KR100233777B1 - Peg 이미데이트 및 그의 단백질 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PEG 또는 이와 관련된 수용성 유기 중합체의 이미데이트 유도체로 유리 아미노 그룹(들)을 갖는 단백질, 펩티드 및 유기 화합물을 개질시키는 방법 및 개질된 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PEG 및 그밖의 다른 수용성 중합체의 신규한 이미데이트 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 수용성 중합체 개질 시약으로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 프라그먼트, 덱스트란, 폴리사카라이드, 폴리아미노산, 폴리비닐알콜 및 수용성 유기 중합체가 포함된다.
PEG-이미데이트의 장점은 단백질의 아미노 그룹과 반응하여 생성된 유도체가 여전히 양전하를 보유하며 양전하를 수용성 중합체 주쇄로부터 멀리 떨어진 곳에 배치시키는데 있다.
또한 수용성 중합체 이미데이트에 의해 유도된 폴리펩티드도 제공된다.

Description

PEG 이미데이트 및 그의 단백질 유도체
본 발명은 이미데이트 말단 그룹을 갖는 개질된 수용성 중합체 및 이들 분자에 의해 개질된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다.
단백질 및 이와 유사한 다른 유기 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 수용성 유기 중합체에 결합시킴으로써 화학적으로 개질시킬 수 있다. 이러한 단백질 복합체의 제조는 수용성 중합체를 결합시킴으로써 폴리펩티드에 목적하는 성질이 부여되기 때문에 중요하다. 상기 목적하는 성질로는 수용액중에서의 용해도 증가, 저장시 안정성 증가, 면역원성 감소, 효소 분해에 대한 저항력 증가, 여러 가지 약제 투여 시스템과의 혼용성, 및 생체내 반감기 증가가 포함된다. PEG 또는 그외의 다른 수용성 중합체로 폴리펩티드를 유도체화시킴으로써 수득되는 상술한 바와 같은 목적하는 성질은 폴리펩티드가 체내에 투여되는 치료제로서 사용될 경우 또는 폴리펩티드가 대상 화합물을 검출 및/또는 정량화하는 분석, 일반적으로 면역 분석에 사용될 경우에 특히 중요하다.
단백질에 대한 리포터 그룹(reporter group), 리간드 등의 결합은 일반적으로 리신 잔기의 측쇄상의 일급 아미노 그룹을 통해 일어난다. 리신 잔기와 특이적으로 결합하고 있는 수개의 PEG-유도체가 합성되었다. PEG의 하이드록실 말단 그룹은 PEG를 목적 단백질에 공유적으로 결합시킬 수 있는 반응성 기능 그룹으로 전환된다. 그러한 PEG-유도체로는 2(알콕시폴리에틸렌글리콕시)-4, 6-디클로로트리아진[참조 : Abuchowski, A., Van Es, T., Palczuk, N.C., 및 Davis, F.F. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3578-3581]; 2-[알콕시폴리에틸렌글리콕시)-S-카복스아미드모텔디티오카보네이트[참조 : King, T.P., 및 Weiner, C. (1980) Int. J. Peptide Protein Res. 16, 147-155]; 2-(알콕시폴리에틸렌글리콕시)-N-숙신이미딜숙시네이트[참조 : Abuchowski, A., Kazo. G.M., Verhoest, C., Van Es. T., Kafkewitz, D., Viau, A., 및 Davis, F. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186]; 2-(알콕시폴리에틸렌글리콕시)카복시이미다졸[참조 : Beauchamp, C.O., Gonias, S.L., Menapace, D.P., al Pizzo, S.V. (1983) Anal. Biochem. 131, 25-33]; 2-(알콕시폴리에틸렌글리콕시)-2,4,5-트리클로로벤젠[참조 : Versonese, F.M., Largajolli, R., Boccu, E., Benassi, C.A., 및 Schiavon, O. (1985) Applied Biochem. Biotech 11, 141-152]; 2-(알콕시폴리에틸렌글리콕시)-4-니트로벤젠[참조 : Versonese, F.M., Largajolli, R., Boccu, E., Benassi, C.A., 및 Schiavon, O. (1985) Applied Biochem. Biotech 11 141-152]; 2-(알콕시폴리에틸렌글리콕시)-2,2,2-트리플루오로에탄[참조 : Delgado, C., Patel, J. N., Francis, G.E., 및 Fisher, D. (1990) Biotech. Applied Biochem. 12, 119-128]; 2-알콕시폴리에틸렌알데히드[참조 : Andrews, B.A., Head, D.M., Dunthorne, P., 및 Asenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech. 4,49-54]; 2-알콕시폴리에틸렌글리콕시메틸에폭사이드[참조 : Andrews, B.A., Head, D.M., Dunthorne, P., 및 Asenjo, J.A. (1990) Biotech. Tech. 4, 49-54]가 포함된다.
알킬 이미데이트는 종종 단백질을 개질시키는데 사용되어 왔다[참조예 : Hunter, M, J., 및 Ludwig, M. L. (1972) Methods Enzymol. 25, 285-596]. 알킬 이미데이트는 알파 및 엡실론 아미노 그룹과 특이적으로 반응하여 모(parent) 아민보다 더 강한 염기인 아미딘을 형성한다. 최초 단백질 아미노 그룹의 양전하는 양전하가 몇몇 원자들에 의해 이동된다 하더라고 그래도 남아있게 된다. 여러 가지 기능 그룹(페닐, 페놀성 그룹, 설프 하이드릴, 형광성 그룹, 소수성 그룹, 방사표지, 스핀 표지, 광친화성 표지등)을 이미도에스테르에 결합시키고 이 방법으로 단백질내에 함침시킬 수 있다. 활성 에스테르 결합 또는 활성 카바메이트 결합과 비교해서 이미도에스테르의 장점은 개질된 리신 그룹의 양전하가 보존된다는데 있다.
단백질에 수용성 중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키는 경우의 장점은 알려져 있으며, 이러한 장점으로는 천연 단백질이 생리적 pH에서 불용성이거나 부분 수용성인 경우에 생리적 pH에서 천연 단백질에 비해 복합 단백질의 수용성의 증가, 천연 단백질에 의한 면역 응답의 감소, 약물동력학적 프로파일의 증가, 저장 수명 증가 및 생물학적 반감기의 증가가 포함된다.
다수의 단백질이 PEG에 의해 개질되었다[참조예 : Inada, Y., Yoshimoto, T. Matsushima, A., 및 Saito, Y. (1986) Trends Biotechnol. 4: 68-73]. 또한 이들에 관한 특허가 출원되었거나 공개되었다. [참조 : 미합중국 특허 제 4,179,337호; 미합중국 특허 제 4,609,546호; 미합중국 특허 제 4,261,973호; 미합중국 특허 제 4,055,635호; 미합중국 특허 제 3,960,830호; 미합중국 특허 제 4,415,665호; 미합중국 특허 4,412,989호; 미합중국 특허 제 4,002,531호; 미합중국 특허 제 4,414,147호; 미합중국 특허 제 3,788,948호; 미합중국 특허 제 4,732,863호; 미합중국 특허 제 4,745,180호; EP 제 152,847호; 1984년 1월 11일에 공개된 EP 98,110; JP 제 5,792,435호]. 상술한 바와 같은 특허 및 특허 공개는 또한 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥시에틸화 폴리올(POP), 헤파린, 헤파린 프라그먼트(fragment), 덱스트란, 폴리사카라이드, 프롤린을 함유하는 폴리아미노산, 폴리비닐알콜(PVA), 및 그외의 다른 수용성 유기 중합체들이 포함되지만 이들로만 제한받지 않는 다른 수용성 중합체 단백질 개질제의 사용을 기술하고 있다. 폴리펩티드가 수용성 중합체와 결합하고 폴리펩티드가 개질될 수 있는 한도에는 몇가지 제한점이 따른다.
상이한 수용성 중합체 시약은 대상으로 하는 폴리펩티드중에 아미노산 잔기를 결합시키기 위해 제공되는 기능 그룹에 따라 달라진다. 이후 본원에서 사용하는 용어 “수용성 중합체 시약”은 수용성 중합체를 폴리펩티드에 결합시키는데 필요한 기능 그룹을 함유하도록 개질된 수용성 중합체를 의미한다. 특정 기능 그룹이 수용성 중합체를 특정 아미노산 잔기에 결합시키는데 필요하다. 공지된 수용성 중합체 시약에 의해 쉽게 개질되지 않는 아미노산 잔기에 결합될 수 있는 수용성 중합체 시약을 제공하는 것이 중요하다. 이전에 결합시키지 못한 아미노산 잔기에 결합될 수 있는 수용성 중합체 시약을 제공함으로써, 다른 아미노산 잔기에게 결합을 통해 나쁜 영향을 미칠 수도 있는 단백질의 생물학적 활성에 실제로 나쁜 영향을 미치지 않고도 수용성 중합체를 단백질에 결합시키는 것이 가능하게 되었다.
수용성 중합체를 결합시킴으로써 폴리펩티드를 개질시키는데 따른 그밖의 다른 제한점은 결합 반응에 의해 전하가 변경된다는 것이다. 아미노산 잔기에 대한 전하의 변화, 즉 전하가 전하를 띠지 않는 잔기내로 혼입되거나 전하를 띠지 않는 잔기가 전하내로 혼입되는 것은 활성 부위를 피괴하거나 3차 구조를 붕괴시킴을 포함하는 다수의 메카미즘에 의해 단백질의 생물학적 활성에 나쁜 영향을 미칠 수도 있다. 상술한 바와 같은 전하의 변화는 누적되기 때문에, 전하를 변경시키는 결합반응은 실제로 폴리펩티드의 기능을 손상시킴이 없이 가능한 유도체화의 양을 제한시킬 수 있음은 명백하다. 따라서 잔기상에 존재하는 전하를 변경시키지 않고 아미노산 잔기에 결합될 수 있는 수용성 중합체 시약을 제공하는 것이 중요하다.
본 발명은 PEG의 이미데이트 유도체 또는 구조적으로 관련있는 다른 수용성 유기 중합체의 이미데이트 유도체로 유리 아미노 그룹(들)을 갖는 유기 화합물, 펩티드 및 단백질을 개질시키는 방법 및 화합물을 제공한다. 또한 본 발명은 PEG의 신규한 이미데이트 유도체 및 그밖의 다른 수용성 중합체를 제공한다. 하나이상의 수용성 중합체 이미데이트 에스테르를 개개 폴리펩티드 또는 이와 유사한 유기 분자에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 다른 특징은 이미데이트 수용성 중합체 유도체를 공유 결합시켜 개질된 단백질을 제공하는 것이다.
이미데이트 수용성 중합체 유도체의 장점은 단백질의 아미노 그룹과 반응하였을 때 생성된 유도체에 양전하가 보유된다는데 있다. 이미데이트 결합은 또한 수용성 중합체 주쇄로부터 멀리 떨어진 곳에 양전하를 배치시켜 양전하가 수용체, 표적 단백질 또는 리간드에 더욱 용이하게 결합되도록 만든다. 따라서 수용성 중합체 이미데이트 유도체에 의해 단백질을 개질시키는 것은 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 염화 시아누르, 및 활성 카바메이트와 같은 결합제를 사용한 일반적으로 사용되는 PEG-개질제에서 나타나는 현상인 양전하의 손실을 막는다.
본 발명의 수용성 중합체 시약으로는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α, β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드] 및 그외의 다른 수용성 유기 중합체의 이미데이트가 포함된다.
본 발명의 수용성 중합체 이미데이트로 유도체화되는 폴리 펩티드에는 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 향원 및 항체가 포함된다. 에리트로포이에틴(EP0), 특히는 인체 에리트로포이에틴의 수용성 중합체 유도체화가 특히 관심이 있다.
본 발명의 또다른 특징은 수용성 중합체 트레실 및 숙신이미드에스테르로 유도체화된 EP0이다.
본 발명은 PEG, 즉 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체의 이미데이트 유도체인 신규한 폴리펩티드 개질제를 제공한다. 본 발명의 분자는 여러 가지 수용성 중합체를 대상 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 그밖의 다른 특징은 하나이상의 수용성 폴리펩티드에 공유적으로 결합되도록 시약 분자, 즉 목적 수용성 중합체 이미데이트에 의해 개질된 폴리펩티드를 제공하는데 있다.
일반적으로, 수용성 중합체를 폴리펩티드에 결합시키는데 유용한 화합물은 다음과 같은 일반식을 갖는다.
상기 식에서, P는 수용성 유기 중합체를 나타낸다. 본 발명의 수용성 유기 중합체는 중합체 주쇄의 말단부분에 하이드록시 그룹을 가지며 a) 덱스트란 및 덱스트란 설페이트를 포함하는 덱스트란 유도체, P-아미노 가교결합된 덱스트린, 및 카복시메틸 덱스트린, b) 셀룰로즈, 및 메틸 셀룰로즈 및 카복시메틸 셀룰로즈를 포함하는 셀룰로즈 유도체, c) 전분 및 덱스트린, 및 전분의 유도체 및 하이드록일악테스, d) 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단 부분에서 알킬 그룹에 의해 치환되거나 비치환된다)를 포함하는 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, e) 헤파린 및 헤파린의 프라그먼트, f) 폴리비닐알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르, g) 폴리비닐피롤리돈, h) α, β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아미드], 및 I) 폴리옥시에틸화 폴리올을 포함하지만 이들로만 한정되지는 않는 공지된 수용성 중합체중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 수용성 중합체 P는 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 덱스트린 및 덱스트린 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 수용성 중합체 P는 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체중에서 선택되며, 이중에서도 폴리에틸렌 글리콜의 모노 메틸 에테르가 특히 바람직하다(단백질간의 가교결합을 막기 위하여). 본 발명의 수용성 중합체 시약에 의해 개질된 폴리펩티드가 의약품으로서 사용되는 경우에, 중합체 P는 무독성이어야 한다.
일반식 (Ⅱ)에서, m은 약 1 내지 20, 특히 바람직하게는 1 내지 10이다.
일반식 (Ⅰ)의 분자 이외에도, 본 발명은 또한 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 분자와 반응하여 개질된 폴리펩티드도 포함된다.
일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 수용성 중합체 시약으로 개질된 폴리펩티드는 각각 다음 일반식 (Ⅲ) 및 (Ⅳ)로 표시될 수 있다.
상기 식에서, P는 전기한 바와같이 수용성 중합체이다. Z는 적어도 하나의 일급 아민을 함유하는 잔기를 갖는 상술한 바와같은 폴리펩티드를 나타내고, n은 1 내지 x의 수를 나타내며, 여기에서 x는 폴리펩티드 Z에 존재하는 리신 잔기의 수보다 1이 더 크다. 일반식 (Ⅳ)에서, m은 약 1 내지 20, 특히 바람직하게는 1 내지 10이다.
수용성 중합체 P는 결합 부위에서 폴리펩티드상에 아미노 말단 그룹 및/또는 리신 잔기의 엡실론 아미노 그룹에 공유적으로 결합된다. 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자당 x개 까지의 수용성 중합체가 결합하여 개질될 수도 있지만, 일반적으로 x개 미만의 수용성 중합체 분자에 의해 대상 폴리펩티드를 개질시키는 것이 바람직하다. 폴리펩티드 분자당 수용성 중합체의 수가 증가하게 되면 개질되지 않은 폴리펩티드에 의한 생물학적 활성이 감소될 수 있기 때문에 최대 수의 수용성 중합체, 즉 x개의 분자로 폴리펩티드를 유도체화시키는 것은 바람직하지 않을 수도 있다.
본 발명의 주요 장점은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키지 않거나, 동일한 수용성 중합체를 본 발명의 아미도에스테르 이외의 화합물을 통해 리신 잔기에 결합시킴으로써 감소된 생물학적 활성보다도 더 작은 정도로 생물학적 활성을 감소시키면서 폴리펩티드가 수용성 중합체의 결합에 의해 개질될 수 있다는 것이다.
용어 “생물학적 활성”은 효소 활성, 수용체(항체 포함) 결합 능력, 리간드 결합 능력, 면역 응답 유도 능력 등을 포함한다.
용어 “항체”는 천연 면역 글로블린 서열을 갖는 다클론 항체 및 단클론 항체, 합성 항체 유도체 등을 포함하며; 항체는 여러 표지, 형광그룹, 방사성 그룹, 효소, 비오틴/아비딘 등으 어느 것에도 결합되도록 개질시킬 수 있다. 합성 항체 유도체는 변경된 결합 특이성에 대해 선택되고 변형되어진 천연 면역글로불린 서열, 유전자적으로 개질된 박테리아에 의해 생성된 다양한 면역글로불린 유전자 유도된 폴리펩티드, 대표적으로 단일쇄, 개질된 일정구역을 함유하도록 개질된 항체등을 포함하며; 항체 형성의 원리에 기초한 상술한 바와 같은 합성 항체 유도체는 참조문헌 [Winter 및 Milstein, Nature., 349 : 293-299(1991)]에 기술되어 있다.
본 발명의 한가지 장점은 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물에 의해 개질된 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드가 다른 에스테르를 사용하여 수용성 중합체를 폴리펩티드에 결합시킴으로써 동일한 정도로 개질된 경우보다도 더욱 월등한 정도로 그들의 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것이다. 이러한 장점은 아미도에스테르에 의해 개질된 리신 잔기상에 양전하가 보유되고 가용성 중합체 주쇄로부터 멀리 떨어진 곳에 양전하가 배치되는 것에 기인한다. 따라서, 본 발명은 개질시킴으로써 나타나는 현상인 생물학적 활성의 손실을 극소화시키면서 수용성 중합체를 결합시킴으로써 수득할 수 있는 장점을 지니는 개질된 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 결과적으로, 수용성 중합체에 의해 더욱 고도로 유도체화되므로 고도로 유도체화 시켰을 때 얻을 수 있는 장점을 지니고, 이보다 덜한 정도로 수용성 중합체에 의해 유도체화된 폴리펩티드와 동일한 정도의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
예를 들어 활성 카바메이트를 사용하는 것과 같은, 수용성 중합체를 단백질에 결합시키는 다른 방법과 비교해서 본 발명의 또 다른 장점은 활성 에스테르가 단백질상의 하이드록실 그룹, 페놀 그룹, 및 설프하이드릴 그룹과 같은 일급 아민 이외의 다른 친핵그룹과 반응할 수 있다는데 있다. 본 발명은 이미데이트가 리신 그룹의 일급 아미노 그룹과 선택적으로 반응한다는 점에 있어 교차-반응 문제를 해결한다.
중합체 P가 양이 상이한 다수의 동일 유니트로 이루어지는 경우에, P의 분자량은 상당히 달라질 수 있다. 또한 P가 지시된 분자량을 가지는 경우에, 이 분자량은 대략적인 것일 수 있으며, 이는 분자중에 존재하는 서브유니트(subunit)의 수와 관련해서 서로에 대해 달라지는 분자 P의 집단의 평균 분자량을 나타낸 것이다. 일반적으로, P는 약 200 내지 200,000, 바람직하게는 700 내지 30,000 의 분자량을 갖는다. P에 대한 적합한 분자량은 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 분자가 폴리펩티드에 결합되는 경우에 개질되는 특정 단백질에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 수용성 중합체 시약을 사용하여 폴리펩티드내 리신 잔기의 엡실론 아민상 및 NH 말단 아미노산상에 일급 아민을 함유하는 여러 가지 폴리펩티드 또는 이와 유사한 분자들을 개질시킬 수 있다. 관련있는 폴리펩티드로는 항체, 단클론, 다클론; M-CSF, GM-CSF를 포함하는 시토킨; 림포킨, IL-2, IL-3, PDGF, EGF를 포함하는 성장인자; hGH를 포함하는 펩티드 호르몬, 에리트로포이에틴; Ⅷ인자를 포함하는 혈액응고인자; 면역원; 효소; 효소 억제제; 리간드 등이 포함된다. 관련 폴리펩티드는 그들의 천연 공급원 또는 유전자적으로 처리된 세포로부터 분리될 수 있거나, 다양한 시험관내 합성방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 수용성 중합체 시약은 대부분의 폴리펩티드를 개질시키기 위해 사용될 수 있지만, 1) 약제로서 사용하기 위한 폴리펩티드, 및 2) 분석에 사용하기 위한 폴리펩티드를 개질시키는 것에 특히 관심이 있다. 분석에 사용되는 폴리펩티드에는 특정 결합 단백질, 특정-결합 단백질에 의해 인지되는 폴리펩티드 및 효소가 포함된다. 특정-결합 단백질이란 항체, 호르몬 수용체, 렉틴 등을 의미한다.
개개 폴리펩티드 분자는 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물의 상이한 구체예와의 반응에 의해 하나 이상의 상이한 수용성 중합체로 유도체화 될 수 있다. 개개 폴리펩티드는 n개 까지의 수용성 중합체에 의해 개질될 수 있으며, 여기에서, n은 폴리펩티드상에 있는 유리 일급 아민의 수이고, 일급 아민은 리신 및 아미노 말단 그룹으로부터 생성된다.
본원에 기술된 거대분자, 예를 들어 폴리펩티드, 수용성 중합체 및 이들의 유도체중 어떠한 것의 염도 이들 분자가 다양한 pH의 수용액 중에 존재하는 (또는 수용액으로부터 분리되는) 경우에는 천연적으로 생성될 것이다. 지시한 생물학적 활성을 갖는 펩티드 및 그외의 다른 거대분자의 모든 염은 본 발명의 범위내에 속한다. 이들의 예로 카복실산 잔기의 알카리 금속, 알칼리 토금속, 및 그밖의 다른 금속염, 아미노 잔기의 산 부가염(예를 들면 HCI), 및 동일 분자내의 카복실산 및 아미노 잔기의 반응에 의해 형성된 쯔비터이온(Zwitterions)이 포함된다.
또한 대상 폴리펩티드의 유도체화가 편리하고 재현될 수 있도록 키트(kit) 형태의 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 수용성 중합체 시약을 제공한다. 키트는 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 수용성 중합체 시약, 완충액, 반응 지시 화합물, 지시제, 예를 들면 브래드포드(Bradford) 분석에 대한 단백질 농도 측정 시약으로 구성된 용액을 함유할 수 있다. 시약 용액은 바람직하게는 기정량으로 공급된다.
[수용성 중합체 이미데이트의 합성]
PEG-이미데이트를 합성하는 다수의 방법이 존재한다. PEG-이미데이트를 합성하는데 사용한 방법이 다른 수용성 중합체 이미데이트를 합성하는데 유사하게 사용될 수 있다.
일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물을 합성하는 바람직한 방법은 PEG-알콜을 적합한 친핵그룹과 반응하여 PEG-니트릴을 형성할 수 있는 활성 알콜로 전환시키는 것을 포함한다. 그후 PEG-니트릴은 PEG-이미데이트로 전환시킨다. 활성 PEG-알콜은 클로라이드, 브로마이드, 트레실, 토실 등이 포함할 수 있다. 활성 PEG-알콜의 합성과 관련있는 참조문헌으로는 Furukawa, S., Katayama, N., Iizuka, T., Urabe, I., 및 Okada, H. (1980) FEBS Lett. : 121, 239-242; Mutter, M. (1978) Tetrahedron Lett. 2839-2842; Harris, J. M., Yalpani, M., Van Alstine, J.M., Struck, E.C., Case, M.G., Paley, M.S., 및 Brooks, D.E. (1984) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341-352; Zalipsky, S., Gilon, C., 및 Zilkha, A. (1983) Eur. Polym. J. 19 : 1177-1183; Buckmann, A. F., Kula, M.R., Wichmann, R., 및 Wandrey, C. (1981) J. Appl. Biochem. 3 : 301-315; Buckman A.F., Morr, M., 및 Johansson, G. (1981) Makromol. Chem. 82 : 1379-1384가 포함된다.
4-톨루엔설포닐 클로라이드
일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물로 폴리펩티드 또는 단백질을 개질시키는 바람직한 방법은 폴리펩티드 또는 단백질을 바람직하게는 9 내지 9.5의 pH에서 일급 아민을 함유하지 않는 염기성 완충액중에 넣어두는 과정을 포함한다. 일반식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물은 목적하는 정도로 개질시키는데 필요한 만큼 1회 또는 수회에 걸쳐 첨가된다.
본 발명이 다음 실시예 의해 설명되지만 이로 한정되는 않는다.
[실시예]
[Ⅰ. PEG-이미데이트의 합성]
PEG-CN 또는 PEG-NH(CH2)5-CN(0.5g)을 0.5㎖의 무수 디클로로메탄중에 용해시킨다. 무수 메탄올(5㎖을 -20℃의 빙욕중에 놓아두고, 약 2㎖의 HCl을 메탄올중에 응축시킨다. PEG-NH(CH2)5-CN 용액을 MeOH/HCl에 가한다. 반응을 -20℃에서 5시간동안 진행시킨 후 반응 혼합물을 냉동실에 밤새 놓아둔다. PEG-이미데이트가 무수 에테르부가시 반응 혼합물로부터 침전된다. 생성물의 IR은 1650에서 이미데이트 특성 밴드를 나타낸다.
본 출원의 모든 실시예에서 약어 “PEG”는 폴리에틸렌 글리콜의 모노메틸에테르를 의미한다.
[Ⅱ. PEG-니트릴의 합성]
PEG-OH를 85℃에서 약 5시간 동안 고진공 오븐중에서 건조시킨다. 냉각시킨 후 15g의 PEG-OH(MW=5000)를 50㎖의 디클로로메탄중에 용해시킨다. 트리에틸아민(6.20㎖)을 가한 다음 11.4g의 4-톨루엔설포닐 클로라이드를 가한다(다른 방법으로는, 2,2,2-트리플루오로에탄설포닐 클로라이드를 사용하여 트레실-PEG를 형성할 수 있다). 혼합물을 밤새 환류시킨다. 디클로로메탄 및 에테르로 반복 침전시켜 목적 생성물인 PEG-OTs를 14g 수득한다.
분석 : 이론치 - S, 0.63
실험치 - S, 0.58
PEG-OTs(5g, 1m㏖e)를 1.38g(13m㏖e)의 Na2CO3및 0.51g(4.6m㏖e)의 6-아미노카프로니트릴과 함께 65㎖의 무수 테트라하이드로푸란중에 도입시킨다. 혼합물을 환류하에 3일동안 가열한다. 혼합물을 냉각한 후 여과한다. 침전을 디클로로메탄중에 용해시키고 여과한다.
에테르를 여과액에 가해 생성물을 침전시킨다. 침전단계를 반복한다. 추가로 MeOH/H2O(5:1)로 용출시키는 LH-20 컬럼상에서 겔 여과하여 정제시킨다. 목적하는 PEG-NH-(CH2)5-CN 물질을 수집해서 무수 디클로로메탄중에 용해시키고, 에테르를 가하여 침전시킨다. 수득량 : 4.06g
분석 : 이론치 - N, 0.55
실험치 - N, 0.41
PEG 니트릴은 시아나이드를 사용하여 PEG-Cl로부터 제조할 수 있다. 이 경우에는 이미데이트와 PEG 간에 결합이 없다.
PEG-OH를 85℃에서 약 5시간동안 고진공 오븐중에서 건조시킨다. 냉각시킨 후 10g(5m㏖e)의 PEG-OH(MW=2000)를 40㎖의 무수 톨루엔중에 도입시킨 후 0.7㎖(5m㏖e)의 트리에틸아민을 도입시킨다. 티오닐 클로라이드(1.1㎖, 5m㏖e)를 1시간에 걸쳐 천천히 가한다. 용액을 4시간동안 환류시킨 후 용액을 실온에서 밤새 교반한다. 용액을 가열한 다음 여과한다. 여과액을 농축.건조시킨다. 잔류물을 물에 용해시키고 활성탄으로 처리한다. 탄소를 여과하고 여과액을 농축시킨 후, 잔류물을 디클로로메탄중에 용해시키고 에트르로 처리한다. 침전 8.3g을 수집한다. 추가로 MeOH/H2O(5:1)로 용출시키는 LH-20 상에서 겔 여과 크로마토그래피하여 정제한다. IR에 의해 생성물에서 668의 클로라이드 밴드를 확인하였다.
분석 : 이론치 - Cl, 1.76
실험치 - Cl, 1.55
PEG-Cl(MW=2000)(1g, 0.5m㏖e) 및 NaCN(0.21g, 4.2m㏖e)을 6.6㎖의 무수 디메틸설폭사이드에 가한다. 혼합물을 100℃에서 70분동안 가열하다. 냉각시킨 후 용액을 여과하고, 여과액을 농축시킨다. 잔류물을 MeOH/H2O(5:1)로 용출시키는 LH-20 컬럼상에서 겔 여과시킨다. PEG-CN을 0.84g 수득한다. IR에 의해 클로라이드 밴드가 없는 것으로 확인되었다.
분석 : 이론치 - N, 0.69
실험치 - N, 0.35
[Ⅲ. OKT3 표지(이미데이트 방법)]
OKT3는 인체 T 세포 항원 수용체와 관련이 있는 200,000 달톤 단백질과 반응하는 IgG2a쥐 단클론 항체이다. 4㎎의 OKT3를 pH 9.2인 4㎖의 0.1M 보레이트 완충액에 도입시킨다. 반응물에 첨가되는 PEG-이미데이트의 양은 목적하는 개질 정도에 따라 달라진다. 일반적으로 15㎎을 가하고; 2시간후 필요하다면 추가로 15㎎의 PEG-이미데이트를 가한다. 실온에서 4시간후 반응 혼합물을 냉각실에서 밤새 놓아둔다. PEG-OKT3를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 30,000MW 컷-오프 멤브레인(cut-off membrance)을 사용한 반복 세척/농축에 의해 비반응 PEG로부터 분리해낸다. 치환된 양을 ZorbaxTMGF-450 또는 ZorbaxTMGF-250 컬럼을 사용하는 HPLC 겔 여과에 의해 측정한다.
유리된 아미노 그룹은 문헌 [Stocks, S.J., Jones, A.J.M., Ramey, C.W., 및 Brooks, D.E. (1986) Anal. Biochem. 154 : 232-234]의 형광 측정 분석방법에 따라 측정한다.
[Ⅳ. OKT3 표지]
[(N-하이드록시숙신이미드 에스테르 방법)]
PEG-이미데이트 대신 PEG-N-하이드록시숙신이미드를 사용하는 것을 제외하고는 PEG-이미데이트에 대한 상기 방법과 동일하다.
[Ⅴ. 표지된 OKT3의 생물학적 활성]
PEG-이미데이트 및 PEG-N-하이드록시숙신이미드에 의해 개질된 OKT3 분자의 생물학적 활성을 비교한다. OKT3는 효능있는 유사 분열 촉진성을 지닌다[참조 : Van Wauwe, J.P., De Mey, J.R., 및 Goossens, J.G. (1980) J. Immunol. 124, 2708-2713].
생물학적 활성에 대한 PEG 개질의 효과를 결정하고 생물학적 활성에 대해 항체에 대한 결합 PEG의 두 개의 상이한 방법을 비교하기 위하여, 마이토젠(mitogen) 분석을 수행한다. 이 분석법은 인체 말초 T 림파구를 분리하고 이 세포를 OKT3 및 PET-OKT3의 농도를 달리하여 2×106세포/㎖에서 4일동안 배양시키는 것으로 이루어진다. 그후 분쇄 티미딘을 세포 배양물에 가한다. 밤새 배양한 후 세포를 수집하여 계수한다.
[표 1]
* 분석 HPLC 겔 여과/유리 아민 분석으로 측정
** Im-5가 이미데이트 결합 PEG 5000인 경우에, NHS-5는 N-하이드록시숙신이미드 결합 PEG 5000이고, Im-2는 이미데이트 결합 PEG 2000이며, NHS-2는 N-하이드록시숙신이미드 결합 PEG 2000이다.
OKT3에 대한 이미데이트-PEG 결합 및 OKT3에 대한 N-하이드록시숙신이미드-PEG 결합간의 유사분열 촉진 활성의 차이가 상기 표 1에 기술되어 있다. 적합한 정도로 개질된 상태 내지 높은 수준으로 개질된 상태, 즉 30-7090에서, 이미데이트-PEG 개질된 OKT3는 숙신이미드-PEG 개질된 OKT3보다 유사분열촉진 활성이 월등히 더 크다. 따라서, 이미데이트-PEG결합에 의한 것과 같이 개질시 양전하가 보존되는 경우가 분자량 2000 내지 5000의 PEG에 대해 보여진 바와같이, 통상적으로 사용되는 숙신이미드-PEG(개질시 전하가 보존되지 않음)보다 생물학적 활성 보유 능력이 더 크다.
[Ⅵ. PEG-에리트로포이에틴]
재조합에 의하여 생성된 인체 에리트로포이에틴(EP0)을 이미데이트-PEG, 숙신이미드-PEG, 트레실-PEG로 개질시킨다. 이미데이트-PEG 및 숙신이미드-PEG를 사용하는 개질은 pH 8.2 또는 9.3에서 수행한다. 트레실-PEG를 사용하는 개질은 pH 7.5, 8.2 또는 9.3에서 수행한다.
대표적인 실험에서, EP0(0.5㎎)를 pH 7.5인 0.8㎖의 0.05M 포스페이트 완충액/0.5M NaCl, 또는 pH 9.3인 0.8㎖의 0.1M 보레이트 완충액에 도입시킨다. 혹종의 경우에 완충액은 0.1%의 SDS를 함유한다. 적합한 활성 그룹을 갖는 10㎎의 PEG를 EP0 용액에 가한다. 반응을 2시간동안 진행시킨 후, EP0에 대한 개질량을 증가시킬 필요가 없는 경우에는 추가로 유사하게 활성화된 PEG를 첨가한다. PEG-EP0 유도체를 pH 7의 0.1M 포스페이트 완충액으로 용출시키는 ZorboxTMGR-250 컬럼을 사용하여 HPLC 겔 여과에 의해 분석한다.
PEG-2000 (분자량 2000의 PEG)을 사용함으로써 분석 HPLC 상에 하나의 주요 단백질 피크가 검출되는 것으로 확인되었다. 세 개의 상이한 결합제를 갖는 PEG-5000을 사용한 경우에, 상당한 양의 비반응 EP0가 남아 있었고 개질된 EP0를 나타내는 두 개의 주요 피크가 검출되었다. 따라서 PEG-2000을 사용하게 되면 PEG-5000 보다 더 완전한 반응 생성물을 수득할 수 있게 된다.
EP0-PEG 유도체를 포스페이트 완충액(소량의 아지드 함유)으로 용출시키는 SephacrylS-200-HR 컬럼(1㎜×45㎜)을 사용하여 겔 여과에 의해 정제한다.
PEG-EP0 유도체를 EP0 수용체를 표현하는 쥐 세포주를 사용하여 생물학적 활성에 대해 분석한다. 상기 세포주는 증식 EP0에 의존한다. 분석법을 이하 기술한다. 세포(106/㎖)를 EP0 부재하에서 24시간동안 증식시킨 후 EP0 또는 PEG-EP0를 가한다. 세포를 42시간 동안 배양한 후, 분쇄 티미딘을 세포에 가한다. 6시간 후 세포를 수집하여 계수한다. 티미딘의 소모량에 의해 세포 증식을 결정한다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
* Im 은 이미데이트 활성된 PEG이고, Trs는 트레실 활성화된 PEG이며, NHS는 숙신이미드 활성화된 PEG이다.
** #PEGs는 EP0의 단일 분자에 결합된 PEG(분자량 2000)분자의 평균양이다.
*** 활성도는 EP0가 100% 활성이라는 조건하에 최대 세포 증식 또는 1/2-최대 세포 증식에 필요한 EP0 또는 PEG-EP0의 양이다.
[표 3]
* Im 은 이미데이트 활성된 PEG이고, Trs는 트레실 활성화된 PEG이며, NHS는 숙신이미드 활성화된 PEG이다.
** #PEGs는 EP0의 단일 분자에 결합된 PEG(분자량 5000)분자의 평균양이다.
*** 활성도는 EP0가 100% 활성이라는 조건하에 최대 세포 증식 또는 1/2-최대 세포 증식에 필요한 EP0 또는 PEG-EP0의 양이다.
상기 표 2 및 3에서 알 수 있는 바와같이, 이미데이트-PEG는 5 또는 8의 PEGs를 가짐으로써 트레실 또는 숙신이미드 그룹으로 활성화된 PEG보다 활성도가 훨씬 더 크다. 트레실-PEG 또는 숙신이미드-PEG와 비교해서 이미데이트-PEG의 생물학적 활성이 증가한 것은 개질시 양전하가 보존된 것으로 설명할 수 있다. 또한, 양전하가 주쇄로부터 약간 떨어져 나와 PEG에 의해 보호받지 못함으로써 수용체와의 상호작용이 더욱 용이해지는 것도 중요한 이유중의 하나이다.
PEG-개질된 알카리 포스파타제의 효소 활성에 대해 네 개의 상이한 PEG 결합(트레실, 숙신이미딜 숙시네이트, 염화 시아누르 및 카보닐 디이미다졸)이 미치는 효과를 비교한 조사에서, 숙신이미딜 숙신네이트가 개질에 대해 가장 활성적인 효소인 것으로 밝혀졌다[참조 : Yoshida, K. 및 Harris, J.M. J. Bioact. Compatible Polym. 4 : 17-24 (1989)]. PEG로 아스파라기나제를 개질시켰을 때 또한 숙신이미딜 숙시네이트가 PEG-염화시아누르보다 결합에 대해 효소 불활성화를 상당히 덜 시키는 것으로 밝혀졌다[참조 : Abuchowski A., Kazo, G.M., Verhoest, C.R., Es. T.V., Kafkewitz, D., Nucci M.L., Viau, A.T., 및 Davis, F.F, Cancer Biochem, Biophys. 7: 175-186 (1984)]. EP0 및 OKT3를 연구한 본 발명에서는 이미데이트 결합 그룹이 숙신이미딜 숙시네이트 결합 그룹보다 더 효과적이었으며, 따라서 PEG-유도체는 선행기술에서 가장 뛰어난 PEG 결합 그룹보다 월등한 것으로 확인되었다.
숙신이미드-PEG 및 트레실-PEG 에스테르로부터 생성된 EP0 유도체의 활성에 관한 표 2 및 (3)의 결과는 주목할 만한 것이다. 트레실-PEG 및 숙신이미드-PEG EP0 유도체는 이미데이트-PEG EP0 유도체보다 덜 활성적이지만, 리신 잔기에 대한 결합으로 양전하가 소실되는 EP0-PEG 유도체에 대해 기대되는 것보다는 덜 활성적이다(트레실-PEG는 이급 아민을 형성하고 숙신아미드-PEG는 아미드 결합을 형성한다). 따라서, 수용성 중합체(수용성 중합체는 화합물(Ⅰ)에서 P에 대한 정의와 동일하다)의 트레실 또는 숙신이미드 에스테르로 EP0(천연 공급원으로부터 분리되거나, 유전자적으로 처리된 세포로부터 생성되거나, 다양한 시험관내 방법에 의해 합성된 인체 또는 비인체의 것)를 유도체화시킬 수도 있다.
상술한 내용은 당업계의 숙련자들이 본 발명을 실행할 수 있을 만큼 충분한 정도로 기술되었다. 실제로, 약품 분야 또는 이와 관련된 분양의 숙련자들에게는 명백한 것으로 본 발명을 실행하기 위한 상기 내용은 하기 특허청구의 범위내에서 다양하게 변형될 수 있다.

Claims (32)

  1. 일반식 (Ⅰ)의 화합물상기식에서, P는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는 수용성 중합체이다.
  2. 제1항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 화합물.
  3. 제1항에 따른 화합물을 폴리펩티드와 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 적어도 하나의 수용성 중합체를 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장인자, 효소, 백신항원 및 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 폴리펩티드가 항체이고, 상기 언급된 반응 단계전에 항체를 항체상의 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물과 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 폴리펩티트가 효소이고, 상기 언급된 반응 단계전에 폴리펩티드를 효소에 대한 기질과 혼합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제3항의 방법에 의해 개질된 폴리펩티드.
  8. 제7항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물.
  9. 일반식 (Ⅲ)의 화합물.상기 식에서, n은 1 내지 x이고, x는 Z 중의 리신 잔기의 수보다 1이 더 크며, P는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는 수용성 중합체이고, Z는 폴리펩티드이며, 여기에서 Z는 Z 중의 리신 잔기를 통해 화합물의 비-폴리펩티드 부분에 공유적으로 결합된다.
  10. 제9항에 있어서, 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 화합물.
  12. 제10항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 화합물.
  13. 제10항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물.
  14. 일반식 (Ⅱ)의 화합물.상기 식에서, P는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는 수용성 중합체이고, m은 1 내지 20이다.
  15. 제14항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 화합물.
  16. 제14항에 따른 화합물을 폴리펩티드와 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 적어도 하나의 수용성 중합체를 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 폴리펩티드가 항체이고, 상이 언급된 반응단계전에 항체를 항체상의 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물과 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 폴리펩티드가 효소이고, 상기 언급된 반응 단계전에 폴리펩티드를 효소에 대한 기질과 혼합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제16항의 방법에 의해 개질된 폴리펩티드.
  21. 제20항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물.
  22. 일반식 (Ⅳ)화합물.상기식에서, m은 1 내지 20이고, n은 1 내지 x이며, x는 Z중의 리신 잔기의 수보다 1이 더 크며, P는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는 수용성 중합체이고, Z는 폴리펩티드이며, 여기에서 Z는 Z중의 리신 잔기를 통해 화합물의 비-폴리펩티드 부분에 공유적으로 결합된다.
  23. 제22항에 있어서, 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 화합물.
  24. 제23항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 화합물.
  25. 제23항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 화합물.
  26. 제22항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성.
  27. 일반식 (Ⅴ)의 화합물.상기 식에서, P는 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는 수용성 중합체이고, n은 1 내지 20이다.
  28. 제27항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 화합물.
  29. 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는, 적어도 하나의 수용성 중합체의 트레실 에스테르에 의해 개질된 에리트로포이에틴 분자.
  30. 제29항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜과 에리트로포이에틴 분자.
  31. 폴리에틸렌 글리콜 단일 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기에서 단일 중합체 및 공중합체는 한쪽 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르아미드]로 이루어진 그룹중에서 선택되는, 적어도 하나의 수용성 중합체의 트레실 에스테르에 의해 개질된 에리트로포이에틴 분자.
  32. 제31항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 에리트로포이에틴 분자.
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