KR20090013816A - 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 활성화 전에 혈류에서 순환 시간이 천연 FIX의 것에 비하여 증가한 (환자에게 주입하고 일주일 후에 주입후 도달한 초기 활성 피크값에 비하여 FIX 활성의 적어도 약 5% 보유한다) FIX 유사체에 관한 것이다. 청구된 FIX 유사체는 FIX 유사체의 분자량을 증가시키는 화학기와의 콘쥬게이션에 의해 추가 변성된 삽입된 시스테인 잔기를 포함한다.

인자 Ⅸ 유사체

Description

연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 Ⅸ 유사체{FACTOR IX ANALOGUES HAVING PROLONGED IN VIVO HALF LIFE}

본 발명은 천연 FIX에 비하여 혈류에서 연장된 순환 시간을 갖는 특정한 혈액 응고 FIX 유사체 및 유도체에 관한 것이다.

인자 IXa(FIXa)는 응고 동안 적합한 트롬빈 형성을 지원하는데 요청되는 대부분의 인자 Xa를 Xase 복합체의 일부로서 발생시킴으로써 지혈에서 중요한 역할을 담당하는 트립신-유사 세린 프로테아제이다((Hoffman and Monroe, III 2001)에 검토되어 있음). 인자 IXa 활성의 선천적 결핍은 약 1:100,000 남성에 영향을 미치는 X-연관 출혈 장애 혈우병 B의 원인이다. 이들 혈우병 환자들은 현재 재조합 또는 혈장-유도 응고 FIX으로 대체 요법에 의해 치료한다. 그러나, 현재 전통적인 필요에 따른 치료보다는 예방이 권장되고 있다. 현재 예방 요법은 일주일에 다수회 투약을 필요로 하지만, 최적의 혈장 수준 및 효능을 위해서 1일 1회 주입이 보다 나을 수 있다. 일간 투여와 연관된 실용성 및 경제적 제한 때문에, 이것은 일반적으로 환자를 위한 선택이 아니다. 따라서, 장시간 작용하는 재조합 인자 IX 생성물에 대하여 명확한 요구가 있다.

WO 2006005058은 인자 IX 부분과 크기가 5-150kDa인 하나 이상의 수용성 폴 리머의 콘쥬게이트에 관한 것이다. WO 2006018204는 변성된 활성화 펩티드를 포함하는 변성된 비타민 k-의존 폴리펩티드에 관한 것이다. WO 2004101740은 적어도 하나의 응고 인자 및 적어도 면역글로불린 불변 영역의 일부분을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. WO 2005001025는 키메라 모노머-다이머 하이브리드 단백질에 관한 것이며, 여기서 상기 단백질은 면역글로불린 불변 영역의 일부분과 생물학적 활성 분자를 포함하는 제1 폴리펩티드쇄 및 생물학적 활성 분자 없이 면역글로불린 불변 영역의 일부분을 포함하는 제2 폴리펩티드쇄를 포함한다. US 2006040856은 사이에 삽입되어 펩티드와 변성기에 공유적으로 부착된 무손상 글리코실 연결기를 통해 연결된 인자 IX와 PEG 부분 사이의 콘쥬게이트에 관한 것이다.

SE 9501285A는 단백질 이황화 산화 환원 효소(예컨대, 단백질 이황화 이성질화효소(PDI)), 글루타레독신 및 산화환원 버퍼의 혼합물을 사용하는 적절하게 접힌, 생물학적 활성 이황화-가교 단백질의 시험관내 생산 과정을 개시한다. 이 참조문헌은 분자내 이황화 결합에 관련된 시스테인에 집중한다.

WO 2006/134173은 인자 IX 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 비천연 시스테인을 포함하는 재조합적으로 제조 조작된 단백질의 선택적 환원 및 유도체화를 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 충분한 생물학적 활성을 유지하여 혈액 응고를 지원하면서 천연 FIX에 비하여 혈류에서 연장된 순환 시간을 갖는 변성 FIX 유사체 또는 유도체를 제공하는 것이다.

발명의 개요

한 양태에서 본 발명은 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체에 관한 것이며, 여기서 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80 또는 84 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141 또는 142 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 146-180 위치에 있는 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

146-180 위치는 활성화시 제거되는 FIX의 활성화 펩티드에 해당하므로, FIX 유사체, 여기서 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 146-180으로부터 선택되는 위치에서 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기로 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 FIX 유사체에서, 이 화학기는 활성화 후 유사체에 존재하지 않을 것이라는 것으로 이해된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 168,169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 177 위치로부터 선택되는 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 160, 161, 162, 163, 164, 165 및 166 위치로부터 선택되는 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된다.

다른 바람직한 구체예에서 FIX 유사체는 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 잔기 E162를 갖는다.

본 발명의 다른 양태는 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체에 관한 것으로서, 이것은 C-말단 T415에 부가된 적어도 하나의 시스테인 잔기를 가지며, 상기 시스테인은 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 비천연 시스테인 잔기에 콘쥬게이트되는 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 다른 바람직한 구체예에서 폴리에틸렌글리콜은 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들면 1,000-75,000 또는 2,000-60,000의 범위 내이다.

바람직한 FIX 유사체는 순환 반감기가 야생형 FIX의 적어도 1.5배이다.

본 발명의 바람직한 FIX 유사체는 응고 분석으로 측정했을 때 생물학적 활성이 야생형 FIX의 적어도 20%이다.

본 발명의 다른 양태는 a) 저분자량 티올-콘쥬게이트 FIX를 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써, 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된(RS-CYS), 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치의 군에서 선택된 위치에 있는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이트하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 FIX 유사체의 제조방법에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서 이 방법은 환원 및 산화된 글루타티온을 포함하는 혼합물을 포함하는 산화환원 버퍼를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서 산화환원 버퍼는 글루타레독신을 더 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 a) 저분자량 티올-콘쥬게이트 FIX를 트리아릴포스핀-3,3',3"-트리술폰산 화합물을 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된(RS-CYS), 위치 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치의 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이션하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 FIX 유사체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 특히 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들면 1,000-75,000 또는 2,000-60,000의 범위 내인 것이다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 혈우병 환자의 치료를 위한 약학적 제형에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병 환자의 치료방법에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 방법은 적어도 주 1회 치료를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서 치료는 주 1회만의 치료를 포함한다.

발명의 상세한 설명

FIX는 인자 VII, 프로트롬빈, 인자 X 및 단백질 C와 유사한 구조를 갖는 비타민 K-의존 응고 인자이다. 혈장 반감기가 약 18-30시간인 순환하는 자이모겐 형태는 N-말단 Y-카르복시글루탐산 풍부 (Gla) 도메인, 2개의 EGF 도메인 및 C-말단 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 4개의 상이한 도메인으로 분리되어 있는 415개 아미노산으로 이루어진다. FIX의 활성화는 Arg¹⁴⁵-Ala¹⁴⁶ 및 Arg¹⁸⁰-Val¹⁸¹에서 제한된 단백질 분해에 의해 발생하며, 35-aa 단편, 소위 활성화 펩티드를 방출한다. 활성화 펩티드는 대량으로 글리코실화되어 2개의 N-연결 및 최대 4개의 O-연결 글리칸을 함유하게 된다.

예컨대 PEG화 또는 지질 부착에 의한 공유 변성은 여러 단백질-기반 제약학에 성공적으로 적용되어 이들의 약물동력학 및 약력학 프로파일을 개선시켜 왔다. 천연 또는 조작 시스테인을 통한 콘쥬게이션은 단백질의 표면 상의 이 아미노산의 희소성과 티올-커플링 화학에 의해 공급되는 높은 선택성 때문에 부위-특정 변성의 유용한 수단을 제공한다. 그러나, 실제로 이 접근은 도입되는 시스테인이 이어지는 변성을 방지하는 시스테인 및 글루타티온과 같은 저분자량(LMW) 티올의 혼성 이황화물로서 발견된다는 사실에 의해 복잡하게 되기도 한다.

따라서, 천연 이황화 결합은 보존하면서 이러한 시스테인과 저분자량 티올의 혼성 이황화물이 화학적으로 환원될 수 있는 방법에 대한 요구가 있다.

사람 인자 IX 유전자가 분리되어 포유류 세포에 발현되었고(K. Kurachi and E. W. Davie. Isolation and characterization of a cDNA coding for human factor IX. PNAS. 79 (21 I):6461-6464, 1982; K. H. Choo, K. G. Gould, D. J. Rees, and G. G. Brownlee. Molecular cloning of the gene for human anti-haemophilic factor IX. Nature 299 (5879):178-180, 1982; R. J. Kaufman, L. C. Wasley, B. C. Furie, B. Furie, and C. B. Shoemaker. Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J.Biol.Chem. 261 (21):9622-9628, 1986), cDNA로부터 아미노산 서열이 추론되었다.

FIX를 사용하는 혈우병 B의 현재 치료는 일반적으로 필요에 따라, 예컨대 발치 또는 수술 전에 주사제가 보충된 약 주 2회의 주사를 포함한다. FIX는 불활성 프로폼(proform)으로서 순환하고 출혈이 정지되어야 할 때만 활성 형태 FIXa로 변환된다. 따라서, 예컨대 주 1회 주사에 기초한 예방적 FIX 치료를 달성하는 한 방법은 환자의 혈류에서 FIX의 순환 시간을 증가시키는 것이다. 이 방법으로 활성화될 준비가 되어 있는 자이모겐 FIX가 어떤 수준으로 항상 존재할 것이며, 이로써 항시 환자에서 정상 혈액 응고 조건이 확보될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 FIX 유사체는 FIX의 천연 아미노산 잔기 중 하나 이상을 Cys 잔기로 치환함으로써 변성된다.

시스테인 잔기의 도입에 적합한 FIX 내 위치의 확인:

변성될 아미노산 위치는 > 50%의 상대적 측쇄 표면 접근성을 갖는 잔기의 풀로부터 얻는 것이 바람직할 것이다. 중쇄 및 EGF2 도메인에 대한 표면 접근성은 공개된 결정학적 데이터로부터 산출되었으며(1RFN, Hopfner et al, 1999), EGF1 도메인에 대한 계산은 돼지 FIXa의 결정 구조로부터 구축된 동족 모델에 기초하였다(1PFX, Brandstetter et al, 1995). 또한, 구조 정보가 입수불가능한 활성화 펩티드에서는 선택된 잔기(잔기 155-177)가 중요한 것으로 생각되었다. 최근 문헌에서 활성화 펩티드의 이 세그먼트는 FIX의 생물학적 활성을 손상하지 않고 제거될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Begbie et al. 2005). 사람 FIX의 모든 관련 위치들이 표 1에 열거된다.

FIX의 부위-특정 변성을 위한 관련 위치들. 'ASA1'은 모든 아미노산 잔기의 접근성(Ų)이고, 'ASA2'는 측쇄의 접근성(Ų)이고, 그리고 'Rel. ASA'는 측쇄의 단편 접근성이다. 서열 넘버링은 키모트립신에 따르고 돼지 FIXa의 결정 구조의 넘버링과 동일하다(1PFX.Pdb). 별표(*) 또는 마이너스(-)로 표시된 측쇄는 각각 FVIIa/TF 복합체 (Chen, C.W. et. al. Thromb Haemost. 2002 ;88 :74-82.) 또는 FVIIIa (Autin, L. et. al. J. Thromb. Haem. 2005, 3: 2044-56)와의 결합에 중요한 것으로 가정된다.

FIX EGF1
Res. No.	잔기	ASA1	ASA2	Rel ASA	표시
44	GLN	98.9	89.62	0.65
45	TYR	127.61	102.77	0.56	*
46	VAL	92.03	79.54	0.73
47	ASP	120.51	105.86	0.91
50	GLN	94.29	81.75	0.56
52	GLU	137.29	121.94	0.85	*
53	SER	110.6	71.75	0.89
54	ASN	78.81	62.97	0.54	*
57	LEU	94.46	85.04	0.57
59	GLY	64.16	47.95	0.89	*
61	SER	57.29	47.74	0.58	*
66	ILE	128.4	117.58	0.77
67	ASN	116.62	99.47	0.86
68	SER	65.52	63.95	0.84
70	GLU	104.08	98.67	0.71
72	TRP	143.49	135.57	0.63
74	PRO	109.62	91.25	0.73	*
80	LYS	191.42	178.01	0.99
84	LEU	103.29	98.38	0.65

FIX EGF2
Res . No .	잔기	ASA1	ASA2	Rel ASA	표시
87	THR	83.57	76.41	0.66
89	ASN	122.26	99.36	0.8
90	ILE	84	79.82	0.53
91	LYS	128.1	96.73	0.58
94	ARG	151.51	138.14	0.69
100	LYS	118.47	114.68	0.67
101	ASN	78.92	63.6	0.56
102	SER	83	53.18	0.63
103	ALA	88.66	47.67	0.7
104	ASP	88.46	74.73	0.62
105	ASN	108.19	99.74	0.86
106	LYS	131.06	126.34	0.68
108	VAL	75.49	69.94	0.59
113	GLU	101.37	87.96	0.58
116	ARG	136.07	129.02	0.64
119	GLU	137.93	126.99	0.82
120	ASN	113.58	86.88	0.72
121	GLN	84.29	83	0.57
123	SER	52.41	52.41	0.57
125	GLU	76.19	76.19	0.55
129	PRO	127.15	91.63	0.8
138	SER	99.87	72.52	0.79
140	THR	78.22	62.84	0.6
141	SER	124.17	90.36	1.02
142	LYS	243.38	231.32	0.95

FIX 중쇄
Res. No .	잔기	ASA1	ASA2	Rel ASA	표시
185	GLU	104.18	102.68	0.73
186	ASP	93.02	81.46	0.74
188	LYS	124.37	123.07	0.67
189	PRO	62.18	58.27	0.51
201	LYS	174.2	136.05	0.73
202	VAL	73.97	68.06	0.63
203	ASP	103.23	96.57	0.79
224	GLU	110.06	99.47	0.71
225	THR	136.54	115.79	1.02
228	LYS	158.34	146.18	0.82
239	GLU	111.9	87.55	0.58
240	GLU	105.36	95.43	0.66
241	THR	93.62	82.06	0.72
243	HIS	160.28	127.85	0.82
247	LYS	147.15	133.67	0.73
249	ASN	62.4	62.4	0.54
252	ARG	120.71	108.77	0.57
257	HIS	134.87	98.77	0.65
260	ASN	71.4	63.12	0.56
261	ALA	62.45	44.52	0.68
262	ALA	94.53	49.72	0.76
263	ILE	141.89	110.3	0.74
265	LYS	100.02	99.84	0.54
277	GLU	104.36	104.36	0.73
280	VAL	102.37	98.01	0.82
292	ASP	72.62	59.01	0.52	-
293	LYS	115.6	115.56	0.67	-
294	GLU	107.3	101.01	0.68	-
301	LYS	146.99	124.63	0.65	-
314	PHE	120.75	120.08	0.72
316	LYS	165.63	138.79	0.76
318	ARG	170.14	155.69	0.8
321	LEU	98.82	95.81	0.61
327	ARG	120.09	116.48	0.55	*
332	ASP	79.51	60.87	0.55	-
333	ARG	148.18	139.33	0.67	-
338	ARG	188.9	160.87	0.76	-
341	LYS	220.48	183.47	0.99
342	PHE	118.35	106	0.59	-
343	THR	92.32	77.52	0.68	-
346	ASN	61.25	59.08	0.51	-
354	HIS	106.42	105.15	0.63	*
355	GLU	100.57	89.47	0.69	*
372	GLU	93.79	75.65	0.53
374	GLU	140.35	102.57	0.72
391	MET	108.83	100.48	0.67
392	LYS	160.88	145.95	0.81
406	ASN	104.27	98.78	0.79
410	GLU	117.19	97.59	0.68
413	LYS	153.75	134.03	0.75
415	THR	201.09	182.54	0.95

FIX 활성화 펩티드
Res . No .	잔기
155	Tyr
156	Val
157	Asn
158	Ser
159	Thr
160	Glu
161	Ala
162	Glu
163	Thr
164	Ile
165	Leu
166	Asp
167	Asn
168	Ile
169	Thr
170	Gln
171	Ser
172	Thr
173	Gln
174	Ser
175	Phe
176	Asn
177	Asp

본 발명의 FIX 유사체는 야생형 FIX와 비교하여 연장된 순환 반감기를 갖는다. 순환 반감기는 예컨대 McCarthy et al Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30에 설명된 바와 같이 당업자에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.

바람직한 구체예에서 본 발명의 FIX 유사체의 순환 반감기는 야생형 FIX의 적어도 1.5배이고, 예를 들어 동일한 분석법 또는 모델로 측정하였을 때 야생형의 적어도 1.6, 예컨대 적어도 1.7, 예를 들어 적어도 1.8, 예컨대 적어도 1.9, 예를 들어 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.2, 예를 들어 적어도 2.4배이다.

또한, 본 발명의 FIX 유사체는 생체내 응혈 형성을 지원하는 충분한 생물학적 활성을 보유한다. 생물학적 활성은 예컨대 McCarthy et al Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30에 설명되어 있는 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정해도 좋다.

바람직한 구체예에서 본 발명의 FIX 유사체의 응고 활성은 동일한 분석법으로 측정했을 때 야생형 FIX의 응고 활성의 적어도 15%, 예를 들어 적어도 20%, 예컨대 적어도 25%, 예를 들어 적어도 30%, 예컨대 적어도 35%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%이다.

돌연변이, 발현 & 정제

FIX 유사체는 재조합 핵산 기술에 의해서 생산될 수 있다. 일반적으로, 복제된 사람 핵산 서열은 변성되어 소망의 FIX 유사체를 암호화한 후 발현 벡터에 삽입되는데, 이것은 차례로 숙주 세포로 형질변환 또는 핵산전달감염된다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유류 세포가 숙주 세포로서 바람직하다.

아미노산 서열 변경은 여러가지 기술에 의해 달성할 수 있다. 핵산 서열의 변성은 부위-특정 돌연변이 생성에 의해 행할 수 있다. 부위-특정 돌연변이 생성 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) 또는 "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, pp. 61-68에 설명되어 있다. 따라서, FIX의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하여 선택의 변경을 도입할 수 있다. 마찬가지로, 특정 프라이머를 사용하는 폴리메라아제 연쇄 반응을 사용하여 DNA 구성물 제조하기 위한 과정은 당업자에게 공지되어 있다(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA 참조).

본 발명의 FIX 유사체를 암호화하는 핵산 구성물은 게놈 또는 cDNA 기원일 수 있으며, 예컨대 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 혼성화에 의해 FIX의 모두 또는 일부를 암호화하는 DNA 서열을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).

FIX 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 핵산 구조는 정립된 표준 방법, 예컨대 Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869에 설명된 포스포아미디트(phosphoamidite) 방법, 또는 Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805에 설명된 방법에 의해 합성 제조할 수도 있다. 포스포아미디트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성하고, 정제하고, 아닐링하고, 결찰하고 적당한 벡터로 복제된다. 사람 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은, 예컨대 US 4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491, 또는 Sambrook et al., supra에 설명되어 있듯이 특정 프라이머를 사용하는 폴리메라아제 연쇄반응에 의해 제조할 수도 있다.

또한, 핵산 구조는 표준 기술에 따라서 합성, 게놈 또는 cDNA 원점의 단편을 결찰함으로써 제조되는 혼합 합성과 게놈, 혼합 합성과 cDNA 또는 혼합 게놈과 cDNA 원점이 될 수 있으며(적합한 것으로서), 단편은 전체 핵산 구조의 여러 부분에 대응한다.

FIX 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 재조합 벡터로 통상적으로 삽입되는데, 이것은 어느 벡터이어도 좋으며 재조합 DNA 과정을 편리하게 수행할 수 있고, 벡터의 선택은 도입되는 숙주 세포에 따르는 경우도 있을 것이다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제되는 벡터, 즉 염색체외 실체로서 존재하는 벡터, 염색체 복제의 독립적인 복제물, 예컨대 플라스미드가 될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포로 도입했을 때 숙주 세포 게놈으로 통합되어 통합된 염색체와 함께 복제되는 것이어도 좋다.

벡터는 FIX 유사체를 암호화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 요청되는 추가의 세그먼트에 작동가능하도록 연결된 발현 벡터가 바람직하다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 또는 이 모두의 구성요소를 포함해도 좋다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 세그먼트가 이들의 의도하는 목적, 예컨대 프로모터에서 전사가 개시되고 폴리펩티드를 암호화기 위해 DNA 서열을 통해 진행하는 목적에 협력하여 기능하도록 배열되어 있는 것을 표시한다.

FIX 유사체를 발현하는데 사용하기 위한 발현 벡터는 복제 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 어떤 DNA 서열이 될 수 있으며, 선택의 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내고 숙주 세포에 동종 또는 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래할 수 있다.

포유류 세포 내의 FIX 유사체를 암호화하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814), CMV 프로모터 (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 주요 후발 프로모터 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)이다.

FIX 유사체를 암호화하는 DNA 서열은, 필요에 따라 사람 성장 호르몬 터미네이터(Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 TPI1 (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) 또는 ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) 터미네이터와 같은 적합한 터미네이터에 작동가능하게 연결되어도 좋다. 발현 벡터는 프로모터로부터 하류 및 FIX 서열 자체를 위한 삽입 부위로부터 상류에 위치한 RNA 접합 부위들의 세트를 함유해도 좋다. 바람직한 RNA 접합 부위들은 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 얻을 수 있다. 또한 삽입 부위의 하류에 위치한 폴리아데닐화 신호가 발현 벡터에 함유된다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.)로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 Elb 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호, 사람 성장 호르몬 유전자 터미네이터(DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) 또는 사람 FIX 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호를 포함해도 좋다. 발현 벡터는 프로모터와 RNA 접합 부위 사이에 위치한 아데노바이러스 2 삼중 리더와 같은 비암호화 바이러스 리더 서열; 및 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함해도 좋다.

본 발명의 FIX 유사체를 숙주 세포의 분비경로로 지시하기 위해서, 분비 신호 서열(리더 서열, 선행 서열 또는 전 서열로 공지됨)이 재조합 벡터에 제공되어도 좋다. 분비 신호 서열은 FIX 유사체를 정확한 판독 프레임으로 암호화하는 DNA 서열에 결합된다. 분비 신호 서열은 보통 펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 대하여 5' 위치한다. 분비 신호 서열은 단백질과 정상적으로 연합하거나 다른 분비된 단백질을 암호화하는 유전자로부터 될 수 있다.

FIX 유사체를 암호화하는 DNA 서열, 프로모터 및 선택적으로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 결찰하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 포함하는 적합한 벡터로 삽입하는데 사용하는 과정은 당업자에게 공지되어 있다(예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).

포유류 세포를 핵산전달감염시키고 세포로 도입된 DNA 서열을 발현하는 방법은 예컨대 Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; 및 Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845에 설명되어 있다.

복제된 DNA 서열은 예컨대 인산 칼슘-배지 핵산전달감염(Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) 또는 전기천공법(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)에 의해 배양된 포유류 세포로 도입된다. 외인성 DNA를 발현하는 세포를 식별 및 선택하기 위해서, 일반적으로 선택가능한 표현형(선택가능한 표지)을 부여하는 유전자가 관심의 유전자 또는 cDNA와 함께 세포로 도입된다. 바람직한 선택가능한 표지는 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉사트와 같은 약물에 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 선택가능한 표지는 증폭성 선택가능한 표지가 될 수 있다. 바람직한 증폭성 선택가능한 표지는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 서열이다. 선택가능한 표지는 Thilly (본원에 참조로 통합되는 Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA)에 의해 검토되어 있다. 당업자는 적합한 선택가능한 표지를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

선택가능한 표지는 관심의 유전자로서 동시에 분리된 플라스미드 상에 세포로 도입될 수 있거나, 이들은 동일한 플라스미드에 도입될 수 있다. 이 형태의 구조는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Levinson and Simonsen, U.S. 4,713,339). 이것은 세포에 도입되는 혼합물에 "담체 DNA"로 알려진 추가의 DNA를 첨가하는데 유리할 수도 있다.

세포가 DNA를 취한 후, 이들은 적절한 성장 배지에서 통상적으로 1-2일 동안 성장하여 관심의 유전자를 발현하기 시작한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "적절한 성장 배지"는 세포 성장 및 FIX 유사체의 발현에 필요한 영양소 및 다른 성분을 함유하는 배지를 의미한다. 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자를 포함한다. 그 다음 안정한 방식으로 선택가능한 표지를 발현하는 세포의 성장을 선택하기 위해 약물 선택이 이루어진다. 증폭성 선택가능한 표지로 핵산전달감염된 세포를 위해서, 약물 농도는 복제된 서열의 증가된 카피수를 선택하기 위해서 증가하여, 증가하는 발현 수준으로 될 수 있다. 안정하게 핵산전달감염된 세포의 복제물은 그 다음 FIX 유사체의 발현을 위해 스크리닝된다.

본 발명에 사용하기 위한 포유류 셀라인의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장 (BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 셀라인이다. 바람직한 BHK 셀라인은 tk- ts13 BHK 셀라인이며 (본원에 참조로 통합된 Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), 이하 BHK 570 세포라고 한다. BHK 570 셀라인은 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852에 ATCC 기탁 번호 CRL 10314로 기탁되었다. tk- ts13 BHK 셀라인도 기탁 번호 CRL 1632로 ATCC로부터 입수가능하다. 또한, 다른 번호의 셀라인을 본 발명 내에서 사용할 수 있으며, Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) 및 CHO-DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)을 포함한다.

본 발명의 FIX 유사체를 세포 배양 배지로부터 회수한 후, 여기에 제한되는 것은 아니지만 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 과정(예컨대, 예비 등전 포커싱(IEF)), 용해도 차이(예컨대, 황산암모늄 침전) 또는 추출(예컨대, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하는 당업계 공지된 여러 과정에 의해 정제할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 항-FIX 항체 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 종래의 화학 정제 수단에 의해 추가의 정제를 달성해도 좋다. 다른 정제 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본원에 설명된 신규의 FIX 폴리펩티드의 정제에 적용할 수 있다(예컨대, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982 참조).

치료 목적으로 FIX 유사체는 적어도 약 90 내지 95% 동종성, 바람직하게는 적어도 약 98% 동종성으로 정제하는 것이 바람직하다. 순도는 예컨대 겔 전기 영동 및 아미노-말단 아미노산 시퀀싱에 의해 평가할 수 있다.

선택적 환원

재조합 기술에 의해 제조되는 단백질의 분자내 이황화 결합에 포함되지 않는 시스테인의 티올기를 통한 화학 콘쥬게이션에 대하여 상술한 장애의 관점에서, 본 발명은 정의된 산화환원 버퍼 혼합물(예컨대, 티올-이황화 산화환원 촉매와의 조합) 또는 트리아릴포스핀의 사용을 제공하여 저분자량 티올과 적어도 하나의 비천연 시스테인, 예컨대 응고 인자를 포함하는 조작된 단백질, 또는 이러한 조작되거나 천연의 시스테인을 갖는 세린 프로테아제의 트립신군의 단백질 사이의 혼합된 이황화 결합을 선택적으로 환원시킨다. 혼합된 이황화의 선택적 환원 후, 그 다음 유리 시스테인은 당업자에게 공지된 바와 같이 단백질 상에 티올-커플링 화학을 사용하는 콘쥬게이션에 의해 변성될 수 있다.

조작 또는 천연 시스테인을 통한 화학적 콘쥬게이션은 단일의 균일한 생성물을 산출하는 단백질의 표적 변성의 선택을 제공한다. 그러나, 시스테인이 저분자량 티올에 콘쥬게이트되고 단백질이 불안정한 분자내 이황화 결합을 함유하는 경우 이 계획은 가능하지 않다. 본 발명은 이어지는 화학적 변성을 위해 유리된 시스테인을 제조하는 저분자량 티올 일부의 선택적 제거가 가능하다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 적어도 하나의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX의 선택적 환원 방법에 관한 것이고, 상기 FIX는 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된 하나 이상의 시스테인 부분을 포함하며(RS-Cys), 상기 부분/부분들은 단백질이 그것의 활성 형태인 경우 분자내 S-S 다리(Cys-S-S-Cys)에 포함되지 않고, 이 방법은 저분자량 티올-콘쥬게이트된 단백질을 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물과 반응시키는 단계를 포함한다.

용어 "선택적으로 환원된"은 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된 시스테인 부분의 우세한 부분, 예컨대 60% 이상, 또는 80% 이상, 예를 들어 90% 이상의 분획을 환원시켜서 다른 기와의 콘쥬게이션을 위해 준비된 티올기로 시스테인 부분을 유리시키는 한편, 다른 이황화 결합(통상적으로 분자내 이황화 결합)의 우세한 부분, 예컨대 60% 이상, 또는 80% 이상, 예를 들어 90% 이상은 보존하여 조작된 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 보존하는 것을 말한다.

(A) 산화환원 버퍼

상술한 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 비천연 시스테인, 예컨대 응고 인자를 포함하는 조작된 단백질 또는 세린 프로테아제의 트립신군의 단백질의 선택적 환원방법을 제공한다. 당해 단백질은 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된 하나 이상의 시스테인 부분을 포함하며(RS-Cys), 상기 부분/부분들은 단백질이 그것의 활성 형태인 경우 분자내 S-S 다리(Cys-S-S-Cys)에 포함되지 않고, 이 방법은 저분자량 티올-콘쥬게이트된 단백질을 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물과 반응시키는 단계를 포함한다.

본원에 사용하는 경우, 용어 "산화환원 버퍼"는 단백질-저분자량 티올 혼합 이황화물(들)(RS-Cys)을 분열시키기 위해 충분히 환원시키고 동시에 단백질 내의 천연 이황화 결합의 완전성을 보존하기 위해 충분히 환원시키는 비율의 티올/이황화 산화환원 쌍을 의미하도록 의도된다.

바람직하게는, 산화환원 버퍼는 저분자량 티올/이황화 산화환원 쌍을 포함한다. 용어 "저분자량"은 산화환원 쌍의 티올-형태가 최대 500g/mol의 분자량을 갖는 것을 의미한다. 이러한 산화환원 쌍의 실례는 (i) 환원 및 산화 글루티온 및 (ii) 환원 및 산화 Y-글루타밀시스테인, (iii) 환원 및 산화 시스테이닐글리신, (iv) 환원 및 산화 시스테인, (v) 환원 및 산화 N-아세틸시스테인, (vi) 시스테아민, 및 (vii) 디히드로리포아미드/리포아미드에서 선택되는 것이고, 바람직하게는 (i) 환원 및 산화 글루타티온이다.

최적의 산화환원 조건은 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 단백질의 산화환원 적정을 행함으로써 결정할 수 있다. Gilbert(1995) 참조.

한 구체예에서, 산화환원 버퍼는 환원 및 산화 글루타티온의 산화환원 쌍이고, 환원 글루타티온의 농도는 0-100mM의 범위에 있고, 환원 글루타티온과 산화 글루타티온 사이의 비는 2-200의 범위에 있다.

다른 구체예에서, 산화환원 버퍼는 산화 및 환원 글루타티온의 산화환원 쌍이고, 환원 글루타티온의 농도는 0-100 mM, 예컨대 0.01-50　mM이고, 산화 글루타티온의 농도는 0-5　mM, 예컨대 0.001-5 mM의 범위이다. 인자 IX 폴리펩티드에 대하여, 환원 글루타티온의 농도는 0-5 mM, 예컨대 0.01-2　mM의 범위 내가 바람직하고, 산화 글루타티온의 농도는 0.001-2　mM, 예컨대 0.001-0.200 mM의 범위 내이다.

일반적으로 글루타티온 및 다른 저분자량 티올은 반응속도론의 관점에서 열등한 환원제/산화제이기 때문에, 티올/이황화 산화환원 촉매는 반응 속도를 향상시키기 위해서 산화환원 버퍼와 콘쥬게이션되어 혼합물에 포함되는 것이 가장 바람직하다.

혼합물에 포함되는 적합한 티올/이황화 산화환원 촉매는 디티올형 및 모노티올형 글루타레독신을 포함한다. 글루타레독신 및 이들의 기능은 Fernandes et al. (2004)에 일반적으로 설명되어 있다. 글루타레독신의 유용한 예는 Escherichia coli로부터의 Grx1, Grx2 또는 Grx3(Holmgren et al., 1995), Saccharomyces cerevisiae로부터의 Grx1p, Grx2p, Grx3p, Grx4p(Luikenhuis et al. 1998; Rodriguez-Manzaneque et al., 1999; Grant, 2001), 및 Grx5p, Homo sapiens로부터의 Grx1 및 Grx2(Padilla et al. 1995; Lundberg et al., 2001), 및 그것의 변이체로부터 선택된 것이다. 변이체는 CXXC 모티프 중의 C-말단 시스테인이 통상적으로 또 다른 아미노산 세린으로 대체된 디티올형 글루타레독신을 포함하지만 여기에 제한되는 것은 아니다(Yang et al., 1998 참조).

산화환원 촉매(특히 글루타레독신)는 0.001-20μM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

혼합물은 단백질 이황화 이성질화효소(PDI)를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

산화환원 버퍼는 염, pH 버퍼 등과 같은 다른 성분을 더 포함해도 좋고, 본 발명의 방법은 당해 단백질에 적합한 온도, 예컨대 -5℃ 내지 50℃의 범위 내, 예를 들어 0℃ 내지 37℃의 범위 내의 온도에서 행해도 좋으며, 당연히 주어진 조건하에서 단백질의 안정성에 의존한다.

(B) 트리아릴포스핀 환원제

상술한 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 비천연 시스테인, 예컨대 응고 인자를 포함하는 조작된 단백질 또는 세린 프로테아제의 트립신군의 단백질의 선택적 환원방법을 제공한다. 당해 단백질은 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된 하나 이상의 시스테인 부분을 포함하며(RS-Cys), 상기 부분/부분들은 단백질이 그것의 활성 형태인 경우 분자내 S-S 다리(Cys-S-S-Cys)에 포함되지 않고, 이 방법은 저분자량 티올-콘쥬게이트된 단백질을 트리아릴포스핀 환원제와 반응시키는 단계를 포함한다.

용어 "트리아릴포스핀 환원제"는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 트리아릴포스핀을 의미하도록 의도된다.

트리아릴포스핀 환원제의 아릴기는 페닐, 나프틸, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸, 안트라실, 펜안트라실, 피레닐, 벤조피레닐, 플루오레닐 및 크산테닐에서 선택하는 것이 바람직하고, 특히 페닐이고, 현재 선택되는 구체예에서 아릴기는 동일한 것이 바람직하다. 현재 가장 주목하는 구체예에서, 모든 3개의 아릴기는 페닐이다. 아릴기, 특히 페닐기에 존재할 수 있는 치환기의 예는 통상적으로 술폰산, 카르복실산, C_1-6-알킬, C_1-6-알콕시, 및 C_1-6-알콕시-C_1-6-알킬, 또는 C_3-6-알킬렌 (2개의 인접한 아릴 탄소 원자가 있는 고리를 나타냄) 또는 C_2-6-알킬렌옥시(2개의 인접한 아릴 탄소 원자가 있는 고리를 나타냄) 또는 C_1-4-알킬렌-옥시-C_1-4-알킬렌(2개의 인접한 아릴 탄소 원자가 있는 고리를 나타냄)에서 선택된 것이다.

현재 가장 주목하는 구체예에서, 적어도 하나의 아릴 (예컨대 페닐)은 술폰산 및 카르복실산에서 선택되는 적어도 하나의 치환기를 가지며, 특히 술폰산이고; 이러한 치환기는 인 원자에 대한 결합에 관하여 메타 위치에 배열되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 모든 3개의 아릴기가 술폰산 치환기를 갖고, 예컨대 모든 3개의 아릴기는 술폰산 치환기 및 적어도 하나의 다른 치환기, 특히 적어도 인 원자에 대한 결합에 관하여 파라-위치 내의 치환기, 특히 이 파라-위치 내의 산소 치환기를 갖는다.

현재 바람직한 환원제의 아릴기는 인 원자에 대한 결합에 관하여 오르소-위치에 어떤 치환기를 갖지 않는 것으로 생각된다.

용어 "C_1-6-알킬"은 1-6개의 탄소원자를 갖는 선형 또는 분기 포화된 탄화수소 잔기를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실 등이다. 마찬가지로, 용어 "C_1-4-알킬"은 1-4개의 탄소원자를 갖는 선형 또는 분기 포화된 탄화수소 잔기를 포괄한다. 용어 "C_1-6-알킬렌", "C_2-6-알킬렌" 등은 각각 "C_1-6-알킬", "C_2-6-알킬"에 대응하는 비라디칼(biradical)을 나타낸다.

적합한 트리아릴포스핀 환원제는 환원 포텐셜과 입체 장애 사이의 유용한 균형을 갖는 것이다. 트리아릴포스핀 환원제의 화학적 성질은 단백질-저분자량 티올 혼성 이황화물(RS-Cys)을 분열시키는 한편 단백질 내 천연 이황화 결합의 완전성을 보존하는 그것의 능력에 의해 나타내어 진다. 현재 가장 주목하는 화합물은 트리페닐포스핀-3,3'-3"-트리술폰산 및 그 유사체와 같은 트리아릴포스핀 트리술폰산이다. 그 실례는 트리페닐포스핀-3,3'-3"-트리술폰산 및 그 유사체에서 선택되는 트리아릴포스핀 환원제, 예컨대 하기 화합물 9-11에서 선택되는 것이다:

트리아릴포스핀 환원제는 0.001-100mM, 예를 들어 0.01-50mM 또는 0.1-25mM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

한 주목하는 구체예에서, 트리아릴포스핀 환원제는 고체 지지체로 고정된다. 이것은 단백질로부터 환원제의 쉬운 분리를 용이하게 할 것이다. 일반적으로, 화합물 9-11과 같은 트리아릴포스핀 환원제는 당업자에게 공지된 수단, 예컨대 하나의 아릴기에 연결기를 도입함으로써 고정될 수 있다. 트리아릴포스핀 시약 12는 연결가능한 1의 변이체의 예이다.

통상적으로 반응은 경우에 따라 주위 온도 등의 0-40℃의 범위 내의 온도에서 5초 내지 수 일의 기간 동안 행한다. 전환율을 확인하기 위해서 이 반응 후에 HPLC를 행해도 좋다. 용매는 수성 버퍼가 바람직하며, 선택적으로 DMSO 또는 DMF와 같은 공용매를 포함한다. 용매는 염, 예컨대 칼슘염을 포함해도 좋다.

콘쥬게이션

상술한 선택적 환원방법의 한 중요한 목적은 화학기의 부착(콘쥬게이션)에 사용할 수 있는 시스테인기, 예컨대 비폴리펩티드 부분을 유리시키는 것이다.

따라서, 한 중요한 구체예에서, 이 방법은 적어도 하나의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분/부분들을 화학기로 콘쥬게이션하는 동시적 및/또는 연속적 단계를 더 포함한다.

이것은 적어도 하나의 선택적으로 환원된 시스테인 부분을 화학기로 콘쥬게이션하는 것은 동시적으로, 즉 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물에 콘쥬게이션을 유도하는 하나 이상의 시약의 첨가에 의해서, 또는 연속하는 단계, 예컨대 선택적으로 환원된 단백질의 정제 및/또는 분리 후 행할 수 있다는 것으로 이해된다.

한 구체예에서, 화학기는 지연기, 즉 비변성 단백질 또는 폴리펩티드와 비교했을 때 단백질(예컨대, 인자 IX 폴리펩티드)로의 콘쥬게이션시 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 기이다. 지연 효과 이면의 구체적 원리는 크기 증가, 펩티다아제 또는 항체에 의해 인지될 수 있는 펩티드 서열의 차단, 또는 예컨대 간 또는 대식세포에 존재하는 글리칸 특정 수용체에 의해 이들이 인지되지 않는 방식의 글리칸의 마스킹, 클리어런스의 억제 또는 감소에 기인할 수 있다. 지연기의 지연 효과는 예컨대 알부민과 같은 혈액 성분으로의 결합, 또는 혈관 조직으로의 비특정 밀착에 기인할 수 있다. 콘쥬게이트된 당단백질은 그것의 생물학적 활성을 실질적으로 보존해야 한다.

본 발명의 한 구체예에서 지연기는 하기 이루어진 군에서 선택된다:

(a) 하나 이상의 카르복실산, 아민 술폰산, 포스폰산 또는 그것의 조합을 함유해도 좋은 저분자량 유기 하전 라디칼(15-1,000Da),

(b) 시클로덱스트린, 또는 선택적으로 분기될 수 있는 폴리에틸렌쇄와 같은 저분자량(15-1,000Da) 중성 친수성 분자.

(c) 지방산 또는 콜린산 또는 그것의 유도체와 같은 저분자량(15-1,000Da) 소수성 분자.

(d) 평균 분자량이 2,000-60,000Da인 폴리에틸렌글리콜.

(e) 정확한 분자 질량이 700 내지 20,000Da, 보다 바람직하게는 700-10,000Da 범위인 덴드리머와 같은 명확히 정의된 정밀 폴리머.

(f) 알부민 또는 Fc-도메인을 선택적으로 함유하는 항체 또는 항체의 일부와 같은 실질적으로 비면역성의 폴리펩티드.

(g) 덱스트란과 같은 고분자량 유기 폴리머.

본 발명의 다른 구체예에서 지연기는 덴드리머, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 같은 폴리알킬렌 글리콜(PAG)을 포함하는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 분기 PEG, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리-비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-코-말산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 무수물 및 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한 특히 주목하는 구체예에서, 지연기는 PEG기이다.

용어 "분기 폴리머", 또는 교대하여 "수지상 폴리머", "덴드리머" 또는 "수지상 구조"는 일부 분기를 포함하는 모노머 구성 단위의 선택으로 조립된 유기 폴리머를 의미한다.

본 발명의 한 구체예에서 지연기는 지방산, C5-C24 지방산, 지방족 이산(예컨대 C5-C24)과 같은 알부민에 결합하는 화합물과 같은, 혈청 단백질 결합-리간드로 이루어진 군에서 선택된다. 지연기의 다른 예는 카르복실산 또는 아민과 같은 생리학적 조건하에서 하전 특성을 변경하는 부분을 포함하는 작은 유기 분자, 또는 작은 알킬 치환기(예컨대 C1-C5 알킬)와 같은 글리칸 특이적 인식을 억제하는 중성 치환기를 포함한다. 한 구체예에서 지연기는 알부민이다.

한 구체예에서, 화학기는 비-폴리펩티드이다.

한 주목되는 구체예에서, 화학기는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 특히 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들어 1,000-75,000 또는 2,000-60,000인 것이다.

콘쥬게이션은 WO 02/077218 A1 및 WO 01/58935 A2에 개시되어 있는 바와 같이 행할 수 있다.

특히 주목되는 것은 단백질과의 콘쥬게이션을 위한 화학기로서 PEG의 사용이다. 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제, 커플링 또는 활성화 부분(예컨대, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지르딘, 옥시란, 피리딜디티오, 비닐 술폰, 또는 바람직하게는 말레이미드 부분)이 존재하거나 존재하지 않는 폴리에틸렌 글리콜 화합물 또는 그것의 유도체를 의미한다. 말레이미도 모노메톡시 PEG와 같은 화합물은 본 발명의 활성 PEG 화합물의 예시이다.

PEG는 덱스트란과 같은 다당류와 비교하여 소수의 가교-연결이 가능한 반응성기만을 가지므로 적합한 폴리머 분자이다. 특히, 단관능 PEG, 예컨대 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)은 그것의 커플링 화학이 비교적 간단하므로 주목된다(하나의 반응성기만이 폴리펩티드 상의 부착기와의 콘쥬게이션에 사용할 수 있음). 결과적으로, 가교-연결의 위험이 제거되어, 얻어진 폴리펩티드 콘쥬게이트는 보다 균일하고 폴리펩티드와 폴리머 분자의 반응을 제어하기 쉬워진다.

폴리펩티드에 폴리머 분자의 공유 부착을 행하기 위해서, 폴리머 분자의 히드록실 말단기를, 예컨대 반응성 관능기를 갖는 활성화 형태로 제공한다. 적합한 활성화 폴리머 분자는 예컨대 Shearwater Corp., Huntsville, Ala., USA, 또는 PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK으로부터 입수가능하다. 대안적으로, 폴리머 분자는 예컨대 WO 90/13540에 개시되어 있는 바와 같이 당업계 공지된 종래의 방법에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 활성화 선형 또는 분기 폴리머 분자의 구체예는 Shearwater Corp. 1997 및 2000 카탈로그 (본원에 참조로 통합된 Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives)에 설명되어 있다. 활성화 PEG 폴리머의 특정 예는 하기 선형 PEG: NHS-PEG (예컨대 SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, 및 SCM-PEG), 및 NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG, 및 PEG2-NHS 및 본원에 참조로 통합되는 U.S. Pat. No. 5,932,462과 U.S. Pat. No. 5,643,575에 개시된 것과 같은 분기 PEG을 포함한다. 또한, 본원에 참조로 통합되는 하기 공보는 유용한 폴리머 분자 및/또는 PEG화 화학을 개시한다: U.S. Pat. No. 5,824,778, U.S. Pat. No. 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, U.S. Pat. No. 4,902,502, U.S. Pat. No. 5,281,698, U.S. Pat. No. 5,122,614, U.S. Pat. No. 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, U.S. Pat. No. 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, U.S. Pat. No. 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, U.S. Pat. No. 5,473,034, U.S. Pat. No. 5,516,673, EP 605 963, U.S. Pat. No. 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316.

폴리펩티드 및 활성화 폴리머 분자의 콘쥬게이션은, 예컨대 하기 참조문헌에 설명된 것과 같은 종래의 방법의 사용에 의해 수행한다(폴리머 분자의 활성화를 위한 적합한 방법도 설명함): R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). 당업자는 사용되는 활성화 방법 및/또는 콘쥬게이션 화학은 폴리펩티드의 부착기(상기 그 이상으로 주어진 예) 및 폴리머의 관능기(예컨대, 아민, 히드록실, 카르복실, 알데히드, 술피드릴, 숙신이미딜, 말레이미드, 비닐술폰 또는 할로아세테이트)에 의존한다는 것을 인지할 것이다. PEG화는 폴리펩티드 상에 모든 이용가능한 부착기(즉 폴리펩티드의 표면에 노출된 부착기)에 콘쥬게이션에 대하여 진행될 수 있거나, 또는 하나 이상의 특정 부착기, 예컨대 N-말단 아미노기에 대하여 진행될 수 있다(U.S. Pat. No. 5,985,265). 또한, 콘쥬게이션은 한단계 또는 단계적 방식으로 달성해도 좋다(예컨대 WO 99/55377에 설명된 바와 같음).

PEG화는 부착되는 PEG 분자의 수, 이러한 분자의 크기 및 형태, 및 이러한 분자가 부착되는 폴리펩티드 위치에 대하여 최적의 분자를 생산하도록 디자인되는 것으로 이해될 것이다. 사용되는 폴리머의 분자량은 달성되는 소망의 효과를 고려하여 선택할 것이다. 예컨대, 콘쥬게이션의 주요 목적이 고분자량 및 큰 크기를 갖는 콘쥬게이트를 달성하는 것이면(예컨대 신장 클리어런스를 감소시키는 것), 하나의 또는 소수의 고분자량 폴리머 분자 또는 분자량이 작은 다수의 폴리머를 콘쥬게이트하는 것으로 선택하여 소망의 효과를 얻을 수 있다. 한 구체예에서, 분자량이 낮은 여러 폴리머 분자를 사용한다. 이것은 또한 높은 수준의 에피토프 차단을 원하는 경우이다. 이러한 경우, 예컨대 분자량이 약 5,000Da인 2-8개 폴리머, 예컨대 3-6개 폴리머를 사용해도 좋다. 그 예를 하기에 설명하는 바와 같이, 고분자량인 소수의 폴리머 분자(예컨대, 12,000-20,000의 MW를 갖는 1-3개)에 비하여 저분자량인 다수의 폴리머 분자(예컨대 5,000의 MW를 갖는 4-6개)를 갖는 것이, 두 경우 부착되는 폴리머 분자의 총 분자량이 동일하거나 유사한 경우에도 폴리펩티드 콘쥬게이트의 기능적 생체내 반감기를 향상시키는 관점에서 유리할 수 있다. 다수의 작은 폴리머 분자의 존재는 적어도 폴리머 분자가 폴리펩티드 표면 상에 비교적 균일하게 분포될 때 예컨대 단일의 큰 폴리머 분자보다 큰 직경 또는 겉보기 크기를 갖는 폴리펩티드를 제공한다는 것으로 생각된다.

본 발명의 콘쥬게이트의 적어도 주요 부분의 겉보기 크기("겉보기 분자량" 또는 "겉보기 질량"이라고도 함)가 적어도 약 50kDa, 예를 들어 적어도 약 55kDa, 예를 들어 적어도 약 60kDa, 예컨대 적어도 약 66kDa인 경우 유리한 결과가 얻어진다는 것이 더 발견되었다. 이것은 신장 클리어런스가 충분히 큰 겉보기 크기를 갖는 콘쥬게이트를 위해 실질적으로 제거된다는 사실에 기인하는 것으로 생각된다. 본문에서, 단백질 콘쥬게이트 또는 인자 IX 폴리펩티드의 "겉보기 크기"는 SDS-PAGE법에 의해 결정된다.

또한, 과도한 폴리머 콘쥬게이션은 화학기(예컨대, 비폴리펩티드 부분)가 콘쥬게이트된 단백질(예컨대 인자 IX 폴리펩티드)의 활성의 손실을 가져오는 것으로 보고되었다(하기 참조). 이 문제는, 예컨대 콘쥬게이션 이전에 관능 부위에 위치한 부착기의 제거 또는 관능 부위의 가역적 차단에 의해 콘쥬게이션 동안 단백질의 관능 부위를 차단함으로써 제거할 수 있다. 구체적으로, 단백질과 화학기(비폴리펩티드 부분) 사이의 콘쥬게이션은 단백질의 관능 부위가 헬퍼 분자, 예컨대 세린 프로테아제 억제제에 의해 차단되는 조건하에서 행할 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 분자는 촉매적 트리아드(triad) 주변의 지역에 결합하여 보호하는 수용체 또는 활성-부위 억제제와 같은, 단백질의 관능 부위를 구체적으로 인지하는 것이다(바람직하게는 촉매적 트리아드에서 어떤 원자의 10Å 내의 아미노산 잔기로서 정의됨).

대안적으로, 헬퍼 분자는 항체, 특히 단백질(예컨대 인자 IX 폴리펩티드)을 인지하는 단일복제 항체이어도 좋다. 특히 헬퍼 분자는 중성 단일복제 항체이어도 좋다.

단백질은 콘쥬게이션을 행하기 전에 헬퍼 분자와 상호작용하는 것이 바람직하다. (혼합 이황화물이 감소되는 단계에서 사용되는 것과 동일한 헬퍼 분자(예컨대 억제제)를 사용하는 것이 더 유리한 경우도 있다.) 이것은 단백질(예컨대 인자 IX 폴리펩티드)의 관능 부위가 차단 또는 보호되어 결과적으로 폴리머와 같은 화학기(예컨대 비폴리펩티드 부분)에 의한 유도체화에 사용불가능하다는 것을 확실하게 한다.

헬퍼 분자로부터의 그것의 용리 후, 화학기와 단백질의 콘쥬게이트는 적어도 부분적으로 보존된 관능 부위로 회복될 수 있다.

제형 및 투여

다른 양태에서 본 발명은 FIX 유사체를 건조 형태로 포함하는 약학적 제형에 관한 것이고, 사용 전 이것에 의사 또는 환자가 용매 및/또는 희석제를 첨가한다. "건조 형태"가 의도됨에 따라 액상 약학적 조성물 또는 제형은 냉동 건조(즉, 동결건조; 예컨대 Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59 참조), 분무 건조(Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20 참조), 또는 공기 건조(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)에 의해 건조된다.

다른 양태에서 본 발명은 FIX 유사체의 수용액 및 버퍼를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이고, 여기서 FIX 유사체는 0.01mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 여기서 상기 제형은 pH가 약 2.0 내지 약 10.0이다.

본 발명의 다른 구체예에서 버퍼는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 그것의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 특정 버퍼의 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 약학적으로 허용가능한 보존제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서 보존제는 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부탄올 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미듀레아, 클로로헥시딘, 디히드로아세테이트 나트륨, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈티오늄 클로라이드, 클로로페네신 (3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 그것의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 다른 구체예에서 보존제는 0.1mg/ml 내지 20mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 보존제는 0.1mg/ml 내지 5mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 보존제는 5mg/ml 내지 10mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 보존제는 10mg/ml 내지 20mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특정 보존제 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 보존제의 용도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995를 참조한다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 등장화제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서 등장화제는 염(예컨대 염화나트륨), 당 또는 당알콜, 아미노산(예컨대 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예컨대 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올) 폴리에틸렌글리콜(예컨대 PEG400) 또는 그것의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 예컨대 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는 모노-, 디- 또는 다당류와 같은 당, 또는 수용성 글루칸을 사용해도 좋다. 한 구체예에서 당 첨가제는 수크로스이다. 당알콜은 적어도 하나의 -OH기를 갖는 C4-C8 탄화수소로 정의되고, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서 당알콜 첨가제는 만니톨이다. 상술한 당 또는 당알콜은 개별적으로 또는 조합하여 사용해도 좋다. 당 또는 당알콜이 액상 조제품에 수용성이고 본 발명의 방법을 사용하여 달성된 안정화 효과에 부정적인 효과를 미치지 않는 한, 사용량에 고정된 제한은 없다. 한 구체예에서, 당 또는 당알콜 농도는 약 1mg/ml 내지 약 150mg/ml이다. 본 발명의 다른 구체예에서 등장화제는 1mg/ml 내지 50mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 등장화제는 1mg/ml 내지 7mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 등장화제는 8mg/ml 내지 24mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 등장화제는 25mg/ml 내지 50mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특정 등장화제 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 등장화제의 용도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995를 참조한다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 킬레이트제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 및 아스파르트산 및 그것의 혼합물의 염에서 선택된다. 본 발명의 다른 구체예에서 킬레이트제는 0.1mg/ml 내지 5mg/ml 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 킬레이트제는 0.1mg/ml 내지 2mg/ml 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 구체예에서 킬레이트제는 2mg/ml 내지 5mg/ml 농도로 존재한다. 이들 특정 킬레이트제 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 킬레이트제의 용도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995를 참조한다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 안정화제를 더 포함한다. 약학적 조성물에서 안정화제의 용도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995를 참조한다.

본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 보관 동안 폴리펩티드에 의한 응고체 형성을 감소시키기에 충분한 아미노산 염기의 양을 더 포함해도 좋다. "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의도함에 따라, 어떤 주어진 아미노산은 그것의 유리 염기 형태 또는 그것의 염 형태로 존재한다. 아미노산의 조합을 사용하는 경우, 모든 아미노산은 그들의 유리 염기 형태로 존재할 수 있거나, 모두가 그들의 염 형태로 존재할 수 있거나, 또는 일부는 그들의 유리 염기로 존재하는 한편 나머지는 그들의 염 형태로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 제조에 사용하는 아미노산은 아르기닌, 리신, 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 하전된 측쇄를 보유하는 것이다. 특정 아미노산(예컨대 글리신, 메티오닌, 히드티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 그것의 혼합물)의 입체이성질체(즉, L, D 또는 DL 이성질체) 또는 이들 입체이성질체의 조합은, 특정 아미노산이 그것의 유리 염기 형태 또는 그것의 염 형태로 존재하는 한 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 한 구체예에서 L-입체이성질체가 사용된다. 본 발명의 조성물은 이들 아미노산의 유사체로 제형화될 수도 있다. "아미노산 유사체"는 본 발명의 액상 약학적 조성물의 보관 동안 폴리펩티드에 의한 응고체 형성 감소의 소망하는 효과를 일으키는 자연 발생 아미노산의 유도체로 의도된다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예컨대 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하고, 적합한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 적합한 시스테인 유사체는 S-메틸-L 시스테인을 포함한다. 다른 아미노산으로서, 아미노산 유사체는 그들의 유리 염기 형태 또는 그들의 염 형태로 조성물에 조합된다. 본 발명의 다른 구체예에서 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응고 억제 또는 지연에 충분한 농도로 사용된다.

본 발명의 다른 구체예에서 메티오닌(또는 다른 황 아미노산 또는 아미노산 유사체)은 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기 위해서, 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 이러한 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드인 경우에 메티오닌 술폭시드에 첨가할 수 있다. "억제"는 시간의 경과에 따라 메티오닌 산화종의 최소의 축적으로 의도된다. 메티오닌 산화 억제는 그것의 바람직한 분자 형태로 폴리펩티드의 보다 큰 유지를 가져온다. 어떤 메티오닌의 입체 이성질체(L, D, 또는 DL 이성질체) 또는 그것의 조합을 사용할 수 있다. 첨가되는 양은 메티오닌 술폭시드의 양이 허가 기관에서 수용하능하도록 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이 되어야 한다. 통상적으로, 이것은 조성물이 약 10% 내지 약 30%를 넘지 않는 메티오닌 술폭시드를 함유한다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이것은 첨가되는 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비가 약 1:1 내지 약 1000:1, 예를 들어 10:1 내지 약 100:1의 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 고분자량 폴리머 또는 저분자량 화합물의 군에서 선택되는 안정화제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG3350), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로오스 또는 그것의 유도체(예컨대 HPC, HPC-SL 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황-함유 물질, 및 다른 염(예컨대 염화나트륨)에서 선택된다. 이들 특정 안정화제 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다.

약학적 조성물은 추가의 안정화제를 포함할 수도 있으며, 이것은 그 안의 치료상 활성 폴리펩티드의 안정성을 더 향상시킨다. 본 발명에 특히 주목하는 안정화제는 메티오닌 산화에 대항하여 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 냉동-해동 또는 기계적 전단과 연관된 응고에 대항하여 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하지만 여기에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서 제형은 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 세정제, 에톡시화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세라이드, 아세틸화 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 폴리머 (예컨대 Pluronic^®F68, poloxamer 188 및 407, Triton X-100와 같은 폴록사머), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 알킬화 및 알콕시화 유도체와 같은 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체(tweens, 예컨대 Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세라이드 또는 그것의 에톡시화 유도체, 디글리세라이드 또는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알콜, 글리세롤, 렉틴 및 포스포리피드(예컨대 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파디틸 글리세롤 및 스핑고미엘린), 포스포리피드 (예컨대 디팔미토일 포스파티드산) 및 리소포스포리피드 (예컨대 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린 및 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르)의 유도체 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜의 알킬, 알콕실 (알킬 에스테르), 알콕시 (알킬 에테르)- 유도체, 예컨대 리소포스타디틸콜린, 디팔미토일포스타티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 및 극성헤드기의 변성물, 즉 콜린, 데탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨 및 양전하로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로포스포리피드 (예컨대 세파린), 글리세로글리코리피드 (예컨대 갈락토피란소이드), 스핑고글리코리피드 (예컨대 세라마이드, 강글리오사이드), 도데실포스포콜린, 달걀 리소레시틴, 푸시드산 유도체- (예컨대 타우로히드로푸시데이트 나트륨 등), 장쇄 지방산 및 그것의 염 C6-C12 (예컨대 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N^α-아실화 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 조합 및 중성 또는 산성 아미노산을 포함하는 디펩티드의 N^α-아실화 유도체, 중성 아미노산 및 2개의 하전된 아미노산의 조합을 포함하는 트리펩티드의 N^α-아실화 유도체, DSS (도큐세이트 나트륨, CAS 등록 번호 [577-11-7]), 도큐세이트 칼슘, CAS 등록 번호 [128-49-4]), 도큐세이트 칼륨, CAS 등록 번호 [7491-09-0]), SDS (도데실 술페이트 나트륨 또는 라우릴 술페이트 나트륨), 카프릴레이트 나트륨, 콜산 또는 그것의 유도체, 빌산 및 그것의 염 및 글리신 또는 타우린 콘쥬게이트, 우루소데옥시콜린산, 콜레이트 나트륨, 데옥시콜레이트 나트륨, 타우로콜레이트 나트륨, 글리코콜레이트 나트륨, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온 (알킬-아릴-술포네이트) 1가 계면활성제, 쯔비터이온 계면활성제 (예컨대 N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 양이온 계면활성제 (4급 암모늄 염기) (예컨대 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온 계면활성제 (예컨대 도데실 β-D-글루코피라노사이드), 폴록사민 (예컨대 테트로닉)이 될 수 있으며, 이들은 에틸렌디아민에 산화 프로필렌 및 산화 에틸렌의 순차 첨가로부터 유도되는 4관능 블록 코폴리머이거나, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체 또는 그것의 혼합물의 군에서 선택할 수 있다. 이들 특정 계면활성제 각각은 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다.

약학적 조성물에서 계면활성제의 용도는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위해서 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995을 참조한다.

다른 성분이 본 발명의 약학적 제형에 존재하는 것이 가능하다. 이러한 추가적 성분은 습윤제, 에멀젼제, 항산화제, 벌크제, 장성 변형제, 킬레이트제, 금속 이온, 유성 매개, 단백질 (예컨대, 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터이온(예컨대, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함해도 좋다. 이러한 추가의 성분은 물론 본 발명의 약학적 제형의 전반적인 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다.

비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기를 사용하여 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥내 주사에 의해 행할 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프를 사용하여 행할 수 있다. 다른 선택은 비강 또는 폐 분사의 형태로 FIX 화합물의 투여를 위한 용액 또는 현탁액이 될 수 있는 조성물이다. 또 다른 선택으로서, 본 발명의 FIX 화합물을 함유하는 약학적 조성물은 예컨대 무바늘 주입에 의해 또는 패치, 선택적으로 이온영동 패치로부터의 경피 투여, 또는 점막, 예컨대 구강 투여를 선택할 수도 있다.

정의

본원에 사용된 바와 같이 "인자 IX" 또는 "FIX"는 본래 응고 경로의 구성원이고 혈액 응고에 필수적인 사람 혈장 인자 IX 당단백질을 의미한다. 이 정의는 이 사람 혈장 인자 IX 당단백질의 천연 및 재조합 형태를 포함한다는 것으로 이해된다. 달리 특정 또는 표시하지 않는 한, 본원에 사용된 인자 IX는 응고에 있어 그것의 정규 역할에 있는 기능적 사람 인자 IX 단백질 분자를 의미하고, 그것의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다.

"천연 FIX"는 SEQ ID NO:1에 나타낸 바와 같은 전장 사람 FIX 분자이다. 아미노산 잔기 위치의 넘버링은 SEQ ID NO:1에 따르며 이때 첫번째 N-말단 아미노산 잔기는 숫자 1 등이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "유사체" 또는 "유사체들"은 SEQ ID NO:1의 서열을 갖는 인자 FIX를 지정하도록 의도되며, 여기서 모체 단백질 중 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환되고 및/또는 여기서 모체 단백질의 하나 이상의 아미노산은 제거되고 및/또는 여기서 하나 이상의 아미노산은 단백질에 삽입되고 및/또는 여기서 하나 이상의 아미노산은 모체 단백질에 첨가된다. 이러한 첨가는 모체 단백질의 N-말단부 또는 C-말단부 중 어느 하나에서 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 이 정의 내의 "유사체" 또는 "유사체들"은 여전히 그것의 활성화 형태로 FIX 활성을 갖는다. 한 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 70% 동일하다. 한 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 80% 동일하다. 다른 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 90% 동일하다. 또 다른 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 95% 동일하다. 본원에 사용된 바와 같이 특정 위치에 대한 언급은 SEQ ID NO:1에서 대응하는 위치를 말한다.

달리 특정하지 않으면, 인자 IX 도메인은 하기 아미노산 잔기를 포함한다: 잔기 Tyr1 내지 잔기 Lys43 영역에 있는 Gla 도메인; 잔기 Gln44 내지 잔기 Leu84 영역에 있는 EGF1; 잔기 Asp85 내지 잔기 Arg145 영역에 있는 EGF2; 잔기 Ala146 내지 잔기 Arg180 영역에 있는 활성화 펩티드; 및 잔기 Val181 내지 Thr414 영역에 있는 프로테아제 도메인. 경쇄는 Gla 도메인, EGF1 및 EGF2을 포괄하는 영역을 의미하는 한편, 중쇄는 프로테아제 도메인을 의미한다.

"FIX 반감기"는 혈액 순환에 있어 인자 IX의 반감기를 의미하며, 쥐와 같은 동물 또는 사람에서 측정되며 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 약물동력학에 의해 측정된다.

"FIX 활성" 또는 "FIX 생물학적 활성"은 응고 과정에서 기능하고, 활성화된 혈소판 상에 FVIIIa와 상호작용을 통해 FXa의 형성을 유도하고, 혈액 응고의 형성을 지원하는 능력으로 정의된다. 이 활성은 예컨대 McCarthy et al Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30에 설명된 바와 같은 응고 분석 등의 기술 및 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 생체외 분석할 수 있다.

"연장된 FIX"는 천연 사람 FIX와 비교하여 투여 후 연장된 시간 동안 환자에게서 순환하는 FIX 화합물을 의미한다.

용어 "삽입된 아미노 잔기"는 천연 FIX 분자 내의 위치에서 보통 발견되지 않는 다른 아미노산 잔기에 의한 천연 아미노산 잔기의 치환, 및 천연 사람 FIX 분자로의 아미노산 잔기의 첨가를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 아미노산 잔기의 첨가는 2개의 실재하는 아미노산 잔기 사이 또는 천연 FIX 분자의 N- 또는 C- 말단 중 어느 하나가 될 수 있다.

용어 "PEG화 FIX"는 FIX 분자에 콘쥬게이트된 PEG 분자를 갖는 FIX를 의미한다. 용어 "시스테인-PEG화 FIX"는 FIX 분자에 도입된 시스테인의 설프히드릴기에 콘쥬게이트된 PEG 분자를 갖는 FIX를 의미한다.

사용되는 아미노산 치환을 위한 용어법은 하기와 같다. 첫번째 문자는 사람 FVIII의 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 그 다음의 숫자는 사람 FIX 내의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 천연 아미노산을 치환(대체)하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예는 E162C이며, 여기서 사람 FIX의 위치 162에서 리신은 시스테인으로 대체된다.

본문에서 아미노산의 3개 문자 또는 1개 문자 표시는 표 2에 나타낸 바와 같이 이들의 종래의 의미로 사용된다. 명백하게 표시되지 않으면, 본원에 언급된 아미노산은 L-아미노산이다. 또한, 펩티드의 아미노산 서열의 좌우 말단은 달리 특정되지 않으면 각각 N- 및 C- 말단이다.

아미노산의 약어

아미노산	3개의 문자 코드	1개의 문자 코드
글리신	Gly	G
프롤린	Pro	P
알라닌	Ala	A
발린	Val	V
류신	Leu	L
이소류신	Ile	I
메티오닌	Met	M
시스테인	Cys	C
페닐알라닌	Phe	F
티로신	Tyr	Y
트립토판	Trp	W
히스티딘	His	H
리신	Lys	K
아르기닌	Arg	R
글루타민	Gln	Q
아스파라긴	Asn	N
글루타민산	Glu	E
아스파르트산	Asp	D
세린	Ser	S
트레오닌	Thr	T
감마-카르복시글루타민산	GLA 또는 Xaa

용어 "저분자량 티올-콘쥬게이트 (RS-Cys) 형태" 및 유사한 용어는 당해 단백질의 시스테인의 티올기가 티올기를 갖는 화합물과 콘쥬게이트된 것을 의미하며, 이때 상기 화합물은 분자량이 500Da 미만이다. 이러한 화합물의 예는 글루타티온, 감마-글루타밀시스테인, 시스테이닐글리신, 시스테인, N-아세틸시스테인, 시스티아민 등이다.

용어 "활성 형태"는 소망하는 작용을, 예컨대 촉매(효소), 자이모겐으로서, 또는 보조 인자 등으로서 행할 수 있는 단백질의 형태(또는 형태들)을 의미한다. "활성 형태"는 "정확하게 접힌 형태"를 의미하는 경우도 있다.

단백질은 일반적으로 적어도 하나의 비천연 시스테인을 포함하는 천연 단백질과 비교하여 "조작된" 폴리펩티드이다. 이러한 "조작된" 폴리펩티드는 당업자에게 명백하듯이 재조합 기술에 의해 바람직하게 제조된다: WO 02/077218 A1 및 WO 01/58935 A2 참조.

본원에 언급된 문헌, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은 각 참조문헌이 참조로서 통합되는 것으로 개별적이고 구체적으로 표시되었고 본원에 그대로 설명되어 있는 것처럼 그대로 동일한 범위로 참조로서 통합된다(법에 의해 허용되는 최대 범위까지).

모든 제목 및 소제목은 본원에서 편의로만 사용되고 어떤 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 제공된 일부 및 모든 실시예, 또는 예시적 언어(예컨대, "와 같은")는 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로 의도되고 달리 주장되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 명세서 내의 언어는 발명의 실행에 본질적이듯이 어떤 비주장 요소를 나타내는 것처럼 해석되지 않는다.

본원에 특허 문헌의 언급 및 통합은 편의만을 위한 것이고 이러한 특허 문헌의 효력, 특허성 및/또는 집행력의 관점을 반영하는 것은 아니다.

본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 만큼 여기에 첨부된 청구항에 기술된 내용의 모든 변형 및 동등을 포함한다.

본 발명의 구체예:

1. 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된, 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.

2. 구체예 1에 있어서, 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80 또는 84 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.

3. 구체예 1에 있어서, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141 또는 142 위치에 있는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.

4. 구체예 1에 있어서, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치에 있는 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.

5. 구체예 1에 있어서, 146-180 위치에 있는 천연 아미노 잔기 중 적어도 하나가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.

6. 구체예 1에 있어서, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 168,169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 177 위치로부터 선택되는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.

7. 구체예 1에 있어서, 160, 161, 162, 163, 164, 165 및 166 위치로부터 선택되는 천연 아미노산 잔기 중 적어도 하나는 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.

8. 구체예 7에 있어서, 아미노산 잔기 E162는 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.

9. C-말단 T415에 부가된 적어도 하나의 시스테인 잔기를 갖고, 상기 시스테인은 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이션되는 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.

10. 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택된 선행 구체예 중 어느 하나에 따른 FIX 유사체.

11. 구체예 10에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들면 1000-75,000, 또는 2,000-60,000의 범위 내인 FIX 유사체.

12. 선행 구체예 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 순환 반감기가 야생형 FIX의 적어도 1.5배인 FIX 유사체.

13. 선행 구체예 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 생물학적 활성이 응고 분석으로 측정했을 때 야생형 FIX의 20% 이상인 FIX 유사체.

14. a) 저분자량 티올-콘쥬게이션 FIX를 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써, 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된(RS-CYS), 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치의 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이션하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 FIX 유사체의 제조방법.

15. 구체예 14에 있어서, 산화환원 버퍼는 환원 및 산화된 글루타티온을 포함하는 혼합물을 포함하는 방법.

16. a) 저분자량 티올-콘쥬게이트 FIX를 트리아릴포스핀-3,3',3"-트리술폰산 화합물을 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써, 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이션된(RS-CYS), 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치의 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이션하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 구체예 1-13 중 어느 하나에 따른 FIX 유사체의 제조방법에 관한 것이다.

17. 구체예 14-16에 있어서, 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택된 방법.

18. 구체예 17에 있어서, 화학기는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 특히 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들면 1,000-75,000, 또는 2,000-60,000의 범위 내인 방법.

19. 구체예 1-13에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 혈우병 환자의 치료를 위한 약학적 제형.

20. 구체예 1-13에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병 환자의 치료방법.

21. 구체예 20에 있어서, 치료는 주 1회 이상의 치료를 포함하는 방법.

22. 구체예 21에 있어서, 치료는 주 1회만의 치료를 포함하는 방법.

하기 실시예에서 사용되는 아미노산 치환에 대한 용어법은 하기와 같다. 첫번째 문자는 SEQ ID NO:1의 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산을 나타낸다. 그 다음의 숫자는 SEQ ID NO:1 내의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 천연 아미노산을 치환하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예는 인자 IX E162C이며, 여기서 SEQ ID No:1의 위치 162의 글루탐산은 시스테인으로 대체된다.

재료 - Sigma로부터 환원 및 산화된 글루타티온(각각 GSH 및 GSSG)을 구입하였다. Nektar Therapeutics (Huntsville, AL)으로부터 PEG5k-말레이미드 (2E2M0H01), PEG20k-말레이미드 (2E2M0P01), PEG40k-말레이미드 (2D3Y0T01)를 구입하였다. 모든 다른 화학물질은 분석용 등급 또는 그 이상이었다.

농도 측정 - 저장 용액 중의 GSSG의 농도를 381 M^-1cm^-1의 소광 계수를 사용하여 248nm에서의 그것의 흡수로부터 측정하였다(Chau and Nelson, 1991). Ellman's 시약 (5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)) 및 412nm에서 2-니트로-5-티오벤조산의 몰랄 소광 계수로서 14150 M^-1cm^-1을 사용하여 GSH의 농도를 측정하였다(Riddles et al., 1979).

글루타레독신의 복제 및 발현 - 제조자의 권장에 따라 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN), 및 측면 NdeI 및 XhoI 제한 부위를 도입하는 프라이머 쌍 oHOJ98-f/oHOJ98을 사용하여 PCR에 의해 Escherichia coli 글루타레독신 2 (Grx2)을 위한 DNA 암호화 서열을 증폭시켰다(프라이머 서열은 표 1에 열거됨). 발표된 과정에 따라 E.coli로부터 PCR 반응을 위한 게놈 주형 DNA를 제조하였다(Grimberg et al., 1989). 정제된 PCR 생성물을 NdeI 및 XhoI으로 절단한 다음 pET-24a(+) (Novagen)의 해당 부위로 결찰하여 pHOJ294을 제공하였다. 벡터에 의해 정지 코돈을 제공하였으므로, 유전자는 C-말단 LEHHHHHH 친화성 태그를 암호화하는 3' 벡터-유도 연장부가 구비되었다. 복제된 서열의 정확한 동일성은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.

발현을 위해서, 화학적 컴페턴트 BL21(DE3) 세포로 294 플라스미드를 도입하였다(Stratagene, La Jolla, CA). 신선한 하룻밤된 형질전환세포를 500 ml TB 배지(terrific broth) ((Sambrook et al., 1989))와 30 μg/ml 카나마이신에 접종하였고, 초기 OD600는 0.02였다. 배양균을 37℃ 배플 플라스크에서 230 rpm으로 중기 -로그 상으로 성장시켰고(OD600 3-4), 이 때 온도를 25℃로 낮추고 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (ITPG)에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 하룻밤 발현 후, 세포를 원심분리로 채취하고, 50 ml 용해(lysis) 버퍼 (50 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, pH 8.0)에 재현탁하고, 그리고 3회 냉해동 순환으로 용해하였다. 투명한 용해물을 5 ml/min의 유속에서 용해 버퍼로 평형화된 20-ml Ni-NTA Superflow (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 컬럼에 로딩하였다. 용해 버퍼로 세정한 후, 용해 버퍼 중의 0-200 mM 이미다졸로부터 선형 구배로 결합 단백질을 용리하였다. 피크 분획물을 모으고, 20mM 디티오트레이톨로 처리한 후 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0에서 광범위한 투석을 행하였다. 단백질을 -80℃에서 저장하고 SDS-PAGE에 의해 >90% 순수한 것으로 판단되었다. 21740 M^-1cm^-1의 소광 계수를 사용하여 280nm에서의 흡수에 의해 농도를 측정하였다.

DNA 암호화 인자 IX 및 인자 IX E162C 및 인자 IX 416C 돌연변이의 구성 -

제조자의 지시에 따른 주형으로서 프라이머 쌍 oHOJ137-f/oHOJ137-r 및 oHOJ155-f/oHOJ155-r (표 3 참조)을 사용하여 QuickChange^®Site-Directed Mutagenesis에 의해 인자 IX E162C 및 인자 IX 416C를 암호화하는 플라스미드 pHOJ338 및 pHOJ358를 각각 구성하였다(Stratagene, La Jolla, CA). 모든 복제된 서열의 정확한 동일성을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.

인자 IX 및 변이체의 정제 - 인자 IX (Cys 변이체)를 함유하는 분획물을 모으고, 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂에 대하여 투석하고, -80℃에서 저장 하는 것을 제외하고, Arruda et al. (2001) Blood, 97, 130-138에 설명된 바와 같이 인자 IX 및 변이체를 정제하였다.

PEG-말레이미드를 사용한 FIX Cys 변이체의 변성 - 4.8 mg FIX Cys 변이체를 30℃에서 5시간 동안 총 체적 4.4 ml 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.5 mM GSH, 20 μM GSSG, 및 10 μM Grx2을 함유하는 pH 7.0 버퍼에서 배양함으로써 선택적 환원을 행하였다. 이어서, 발생한 유리 티올을 0.8 mM의 최후 농도로 PEG5k-말레이미드, PEG20k-말레이미드, 또는 PEG40k-말레이미드(물에 용해된)의 첨가에 의해 선택적으로 변성시킨다. 0.5 mM 시스테인으로 퀀칭시 티올 알킬화를 실온에서 15분 동안 진행시켰다. EDTA를 과잉의 칼슘에 첨가하고 (20 mM 최종 농도) 버퍼 A (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.0)로 평형화된 1 ml HiTrap Q FF 컬럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)으로 전체 성분을 로딩하여 FIX Cys 변이체를 포획하였다. 버퍼 A로 세정한 후, HiTrap 컬럼 앞에 장착된 HiLoad Superdex 200 16/60 pg 컬럼 (Amersham Biosciences)으로 직접 버퍼 B (10 mM GlyGly, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.01% Tween 80, pH 7.0)으로 결합 단백질의 1단계 용리를 행한다. 1 ml/min 의 유속으로 PEG화 및 비-PEG화 종을 분리하고 280 nm에서 흡수에 의해 검출한다. PEG화 FIX Cys 변이체를 함유하는 피크를 수집하고 -80℃에서 저장한다.

플라스미드의 구성에 사용된 DNA 올리고

프라이머	플라스미드	서열 (5'→3')
oHOJ98-f	pHOJ294	GCCGCCGGCATATGAAGCTATACATTTACGATCACTGCCC
oHOJ98-r	pHOJ294	CCGCCGCCCTCGAGAATCGCCATTGATGATAACAAATTGATTTGTG
oHOJ137-f	pHOJ338	CTATGTAAATTCTACTGAAGCTTGCACCATTTTGGATAACATCAC
oHOJ137-r	pHOJ338	GTGATGTTATCCAAAATGGTGCAAGCTTCAGTAGAATTTACATAG
oHOJ155-f	pHOJ358	GGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGCTAAGCGGCCGCTTCCC
oHOJ155-r	pHOJ358	GGGAAGCGGCCGCTTAGCAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC

참조문헌

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<110> Novo Nordisk Health Care AG <120> Factor IX Analogues Having Prolonged in vivo Half Life <130> DK-08P-1068 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> The three-letter indication "Xaa" means 4-carboxyglutamic acid (gamma-carboxyglutamate) <222> (1)..(415) <400> 1 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 20 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415

Claims (15)

1. 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치에 있는 천연 아미노 잔기 중 하나 이상이 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된, 연장된 순환 반감기를 갖는 FIX 유사체.
2. 제1항에 있어서, 146-180 위치에 있는 천연 아미노 잔기 중 하나 이상이 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
3. 제2항에 있어서, 아미노산 잔기 E162가 FIX 폴리펩티드의 분자량을 증가시키는 화학기와 콘쥬게이트된 시스테인 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
4. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에서 선택 되는 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
5. 제4항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜은 평균 분자량이 500-100,000, 예를 들면 1,000-75,000 또는 2,000-60,000의 범위 내인 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
6. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체의 순환 반감기는 야생형 FIX의 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
7. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 분석으로 측정했을 때 유사체의 생물학적 활성은 야생형 FIX의 20% 이상인 것을 특징으로 하는 FIX 유사체.
8. a) 저분자량 티올-콘쥬게이트 FIX를 산화환원 버퍼를 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써, 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된(RS-CYS), 위치 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415의 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스 테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이션하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선행항 중 어느 한 항에 따른 FIX 유사체의 제조방법.
9. a) 저분자량 티올-콘쥬게이트된 FIX를 트리아릴포스핀-3,3',3"-트리술폰산 화합물을 포함하는 혼합물과 반응시킴으로써, 저분자량 티올에 이황화 다리를 통해 콘쥬게이트된(RS-CYS), 위치 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 또는 415 위치의 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 조작된 FIX 폴리펩티드를 선택적으로 환원하는 단계, 및 b) 하나 이상의 선택적으로 환원된 시스테인(HS-Cys) 부분을 화학기와 콘쥬게이션하는 동시적 또는 연속적 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 FIX 유사체의 제조방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 화학기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 화학기는 폴리에틸렌글리콜, 특히 평균 분자량이 500- 100,000, 예를 들면 1,000-75,000 또는 2,000-60,000의 범위 내인 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제7항에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 혈우병 환자의 치료를 위한 약학적 제형.
13. 제1항 내지 제7항에 따른 FIX 유사체의 치료상 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병 환자의 치료방법.
14. 제13항에 있어서, 치료는 주 1회 이상의 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 치료는 주 1회만의 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.