JP3342060B2 - Ｐｅｇイミデート類およびそれらの蛋白質誘導体 - Google Patents
Ｐｅｇイミデート類およびそれらの蛋白質誘導体Info
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- C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
- C08G63/91—Polymers modified by chemical after-treatment
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
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- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Description
【発明の分野】本発明は、末端イミデート（imidate）
基で修飾した水溶性ポリマー類、および上記分子で修飾
したポリペプチド分子に関する。
基で修飾した水溶性ポリマー類、および上記分子で修飾
したポリペプチド分子に関する。
【従来技術】蛋白質および他の同様な有機分子は、ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）の如き水溶性有機ポリマ
ーに連結させることによって化学的に修飾され得る。上
記蛋白質接合体の製造は、該水溶性ポリマー類を取り付
けることで所望の特性をポリペプチド類に与えることが
可能なため、興味の持たれるものである。これらの所望
特性には、水溶液中の上昇した溶解性、貯蔵中の増大し
た安定性、減少した免疫原性、酵素分解に対する上昇し
た耐性、幅広い種類の薬物投与系との適合性、および上
昇したインビボ半減期が含まれる。ＰＥＧもしくは他の
水溶液ポリマー類を用いたポリペプチド類の誘導化によ
ってもたらされる上記特性は、このポリペプチドを体に
注入する治療剤として用いる時、或はこのポリペプチド
を、興味の持たれている化合物の検出および／または定
量アッセイ、通常免疫アッセイで用いる時、特に興味が
持たれている。蛋白質に対する、レポーター基、リガン
ドなどの付着は、通常、リジン残基側鎖上の第一級アミ
ノ基を通して進行する。リジン残基に特異的に連成する
いくつかのＰＥＧ誘導体が合成された。典型的には、Ｐ
ＥＧのヒドロキシル末端基を、興味の持たれている蛋白
質にＰＥＧを共有結合的に付着させることの可能な反応
性官能基に変換する。これらのＰＥＧ誘導体には、２
（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４，６−ジク
ロロトリアジン〔Abuchowski, A.、 Van Es, T.、 Palczu
k, N.C.およびDavis, F.F. (1977) J. Biol. Chem. 25
2、 3578-3581〕；２−（アルコキシポリエチレングリコ
キシ）−Ｓ−カルボキサミドメチルジチオカーボネート
〔King, T.P.およびWeiner, C. (1980) Int. J. Peptid
e Protein Res. 16、 147-155〕；２−（アルコキシポリ
エチレングリコキシ）−Ｎ−スクシニミジルスクシネー
ト〔Abuchowski, A.、 Kazo, G.M.、 Verhoest, C.、 Van
Es, T.、 Kafkewitz, D.、 Viau, A.およびDavis, F. (19
84) Cancer Biochem. Biophys.7、 175-186〕；２−（ア
ルコキシポリエチレングリコキシカルボキシイミダゾー
ル〔Beauchamp, C.O.、 Gonias, S.L.、 Menapace, D.P.
およびPizzo, S.V. (1983) Anal. Biochem. 131、 25-3
3〕；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−
２，４，５−トリクロロベンゼン〔Versonese, F.M.、 L
argajolli, R.、 Boccu, E.、 Benassi, C.A.およびSchia
von, O. (1985) Applied Biochem. Biotech11、 141-15
2〕；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４
−ニトロベンゼン〔Versonese, F.M.、 Largajolli, R.、
Boccu, E.、 Benassi, C.A.およびSchiavon, O. (1985)
Applied Biochem. Biotech 11、 141-152〕；２−（ア
ルコキシポリエチレングリコキシ）−２，２，２−トリ
フルオロエタン〔Delgado, C.、Patel, J.N.、 Francis,
G.E.およびFisher, D. (1990) Biotech. Applied Bioch
em. 12、 119-128〕；２−（アルコキシポリエチレンア
ルデヒド〔Andrews, B.A.、 Head, D.M.、 Dunthrone, P.
およびAsenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech. 4、49-5
4〕；２−アルコキシポリエチレングリコキシメチルエ
ポキシド〔Andrews,B.A.、 Head, D.M.、 Dunthrone, P.
およびAsenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech.4、 49-54〕
が含まれる。蛋白質の修飾でしばしばアルキルのイミデ
ート類が用いられてきた。〔論評に関しては、Hunter,
M.J.およびLudwig, M.L. (1972) Methods Enzymol. 25、
585-596参照のこと〕。アルキルイミデート類は、特異
的に、アルファおよびイプシロンアミノ基と反応して、
親アミン類よりも強い塩基であるアミジン類を生じる。
この元の蛋白質アミノ基が有する正電荷は保持される
が、この正電荷は数原子だけシフトする。種々の官能基
（フェニル、フェノール系、スルフヒドリル、蛍光、疎
水性、放射標識、スピン標識、光親和性標識など）をイ
ミドエステル類に取り付けることが可能であり、そして
このようにして、これらを蛋白質の中に導入することが
可能である。活性エステル連成もしくは活性カルバメー
ト連成よりもイミドエステルが有利であることは、修飾
すべきリジン基の正電荷が保持されることにある。蛋白
質に水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコールを連
成させることの利点は、充分に示されており、そしてこ
れらの利点には下記のものが含まれる。未変性の蛋白質
が生理学的ｐＨで不溶であるか或は部分的にのみ可溶な
場合、この生理学的ｐＨで該連成蛋白質が示す溶解性は
未変性蛋白質の溶解性よりも高いこと、未変性蛋白質が
示す免疫応答を低下させること、薬学的速度プロファイ
ルが上昇すること、半減期が上昇すること、そして生物
学的半減期が上昇すること。数多くの蛋白質がＰＥＧで
修飾されてきた。〔論評に関しては、Inada, Y.、 Yoshi
moto, T.、 Matsushima, A.およびSaito, Y. (1986) Tre
nds Biotechnol. 4:68-73参照のこと〕。以下に挙げる
ように、この分野に関する数多くの特許出願も、発行さ
れるか、或は公開されてきた：米国特許番号4,179,337;
米国特許番号4,609,546; 米国特許番号4,261,973; 米
国特許番号4,055,635; 米国特許番号3,960,830; 米国特
許番号4,415,665; 米国特許番号4,412,989; 米国特許番
号4,002,531; 米国特許番号4,414,147; 米国特許番号3,
788,948; 米国特許番号4,732,863; 米国特許番号4,745,
180; EP番号152,847；1984年1月11日発行のEP番号98,11
0；JP番号5,792,435。上記特許および特許公開もまた、
他の水溶性ポリマー蛋白質改質剤の使用を開示してお
り、そしてこれらには、これに限定されるものではない
が、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキシ
エチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ヘパリン、ヘパリンフ
ラグメント、デキストラン、ポリサッカライド類、プロ
リンを含むポリアミノ酸、ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）、および他の水溶性有機ポリマー類が含まれる。水
溶性ポリマー類にポリペプチド類を連結させること、そ
してこれらのポリペプチド類を修飾する度合、に関して
いくつかの制限が存在している。異なる水溶性ポリマー
試薬は、興味の持たれているポリペプチド類中のアミノ
酸残基に連成させるための官能基に対して変化する。こ
れ以後用いる言葉「水溶性ポリマー試薬」は、水溶性ポ
リマーをポリペプチドに連結させるための官能基を持た
せるように修飾した水溶性ポリマー類を表す。特定の官
能基は、水溶性ポリマーが特定のアミノ酸残基に連成し
得るようにする。公知の水溶性ポリマー試薬を用いたの
では修飾を受けないアミノ酸残基に連成し得る水溶性ポ
リマー試薬を提供することは、興味の持たれるものであ
る。以前には連成させることができなかったアミノ酸残
基に連成し得る水溶性ポリマー試薬を提供することによ
り、他のアミノ酸残基の連成では悪影響を受ける蛋白質
の生物学的活性に本質的な悪影響を与えることなく、水
溶性ポリマー類を蛋白質に連成させることが可能にな
る。水溶性ポリマー類を連成させることによるポリペプ
チド類の修飾に対するもう１つの制限は、連成反応によ
って引き起こされる電荷の変化である。アミノ酸残基に
関して、電荷を有していない残基に電荷を導入するか、
或はその逆によって電荷を変化させると、いくつかの機
構によって、蛋白質の生物学的活性が悪影響を受ける可
能性があるが、これらの機構には、三次構造の崩壊およ
び活性部位の破壊が含まれる。上記電荷の変化は累加的
であるため、電荷を変化させる連成反応は、該ポリペプ
チドの機能を本質的に悪化させることのない可能な誘導
化の度合を制限し得る、ことも明らかである。従って、
残基上に存在している電荷を変化させることなくアミノ
酸残基に連成し得る水溶性ポリマー試薬を提供すること
も、興味の持たれるものである。
エチレングリコール（ＰＥＧ）の如き水溶性有機ポリマ
ーに連結させることによって化学的に修飾され得る。上
記蛋白質接合体の製造は、該水溶性ポリマー類を取り付
けることで所望の特性をポリペプチド類に与えることが
可能なため、興味の持たれるものである。これらの所望
特性には、水溶液中の上昇した溶解性、貯蔵中の増大し
た安定性、減少した免疫原性、酵素分解に対する上昇し
た耐性、幅広い種類の薬物投与系との適合性、および上
昇したインビボ半減期が含まれる。ＰＥＧもしくは他の
水溶液ポリマー類を用いたポリペプチド類の誘導化によ
ってもたらされる上記特性は、このポリペプチドを体に
注入する治療剤として用いる時、或はこのポリペプチド
を、興味の持たれている化合物の検出および／または定
量アッセイ、通常免疫アッセイで用いる時、特に興味が
持たれている。蛋白質に対する、レポーター基、リガン
ドなどの付着は、通常、リジン残基側鎖上の第一級アミ
ノ基を通して進行する。リジン残基に特異的に連成する
いくつかのＰＥＧ誘導体が合成された。典型的には、Ｐ
ＥＧのヒドロキシル末端基を、興味の持たれている蛋白
質にＰＥＧを共有結合的に付着させることの可能な反応
性官能基に変換する。これらのＰＥＧ誘導体には、２
（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４，６−ジク
ロロトリアジン〔Abuchowski, A.、 Van Es, T.、 Palczu
k, N.C.およびDavis, F.F. (1977) J. Biol. Chem. 25
2、 3578-3581〕；２−（アルコキシポリエチレングリコ
キシ）−Ｓ−カルボキサミドメチルジチオカーボネート
〔King, T.P.およびWeiner, C. (1980) Int. J. Peptid
e Protein Res. 16、 147-155〕；２−（アルコキシポリ
エチレングリコキシ）−Ｎ−スクシニミジルスクシネー
ト〔Abuchowski, A.、 Kazo, G.M.、 Verhoest, C.、 Van
Es, T.、 Kafkewitz, D.、 Viau, A.およびDavis, F. (19
84) Cancer Biochem. Biophys.7、 175-186〕；２−（ア
ルコキシポリエチレングリコキシカルボキシイミダゾー
ル〔Beauchamp, C.O.、 Gonias, S.L.、 Menapace, D.P.
およびPizzo, S.V. (1983) Anal. Biochem. 131、 25-3
3〕；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−
２，４，５−トリクロロベンゼン〔Versonese, F.M.、 L
argajolli, R.、 Boccu, E.、 Benassi, C.A.およびSchia
von, O. (1985) Applied Biochem. Biotech11、 141-15
2〕；２−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４
−ニトロベンゼン〔Versonese, F.M.、 Largajolli, R.、
Boccu, E.、 Benassi, C.A.およびSchiavon, O. (1985)
Applied Biochem. Biotech 11、 141-152〕；２−（ア
ルコキシポリエチレングリコキシ）−２，２，２−トリ
フルオロエタン〔Delgado, C.、Patel, J.N.、 Francis,
G.E.およびFisher, D. (1990) Biotech. Applied Bioch
em. 12、 119-128〕；２−（アルコキシポリエチレンア
ルデヒド〔Andrews, B.A.、 Head, D.M.、 Dunthrone, P.
およびAsenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech. 4、49-5
4〕；２−アルコキシポリエチレングリコキシメチルエ
ポキシド〔Andrews,B.A.、 Head, D.M.、 Dunthrone, P.
およびAsenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech.4、 49-54〕
が含まれる。蛋白質の修飾でしばしばアルキルのイミデ
ート類が用いられてきた。〔論評に関しては、Hunter,
M.J.およびLudwig, M.L. (1972) Methods Enzymol. 25、
585-596参照のこと〕。アルキルイミデート類は、特異
的に、アルファおよびイプシロンアミノ基と反応して、
親アミン類よりも強い塩基であるアミジン類を生じる。
この元の蛋白質アミノ基が有する正電荷は保持される
が、この正電荷は数原子だけシフトする。種々の官能基
（フェニル、フェノール系、スルフヒドリル、蛍光、疎
水性、放射標識、スピン標識、光親和性標識など）をイ
ミドエステル類に取り付けることが可能であり、そして
このようにして、これらを蛋白質の中に導入することが
可能である。活性エステル連成もしくは活性カルバメー
ト連成よりもイミドエステルが有利であることは、修飾
すべきリジン基の正電荷が保持されることにある。蛋白
質に水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコールを連
成させることの利点は、充分に示されており、そしてこ
れらの利点には下記のものが含まれる。未変性の蛋白質
が生理学的ｐＨで不溶であるか或は部分的にのみ可溶な
場合、この生理学的ｐＨで該連成蛋白質が示す溶解性は
未変性蛋白質の溶解性よりも高いこと、未変性蛋白質が
示す免疫応答を低下させること、薬学的速度プロファイ
ルが上昇すること、半減期が上昇すること、そして生物
学的半減期が上昇すること。数多くの蛋白質がＰＥＧで
修飾されてきた。〔論評に関しては、Inada, Y.、 Yoshi
moto, T.、 Matsushima, A.およびSaito, Y. (1986) Tre
nds Biotechnol. 4:68-73参照のこと〕。以下に挙げる
ように、この分野に関する数多くの特許出願も、発行さ
れるか、或は公開されてきた：米国特許番号4,179,337;
米国特許番号4,609,546; 米国特許番号4,261,973; 米
国特許番号4,055,635; 米国特許番号3,960,830; 米国特
許番号4,415,665; 米国特許番号4,412,989; 米国特許番
号4,002,531; 米国特許番号4,414,147; 米国特許番号3,
788,948; 米国特許番号4,732,863; 米国特許番号4,745,
180; EP番号152,847；1984年1月11日発行のEP番号98,11
0；JP番号5,792,435。上記特許および特許公開もまた、
他の水溶性ポリマー蛋白質改質剤の使用を開示してお
り、そしてこれらには、これに限定されるものではない
が、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキシ
エチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ヘパリン、ヘパリンフ
ラグメント、デキストラン、ポリサッカライド類、プロ
リンを含むポリアミノ酸、ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）、および他の水溶性有機ポリマー類が含まれる。水
溶性ポリマー類にポリペプチド類を連結させること、そ
してこれらのポリペプチド類を修飾する度合、に関して
いくつかの制限が存在している。異なる水溶性ポリマー
試薬は、興味の持たれているポリペプチド類中のアミノ
酸残基に連成させるための官能基に対して変化する。こ
れ以後用いる言葉「水溶性ポリマー試薬」は、水溶性ポ
リマーをポリペプチドに連結させるための官能基を持た
せるように修飾した水溶性ポリマー類を表す。特定の官
能基は、水溶性ポリマーが特定のアミノ酸残基に連成し
得るようにする。公知の水溶性ポリマー試薬を用いたの
では修飾を受けないアミノ酸残基に連成し得る水溶性ポ
リマー試薬を提供することは、興味の持たれるものであ
る。以前には連成させることができなかったアミノ酸残
基に連成し得る水溶性ポリマー試薬を提供することによ
り、他のアミノ酸残基の連成では悪影響を受ける蛋白質
の生物学的活性に本質的な悪影響を与えることなく、水
溶性ポリマー類を蛋白質に連成させることが可能にな
る。水溶性ポリマー類を連成させることによるポリペプ
チド類の修飾に対するもう１つの制限は、連成反応によ
って引き起こされる電荷の変化である。アミノ酸残基に
関して、電荷を有していない残基に電荷を導入するか、
或はその逆によって電荷を変化させると、いくつかの機
構によって、蛋白質の生物学的活性が悪影響を受ける可
能性があるが、これらの機構には、三次構造の崩壊およ
び活性部位の破壊が含まれる。上記電荷の変化は累加的
であるため、電荷を変化させる連成反応は、該ポリペプ
チドの機能を本質的に悪化させることのない可能な誘導
化の度合を制限し得る、ことも明らかである。従って、
残基上に存在している電荷を変化させることなくアミノ
酸残基に連成し得る水溶性ポリマー試薬を提供すること
も、興味の持たれるものである。
【発明の要約】本発明は、ＰＥＧのイミデート誘導体
か、或は構造的に関連した水溶性有機ポリマー類のイミ
デート誘導体を用いて、遊離アミノ基（類）を有する蛋
白質、ペプチド類および有機化合物を修飾するための方
法および化合物を提供するものである。ＰＥＧの新規イ
ミデート誘導体および他の水溶性ポリマー類を提供す
る。個々のポリペプチド類または同様な有機分子に、１
個以上の水溶性ポリマーイミデートエステル類を連成さ
せることができる。本主題発明の別の観点は、該イミデ
ート水溶性ポリマー誘導体を共有結合的に付着させるこ
とによって修飾した蛋白質を提供することにある。イミ
デート水溶性ポリマー誘導体の利点は、蛋白質のアミノ
基と反応した時、この得られる蛋白質誘導体が正電荷を
保持していることである。イミデート連成はまた、該水
溶性ポリマーバックボーンから正電荷を取り除き、これ
によって、この正電荷が、レセプタ、標的蛋白質もしく
はリガンドとの結合部に近付き易くなる。従って、水溶
性ポリマーイミデート誘導体による蛋白質の修飾によ
り、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル類、シアヌー
ル酸クロライドおよび活性カルバメート類の如き連成剤
を用いた、通常に使用されているＰＥＧ改質剤で見られ
るような、正電荷の損失が回避され得る。本主題発明の
水溶性ポリマー試薬には、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類、のイミデート類が含まれ、ここで、上記
ホモポリマー類およびコポリマー類の、１つの末端は、
未置換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化
ポリオール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライ
ド類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポ
リ〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミ
ド〕、並びに他の水溶性有機ポリマー類で置換されてい
る。本主題の水溶性ポリマーイミデート類を用いた水溶
性ポリマー誘導化で興味の持たれているポリペプチド類
には、ホルモン類、リンフォカイン類、サイトカイン
類、成長因子、酵素、ワクチン抗原、および抗体が含ま
れる。エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、特にヒトエリト
ロポイエチンの水溶性ポリマー誘導体が特に興味の持た
れるものである。本発明の別の観点は、水溶性ポリマー
のトレシル（tresyl）およびスクシニミドエステル類を
用いて誘導したＥＰＯである。
か、或は構造的に関連した水溶性有機ポリマー類のイミ
デート誘導体を用いて、遊離アミノ基（類）を有する蛋
白質、ペプチド類および有機化合物を修飾するための方
法および化合物を提供するものである。ＰＥＧの新規イ
ミデート誘導体および他の水溶性ポリマー類を提供す
る。個々のポリペプチド類または同様な有機分子に、１
個以上の水溶性ポリマーイミデートエステル類を連成さ
せることができる。本主題発明の別の観点は、該イミデ
ート水溶性ポリマー誘導体を共有結合的に付着させるこ
とによって修飾した蛋白質を提供することにある。イミ
デート水溶性ポリマー誘導体の利点は、蛋白質のアミノ
基と反応した時、この得られる蛋白質誘導体が正電荷を
保持していることである。イミデート連成はまた、該水
溶性ポリマーバックボーンから正電荷を取り除き、これ
によって、この正電荷が、レセプタ、標的蛋白質もしく
はリガンドとの結合部に近付き易くなる。従って、水溶
性ポリマーイミデート誘導体による蛋白質の修飾によ
り、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル類、シアヌー
ル酸クロライドおよび活性カルバメート類の如き連成剤
を用いた、通常に使用されているＰＥＧ改質剤で見られ
るような、正電荷の損失が回避され得る。本主題発明の
水溶性ポリマー試薬には、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類、のイミデート類が含まれ、ここで、上記
ホモポリマー類およびコポリマー類の、１つの末端は、
未置換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化
ポリオール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライ
ド類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポ
リ〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミ
ド〕、並びに他の水溶性有機ポリマー類で置換されてい
る。本主題の水溶性ポリマーイミデート類を用いた水溶
性ポリマー誘導化で興味の持たれているポリペプチド類
には、ホルモン類、リンフォカイン類、サイトカイン
類、成長因子、酵素、ワクチン抗原、および抗体が含ま
れる。エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、特にヒトエリト
ロポイエチンの水溶性ポリマー誘導体が特に興味の持た
れるものである。本発明の別の観点は、水溶性ポリマー
のトレシル（tresyl）およびスクシニミドエステル類を
用いて誘導したＥＰＯである。
【好適な具体例の説明】本主題発明は、水溶性ポリマー
類、例えばＰＥＧ、即ちポリエチレングリコールなどの
イミデート誘導体である新規ポリペプチド改質剤を提供
するものである。本主題発明の分子は、興味の持たれて
いるポリペプチドに種々の水溶性ポリマー類を共有結合
的に付着させるために用いられ得る。本主題発明の別の
観点は、該試薬分子、即ち主題の水溶性ポリマーイミデ
ート類によって１種以上の水溶性ポリペプチド類に共有
結合し得るように修飾された、ポリペプチド類を提供す
ることにある。一般に、水溶性ポリマー類をポリペプチ
ド類に連成させるに有効な化合物の式は下記の如くであ
る： （Ｉ）
類、例えばＰＥＧ、即ちポリエチレングリコールなどの
イミデート誘導体である新規ポリペプチド改質剤を提供
するものである。本主題発明の分子は、興味の持たれて
いるポリペプチドに種々の水溶性ポリマー類を共有結合
的に付着させるために用いられ得る。本主題発明の別の
観点は、該試薬分子、即ち主題の水溶性ポリマーイミデ
ート類によって１種以上の水溶性ポリペプチド類に共有
結合し得るように修飾された、ポリペプチド類を提供す
ることにある。一般に、水溶性ポリマー類をポリペプチ
ド類に連成させるに有効な化合物の式は下記の如くであ
る： （Ｉ）
【化６】 および（ＩＩ）
【化７】 Ｐは、水溶性有機ポリマーを表す。興味の持たれる水溶
性有機ポリマー類は、ポリマーバックボーンに付いてい
るヒドロキシ基を有しており、そしてこれらは公知の水
溶性ポリマー類から選択され、これらには、これに限定
されるものではないが、（ａ）デキストラン、並びに硫
酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋させたデキストリン、
およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストラ
ン誘導体、（ｂ）セルロース、並びにメチルセルロース
およびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース誘
導体、（ｃ）澱粉およびデキストリン類、並びに澱粉の
誘導体および加水分解物、（ｄ）ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー類、ポリプロピレングリコール
のホモポリマー類、エチレングリコールとプロピレング
リコールとのコポリマー類〔ここで、上記ホモポリマー
類およびコポリマー類の、１つの末端は、アルキル基で
置換されているか或は未置換である〕を含むポリアルキ
レングリコールおよびそれらの誘導体、（ｅ）ヘパリン
およびヘパリンのフラグメント、（ｆ）ポリビニルアル
コールおよびポリビニルエチルエーテル類、（ｇ）ポリ
ビニルピロリドン、（ｈ）α，β−ポリ〔（２−ヒドロ
キシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド、および（ｉ）ポ
リオキシエチル化ポリオール類が含まれる。好適には、
この水溶性ポリマーＰは、デキストランおよびデキスト
ラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体、
ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体から選択
される。最も好適には、この水溶性ポリマーＰは、ポリ
エチレングリコールおよびそれらの誘導体から選択さ
れ、そしてポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ルが特に好適である（蛋白質間の架橋を回避する目的
で）。本主題発明の水溶性ポリマー試薬で修飾したポリ
ペプチド類を薬剤として用いる場合、ポリマーＰは無毒
であるべきである。式ＩＩにおいて、ｍは約１〜２０の
範囲であり、１〜１０の範囲が特に好適である。式Ｉを
有する分子に加えて、本主題発明はまた、式ＩおよびＩ
Ｉを有する分子との反応で修飾されたポリペプチド類を
包含している。式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリマ
ー試薬で修飾したポリペプチド類は、それぞれ、式（Ｉ
ＩＩ）および（ＩＶ）（ＩＩＩ）
性有機ポリマー類は、ポリマーバックボーンに付いてい
るヒドロキシ基を有しており、そしてこれらは公知の水
溶性ポリマー類から選択され、これらには、これに限定
されるものではないが、（ａ）デキストラン、並びに硫
酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋させたデキストリン、
およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストラ
ン誘導体、（ｂ）セルロース、並びにメチルセルロース
およびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース誘
導体、（ｃ）澱粉およびデキストリン類、並びに澱粉の
誘導体および加水分解物、（ｄ）ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー類、ポリプロピレングリコール
のホモポリマー類、エチレングリコールとプロピレング
リコールとのコポリマー類〔ここで、上記ホモポリマー
類およびコポリマー類の、１つの末端は、アルキル基で
置換されているか或は未置換である〕を含むポリアルキ
レングリコールおよびそれらの誘導体、（ｅ）ヘパリン
およびヘパリンのフラグメント、（ｆ）ポリビニルアル
コールおよびポリビニルエチルエーテル類、（ｇ）ポリ
ビニルピロリドン、（ｈ）α，β−ポリ〔（２−ヒドロ
キシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド、および（ｉ）ポ
リオキシエチル化ポリオール類が含まれる。好適には、
この水溶性ポリマーＰは、デキストランおよびデキスト
ラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体、
ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体から選択
される。最も好適には、この水溶性ポリマーＰは、ポリ
エチレングリコールおよびそれらの誘導体から選択さ
れ、そしてポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ルが特に好適である（蛋白質間の架橋を回避する目的
で）。本主題発明の水溶性ポリマー試薬で修飾したポリ
ペプチド類を薬剤として用いる場合、ポリマーＰは無毒
であるべきである。式ＩＩにおいて、ｍは約１〜２０の
範囲であり、１〜１０の範囲が特に好適である。式Ｉを
有する分子に加えて、本主題発明はまた、式ＩおよびＩ
Ｉを有する分子との反応で修飾されたポリペプチド類を
包含している。式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリマ
ー試薬で修飾したポリペプチド類は、それぞれ、式（Ｉ
ＩＩ）および（ＩＶ）（ＩＩＩ）
【化８】 および（ＩＶ）
【化９】 〔式中、Ｐは、上述した如き水溶性ポリマーである〕で
表すことができる。Ｚは、上述した如きポリペプチドを
表し、そしてこれは、少なくとも１個の第一級アミン含
有残基を含んでおり、そしてｎは、１〜ｘの範囲の数を
表し、ここで、ｘは、ポリペプチドＺ中に存在している
リジン残基の数よりも１大きい。式ＩＶにおいて、ｍは
約１〜２０の範囲であり、１〜１０の範囲が特に好適で
ある。リジン残基のイプシロンアミノ基および／または
ポリペプチド上の末端アミノ基に、水溶性ポリマーＰ
を、連成部位で共有結合的に連結させる。ポリペプチド
分子１個当たりｘ個に及ぶ水溶性ポリマー類を連成させ
ることによってポリペプチド類を修飾してもよいが、通
常、与えられたポリペプチドをｘ個未満の水溶性ポリマ
ー分子で改質することが望ましい。最大数の水溶性ポリ
マー類、即ちｘ個の分子でポリペプチドの誘導化を行う
のは望ましくない、と言うのは、ポリペプチド１分子当
たりの水溶性ポリマー類の数を増大させると、その未修
飾ポリペプチドが有する生物学的活性が低下する可能性
があるからである。本主題発明の重要な利点は、ポリペ
プチドの生物学的活性が本質的に低下しないか、或はこ
の生物学的活性の低下度合を、本主題発明のイミドエス
テル以外の化合物を用い同じ水溶性ポリマーをリジン残
基に付着させることによる生物学的活性低下度合よりも
低く抑えながら、ポリペプチド類を修飾することが可能
な点である。この言葉「生物学的活性」には、酵素活
性、レセプタ（抗体を含む）への結合能力、リガンドに
結合する能力、免疫応答を誘発する能力などが含まれ
る。この言葉「抗体」は、天然の免疫グロブリン配列を
有するポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗
体、合成抗体誘導体などを包含することを意図したもの
であり、そして、種々の標識、蛍光、放射能、酵素、ビ
オチン／アビジンなどのいずれかに結合させるように抗
体を修飾してもよい。合成抗体誘導体には、天然の免疫
グロブリン配列であるが、変異を受けさせた後、変化し
た結合特異性に関して選択したもの、種々の免疫グロブ
リン遺伝子由来ポリペプチド類、遺伝的に修飾した細菌
が産生する典型的な一本鎖、修飾された一定領域を含む
ように修飾された抗体などが含まれ、そして抗体形成の
原理を基とした上記合成抗体誘導体に関する論評が、Wi
nterおよびMilstein、 Nature、 349: 293-299 (1991)に
示されている。本主題発明の利点は、式（Ｉ）および
（ＩＩ）の化合物で修飾したポリペプチド類が、他のエ
ステル類を用いて水溶性ポリマー類をポリペプチド類に
結合させることによって同じポリペプチドを同じ度合に
まで修飾した時よりも高い度合で、それらの生物学的活
性を維持し得る点である。このような利点は、該イミド
エステル類で修飾したリジン残基上に正電荷が保持され
ていると共に、該可溶ポリマーバックボーンから正電荷
が取り除かれたことの結果である。従って、本主題発明
は、この修飾に関連した生物学的活性損失を最小限にし
ながら、水溶性ポリマー類を連結させることに伴う利点
を有する改質ポリペプチド類を提供することである。そ
の結果として、水溶性ポリマー類を用いて低い度合の誘
導化を行ったポリペプチド類と同じレベルの生物学的活
性を有していると共に、水溶性ポリマー類を用いた高度
の誘導化を行うことで、このより高い度合の誘導化に関
連した利点を有している、ポリペプチド類を作り出すこ
とが可能になる。水溶性ポリマー類を蛋白質に連成させ
るための他の方法、例えば活性を示すカルバメート類の
使用に比べた時の、本主題発明が有する追加的利点は、
上記活性エステル類は、第一級アミン類以外の求核物
質、例えば蛋白質上のヒドロキシル基、フェノール系
基、およびスルフヒドリル基などと反応することにあ
る。本主題発明で、選択的に該イミデート類がリジン残
基の第一級アミノ基と反応する点で、上記交差反応性に
関する問題を回避することが可能である。該ポリマーＰ
は、種々の量の、多数の同一単位を含んでいるため、Ｐ
の分子量がかなり変化し得ることは理解されるであろ
う。更に、Ｐが一定の分子量を有すると述べられている
場合、この分子量はおおよそであり、そしてこれは、こ
の分子中に存在しているサブユニットの数に関して互い
に異なる分子Ｐの集団が有する平均分子量を反映してい
る。一般に、Ｐの分子量は約２００〜２００，０００で
あり、好適には７００〜３０，０００の範囲である。Ｐ
に関する適切な分子量は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の分
子をポリペプチドに連成させる場合、改質すべき特定の
蛋白質に従って変化する。本主題発明の水溶性ポリマー
試薬を用いて、ＮＨ2末端アミノ酸上に、そしてポリペ
プチド内のリジン残基が有するイプシロンアミン上に、
第一級アミンを含んでいる種々のポリペプチド類もしく
は同様な分子を修飾することができる。興味の持たれる
ポリペプチド類には、モノクローナルおよびポリクロー
ナル抗体；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカイ
ン類；リンフォカイン類、ＩＬ−２、ＩＬ−３、成長因
子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦを含む）；ｈＧＨ、エリトロポイ
エチンを含むペプチドホルモン類；ファクターＶＩＩＩ
を含む血液凝固因子；免疫原；酵素；酵素阻害因子；リ
ガンドなどが含まれる。興味の持たれるポリペプチド類
は、それらの天然源または遺伝工学細胞から単離される
か、或は種々のインビトロ合成方法で作り出されてもよ
い。本主題発明の水溶性ポリマー試薬を用いて大部分の
ポリペプチドを修飾することが可能であるが、（１）薬
剤として用いるためのポリペプチド類、および（２）ア
ッセイで用いるためのポリペプチド類、を修飾すること
が特に興味の持たれるものである。アッセイで用いるた
めのポリペプチドには、特異的に結合する蛋白質、特異
的に結合する蛋白質によって認識されるポリペプチド
類、並びに酵素が含まれる。特異的に結合する蛋白質
は、抗体、ホルモンレセプタ、レクチン類などを意図し
ている。式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物に関する異な
る具体例との反応によって、１種以上の異なる水溶性ポ
リマーを用いた個々のポリペプチド分子の誘導化を行っ
てもよい。ｎ個以下の水溶性ポリマー〔ここで、ｎは、
ポリペプチド上の遊離第一級アミンの数であり、そして
この第一級アミンは、リジンおよびアミノ末端からのも
のである〕で個々のポリペプチド類を修飾してもよい。
ここに記述する巨大分子のいずれか、例えばポリペプチ
ド類、水溶性ポリマー類およびそれらの誘導体、の塩類
は、種々のｐＨの水溶液中に上記分子が存在している
（またはそれから単離される）時、自然と存在してい
る。ペプチド類および指示した生物学的活性を示す他の
巨大分子全ての塩類は、本発明の範囲内に入ると考えら
れる。その例には、カルボン酸残基のアルカリ、アルカ
リ土類および他の金属の塩類、アミノ残基の酸（例えば
ＨＣｌ）付加塩、並びに同一分子内のカルボン酸とアミ
ノ残基との反応によって生じる両性イオンが含まれる。
キットの形態で式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリマ
ー試薬を供給し、その結果として、興味の持たれている
ポリペプチド類の便利で再現性を示す誘導化を提供す
る、こともまた興味の持たれるものである。興味の持た
れるキットには、式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリ
マー試薬、緩衝液、反応指示化合物、説明書、例えばBr
adfordアッセイなどのための蛋白質濃度測定試薬、が入
っている溶液が備わっていてもよい。好適には、予め測
定した量で試薬溶液を供給する。
表すことができる。Ｚは、上述した如きポリペプチドを
表し、そしてこれは、少なくとも１個の第一級アミン含
有残基を含んでおり、そしてｎは、１〜ｘの範囲の数を
表し、ここで、ｘは、ポリペプチドＺ中に存在している
リジン残基の数よりも１大きい。式ＩＶにおいて、ｍは
約１〜２０の範囲であり、１〜１０の範囲が特に好適で
ある。リジン残基のイプシロンアミノ基および／または
ポリペプチド上の末端アミノ基に、水溶性ポリマーＰ
を、連成部位で共有結合的に連結させる。ポリペプチド
分子１個当たりｘ個に及ぶ水溶性ポリマー類を連成させ
ることによってポリペプチド類を修飾してもよいが、通
常、与えられたポリペプチドをｘ個未満の水溶性ポリマ
ー分子で改質することが望ましい。最大数の水溶性ポリ
マー類、即ちｘ個の分子でポリペプチドの誘導化を行う
のは望ましくない、と言うのは、ポリペプチド１分子当
たりの水溶性ポリマー類の数を増大させると、その未修
飾ポリペプチドが有する生物学的活性が低下する可能性
があるからである。本主題発明の重要な利点は、ポリペ
プチドの生物学的活性が本質的に低下しないか、或はこ
の生物学的活性の低下度合を、本主題発明のイミドエス
テル以外の化合物を用い同じ水溶性ポリマーをリジン残
基に付着させることによる生物学的活性低下度合よりも
低く抑えながら、ポリペプチド類を修飾することが可能
な点である。この言葉「生物学的活性」には、酵素活
性、レセプタ（抗体を含む）への結合能力、リガンドに
結合する能力、免疫応答を誘発する能力などが含まれ
る。この言葉「抗体」は、天然の免疫グロブリン配列を
有するポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗
体、合成抗体誘導体などを包含することを意図したもの
であり、そして、種々の標識、蛍光、放射能、酵素、ビ
オチン／アビジンなどのいずれかに結合させるように抗
体を修飾してもよい。合成抗体誘導体には、天然の免疫
グロブリン配列であるが、変異を受けさせた後、変化し
た結合特異性に関して選択したもの、種々の免疫グロブ
リン遺伝子由来ポリペプチド類、遺伝的に修飾した細菌
が産生する典型的な一本鎖、修飾された一定領域を含む
ように修飾された抗体などが含まれ、そして抗体形成の
原理を基とした上記合成抗体誘導体に関する論評が、Wi
nterおよびMilstein、 Nature、 349: 293-299 (1991)に
示されている。本主題発明の利点は、式（Ｉ）および
（ＩＩ）の化合物で修飾したポリペプチド類が、他のエ
ステル類を用いて水溶性ポリマー類をポリペプチド類に
結合させることによって同じポリペプチドを同じ度合に
まで修飾した時よりも高い度合で、それらの生物学的活
性を維持し得る点である。このような利点は、該イミド
エステル類で修飾したリジン残基上に正電荷が保持され
ていると共に、該可溶ポリマーバックボーンから正電荷
が取り除かれたことの結果である。従って、本主題発明
は、この修飾に関連した生物学的活性損失を最小限にし
ながら、水溶性ポリマー類を連結させることに伴う利点
を有する改質ポリペプチド類を提供することである。そ
の結果として、水溶性ポリマー類を用いて低い度合の誘
導化を行ったポリペプチド類と同じレベルの生物学的活
性を有していると共に、水溶性ポリマー類を用いた高度
の誘導化を行うことで、このより高い度合の誘導化に関
連した利点を有している、ポリペプチド類を作り出すこ
とが可能になる。水溶性ポリマー類を蛋白質に連成させ
るための他の方法、例えば活性を示すカルバメート類の
使用に比べた時の、本主題発明が有する追加的利点は、
上記活性エステル類は、第一級アミン類以外の求核物
質、例えば蛋白質上のヒドロキシル基、フェノール系
基、およびスルフヒドリル基などと反応することにあ
る。本主題発明で、選択的に該イミデート類がリジン残
基の第一級アミノ基と反応する点で、上記交差反応性に
関する問題を回避することが可能である。該ポリマーＰ
は、種々の量の、多数の同一単位を含んでいるため、Ｐ
の分子量がかなり変化し得ることは理解されるであろ
う。更に、Ｐが一定の分子量を有すると述べられている
場合、この分子量はおおよそであり、そしてこれは、こ
の分子中に存在しているサブユニットの数に関して互い
に異なる分子Ｐの集団が有する平均分子量を反映してい
る。一般に、Ｐの分子量は約２００〜２００，０００で
あり、好適には７００〜３０，０００の範囲である。Ｐ
に関する適切な分子量は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の分
子をポリペプチドに連成させる場合、改質すべき特定の
蛋白質に従って変化する。本主題発明の水溶性ポリマー
試薬を用いて、ＮＨ2末端アミノ酸上に、そしてポリペ
プチド内のリジン残基が有するイプシロンアミン上に、
第一級アミンを含んでいる種々のポリペプチド類もしく
は同様な分子を修飾することができる。興味の持たれる
ポリペプチド類には、モノクローナルおよびポリクロー
ナル抗体；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカイ
ン類；リンフォカイン類、ＩＬ−２、ＩＬ−３、成長因
子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦを含む）；ｈＧＨ、エリトロポイ
エチンを含むペプチドホルモン類；ファクターＶＩＩＩ
を含む血液凝固因子；免疫原；酵素；酵素阻害因子；リ
ガンドなどが含まれる。興味の持たれるポリペプチド類
は、それらの天然源または遺伝工学細胞から単離される
か、或は種々のインビトロ合成方法で作り出されてもよ
い。本主題発明の水溶性ポリマー試薬を用いて大部分の
ポリペプチドを修飾することが可能であるが、（１）薬
剤として用いるためのポリペプチド類、および（２）ア
ッセイで用いるためのポリペプチド類、を修飾すること
が特に興味の持たれるものである。アッセイで用いるた
めのポリペプチドには、特異的に結合する蛋白質、特異
的に結合する蛋白質によって認識されるポリペプチド
類、並びに酵素が含まれる。特異的に結合する蛋白質
は、抗体、ホルモンレセプタ、レクチン類などを意図し
ている。式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物に関する異な
る具体例との反応によって、１種以上の異なる水溶性ポ
リマーを用いた個々のポリペプチド分子の誘導化を行っ
てもよい。ｎ個以下の水溶性ポリマー〔ここで、ｎは、
ポリペプチド上の遊離第一級アミンの数であり、そして
この第一級アミンは、リジンおよびアミノ末端からのも
のである〕で個々のポリペプチド類を修飾してもよい。
ここに記述する巨大分子のいずれか、例えばポリペプチ
ド類、水溶性ポリマー類およびそれらの誘導体、の塩類
は、種々のｐＨの水溶液中に上記分子が存在している
（またはそれから単離される）時、自然と存在してい
る。ペプチド類および指示した生物学的活性を示す他の
巨大分子全ての塩類は、本発明の範囲内に入ると考えら
れる。その例には、カルボン酸残基のアルカリ、アルカ
リ土類および他の金属の塩類、アミノ残基の酸（例えば
ＨＣｌ）付加塩、並びに同一分子内のカルボン酸とアミ
ノ残基との反応によって生じる両性イオンが含まれる。
キットの形態で式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリマ
ー試薬を供給し、その結果として、興味の持たれている
ポリペプチド類の便利で再現性を示す誘導化を提供す
る、こともまた興味の持たれるものである。興味の持た
れるキットには、式（Ｉ）および（ＩＩ）の水溶性ポリ
マー試薬、緩衝液、反応指示化合物、説明書、例えばBr
adfordアッセイなどのための蛋白質濃度測定試薬、が入
っている溶液が備わっていてもよい。好適には、予め測
定した量で試薬溶液を供給する。
【水溶性ポリマーイミデート類の合成】ＰＥＧ−イミデ
ート類の合成にはいくつかの方法が存在している。ＰＥ
Ｇイミデート類の合成で用いられている方法を同様に、
他の水溶性ポリマーイミデート類の合成で用いることが
できる。式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物を合成するた
めの好適な方法は、ＰＥＧアルコールを、適当な求核剤
と反応し得る活性化アルコールに変換して、ＰＥＧ−ニ
トリルを生じさせることを伴うものである。このＰＥＧ
−ニトリルを次にＰＥＧ−イミデートに変換する。活性
化されたＰＥＧ−アルコール類には、塩化物、臭化物、
トレシル、トシルなどが含まれる。この活性化ＰＥＧ−
アルコールの合成に関する参考例には、Furukawa, S.、
Katayama, N.、 Iizuka, T.、 Urabe, I.およびOkada, H.
(1980) FEBS Lett.: 121、 239-242; Mutter, M. (197
8) Tetrahedron Lett. 2839-2842; Harris, J.M.、 Yalp
ani, M.、 Van Alstine, J.M.、 Struck, E.C.、 Case, M.
G.、 Paley, M.S.およびBrooks, D.E. (1984) J. Polym.
Sci. Polym. Chem. Ed. 22、 341-352; Zalipsky, S.、
Gilon, C.およびZilkha, A.(1983) Eur. Polym. J. 19:
1177-1183; Buckmann, A.F.、 Kula, M.R.、 Wichmann,
R.およびWandrey, C. (1981) J. Appl. Biochem. 3: 30
1-315; Buckmann, A.F.、 Morr, M.およびJohansson, G.
(1981) Makromol. Chem. 82: 1379-1384が含まれる。
ート類の合成にはいくつかの方法が存在している。ＰＥ
Ｇイミデート類の合成で用いられている方法を同様に、
他の水溶性ポリマーイミデート類の合成で用いることが
できる。式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物を合成するた
めの好適な方法は、ＰＥＧアルコールを、適当な求核剤
と反応し得る活性化アルコールに変換して、ＰＥＧ−ニ
トリルを生じさせることを伴うものである。このＰＥＧ
−ニトリルを次にＰＥＧ−イミデートに変換する。活性
化されたＰＥＧ−アルコール類には、塩化物、臭化物、
トレシル、トシルなどが含まれる。この活性化ＰＥＧ−
アルコールの合成に関する参考例には、Furukawa, S.、
Katayama, N.、 Iizuka, T.、 Urabe, I.およびOkada, H.
(1980) FEBS Lett.: 121、 239-242; Mutter, M. (197
8) Tetrahedron Lett. 2839-2842; Harris, J.M.、 Yalp
ani, M.、 Van Alstine, J.M.、 Struck, E.C.、 Case, M.
G.、 Paley, M.S.およびBrooks, D.E. (1984) J. Polym.
Sci. Polym. Chem. Ed. 22、 341-352; Zalipsky, S.、
Gilon, C.およびZilkha, A.(1983) Eur. Polym. J. 19:
1177-1183; Buckmann, A.F.、 Kula, M.R.、 Wichmann,
R.およびWandrey, C. (1981) J. Appl. Biochem. 3: 30
1-315; Buckmann, A.F.、 Morr, M.およびJohansson, G.
(1981) Makromol. Chem. 82: 1379-1384が含まれる。
【化１０】 式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物を用いてポリペプチド
類もしくは蛋白質を修飾する好適な方法は、第一級アミ
ンが入っておらずそして好適にはｐＨが９〜９．５の塩
基性緩衝液の中にポリペプチドもしくは蛋白質を入れる
ことを伴う。所望度合の修飾に応じて、式（Ｉ）および
（ＩＩ）の化合物を単一添加もしくは多数回添加として
加える。本発明を記述してきたが、本主題発明を説明す
る目的で以下の実施例を示し、制限するものではない。
類もしくは蛋白質を修飾する好適な方法は、第一級アミ
ンが入っておらずそして好適にはｐＨが９〜９．５の塩
基性緩衝液の中にポリペプチドもしくは蛋白質を入れる
ことを伴う。所望度合の修飾に応じて、式（Ｉ）および
（ＩＩ）の化合物を単一添加もしくは多数回添加として
加える。本発明を記述してきたが、本主題発明を説明す
る目的で以下の実施例を示し、制限するものではない。
Ｉ． ＰＥＧ−イミデート類の合成 乾燥ジクロロメタン０．５ｍＬにＰＥＧ−ＣＮもしくは
ＰＥＧ−ＮＨ−（ＣＨ 2）5−ＣＮ（０．５ｇ）を溶解し
た。−２０℃の氷浴の中に乾燥メタノール（５ｍＬ）を
入れた後、このメタノールに約２ｍＬのＨＣｌを導入し
て液化した。このＭｅＯＨ／ＨＣｌに上記ＰＥＧ−ＮＨ
−（ＣＨ2）5−ＣＮ溶液を加えた。この反応を−２０℃
で５時間進行させ、そしてその後、この反応混合物を冷
凍庫の中に一晩入れた。乾燥エーテルを添加すること
で、この反応混合物からＰＥＧ−イミデートを沈澱させ
た。この生成物のＩＲは、１６５０に特徴的なイミデー
ト帯を示していた。本出願中の実施例全てで用いる省略
形「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールのモノメチル
エーテルを表している。 ＩＩ． ＰＥＧ−ニトリルの合成 高真空オーブン中８５℃で約５時間ＰＥＧ−ＯＨを乾燥
した。冷却後、１５ｇのＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝５００
０）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。トリエチ
ルアミン（６．２０ｍＬ）に続いて１１．４ｇの４−ト
ルエンスルホニルクロライドを加えた。（二者択一的
に、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロラ
イドを用いることでトレシル−ＰＥＧを生じさせること
も可能である）。この混合物を一晩還流させた。エーテ
ルを用いて繰り返しジクロロメタンから沈澱させること
で、所望の生成物であるＰＥＧ−ＯＴｓが得られた。収
量１４ｇ。分析：Ｓに関する計算値０．６３、Ｓに関す
る測定値０．５８。１．３８ｇ（１３ミリモル）のＮａ
2ＣＯ3および０．５１ｇ（４．６ミリモル）の６−アミ
ノカプロニトリルと一緒にＰＥＧ−ＯＴｓ（５ｇ、１ミ
リモル）を乾燥テトラヒドロフラン６５ｍＬの中に入れ
た。この混合物を還流に３日間加熱した。この混合物を
冷却した後、濾過した。沈澱物をジクロロメタンに溶解
した後、濾過した。この濾液にエーテルを加えること
で、生成物を沈澱させた。この沈澱段階を繰り返した。
ＬＨ−２Ｏカラムを用いたゲル濾過を用い、ＭｅＯＨ／
Ｈ2Ｏで溶離させることにより、更に一層の精製を行っ
た。興味の持たれている材料であるＰＥＧ−ＮＨ−（Ｃ
Ｈ2）5−ＣＮを集め、「乾燥」ジクロロメタンの中に取
り上げた後、エーテルを添加することで沈澱させた。収
量４．０６ｇ。分析：Ｎに関する計算値０．５５、Ｎに
関する測定値０．４１。シアン化物に置き換えることで
ＰＥＧ−ＣｌからＰＥＧニトリルを製造することもでき
る。この場合、イミデートとＰＥＧとの間のリンカーは
存在していない。
ＰＥＧ−ＮＨ−（ＣＨ 2）5−ＣＮ（０．５ｇ）を溶解し
た。−２０℃の氷浴の中に乾燥メタノール（５ｍＬ）を
入れた後、このメタノールに約２ｍＬのＨＣｌを導入し
て液化した。このＭｅＯＨ／ＨＣｌに上記ＰＥＧ−ＮＨ
−（ＣＨ2）5−ＣＮ溶液を加えた。この反応を−２０℃
で５時間進行させ、そしてその後、この反応混合物を冷
凍庫の中に一晩入れた。乾燥エーテルを添加すること
で、この反応混合物からＰＥＧ−イミデートを沈澱させ
た。この生成物のＩＲは、１６５０に特徴的なイミデー
ト帯を示していた。本出願中の実施例全てで用いる省略
形「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールのモノメチル
エーテルを表している。 ＩＩ． ＰＥＧ−ニトリルの合成 高真空オーブン中８５℃で約５時間ＰＥＧ−ＯＨを乾燥
した。冷却後、１５ｇのＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝５００
０）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。トリエチ
ルアミン（６．２０ｍＬ）に続いて１１．４ｇの４−ト
ルエンスルホニルクロライドを加えた。（二者択一的
に、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロラ
イドを用いることでトレシル−ＰＥＧを生じさせること
も可能である）。この混合物を一晩還流させた。エーテ
ルを用いて繰り返しジクロロメタンから沈澱させること
で、所望の生成物であるＰＥＧ−ＯＴｓが得られた。収
量１４ｇ。分析：Ｓに関する計算値０．６３、Ｓに関す
る測定値０．５８。１．３８ｇ（１３ミリモル）のＮａ
2ＣＯ3および０．５１ｇ（４．６ミリモル）の６−アミ
ノカプロニトリルと一緒にＰＥＧ−ＯＴｓ（５ｇ、１ミ
リモル）を乾燥テトラヒドロフラン６５ｍＬの中に入れ
た。この混合物を還流に３日間加熱した。この混合物を
冷却した後、濾過した。沈澱物をジクロロメタンに溶解
した後、濾過した。この濾液にエーテルを加えること
で、生成物を沈澱させた。この沈澱段階を繰り返した。
ＬＨ−２Ｏカラムを用いたゲル濾過を用い、ＭｅＯＨ／
Ｈ2Ｏで溶離させることにより、更に一層の精製を行っ
た。興味の持たれている材料であるＰＥＧ−ＮＨ−（Ｃ
Ｈ2）5−ＣＮを集め、「乾燥」ジクロロメタンの中に取
り上げた後、エーテルを添加することで沈澱させた。収
量４．０６ｇ。分析：Ｎに関する計算値０．５５、Ｎに
関する測定値０．４１。シアン化物に置き換えることで
ＰＥＧ−ＣｌからＰＥＧニトリルを製造することもでき
る。この場合、イミデートとＰＥＧとの間のリンカーは
存在していない。
【化１１】 高真空オーブン中８５℃で約５時間ＰＥＧ−ＯＨを乾燥
した。冷却後、１０ｇ（５ミリモル）のＰＥＧ−ＯＨ
（ＭＷ＝２０００）を４０ｍＬの乾燥トルエンの中に入
れ、続いて０．７ｍＬ（５ミリモル）のトリエチルアミ
ンを加えた。塩化チオニル（１．１ｍＬ、５ミリモル）
を、１時間かけてゆっくりと加えた。この溶液を４時間
還流させ、その後、この溶液を室温で一晩撹拌した。こ
の溶液を加熱した後、濾過した。この濾液を濃縮乾固し
た。この残渣を水に溶解した後、活性炭素で処理した。
この炭素を濾別しそして濾液を濃縮した後、この残渣を
ジクロロメタン中に取り上げ、そしてエーテルで処理し
た。この沈澱物を集めた。収量８．３ｇ。ＬＨ−２Ｏを
用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用い、ＭｅＯＨ／
Ｈ2Ｏ（５：１）で溶離させることにより、更に一層の
精製を行った。この生成物のＩＲは、６６８に塩化物の
帯を示していた。分析：Ｃｌに関する計算値１．７６、
Ｃｌに関する測定値１．５５。１ｇ（０．５ミリモル）
のＰＥＧ−Ｃｌ（ＭＷ＝２０００）とＮａＣＮ（０．２
１ｇ、４．２ミリモル）を６．６ｍＬの乾燥ジメチルス
ルホキサイドに加えた。この混合物を１００℃で７０分
間加熱した。冷却した後、この溶液を濾過し、そして濾
液を濃縮した。この残渣を、ＬＨ−２Ｏカラムを用いた
ゲル濾過を用い、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（５：１）で溶離さ
せた。ＰＥＧ−ＣＮの収量０．８４ｇ。ＩＲは塩化物の
帯を示していなかった。分析：Ｎに関する計算値０．６
９、Ｎに関する測定値０．３５。 ＩＩＩ． ＯＫＴ３の標識化（イミデート方法） ＯＫＴ３は、ヒトＴ細胞抗原レセプタに関連した２０，
０００ダルトンの蛋白質と反応するＩｇＧ2aネズミモノ
クローナル抗体である。ｐＨが９．２の０．１Ｍホウ酸
塩緩衝液４ｍＬの中に４ｍｇのＯＫＴ３を入れた。この
反応体に添加するＰＥＧイミデート量を、所望の修飾度
に比例して変化させた。通常１５ｍｇ添加し、そして２
時間後、望まれるならば更に１５ｍｇのＰＥＧ−イミデ
ートを加えた。室温で４時間後、反応混合物を冷室中に
一晩置いた。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ
Ｃ）によるか、或は３０，０００ＭＷカットオフ膜を用
いた洗浄／濃縮を繰り返すことにより、未反応のＰＥＧ
からＰＥＧ−ＯＫＴ３を分離した。ZorbaxTM GF-450ま
たはZorbaxTM GF-250カラムを用いたＨＰＬＣゲル濾過
で、置換度を測定した。遊離アミノ基の測定では、Stoc
ks, S.J.、 Jones, A.J.M.、 Ramey, C.W.およびBrooks,
D.E. (1986) Anal. Biochem. 154: 232-234の蛍光分析
方法を用いた。 ＩＶ． ＯＫＴ３の標識化（Ｎ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステル方法） ＰＥＧ−イミデートの代わりにＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドを用いる以外は、ＰＥＧ−イミデートに関
して上述したのと同じ操作に従った。 Ｖ． 標識したＯＫＴ３の生物学的活性 ＯＫＴ３分子の生物学的活性に関して、ＰＥＧ−イミデ
ートで改質したものとＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドで改質したものとを比較した。ＯＫＴ３は有効な分
裂促進性を有している〔Van Wauwe, J.P.、 De Mey, J.
R.およびGoossens, J.G. (1980) J. Immunol. 124、 270
8-2713〕。生物学的活性に対するＰＥＧ修飾の効果を測
定し、そして生物学的活性に関して、ＰＥＧを該抗体に
連成させるための２つの異なる方法を比較する目的で、
分裂促進因子アッセイを行った。このアッセイは、ヒト
末梢Ｔリンパ球を単離した後、異なる濃度のＯＫＴ３お
よびＰＥＧ−ＯＫＴ３と一緒に４日間、上記細胞を２ｘ
１０6個細胞／ｍＬで培養することから成る。次に、こ
の細胞培養物に、トリチウム原子を含んでいるチミジン
を加える。一晩培養した後、これらの細胞を収穫し、そ
してその数を数える。
した。冷却後、１０ｇ（５ミリモル）のＰＥＧ−ＯＨ
（ＭＷ＝２０００）を４０ｍＬの乾燥トルエンの中に入
れ、続いて０．７ｍＬ（５ミリモル）のトリエチルアミ
ンを加えた。塩化チオニル（１．１ｍＬ、５ミリモル）
を、１時間かけてゆっくりと加えた。この溶液を４時間
還流させ、その後、この溶液を室温で一晩撹拌した。こ
の溶液を加熱した後、濾過した。この濾液を濃縮乾固し
た。この残渣を水に溶解した後、活性炭素で処理した。
この炭素を濾別しそして濾液を濃縮した後、この残渣を
ジクロロメタン中に取り上げ、そしてエーテルで処理し
た。この沈澱物を集めた。収量８．３ｇ。ＬＨ−２Ｏを
用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用い、ＭｅＯＨ／
Ｈ2Ｏ（５：１）で溶離させることにより、更に一層の
精製を行った。この生成物のＩＲは、６６８に塩化物の
帯を示していた。分析：Ｃｌに関する計算値１．７６、
Ｃｌに関する測定値１．５５。１ｇ（０．５ミリモル）
のＰＥＧ−Ｃｌ（ＭＷ＝２０００）とＮａＣＮ（０．２
１ｇ、４．２ミリモル）を６．６ｍＬの乾燥ジメチルス
ルホキサイドに加えた。この混合物を１００℃で７０分
間加熱した。冷却した後、この溶液を濾過し、そして濾
液を濃縮した。この残渣を、ＬＨ−２Ｏカラムを用いた
ゲル濾過を用い、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（５：１）で溶離さ
せた。ＰＥＧ−ＣＮの収量０．８４ｇ。ＩＲは塩化物の
帯を示していなかった。分析：Ｎに関する計算値０．６
９、Ｎに関する測定値０．３５。 ＩＩＩ． ＯＫＴ３の標識化（イミデート方法） ＯＫＴ３は、ヒトＴ細胞抗原レセプタに関連した２０，
０００ダルトンの蛋白質と反応するＩｇＧ2aネズミモノ
クローナル抗体である。ｐＨが９．２の０．１Ｍホウ酸
塩緩衝液４ｍＬの中に４ｍｇのＯＫＴ３を入れた。この
反応体に添加するＰＥＧイミデート量を、所望の修飾度
に比例して変化させた。通常１５ｍｇ添加し、そして２
時間後、望まれるならば更に１５ｍｇのＰＥＧ−イミデ
ートを加えた。室温で４時間後、反応混合物を冷室中に
一晩置いた。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ
Ｃ）によるか、或は３０，０００ＭＷカットオフ膜を用
いた洗浄／濃縮を繰り返すことにより、未反応のＰＥＧ
からＰＥＧ−ＯＫＴ３を分離した。ZorbaxTM GF-450ま
たはZorbaxTM GF-250カラムを用いたＨＰＬＣゲル濾過
で、置換度を測定した。遊離アミノ基の測定では、Stoc
ks, S.J.、 Jones, A.J.M.、 Ramey, C.W.およびBrooks,
D.E. (1986) Anal. Biochem. 154: 232-234の蛍光分析
方法を用いた。 ＩＶ． ＯＫＴ３の標識化（Ｎ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステル方法） ＰＥＧ−イミデートの代わりにＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドを用いる以外は、ＰＥＧ−イミデートに関
して上述したのと同じ操作に従った。 Ｖ． 標識したＯＫＴ３の生物学的活性 ＯＫＴ３分子の生物学的活性に関して、ＰＥＧ−イミデ
ートで改質したものとＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドで改質したものとを比較した。ＯＫＴ３は有効な分
裂促進性を有している〔Van Wauwe, J.P.、 De Mey, J.
R.およびGoossens, J.G. (1980) J. Immunol. 124、 270
8-2713〕。生物学的活性に対するＰＥＧ修飾の効果を測
定し、そして生物学的活性に関して、ＰＥＧを該抗体に
連成させるための２つの異なる方法を比較する目的で、
分裂促進因子アッセイを行った。このアッセイは、ヒト
末梢Ｔリンパ球を単離した後、異なる濃度のＯＫＴ３お
よびＰＥＧ−ＯＫＴ３と一緒に４日間、上記細胞を２ｘ
１０6個細胞／ｍＬで培養することから成る。次に、こ
の細胞培養物に、トリチウム原子を含んでいるチミジン
を加える。一晩培養した後、これらの細胞を収穫し、そ
してその数を数える。
【表１】 ＊ 分析用ＨＰＬＣゲル濾過／遊離アミン分析からの見
積もり。 ＊＊ ここで、Ｉｍ−５はイミデート連成ＰＥＧ５００
０であり、ＮＨＳ−５はＮ−ヒドロキシスクシニミド連
成ＰＥＧ５０００であり、Ｉｍ−２はイミデート連成Ｐ
ＥＧ２０００であり、そしてＮＨＳ−２はＮ−ヒドロキ
シスクシニミド連成ＰＥＧ２０００である。 ＯＴＫ３に連成させたイミデート−ＰＥＧとＯＴＫ３に
連成させたＮ−ヒドロキシスクシニミド−ＰＥＧとの間
の、分裂促進活性に関する差を表Ｉに示す。中間程度か
ら高レベルの修飾、即ち３０〜７０９０の修飾におい
て、イミデート−ＰＥＧで修飾したＯＴＫ３に関連した
分裂促進活性は、スクシニミド−ＰＥＧ修飾ＯＴＫ３よ
りもかなり高い。従って、分子量が２０００と５０００
のＰＥＧで示されているように、イミデート−ＰＥＧ連
成で示される修飾時の正電荷保持により、従来用いられ
ていたスクシニミド−ＰＥＧ（これは、修飾したとき電
荷を保持しない）よりも良好な生物学的活性の維持がも
たらされる。 ＶＩ． ＰＥＧ−エリトロポイエチン 組換え型的に製造したヒトエリトロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）を、イミデート−ＰＥＧ、スクシニミド−ＰＥＧお
よびトレシル−ＰＥＧで修飾した。イミデート−ＰＥＧ
およびスクシニミド−ＰＥＧを用いた修飾を、ｐＨ８．
２もしくは９．３で行った。トレシル−ＰＥＧを用いた
修飾を、ｐＨ７．５、８．２または９．３のどれかで行
った。典型的な実験において、０．８ｍＬの、０．０５
Ｍの燐酸塩緩衝液／０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５の
中か、或は０．８ｍＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ
９．３の中に、ＥＰＯ（０．５ｍｇ）を入れた。いくつ
かの実験で、これらの緩衝液に０．１％のＳＤＳを含有
させた。このＥＰＯ溶液に、適当な活性基を有するＰＥ
Ｇを１０ｍｇ加えた。この反応を約２時間進行させ、そ
の後、ＥＰＯに対する修飾度を上昇させる必要がある場
合、同様に活性化したＰＥＧを更に添加した。ZorbaxTM
GF-250カラムを用いたＨＰＬＣゲル濾過を用い、０．
１Ｍの燐酸塩緩衝液ｐＨ７で溶離させることにより、Ｐ
ＥＧ−ＥＰＯ誘導体を分析した。ＰＥＧ−２０００（分
子量が２０００のＰＥＧ）を用いることにより、分析用
ＨＰＬＣで単一の主要蛋白質ピークを検出することが可
能である、ことが見いだされた。これらの異なる３種の
リンカーと一緒にＰＥＧ−５０００を用いると、有意量
の未反応ＥＰＯが残存し、そして修飾されたＥＰＯを示
す２つの主要ピークが検出された。従って、ＰＥＧ−２
０００を用いると、ＰＥＧ−５０００を用いた時よりも
奇麗な反応生成物が得られた。Sephacryls-200-HRカラ
ム（１ｍｍｘ４５ｍｍ）使用ゲル濾過を用い、燐酸塩緩
衝液（少量のアジドが入っている）で溶離させることに
より、該ＥＰＯ−ＰＥＧ誘導体を精製した。ＥＰＯレセ
プタを発現するネズミ細胞系を用いて、上記ＰＥＧ−Ｅ
ＰＯ誘導体に関する生物学的活性を分析した。この細胞
系は、成長に関してＥＰＯに依存している。このアッセ
イは下記の通りである。ＥＰＯの存在無しで２４時間、
細胞（１０6個／ｍＬ）を増殖させ、その後、ＥＰＯも
しくはＰＥＧ−ＥＰＯのどちらかを加える。これらの細
胞を４２時間培養した後、これらの細胞に、トリチウム
原子を含んでいるチミジンを加える。６時間後、これら
の細胞を収穫し、そしてその数を数える。増大したチミ
ジン吸収によって、細胞の増殖を測定する。表ＩＩにそ
の結果を示す。
積もり。 ＊＊ ここで、Ｉｍ−５はイミデート連成ＰＥＧ５００
０であり、ＮＨＳ−５はＮ−ヒドロキシスクシニミド連
成ＰＥＧ５０００であり、Ｉｍ−２はイミデート連成Ｐ
ＥＧ２０００であり、そしてＮＨＳ−２はＮ−ヒドロキ
シスクシニミド連成ＰＥＧ２０００である。 ＯＴＫ３に連成させたイミデート−ＰＥＧとＯＴＫ３に
連成させたＮ−ヒドロキシスクシニミド−ＰＥＧとの間
の、分裂促進活性に関する差を表Ｉに示す。中間程度か
ら高レベルの修飾、即ち３０〜７０９０の修飾におい
て、イミデート−ＰＥＧで修飾したＯＴＫ３に関連した
分裂促進活性は、スクシニミド−ＰＥＧ修飾ＯＴＫ３よ
りもかなり高い。従って、分子量が２０００と５０００
のＰＥＧで示されているように、イミデート−ＰＥＧ連
成で示される修飾時の正電荷保持により、従来用いられ
ていたスクシニミド−ＰＥＧ（これは、修飾したとき電
荷を保持しない）よりも良好な生物学的活性の維持がも
たらされる。 ＶＩ． ＰＥＧ−エリトロポイエチン 組換え型的に製造したヒトエリトロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）を、イミデート−ＰＥＧ、スクシニミド−ＰＥＧお
よびトレシル−ＰＥＧで修飾した。イミデート−ＰＥＧ
およびスクシニミド−ＰＥＧを用いた修飾を、ｐＨ８．
２もしくは９．３で行った。トレシル−ＰＥＧを用いた
修飾を、ｐＨ７．５、８．２または９．３のどれかで行
った。典型的な実験において、０．８ｍＬの、０．０５
Ｍの燐酸塩緩衝液／０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５の
中か、或は０．８ｍＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ
９．３の中に、ＥＰＯ（０．５ｍｇ）を入れた。いくつ
かの実験で、これらの緩衝液に０．１％のＳＤＳを含有
させた。このＥＰＯ溶液に、適当な活性基を有するＰＥ
Ｇを１０ｍｇ加えた。この反応を約２時間進行させ、そ
の後、ＥＰＯに対する修飾度を上昇させる必要がある場
合、同様に活性化したＰＥＧを更に添加した。ZorbaxTM
GF-250カラムを用いたＨＰＬＣゲル濾過を用い、０．
１Ｍの燐酸塩緩衝液ｐＨ７で溶離させることにより、Ｐ
ＥＧ−ＥＰＯ誘導体を分析した。ＰＥＧ−２０００（分
子量が２０００のＰＥＧ）を用いることにより、分析用
ＨＰＬＣで単一の主要蛋白質ピークを検出することが可
能である、ことが見いだされた。これらの異なる３種の
リンカーと一緒にＰＥＧ−５０００を用いると、有意量
の未反応ＥＰＯが残存し、そして修飾されたＥＰＯを示
す２つの主要ピークが検出された。従って、ＰＥＧ−２
０００を用いると、ＰＥＧ−５０００を用いた時よりも
奇麗な反応生成物が得られた。Sephacryls-200-HRカラ
ム（１ｍｍｘ４５ｍｍ）使用ゲル濾過を用い、燐酸塩緩
衝液（少量のアジドが入っている）で溶離させることに
より、該ＥＰＯ−ＰＥＧ誘導体を精製した。ＥＰＯレセ
プタを発現するネズミ細胞系を用いて、上記ＰＥＧ−Ｅ
ＰＯ誘導体に関する生物学的活性を分析した。この細胞
系は、成長に関してＥＰＯに依存している。このアッセ
イは下記の通りである。ＥＰＯの存在無しで２４時間、
細胞（１０6個／ｍＬ）を増殖させ、その後、ＥＰＯも
しくはＰＥＧ−ＥＰＯのどちらかを加える。これらの細
胞を４２時間培養した後、これらの細胞に、トリチウム
原子を含んでいるチミジンを加える。６時間後、これら
の細胞を収穫し、そしてその数を数える。増大したチミ
ジン吸収によって、細胞の増殖を測定する。表ＩＩにそ
の結果を示す。
【表２】 ＊ ここで、Ｉｍ＝イミデート、Ｔｒｓ＝トレシル、Ｎ
ＨＳ＝スクシニミド（でＰＥＧを活性化） ＊＊ ここで、＃ＰＥＧは、ＥＰＯの単一分子に結合し
たＰＥＧ（分子量２０００）分子の平均数である。 ＊＊＊ ここで、活性は、ＥＰＯが１００％の活性を示
すことを基にして、最大の細胞増殖か或はその半分を与
えるに必要なＥＰＯもしくはＰＥＧ−ＥＰＯ量である。
ＨＳ＝スクシニミド（でＰＥＧを活性化） ＊＊ ここで、＃ＰＥＧは、ＥＰＯの単一分子に結合し
たＰＥＧ（分子量２０００）分子の平均数である。 ＊＊＊ ここで、活性は、ＥＰＯが１００％の活性を示
すことを基にして、最大の細胞増殖か或はその半分を与
えるに必要なＥＰＯもしくはＰＥＧ−ＥＰＯ量である。
【表３】 ＊ ここで、Ｉｍ＝イミデート、Ｔｒｓ＝トレシル、Ｎ
ＨＳ＝スクシニミド（でＰＥＧを活性化） ＊＊ ここで、＃ＰＥＧは、ＥＰＯの単一分子に結合し
たＰＥＧ（分子量５０００）分子の平均数である。 ＊＊＊ ここで、活性は、ＥＰＯが１００％の活性を示
すことを基にして、最大の細胞増殖か或はその半分を与
えるに必要なＥＰＯもしくはＰＥＧ−ＥＰＯ量である。 表ＩＩおよびＩＩＩに示されているように、５個または
８個のＰＥＧを結合させたイミデート−ＰＥＧは、トレ
シルもしくはスクシニミド基で活性化したＰＥＧよりも
かなり高い活性を示している。該イミデート−ＰＥＧが
その相対物よりも高い生物活性を示すことに関する可能
な説明は、修飾したときそれが正電荷を保持しているこ
とである。また可能性のある重要性は、ＰＥＧのバック
ボーンから正電荷が若干取り除かれ、それによって、Ｐ
ＥＧで保護されている時とは異なり、該レセプタとの相
互作用を生じ易くなることである。ＰＥＧで修飾したア
ルカリ性ホスファターゼが示す酵素活性に対して、４つ
の異なるＰＥＧ連成化学品（トレシル、スクシニミジル
スクシネート、シアヌール酸クロライド、およびカルボ
ニルジイミダゾール）を比較した試験において、修飾を
行った時、スクシニミジルスクシネートが最も高い活性
を示す酵素を与えることが見いだされた〔Yoshinga, K.
およびHarris, J.M. J. Bioact. CompatiblePolym. 4:
17-24 (1989)〕。ＰＥＧを用いたアスパラギナーゼの修
飾でもまた、連成させた時、スクシニミジルスクシネー
トが酵素を不活性にする度合は、ＰＥＧ−シアヌール酸
クロライドのそれよりも有意に低いことが示された〔Ab
uchowski, A.、 Kazo, G.M.、 Verhoest, C.R.、 Es. T.
V.、 Kafkewitz, D.、 Nucci M.L.、 Viau, A.T.およびDav
is, F.F. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175-186 (198
4)〕。このＥＰＯおよびＯＫＴ３試験の両方において、
該イミデート連成化学品は、スクシニミジルスクシネー
ト連成化学品よりも良好であり、従って、ここに教示す
るＰＥＧ誘導体は、以前に送り出された最良の連成用Ｐ
ＥＧ化学品よりも優れていることを示している。該スク
シニミド−ＰＥＧおよびトレシル−ＰＥＧエステルを用
いて製造したＥＰＯ誘導体が示す活性に関する表ＩＩお
よびＩＩＩの結果は、興味の持たれるものである。この
トレシル−ＰＥＧおよびスクシニミド−ＰＥＧのＥＰＯ
誘導体は、匹敵するイミデート−ＰＥＧのＥＰＯ誘導体
よりも低い活性を示してはいるが、このトレシルおよび
スクシニミド−ＰＥＧ誘導体は、リジン残基に連成させ
た結果として正電荷の損失が生じているＥＰＯ−ＰＥＧ
誘導体（該トレシル−ＰＥＧは第二級アミンを生じ、そ
して該スクシニミド−ＰＥＧはアミド結合を生じる）に
関して予測されたよりも高い活性を示している。従っ
て、水溶性ポリマー類（水溶性ポリマー類は、化合物
（Ｉ）中のＰと同様に定義される）のトレシルもしくは
スクシニミドエステルを用いてＥＰＯ（天然源から単離
されたか、遺伝工学細胞から得られるか、或は種々のイ
ンビトロ方法で合成された、ヒトもしくはヒト以外の）
の誘導化を行うことも興味の持たれるものである。本分
野の技術者が本発明を実施するには前述した明細で充分
であると考えられる。実際、薬学的調合物の分野および
それに関連した分野の技術者にとって明らかな、本発明
を実施するための上記様式に関する種々の修飾形は、請
求の範囲内に入ると解釈される。本発明の特徴および態
様は以下のとうりである。 １． 式
ＨＳ＝スクシニミド（でＰＥＧを活性化） ＊＊ ここで、＃ＰＥＧは、ＥＰＯの単一分子に結合し
たＰＥＧ（分子量５０００）分子の平均数である。 ＊＊＊ ここで、活性は、ＥＰＯが１００％の活性を示
すことを基にして、最大の細胞増殖か或はその半分を与
えるに必要なＥＰＯもしくはＰＥＧ−ＥＰＯ量である。 表ＩＩおよびＩＩＩに示されているように、５個または
８個のＰＥＧを結合させたイミデート−ＰＥＧは、トレ
シルもしくはスクシニミド基で活性化したＰＥＧよりも
かなり高い活性を示している。該イミデート−ＰＥＧが
その相対物よりも高い生物活性を示すことに関する可能
な説明は、修飾したときそれが正電荷を保持しているこ
とである。また可能性のある重要性は、ＰＥＧのバック
ボーンから正電荷が若干取り除かれ、それによって、Ｐ
ＥＧで保護されている時とは異なり、該レセプタとの相
互作用を生じ易くなることである。ＰＥＧで修飾したア
ルカリ性ホスファターゼが示す酵素活性に対して、４つ
の異なるＰＥＧ連成化学品（トレシル、スクシニミジル
スクシネート、シアヌール酸クロライド、およびカルボ
ニルジイミダゾール）を比較した試験において、修飾を
行った時、スクシニミジルスクシネートが最も高い活性
を示す酵素を与えることが見いだされた〔Yoshinga, K.
およびHarris, J.M. J. Bioact. CompatiblePolym. 4:
17-24 (1989)〕。ＰＥＧを用いたアスパラギナーゼの修
飾でもまた、連成させた時、スクシニミジルスクシネー
トが酵素を不活性にする度合は、ＰＥＧ−シアヌール酸
クロライドのそれよりも有意に低いことが示された〔Ab
uchowski, A.、 Kazo, G.M.、 Verhoest, C.R.、 Es. T.
V.、 Kafkewitz, D.、 Nucci M.L.、 Viau, A.T.およびDav
is, F.F. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175-186 (198
4)〕。このＥＰＯおよびＯＫＴ３試験の両方において、
該イミデート連成化学品は、スクシニミジルスクシネー
ト連成化学品よりも良好であり、従って、ここに教示す
るＰＥＧ誘導体は、以前に送り出された最良の連成用Ｐ
ＥＧ化学品よりも優れていることを示している。該スク
シニミド−ＰＥＧおよびトレシル−ＰＥＧエステルを用
いて製造したＥＰＯ誘導体が示す活性に関する表ＩＩお
よびＩＩＩの結果は、興味の持たれるものである。この
トレシル−ＰＥＧおよびスクシニミド−ＰＥＧのＥＰＯ
誘導体は、匹敵するイミデート−ＰＥＧのＥＰＯ誘導体
よりも低い活性を示してはいるが、このトレシルおよび
スクシニミド−ＰＥＧ誘導体は、リジン残基に連成させ
た結果として正電荷の損失が生じているＥＰＯ−ＰＥＧ
誘導体（該トレシル−ＰＥＧは第二級アミンを生じ、そ
して該スクシニミド−ＰＥＧはアミド結合を生じる）に
関して予測されたよりも高い活性を示している。従っ
て、水溶性ポリマー類（水溶性ポリマー類は、化合物
（Ｉ）中のＰと同様に定義される）のトレシルもしくは
スクシニミドエステルを用いてＥＰＯ（天然源から単離
されたか、遺伝工学細胞から得られるか、或は種々のイ
ンビトロ方法で合成された、ヒトもしくはヒト以外の）
の誘導化を行うことも興味の持たれるものである。本分
野の技術者が本発明を実施するには前述した明細で充分
であると考えられる。実際、薬学的調合物の分野および
それに関連した分野の技術者にとって明らかな、本発明
を実施するための上記様式に関する種々の修飾形は、請
求の範囲内に入ると解釈される。本発明の特徴および態
様は以下のとうりである。 １． 式
【化１２】 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーである〕に従う化合物。 ２． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホモ
ポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマー
類、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコ
ポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホモ
ポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置換
であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオ
ール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド類、
ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１項記載の化合物。 ３． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールで
ある第２項記載の化合物。 ４． 第１項記載の化合物とポリペプチドとを反応させ
る段階を含む、少なくとも１種の水溶性ポリマーをポリ
ペプチドに共有結合させる方法。 ５． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカイ
ン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第４項記載の
方法。 ６． 上記ポリペプチドが抗体であり、そして上記方法
が、上記反応段階に先立つ、上記抗体上の結合部位に対
して特異的に結合し得る化合物と上記抗体とを一緒にす
る段階を更に含む第４項記載の方法。 ７． 上記ポリペプチドが酵素であり、そして上記方法
が、上記反応段階に先立つ、上記酵素用基質と上記ポリ
ペプチドとを混合する段階を更に含む第４項記載の方
法。 ８． 第４項の方法で修飾したポリペプチド。 ９． 第８項記載のポリペプチドと薬学的に許容される
担体とを含む組成物。 １０． 式
ポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマー
類、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコ
ポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホモ
ポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置換
であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオ
ール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド類、
ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１項記載の化合物。 ３． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールで
ある第２項記載の化合物。 ４． 第１項記載の化合物とポリペプチドとを反応させ
る段階を含む、少なくとも１種の水溶性ポリマーをポリ
ペプチドに共有結合させる方法。 ５． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカイ
ン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第４項記載の
方法。 ６． 上記ポリペプチドが抗体であり、そして上記方法
が、上記反応段階に先立つ、上記抗体上の結合部位に対
して特異的に結合し得る化合物と上記抗体とを一緒にす
る段階を更に含む第４項記載の方法。 ７． 上記ポリペプチドが酵素であり、そして上記方法
が、上記反応段階に先立つ、上記酵素用基質と上記ポリ
ペプチドとを混合する段階を更に含む第４項記載の方
法。 ８． 第４項の方法で修飾したポリペプチド。 ９． 第８項記載のポリペプチドと薬学的に許容される
担体とを含む組成物。 １０． 式
【化１３】 〔式中、ｎは１〜ｘであり、ｘはＺ中のリジン残基の数
よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてＺ
はポリペプチドである〕に従う化合物であり、ここでＺ
が、Ｚ中のリジン残基を通してこの化合物の非ポリペプ
チド部分に共有結合している化合物。 １１． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１０項記載の化合物。 １２． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第１１項記載
の化合物。 １３． 上記ポリペプチドが抗体である第１２項記載の
化合物。 １４． 上記ポリペプチドがエリトロポイエチンである
第１２項記載の化合物。 １５． 第１２項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 １６． 式
よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてＺ
はポリペプチドである〕に従う化合物であり、ここでＺ
が、Ｚ中のリジン残基を通してこの化合物の非ポリペプ
チド部分に共有結合している化合物。 １１． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１０項記載の化合物。 １２． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第１１項記載
の化合物。 １３． 上記ポリペプチドが抗体である第１２項記載の
化合物。 １４． 上記ポリペプチドがエリトロポイエチンである
第１２項記載の化合物。 １５． 第１２項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 １６． 式
【化１４】 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてｍは１〜２
０である〕に従う化合物。 １７． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１６項記載の化合物。 １８． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第１７項記載の化合物。 １９． 第１６項記載の化合物とポリペプチドとを反応
させる段階を含む、少なくとも１種の水溶性ポリマーを
ポリペプチドに共有結合させる方法。 ２０． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第１９項記載
の方法。 ２１． 上記ポリペプチドが抗体であり、そして上記方
法が、上記反応段階に先立つ、上記抗体上の結合部位に
対して特異的に結合し得る化合物と上記抗体とを一緒に
する段階を更に含む第１９項記載の方法。 ２２． 上記ポリペプチドが酵素であり、そして上記方
法が、上記反応段階に先立つ、上記酵素用基質と上記ポ
リペプチドとを混合する段階を更に含む第１９項記載の
方法。 ２３． 第１９項の方法で修飾したポリペプチド。 ２４． 第２３項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 ２５． 式
０である〕に従う化合物。 １７． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第１６項記載の化合物。 １８． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第１７項記載の化合物。 １９． 第１６項記載の化合物とポリペプチドとを反応
させる段階を含む、少なくとも１種の水溶性ポリマーを
ポリペプチドに共有結合させる方法。 ２０． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第１９項記載
の方法。 ２１． 上記ポリペプチドが抗体であり、そして上記方
法が、上記反応段階に先立つ、上記抗体上の結合部位に
対して特異的に結合し得る化合物と上記抗体とを一緒に
する段階を更に含む第１９項記載の方法。 ２２． 上記ポリペプチドが酵素であり、そして上記方
法が、上記反応段階に先立つ、上記酵素用基質と上記ポ
リペプチドとを混合する段階を更に含む第１９項記載の
方法。 ２３． 第１９項の方法で修飾したポリペプチド。 ２４． 第２３項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 ２５． 式
【化１５】 〔式中、ｍは１〜２０であり、ｎは１〜ｘであり、ｘは
Ｚ中のリジン残基の数よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリ
マーであり、そしてＺはポリペプチドである〕に従う化
合物であり、ここでＺが、Ｚ中のリジン残基を通してこ
の化合物の非ポリペプチド部分に共有結合している化合
物。 ２６． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第２５項記載の化合物。 ２７． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第２６項記載
の化合物。 ２８． 上記ポリペプチドが抗体である第２７項記載の
化合物。 ２９． 上記ポリペプチドがエリトロポイエチンである
第２７項記載の化合物。 ３０． 第２５項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 ３１． 式
Ｚ中のリジン残基の数よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリ
マーであり、そしてＺはポリペプチドである〕に従う化
合物であり、ここでＺが、Ｚ中のリジン残基を通してこ
の化合物の非ポリペプチド部分に共有結合している化合
物。 ２６． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第２５項記載の化合物。 ２７． 上記ポリペプチドが、ホルモン類、リンフォカ
イン類、サイトカイン類、成長因子、酵素、ワクチン抗
原、および抗体から成る群から選択される第２６項記載
の化合物。 ２８． 上記ポリペプチドが抗体である第２７項記載の
化合物。 ２９． 上記ポリペプチドがエリトロポイエチンである
第２７項記載の化合物。 ３０． 第２５項記載のポリペプチドと薬学的に許容さ
れる担体とを含む組成物。 ３１． 式
【化１６】（Ｖ） Ｐ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＮ 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてｎ＝１〜２
０である〕に従う化合物。 ３２． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第３１項記載の化合物。 ３３． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３２項記載の化合物。 ３４． 少なくとも１種のトレシル水溶性ポリマーエス
テルで修飾されており、ここで、上記水溶性ポリマー
が、ポリエチレングリコールのホモポリマー類、ポリプ
ロピレングリコールのホモポリマー類、エチレングリコ
ールとプロピレングリコールとのコポリマー類から成る
群から選択され、そしてここで、上記ホモポリマー類お
よびコポリマー類の１つの末端が、未置換であるか、或
はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオール類、ポリ
ビニルアルコール、ポリサッカライド類、ポリビニルエ
チルエーテル類、およびα，β−ポリ〔（２−ヒドロキ
シエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕で置換されている
エリトロポイエチン分子。 ３５． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３４項記載のエリトロポイエチン分子。 ３６． 少なくとも１種のスクシニミド水溶性ポリマー
エステルで修飾されており、ここで、上記水溶性ポリマ
ーが、ポリエチレングリコールのホモポリマー類、ポリ
プロピレングリコールのホモポリマー類、エチレングリ
コールとプロピレングリコールとのコポリマー類から成
る群から選択され、そしてここで、上記ホモポリマー類
およびコポリマー類の１つの末端が、未置換であるか、
或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオール類、ポ
リビニルアルコール、ポリサッカライド類、ポリビニル
エチルエーテル類、およびα，β−ポリ〔（２−ヒドロ
キシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕で置換されてい
るエリトロポイエチン分子。 ３７． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３６項記載のエリトロポイエチン分子。
０である〕に従う化合物。 ３２． 上記ポリマーが、ポリエチレングリコールのホ
モポリマー類、ポリプロピレングリコールのホモポリマ
ー類、エチレングリコールとプロピレングリコールとの
コポリマー類から成る群から選択され、ここで、上記ホ
モポリマー類およびコポリマー類の１つの末端が、未置
換であるか、或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリ
オール類、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド
類、ポリビニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ
〔（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕
で置換されている第３１項記載の化合物。 ３３． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３２項記載の化合物。 ３４． 少なくとも１種のトレシル水溶性ポリマーエス
テルで修飾されており、ここで、上記水溶性ポリマー
が、ポリエチレングリコールのホモポリマー類、ポリプ
ロピレングリコールのホモポリマー類、エチレングリコ
ールとプロピレングリコールとのコポリマー類から成る
群から選択され、そしてここで、上記ホモポリマー類お
よびコポリマー類の１つの末端が、未置換であるか、或
はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオール類、ポリ
ビニルアルコール、ポリサッカライド類、ポリビニルエ
チルエーテル類、およびα，β−ポリ〔（２−ヒドロキ
シエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕で置換されている
エリトロポイエチン分子。 ３５． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３４項記載のエリトロポイエチン分子。 ３６． 少なくとも１種のスクシニミド水溶性ポリマー
エステルで修飾されており、ここで、上記水溶性ポリマ
ーが、ポリエチレングリコールのホモポリマー類、ポリ
プロピレングリコールのホモポリマー類、エチレングリ
コールとプロピレングリコールとのコポリマー類から成
る群から選択され、そしてここで、上記ホモポリマー類
およびコポリマー類の１つの末端が、未置換であるか、
或はアルキル基、ポリオキシエチル化ポリオール類、ポ
リビニルアルコール、ポリサッカライド類、ポリビニル
エチルエーテル類、およびα，β−ポリ〔（２−ヒドロ
キシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド〕で置換されてい
るエリトロポイエチン分子。 ３７． 上記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール
である第３６項記載のエリトロポイエチン分子。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−289235（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08G 65/32 - 65/3389 C07K 17/08 C08G 69/40
Claims (6)
- 【請求項１】 式 【化１】 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーである〕に従う化合物。
- 【請求項２】 請求項１記載の化合物とポリペプチドと
を反応させる段階を含む、少なくとも１種の水溶性ポリ
マーをポリペプチドに共有結合させる方法。 - 【請求項３】 式 【化２】 〔式中、ｎは１〜ｘであり、ｘはＺ中のリジン残基の数
よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてＺ
はポリペプチドである〕に従う化合物であり、ここでＺ
が、Ｚ中のリジン残基を通してこの化合物の非ポリペプ
チド部分に共有結合している化合物。 - 【請求項４】 式 【化３】 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてｍは１〜２
０である〕に従う化合物。 - 【請求項５】 式 【化４】 〔式中、ｍは１〜２０であり、ｎは１〜ｘであり、ｘは
Ｚ中のリジン残基の数よりも１大きく、Ｐは水溶性ポリ
マーであり、そしてＺはポリペプチドである〕に従う化
合物であり、ここでＺが、Ｚ中のリジン残基を通してこ
の化合物の非ポリペプチド部分に共有結合している化合
物。 - 【請求項６】 式 （Ｖ） P-NH-(CH2)n-CN 〔式中、Ｐは水溶性ポリマーであり、そしてｎ＝１〜２
０である〕に従う化合物。
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