JP2008530271A - ポリマー複合体の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の工程は、様々なポリマー(PEG)複合体の調製に有用である。本発明の過程で生成される反応混合物の多様な成分の選択には、かなりの自由裁量があるが、各工程での成分の特徴は、本方法を一般化して説明できるほど十分に類似している。図1には、後述する反応の概略が提供されているので参照されたい。
周知のポリマーまたはPEG活性化技術を用いて、第1反応混合物を生成する。これは、すなわち、結果的にPEG−OHなどの活性化可能なポリマー残基、およびSC−PEGなどの活性化されたポリマー残基を含む溶液となる。過剰の小分子剤は、再結晶などの既知の技術を用いて容易に除去可能である。
第1反応混合物を生成した後、それを、活性化されたポリマー残基と反応していない少なくとも1つの官能基を有する多官能性の結合部分と反応させる。反応は、第1反応混合物中にみられる活性化されたポリマー残基が、好ましくは多官能性の結合部分に対して過剰モルで存在する条件下で行う。
中間体ポリマー複合体が生じた後、第1および第2のクエンチ剤を第2反応混合物に別々に加え、それぞれ第3および第4の反応混合物を生成する。
第4反応混合物中の中間体ポリマーの保護基を、効果的な量の脱保護剤、すなわち、強酸もしくは強塩基を用いて脱保護する。適切な塩基としては、限定はしないが、水酸化リチウム、水酸化カリウム、カリウムt−ブトキシド、ブチルリチウム、およびナトリウムアミドが挙げられる。適切な酸は、トリフルオロ酢酸(TFA)、硫酸、リン酸、および塩酸などから選択可能である。水酸化リチウムを加えて脱保護し、次に塩酸で中和するのが好ましい。その後、第4の混合物を中和して第5反応混合物を生成する。
第6反応混合物には2種類の不活性化されたポリマー残基、および、さらなる精製なしにターゲットとする生物活性化剤と反応させるのに適した1種類の活性化された分岐鎖ポリマーリンカーが含まれ、ポリマー複合体を生成する。これらの活性化された分岐鎖ポリマーについては、前述の、一般的には譲渡されている特許文献1、特許文献2および米国特許第第6,113,906号明細書に記載のものであって構わない。1つの特に好ましい活性化された分岐鎖ポリマーは:
(R)n−L−D
である。
Rはポリマー残基であり;
Lは、芳香族基を含有するか否かを問わず、リジン、ジアミノプロパノール、適切なアミノ酸などの多官能性の結合部分であり;
Dは、離脱基、生物活性部分、ターゲット部分および診断用薬からなる群の構成要素であり;および、
nは、正の整数であり、2であることが好ましい。
R1−2は、同一もしくは異なるポリマー残基であり;
Y1−6は、独立して、O、S、またはNR3であり、ここで、R3は、H(好ましい)、C1−6アルキルおよび置換アルキル、C3−6分岐鎖アルキルおよび置換分岐鎖アルキルおよびC4−8シクロアルキルの中から選択され;
Jは、二官能性の結合部分であり;および
Dは、離脱基、生物活性化合物、ターゲット部分または診断用薬である。この態様中では、Y2およびY4はOであることが好ましく、一方、Y1、Y3、Y5およびY6はO、SまたはNHのいずれかである。
(a)は約1〜約5の整数であり;
Zは、O、NR4、S、SOまたはSO2であり;ここでR4はH、C1−8アルキル、C1−8分岐鎖アルキル、C1−8置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり;
(m)は、0または1であり;
(p)は、正の整数であり、約1〜約6であることが好ましく、および
Dは、離脱基、生物活性化合物、ターゲット部分または診断用薬である。
上記のように、R、R1およびR2はポリマー残基である。それぞれが、ポリアルキレンオキサイド(PAO)などの実質的に非抗原性の水溶性ポリマー残基であることが好ましく、ポリエチレングリコールがさらに好ましい。説明の目的であって、限定はしないが、ポリエチレングリコール(PEG)残基部分は以下の中から選択可能である:
xは、重合度、すなわち、約10〜約2,300であり;
R5は水素、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、C3−12分岐鎖アルキル、C3−8シクロアルキル、C1−6置換アルキル、C2−6置換アルケニル、C2−6置換アルキニル、C3−8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1−6ヘテロアルキル、置換C1−6ヘテロアルキル、C1−6アルコキシアルキル、フェノキシアルキルおよびC1−6ヘテロアルコキシの中から選択され;および
R6は、キャップ基、すなわち、メチル、エチル、ベンジル、などである。
tは、正の整数であり、約1〜約12であることが好ましい。
別の態様では、上記の方法は、さらに混合物7中の副生成物からポリマー複合体を分離または単離する工程を包含する。これは、成果を達成するのに適した技術的に受容可能な方法のいずれかを用いて行うことが可能である。用いられる方法は、効率的に大量生産するための設置に利用可能なものであることが好ましい。ほとんどの場合は、膜分離法またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、望まれる結果を達成していると考えられる。しかしながら、イオン交換、アフィニティー、および疎水性のカラムクロマトグラフィーもまた、当業者による個々の必要性に応じて利用可能である。例えば、反応混合物を水で希釈し、SPセファロース(登録商標)FF樹脂を充填したカラムに通しても良い。次にカラムをPBS(リン酸塩)緩衝液などの適切な緩衝液で洗浄し、不活性なPEGおよび反応の間に加水分解されたPEGをすべて除去する。次に、付加された2以上の部位を有するポリマー複合体を、所望のポリマー複合体が、例えば、90〜95%の高純度で溶出する前に、異なる濃度勾配の緩衝液で洗い流す。
Dが生物活性を有する化合物である構造式(I)の態様では、これらの適した化合物の非限定的なリストには、有機化合物、酵素、タンパク質、ポリペプチドなどの残基が含まれる。上記に加えて、生物活性を有する化合物は、また、酵素、タンパク質、ポリペプチド、モノクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、SS1Pなどの免疫複合体、CC49などの単鎖抗原結合蛋白(SCA)の残基であってもよく、また、それらの断片も意図するものである。適切なタンパク質としては、限定はしないが、ポリペプチド、酵素、ペプチド、および、ポリマーに付加するための少なくとも1つの利用可能な基を有する同種のもの、例えば、ε−アミノ、シスチニルチオ、N−末端アミノなどが挙げられ、有機溶媒中で反応を触媒可能であると同時に、生理または薬理活性を有する材料も含まれる。
Dが診断用薬である構造式(I)の態様では、適切な薬剤の非限定的なリストとしては、染料、キレート剤、および同位体で標識された化合物ならびに緑色蛍光タンパク質(GFP)などの他の標識された化合物が挙げられる。
Dがターゲット部分である構造式(I)の態様では、適切な薬剤の非限定的なリストとしては、TATペプチドおよびU−7ペプチドなどのペプチド、CC49などの単鎖抗体、例えばタウリンおよびビオチンなどの小分子が挙げられる。
本発明の別の態様では、診断用薬は、診断または画像化を目的として選択されるタグである。よって、例えばアミノ酸残基などの適切な部分を、標準技術である放射性同位体、放射線不透性ラベル、磁気共鳴ラベル、もしくは磁気共鳴画像法に適する他の非放射性の同位体ラベル、蛍光型のラベル、可視色を示す、および/または紫外線、赤外線もしくは電気化学的刺激下で蛍光を発する能力のあるラベルのいずれかと結合させることによって適切なタグを調製し、外科的処置などの間に、腫瘍組織を画像化可能にする。状況に応じて、診断用のタグは結合する治療部分に取り込まれ、および/またはそれと結合し、動物またはヒトである患者の体内で治療的生物活性のある材料の分布をモニタ可能にする。
実施例1
第1反応混合物:
化合物1 20kのmPEG−OH(125g、6.24mmol)をトルエン(1.88l)と共に窒素雰囲気下で2時間共沸し、375mmolの溶媒を除去した。この溶液を50℃に冷却した。トリホスゲン(1.24g、4.18mmol)およびピリジン(0.99g、12.47mmol)を加え、反応溶液を50℃で3時間攪拌した。N−ヒドロキシコハク酸イミド(1.79g、15.59mmol)およびピリジン(1.23g、15.59mmol)を次に加えた。反応溶液を50℃で20時間攪拌し、続いて濾過して、ピリジン塩を除去した。40℃、真空下でトルエン溶媒を完全に除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン(400ml)に溶解した。エチルエーテル(2.50l)を溶液にゆっくりと加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル(875ml)に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール(3.75l)をゆっくりと加え、白色の固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、40℃で乾燥し、化合物1および2を含む第1反応混合物を得た(112g、5.55mmol、89%)。
実施例2
第2および第3反応混合物:
化合物1および2の第1反応混合物(5.0g、0.25mmol)を、窒素雰囲気下で無水クロロフォルム(50ml)に溶解した。1−リジンエチルエステル二塩酸塩(26mg、0.10mmol)およびトリエチルアミン(42mg、0.41mmol)を加えた。反応溶液を30℃に加熱し、30℃で20時間攪拌し、化合物1、2および4を含む第2反応混合物を得た。この第2反応混合物を室温まで冷却し、ベンジルアミン(53.2mg、0.50mmol)を加えて、第1反応混合物中の過剰な活性化PEGをクエンチした。この反応溶液を室温で20時間攪拌した。溶媒を30℃、真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン(15ml)に溶解した。エチルエーテル(100ml)をゆっくりと溶液に加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル(10ml)に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール(150ml)をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、40℃で乾燥し、化合物1、4および5の第3反応混合物を得た(4.5g、90重量%)。
実施例3
第4反応混合物:
化合物1、4および5を含む第3反応混合物(4.23g)を無水ジクロロメタン(40ml)に溶解し、続いて塩化t−ブチルジメチルシリル(8mg、0.05mmol)およびトリエチルアミン(26mg、0.26mmol)を加えた。反応溶液を室温で、窒素雰囲気下、20時間攪拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン(15ml)に溶解した。エチルエーテル(100ml)を溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル(10ml)に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール(125ml)をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、40℃で乾燥し、化合物4、5および6の第4反応混合物を得た(3.8g、93重量%)。
実施例4
第5反応混合物:
化合物4、5および6の第4反応混合物(3.46g)を水(20ml)に完全に溶解した。水酸化リチウム一水和物(5.4mg、0.13mmol)を加え、反応溶液を室温で20時間攪拌した。溶液のpHを2〜2.5に調整し、続いてジクロロメタン(100ml)で2回抽出した。混合有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン(15ml)に溶解した。エチルエーテル(100ml)をこの溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、40℃で乾燥し、化合物5、6および7の第5反応混合物を得た(3.0g、87重量%)。
実施例5
第6反応混合物:
化合物5、6および7の第5反応混合物(2.22g)、N−ヒドロキシコハク酸イミド(38mg、0.33mg)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(85mg、0.66mmol)を無水ジクロロメタンおよびN,N−ジメチルホルムアミドの混合溶媒に、窒素雰囲気下で溶解した。溶液を0℃まで氷浴で冷却し、1−[3−(ジメチルアミン)プロピル]−3−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えた。反応溶液を0℃〜室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン(7ml)に溶解した。エチルエーテル(50ml)を溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル(4.5ml)に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール(70ml)をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、40℃で乾燥し、化合物5、6および8の第6反応混合物を得た(2.07g、93重量%)。
実施例6
PEG2−IFNβ−1b(モノPEG化されたPEG2インターフェロンβ−1b)
純粋なIFNβ−1b(0.45mg/mlで5ml)を50mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、0.05%両性界面活性剤3−14、pH=7.9の条件下で、化合物5、6および8を含む第6反応混合物(38mg)と反応させることにより、PEG化されたIFNβ−1b(モノPEG化されたPEG2インターフェロンβ−1b)を合成した。反応混合物を1.5時間、25℃で攪拌した。PEG化反応を、グリシン(1Mグリシン溶液で9.5μl)を加えてクエンチ処理し、次に、2N酢酸でpHを6.5に下げた。モノPEG化複合体化合物9(分岐鎖PEG化タンパク質)を、RP−HPLCにより収率39%で得た(表1参照)。直鎖PEG化(1/2PEG)IFNβ−1bは得られなかった。後述の工程を用いて純粋なモノPEG化IFNβ−1b化合物9を単離した。
比較用のPEG化されたIFNβ−1bを、分岐鎖活性化PEG8および実施例6で用いた第6反応混合物の代わりに、同一の分子量を持つ、ネクター社のPEG2−NHSを用いて、同一の結合条件下で調製した。この比較用のPEG2−NHSを、インターフェロンと反応させる前に、カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。PEG化後、やはりRP−HPLC分析を行った。結果を以下の表2に示す。
Claims (30)
- a)活性化可能なポリマー残基を、離脱基を提供する能力のある活性化剤と反応させ、活性化されたポリマー残基および活性化可能なポリマー残基を含む第1反応混合物を提供し、
b)前記第1反応混合物を、前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性の保護基を有する多官能性の結合部分と、前記第1反応混合物の前記活性化されたポリマー残基が、前記多官能性の結合部分に対して過剰に存在する条件下で反応させ、前記第1反応混合物、および、前記活性化されたポリマー残基と前記多官能性の結合部分との前記反応により得られる前記保護基を有する中間体ポリマーを含有する第2反応混合物を生成し;
c)前記第2反応混合物を十分な量の第1クエンチ剤でクエンチ処理して、前記活性化されたポリマー残基を不活性化し、前記中間体ポリマーを含む第3反応混合物を生成し、
d)十分な量の第2クエンチ剤を前記第3反応混合物に加えて、前記活性化可能なポリマー残基を不活性化し、前記中間体ポリマーを含む第4反応混合物を生成し;
e)前記保護基を前記中間体ポリマーから除去し、前記第4反応混合物を中和して第5反応混合物を生成し;
f)前記第5反応混合物と、生物活性部分と結合させるための前記中間体ポリマーを活性化する能力のある化合物を反応させ、活性化されたポリマーを含有する第6反応混合物を生成する;
各工程を有してなる、活性化されたポリマーを調製する方法。 - 前記第6反応混合物を、生物活性のある化合物、ターゲット部分または診断用薬と反応させ、ポリマー複合体を生成する工程をさらに包含することを特徴とする請求項1記載の方法。
- ポリマー複合体を単離する工程をさらに包含することを特徴とする請求項2記載の方法。
- 前記単離が、膜分離法もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 前記ポリマー複合体が、下記構造式:
(R)n−L−D
であることを特徴とする請求項2記載の方法。
ここで:
Rがポリマー残基であり;
Lが多官能性の脂肪族結合部分であり;
Dが、生物活性部分、ターゲット部分および診断用薬からなる群より選択される構成要素であり;および
nが正の整数である。 - 前記Rが、ポリアルキレンオキサイドであることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記ポリアルキレンオキサイドが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが、約200〜約120,000の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項7記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが、約2,000〜約80,000の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項8記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが、約10,000〜約40,000の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 前記活性化可能なポリマー残基が、mPEG−OH、mPEG−NH2、mPEG−CO2H、mPEG−SO2、およびmPEG−ハロゲンからなる群より選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記活性化可能なポリマー残基が、mPEG−OHであることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも1つの官能基を有する前記多官能性の結合部分が、置換アルキルジアミン、トリアミン、天然および非天然アミノ酸誘導体およびマロン酸エステル誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも1つの官能基を有する前記多官能性の結合部分が、リジン、ジアミノアルキル、ジヒドロキシアルキル、およびジチオアルキルから選択されることを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも1つの官能基を有する前記多官能性の脂肪族結合部分が、リジン、リジンエステル、またはリジンエチルエステルであることを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記第1クエンチ剤が、遊離アミン、遊離チオールまたは遊離ヒドロキシル基を含有する化合物であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記第1クエンチ剤が、システイン、ベンジルアミン、n−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、C−末端保護化アミノ酸およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項18記載の方法。
- 前記第2クエンチ剤がシリル基または酸塩化物を含有することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記第2クエンチ剤が、TBDMSiCl、TMSiCl、MeI、MeSO4、CF3SO3Me、およびMe3OBF4からなる群より選択されることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記第2クエンチ剤が、TBDMSiClであることを特徴とする請求項21記載の方法。
- 前記中間体ポリマー複合体を活性化させる能力のある前記化合物が、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)であることを特徴とする請求項21記載の方法。
- 前記生物活性のある化合物が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、単鎖結合抗原(SCA)、抗体、抗体フラグメント、および天然または合成の医薬品から選択されることを特徴とする請求項2記載の方法。
- 前記タンパク質がインターフェロンであることを特徴とする請求項24記載の方法。
- 前記インターフェロンが、α、βまたはγインターフェロンであることを特徴とする請求項25記載の方法。
- 活性化可能なポリマー残基がmPEG−OHであり;
離脱基を提供する能力のある活性化剤がN−ヒドロキシスクシンイミジルであり;
前記活性化されたポリマー残基がmPEG−スクシンイミジルカーボネートであり;
前記第1クエンチ剤がベンジルアミンであり;
前記第2クエンチ剤がTBMSiClであり;および、
生物活性部分と結合するための前記中間体ポリマー複合体を活性化させる能力のある前記化合物が、N−ヒドロキシスクシンイミジルであることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 前記N−ヒドロキシスクシンイミジル活性化中間体ポリマー複合体が、さらに生物活性のある化合物と反応することを特徴とする請求項28記載の方法。
- a)活性化可能なポリマー残基を、離脱基を提供する能力のある活性化剤と反応させて、活性化されたポリマー残基および活性化可能なポリマー残基を含む第1反応混合物を提供し;
b)前記第1反応混合物を、前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性の保護基を有する多官能性の結合部分と、前記第1反応混合物の前記活性化されたポリマー残基が前記多官能性結合部分に対して過剰に存在する条件下で反応させて、前記第1反応混合物および前記活性化ポリマー残基と前記多官能性結合部分との前記反応で得られた前記保護基を含有する中間体ポリマーを含む第2反応混合物を生成し;
c)前記第2反応混合物を十分な量の第1クエンチ剤でクエンチ処理して、前記活性化可能なポリマー残基を不活性化させ、前記中間体ポリマーを含む第3反応混合物を生成し;
d)十分な量の第2クエンチ剤を前記第3反応混合物に加え、前記活性化されたポリマー残基を不活性化させ、前記中間体ポリマーを含む第4反応混合物を生成し;
e)前記保護基を前記中間体ポリマーから除去し、前記第4反応混合物を中和して第5反応混合物を生成し;
f)前記第5反応混合物を、生物活性部分と結合するための前記中間体ポリマーを活性化させる能力のある化合物と反応させ、活性化されたポリマーを含む第6反応混合物を生成する;
各工程を有してなる活性化されたポリマーを調製する方法。
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