczono w 20-litowym reaktorze wyposażonym w przedmuchiwanie powietrzem, lejek służący do dodawania wyrównujący ciśnienie z wlotem gazu, łaźnię chłodzącą i wylot gazu. Przed zamknięciem kolby dodano dichlorometan (9,3 l) i pirydynę (2 l), co dało jednorodny roztwór. Lejek załadowano chlorkiem chloroacetylu (0,388 kg, 3,43 moli, 273 ml) w postaci 60% roztworu w dichlorometanie. Kolbę uszczelniono i rozpoczęto mały przepływ suchego azotu. Łaźnię ochłodzono do -65^OC ±5°C i mieszaninę reakcyjną mieszano 30 minut. Po tym czasie rozpoczęto dodawanie kroplami roztworu chlorku acylu z szybkością 3-4 ml na minutę. Po całkowitym dodaniu tego roztworu, mieszaninę reakcyj ną utrzymywano w -65°±5°C dodatkowo

176 272 przez jedną godz. Po tym czasie dodawano do mieszaniny reakcyjnej chlorek benzoilu (0,614 kg, 4,37 moli, 0,507 l) z szybkością 8-12 ml na minutę. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i pozostawiono na 17 godz. Mieszaninę reakcyjną przesączono, by usunąć osad soli, i przesącz zatężono pod próżnią, by usunąć większość dichlorometanu. Małą próbkę odłożono dla ^-NMR.

‘H-NMR (CDCb) δ: 5,75(1H, dd, J23=10,6Hz, H-2), 5,56(1H, s, CHPh), 5,25(1H, dd, J34=3,44Hz, H-3), 4,69(-H, d, J-=8,48Hz, H1), 4,48(1H, bd, H-4), -,-5(3H, t, OCH2H3).

Do koncentratu dodano wodę (180 ml) i uzyskaną mieszaninę mieszano przez dwie godz. w 40°C. Po tym czasie, mieszaninę reakcyjną dalej zatężono, uzyskując żółtą pozostałość, którą rozpuszczono w dichlorometanie (-- l) i przeniesiono do 50-litrowego ekstraktom. Roztwór organiczny sukcesywnie ekstrahowano przy użyciu lodowatego wodnego roztworu 0,5N HCl (11 l), wodnego nasyconego wodorowęglanu sodowego (11 l), i zimnej wody (11 l). Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu (1,0 kg), przesączono, i odparowano przesącz, uzyskując żółtą substancję stałą, którą osuszono pod wysoką próżnią. Reakcję tę monitorowano za pomocą TLC na żelu krzemionkowym rozwiniętej przy użyciu mieszaniny heksan : octan etylu 1:-. Tę substancję stałą rozpuszczono w gorącym etanolu (9,5 l) co, po ochłodzeniu i sączeniu, dało 2A^-^xn/oi0a4,6'Ό--benz.ylideno-β-D-galaatopirrmozyd etylu, Związek 9 (0,737 kg, -,85 mol) z wydajnością 59%.

^lH-NMR (CDCb) δ: 5,59 (-H, s, CHPh), 5,36 (1H, dd, J2,)=-0,07 Hz, H-2 ), 4,64 (1H, d, J-,2=8, 2- Hz, H-1), 1,-5 (3H, t, OC^CH^.

Aby potwierdzić, że benzoesan był w postaci C-2 i że C-3 miał wolną grupę hydroksylową, kroplę izocyjanianu trichloroacetylu dodano do próbki NMR i ponownie uzyskano widmo. Widmo to zawierało dublet dubletów w niskim obszarze pola przy 8=5,27 typowy dla H-3 galaktozy, która jest estryfikowana przy C-3. Oryginalny przesącz uzyskany z mieszaniny reakcyjnej zawierał dodatkowe ilości produktu.

Przykład 10. (β-D-galaktopiranozylo)-(1-4)-O-(2-N-allliokjykarbonylo-2-deokjy-βD-glukopiranozyło)-(1-3)-O-β-D-galίd<topiranozyd etylu (Związek 10).

Do mieszaniny 2-Oabϊn/oilo-4,6-O-benzylideno-β-D-galla<kopirίUlozydu etylu, Związek 9 (0,76 g, 1,9 mmoli), sit molekularnych 4A (2 g), dichlorometanu (-0 ml), kolidyny (0,278 ml, 2,1 mmoli), i trifluorometanosulfonianu srebra (0,522 g, 2 mmoli) ochłodzonej do -25^UC dodano kroplami roztwór chlorku 4-O--2,),4,6-tetra-O-acetylo-β-D-galaktopirano/ylo)-3,4,6-triO-acetylo-2-deoksy-2-atallmldo-β-D-glukopiranozylu (Związek 6; 1,484 g, 2 mmoli) rozpuszczony w dichlorometanie (5 ml). Uzyskaną mieszaninę mieszano i ogrzano do temperatury otoczenia po całkowitym dodaniu chlorku. Po dwóch godz., mieszaninę rozcieńczono przy użyciu dichlorometanu i przesączono. Przesącz przemyto sukcesywnie przy użyciu wodnego wodorosiarczynu sodu, wodnego roztworu kwasu solnego, wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, i ostatecznie, wody. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i odparowano, uzyskując stałą masę, którą rekIysjallzowano z mieszaniny dichlorometan:heksan.

Na uzyskany w pełni blokowany trisacharyd (0,66 g) podziałano przy użyciu 80% wodnego roztworu kwasu octowego (5 ml) w 80°C przez dwie godz., po którym to czasie rozpuszczalnik usunięto przez odparowanie. Pozostałość współodparowano przy użyciu toluenu-octanu etylu dwukrotnie, uzyskując pozostałość, którą rozpuszczono w etanolu (10 ml). Dodano hydrat hydrazyny (0,3 ml) i uzyskaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 17 godz., uzyskując osad, który pr/esą^z-ono, uzyskując po suszeniu stałą substancję (0,45 g). Tę stałą substancję rozpuszczono w mieszaninie metanol: woda 5: - i podziałano na mieszaninę przy użyciu dialilopirowęglanu (0,166 ml). Przezjedną godz. Uzyskaną mieszaninę odparowano i podzielono między dichlorometan i wodę. Warstwę wodną oddzielono i zatężono, uzyskując Związek -0 jako pozostałość, która zestaliła się po rozcieraniu przy użyciu mieszaniny octan etylu : aceton 2:1. Dało to tytułowy trisacharyd (Związek 10), który enzymatycznie sialilowano, uzyskując [(5-accltaηido-3,5alideokjy-α-D-glllceroD-aalaato-nonuJopirmnzyjonian jodu)]-(2-3)-O(β-D-aalaktopirruκ)/yl())-( 1 -4)-a)--2-N-alllioksj'karbonylo-2aleoksy -β-DallJ kopiirmozylo)-( - -3--O-βD-galaktopirano/yd etylu (Związek -1) identyczny z wytworzonym według następującej procedury.

I76 272

Przykład ii. [(5-acetamido-3,5-dideokty-α-D-gllcero-D-aalίakrt-aonulopiranozylonian sodu)]-(2a3)-O-(β-D-gallaίtopiranozylo)-( i -4a-O-(2-N-alliloksykarbnnyta-a-dekkya^aD glukopiranozylo)-(i-3)-O-β-D-aalaktopiranozyd etylu (Związek ii).

Poniższy tekst opisuje enzymatyczną przemianę disachaeydu (Związek 9) dla wytworzenia tytułowego związku (Związek --) przy użyciu transferazy galaktozylowej i transferazy .sialilowej.

Do wody (-2 l), dodano kwasu N-(2-hydroktyetylo)piperazyno-N'-[2-etanosulfonowego] (0,4i0 kg) i pH uzyskanego roztworu doprowadzono do 7,5. Dodano albuminę surowicy krwi bydlęcej (-7 g) i mieszaninę mieszano do uzyskania całkowitego roztworu. 3-O-(2-N-aΠlloktykarbonyl-2-amino-2-deoksy-β-D-glukopiranozylo)-β-D-galaakopiranozyd etylu (Związek 9) (0,3 kg), glukozo-i-fosforan (0,27i kg), fosfoenolopirogronian (0,-77 kg), chlorek potasu (0,087 kg), azydek sodu (8,4 g), i urydyno-5'-difosforan (8,76 g) dodano i uzyskaną mieszaninę mieszano do rozpuszczenia substancji stałych. Następnie dodano chlorek manganu (-M, 506 ml) i chlorek magnezu (i M, -68 ml). Następnie dodano kinazę pirogronianową (42,000 U), pirofosforylazę urydyIKw5+diiΌsforanoolikozową (2,000 U), nieorganiczną pirofosfatazę (8,400 U), epimerazę urydyno-5'-aifotSotanogal;a<iozylową (9-, 000 U), i transferazę urydyno-5'-difosforanogaaaktozową (8 850 U). Końcową objętość mieszaniny reakcyjnej doprowadzono przy użyciu wody do -7 l. Po 48 godz. dodano chlorek magnezu (i M, 340 ml). Reakcję monitorowano za pomocą TLC na żelu krzemionkowym rozwiniętej przy użyciu mieszaniny izopropanoo: i M octan amonu 4:i. Po 8-9 dniach TLC wskazało na to, że reakcja przebiegła w >95%, po którym to czasie przyrządzono następujący roztwór.

Przyrządzono roztwór kwasu N-(2-hydroksyetylo]-piperazynowego-N'[2-etanosulfonowego] (0,528 kg) w wodzie (i5 l) i pH uzyskanego, roztwór doprowadzono do 7,5. Dodano albuminę surowicy krwi bydlęcej (22 g), azydek sodu (ii,5 g), kwas sialowy (0,242 kg), fosfoenolopirogronian (0,395 kg), cytydyno^-monofosforan (25 g), adenozyno-5'-trifosforan (4,7 g), chlorek manganu (-M, 780 ml). Do tego roztworu dodano kinazę pirogronianową (207, 000 U), myokinazę (I25, 000 U), syntetazę kwasu cytydyno-5'monofosfoaano-N-acetyloneuraminowy (3245 U), nieorganiczną pirofosfatazę (9400 U), i α-2,3-atalliotransferazę (-640 U). Objętość tej mieszaniny doprowadzono do 22 l i ten roztwór dodano do reakcji transferazy galaktozylowej. Reakcję monitorowano za pomocą TLC na żelu krzemionkowym rozwiniętej przy użyciu mieszaniny izopropanot: iM octan amonu 4:i. Po -0--2 dniach, TLC wskazało na to, że reakcja przebiegła dając >95% tytułowego związku (Związek ii).

Przykład i2. [(5-acet;aπido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-glicero-D-galakto-nonulopiranozytoninn)mrlylu](22-3-O--2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-gallakopiria^ozylo)-(1a4)-Oa (3,6-di-O-acetylo-2-N-alłiioksykarbonylca2-deoksy-β-D-glukopiranozylo)-(--3)-O-2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-aallakopir;Mlozyd etylu (Związek i2)

Roztwór (40 l) [(5-acettnπido-3,5-dideoksy-α-D-aliceto-D-g^daklononnlopiranozylonianu) sodu]-(2-3)-O-e-D-gualakopirrmozylo) (i -4)-O-(2-N-alhloksykarbonyto-2-deoksy-β-D-glukopiranozyloo -e-D-gaaaktopir;aiozydu etylu (Związek 11) przesączono przez bibułę filtracyjną. Przesącz odparowano do gęstego syropu w 50-litrowej kolbie rotavapor. Syrop współodparowano dwukrotnie przy użyciu pirydyny (2 x2 1), a następnie utrzymywano pod próżnią przez 20 godz. Kolbę do odparowywania załadowano roztworem N,N-dimetylaminopirydyny (20 g) w pirydynie (-2 l). Łaźnię dla rotavapor załadowano mieszaniną lód-woda, i rotowanie kolby kontynuowano, podczas gdy w czasie jednej godz. dodawano bezwodnik octowy (6 l). Dwie godz. po całkowitym dodaniu, dodano jeszcze bezwodnik octowy (2 l) i uzyskaną mieszaninę pozostawiono na 20 godz., powoli rotując w temperaturze pokojowej. Aby zapewnić całkowite acetylowanie, dodano jeszcze bezwodnik octowy (11) i mieszaninę rotowano przez dodatkowe 24 godz. Reakcję zbadano za pomocą TLC (octan etylu:heksan:etanol, I0: i0:3).

Po zakończeniu reakcji przyłożono próżnię i zebrano I4 i destylatu. Do uzyskanej pozostałości, dodawano przez okres jednej godz. metanol (-5 l) i mieszaninę rotowano w temperaturze pokojowej przez 20 godz. Po tym czasie, TLC na żelu krzemionkowym (octan etylu:heksan:etanol, -0:i0:3 i dichlorometan:aceton 3:2) wykazała całkowitą przemianę laktonu do wolniej poruszającej się plamy, która była związkiem - estrem monohydroksymetylowym. Mieszaninę następnie zatężono (odparowano i8i) i mieszaninę ochłodzono w wodzie lodowej, podczas gdy bezwodnik octowy (3 l) dodawano w przeciągu 30 min. Mieszaninę pozostawiono na 20 godz.

I76 272

TLC na żelu kioamiupkowym (Zlzhloiometcp:azeiup 3:2) wykazała całkowite azatylowaπia, przy czym produkt proamieszcncł się piezu szybciej.

Metanol (-i) dodano, by zlikwidować nadmiar bezwodnika octowego, podczas czego zauważono pieznazzpą egooteumę. Po jednej godz., mieszaninę zatęjopu do syropu, który pioepiesiopo do 50-litrowego ekstraktom przy użyciu miasoαnipy ^Πρ etylu - woda (I3/-3 l). Mieszaninę intensywnie mieszano. Po rozdziale faz, dolną warstwę (wodną) odciągnięto, a pozostałą warstwę organiczną przesączono przez bibułę Ciltiαzyjną. Przesącz przemyto przy użyciu 5% wodnego roztworu kwasu solnego (i5 l), warstwa wodna powinna po przemyciu wciąż być silnie kwaśna według papierka pH, i -M wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (i5i, warstwa wodna powinna po przemyciu wciąż być alkaliczna według papierka pH). Następnie warstwę organiczną puoaniasiunu do 20-litrowego zbiornika, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i przesączono.

Przesącz zatężupo do półstałej pozostałości. Pozostałość tę rozpuszczono w dichlorometanie (3 l), i wprowadzono pa kolumnę z żelem krnalmiopkowym (-0 kg), napełnioną dichlorometanem. Wymywanie najpierw przy użyciu dichlorometanu (25 l), następnie. 3:- dichloromeicp:aceiop (25 l), i usiateczpia przy użyciu -:- Zizhloromatap:αcetop (50 l) dało frakcje zawieiająze produkt. Rozdział do linii bazowej osiągnięto z materiału disccł^aryduwego, baiZou pienpaczpy rozdział osiągnięto ze śladów materiału poruszającego się - piezpαcopie szybciej. Frakcje zawiarająda produkt odparowano, i powtórnie rozpuszczono w dichlorometanie (i,5 l). Roztwór ten powoli dodano do intensywnie mieszanej miesoapipy eteru etylowego (7,5 l) i heksanu (I0 l). Uzyskany osad przesączono i przemyto przy użyciu 2: i atar:haksαp, ususoupu pa powietrzu przez noc, a następnie osuszono pod wysoką próżnią przez 48 godz. Osad był tytułowym Związkiem -2 jak pokazał ¹ H-NMR, i zawierał małą ilość resztkowego rozpuszczalnika (i-5%, wag./wag.).

Ή-NMR (CDCb) δ: 4,67 (d, IH, H-i), 4,49 (d, iH, H-i'), 4. 33 (d, -H, H-i).

Przykład -3. [(5-acetamiZo-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tatrα-O-acetylu-α-D-glizaro-D-galαkto2-nonuiopiranozyjorliαπ metylujl-^^bO (2,4,6-iri-O-acetylo-β-D-galίCkopiranozylo)-(1,4)-O- (2 αmino-2-deoksy-3,6-dii0-aαztrlo-β-D-glukouiruαnunlol--l,3)-0-2,4,6-iii-0-azatylo-βD-galαktopirapooyZ etylu (Związek i3). ,

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu [(5-acetamido-3,5-ZiZeuksy-4,7,8,9-teiia-0-αzaiylo-α-D-glicero-D-galίCko-2-2Punlooirucouylomanu meiylu]-(2,3)-O(2,4,6-iri-O-acetyloβ-D-2glakiopiranQzylu)-(-,4)-O-(2-alliluksykαibonylamid2-2-Zaoksy-3,6-di-0)-azerylo-βD-glukopiianuoylu)-(-,3)-O-2,4,6-iri-O-acetylo-2-D-2alaktopiranozyZu etylu (Związek -2) (5,i0 g, 3,80 mmoli) w bezwodnym THF w atmosferze argonu w rampararuioa pokojowej dodano pulimaiylohydiusiloksαp (420 gl). Mieszaninę reakcyjną przeprowadzono trzykrotnie przez cykl próżni/zoysozzepia przy użyciu argonu do oZgCfuwapia roztworu. Kolbę owinięto w folię aluminiową by chronić roztwór od światła, i na roztwór podziałano przy użyciu tetrakisίriCenyloiosfipy palladu (Pd(PPh3)4; -58 mg, 0,-4 mmol). Po mieszaniu przez -8 godz. w iempaiaiurza pokojowej, TLC w i): i CHCl3:MeOH wskazało na całkowite zużycie Związku i2 i obecność pojedynczego produktu o niższym Rf. Mieszaninę reakcyjną rooziańczopu przy użyciu 600 ml ErOAc i przemyto ix200 ml przy użyciu H 2O i -x200 ml przy użyciu nasyconego roztworu NaCl. Roztwór organiczny osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono przez odparowanie rotacyjne, i chromatografowam rzutowo na kolumnie z żelem kinemiopkuwym (65 mmxi0) przy użyciu 3: i EtOAc: aceton jako aluapta. Frakcje zawierające produkt (jak ustalono za pomocą TLC) zebrano i zatężopo, uzyskując Związek i3 (4,42 g, 87%) jako brązową substancję stałą.

*H-NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCb) 5,50 (m, iH), 5,44 (dd, J=6 Hz, J= 2 Hz, -H), 5,35-5,0- (m), 4,89 (m, 2H), 4,63 (d, J=6 Hz, -H), 4,59-4,35 (m), 4,22-3,38 (m), 3,8(s, 3H), 2,69 (m, iH), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=-0 Hz, iH), 2,27-i,85 (i2s, 36H), i,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, iH), - ,2- (t, J=5 Hz, 3H).

Przykład -4. [(5-acetiCoido-3,5-Zidauksy-4,7,8,9-ieira-O-acetylo-α-D-glizaro-D-galakio-2-2Duplopiranozylopiαn metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-iri-O-acetylo-β-D-gallCkiupirapuoylo)(1,4)-O-(2-amiPO-2-deuksy-6-O-αzetylo-β-D-2lukopii·un^ozyjo)(i,3)-0-2,4,6-iri-O-acetylo-βD-galaktopiiapunyZ etylu (Związek i4).

176 272

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 13 (4,42 g, 3,29 mmoli) w 366 ml 4:1 MeOH:H2O w temperaturze pokojowej w zamkniętej kolbie dodano kwas octowy lodowaty (188 μΐ, 3,29 mmol). Bladożółty roztwór następnie ogrzano do 50°C. Po 48 godz, TLC w 10:1 CHCkMeOH wskazała na niemal całkowite zniknięcie Związku 13 i pojawienie się dominującego produktu o nieco wyższym Rf. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, zatężono przez odparowanie rotacyjne do oleju, i chromatografowano rzutowo na kolumnie (65 mm x 10) z żelem krzemionkowym przy użyciu 110:10:4 EtOAc:heksan:MeOHjkko eluenta. Frakcje zawierające produkt (jak określono za pomocą TLC) zebrano i zatężono, uzyskując Związek 14 (2,78 g, 65%) jako pianę.

’H-NMR (300 mHz, δ w ppm względem CHCI3) 5,50 (m, 1H), 5,40 (d, J=2 Hz, 1H), 5,25 (d, J=7 Hz, 1H), 5,17 (dd, J=6 Hz, J=7 Hz, 1H), 5,04 (dd, J=6 Hz, J=7 Hz, 1H), 4,89 (d, J=3 Hz, 1H), 4,63 (d, J=6 Hz, 1H), 4,59 (dd, J=3 Hz, J=7 Hz, 1H), 4,42-3,40 (m), 3,81 (s, 3H), 2,69 (m, 1H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,21 (t, J=5 Hz, 3H).

Przykład 15. [(5-aceeamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-a-D-glicero-D-galakto-^^noonuiopiirin.o^z^yonian metylu)]-(2,3)-O-j2,4,6-tri-O^^(^f^1^ylo-e-]D--^ikik^1^t^]^iranozylo)(1.4) -O-(2-benzamido-2-deokjy-6-O-acetylo-β-D-glukopiranozylo)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-ace tylo-β-]Dnalaki.opiranozyd etylu (Związek 15).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 14 (150 mg, 0,12 mmol) w 2 ml dichlorometanu w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu dodano bezwodny NaHCO3 (40 mg, 0,48 mmol), i chlorek benzoilu (34 mg, 0,24 mmol, 28 μΐ). Po mieszaniu przez 24 godz. TLC w 80:20 EtOAc:aceton wskazało na całkowite zużycie materiału wyjściowego i pojawienie się materiału o nieco wyższym Rf. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu 150 ml octanu etylu i przemyto 1 x 50 ml przy użyciu H2O. Roztwór organiczny osuszono (MgSO 4), przesączono, zatężono, i chromatografowano rzutowo na kolumnie z żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny 90:10 EtOAc: aceton jako eluenta. Frakcje zawierające produkt (jak określono za pomocą TLC) zebrano i zatężono przez odparowanie rotacyjne i następnie pod wysoką próżnią do kremowowoskowatej substancji stałej, Związek 15: (140 mg, 83%).

^lH-NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCI3) 7,75 (d, J=7 Hz, 2H), 7,45 (d, J=7 Hz, 1H), 7,39 (dd, J=7 Hz, J=7 Hz, 2H), 6,45 (d, J=5 Hz, 1H), 5,50 (m, 1H), 5,40 (d, J=2 Hz, 1H), 5,37 (d, J=2 Hz, 1H), 5,27 (m, 1H), 5,09 (m, 1H), 4,82 (d, J=3 Hz, 1H), 4,63 (d, J=6 Hz, 1H), 4,59 (dd, J=3 Hz, J=7 Hz, 1H), 4, 39-3,40 (m), 3, 81 (s, 3H), 3,19 (m, 1H), 2, 57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10Hz, J=10Hz, 1H), 1,15 (t, J=5 Hz, 3H).

Przykład 16. [(5-aceIamido-3,5-dideokjy-4,7,8,9-tetrα-O-acetylo-α-D-glycero-D-galakto-2-nonulopiranozylooiαn metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetylo-e-D-g:aaktopiranozylo)(1.4) -O-[(2,3,4-tri-O-benzylo-α-L-nukopiranozylo)-(1,3)]-0-(2-benzamido-2-deoksy-3,6-diC)-kcetyit>eT>glukopiraTozylo)-(1.3)-O-2,4,6-rii-Q-ia:etylo-e-D-galk<topirmozyd etylu (Związek 16).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 15 (140 mg, 0,1 mmol) w 1 ml dichloroetanu w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu dodano sproszkowane, osuszone w płomieniu sita molekularne 4A (100 mg), tetrarπeIyjomocznik (120 μΐ, 1 mmol), i fluorku tri-O-buezylofukozylu (218 mg, 0,5 mmola). Po mieszaniu przez jedną godz., w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną ochłodzono do -20°C i podziałano przy użyciu SnCl2 (95 mg, 0,5 mmola) i AgClO4 (126 mg, 0,5 mmol). Mieszaninę reakcyjną następnie pozostawiono powoli do ogrzania do temperatury pokojowej. Po mieszaniu przez 24 godz., TLC w 10:1 CHCkMeOH wskazało na niemal całkowite zużycie materiału wyjściowego i pojawienie się materiału o nieco niższym Rf.

Mieszaninę rekkcyyną przesączono przez wkładkę z celitu przy użyciu 50 ml dichlorometanu, i przesącz przemyto 2x50 ml przy użyciu H2O. Roztwór organiczny osuszono (MgSO4), przesączono, zatężono, i chromatografowano rzutowo na kolumnie (20 mm x 6) z żelem krzemionkowym przy użyciu mieszaniny (10:10:3) EtOAc:heksan:MeOH jako eluenta. Frakcje zawierające produkt (jak określono za pomocą TLC) zebrano i zatężono przez odparowanie rotacyjne i następnie pod wysoką próżnią do białej błonki, Związek 16 (140 mg, 77%).

176 272 ¹ H-NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCb) 7,46 (d, J=7 Hz, 2H), 7,35-7,12 (m, 18H), 6,45 (d, J=6 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,20 (m, 1H), 2,55 (dd, J=4 Hz, J=12 Hz, 1H), 118 (d, J=6 Hz, 3H), 1,10 (t, J=6 Hz, 3H).

Przykład 17. (5-acetamldo-3,5-dideoksy-α-D-glicero-D-galakto-2-aonulopiraoozylonian etylu)-(2,3)-O-^-D-gdaktopiranozylo)-( 1,4^Ca[(α-L--flkoplraoozylo--( 1 .3]-O-(2-benzamido -2a.ieoksy-β-tDal^uU^:oPi^ranoxylo)-( 1,3)-O-β-LDgalaktopiranozyc^ (Związek 17).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 16 (140 mg, 77 μ moli) w 4 ml metanolu dodano wodorotlenek palladu na węglu (140 mg, 20% wag. palladu). Zawiesinę następnie przeprowadzono trzykrotnie przez cykl próżni/oczyszczania przy użyciu gazowego wodoru i następnie utrzymywano w atmosferze wodoru pod ciśnieniem jednej atmosfery w temperaturze pokojowej. Pojednej godz., TLC w 5:1 EtOAc:MeOH wskazało nacałkowity zanik Związku 16 i pojawienie się pojedynczego materiału o niższym Rf. Zawiesinę przesączono przez wkładkę z celitu przy użyciu 50 ml metanol i zatężono przez odparowanie rotacyjne do oleju. Olej ten rozpuszczono w 5 ml 4:1 MeOH:H2O i mieszano, w temperaturze pokojowej w zamkniętej kolbie. Metanolan sodu (proszek) (140 mg, 2,6 mmoli) dodano do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu. Po 16 godz., TLC w 60:50:15 CHCb:MeOH:15 mM CaCb wskazało na całkowity zanik materiału wyjściowego i pojawienie się pojedynczego produktu o niższym Rf.

Na mieszaninę podziałano przy użyciu 1 grama Dowex 50x8-400 żywicy kationowymiennej (postać wodorowa, świeżo przemyta metanolem) i mieszano przez jedną minutę. Mieszaninę przesączono przez lejek ze spiekiem i przesącz zatężono przez odparowanie rotacyjne' do oleju. Materiał ten chromatografowano na kolumnie (40 mm x 8 (ośr<^odki do filtracji żelowej: Bio-Rad Bio-Gel P2 (wielkość oczek: drobne)) przy użyciu 0,1M wodorowęglanu amonu jako eluenta. Frakcje zawierające produkt (jak określono za pomocą TLC) zebrano i liofilizowano do białego proszku (Związek 17) (60 mg, 72%).

*H-NMR (300 Mhz, δ w ppm względem HOD) 7,70 (d, J=7 Hz, 2H), 7,55 (d, J=7 Hz, 1H), 7,47 (dd, J=7 Hz, J=7 Hz, 2H), 5,08 (d, J=4 Hz, 1H), 4,50 (d, J=8 Hz, 1H), 4,27 (d, J=8 Hz, 1H), 4,10 (d, J=3 Hz, 1H), 4,05-3,40 (m), 2,70 (dd, J=4,6 H2, J=12,4 Hz, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,74 (dd, J= 12,4 Hz, J=12,4 Hz, 1H),1,10 (t, J=7 Hz, 3H), 1,07 (d, J=7 Hz, 3H).

Przykład 18. [(5-acetamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-a-D-glicero-D-galakto-2aionulopiranozyloman metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopiranozylo)-( 1,4)-O-[(α-L-aukopiranozylo)-( 1,3)]-O-t2-a'-aoflamido-2-deoksy-3,6-di-O-aGetylo -β-D-glukopiraoozylo)-(1,3)-0-2,4,6-tri-O-&::etylo-β-D-aalakiopirίuoozyd etylu (Związek 29).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 25 (wytworzony analogicznie do Związku 16; 90 mg, 48 (imoli) w 5 ml metanolu dodano wodorotlenek palladu na węglu (40 mg, 40% wag. palladu). Zawiesinę następnie przeprowadzono trzykrotnie przez cykl próżni/oczyszczania przy użyciu gazowego wodoru i następnie utrzymywano w atmosferze wodoru pod ciśnieniem jednej atmosfery w temperaturze pokojowej. Po 24 godz., TLC w 90:10 CkbCbAleOH wskazało na całkowity zanik Związku 25 i pojawienie się pojedynczego materiału o niższym Rf. Zawiesinę przesączono przez wkładkę z celitu przy użyciu 50 ml metanolu i zatężono przez odparowanie rotacyjne do kremowowoskowatej substancji stałej. Produkt chromatografowano rzutowo na kolumnie z żelem krzemionkowym przy użyciu 90:10 CkbCbAleOH jako eluenta. Frakcje zawierające produkt (jak określono za pomocą TLC) zebrano następnie i zatężono, uzyskując Związek 29 (55 mg, 72%) jako białą woskowatą substancję stałą.

*H-NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCb) 8,39 (s, 1 H), 7,94 (d, J=7 Hz, 1H), 7,82 (m, 2H), 7,57 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 5,57-5,41 (m, 3H), 5,22 (d, J=7 Hz, 1H), 5,15 (m, 1H), 4,97-4,39 (m), 4,35 (d, J=4 Hz, 2H), 4,19-3,42 (m), 3,81 (s, 3H), 3,23 (m, 1H), 2,75 (bs, 1H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,23 (d, J=5 Hz, 3H), 1,05 (t, J=5 Hz, 3H).

Przygotowano również następujące procedury, zasadniczo podobne do omawianych powyżej i do Schematu 3 dla przemiany Związku 14 w Związki 15, 16 i 17, Związków 18-38. Tabele 1, 2 i 3, poniżej pokazują uogólnione struktury dla grup związków odpowiadających Związkom 15, i6 lub i7, i dostarczają inne dane dotyczące każdego z tych związków. Tabela 1

4s

17s 272 pokazuje środek acylujący stosowany do wytwarzania każdej grupy R- Po Tabelach 1-3 następują dane NMR i dodane dane dla kilku z tych związków, i inhibitorów - związków 30-38, w tym wydajności ostatniego etapu.

Tablica 1

Środek acylujący grupę R¹ coa

Związek #

Wydajność ^R, ^{(rozpuszczaln}'^,k)

148 mg,87% 0.4(90:10 EtOAc:aceton )

F coa

136 mg,78% 0.43 (90:10 EtOAc:aceton

NO, coa

133 mg. 78% 0.40 (90:10 EtOAc:aceton )

143 mg. 82% 0.45 (90:10 EtOAc:aceton )

i76 272

Tablica 2

AcO	AcO Ac</ /'''CW	CU^CMa / °%7	OAc		AcO _^OAc
V o	-ί— AcO	HjC-- BnO	•OAc	Cfc -CBn	\ OAc KH i
Związek #	Akceptor glikozylowy	Wydajność	Rf (rozpuszczalnik)
22	18		135 mg,74%	0.35 (92:8 EtOAc:aceton )
23	19		100 mg,58%	0.39 (92:8 EtOAc:aceton )
24	20		105 mg, 65%	0.37 (92:8 EtOAccaceton )
25	21		100 mg. 58%	0.37 (92:8 EO>Ac:aceton )

176 272

Tablica 3

Związek #	Benzylowany pentasacharyd
26	22

Wydajność R, (rozpuszczalnik)

62mg.60% 0.32 (90:10 CH₂CI₂:M<eOH) mg,50% 0.39 (90:10 C^C^MeOH) mg, 65% 0.31 (90:10 C^C^MeOH)

Przykład -9. [(5-acelίuηido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetyIo-α-D-glicero-D-galakto-2-nonulopiranozylonian metydu)]-(2,3-0-(2,4.MtIi4>ίtcetylo-β-D-gallUkopinulO/ylo)-(l,4)-O(2-benzyloksykarbonylamida-2-deoksy-6-O-acetylo-β-D-alukopiranozylo)-(-,))C^-2,4-6a-trl-Onκ^«^ty l o-β-a^^έlⁱliU^ttoPI^^unl/yd etylu (Związek 39).

Roztwór chlorku benzyloksykarbonylu (CBZ-Cl) (-,2 ml, 8,4 mmoli) w GfoCb (2,0 ml) dodawano kroplami do mieszaniny Związku -4a (10,8 g, 8,3 mmoli) i NaHC03 (1,4 g, -6,6 mmol) w CH2Cl2 (-00 ml), i miej/aninę reakcyjną miej/ano przez noc (około -8 godz). Do tej mieszaniny dodano NaHCO3 (1,4 g, -6,6 mmoli) i CBZ-Cl (1,2 ml, 8,4 mmoli), i uzyskaną mieszaninę mieszano dodatkowo przez cztery godz. Uzyskaną mieszaninę rozcieńczono przy użyciu AcOEt, przemyto H2O, osuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono. Pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym, uzyskując Związek 39 (7,75 g, wydajność 65%) jako białą substancję stałą.

Przykład 20. [(5-acelamldo-3,5-dideokjy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-gllcero-D-galakΐo-2-aonnllopiranozyionian metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acelylo-β-D-galιdctopir<alo/ylo)-( 1,4)O-[(2,3,4-tπ-O-ben/ylo-α-L-aukopiranozylo)-(1,3)]-O-(2-nenzyjoksykarbonylamido-2deokjy-),6-di-O-acetyloaβ-D-glukopiranozylo)-(-,3)-O-2,4,6-triaO-acetylo-β-D-ga laktopiranozyd etylu (Związek 40).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 39 (3,90 g, 2,72 mmoli) w 10.0 ml C1CH2CH2C1 dodano sproszkowane sita molekularne (MS4A) (-2 g), tetrametyjomoc/nik (TMU) (3,25 ml, 27,2 mmoli) i fluorek 2,3,4-tri-O-nenzyjo-L-aukozylu (CMH-048,5,94 g, -3,6 mmoli). Po mieszaniu przez 90 minut w temperaturze pokojowej, mieszaninę osłaniano przed

17s 272 światłem, ochłodzono do -20°C i działano przy użyciu SnCl2 (2,59 g, -3^ mmoli) i AgC1O4 (98%, 2,88 g, —3,s mmoli). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej przez okres 90 minut, i mieszano przez 24 godz. Dla zupełności reakcji, TMU (1,95 ml, -s,3 mmoli), CMH-048 (3,5s g, 8,-s mmoli), SnCl2 (1,55 g, 8,17 mmoli) i AgC1O4 (1,73 g, 8,17 mmoli) dodano ponownie do mieszaniny w zerze °C, którą następnie pozostawiono do powolnego ogrzania do temperatury pokojowej. Po 48 godz., uzyskaną mieszaninę przesączono przez wkładkę z celitu i przesącz przemyto przy użyciu H2O. Fazę organiczną osuszono nad Na2SO4, przesączono, zatężono, i chromatografowano na żelu krzemionkowym (heksaniAcOEi/MeOH = -0/10/2), uzyskując Związek 40 (3^5 g, wydajność 73%) i wydzielono materiał wyjściowy, Związek 39 ^72 mg, wydajność 17%).

Przykład 21. [(5-acetamido-3,5-dideoksya4,7,8,9-tetra-O-acety1o-α-D-g1icero-D-ga1akto-2-aonϋlopiranozy1onianmetyh))]-(2,3)-O-(2,4,6-trl-O-acetylo-β-D-galaktoplrano zylo) -(1,4)-O-[(α-L-aucopiranozy1o)-(1,3)]-O-(2-amino-2-deoksy-3,6-di-O-acety1o-βD-glukopiranozy1o)-(1,3)-0-2,4,6-iri-O-acetylo-β-D-aalkktopłranozydety1u (Związek41).

Mieszaninę Związku 40 (3,0s g, 1,66 mmoli), HCOONH4( 1,05 g, -6,6'mmol1)i 10%Pd-C (mokry, 3,0 g) w EtOH (80 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia mieszając przez 9,5 godz. Do tej mieszaniny dodano jeszcze HCOONH4 (1,05 g, i/)© mmoli) i 10% Pd-C (3,0 g), i uzyskaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez dodatkowe 11 godz. Uzyskaną mieszaninę przesączono przez wkładkę z celitu i zatężono, uzyskując Związek 41 (2,30 g, wydajność 9s%) jako białą substancję stałą.

Przykład 22. [(5-acetamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acety1o-a-D-g1icero-D-galakto-2-nooulopiranozylonian metylulf^^-O-^As-tri-O-acetylo-e-D-galaktopiranozy1o)-(1,4)-O-[(α-L-aukopiranozy1o)-(1,3)]-O-[2--3,5-aichlorobenzol1amido--2-deoksy-3,6-di-O-acetylo-e-D-ghikopiranozyloH-Jj-OUAs-tri-O-acetylo-e-D-galaktopiranozyd etylu (Związek 42).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu Związku 41 (40 mg, 0,028 mmoli) w CH2CI2 (8,9 ml) dodano NaHCO3 (4s mg, 0,54 mmol) i chlorku 3,5-dichlorobenzoilu (58,s mg, 0,28 mmoli). Po -2 godz. w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono przy użyciu EtOAc i przemyto H2O. Fazę organiczną osuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano, uzyskując surowy Związek 42 (98,4 mg) jako bladożółty olej.

Przykład 23. [(5-acetaInido-3,5-dideoksya4,7,8,9-ieira-O-acety1o-α-D-g1iceiΌ-D-ga1akio-2-nonuk.)piranozy1onian metylujE^^-O-CŻAs-tri-O-acetylo-e-D-galilktopiranozylo)(1,4)-O-[(α-L-aukopiranozy1o)-(1,3)]-O-[2-(3,5-aichlorobenzamido--2-deoksy-3,6-di -O-acety1o-β-D-glukoplranozjιlo)]-(1,3)-O-2,4,6-iri-O-aceiy1o-β-D-ga1aktoplranozyd etylu (Związek 43).

Do utrzymywanego w stanie mieszania roztworu surowego Związku 42 (98,4 mg) w MeOH (8,9 ml) dodano 28% NaOMe-MeOH (300 μ1). Po 48 godz. w temperaturze pokojowej, mieszaninę zneutralizowano przy użyciu DOWEX 50W-X8 (forma H+) i przesączono. Przesącz zatężono, rozcieńczono przy użyciu EtOAc, i ekstrahowano przy użyciu H2O. Fazę wodną odparowano, uzyskując odpowiedni ester. Na ester działano przy użyciu 1N NaOH (200 μ1) w H2O (5,0 ml). Mieszaninę mieszano przez 12 godz. w temperaturze pokojowej, zneutralizowano przy użyciu DOWEX 50W-Xe (forma H+) i przesączono. Przesącz zatężono, oczyszczono za pomocą filtracji żelowej (p-2) (H2O jako eluent), i liofilizowano, uzyskując Związek 43 (31,s mg, wydajność ilościowa) jako biały proszek.

¹ H-NMR (270 MHz, δ w ppm względem H2O) 7^1 (s, 3H), 5,00 (d, J=3,9s Hz, 1H), 4,47 (d, J=7,59 Hz, 1H), 4,2s (d, J=7,92 Hz, 1H), 4,09 (d, J=2,97 Hz, 1H), 4,04-3,30 (m), 2^7 (m, 1H), 1,94 (s, 3H), 1,72 (t, J= 11,88 Hz, -H), 1,09 (m, 6H).

Dane NmR związków 18-28

[('5-acetamido-3,5-dldeoksy-4,7,8,9-ieira-O-acety1o-α-D-glicero-D-ga1aklo-2nonulopiranozylonian metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acety1o-β-D-aallatopiranozy1o)-( 1,4) O-(2-p-ffuorobenzamida-2-deoksy-6-O-acety1o-β-D-alllkopiranozy1o)-(1,3) -O-2,4,6-iri-O-acety1o-β-D-aalkktopiraaozydety1u (Związek -8).

—H NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCI3) 7,79 (m, 2H), 7,15 (m, 2H), s,41 (d, J=5 Hz, 1H), 5,53 (m, —H), 5,42 (m, 1H), 5,23 (d, J=7 Hz, —H), 5,17 (m, 2H), 4,89 (d, J=3 Hz, —H),

I76 272

4,63 (d, J=6 Hz, IH), 4,59 (dd, J=3 Hz, J=7 Hz, IH), 4,42-3,40 (m), 3,8- (s, 3H), 3,-9 (m, IH), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=i0 Hz, -H), 2,27--,85 (i2s, 36H), -,77 (dd, J=i0 Hz, J=-0 Hz, IH), -,i5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamiίi()-3,5-dideoksya4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-gllce[Ό-D-gaiakto-2-rlonulopiPlnozylonian metylu)](2,3)-O-(2,4,6-rpi-O-acetylo-δ-D-galίak:opirrarozylo)-(1,4)-O-(2-p-nitrybenzaπ·iido-2-deokty-6-O-acetylo-β-D-glukopiranozylo)-(1,3)aO-2,4,6-rriaO-acetylo -β· D-galaktopiranozyd etylu (Związek i9).

-Η NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCb) 8,22 (d, J=8 Hz, 2H), 7,95 (d, J=8 Hz, 2H), 6,8- (d, J=5 Hz, IH), 5,59-5,37 (m, 2H), 5,2- (d, J=4 Hz, IH), 5,- i (m, 2H), 4,89 (d, J=2 Hz, -H), 4,63 (d, J=5 Hz, -H), 4,59 (dd, J=i Hz, J=7 Hz, i H), 4,42-3,40 (m), 3,79 (s, 3H), 3,-9 (m, IH), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=i0 Hz, iH), 2,27--,85 (i2s, 36H), i,77 (dd, J=-0 Hz, J=-0 Hz, IH), i,-5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideokty-4,7,8,9-terra-O-acetylo-α-D-glicero-D-galakto-2 -nonulopiranozylonian merylu)]a(2,3)-O-(2,4,6-rri-O-acetylo-β-D-galaktopiranozylo)(i,4)-O-(2-(E-1-okto-3-aenylopropa2-en)amino-2-deokty-6-O-acetylo-β-D-glukopiranozy ·lo)- i,3)-O-2,4,6-tri-C)-acetylo-β-D-gaka<iopiranozyd etylu (Związek 20).

H NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCb) 7,57 (d, J=i - Hz, iH), 7,45-7,25 (m, 5H), 6,39 (d, J=i - Hz, IH), 5,87 (d, J=4 Hz, IH), 5,45 (m, -H), 5,39 (m, 2H), 5,2- (t, J=7 Hz, IH), 5,-7-4,97 (m, 2H), 4,89 (d, J=2 Hz, -H), 4,63 (d, J=5 Hz, IH), 4,59 (dd, J=i Hz, J=7 Hz, IH), 4,42-3,40 (m), 3,79 (s, 3H), 3,05 (m, -H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=-0 Hz, -H), 2,27--,85 (i2s, 36H), -,77 (dd, J=-0 Hz, J=-0 Hz, IH), -,-5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-glicero-D-galakto-2-nonulopiranozylonian metylu)]-(2,3)-O--2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopiralozylo)-(i,4)-O-2-2'-naftamido-2-deoksy-6-O-acetyl-β-D-glukopiranozylo)-(i,3)-O-2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopira ano zyd etylu (Związek 21).

*H NMR (300 MHz, δ w ppm względem CHCb) 8,25 (s, -H), 7,95-7,42 (m, 6H), 6,58 (d, J=5 Hz, IH), 5,53 (m, -H), 5,44 (d, J=2 Hz, -H), 5,4--5,23 (m), 5,-7-5,0- (m), 4,89 (d, J=3 H2, IH), 4,63 (d, J=6 Hz, -H), 4,59 (dd, J=3 Hz, J=7 Hz, IH), 4,42-3,40 (m), 3,81 (s, 3H), 3,27 (m, IH), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=-0 H2, -H), 2,27--,85 (i2s, 36H), i,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, -H), -,-5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-gllcero-D-galakto-2-nonulopiranozylonian metylu)-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetyly-δ-D-gallakopir<aiozyly)-(i,4)-O-(2,3,4-triO-benzylo-[α-L-aukopiranozylo)-(i,3)]-O-(2ap-fluorobenzamido-2-deoksy-3,6-diO-;lcetylo-β-D-glukopir'anozylo)]a - ,3)-O-2,4,6>tri-O-acetylo--β-D-gaiaktopiranozyd etylu (Związek 22).

^lH NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCb) 7,42 (m, 2H), 7,39-7,-7 (m, I5H), 6,95 (t, J=7 Hz, 2H), 6,45 (d, J=5 Hz, IH), 5,57-5,37 (m, 3H), 5,27 (d, J=7 Hz, -H), 5,I7-4,45 (m), 4,39 (d, J=7 Hz, IH), 4,25-3,4i (m), 3,8- (s, 3H), 3,2- (m, -H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=i0 Hz, -H),

2,27--,85 (i2s, 36H), i,77 (dd, J=-0 Hz, J=-0 Hz, IH), -,-9 (d, J=5 Hz, 3H), -,-5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideokty-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-glicero-D-galakro-2-nonulopiranozylonian metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetylo-e-D-gaaktopiranozylo)-(I,4)-O-[(2,3,4tri-O-benzyloaα-L-aukopiranozylo)-(i,3)]-O--2-p-aiirobenzamido-2adeokty-3,6-di-Oacetylo-p-D-glukopiranozylo)]-(i,3)-O-2,4,6-tri-O-acetylo—β-D-galakiopiranozyd etylu (Związek 23).

ii NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCb) 8,-5 (d, J=8 Hz, 2H), 7,55 (d, J='g Hz, 2H), 7,4--7,-5 (m, I5H), 6,63 (d, J=5 Hz, IH), 5,48 (m, -H), 5,43 (dd, J=6 Hz, J=2 Hz, -H), 5,37 (d, J=6 Hz, -H), 5,-9 (d, J=8 Hz, IH), 5,-5-4,45 (m), 4,42 (t, J=4 Hz, i H), 4,25 (m, 2H),

4,I8-3,40 (m), 3,82 (s, 3H), 3,25 (m, IH), 2,59 (dd, J=3 Hz, J=-0 Hz, -H), 2,27-I,85 (i2s, 36H), -,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, 1H), 1,I9 (d, J=5 Hz, 3H), i-5 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-D-glicero-D-galakto-2-nonu l o - paranozyloaian metylu-]-(2,a)-0-(4,4,6-ari-0-acelolδ-β-D-galaktoplranyzylo)-(1,4)-0[(2,3,4atriaO-benzylo-α-L-fukopiranozylo)-(i,3)]aO-(2-(Ea1-okto

176 272

-3-neenloρro--n-ennlΠminn-n-eeokjn33,n-di-O-nceeylo-β-D-gll±optfαnozylo)]-(1,3)-O2,4,6-trin^-acetylo-[3-nD-nξ^kl^icOPrranozyc^ etylu (Związek 24).

’H NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCI3) 7,42 (d, J=11 Hz, 1H), 7,39-7,15 (m, 20H), 5,94 (d, J=11 Hz, 1H), 5,85 (d, J=4 Hz, 1H), 5,55-5,29 (m, 4H), 5,17-4,42 (m), 4,25 (m, 2H), 4,17-3,40 (m), 3,79 (s, 3H), 3,05 (m, 1H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,19 (d, J=5 Hz, 3H), 1,15 (t, J=5 Hz, 3H).

[(J-acetamido-3,J-dideoksy-4,7,8,9-tetrα-O-acetylo-α-D-głlcero-D-nalakto-2-nonulopi ranozylonian metylrl)]-(2,3)nO-(2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galakiopiranozylo')-(1,4)-O[(2,3,4-tri-O-benzylo-α-L-nukopiranozylo)-(r,3)]-O-(2-2'-naftαmido-2-deokjj-3,6-dinOacetylo-β-D-glukopiranozylo)-(r,3)-O-2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galikk;opiranozyd etylu (Związek 25).

¹H NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCI3) 8,13 (s, 1H), 7,84 (d, J=7 Hz, 1H), 7,78 (d, J=7 Hz, 1H), 7,57 (m, 2H), 7,37-7,11 (m, 16H), 6,98 (d, J=7 Hz, 1H), 6,65 (d, J=5 Hz, 1H), 5,57-5,35 (m, 2H), 5,22 (d, J=7 Hz, 1H), 5,15-5,01 (m, 3H), 4,97-4,45 (m), 4,25 (m, 2H),

4,19-3, 42 (m), 3,81 (s, 3H), 3,23 (m, 1H), 2.57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,19 (d, J=5 Hz, 3H), 1,05 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-nceIίαπido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetrk-O-ncetylo-α-D-glicero-n)~gαlkkto-2-nonulopirαoon zylonian metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopiranozylo)-(r,4)-O[(α-Lfukopirknozyło)-(r,3)]-O-(2-p-fluorobeozamido-2-deokjy-3,6-di-O-ncetylo-β-d--gukopirίkiozylo) -(r,3)-0-2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopiraoozyd etylu (Związek 26).

’H NMR (300 M Hz, β w ppm względem CHCI3) 7,83 (m, 2H), 7,17 (m, 2H), 5,45 (m, 1H), 6,40 (m, 2H), 5,23 (d, J=5 Hz, 1H), 5,17-4,75 (m, 3H), 4,77-4,45 (m, 4H), 4,36 (m, 2H),

4,19-3, 41 (m), 3,81 (s, 3H), 3,09 (bs, 1H), 2,62 (m, 1H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=10 H2, 1H),

2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,24 (d, J=S Hz, 3H), 1,15 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-aceeamido-3,5-dideoksy-4,7,8,9-tetrα-O-acetylo-α-nD-gllcero-D-galαkto-2-noulopiranozylonian) metylu)]-(2,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetylo-β-D-galaktopiranozylo)-(r,4)-O[(αL-fukopirkoozylo)-(r,3)]-O-(2-p-nminobenzkmido-2-deoksy-3,6ndi-O-acetylo-βD-glu kopiraIiO/yio)-1l,3)-O-2,4,6-tπ-O-acel.ylo-β-IDnalaktopiranozyd etylu (Związek 27).

^!H NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCI3) 7,61 (d, J=8 Hz, 2H), 2H), 6,75 (d, J=5 Hz, 1H), 6,57 (d, J=8 Hz, 2H), 5,57 (m, 1H), 5,43 (dd, J=6 Hz, J=2 Hz, 1H), 5,27 (d, J=2 Hz, 1H), 5,19 (d, J=8 Hz, 1H), 5,09 (m, 1H), 4,95 (m, 2H), 4,77-4,63 (m), 4,55 (dd, J=7 Hz, J=1 Hz, 1H), 4,42 (t, J=4 Hz, 1H), 4,35 (m, 2H), 4,21-3,38 (m), 3,82 (s, 3H), 3,17 (m, 1H), 2,95 (bs, 1H), 2,59 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,42 (bs, 1H), 2,27-1,85 (12S, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,22 (d, J=5 Hz, 3H), 1,15 (t, J=5 Hz, 3H).

[(5-aceIamido-3,5-dideokjy-4,7,8,9-tetra-O-acetylo-α-n)-glicero-D-galakto-2-nonulopiranozylonikn metylu)]-(2,3)nO-(2,4,6-tri-O-^acetylo-β-D-gal^aktopirkoozylo)-( 1,4)-O[(o-Lfukopirαnozylo)-(r,3)]-O-(2-(3'-fenylo)-propiookmido-2-deokjy-3,6-di-0-acetylo-β-D -glukopiranozylo)-(1,3)-O-2,4,6--t.I·i-O-acetyl()-β-D-nalakiopiIrinozyd etylu (Związek 28).

*H NMR (300 M Hz, δ w ppm względem CHCI3) 7,29 (m, 5H), 6,39 (D, J=2 Hz, 1H), 5,85 (d· J=4 Hz, 1H), 5,55-5,19 (m, 5H), 5,11 (t, J=5 Hz, 1H), 4,95 (m, 4H), 4,71-4,35 (m), 4,17-3,22 (m), 3,79 (s, 3H), 2,95 (t, J=3H, 2H), 2,57 (dd, J=3 Hz, J=10 Hz, 1H), 2,47 (t, J=3 Hz, 2H),

2,27-1,85 (12s, 36H), 1,77 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,24 (d, J=5 Hz, 3H), 1,15 (t, J=5 Hz, 3H).

Dane dla Związków 30-38

[(5-ac£IaIπido-3,J-dideokjy-α-n)-glicero-D-nalakto-n-nnnolopiranozylooian)]-(2,3)-O-(β -D-gakιkiopiranozyk))-(1,4)-O-[(c/.-L-nukopiranozylo)-(1,3)]-O-n2-p-nuorrbunzamidcn2-deoksy-βD-gIukopiranozylo)-( 1,3)-O-e-D-galikk:opiranozyd etylu (Związek 30).

Rf= 0,62 (3 : 1 i-Pr^l^T :NH4OAc), biała substancja stała, 41 mg, 96%.

*H-NMR (300 M Hz, δ w ppm względem H2O) 7,83 (m, 2H, aromaty), 7,25 (m, 2H, aromaty), 5,18 (d, J=S Hz, H-1(fuc), 1H), 4,95 (m), 4,56 (d, J=8 Hz, 1H), 4,37 (d, J=8 Hz, 1H),

4,19 (d, J=3,5 Hz, 1H), 4,15-3,42 (m), 2,77 (dd, J=3 Hz, J=10Hz, 1H), 2,05 (s,3H),NAc), 1,79 (dd, J=10 Hz, J=10 Hz, 1H), 1,19 (m, 3H).

I76 272

[(5-aceeamiZo-3,5-2ideoksy-α-D-gllcero-D-2alaCko-2-2POPlopiranozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-g^ClCkopirialozylu)-(1,4)-O-[(α-L-2ukopiranozylo)-(i,3)]-O-[2-2-2:aCnnUjnzamido-2-deoksy-β -D-2lukopiranozylo)-(i,3)-O-β-D-gίCaktopiranozyd etylu (Związek 3i).

Rf = 0,52 (3:i i-PrOH :NH4OAc), biała substancja stała, 26 mg, 96%.

¹H NMR (300 MHz, δ w ppm względem H2O) 7,65 (d, J=9 Hz, 2H, aromaty), 6,82 (d, J=9 Hz, 2H), 5,i9 (d, J=3 Hz, H-i-fuc, iH), 4,95 (m), 4,59 (d, J=8 Hz, iH), 4,38 (d, J=8 Hz, iH),

4,i9 (d, J=2 Hz, iH), 4,i5-3,42 (m), 3,-9 (q, J=6 Hz, 2H, CHZCH3), 2,79 (dd, J=3 H2, J=ii Hz, H<kw-3 (kwas .sialowy), iH), 2,05 (s, 3H, N Ac), i,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, Hks-3 (kwas stalowy), iH), -,i9 (d, J=6 Hz, 3H, H-6-uc), i,i7 (t, J=6 Hz, 3H).

[(5-2ceeamido-3,5-dideuksy-α-D-glicero-D-2alakio-2-2noplopiranozyloniαn)]-(2,3)-O-(β -2D2^αaCiopiranox,ylo)2 i ,4)-O-[((α-L-2ckop jranozylo)-(i ,3)]-O-l'(((“((3-2cnplo)-]oropioπ -amidu-2-deoksy-β-D-glukouiianozylu)]-(1,3)-O-β-D-galίCίiopiranuzyZ etylu (Związek 32).

Rf = 0,62 (3:i i-PrOH:NH4OAc), biała substancja stała, 47 mg, 98%.

Ή NMR (300 M Hz, δ w ppm względem HO) 7,42-7,25 (m, 5H), 5,i9 (d, J=4 Hz, H-i-uc, iH), 4,95 (m), 4,57 (d, J=8 Hz, iH), 4,38 (d, J=8 Hz, iH), 4,i3 (d, J=2 Hz, iH), 4,ii-3,42 (m), 2,95 (t, J=5 Hz, 2H, a-CH2), 2,75 (dd, J=3 Hz, J=i0 Hz, Hekw-3 (kwas sialowy), iH), 2,63 (t, J=5 Hz, 2H, CHzPh), 2,05 (s, 3H, NAc), i,80 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, Ha<s-3 (kwas sialowy), iH),.i,24 (t, J=5 Hz, 3H), i,i8 (d, J=5 Hz, 3H).

[(5-aceeamido-3,5-dideoksy-α-D-gllcero-D-2alakio-2-2nuplopiranozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-2alakiopiranozylo)-(i,4)-O-[(α-L-2ukopiranozylu)-(i,3)]-O-(2,2'-nafiamido-2-Zeoksy-β 2^^2^^^LUi^cU^{^}iiucpof;jlo)-1,3)-O-β-ID^-^aIia<t^U^{^}i^lr^c^<_l·unyZ etylu (Związek 33).

Rf = 0,52 (3:i i-PrOH:NH40Ac), biała substancja stała, 35 mg, 96%.

’H NMR (300 MHz, δ w ppm względem H2O) 8,39 (s, aromaty, iH), 8,02 (m, aromaty, 2H), 7,82 (d, J=7 Hz, aromaty, iH), 7,63 (m, aromaty, 3H), 5,i9 (d, J=4 Hz, H-Kfuc), iH), 4,95 (m), 4,57 (d, J=8 Hz, iH), 4,35 (d, J=8 Hz, iH), 4,i9 (d, J=2 Hz, iH), 4,i5-3,42 (m), 2,77 (dd, J=3 Hz, J=i i Hz, Hekw-3 (kwas stalowy), iH), 2,05 (s, 3H, NAc), i,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, Hks-3 (kwas sialowy), iH), i,i9 (d, J=6 Hz, 3H, H-6-fuc), i,05 (t, J=6 Hz, 3H).

[(5-2ceeamiZu-3,5-dideoksy-α-D-glicero-D-2glakio-2-2nuplopiranozyloniαn)]-(2,3)-O-(β i ,4)-O-[(αZL2klkopiiαpunylo2( i ,3)-O-(2,2'-feπylaceicmίdo-2-Zaoksy-βD-glukupirαnunylu)-(i,3)-O-β-D-galaktopiranozyZ etylu (Związek 34).

Rf = 0,62 (4,5:- i-PrOnNHOAc), biała substancja stała, 24 mg, 68 %.

Ή-NMR (300 M Hz, δ w ppm względem HO) 7,45-7,27 (m, 5H), 4,85 (d, J=3 Hz, H-1 -fuc, iH), 4,75 (m), 4,55 (d, J=8 Hz, iH), 4,38 (d, J=8 Hz, iH), 4,i3 (d, J=2 Hz, iH), 4,09-3,42 (m), 2,78 (dd, J=3 Hz, J=i0 Hz, H_eew-3 (kwas sialowy), 1H), 2,05 (2s, 5H, N Ac, Ph C Hz), i ,80 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, Η^-3 (kwas stalowy), iH), i,24 (t, J=5 Hz, 3H), i,i8 (d, J=5 Hz, 3H).

[(5-2ceeemidu-3,5-dideoksy-α-D-glicaro-D-galαktu-2-nonulupπ·αpozylonlan)]-(2,3)-O-(β -D-g;Cαiopirapozylo)-(i,4)-O-[(α-L-fukopirαpooylo)-(i,3)]-O-(2---mceoUiybeapamidu-2-daoksy-β -D-2lukopiranozylo)-( 13)-O-β-D-2aIakiopiranozyZ etylu (Związek 35).

Rf = 0,52 (3:i i-PrOH:NH4O Ac), biała substancja stała, 46 mg, 90%.

Ή NMR (300 MHz, δ w ppm względem HO) 7,75 (d, J=9 Hz, 2H, aromaty), 7,05 (d, J=9 Hz, 2H), 5,ii (d, J=3 Hz, H-i-fuc, iH), 4,95 (m), 4,52 (d, J=8 Hz, iH), 4,25 (d, J=8 Hz, iH),

4,i9 (d, J=2 Hz, iH),4,i5-3,39 (m), 3,82 (s, 3H, OCH), 2,75 (dd, J=3 Hz, J=i i Hz, Hekw-3 (kwas sialowy), iH), i,99 (s, 3H, NAc), i ,77 (dd, J=i0Hz, J=i0 Hz, Hks-3 (kwas sialowy), iH), i,i7 (m, SH, H-6-fuc, CH2CH3).

[(5-acetamidu-3,5-dideuksy-α-D-glicero-D-2aIakio-2-2noplopiranozylupian)]-(2,3)-O-(β -D-2alakiopiranozylu)-(1,4)-O-[(α-L-2ukopiranozylu)-(l,3)]-O-(2-p-terii2utrlbenzamiZu -2-2zoksy-2-D-2lukouHanozylo)-(i Aj-O-e-D-aktaiopii'apozyZ etylu (Związek 36).

Rf = 0,52 (3:i i-PrOH:NH4OAz), biała substancja stała, 46 mg, 90%.

Ή NMR (300 MHz, δ w ppm względem H2O) 7,65 (d, J=9 Hz, 2H, aromaty), 7,58 (d, J=9 Hz, 2H), 5,i9 (d, J=4 Hz, H-i (fuc), iH), 4,95 (m), 4,57 (d, J=8 Hz, iH),4,38 (d, J=8 Hz, iH),

4,i9 (d, J=2 Hz, iH), 4,i5-3,39 (m), 2,73 (dd, J=3 Hz, J=ii Hz, Hkw-3 (kwas stalowy), iH), 2,05 (s, 3H, N Ac), i,77 (dd, J=i0 Hz, J=i0 Hz, Hak--3 (kwas stalowy), iH), i,24 (s, 9H, t-Bu), i, i7 (m, 5H, H-6-fuc, CH2CH3).

‘76272

[(5-acettanido-3,5-dideoksy-α-D-gllceIΌ-D-kalakto-k-rlonulopiranozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-garaktopiranozylo)-( i ,4)-O-[(a-L-ftikopiranozylo)-( - ,3)]-O-(2-benzamido-2-deoksy-β-Dglukopiranozylo)-(1,3)-O-β-D-karaαtopiranozyd (Związek 37).

Ή-NMR (300 MHz, δ w ppm względem H2O) -,-5 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 - fuc), i,8(IH, t, J=-0,4 Hz, H-3a - NANA), 2,02 (3H, s, CH3CONH), 2,78 (-H, dd, J=i0,4 Hz, 3,2 Hz, H-3e - NANA), 3,5-4,2 (m), 4,4-4,8 (m), 5,09,5,-6 (d, d, H-- of FUC, a, p), 5,2 (d, J=3,4 Hz, H-- a), 7,5-7,8 (5H, aromaty).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-α-D-gllceIΌ-D-kalakto-k-knoulopiirmozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-galaktopiranozylo)-( - ,4)-O-[(a-L-fukopiranozylo)-( i ,3]]-O-(2-aenzamido-2-deoksy-β-Dglukopiranozylo)-(-,3)-O-β-D-garaktopiranozyd benzylu (Związek 38)

Ή-NMR (300 MHz, δ w ppm względem H2O) i,08 (3H, d, J=6,4 Hz, CH3 - fuc), i,76 (-H, t, J=-0,4 Hz, H-3a - NANA), i,97 (3H, s, CH3CONH), 2,7 (-H, dd, J=-0,4 Hz, 3,2 Hz, H-3e - NANA), 3,4-4,2 (m), 4,5 (-H, d, J=7,7 Hz), 4,6 (-H, d, J=8,0 Hz), 5,02 (d, J=3,8 Hz, H-i - FUC), 7-7,8 (i OH, aromaty).

Dane NMR Związków 44-49

[(5-acet<αnido-3,5-dideoksy-α-D-gllcero-D-kalakto-k-knnulopπrmozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-gditopirrmozylo)-(-,4)-O-[(α-L--ukopirrnozylo)-(-,3)]-O-)2--3,4-kichlorobenzamido-2-deoksy -β-D-klukopiranozyk>)-(1,3)-O-β-D-gallr<topiranozyd etylu (Związek 44).

Ή-NMR (270 MHz, δ w ppm względem H₂O) 7,82 (s, iH), 7,56 (m, 2H), 5,99 (d, J=3,96 Hz, -H), 4,47 (d, J=7,59 Hz, iH), 4,25 (d, J=7,9- Hz, -H), 4,I5-3,22 (m), 2,66 (dd, J=-2,54 Hz, J=3,96 Hz, IH), i,94 (s, 3H), -,76 (t, J=i2,54 Hz, -H), -,i0 (m, 6H).

[(5-acelamido-3,5-dideoksy-α-D-gllcero-D-kalakto-k-konulopir^mozylonian)]-(2,3)-O-)β -D-garaktopiranozylo)-(1,4)-O-[(α-L-fukopiranozylo--(1,3])-O-(2-furanami0k-k-deoksk-β-D -glukopiranozylo)-(-,3)-O-β-D-gar^aίtopiranozyd etylu (Związek 45).

‘H-NMR (270 MHz, δ w ppm względem H₂O) 7,59 (d, J=i,98 Hz, IH), 7,i0 (d, J=3,63 Hz, IH), 6,54 (dd, J=3,36 H2, J=i,98 Hz, IH), 5,05 (d, J=4,29 Hz, IH), 4,46 (d, J=7,59 Hz, -H), 4,23 (d, J=7,92 Hz, IH), 4,06 (d, J=2,97 Hz, iH), 4,02-3,32 (m), 2,68 (dd, J=i2,87 Hz, J=3,96 Hz, -H), i,95 (s, 3H), i,77 (t, J=i2,87 Hz, -H), i,08 (m, 6H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-α-D-gllceIΌ-D-kalakto-k-knnulopiranozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-garlrk:opiranozylo)-( i ,4)-O-[(α-L-fukopiranozylo)-(1,3)]-O-(2-tiofenamidk-2-deoksy-β-D -glukopiranozylo)-(-,3--O-β-D-galaktopiranozyd etylu (Związek 46).

¹ H-NMR (270 MHz, δ w ppm względem H₂O) 7,63 (m, 2H), 7,-0 (m, -H), 5,06 (d, J=3,63 Hz, -H), 4,46 (d, J=7,92 Hz, -H), 4,23 (d, J=7,92 Hz, IH), 4,06 (d, J=3,30 Hz, UH), 4,04-3,30 (m), 2,67 (dd, J=-2,2- Hz, J=3,96 Hz, IH), i,94 (s, 3H), i,73 (t, J=-2,2- H2, IH), i,07 (m, 6H).

[(5-kcettmido-3,5-dideoksykX-D-gllcero-D-karakto-k-konnlopπrαlozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-gar;rkopirίmozylo)-(-,4)-O-)(α-L-kukopirrnozylo)-(1,3)]-O-)2--2-tiometylolnikolynamido-2 -deoksy-β-D-glukopίranozylo)-(l,3--0-β-D-garaktopiranozyd etylu (Związek 48).

Ή NMR (270 MHz, δ w ppm względem H₂O) 7,62 (m, 2H), 7,06 (m, -H), 5,04 (d, J=3,96 Hz, IH), 4,43 (d, J=7,59 Hz, IH), 4,23 (d, J=7,92 Hz, IH), 4,i0-3,20 (m), 2,68 (m, IH), 2,i4 (s, 3H), 2. 09 (s, 3H), -. 70 (m, -H), i,05 (m, 6H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-α-D-glicero-D-karakto-k-konulopiranozylonian)]-(2,3)-O-(β -D-kd;rktopiranozylo)-(i,4)-O-[(α-L-)ukopiranozylo)-(-,3)]-O-)2-(ćekdddcyloksy-k--rrtamido)-2 -deoksy-β-D-klukopi^ranozylo]-(-,3)-O-β-D-karaktopiranozyd etylu (Związek 47).

‘H NMR (270 MHz, δ w ppm względem CH3OH) 8,32 (s, -H), 7,90-7,78 (m, 3H), 7,26-7, ‘6 (m, 2H), 5,-7-5,i3 (m, iH), 4,48-4,40 (m, iH), 4,22-3,32 (m), 2,88-2,82 (m, ‘H),2,0(s, 3H), -,85--,‘9 (m), 0,9--0,85 (m, 3H).

[(5-acetamido-3,5-dideoksy-α-D-glicero-D-kalakto-k-konulopiranozylonian)]-(2,3)-O-)β -D-karaktopiranozylo)-(-,4)-O-[(α-L-kukopiranozylo)-(i,3)]-O-(2-m-katyloksybenzamid o-2-deoksy-β-D-klukopiranozylo)-(-,3)-O-β-D-gar^αtopiranozyd etylu (Związek 49).

-H-NMR (270 MHz, δ w ppm względem H₂O) 7,39-7,22 (m, 3H), 7,-3-7,09 (m, -H), 5,03 (d, J=3,96 Hz, -H), 4,46 (d, J=7,92 Hz, iH), 4,23 (d, J=7,92 Hz, UH), 4,07-3,34 (m), 2,68-2,64 (m, iH), i,93 (s, 3H), i,74--,62 (m, 3H), -,30--44 (m, 2H), i,07 (t, J=7,25 Hz, 3H); i,06 (d, J=5,60 Hz, 3H), 0,84 (t, J=7,58 Hz, 3H).

Dane związków 50 i 5i

176 272

[:5a.lc;c'lίanidoa3,5-tłideoksy-αaD--^ll(^l^lxo^a^-al^ll^l^itoa-annoll·)f^^lrao^ozylooam)]-(2,3)-O-(ββ -D-aalakiopiranozylo)-(1,4)-O-[(α-L-aukopiranozylo)-(1,3)]-O-(2-nikotynamido-2-deokjy a3aDallll^opi^ΓaΓ^ozyk>)-( 1,3)-O-β-D-gHlaktopiranozyd etylu (Związek 50).

Rf = 0,22 (krzemionka, izopropanol/1'M NH4OAC).

‘H NMR (300 MHz, D2O) : δ 1,13 (d, 3H, j=6,6 Hz, CH3 fuc), 1,15 (t, 3H, J=6,7 Hz, OCH2CH3), 1,78 (t, 1H, J=11,9 Hz, H-3a NANA), 2,01 (s, 3H, COCH3), 2,74 (dd, 1H, J=4,4, 11,9, H-3e NANA), 3,41-4,33 (szereg pików, 34H), 4,31 (d, 1H, J=8,1 Hz, β-anomer Gal), 4,53 (d, 1H, J=8,0 Hz, β-anomer Gal), 5,10 (d, 1H, J=3,7 Hz, α-anomer fuc), 7,56 (m, iH, H-5 pirydyl), 8,16 (dd, 1H, J=1,3, 8,1 Hz, H-4 pirydyl), 8,68 (m, 1H, H-6 pirydyl), 8,85 (s, 1H, H-2 pirydyl).

[(5-acetamido-3,5-dideokjy-α-D-gllcero-D-aalakio-a-nonolopiraαozylonian sodu)](2,3)-Oaβ-D-aalakiopiranozyloH 1,4)-O-[(α-L·lukopirαnozylo)-(1,3)H)-O-t--2-tenzennsulfonami do-2-deoksy-β-D-alukopiraoozyd)-β-D-galakiopiranozyd etylu (Związek 51).

Rt = 0,28 (krzemionka, 20% iM NH4O Ac/izopropanol).

iH^MR (300 MHz, D2O, ppm względem HO): δ 7,92 (d, J=7,4 Hz, 2H), 7,69 (d, J=7,2 Hz, 1H), 7,60 (t, J=7,2 Hz, 2H), 5,47 (d, J=4,0 Hz, 1H), 4,62 (d, J=8,1 Hz, 1H), 4,51 (d, 1=1,6 Hz, 1H), 4,24 (d, J=8,0 Hz, 1H), 4,07 (dd, J=3,1,9,6 Hz, 1H), 3,99 (d, J=3,1 Hz, 1H), 3,96=3,46 (m, 29H), 2,75 (dd, J=4,6,12,5 Hz, 1H), 2,68 (dd, J=8,1,8,1 Hz, 1H), 2,02 (s, 3H), 1,78 (t, J=12,1 Hz, 1H), 1,20 (t, 3H), 116 (d, J=6,5 Hz, 3H).

Badanie wiązania komórek

Opracowano badanie adhezji komórkowej HL-60/zmodylikowaoej rekombmacyjnej rozpuszczalnej E-sdektyny, aby dostarczyć prostą i wysoce powtarzalną metodę, dzięki której można porównać potencjał blokujący E-selektynę analogów oligosacharydowych sialilowego Lewis X. W tej próbie, rekombinacyjna rozpuszczalna E-selekiyoa jest wiązana do plastikowej powierzchni płytki ELISA z 96 wgłębieniami. Do wgłębień są dodawane rozcieńczenia badanych związków analogów SLe\ a następnie komórki HL-60, noszące ligand dla E-seiektyny. Komórki pozostawiono, by przylegały do płytki do badań pokrytej Easelektyną i nie przylegające komórki usuwano przez przemywanie automatycznym przemywaczem płytek. Związane komórki policzono przez zmierzenie mieloperoksydazy enzymu komórkowego. Stężenie badanego oligosacharydu wymagane dla uzyskania 50% inhibitowania kontrolnej adhezji użyto do porównania mocy analogów. Skuteczność stosowania podobnej części związanego rekombinacyjnego rozpuszczalnego ELAM-1 jako substratu dla wiązania HL-60 i innych komórek, które wiążą się do komórek zawierających receptor ELAM-I (E-sclcktynę) wykazali Lobb et al., J. Immunol., 147: 124--19(1991).

Materiały i metody

Materiały

Płytka ELISA, Immulon 2 (Dynatec Laboratories) (Fisher 14-245-61)

Jednostki filtru 0,2 m (Nalgene #150-0020) rELAM (rekombinacyjny zmodyfikowany ELAM-1) oczyszczony na zasadzie powinowactwa, wytworzony jak opisano poniżej. Każdą szarżę rELAM zbadano co do funkcji, by oznaczyć odpowiednie stężenie do stosowania w badaniach. Szarżę miareczkowano w zakresie 1-5 ug/ml za pomocą iohibitowaoia Związkiem Z (opisanym poniżej) jako standardem. Następnie przygotowano małe części próbek, zamrożono w łaźni z acetonem i suchym lodem i przechowywano w -70^oC. Każdą próbkę otwierano tylko raz i następnie wyrzucano lub przechowywano, by użyć w innych rodzajach prób.

Rozpuszczalną postać E-selektyny (rElam lub sol-E-seiekiyna) użytą w niniejszych próbach wytworzono przez usunięcie z cDNA domeny przezbłonowej. To rekombinacyjne cDNA klonowano na wektor (ssaków) dla ekspresji pCDNAl [pochodna pCDM 8; Seed, Natura, 329:840 (1987)], który zawiera chimeryczny promotor wirusa HIV/cytomegalowirusa. Po wprowadzeniu go do linii komórkowej 293 ludzkiej nerki transformowanej adenowirusem, ekspresja promotora CMV jest skutecznie aktywowana przez produkty genów El według mechanizmu, który nie został w pełni podany. Wprowadzono konstrukcję pCDNAI-sol-E-seeektyna, poprzez transfer genu za pośrednictwem fosforanu wapnia, do 293 komórek i wygenerowano stabilną linię komórkową ekspresjonującą wysokie poziomy sol-E-seiekiyny. Sol-E-sdektyna

176 272 wytwarzana przez te komórki była oczyszczana Za pomocą chromatografii na zasadzie immunopowinowactwa na kolumnie Proteina - Sepharose z przeciwciałem monoklonalnym anty-Eselektyny.

Bardziej szczegółowo, linię komórkową 293 z transformowanej adenowirusem ludzkiej nerki otrzymano z ATCC (CRL-1573). 293 komórki wzrosły jako adherentna hodowla w DMEM, otrzymana z Whittaker Bioproducts (Walkerville, MD), zasilone -0% surowicy płodu bydlęcego (FBS), otrzymanej z JRH Biochemical (Lenexa, KS).

Plazmid pCDNA-, pochodna pCDM8 [Seed, Nature, 339:840 (-987)] otrzymano z Invitrogen (San Diego, CA). Plazmid pBluescript II otrzymano z Stratagene (San Diego, CA). Plazmid pSV2-neo [Southern et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:327 (1982)] zawiera gen E. coli kodujący aminoglikozyd 3'-fosfotransferazy. Gdy pSV2-neo jest wprowadzony do komórek ssaka, transfekowane komórki wykazują odporność na antybiotyk G418.

Fragment DNA o 1,67 Kbp kodujący ucięty gen strukturalny dla E-selektyny wyizolowano przez wzmocnienie przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) cDNA wyprowadzonego z m RNA, wyizolowanego z ludzkich komórek śródbłonkowych aktywowanych IL-1. Amplimer 5' wstawił jedyne miejsce restrykcyjne Cla - 28 nukleotydów w górę od kodona inicjacji genu strukturalnego. Erselektyny. 3'-Amplimer wstawił kodon końcowy TGA po aminokwasie numer 527 dojrzałej E-selektyny, po którym nastąpiło jedyne miejsce restrykcyjne Xhol. Koniec karboksy sol-E-sdektyny jest umiejscowiony na końcu karboksy szóstego powtarzanego elementu zgodności, tym samym usuwając domenę przezbłonową. Fragment PCR o 1,67 Kbp współw-ytrawiano z endonukleazami re^l^tr^'^mi Cla - oraz Xho 1 i subklonowano na miejsca restrykcyjne Cla 1 Xho wektora klonującego pBluescript, dając wektor pBSn-sol-E-selektyny. Rozpus/c/alna E-sdektyna ma 527 aminokwasów długości i zawiera 11 potencjalnych miejsc glikozylacji.

Fragment DNA o - ,67 Kbp zawierający cDNA sol-E- s^łl3[^ k^j/ny wyizolowano z pBSlk solEn^el(^^^^Jyny i subklonowano na miejscach Eco RV oraz Xho 1 wektora ekspresji pCDNA1, tym samym dostarczając wektor pCE^N A1 -aj;>l-lE-sslektyny.

pCDN A1-s sd-Iz-aslektyn^ kotransfekowano z pSV2-neo, przez technikę fosforanu wapnia [Kriegler, Gene Transfer and EXpression: A Laboratory Manual, W. H. Freeman, New York, N. Y. (199-)] do 293 komórek. 48 godzin po transfekcji, transfekowane 293 komórki trypsynizowano i płytkowano na DMEM, 10% FBS, oraz 600 mg/ml G418 (Geneticin, Sigma). Ośrodek zmieniano co trzy dni, dopóki uzyskano trwałą populację odporną na G4-8.

Pojedyncze klony komórek odpornych na G418 wyizolowano za pomocą cylindrów klonujących. Wyizolowane klony przesiewano dla syntezy jol-E-sslektyny za pomocą próby immunosorbenta /wią/anego z enzymem (ELISA), wykorzystując przeciwciało monoklonalne anty-E-aslektyny oznaczone CY1787 jako pierwotne przeciwciało. Dodatnie klony płytkowano przy 10⁶ komórek/ 100 mm płytki. Były one metabolicznie znakowane 24 godziny później przy użyciu [3⁵S]-mettoniny przez pięć ' godzin. Znakowaną sol-E-aelektynę immunoznakowano z ośrodka z przeciwciałem monoklonalnym anty-E-selektyny i elektfóforezowano przez 10%· żel PAGE, żel wysuszono i poddano autoradiografii. Wybrano klon 293#3 jako trwałą linię komórkową, która wytworzyła największą ilość 110-Kd joln^ί-sjill^l<tyi^y proteiny/komórkę.

10-komorową Nuc Cell Factory (6250 cm2 całkowitego pola powierzchni, Nunc) obsiano za pomocą 2,78 x 10⁸ komórek (klon 293#3) w 850 ml w DMEM uzupełnianym 5% FBS i inkubowanym w 37°C przez 72 godz. Pożywkę zebrano i zastąpiono 850 ml DMEM 5% FBS. Po inkubowaniu Cell Factory w 37°C przez 48 godz., pożywkę zebrano po raz drugi i zastąpiono 850 ml DMEM 5% FBS. Po inkubowaniu Cell Factory w 37°C przez48 godz., pożywkę zebrano po raz trzeci i ostatni. Po każdym zebraniu, 0,02% azydku sodu dodano do pożywki. Pożywkę wyklarowano przez odwirowanie (5000 x g), przepuszczono przez filtr 0,2 mm i przechowywano w 4°C do dalszego oczyjzc/ania.

Przeciwciało monoklonalne CY-787 sprzężono z Sepharose proteiny A zasadniczo tak, jak opisali Schneider i in., J. Biol. Chem, 257:10766 (1982).. Ujmując to w skrócie: 28 mg monoklonalnego CY-787 (5 mg/ml) w PBS zmieszano z 5 ml Sepharose proteiny A przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Następnie kulki przemyto czterokrotnie przez odwirowywanie przy użyciu 25 ml 0,2 M buforu boranowego, pH 8,2, po którym nastąpiły dwa przemywania

5s

17s 272 przy użyciu 10 ml 0,2 M irietanoloaminy, pH 8,2. Następnie żywicę przeprowadzono w stan zawiesiny w 40 ml 0,2 M buforu trietanoloaminy, pH 8,2, zawierającego 0,02 M dimetylopimelimidanu. Po prowadzeniu reakcji przez 45 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, żywicę przemyto dwukrotnie przy użyciu 0,02M etanoloaminy, pH 8,2, po którym nastąpiły trzy przemywania przy użyciu -0 ml 0,2 M buforu boranowego, pH 8,2. Niezwiązane przeciwciało usunięto przez wymywanie buforem 0,1 M octanu sodu, pH 4,5. Z użytego przeciwciała, 89% zastało sprzężone do Sepharose proteiny A.

Ciecz sklarowana nad hodowlą tkankową (2550 ml) przepuszczono przez wstępną kolumnę (0,7 cm x 1,5 cm) Sepharose proteiny A połączoną szeregowo z kolumną chromatograficzną powinowactwa (1,5 cm x 3 cm) CY-787-Sepharose proteiny A przy szybkości przepływu 20 ml/godz. Następnie kolumny rozłączono, a kolumnę powinowactwa zawierającą CY1787 przemyto buforem 20 mM Tris, pH 7,5, zawierającym 150 mM NaCl i 2 mM CaCl2, dopóki absorbancja eluatu przy 280 nm osiągnęła zero. Związaną E-selektynę wymyto buforem 0,1 M octanu sodu, pH 3,5, zawierającym 1 mM CaCl 2 przy użyciu przepływu grawitacyjnego. Frakcje (1 ml) zebrano do 300 ml 2M Tris, pH 10. Frakcje zawierające proteinę zebrano i dializowano wobec DPBS. Po zatężeniu Amicon Centriprep 30 dopóki stężenie proteiny osiągnęło 1 mg/ml, oczyszczoną selektynę podzielono na części i przechowywano w -80°C. Czystość była większa niż 90% (SDS-PAGE). Ogółem oczyszczono 10 mg E-selektyny z 2550 ml pożywki hodowli komórkowej.

Du1becco’s PBS (DPBS) (Whittaker, 17-513B) HL-s0 (ATCC, CCL 240). Duża porcja komórek HŁ^-s0 wzrosła, była zbadana na działanie i stwierdzono, że jest pozbawiona mykoplazmy. Komórki zamrożono przy -180°C w 10%o DMSO, 10% surowicy płodu jagnięcego, 80% RPMI —s40 (WhiUaker) przy -5 x 1(0 komórek na ampułkę w krioampułkach 2 ml. Zamrażanie wykonano przy użyciu zamrażacza o kontrolowanej szybkości. Związek Z: standardowy pentasacharyd SLeX - OEt; NeuAca->3Gaiei->[Fukal->]GlcNacei->3GaieOEt

Wzorzec Związku Z przygotowano w postaci 10 mM roztworu w DPBS. Roztwór przechowywano w temperaturze -20°C.

Związek Z: standardowy wykonano jako 10 mM roztwór w DPBS

Bufor do przemywania neuńofila (NWB):

10Χ HBSS (Gibco, 3-0-4065) 20 nm

1M HEPES (Gibco, 380^^s30) 2 ml

Super Q H₂O 178 ml

D-Glukoza (Sigma, G 7021) 0,4 g

200 ml

Przygotowywać świeży roztwór codziennie lub przechowywać .s^i^ir^dli^^owany roztwór w temperaturze 4°C.

pH w zakresie 7,2-7,4, sterylizowany przez filtrację (0,2 μ).

100 mM CaCl2 produkt wyjściowy:

Chlorek wapnia, bezwodny (Baker, -308) 11 i g

Super Q H₂O 100 ml

Steiylizowany przez filtrację (0,2 m) 100 ml

Bufor przemywający neutrofi1+ - mM CaCĘ + 0,1 procent (NBW/Ca/BSA): Albumina surowicy krwi bydlęcej (Sigma, A^l 8) 10 g

100 mM CaCl2 produkt wyjściowy 100 ml

NBW do 1000 ml pH od 7,2 do 7,4. SteiyUzowany przez filtrację (0,2 μ), przechowywać w temperaturze 4°C.

Bufor blokujący:

DPBS (Whittaker, 17-513B)

Albumina surowicy krwi bydlęcej (Sigma, A-s918)

100 ml Ig

100 ml

176 272 pH od 7,2 do 7,4. Sterylizowany przez filtrację (0,2 μ), przechowywać w temperaturze 4°C. Roztwór kwasu cytrynowego 0,- M:

Kwas cytrynowy, bezwodny, wolny kwas (Sigma, C-0759) -0,5 g

Super Q H2O doprowadzać do 5500 ml

Przygotować w cylindrze objętościowym lub miarowym. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

Roztwór fosforanu sodu, 0,2M:

Fosforan sodu, dwuzaoadowy, bezwodny (Na2HPO4) (Sigma, S-0876) 14,2 g

Super Q H₂O doprowadza ć do 500 ml

Przygotować w cylindrze objętościowym lub miarowym. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

Roztwór fosforanu sodu (0,2M): Fosforan soou, 14,2 g dwuzasadowy, bezwodny (Na2HPO4) (Sigma, S-0876)

Super Q H2O doprowadzi do 500 ml ml

Przygotować w cylindrze objętościowym lub miarowym. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

Bufor cytrynianowo-fosforowy:

Roztwór kwasu cytrynowego (0,1 M) 24,3 ml

Roztwór fosforanu sodu (0,2M) 22,7 ml

Super Q H2O 50 ml

Przechowywać w temperaturze pokojowej.

Bufor lizji komórkowej:

Nonidet P 40 (NP-40) (Sigma, N-6507) 0,1 g

0,1 M Cytrynian 24,3 ml

0,2M Fosforan sodu, dwuzasadowy 25,7 ml

Super Q H2O 50 ml

100 ml

Przechowywać w temperaturze pokojowej.

OPDA (o-aenyj^eno<U^amina):

Bufor cytrynianowo-fooforanowy -0 ml

Dichlorowodorek o-aenyjenodiamlny (Sigma, P 8287) 10 mg

H2O2 (Sigma, H 1009) 10 μΕ ml

Przygotować bezpośrednio przed użyciem. Nadtlenek wodoru przechowywano w ciemności w temperaturze 10°C.

Bufor hamujący H2SO4, 4 N

Kwas siarkowy, 18M (Fisher, A30C^s-212) 111 ml

Super Q H2O do 500 ml

Metoda

1. rELAM (80(^-616^^ noiriećceono do dopowiedniugo gtężenie di danty seiOe W tych oznaczeniach rELAM stosowano w stężeniu 2,5 μg/ml w DPBS. Stosując pipetę wielokanałową, do 50 μl na zagłębienie, dodano Uo następujących zagłębień płytki ELISA:E1-E6, F1-F6 oraz G1-G6. DPBS (50 μθ dodano do zagłębień H1, H2 i H3 dla celów kontrolnych. Płytka ta jest określana jako płytka do badania wstępnego.

Jedną dodatkową płytkę do prób pokryto na każde trzy badane próbki. Ponownie, przy użyciu pipety wielokanałowej 50 μl re/cieńc/enegę rELAM dodano Uo następujących

176 272 zagłębień płytek: B1-B12, C1-C12,D1-D12,E1-E12,F1-F12, G1-G12. DPBS (50 gl) do płytek Hi, H2 oraz H3 dla celów kontrolnych. Płytki te są znanejako płytki dla próbek. Płytki te pokryto folią i inkubowano trzy godziny w temperaturze pokojowej.

2. Płytki przemyto trzykrotnie buforem blokującym 200 gl. Zagłębienia ponownie napełniono 2CC gl buforu blokującego pokrytego folią i inkubowanego w temperaturze pokojowej przez jedną godz.

3. Trzy ampułki zamrożonych komórek HL-60 rozmrażano dla każdych dwóch przygotowanych płytek dla próbek. Ampułki szybko rozmrażano w łaźni wodnej 37°C. Komórki wpipetowano do probówki do wirówki (15 ml) zawierającej 10 ml lodowatego NWB z 1%BSA. Komórki odwirowywano przez siedem minut przy 1200 obr/min w wirówce w 4°C i przemyto jeszcze dwukrotnie w NWB/BSA. Komórki zliczono przy użyciu hemocymetru i powtórnie przeprowadzono w w stan zawiesiny w układzie: I07/ml w NWB + 1% BSA + ImM CaCl2.

4. Podczas gdy komórki były przemywane, przygotowano roztwory związku: standardowy i do badania. Związek oligasacharydowy przeznaczony do badania zważono w probówkach eppendorfa i dodano DPBS w ilości wystarczającej, by każda próbka stanowiła 10 mM roztwór według jego ciężaru cząsteczkowego. 6 gl każdej próbki usunięto i 2 gl rozdzielono między wszystkie kwadraty paska testowego pH. Jeśli nie miała pH 7-7,4, wartość pH doprowadzano do tego zakresu lub związku nie badano. Badanie wymaga 180 gl roztworu 10 mM każdego roztworu związku oraz 180 gl 10 mM roztworu standardowego Związku Z na każdą płytkę używaną w badaniach, w tym płytkę do badania.

5. Blokowane płytki ELISA odwrócono, strzepnięto i wykonano plamy na ręczniczkach papierowych, by usunąć całą ciecz z zagłębień. Do każdego zagłębienia dodano następnie 40 gl NWB + 1% BSA + 1 mM Ca2+ przy użyciu pipety wielokanałowej.

6. Całą ciecz usunięto z zagłębień E 6 i G 6 płytki do wstępnego badania. 40 gl 10 mM roztworu Związku Z dodano do każdego z pustych zagłębień, jak również do zagłębień E5 i G5. Roztwór w zagłębieniu E5 zmieszano przez pipetowanie i odpipetowywanie 10 razy (pipeteman p 200 ustawiony na 40 gl). 40 gl roztworu usunięto z zagłębienia i rozcieńczono seryjnie wzdłuż płytki w zagłębieniu E4, a następnie E3, a następnie E2, każdorazowo mieszano 10 razy. 40 gl usunięto i odrzucono z ostatniego zagłębienia. Procedurę tę powtórzono dla rzędów G4 do G2.

7. Komórki HL-60 (2 x 105) dodano do każdego zagłębienia (oprócz Hi) w 20 gl przy użyciu pipety wielokanałowej. Płytkę tę umieszczono przez pięć sekund na wstrząsarce dla płytek, i odstawiono na 15 minut w temperaturze pokojowej.

8. Płytkę przemyto przy użyciu przemywarki Molecular Devices Microplate nastawionej na powolne dostarczanie cieczy i na 3 przemycia na zagłębienie (roztwór przemywający: NWB + 1% BSA + 1 mM CaCb.

9. Bufor do lizji komórkowej (50 gl na zagłębienie) dodano i płytkę umieszczono na wstrząsarce na pięć minut w temperaturze pokojowej.

10. Dodano 50 gl na zagłębienie roztworu OPDA i płytkę umieszczono na wstrząsarce płytek przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

11. Reakcję barwiącą zatrzymano przez dodanie 40 gl na zagłębienie H2SO4 buforu zatrzymującego i odczytano przy 492 nm gęstość optyczną (O. D.) dla zagłębień, odejmując zagłębienie Hi jako ślepą próbę.

12. Kontrolę negatywną określono przez obliczenie średniej wartości O. D. dla zagłębień H2iH3. Jest to negatywna kontrola wiązania bez E-seeektyny. Pożytywną kontrolę wiązania obliczono dla krzywej standardowej jako średnią dla zagłębień E1, Fi, F2, F3, F4, F5, F6 i Gi. Jeśli negatywna kontrola wiązania bez E-seeektyny była większa niż 10% średniej pozytywnej kontroli wiązania, próby nie kontynuowano. Jeśli wartość ta była mniejsza niż lub równa 10% średniej pozytywnej kontroli wiązania, duplikaty próbki (E6, G6), (E5, G5), (E4, G4), (E3, G3) i (E2, G2) uśredniono. Każdą śr^Jmią duplikatu podzielono przez średnią wartość pozytywnej kontroli wiązania, uzyskując procentowość pozytywnego wiązania dla każdego stężenia badanego związku. Procent pozytywnej kontroli wiązania wykreślono względem logarytmu stężenia inhibitora. Z wykresu wyznaczono punkt inhibitowania 50%. Punkt ten powinien leżeć pomiędzy 0,5 a 1,5 mM, a jeśli tak nie było, próby nie kontynuowano.

176 272

13. Jeśli krzywk zawdiodowa uOwa dy ws tuonwgobadan ia minie i hi się w obręw io «rępi^szczalnych granic, następowała ρę/ojtała część próby. Standardowy Związek Z rozcleńczędo na każdej płytce z próbkami jak w etapie 6. Badane związki ro/cieńc/adę podobnie. Badane związki analogi SLe* umlsjzc/ędę na płytce według następującego schematu:

Stężenie		Próba #-	Próba #2	Próba #3
6,6 mM	lub Rozc.1	B6,D6	B7,D7	E7,G7
3,3 mM	Re/c.2	B5,D5	B8,D8	E8,G8
1,65 mM	Rozc.3	B4,D4	B9,D9	E9,G9
0,82 mM	Rozc.4	B3,D3	B10,D-0	E-0,G10
0,4-2 mM	Rozc.5	B2,D2	B-1,D11	E-1,G--

-4. GUy wszystkie badane próbki ro/cieńc/ęne na płytce, płytki HL-60 dodano, tak jak w etapie 7 powyżej, i procedura postąpiła przez etap 11 jak powyżej.

15. Oblic/ono średrnią pozytywnej kontroli dią/adia dla próby #- z zagłębień B2, Cl -6 i D2; dla próby #2 z zagłębień B12, C7--2 i D12; oraz Ula próby #3 z zagłębień E12, F7--2 i G12. Procent pozytywnego wiązania dla każdego rozcieńczania każdej próby wykreylędo i z wykresu wyzdaczedo punkt 50% idhibitowania. Aktywność dla każdego badanego związku analogu SLeX zapisano jako stosunek wartości 50% wią/ania dla standardowego Związku Z peUzleledy przez 50% wartości wiązania dla badanej próbki SLeX. Wartość Ula samego SLeX określono podobnie.

Stosunki dla samego SLeX i szeregu rozpatrywanych związków analogów SLe.x podano w tabeli 4, poniżej.

Tablica 4

Badanie adhezji komórkowej An^elektydy

Iloraz

Związek Związek nr IC5 związku Z ( IC^ ;ąviązku

0.76

5.0

3.2

I76 272

Tablica 4 (ciąg dalszy)

Badanie adhezji komórkowej E-se!ektyny

Iloraz

Związek Związek nr IC5 związku Z ( ICgo związku

4.3

0.53

9.3

10.0

112

0.2

4.7

5.7

8.9 si m 272

Tablica 4 (ciąg dalszy)

Badanie adhezji komórkowej E-selektyny

Związek

Iloraz

Związek nr 1650 związku Z ( IC.ą z/kązku

4.0

10.0

HO OH I wo-J-SrOJ

AcHM-**» ‘OOC

2.3

6.0

4s

6.0

0.3

176 272

Tablica 4 (ciąg dalszy)

Badanie adhezji komórkowej E-seiektyny

Iloraz

Związek Związek nr (1^50 związku Z ( IC,ą z/kązku

Powyższe jest zamierzone jako zilustrowanie niniejszego wynalazku lecz nie jego ograniczenie. Można wykonać liczne zmiany i modyfikacje bez odchodzenia od prawdziwego ducha i zakresu nowych idei wynalazku.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Analog sialilowy Le^x o wzorze I .OR² w którym Z oznacza wodór, C1-Ce-acyl lub

   R'w

   H₃c a Y jest wybrany z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

   R¹ jest wybrany z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-C3-alkilen, w którym aryl ma jeden pięcio- lub sześccoczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowane pierścienie aromatyczne pięcio/sześcio-członowy, lub dwa skondensowane szescioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej: pierścienie hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Cl-Cis-aaki!, CiCi-ancoksy, amino, mono-Ci-Cis-alkilamino, di-Cl-Cll-alkiiamino, benzylamino, Ci-Cn-alkilbenzylamino, Όι-<Ζι---ϊοη11ο1 i Ci-Ci--allkikarboksamido, lub

   R-Y oznacza alliloksykarbonyl lub chloroacetyl;

   R² jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, Ci-Cn-hydrokarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, Ci-Có-alkilo-Ci-Cs-alkileno-m-kiuboksylan, m-tri--CiC4-^ll^ii^oy^l^?enylo)-sililo-C2-(C4-^ll^ile3, monosacharyd i disacharyd;

   lub OR2 łącznie tworzą karbaminian Ci-Cn-hydrokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

   R³ oznacza wodór lub Ci-Ce-icy!;

   R⁴ oznacza wodór, Ci-C6-alkil lub benzyl;

   R⁵jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i Ci-Cs-acyl;

   R⁷ oznacza metyl lub hydroksymetyl; i

   X jest wybrany z grupy obejmującej: Ci-C6-acyIoksy, C2-C6-hydroksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec i azydo.
2. 2. Analog sialilowy LeX o wzorze

   176 272 w którym Y jest wybrane z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

   R¹ jest wybrane z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-t^-aakilen, w którym aryl ma jeden pięcioczłonowy pierścień aromatyczny, jeden sześcioczłonowy pierścień aromatyczny lub dwa skondensowane sześcioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej: pierścienie hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Ci2-alkil, Ci-Cn-alkoksy, amino, mono-Ci-Ci2-aakilamino, di-Ci-Ci-aldianino, benzylamino, Ci-CE-iOdlbenzylanino, Ci-Ci-tiorakil i Ci-Ci-ialtilkarboksamido, lub

   R2 jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, Ci-<TCis-l^h^^droYarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, Ci-C6-alkilo-Ci-C5-alkileno-ω-karboksylan, ω-tri(Ci-C4-alkilo/fenylo)-sililo-C2-C4-alkilen, monosacharyd i disacharyd;

   lub OR2 łącznie tworzą karbaminian Ci-Cn-hydrokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

   r3 oznacza wodór lub Ci-Ce-acyl;

   R⁴ oznacza wodór, Ci-Có-alkil lub benzyl;

   R⁵ jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i Ci-Có-acyl;

   R⁷ oznacza metyl lub hydroksymetyl; i

   X jest wybrany z grupy obejmującej: Ci-C6-acyloksy, C2-C6-hydroksylacyloksy, hydroksy, chlorowiec i azydo.
3. 3. Analog sialilowy Le^x o wzorze w którym Z oznacza wodór, .Ci-Có-acyl lub

   Ypest wybrany z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

   R ^rjest wybrany z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-t^-aakilen, w którym aryl ma jeden pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowane

   176 272 pierścienie aromatyczne pięcio/sześcio-członowy, lub dwa skondensowane sześcioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej: pierścienie hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Cis-aUdl, CiCi-alkoksy, amino, mono^^^i-Ci-idl^ilamino, di-Ci -Ci ilamino, benzylamino, Ci-Ci-alkilbenzylamino, Ci-Cts-tioalkil i Ci-Cis-aUdlkarboksamido; lub

   Riy oznacza alliloksykarbonyl lub chloroacetyl;

   R³ oznacza wodór lub Ci-C6-acyl;

   R⁴ oznacza wodór, Ci-Ce-aUdl lub benzyl;

   R⁵ jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, benzyl, metoksybenzyl, dimetoksybenzyl i Ci-C6-acyl;

   R⁶ jest wybrany z grupy obejmującej: wodór, Ci-Ct--hydrokarbyl o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, Cl-C6-alkilo-Cl-C6-alkileno-ω-karboksylan, m--ri--CiC4-alkilo/fenylo)-sililo-C2-C4-alkilen;

   lub OR² łącznie tworzą karbaminian Ci-Ci8-hydrokarbylu o prostym łańcuchu, rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

   R⁷ oznacza metyl' lub hydroksymetyl; i

   X jest wybrany z grupy obejmującej: Ci-C6-acyloksy, C2-<©6,—^2^cd^i^l^^^j^l^a^c^Ίoksy, hydroksy, chlorowiec i azydo.
4. 4. Analog sialilowy Le^x o wzorze w którym Y jest wybrane z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

   Ri jest wybrane z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Ci-t^-aUdlen, w którym aryl ma jeden pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowane pierścienie aromatyczne pięcio/sze.ścio-czionowy, lub dwa skondensowane sześcioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej: pierścienie hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monoiiahydrokaibylowy, monoazahy'drokait)ydowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl oznacza uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Cig-aUcil, CiCi-^koksy, amino, mono-Ci-Ci-^lklamino, di-Ci-Cn-^ldlamino, benzylamino i Ci-Cii-alkilbenzylamino, Ci-Cis-tioalkil i Ci-Ci --alkilkarboksamido;

   Rjest wybrane z grupy obejmującej: wodór, o prostym łańcuchu, o rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, ω-kaI·boksylcp-Cl-C6-alkilo-C|-C5-alkylapu, CO-tr-Ci^^CC4-aakilo/fenylo)-5i 1 ilo^^2-(C4--al^^len, monosacharyd i disacharyd;

   lub OR² łącznie tworzą Ci-Ci--kai©ammian-hydrokarbydu o prostym łańcuchu, o rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

   R⁷ oznacza metyl lub hydroksymetyl;

   a X jest wybrane z grupy obejmującej: Ci-C6-acyloksy, C2-<bc_>-l^J/chi^li:sJ/Il^αii/loksy, hydroksy, chlorowiec lub azydo.
5. 5. Kompozycjafarmacautyczna, znamiznna tyin żz obejmuje jarmafautycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik z rozpuszczoną lub dyspergowaną w nim inhibitujązą adhezję komórkową ilością związku o wzorze:

   176 272 w którym Y jest wybrane z grupy obejmującej: C(O), SO2, HNC(O), OC(O) i SC(O);

   R¹ jest wybrane z grupy obejmującej: aryl, podstawiony aryl i fenylo-Gi-Cs-aUkilen, w którym aryl ma jeden pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień aromatyczny, skondensowane pierścienie aromatyczne pięcio/sześcio-członowy, lub dwa skondensowane sześcioczłonowe pierścienie aromatyczne, które to pierścienie są wybrane z grupy obejmującej: pierścienie hydrokarbylowy, monooksahydrokarbylowy, monotiahydrokarbylowy, monoazahydrokarbylowy i diazahydrokarbylowy, a podstawiony aryl jest to uprzednio wspomniany aryl, mający podstawnik wybrany z grupy obejmującej: chlorowiec, trifluorometyl, nitro, Ci-Cis-aUcil, CiCis-ałkoksy, amino, mono-^C-(Ci8--dl<ikanino, di-Ci-Ci--ińłkiamino, benzylamino i Ci-Ci-alkilbenzylamino;

   R 2 jest wybrane z grupy obejmującej: wodór, Ci-Ci--hydrokarbyl o prostym łańcuchu, o rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny, oi-karboksylan Cl-C6-alkilo-Cl-C5-alkylenu, ω-tri(Cl-C4-allάlo/fenylo)sllllo-C2-C4-alkilen, monosacharyd i disacharyd, lub OR2 łącznie tworzą C1 -Ci 8 karbaminian hydrokarbylu o prostym łańcuchu, o rozgałęzionym łańcuchu lub cykliczny;

   R⁷ oznacza metyl lub hydroksymetyl;

   a X jest wybrane z grupy obejmującej: C-G-acyloksy, CGCf,-hydroksy kicyloksy, hydroksy, chlorowiec lub azydo.
6. 6. Sposób wytwarzania soli laktozoamoniowej, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   (a) domieszanie do laktulozy aminy pierwszorzędowej, która jest monopodstawioną pochodną amoniaku, i w której atom azotu jest związany z usuwalną na drodze redukcji grupą blokującą, taką jak benzylamina, tak by utworzyć mieszaninę reakcyjną, przy czym pierwszorzędowa amina służy zarówno jako reagent i rozpuszczalnik i jest obecna w ilości od około 2 do około 10 razy większej od ilości moli laktulozy, (b) utrzymywanie mieszaniny reakcyjnej w temperaturze od około 10°C do około 60°C przez okres czasu wystarczający dla utworzenia odpowiedniego N-glikozydu laktulozy, (c) przereagowanie utworzonego N-glikozydu laktulozy z kwasem karboksylowym o wartości pKa od około 2.5 do około 5.0 w ilości aż do równoważnikowej w Ci-tCa-aUki^l^olu jako rozpuszczalniku i w temperaturze około -0°C do około 30°C, tak by przekształcić N-glikozyd laktulozy w sól laktozoamoniową, w której grupa aminowa jest związana z usuwalną na drodze redukcji grupą blokującą, (d) usuniecie na drodze redukcji grupy blokującej ze wspomnianej soli laktozoamoniowej z zablokowaną aminą, tak by utworzyć sól laktozoamoniową.
7. 7. Związek według zastrz. 4, znamienny tym, że należy do grupy składającej się z:

   176 272
8. 8. Związek według zastrz. 4, znamienny tym, że należy do grupy składającej się z:

   O(CH₂)₃CH₃

   176 272
9. 9. Związek według zastrz. 4, znamienny tym, że należy do grupy składającej się z:

   176 272

   OMe oraz

   176 272