ES2390816T3 - N,N-bis-(2-hidroxietil) glicina amida como ligador en profármacos conjugados con polímeros - Google Patents

Abstract

Un profármaco polimérico que comprende al menos un polímero unido vía al menos un enlace permanente con un ligador de bicina, que se une vía un enlace temporal con una amina que contiene una fracción biológicamente activa, en donde el profármaco o el correspondiente reactivo del ligador del profármaco polimérico tienen la siguiente estructura: en donde T es D o A; siendo D un residuo de una amina que contiene una fracción biológicamente activa, en donde D se conecta con el ligador del profármaco polimérico a través de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fracción biológicamente activa; y siendo A un grupo saliente; X es una fracción espaciadora tal como R13-Y1; Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contiene un par de electrones libres o está ausente;

Description

N,N-bis-(2-hidroxietil) glicina amida como ligador en profarmacos conjugados con polimeros.

Campo

La presente invencion se refiere a profarmacos polimericos que tienen enlaces temporales con grupos amino de entidades biologicamente activas tales como peptidos, proteinas, productos naturales o compuestos quimicos sinteticos.

Antecedentes

Por lo general, los polimeros en la administracion del farmaco se utilizan, ya sea de una manera no-covalente, con el farmaco formulado fisicoquimicamente en una mezcla solvente-polimero, o mediante una union covalente permanente de un polimero reactivo con uno de los grupos funcionales del farmaco.

La encapsulacion no-covalente del farmaco se ha aplicado a las formulaciones de deposito para perfiles de accion prolongada. Por lo general, el farmaco se mezcla con el material del polimero y se procesa de tal manera, que el farmaco llega a ser distribuido por todo el material del polimero a granel. Tales agregados polimero-farmaco se pueden formar como microparticulas que se administran como una suspension inyectable o los agregados polimerofarmaco se formulan como geles que se administran en una inyeccion en bolo unica. La liberacion del farmaco ocurre cuando el polimero se hincha o la degradacion del polimero permite la difusion del farmaco al exterior del polimero a granel. Tales procesos de degradacion pueden ser autohidroliticos o catalizados por enzimas. Un ejemplo de un farmaco comercializado basado en administracion en bolo de un gel farmaco-polimero es Lupron Depot. Un ejemplo de un farmaco comercializado basado en microparticulas suspendidas es Nutropin Depot.

Una desventaja de este enfoque no-covalente es que con el fin de evitar la liberacion del farmaco no controlada, del tipo rafaga, la encapsulacion del farmaco tiene que ser altamente eficiente mediante la creacion de ambiente muy concurrido estericamente. La restriccion de la difusion de un molecula del farmaco sin unir, soluble en agua requiere contactos fuertes de van der Waals, frecuentemente mediados a traves de fracciones hidrofobas. Muchos farmacos conformacionalmente sensibles, tales como proteinas o peptidos, se presentan disfuncionales durante el proceso de encapsulacion y/o durante el posterior almacenamiento del farmaco encapsulado. Ademas, dichos farmacos que contienen amino, experimentan facilmente reacciones secundarias con productos de degradacion del polimero (ver, por ejemplo, D.H. Lee et al., J. Contr. Rel., 2003, 92, 291-299). Ademas, la dependencia del mecanismo de liberacion del farmaco tras la biodegradacion puede causar variabilidad entre pacientes.

Alternativamente, los farmacos pueden ser conjugados con los polimeros a traves de enlaces covalentes permanentes. Este enfoque se aplica a varias clases de moleculas, desde las llamadas moleculas pequenas, a los productos naturales hasta grandes proteinas.

Muchos agentes medicinales de molecula pequena, como alcaloides y agentes anti-tumor, muestran baja solubilidad en fluidos acuosos. Una forma para solubilizar estos compuestos de molecula pequena es conjugar los compuestos de molecula pequena con polimeros hidrofilicos (solubles en agua). Para este fin se ha descrito una variedad de polimeros solubles en agua, tales como albumina de suero humana, dextrano, lecitinas, poli (etileno glicol) (PEG), poli(estireno-co-anhidrido maleico), poli(N-hidroxipropilmetacrilamida), poli(divinil eter co-anhidrido maleico), acido hialuronico (R. Duncan, Nature Rev. Drug Disc., 2003, 2, 347-360).

Un desafio importante en la terapia del cancer es dirigir selectivamente los agentes citotoxicos a las celulas tumorales. Un metodo prometedor para acumular agentes contra el cancer de molecula pequena en tejido tumoral y disminuir los efectos secundarios indeseables de estos agentes, es la union de la citotoxina a un portador macromolecular. La orientacion pasiva de conjugados del farmaco polimerico a tumores se basa en el asi llamado efecto de retencion y permeabilidad mejorada (EPR), segun se describe por Matsumura, Y. and Maeda, H., in Cancer Res., 1986, vol 6, pp 6387-6392. Como resultado, varios conjugados polimero-farmaco han entrado en ensayos clinicos como agentes contra el cancer.

La modificacion covalente de moleculas biologicas con poli(etileno glicol) se ha estudiado ampliamente desde los finales de 1970. Las asi llamadas proteinas PEGiladas han demostrado eficacia terapeutica mejorada mediante el incremento de la solubilidad, reduciendo la inmunogenicidad, y aumentando la circulacion de la vida media in vivo debido a depuracion renal reducida y la proteolisis por enzimas (ver, por ejemplo, Caliceti P.,Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev. 2003, 55, 1261-1277).

Sin embargo, muchas moleculas biologicas tales como INFalfa2, saquinavir o somatostatina son inactivas o muestran actividad biologica disminuida cuando el polimero se conjuga covalentemente con el farmaco (T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904).

Con el fin de evitar la deficiencia impuesta por ya sea las mezclas del polimero no-covalente o la union covalente permanente, puede ser preferible emplear un tecnologia de profarmacos para la conjugacion quimica del farmaco con el portador del polimero. En tales profarmacos polimericos, las fracciones biologicamente activas (farmacos, terapeutico, molecula biologica, etc.) por lo general se unen a la fraccion del portador polimerico mediante un enlace temporal formado entre la fraccion portadora y un grupo hidroxi, amino o carboxi de la molecula del farmaco.

Los profarmacos son agentes terapeuticos que casi son inactivos per se, pero previsiblemente se transforman en metabolitos activos (ver B. Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Profarmaco Metabolism, Wiley-VCH, 2003, page 4). La tecnologia de profarmaco portador se puede aplicar de tal manera que el farmaco se libera in vivo del polimero con el fin de recuperar su actividad biologica. La actividad biologica reducida del profarmaco segun se compara con el farmaco liberado, es ventajosa si se desea, una liberacion controlada o lenta del farmaco. En este caso, una cantidad relativamente grande del profarmaco se puede administrar sin efectos secundarios concomitantes y el riesgo de sobredosis. La liberacion del farmaco se produce con el tiempo, reduciendo asi la necesidad de administracion repetida y frecuente del farmaco.

La activacion del profarmaco puede ocurrir por escision enzimatica o no-enzimatica del enlace temporal entre el portador y la molecula del farmaco, o una combinacion secuencial de ambos, i.e. una etapa enzimatica seguida por un reordenamiento no-enzimatico, como se muestra en la Fig. 1. En un ambiente in vitro libre de enzima tal como una solucion reguladora acuosa, un enlace temporal tal como un ester o amida puede experimentar hidrolisis, pero la correspondiente velocidad de hidrolisis puede ser demasiado lenta y no es util terapeuticamente. En un ambiente in-vivo, las estearasas o amidasas por lo general estan presentes y las estearasas y amidasas pueden causar una aceleracion catalitica significante de las cineticas de hidrolisis de dos veces hasta varias ordenes de magnitud (ver, por ejemplo, R.B. Greenwald et al. J.Med.Chem. 1999, 42 (18), 3857-3867).

Definiciones basadas en IUPAC

(segun se indica en http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem/ (consultada el 8 de Marzo del 2004)

Profarmaco

Un profarmaco es cualquier compuesto que sufre una biotransformacion, antes de mostrar sus efectos farmacologicos. Por lo tanto, los profarmacos se pueden considerar como farmacos que contienen grupos protectores no-toxicos especializados utilizados de manera transitoria para alterar o eliminar las propiedades indeseables en la molecula principal.

Profarmaco unido al portador (Profarmaco portador)

Un profarmaco unido al portador es un profarmaco que contiene un enlace temporal de una sustancia activa dada con un grupo portador transitorio que produce propiedades farmacocineticas o fisicoquimicas mejoradas y que se puede retirar facilmente in vivo, usualmente mediante una escision hidrolitica. Esto se muestra graficamente en la Fig. 1.

Profarmaco en cascada

Un profarmaco en cascada es un profarmaco portador, por el cual la escision del grupo portador se hace efectiva solo despues de desenmascarar un grupo de activacion.

Profarmaco en cascada polimerico

Un profarmaco en cascada polimerico es un profarmaco portador que contiene un enlace temporal de una sustancia activa dada, con un grupo portador polimerico transitorio por el cual la escision del portador se hace efectiva solo despues de desenmascarar un grupo de activacion.

Profarmaco bioprecursor

Un profarmaco bioprecursor es un profarmaco que no implica el enlace con un grupo portador, sino que resulta de una modificacion molecular del principio activo en si mismo. Esta modificacion genera un nuevo compuesto, capaz de ser transformado metabolica o quimicamente, siendo el compuesto resultante el principio activo.

Biotransformacion

La biotransformacion es la conversion quimica de sustancias por organismos vivos o preparaciones enzimaticas.

Otras definiciones:

Ligador

Los grupos o estructuras quimicas que controlan la escision, presentes en profarmacos portador que no se proporcionan por la entidad portadora ni por el farmaco.

Los profarmacos son de dos clases, bioprecursores y profarmacos unidos al portador. Los bioprecursores no contienen un grupo portador y se activan por la creacion metabolica de un grupo funcional. En los profarmacos unidos al portador la sustancia activa se une a una fraccion portadora mediante un enlace temporal. El portador puede ser inerte biologicamente (por ejemplo PEG) o puede tener propiedades de focalizacion (por ejemplo anticuerpos). Esta invencion se relaciona con los profarmacos polimericos macromoleculares o unidos al portador, donde el portador por si mismo es una macromolecula tal como una proteina portadora o polisacarido o polietileno glicol.

La escision de un profarmaco portador genera una entidad molecular (farmaco) de bioactividad aumentada y al menos un subproducto, el portador. Despues de la escision, la entidad bioactiva revelara al menos un conjugado previamente y por consiguiente un grupo funcional protegido, y la presencia de este grupo por lo general contribuye a la bioactividad del farmaco.

Con el fin de implementar un estrategia del profarmaco, al menos un cierto grupo funcional en la molecula del farmaco se emplea para la union del polimero portador. Los grupos funcionales preferidos son grupos hidroxilo o amino. Por consiguiente, tanto la fijacion quimica como las condiciones de hidrolisis dependen del tipo de grupo funcional empleado.

En un mecanismo simple de escision de una-etapa, el enlace temporal del profarmaco por lo general se caracteriza mediante una dependencia enzimatica o labilidad intrinseca. La susceptibilidad de este enlace a la hidrolisis en un ambiente acuoso con o sin catalisis de la enzima controla la cinetica de escision entre el portador polimerico y el farmaco.

Los diversos profarmacos macromoleculares se describen en la literatura, cuando el enlace temporal es un enlace ester labil. En estos casos, el grupo funcional proporcionado por la entidad bioactiva es cualquiera un grupo hidroxilo

o un acido carboxilico (por ejemplo Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, "A Hyaluronic Acid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells", Biomacromolecules 2000, 1, 208-218, J Cheng et al, Synthesis of Linear, beta-Cyclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017,

R.

Bhatt et al, Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poly(L-glutamic acid) Conjugates of 20(S)-Campthothecin,

J.

Med. Chem. 2003, 46, 190-193 ; R.B. Greenwald, A. Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667; B. Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003,Chapter 8).

Especialmente para biomacromoleculas terapeuticas, pero tambien para ciertos farmacos de molecula pequena, puede ser deseable unir el portador macromolecular con los grupos amino de la entidad bioactiva (i.e. N-terminal o grupos amino lisina de proteinas). Este sera el caso si el enmascaramiento de la bioactividad del farmaco requiere la conjugacion de un cierto grupo amino de la entidad bioactiva, por ejemplo un grupo amino localizado en un centro activo o una region o epitope involucrado en el enlace receptor. Tambien, durante la preparacion del profarmaco, los grupos amino se pueden dirigir mas de forma quimioselectiva y servir como una mejor maniobra para la conjugacion del portador y el farmaco, debido a su mayor nucleofilicidad en comparacion con los grupos hidroxilicos o fenolicos. Esto es particularmente cierto para las proteinas que pueden contener una gran variedad de diferentes funcionalidades reactivas, cuando las reacciones de conjugacion no-selectiva conducen a mezclas de producto nodeseadas que requieren purificacion y caracterizacion extensiva y puede reducir el rendimiento de la reaccion y la eficiencia terapeutica del producto.

Los enlaces de amida asi como los carbamatos alifaticos usualmente son mucho mas estables contra la hidrolisis que los esteres de enlace, y la velocidad de escision del enlace amida deberia ser muy lenta para la utilidad terapeutica en un profarmaco unido al portador. Por lo tanto, es ventajoso adicionar componentes quimicos estructurales tales como grupos vecinos con el fin de ejercer control sobre la capacidad de division del enlace profarmaco amida. Tales estructuras quimicas adicionales que controlan la escision, que no se proporcionan ni por la entidad portadora ni por el farmaco se llaman "ligadores". Los ligadores del profarmaco pueden tener un efecto fuerte en la velocidad de hidrolisis de un enlace temporal dado: La variacion de la naturaleza quimica de estos ligadores permite la ingenieria de las propiedades del enlace en gran medida. Varios ejemplos se han publicado de la activacion del profarmaco de fracciones biologicamente activas que contienen amina, mediante enzimas especificas de liberacion dirigida. Un prerrequisito para la dependencia enzimatica es que la estructura del ligador muestra una fraccion estructural que se reconoce como un sustrato por una enzima endogena correspondiente (tal como se muestra en la Fig. 2). En estos casos, la escision del enlace temporal ocurre en un proceso de una etapa que se cataliza por la enzima. G. Cavallaro et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12, 143-151 describe la liberacion enzimatica de un agente antitumoral por la proteasa plasmina. La citarabina se acopla via la secuencia tripeptido D-Val-Leu- Lys con el polimero alfa, beta-poli(N-hidroxietil)-DL-aspartamida (PHEA). La liberacion enzimatica de la citarabina se realiza por la proteasa plasmina cuya concentracion es relativamente alta en diferentes clases de masa tumoral.

La aceleracion catalizada de la enzima de la escision del profarmaco es una caracteristica deseable para las aplicaciones dirigidas de organos o celulares. La liberacion dirigida de la entidad bioactiva se realiza, si una enzima, que divide selectivamente el enlace, esta presente especificamente en el tipo de celula o de organo elegido para el tratamiento.

Una propiedad tipica de un enlace temporal dependiente de la enzima es su estabilidad con respecto a la hidrolisis. El enlace temporal dependiente de la enzima por si mismo no sufrira autohidrolisis a una velocidad que liberaria el farmaco a tal grado que el efecto terapeutico del farmaco puede ser inducido en un regimen de dosificacion normal. Es solo en la presencia de la enzima, que el ataque de la enzima en el enlace temporal dependiente de la enzima causa una significante aceleracion de escision del enlace temporal dependiente de la enzima y concomitantemente un aumento de la concentracion del farmaco libre.

Se han descrito, otros ejemplos de profarmacos polimericos antitumorales activados por enzimas especificas como beta lactamasa (R. Satchi-Fainaro et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 797-804) y cisteina proteasas como catepsina B (R. Duncan et al. J. Contr. La liberacion 2001, 74, 135-146). Wiwattanapatapee et al. (2003) esboza un profarmaco dendrimero para la administracion colonica del acido 5-aminosalicilico. La molecula del farmaco se conjuga mediante un enlace azo con dendrimero PAMAM "generacion 3". El acido 5-aminosalicilico se libera en el colon por una enzima bacteriana llamada azo reductasa (W. R. Wiwattanapatapee, L. Lomlim, K. Saramunee, J. Controlled Release, 2003, 88: 1-9).

Un inconveniente importante de predominantemente escision enzimatica es la variabilidad entre pacientes. Los niveles de enzimas pueden diferir significantemente entre individuos resultando en variacion biologica de activacion del profarmaco mediante la escision enzimatica. Los niveles de enzimas tambien pueden variar dependiendo del sitio de administracion. Por ejemplo se conoce que en el caso de inyeccion subcutanea, ciertas areas del cuerpo producen efectos terapeuticos mas predecibles que otros. Para reducir este efecto impredecible, la escision noenzimatica o catalisis intramolecular es de particular interes (ver, por ejemplo, B. Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism,Wiley-VCH, 2003, page 5).

Ademas, es dificil establecer una correlacion in vivo-in vitro de las propiedades farmacocineticas para tal profarmaco dependiente de las enzimas unidas al portador. En la ausencia de una fiable optimizacion de correlacion in vivo-in vitro de un perfil de liberacion se convierte en una tarea engorrosa.

Otros profarmacos polimericos que emplean enlaces temporales con grupos amino presentes en la molecula del farmaco se basan en un mecanismo de cascada. La escision de cascada esta permitida por compuestos ligadores que se componen de una combinacion estructural de un grupo de enmascaramiento y un grupo de activacion. El grupo de enmascaramiento se une al grupo de activacion por medio de un primer enlace temporal tal como un ester

o un carbamato. El grupo de activacion se une a un grupo amino de la molecula del farmaco a traves de un segundo enlace temporal, por ejemplo un carbamato. La estabilidad, o susceptibilidad a la hidrolisis del segundo enlace temporal (por ejemplo carbamato) es dependiente de la presencia o ausencia del grupo de enmascaramiento. En la presencia del grupo de enmascaramiento, el segundo enlace temporal es altamente estable y poco probable que libere el farmaco con cinetica terapeuticamente util. En la ausencia del grupo de enmascaramiento, este enlace se convierte en muy labil, causando una escision rapida y la liberacion del farmaco.

La escision del primer enlace temporal es la etapa limitante de la velocidad en el mecanismo de cascada. Esta primera etapa puede inducir un reordenamiento molecular del grupo de activacion tal como 1,6-eliminacion. El reordenamiento hace el segundo enlace temporal mucho mas labil, que se induce su escision. Idealmente, la velocidad de escision del primer enlace temporal es identica a la velocidad de liberacion deseada para la molecula del farmaco en un escenario terapeutico dado. Ademas, es deseable que la escision del segundo enlace temporal sea sustancialmente instantanea despues de que su labilidad se ha inducido por la escision del primer enlace temporal (ver Fig. 3).

Ejemplos de tales profarmacos polimericos basados en eliminacion 1,6 se han descrito por R.B. Greenwald et al. J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667 & PCT Patent Application WO-A-99/30727, F.M.H. DeGroot et al. (WO02083180 and WO04043493A1), y D. Shabat et al. (WO04019993A1).

Ejemplos de profarmacos polimericos que contienen amino basados en lactonizacion trimetil bloqueada se describen por R.B. Greenwald et al. J.Med.Chem. 2000, 43(3), 457-487; PCT Patent Application No. WO-A-02/089789). En este sistema de profarmaco, el acido o-hidroxifenil-dimetilpropionico sustituido se une a PEG por un grupo ester, carbonato, o carbamato como un primer enlace temporal y con grupos amino de moleculas del farmaco por medio de un enlace amida como segundo enlace temporal. La etapa determinante de la velocidad en la liberacion del farmaco es la escision enzimatica del primer enlace. Esta etapa se sigue por la escision de amida rapida mediante la lactonizacion, liberando un subproducto de lactona aromatica.

La desventaja en los sistemas de profarmaco mencionados anteriormente descritos por Greenwald, DeGroot y Shabat es la liberacion de subproductos de molecula pequena aromaticos altamente reactivos y potencialmente toxicos como metiluros de quinona o lactonas aromaticas despues de la escision del enlace temporal. Las entidades potencialmente toxicas se liberan en una estequiometria 1:1 con el farmaco y pueden asumir altas concentraciones in vivo.

Un grupo diferente de profarmacos en cascada con grupos de activacion aromaticos basados en la eliminacion 1,6 estructuralmente separa el grupo de enmascaramiento y el portador. Esto se puede lograr, empleando un enlace permanente entre el portador del polimero y el grupo de activacion. Este enlace estable no participa en el mecanismo de escision en cascada. Si el portador no esta sirviendo como un grupo de enmascaramiento y el grupo de activacion se acopla al portador por medio de un enlace estable, se evita la liberacion de subproductos potencialmente toxicos tales como el grupo de activacion. La union estable del grupo de activacion y el polimero, tambien suprime la liberacion de intermedios farmaco-enlace con farmacologia indefinida.

Antczak et al. (Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48) describe un reactivo que forma la base de un sistema en cascada del profarmaco macromolecular para moleculas del farmaco que contiene amina. En esta tecnologia un anticuerpo sirve como el portador, un enlace estable conecta el anticuerpo a un grupo de activacion, que lleva un grupo de enmascaramiento enzimaticamente disociable. Tras la eliminacion enzimatica del grupo de enmascaramiento ligado al ester, un segundo enlace temporal divide y libera el compuesto farmaco, como se muestra en la Fig. 4.

D. Shabat et al. (Chem. Eur. J. 2004, 10, 2626-2634) describe un sistema de profarmaco polimerico basado en un grupo de activacion de acido mandelico. En este sistema el grupo de enmascaramiento se une al grupo de activacion por un enlace carbamato. El grupo de activacion se conjuga permanentemente a un polimero, poliacrilamida, via un enlace amida. Despues de la activacion enzimatica del grupo de enmascaramiento por un anticuerpo catalitico, el grupo de enmascaramiento se divide por ciclacion y el farmaco se libera. El grupo de activacion esta conectado al polimero poliacrilamida despues de la liberacion del farmaco.

M.-R Lee et al. describe (Angew. Chem. 2004, 116, 1707-1710) un sistema de profarmaco similar, basado en un grupo de activacion de acido mandelico y un grupo de enmascaramiento ligado al ester enzimaticamente disociable.

Sin embargo, en estos ligadores una etapa de eliminacion 1,6 aun genera un intermedio aromatico altamente reactivo. Incluso si la fraccion aromatica permanece permanentemente unida al portador polimerico, se pueden causar las reacciones secundarias con efectos inmunogenicos o potencialmente toxicos.

Por estas razones, existe una necesidad de proporcionar novedosas tecnologias de enlace para la formacion de profarmacos polimericos de amina que contienen agentes activos, utilizando ligadores alifaticos del profarmaco que no son dependientes de la enzima y no generan intermedios aromaticos reactivos durante la escision.

A.J. Garman et al. (A.J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365 1987) utiliza PEG5000anhidrido maleico para la modificacion reversible de grupos amino en activador del tejido del tipo plaminogeno y uroquinasa. La regeneracion de la enzima funcional a partir de un conjugado PEG-uPA bajo la incubacion con solucion reguladora pH 7.4 mediante la escision del enlace de acido maleamico despues de la cinetica de primer orden con una vida media de 6.1 h. Una desventaja del enlace de acido maleamico es la falta de estabilidad del conjugado a valores de pH mas bajos. Esto limita la aplicabilidad del enlace de acido maleamico con agentes activos que sean estables a valores de pH basicos (altos), como purificacion del conjugado del polimero del agente activo tiene que ser realizado bajo condiciones basicas (pH alto), para prevenir la escision prematura del profarmaco.

Mas recientemente, R.B. Greenwald et al. (Greenwald et al. J. Med.Chem. 2004, 47, 726-734 and WO 2004/108070A2) describieron un sistema de profarmaco en cascada PEG basado en enlace N,N-bis-(2hidroxietil)glicina amida (bicina). En el sistema descrito en Greenwald et al paper and patent application, dos moleculas portadoras PEG se unen via enlaces temporales a una molecula de bicina acoplada a un grupo amino de la molecula del farmaco. La primera de las dos etapas en la activacion del profarmaco es la escision enzimatica de los primeros enlaces temporales que conectan ambas moleculas portadoras PEG con los grupos hidroxi del grupo de activacion bicina. Los diferentes enlaces entre PEG y bicina se describen resultando en diferentes cineticas de activacion del profarmaco. La segunda etapa en activacion del profarmaco es la escision del segundo enlace temporal que conecta el grupo de activacion bicina con el grupo amino de la molecula del farmaco (Fig. 5). La principal desventaja de este sistema es la conexion del polimero con el ligador de bicina via enlaces temporales y la velocidad de hidrolisis lenta de este segundo enlace de amida bicina temporal (tl/2 > 3 h en solucion reguladora de fosfato) que resulta en la liberacion de un intermedio del profarmaco modificado con bicina que puede mostrar diferentes propiedades farmacocineticas, inmunogenicas, de toxicidad y farmacodinamicas, segun se compara con la molecula nativa principal del farmaco.

WO-A 2004/014424 describe conjugados polimericos liberables basados en ligadores biodegradables alifaticos.

5 International patent application WO-A 2004/085386, se relaciona con la sintesis de conjugados polimericos heterobifuncionales de alto peso molecular utiles en la focalizacion y la administracion de agentes terapeuticos.

WO-A 2006/065867 se relaciona con las inmunotoxinas del polimero-conjugado dirigidas al antigeno de la celula tumoral mesotelina.

Los polimeros y conjugados liberables hechos de estos, utiles para ampliar la vida circulante in vivo de materiales 10 biologicamente activos se revelan en WO-A 2006/066020.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion aborda las desventajas descritas anteriormente. La invencion provee los profarmacos polimericos caracterizados por la conexion de un polimero via un ligador de bicina con un grupo amino primario o secundario de una molecula del farmaco que contiene una amina, mediante la cual, el polimero se une al ligador de

15 bicina via un enlace permanente y el enlace entre el ligador de bicina y la molecula del farmaco que contiene la amina es el enlace temporal. La bicina se utiliza en esta aplicacion como sinonimo para N, N-bis(2-hidroxietil)-glicil o N, N-bis(2-hidroxietil)-glicina amida o N, N-bis(2-hidroxi) glicina. Debido a la presencia de un enlace permanente entre el portador y el ligador de bicina los profarmacos polimericos de acuerdo con la presente invencion se asegura la liberacion de las moleculas del farmaco nativas sin modificar (Fig. 6).

20 La invencion provee los profarmacos polimericos que comprenden al menos un polimero unido via al menos un enlace permanente con un ligador de bicina, que se une via un enlace temporal a un grupo amino primario o secundario de una amina que contiene la fraccion biologicamente activa, en donde el profarmaco o los correspondientes reactivos de ligador del profarmaco polimerico son de la Formula Ia, Ib, o Ic.

25 o

o en donde T, x, y R1 a R12 se definen a continuacion:

La liberacion del farmaco nativo de un profarmaco polimerico de acuerdo con la presente invencion, mediante la escision hidrolitica del residuo del polimero sustituido por bicina se ejemplifica por un profarmaco polimerico de acuerdo con la formula Ia donde R2 a R12 son hidrogeno.

Como se describe anteriormente, la liberacion del farmaco nativo a partir del portador polimerico se puede mediar mediante una etapa enzimatica o no-enzimatica, tal como hidrolisis dependiente del PH o ciclacion intramolecular. En la modalidad preferida de la invencion, la escision se realiza no-enzimaticamente. La vida media de la cinetica de escision en una solucion reguladora acuosa de pH 7.4 a 37 °C del profarmaco polimerico de acuerdo con la presente invencion es preferiblemente entre 3 horas y 6 meses, mas preferiblemente entre 1 dia y 3 meses, y mas preferiblemente entre 1 dia y 2 meses.

Definicion de x, T, R1 a R12 en la formula Ia, Ib, o Ic

En los profarmacos polimericos o los correspondientes reactivos de ligador del profarmaco polimerico de Formula Ia, Ib, o Ic, T es D o A.

Una modalidad es el reactivo del ligador del profarmaco polimerico de la presente invencion, en donde T es un grupo saliente A, para la conjugacion covalente con una fraccion biologicamente activa y unido con un portador.

En el caso, donde la estructura inventiva es un reactivo del ligador del profarmaco polimerico, T es A, y A es un grupo saliente. En una modalidad, A se selecciona del grupo de grupos salientes que consisten de cloro, bromo, fluor, nitrofenoxi, imidazolil, N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxibenzotriazolil, N-hidroxiazobenzotriazolil, pentafluorfenoxi, N-hidroxisulfosuccinimidil, o heteroarilo.

En el caso, donde la estructura inventiva es un profarmaco polimerico, T es D, y D es un residuo de una fraccion biologicamente activa que contiene una amina, incluyendo fracciones bioactivas o biopolimeros de molecula pequena como proteinas, polipeptidos y oligonucleotidos (ARN, ADN), acidos nucleicos de peptidos (PNA), y en donde D se conecta con el ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa.

Tener en cuenta, que en esta referencia la descripcion por lo general se hace a los profarmacos. Un profarmaco verdadero se encuentra cuando T es el residuo de la fraccion o material biologicamente activo que contiene amina. Si T es un grupo saliente A, entonces la formula representa un reactivo del ligador del profarmaco polimerico. Por simplicidad el reactivo del ligador del profarmaco polimerico tambien sera referido como profarmacos en esta descripcion. Se entendera por el contexto, si se indica un profarmaco verdadero o un reactivo del ligador del profarmaco polimerico.

Las fracciones bioactivas de moleculas pequenas organicas, incluyen fracciones tales como agentes activos del sistema nervioso central, anti-infecciosos, anti-neoplasicos, antibacterianos, anti-fungicos, analgesicos, anticonceptivos, anti-inflamatorios, esteroidales, vasodilatadores, vasoconstrictores, y agentes cardiovasculares con al menos un grupo amino primario o secundario. Ejemplos de tales compuestos son daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitoxantrona, aminoglutetimida, amantadina, diafenilsulfona, etambutol, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxazol, sulfaleno, clinafloxacina, moxifloxacina, ciprofloxaxina, enoxacina, norfloxacina, neomicina B, esprectinomicina, canamicina A, meropenem, dopamina, dobutamina, lisinopril, serotonina, carbutamida, acivicina.

En una modalidad, la fraccion biologicamente activa del profarmaco de la presente invencion se selecciona del grupo de fracciones biologicamente activas que consisten de agentes o biopolimeros de moleculas pequenas biologicamente activos. Preferiblemente, los biopolimeros se seleccionan del grupo de biopolimeros que consisten de proteinas, polipeptidos, oligonucleotidos y acidos nucleicos de peptidos.

Las proteinas y polipeptidos apropiados que tienen al menos un grupo amino libre incluyen ACTH, adenosina desaminasa, agalsidasa, albumina, alfa-1 antitripsina (AAT), inhibidor de la alfa-1 proteinasa (API), alteplasa, anistreplasa, ancrod serina proteasa, anticuerpos (monoclonal o policlonal, y fragmentos o fusiones), antitrombina III, antitripsinas, aprotinina, asparaginasas, bifalina, proteinas morfogenicas del hueso, calcitonina (salmon), colagenasa, ADNasa, endorfinas, enfuvirtide, encefalinas, eritropoyetinas, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor Ix, fibrinolisina, proteinas de fusion, hormonas estimulantes del foliculo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), galactosidasa, glucagon, GLP-1 semejante a los peptidos similares al glucagon, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias macrofagas de granulocitos (GM-CSF), proteina que activa la fosfolipasa (PLAP), gonadotropina corionica (hCG), hemoglobinas, vacunas de hepatitis B, hirudina, hialuronidasas, iduronidasa, globulinas inmunes, vacunas contra la gripe, interleucinas (1 alfa, 1 beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12), antagonista del receptor IL-1 (rhIL-1ra), insulinas, interferones (alfa 2a, alfa 2b, alfa 2c, beta 1a, beta 1b, gamma 1a, gamma 1b), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factores de crecimiento transformantes, lactasa, leuprolida, levotiroxina, hormona luteinizante, vacuna contra lyme, peptido natruiretico, pancrelipasa, papaina, hormona paratiroide, PDGF, pepsina, acetilhidrolasa del factor activador de las plaquetas (PAF-AH), prolactina, proteina C, octreotida, secretina, sermorelina, superoxido dismutasa (SOD), somatropinas (hormona de crecimiento), somatostatina, estreptoquinasa, sucrasa, fragmento de la toxina del tetanos, tilactasa, trombinas, timosina, hormona estimulante de la tiroides, tirotropina, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF receptor-IgG Fc, activador tisular del plasminogeno (tPA), TSH, urato oxidasa, uroquinasa, vacunas, proteinas de las plantas tales como lecitinas y ricinas.

Tambien se incluyen en este documento cualquier polipeptido sintetico o cualquier porcion de un polipeptido con bioactividad in vivo. Ademas, se incluyen las proteinas preparadas por metodologias de ADN recombinante incluyendo versiones mutantes de las proteinas mencionadas anteriormente, fragmentos de anticuerpos, proteinas de enlace de cadena simple, anticuerpos cataliticos y proteinas de fusion.

En una modalidad preferida, los profarmacos de la presente invencion comprenden proteinas preparadas por tecnologia de ADN recombinante.

En una modalidad preferida, los profarmacos de la presente invencion comprenden una proteina seleccionada del grupo de proteinas que consiste de fragmentos de anticuerpos, proteinas de enlace de cadena simple, anticuerpos cataliticos y proteinas de fusion.

Las proteinas preferidas son anticuerpos, calcitonina, G-CSF, GM-CSF, eritropoyetinas, hemoglobinas, interleucinas, insulinas, interferones, SOD, somatropina, TNF, TNF-receptor-IgG Fc, y GLP-1 semejante a los peptidos similares al glucagon.

x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1.

Y 1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un par de electrones libres, o esta ausente.

R13 se selecciona a partir de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos.

R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos hidroxilo. Apropiados grupos protectores se describen en TW Greene, P.G.M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 1999, JohnWiley & Sons, 3rd ed.

R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida.

R4 a R12 preferiblemente se seleccionan independientemente de hidrogeno, alquilo C1 a C8 o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido.

R4 a R12 mas preferiblemente son hidrogeno.

El termino "heteroalquilo" en el contexto de la presente invencion indica cadenas alquilo (lineal, ciclico o ramificado) donde las cadenas alquilo contienen o estan sustituidas en cualquier posicion uno o mas heteroatomos, independientemente seleccionados de O, S, N, P, Si, Cl, F, Br, I, etc. o grupos, independientemente seleccionados de carboxamida, ester carboxilico, ester de fosfonato, ester de fosfato, enlaces dobles o triples, carbamato, urea, tiourea, tiocarbamato, oxima, ciano, carboxilo, carbonilo, etc.

R1 es un polimero.

En una modalidad preferida, R1 se selecciona del grupo de polimeros que consiste de polimeros basados en polialquiloxi como poli(propileno glicol) o poli(etileno glicol), dextrano, chitosan, acido hialuronico y derivados, alginato, xilano, manano, carragenina, agarosa, celulosa, almidon, hidroxietil almidon (HES) y otros polimeros basados en carbohidratos, poli(vinil alcoholes), poli(oxazolinas), poli(anhidrido), poli(orto esteres), poli(carbonatos), poli(uretanos), poli (acrilicos acidos), poli(acrilamidas) tales como poli(hidroxipropilmetacrilamida) (HMPA), poli(acrilatos), poli(metacrilatos) como poli(hidroxietilmetacrilato), poli(organofosfazenos), poli(siloxanos), poli(vinilpirrolidona), poli(cianoacrilatos), poli(esteres) tales como poli(lactico acido) o poli(glicoles acidos), poli(iminocarbonatos), poli(amino acidos) tal como poli(glutamico acido), colageno, gelatina, copolimeros, copolimeros de injerto, polimeros reticulados, y copolimeros en bloque a partir de los polimeros enumerados anteriormente.

En una modalidad, R1 es un hidrogel.

Los hidrogeles se pueden definir como redes polimericas anfifilicas, tri-dimensionales o hidrofilicas que embeben grandes cantidades de agua. Las redes estan compuestas de homopolimeros o copolimeros, son insolubles debido a la presencia de reticulaciones fisicas o quimicas covalentes (ionicas, interacciones hidrofobicas, enmallamientos). Las reticulaciones proporcionan la estructura de red y la integridad fisica. Los hidrogeles muestran una compatibilidad termodinamica con agua, lo que les permite que se hinchen en medios acuosos. (ver.: N.A. Peppas,

P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Las cadenas de la red se conectan de tal manera que los poros existen y que una fraccion sustancial de estos poros tienen dimensiones entre 1 y 1000 nm. Seleccionando ciertas condiciones de polimerizacion, el hidrogel se puede obtener en la forma de un gel amorfo o como resina moldeada. Tales perlas suaves pueden tener un

Los hidrogeles se pueden sintetizar a partir de los polimeros y copolimeros enumerados anteriormente y reticulados fisicamente o reticulados quimicamente por polimerizacion de radicales, anionica o cationica, por reacciones quimicas como reacciones de condensacion o adicion como se describe en W.E. Hennink and C.F. van Nostrum, Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 13-36.

En otra modalidad, R1 es un polimero ramificado e hiper-ramificado. Ejemplos de tales polimeros incluyen dendrimeros y otros polimeros densos en estrellas. (R. Esfand, D.A. Tomalia, Drug Discov Today, 2001, 6(8), 427436; P.M. Heegaard, U. Boas, Chem. Soc. Rev. 2004 (33(1), 43-63; S.M. Grayson, J.M. Frechet, Chem. Rev. 2001, 101 (12), 3819-3868).

R1 tambien puede ser un biopolimero como una proteina. En una modalidad, la proteina es albumina, un anticuerpo, fibrina, caseina, y otra proteina plasmatica.

Cada polimero R1 puede llevar una o mas sustancias biologicamente activas unidas con el polimero por conjugacion con un segundo ligador del profarmaco como se describe en este documento o cualquier otro enlace conocido por un experto en la tecnica. Los polimeros pueden tener otros sustituyentes y pueden ser funcionalizados para la union con la fraccion espaciadora x, i.e. R1 tiene al menos un grupo funcional para el enlace con x. En una modalidad, tales grupos funcionales se seleccionan del grupo de grupos funcionales que consiste de acido carboxilico y derivados activados, amino, maleimida, tiol, acido sulfonico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, hidroxil, aldehido, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, acido fosforico y derivados, acido fosfonico y derivados, haloacetilo, haluros de alquilo, acriloilo, agentes arilantes como los fluoruros de arilo, hidroxilamina, disulfuros como disulfuro de piridilo, sulfona de vinilo, cetona de vinilo, diazoalcanos, compuestos diazoacetilo, epoxido, oxirano, y aziridina.

Los grupos funcionales preferidos para el polimero R1 incluyen tiol, maleimida, amino, acido carboxilico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, aldehido, y haloacetilo.

Los grupos funcionales especialmente preferidos incluyen tiol, maleimida, amino, acido carboxilico y derivados, carbamato y derivados, y carbonato y derivados de estos.

En una modalidad, los enlaces o grupos formados entre x y R1 se seleccionan del grupo de enlaces o grupos que consisten de disulfuro, S-succinimido, amida, amino, ester carboxilico, sulfonamida, carbamato, carbonato, eter, oxima, imina, tioeter, hidrazona, urea, tiourea, fosfato, fosfonato.

Los enlaces o grupos formados entre x y R1 preferidos comprenden S-succinimido, amida, carbamato, tioeter y urea.

Preferiblemente, los polimeros R1 son bien hidratados, degradables o excretables, no-toxicos y no-inmunogenicos en mamiferos. Los polimeros R1 preferidos incluyen polimeros basados en polialcoxi como polietileno glicol y reactivos polietileno glicol como aquellos descritos en Nektar Inc. 2003 catalog "Nektar Molecule Engineering -Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" y polimeros reticulados, ramificados, hiperramificados, e hidrogeles, y proteinas como albumina.

Procedimientos de sintesis general de los profarmacos polimericos

La sintesis de los ejemplos representativos de profarmacos polimericos de acuerdo con la presente invencion, se describe en la seccion de Ejemplos.

Los profarmacos de la presente invencion se pueden preparar en diversas maneras diferentes. La Fig. 8 muestra una primera ruta general para la sintesis de los profarmacos polimericos de la presente invencion de acuerdo con la formula Ic.

En este primer metodo, el intermedio inmovilizado en la fase solida (IV) se proporciona por el desplazamiento del grupo saliente A del material inicial inmovilizado (III) con el material inicial (II). Opcionalmente, esta sustitucion puede tener lugar en solucion con material inicial soluble (III). x en (III) puede ser protegido con un grupo protector PG apropiado. Los grupos protectores apropiados se describen en TW Greene, P.G.M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 1999, John Wiley & Sons, 3rd ed..

El intermedio (V) se escinde de la fase solida y todos los grupos protectores se escinden con reactivos como acido trifluoroacetico o DTT. El intermedio (V) luego se hace reaccionar con el polimero R1 para producir el profarmaco polimerico (Ica).

Los profarmacos polimericos de acuerdo con la formula Ib, se pueden preparar por metodos similares conocidos por los expertos en la tecnica, como se describe anteriormente para los profarmacos de acuerdo con la formula Ic utilizando por ejemplo el material inicial IIa.

10 La Fig. 9 muestra una segunda ruta general para la sintesis de los profarmacos polimericos de la presente invencion de acuerdo con la formula Ia.

En este segundo metodo, el intermedio inmovilizado en la fase solida (VII), se proporciona a partir del material inicial

(VI) mediante una o dos etapas de sustitucion nucleofilica o una o dos etapas de alquilacion reductiva.

Opcionalmente, estas etapas de sustitucion o alquilacion reductiva se pueden llevar a cabo en solucion con material 15 inicial soluble (VI). x en (III) se puede proteger con un grupo protector PG apropiado.

El intermedio (VIII) se escinde a partir de la fase solida y todos los grupos protectores se escinden con reactivos como acido trifluoroacetico o DTT. El intermedio (VIII) luego se hace reaccionar con el polimero R1, para producir el profarmaco polimerico (Iaa).

La Fig. 10 muestra otra ruta general para la sintesis de los profarmacos polimericos de la presente invencion de 20 acuerdo con la formula Ia.

En este metodo, el intermedio inmovilizado en la fase solida (x), se proporciona a partir del material inicial (Ix) mediante una o dos etapas de sustitucion nucleofilica o una o dos etapas de alquilacion reductiva. Opcionalmente, estas etapas de sustitucion o alquilacion reductiva, se pueden llevar a cabo en solucion con material inicial soluble (Ix). x en (x) puede ser protegido con un grupo protector PG apropiado. El intermedio (xI) se escinde a partir de la

25 fase solida con reactivos como hexafluoro-isopropanol sin escision del grupo protector. En una primera ruta, el intermedio (xI) se activa con reactivos tales como carbodiimidas y N-hidroxisuccinimida para producir (xII). El intermedio (xII) se hace reaccionar con una amina que contiene la molecula del farmaco para producir el intermedio (xIII). Despues de la escision del grupo protector PG a partir del intermedio (xIII), el compuesto se hace reaccionar con el polimero R1 para producir el profarmaco polimerico Iaa.

30 En una segunda ruta, el grupo protector PG se escinde a partir de (xI), con los reactivos tales como acido trifluoroacetico o DTT y el residuo se hace reaccionar con el polimero R1 para producir el intermedio (xIV). El intermedio (xIV) se activa con los reactivos tales como carbodiimidas y N-hidroxisuccinimida para producir el intermedio (xV), que se hace reaccionar con la amina que contiene el farmaco para formar el profarmaco polimerico Iaa.

En una tercera ruta, el grupo protector PG se escinde a partir del intermedio (xII) activado y el residuo se hace reaccionar con el polimero R1, para producir el intermedio (xV), el cual luego se hace reaccionar con el farmaco que contiene la amina para formar el profarmaco polimerico Iaa.

Se entiende, que las estructuras del ligador de acuerdo con la invencion descrita y que llevan grupos protectores o grupos salientes segun se describe y utilizan en la sintesis de profarmacos polimericos correspondientes se consideran dentro del rango de la invencion.

Un aspecto de la presente invencion es un metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende las siguientes etapas:

-

�suministro de una molecula inicial de Formula III

-

�desplazamiento de A con una molecula inicial de Formula II

-

�escision del intermedio resultante a partir de la fase solida y escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula V, y

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula V, para formar el profarmaco polimerico;

en donde

A, D, x, Y1, y R1 a R13 se utilizan, como se describe anteriormente.

Otro aspecto de la presente invencion es un metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende las

20 siguientes etapas: -�suministro de una molecula inicial de Formula VI

-

�formacion de un intermedio de Formula VII, por al menos una etapa de sustitucion o alquilacion reductiva

-

�escision del intermedio de Formula VII a partir de la fase solida y escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula VIII, y

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula V, para formar el profarmaco polimerico; en donde

10 A, D, x, Y1, y R1 to R13 se utilizan, como se describe anteriormente.

-

�formacion de un intermedio de Formula VII, por al menos una etapa de sustitucion o alquilacion reductiva

-

�escision del intermedio de Formula VII, a partir de la fase solida y escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula VIII, y

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula VIII, para formar el profarmaco polimerico; en donde A, D, x, Y1, y R1 a R13 se utilizan, como se describe anteriormente.

-

�activacion del intermedio de Formula xI con un reactivo de activacion, para formar un intermedio de Formula xII

-

�reaccion del intermedio de Formula xII con una amina que contiene el farmaco D, para formar un intermedio de 10 Formula xIII, y

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xII, despues de la escision del grupo protector PG para formar el profarmaco polimerico; en donde 15 A, D, x, Y1, y R1 a R13 se utilizan, como se describe anteriormente.

Otro aspecto de la presente invencion es un metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende las siguientes etapas: -�suministro de una molecula inicial de Formula x -�activacion del intermedio de Formula xI con un reactivo de activacion, para formar un intermedio de Formula xII

-

�reaccion del intermedio de Formula xII con una amina que contiene el farmaco D, para formar un intermedio de Formula xIII, y

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xIII despues de la escision del grupo protector PG, para 10 formar el profarmaco polimerico;

en donde

A, D, x, Y1, y R1 a R13 se utilizan, como se describe anteriormente. Otro aspecto de la presente invencion es un metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende las siguientes etapas:

15 -�suministro de una molecula inicial de Formula x

-

�fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xI, despues de la escision del grupo protector PG, para formar un intermedio de formula xIV;

-

�activacion del intermedio de Formula xIV con un reactivo de activacion, para formar un profarmaco polimerico reactivo de Formula xV, y

5 -�reaccion del intermedio de Formula xV con una amina que contiene el farmaco D, para formar el profarmaco polimerico;

en donde

A, D, x, Y1, y R1 a R13 se utilizan, como se describe anteriormente.

imidazolil, N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxibenzotriazolil, N-hidroxilazobenzotriazolil, pentafluorfenoxi y N10 hidroxisulfosuccinimidil.

Otro aspecto de la presente invencion es un metodo para hidrolizar el profarmaco de la presente invencion que comprende una etapa de colocar el profarmaco en solucion con un pH de aproximadamente 7.4. En una modalidad preferida, la solucion es un fluido extra-celular.

Aplicacion de los profarmacos polimericos en terapia molecular

15 Una ventaja clave de la presente invencion es la liberacion de una fraccion biologicamente activa no modificada a partir del profarmaco polimerico. En los profarmacos descritos por Greenwald et al. (Greenwald et al. J. Med.Chem. 2004, 47, 726-734) la fraccion biologicamente activa se libera del portador polimerico como una molecula del farmaco modificada con bicina con la propiedades imprevisibles de farmacocinetica, inmunogenicas, toxicidad y farmacodinamica. La liberacion de la molecula del farmaco modificada con bicina es imposible en los profarmacos

20 de acuerdo con la presente invencion debido al enlace permanente del portador del polimero con el ligador de bicina.

Para los profarmacos polimericos es deseable para la cinetica de escision del enlace temporal proceder bajo condiciones presentes en la sangre del cuerpo humano (pH 7.4, 37°C). Lo mas importante, la escision del enlace temporal se debe basar en la hidrolisis y mostrar ninguna o solo muy limitada dependencia con las entidades

25 quimicas o bioquimicas o fisicoquimicas presentes en la sangre humana tales como enzimas, sales o proteinas de enlace.

Otra ventaja de la clave de los profarmacos polimericos de la presente invencion es su predominante escision noenzimatica: la vida media del profarmaco in vivo es al menos 50% de la vida media del profarmaco en una solucion reguladora libre de enzima que tiene pH 7.4. Predominantemente, esta escision no-enzimatica permite una mejor

30 previsibilidad y control de las velocidades de liberacion despues de la administracion a un organismo vivo y reduce la variabilidad entre pacientes.

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que la velocidad de escision del enlace temporal que conecta el ligador de bicina con el grupo amino de la molecula del farmaco, se puede controlar por los efectos del grupo vecino mediados por diferentes sustituciones o uniones del polimero del ligador de bicina. Las velocidades de liberacion se rigen por una reaccion quimica sustancialmente no-enzimatica que es a su vez dependiente de la estructura molecular del ligador. Las modificaciones sistematicas o aleatorias de la estructura quimica, por ejemplo cambiando el sitio de union del polimero en el ligador de bicina, permiten la generacion de los ligadores del profarmaco con diferentes velocidades de liberacion. Por lo tanto, es posible crear una variedad de ligadores del profarmaco y seleccionar aquellos ligadores del profarmaco de escision rapida o lenta de acuerdo con las exigencias planteadas por una aplicacion medicinal o terapeutica dada.

El control de la liberacion independiente de la enzima permite formulaciones de deposito sin la necesidad de encapsulacion. Hasta ahora, los materiales principalmente compatibles como hidrogeles con grandes tamano de poros no podrian ser utilizados para formulaciones de deposito debido a su falta de propiedades de encapsulacion. A partir de tales materiales biocompatibles mecanicamente suaves y bien hidratados, la fraccion biologicamente activa deberia ser liberada muy rapido para la mayoria de aplicaciones terapeuticas. En combinacion con los ligadores del profarmaco descrito en esta invencion, el material portador se puede optimizar por sus propiedades de biocompatibilidad como la liberacion esta regida por la cinetica de escision del ligador y no necesita degradacion enzimatica o quimica del portador del polimero por si mismo.

Descripcion de las Figuras

Fig. 1 muestra un profarmaco unido al portador.

Fig. 2 muestra un profarmaco enzima-dependiente unido al portador.

Fig. 3 muestra un profarmaco en cascada donde el grupo de enmascaramiento es parte del portador.

Fig. 4 muestra un profarmaco enzima-dependiente en cascada donde el grupo de enmascaramiento es distinto del portador y el portador se une permanentemente al grupo de activacion.

Fig. 5 muestra un profarmaco en cascada unido al portador con el grupo de activacion bicina, donde el grupo de enmascaramiento es parte del portador.

Fig. 6 muestra un profarmaco unido al portador con el ligador de bicina donde el portador se une permanentemente al ligador de bicina.

Fig. 7 muestra in vivo la escision de profarmacos polimericos.

Fig. 8 muestra metodos de sintesis general.

Fig. 9 muestra metodos de sintesis general.

Fig.10 muestra metodos de sintesis general.

Ejemplos

Materiales

Los Fmoc-aminoacidos, resinas y PyBOP fueron adquiridos de Novabiochem y se nombran de acuerdo con el catalogo. Fmoc-Ado-OH fue obtenido de Neosystem. Todos los productos quimicos adicionales fueron adquiridos de Sigma Aldrich. La insulina humana recombinante fue de ICN Biomedicals (USA). Maleimida-PEG5k fue obtenido de Nektar (USA). 5-(y-6)-carboxifluoresceina succinimidil ester (isomeros mezclados) fue obtenido de Molecular Probes.

Analisis

La espectrometria de masas (MS) se llevo a cabo en un instrumento Waters ZQ 4000 ESI y los espectros fueron interpretados, si es necesario, mediante un software MaxEnt de Waters.

La cromatografia de exclusion molecular se realizo utilizando un sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic equipado con una columna Superdex 200 (Amersham Bioscience).

Sintesis de 1:

1 g (5.5 mmol) de 3,6-Dioxaoctano-1,8-ditiol se disolvieron en 10 ml de DMF y se adicionaron 1 g (3.6 mmol) de tritilcloruro y 1 ml de piridina. La solucion se agito a temperatura ambiente, durante 30 min y mono-S-tritil protegido 5 3,6- dioxaoctano-1,8-ditiol se purifico por RP-HPLC (rendimiento 850 mg, 2 mmol, 56 %).

10 durante 72 horas. Despues de la adicion de 1 ml de acido acetico, el producto 1 se purifico por RP-HPLC (rendimiento: 215 mg, 0.4 mmol, 56 %).

MS [M+Na]+ = 564.9 (MW+Na calculado = 564.8 g/mol)

Sintesis de 2:

15 2 se sintetizo como se describe para 1, utilizando 1 g de 1,4-ditiotreitol. MS [M+Na]+ = 536.8 (MW+Na calculado = 536.7 g/mol) Sintesis de 3 y 4:

GLP(7-36) protegido de cadena lateral Lys28 ivDde (secuencia: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde) GRamida) se sintetizo sobre la resina Rink-amida empleando fmoc-estrategia (Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany). El grupo protector-fmoc N-terminal se recupero y la resina se lavo con DCM y se seco. 50 mg de resina (0.11 mmol/g, 5.5 mol) se suspendio en una solucion de 42 mg de acido bromoacetico (300 mol) y 47 l (300 mol) de DIC en 500 l de DMF. La mezcla se agito durante 30 min a temperatura ambiente. Despues de lavar la resina seis veces con DMF la resina se incubo durante 2 h en una solucion de 20 mg de 2�y 10 l de DIEA en 200

l de DMF. Despues de lavar la resina seis veces con DMF el grupo protector ivDde se escindio por incubacion la resina 3 veces con 5% de hidrazina en DMF durante 20 min. La resina se lavo seis veces cada una con DMF y DCM. La escision del peptido a partir de la resina y la eliminacion de los grupos protectores se logro con 96/2/2 (v/v/v) de TFA/trietilsilano/agua durante 90 min. Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno. 3a se purifico por RP-HPLC y se liofilizo. MS: [M+3H]3+ = 1204.2, [M+2H]2+ = 1806.3 (MW calculado = 3609 g/mol)

Para la sintesis de 3b, 150 mg de resina (0.11 mmol/g, 16.5 mol) se suspendieron en una solucion de 126 mg de acido bromoacetico (900 mol) y 141 l (900 mol) de DIC en 1.5 ml de DMF. La mezcla se agito durante 30 min a temperatura ambiente. Despues de lavar la resina seis veces con DMF, la resina se incubo durante 2 h en una

ambiente. La resina luego se incubo con la mezcla de reaccion por 2 h y la resina se lavo 6 veces con DMF. El grupo protector Fmoc se recupero con 20% de piperidina en DMF durante 15 min. La resina se lavo 6 veces con DMF y se

resina y la eliminacion de grupos protectores se logro con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v) durante 90 min. Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno. 3b se purifico por RP-HPLC y se liofilizo. MS: [M+3H]3+ = 1372.0, [M+2H]2+ = 2057.5 (MW calculado = 4113 g/mol)

min a temperatura ambiente. Despues de lavar la resina seis veces con DMF, el grupo protector de ivDde se escindio por incubacion de la resina 3 veces con 5% de hidrazina en DMF durante 20 min. El acido bromoacetico se acoplo como se describe anteriormente. Despues de lavar la resina seis veces con DMF, la resina se incubo durante 14 h en una solucion de 20 mg de 2y 10 l de DIEA en 200 l de DMF. La resina se lavo seis veces cada una con DMF y DCM. La escision del peptido de la resina y la eliminacion de los grupos protectores se logro con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v). Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno y 4 se purifico por RP-HPLC y se liofilizo.

MS: [M+3H]3+ = 1227.9, [M+2H]2+ = 1841.4 (MW calculado = 3680 g/mol)

Sintesis de 5 y 6: 5�y 6�fueron sintetizados como se describe para 3�y 4, utilizando respectivamente 20 mg de 1.

5: MS: [M+3H4+ = 1213.4, [M+2H]3+ = 1819.3 (MW calculado = 3637 g/mol)

6: MS: [M+3H]4+ =1237.4, [M+2H]3+ =1855.2 (MW calculado = 3708 g/mol) Esquema de sintesis para el compuesto 14

Sintesis del compuesto 11

750 mg del acido 6-(1,3-dioxo-1,3-dihidroisoindl-2-il) hexanoico (2.9 mmol) y 180 mg de fosforo rojo (5.8 mmol) fueron suspendidos en 7 ml de CCl4 y 600 l de Br2 (11.7 mmol) se adicionaron en dos porciones. La mezcla de reaccion se agito a 90°C, durante 5 h. Despues de enfriar, la mezcla se diluyo con 20 ml de agua y 20 ml de dietileter, y se neutraliza con NaHCO3. El exceso de Br2 se redujo, mediante la adicion de NaHSO3. La capa organica separada fue extraida con NaHCO3 acuoso. Las capas acuosas se combinaron y acidificaron con HCl concentrado. El producto crudo se recolecto por filtracion y se recristalizo a partir de EtOH-agua.

Rendimiento 350 mg (36%)

MS [M+Na]4 = 364.2 (MW+Na calculado = 363.0 g/mol)

Sintesis del compuesto 13

GLP(7-36) protegido de cadena lateral (secuencia: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-amida) se sintetizo en la resina Rink-amida empleando la estrategia-fmoc (Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany). El grupo protector-fmoc N-terminal se recupero y la resina se lavo con DCM y se seco.

Una solucion de 3.6 mg de 11 (10 mol), 1.5 mg de HOBt (10 mol), y 1.6 l de DIC (10 mol) en 300 l de DMF se adiciono a 10 mg de resina cargada (0.22 mmol/g, 2.2 mol) y la mezcla se agito a RT, durante 3h. Despues de lavar la resina con DMF y DCM una solucion de 19 mg de bis(2-hidroxietil)amina (180 mmol) en 400 ml de DMF se adiciono y la suspension se incubo a 70°C, durante 2h para producir 12. La resina se lavo con DMF y EtOH y luego se trata con 400 l de N2H4 monohidrato/etanol 1/99 (v/v) a 60°C, durante 1 h para remover el grupo protector ftalimida. Despues de lavar con EtOH y DMF, se adiciono una solucion de 3.8 mg de acido Mmt-mercaptopropionico (10 mmol), 1.5 mg de HOBt (10 mol), y 1.6 l de DIC (10 mol) en 300 l de DMF y la mezcla se agito a RT durante 3h y posteriormente la resina se lavo con DMF y DCM. La escision del peptido a partir de la resina y la eliminacion de los grupos protectores se logro con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v). Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno y 13 se purifico por RP-HPLC y se liofilizo.

13: Rendimiento 1.2 mg (14%)

MS [M+2H]2+= 1801.4; [M+3H]3+ = 1201.2 (MW calculado = 3604 g/mol)

Sintesis de los conjugados 7, 8, 9, 10, y 14

Una solucion de 3 (0.1 mol) en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) (30 l) se mezclo con maleimida-PEG5k (0.2 mol) en acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) (50 l) y 50 l de solucion reguladora de fosfato 0.5 M (pH 7.4). La mezcla se incubo a RT durante 10 min. El conjugado 7 se purifico por RP-HPLC y se analizo por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo, 0.75 ml/min), utilizando como fase movil solucion reguladora de fosfato 10 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0.005 %.

7: tiempo de retencion SEC: 19.5 min

8, 9, y 10 fueron sintetizados a partir de 4, 5, y 6, respectivamente, como se describe anteriormente.

14 se sintetizo a partir de 13, como se describe anteriormente y se purifico por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 ml/min), utilizando como fase movil solucion reguladora de fosfato 10 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0.005 %. El eluato recolectado (aproximadamente 1.0 ml) se diluyo con 0.5 ml de solucion reguladora que contiene 0.05 % de NaN3 y se utiliza directamente para la determinacion de la velocidad de liberacion.

14: tiempo de retencion SEC: 19.7 min Esquema de sintesis para el compuesto 17

Sintesis del compuesto 16

170 mg de resina 2-Clorotritil cloro (carga 1.2 mmol/g, 0.2 mmol) se incubo durante 1.5 h con 200 mg de Dde Lys(Fmoc)-OH (0.4 mmol) y 140 l de DIEA (0.8 mmol) en 4 ml de DCM . El grupo protector-Fmoc se escindio con piperidina en DMF y la resina se lavo con DCM y DMF. La resina se agito a temperatura ambiente durante 2 h con una solucion de 209 mg de acido Trt-mercaptopropionico (0.6 mmol), 93 mg de HOBt (0.6 mmol), y 97 l de DIC (0.6

mmol) en DMF. La resina se trato tres veces con hidrazina al 2 % en DMF para remover el grupo protector Dde. Despues de lavar con DMF, se adiciono una solucion de 240 mg del dimero glicol aldehido (2.00 mmol), 252 mg de NaCNBH3 (4.00 mmol), y 200 l del acido acetico en 20 ml de DMF y la mezcla se agito durante la noche para producir 15. La resina se lavo con DMF y se agito con 309 mg de Mmt-Cl (1.00 mmol) en 2 ml de piridina a RT 5 durante 3 h. La resina se lavo con DCM y se seco. El producto 16 se escindio a partir de la resina con HFIP/DCM 1/7 (v/v) (2 x 2 min). Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno y 16 se purifico por cromatografia de columna de silica gel utilizando como fase movil DCM/MeOH/Et3N (85:15:0.03 (v/v)). Rf (DCM/MeOH/Et3N (85:15:0.03 (v/v)) =

0.5

16: Rendimiento 108 mg (50 %)

10 MS [M+Na]+ = 1131.9 (MW+Na calculado = 1131.6 g/mol)

Sintesis del compuesto 17

65 mg de 16 (59 mol), 9.3 l de DIC (60 mol), y 13.8 mg de HOSu (120 mol) en 4 ml de acetonitrilo fueron agitados a RT, durante 3 h. El solvente se evaporo y 17 se purifico por cromatografia de columna de silica gel, utilizando como fase movil heptano/EtOAc/Et3N (50:50:0.03 (v/v)).

15 Rf(heptano/EtOAc/Et3N (50:50:0.03 (v/v)) = 0.4

17: Rendimiento 56 mg (77 %) como sal de TFA

MS [M+Na]+ = 1228.7 (MW+Na calculado = 1228.6 g/mol)

Sintesis del compuesto 18

20 Sintesis de N B29-fluoresceina insulina:

80 mg de (13.8 mol) rh-insulina se disolvieron en 4 ml de DMF/DMSO 1/1 (v/v) y se adicionaron 40 l de DIEA. Se adicionaron 8 mg de (17 Pmol) 5-(y-6)-carboxifluoresceina succinimidil ester y la solucion se agito durante 30 min a temperatura ambiente. Se adicionaron 4 ml de acetonitrilo/agua/acido acetico 5/5/1 (v/v/v), producto N B29fluoresceina insulina se purifico por RP-HPLC y se liofilizo. El sitio de conjugacion se verifico por reduccion de N B29

25 fluoresceina insulina con 1,4-ditiotreitol, digestion de proteasa y analisis de MS.

MS: [M+2H]2+ = 3084.0; [M+3H]3+ = 2054.6 (MW calculado = 6166 g/mol)

4.4 mg de 16 (4.0 mol), 0.6 l de DIC (4.0 mol), y 0.9 mg de HOSu (8.0 mol) en DMF (20 l) se hicieron reaccionar a RT durante 2 h. La solucion se adiciono a 6.2 mg de N B29 . fluoresceina-rh-insulina (1.0 mol) y DIEA (2

l) en DMSO (60 l) y la mezcla se agito a RT durante 90 min. La mezcla de reaccion se neutralizo con acido acetico 30 y se diluyo con acetonitrilo/H2O. La purificacion RP-HPLC proporciono el intermedio Mmt y Trt-protegido apropiado.

Despues de la liofilizacion, el intermedio Mmt- y Trt-protegido se mezclo con TFA/trietilsilano 95:5 (v/v) y se agito durante 5 min. Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno y 18 se purifico por RP-HPLC y se liofilizo.

MS [M+2H]2+= 3238.2; [M+3H]3+ = 2157.2 (MW calculado = 6472 g/mol) Sintesis del compuesto 19

Una solucion de 18 (1.5 nmol) en acetonitrilo/agua 1/4 (v/v) (20 l) se mezclo con maleimida-PEG5k (1.9 nmol) en acetonitrilo/agua 1/4 (v/v) (10 l) y 50 l de solucion reguladora de fosfato 0.5 M (pH 7.4) y se incubo a RT durante 2 min. El compuesto se purifico por SEC (columna: Superdex 200, velocidad de flujo: 0.75 mL/min), utilizando como fase movil solucion reguladora HEPES 10 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween 20 al 0.005 %. El eluato recolectado (aproximadamente 1.5 mL) se utilizo directamente para la determinacion de la velocidad de liberacion.

19: tiempo de retencion SEC: 18.8 min

Sintesis de compuesto conjugado N B29 20

Despues de la liofilizacion, el intermedio Trt- y Mmt-protegido se mezclo con TFA/trietilsilano 95:5 (v/v) y se agito 15 durante 5 min. Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno y 20 se purifico por RP-HPLC y se liofilizo. La posicion de la modificacion de insulina se verifico por reduccion de DTT y analisis de MS.

MS [M+3H]3+ = 2038.1; [M+4H]4+ = 1528.1 (MW calculado = 6112 g/mol)

Sintesis del compuesto 21

20 21 se sintetizo a partir de 20, como se describe para 19.

21: tiempo de retencion SEC: 18.6 min

Sintesis de 22

GLP(7-36) protegido de cadena lateral Lys28 ivDde (secuencia: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GRamida) se sintetizo sobre la resina Rink-amida empleando la 5 estrategia-fmoc (Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany). El grupo protector fmoc N-terminal se recupero y la resina se lavo con DCM y se seco. 150 mg de resina (0.11 mmol/g, 16.5 mol) se incubaron durante 1 h en una solucion de 20 mg de Fmoc-Ado-OH (50 mol), 25 mg de PyBop (50 mol), y 17 l de DIEA en 500 l de DMF. Despues de la eliminacion del grupo protector fmoc con DMF/piperidina/DBU 96/2/2, la resina se incubo durante 1 h con una solucion de 17.4 mg de acido Trt-mercaptopropionico (50 mol), 25 mg de PyBop (50 mol), y 10 17 l de DIEA (100 mol) en 500 l de DMF. El grupo protector de ivDde se recupero por incubacion de la resina en 500 l de DMF/hidrazina 9/1 (v/v) durante 2 h. Despues de lavar la resina con DMF, Fmoc-Ado-OH se acoplo y el grupo protector fmoc se recupero como se describe anteriormente. La resina luego se incubo 2 h, con una solucion de 16 mg de 5-(y-6)-carboxifluorescein-succinimidil ester y 6 l de DIEA en 500 ml de DMF. La escision del peptido a partir de la resina y la eliminacion de los grupos protectores se logro con TFA/trietilsilano/agua 96/2/2 (v/v/v)

15 durante 90 min. Los volatiles fueron retirados con flujo de nitrogeno. 22 se purifico por RP-HPLC y se liofilizo.

MS: [M+3H]3+ = 1345.9, [M+2H]2+ = 2016.9 (MW calculado = 4034 g/mol)

Sintesis de rHSA-maleimida (23)

500 l de solucion de rHSA 3 mM (1.5 mol) en NaCl 145 mM, octanoato de sodio 32 mM, Tween-80 al 0.0015% se

20 mezclo con 100 l de solucion reguladora de fosfato 0.5 M pH 7.0. Se adicionaron 1.5 mg de N,N'bismaleimidopropionil-2-hidroxi-1,3-diaminopropano (3.75 mol) y la mezcla se hizo reaccionar durante 20 min a RT. El compuesto 23 se purifico por SEC (columna: Superdex 200 26/60, velocidad de flujo: 4 ml/min), utilizando como fase movil solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM.

ESI-MS = 66900 (MW calculado = 66864 g/mol)

25 Sintesis de rHSA marcado con bodipy (24)

500 l de solucion de rHSA 3 mM (1.5 mol) en NaCl 145 mM, octanoato de sodio 32 mM, Tween-80 al 0.0015% se mezclo con 250 l de solucion reguladora de borato de sodio 0.5 M pH 8.0. Se adicionaron 43 l de BODIPY® TR-x 100 mM, STP ester (Molecular Probes) en DMSO y la mezcla se hizo reaccionar durante 20 min a RT. La rHSA marcada con Bodipy (24) se purifico por SEC (columna: Superdex 200 26/60, velocidad de flujo: 4 ml/min) utilizando

30 como fase movil solucion reguladora de fosfato de sodio 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM.

Sintesis de 25

10 26 se sintetizo como se describe para 25 utilizando 23 y 3b.

MS: 70950 (MW calculado = 70977 g/mol)

Liberacion de fluoresceina-GLP-1 a partir de rHSA conjugada 26 in vivo

La liberacion de fluoresceina-GLP-1 a partir de rHSA conjugada 26 in vivo, se determino sustractivamente, determinando la cantidad de fluoresceina-GLP-1 que permanece unida al conjugado despues de la inyeccion en

15 rata. Esto se logro, mediante la comparacion de dos diferentes conjugados rHSA-fluoresceina-GLP-1, una en las cuales la GLP-1 marcada con fluoresceina se unio a albumina con un enlace reversible (conjugado 26), y una construccion control en la cuales GLP-1 marcada se unio a rHSA permanentemente (conjugado 25). Con el fin de obtener cinetica in vivo de alta precision y controlar la variabilidad del sitio de inyeccion, se utilizo un estandar interno. Este estandar interno se proporciono por co-inyeccion de rHSA marcada con bodipy sin conjugar (24).

20 En el experimento control, se utilizo un grupo de cinco ratas macho Sprague Dawley. Una mezcla de 56 nmol 25 y 97 nmol 24 en 450 l de fosfato de sodio 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM se inyecto por via subcutanea en cada rata. Las muestras de plasma se tomaron a intervalos de tiempo y se determino la fluorescencia de la fluoresceina y Bodipy. Las relaciones normalizadas de fluorescencia de fluoresceina/Bodipy en el tiempo se representaron graficamente (figura 7, triangulos).

25 En el experimento principal, se utilizo un grupo de tres ratas macho Sprague Dawley. Una mezcla de 40 nmol de 26 y 72 nmol de 24 en 450 l de fosfato de sodio 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM se inyecto por via subcutanea a cada rata. Las muestras de plasma se tomaron a los mismos intervalos de tiempo como en el experimento control y se determino la fluorescencia de fluoresceina y Bodipy. Las relaciones normalizadas de la fluorescencia de fluoresceina/Bodipy en el tiempo se representaron graficamente (figura 7, cuadrados).

Los datos obtenidos en el experimento principal divididos por los datos obtenidos en el experimento control registrados en el tiempo dieron la cinetica de liberacion de fluoresceina-GLP-1 a partir del conjugado 26.

Liberacion de peptido o fluoresceina-peptido a partir de los conjugados en solucion reguladora pH 7.4

La liberacion de (fluoresceina)-peptido a partir de los conjugados (fluoresceina)-peptido 7, 8, 9, 10, 14, 19, 21, y 26

5 se realizo mediante la hidrolisis del enlace en solucion reguladora acuosa pH 7.4. Los conjugados liofilizados se disolvieron en solucion reguladora HEPES 10 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween 20 al 0.005 %. Los conjugados re-disueltos y los eluatos SEC de los conjugados (fluoresceina) peptido recolectados se incubaron a 37 °C y las muestras se tomaron a intervalos de tiempo y analizaron por RP-HPLC (conjugados peptido) y deteccion UV a 215 nm o SEC (conjugados peptido fluoresceina) y la deteccion a 500 nm. Los picos que se correlacionan con el

10 tiempo de retencion de peptido nativo o fluoresceina-peptido, respectivamente, se integraron y registraron contra el tiempo de incubacion, y se aplico el software de ajuste de curva para estimar la correspondiente vida media de liberacion.

compuesto

t1/2 solucion reguladora pH 7.4 t1/2 in vivo

7

6 d nd

8

9 d nd

9

10 d nd

10

11 d nd

14

12 d nd

19

22 d nd

21

74 d nd

26

6d 3.75 d

15

Abreviaturas:

Ado

Acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico

Boc

t-butiloxicarbonil

Bodipy

BODIPY® TR-x

DBU

1,3-diazabiciclo[5.4.0]undeceno

20

DCM diclorometano

(iv)Dde

1-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciclohexiliden)3-metil-butil

DIC

diisopropilcarbodiimida

DIEA

diisopropiletilamina

DMAP

dimetilamino-piridina

25

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO

dimetilsulfoxido

DSC

disuccinidilcarbonato

EDTA

acido etilenodiaminatetraacetico

eq

equivalente estequiometrico

fmoc

9-fluorenilmetoxicarbonil

Fmoc-Ado-OH

acido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico

HFIP

hexafluoroisopropanol

HEPES

N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(acido 2-etanosulfonico)

HOBt

N-hidroxibenzotriazol

LCMS

cromatografia liquida acoplada a espectrometria de masa

Mal

maleimidopropionil

Mmt

4-metoxitritil

MS

espectro de masas

MW

masa molecular

Npys

3-nitro-2-piridinasulfenil

PyBOP

benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato

rHSA

albumina de suero humana recombinante

RP-HPLC

cromatografia liquida de alta resolucion de fase reversa

RT

temperatura ambiente

SEC

cromatografia de exclusion molecular

Suc

succinimidopropionil

TES

trietilsilano

TFA

acido trifluoroacetico

THF

tetrahidrofurano

UV

ultravioleta

VIS

visual

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un profarmaco polimerico que comprende al menos un polimero unido via al menos un enlace permanente con un ligador de bicina, que se une via un enlace temporal con una amina que contiene una fraccion biologicamente activa, en donde el profarmaco o el correspondiente reactivo del ligador del profarmaco polimerico tienen la siguiente estructura:

   o

   o

   en donde T es D o A;

   siendo D un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa, en donde D se conecta con el ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa; y siendo A un grupo saliente;

   15 x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1;

   Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un par de electrones libres o esta ausente;

   R13 se selecciona a partir de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos;

   R2 y R3 se seleccionan independientemente a partir de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos hidroxilo;

   R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida,

   R1 es un polimero.

2. 2.

   El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde la fraccion biologicamente activa se selecciona del grupo de fracciones biologicamente activas que consisten de agentes de moleculas pequenas biologicamente activas o biopolimeros.

3. 3.

   El profarmaco de la reivindicacion 2, en donde los biopolimeros se seleccionan del grupo de biopolimeros que consiste de proteinas, polipeptidos, oligonucleotidos y acidos nucleicos de peptidos.

4. 4.

   El profarmaco de la reivindicacion 3, en donde los polipeptidos se seleccionan del grupo de polipeptidos que consisten de ACTH, adenosina desaminasa, agalsidasa, albumina, alfa-1 antitripsina (AAT), inhibidor de la alfa-1 proteinasa (API), alteplasa, anistreplasa, ancrod serina proteasa, anticuerpos (monoclonal o policlonal, y fragmentos

   o fusiones), antitrombina III, antitripsinas, aprotinina, asparaginasas, bifalina, proteinas morfogenicas del hueso, calcitonina (salmon), colagenasa, ADNasa, endorfinas, enfuvirtide, encefalinas, eritropoyetinas, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor Ix, fibrinolisina, proteinas de fusion, hormonas estimulantes del foliculo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), galactosidasa, glucagon, peptidos similares al glucagon semejantes a GLP-1, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias macrofagas de granulocitos (GM-CSF), proteina que activa la fosfolipasa (PLAP), gonadotropina corionica (hCG), hemoglobinas, vacunas de hepatitis B, hirudina, hialuronidasas, idurnonidas, globulinas inmunes, vacunas contra la gripe, interleucinas (1 alfa, 1 beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12), antagonista del receptor IL-1 (rhIL-1ra), insulinas, interferones (alfa 2a, alfa 2b, alfa 2c, beta 1a, beta 1b, gamma 1a, gamma 1b), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factores de crecimiento transformantes, lactasa, leuprolida, levotiroxina, hormona luteinizante, vacuna contra lyme, peptido natruiretico, pancrelipasa, papaina, hormona paratiroide, PDGF, pepsina, acetilhidrolasa del factor activador de las plaquetas (PAF-AH), prolactina, proteina C, octreotida, secretina, sermorelina, superoxido dismutasa (SOD), somatropinas (hormona de crecimiento), somatostatina, estreptoquinasa, sucrasa, fragmento de la toxina del tetanos, tilactasa, trombinas, timosina, hormona estimulante de la tiroides, tirotropina, factor de necrosis tumoral (TNF), receptor del TNF -IgG Fc, activador tisular del plasminogeno (tPA), TSH, urato oxidasa, uroquinasa, vacunas, y proteinas de las plantas tales como lectina y ricina.

5. 5.

   El profarmaco de la reivindicacion 3, en donde la proteina es una proteina preparada por tecnologia de ADN recombinante.

6. 6.

   El profarmaco de la reivindicacion 3, en donde la proteina se selecciona del grupo de proteinas que consiste de fragmentos de anticuerpos, proteinas de enlace de cadena simple, anticuerpos cataliticos y proteinas de fusion.

7. 7.

   El profarmaco de la reivindicacion 3, en donde la proteina se selecciona del grupo de proteinas que consiste de anticuerpos, calcitonina, G-CSF, GM-CSF, eritropoyetinas, hemoglobinas, interleucinas, insulinas, interferones, SOD, somatropina, TNF, receptor del TNF-IgG Fc, peptidos similares al glucagon semejante al GLP-1,

8. 8.

   El profarmaco de la reivindicacion 2, en donde los agentes de moleculas pequenas biologicamente activas se seleccionan del grupo de agentes que consiste de agentes activos del sistema nervioso central, agentes antiinfecciosos, anti-neoplasicos, antibacterianos, anti-fungicos, analgesicos, anticonceptivos, anti-inflamatorios, esteroidales, vasodilatadores, vasoconstrictores, y agentes cardiovasculares con al menos un grupo amino primario

   o secundario.

9. 9.

   El profarmaco de la reivindicacion 2, en donde los agentes de moleculas pequenas biologicamente activas se seleccionan del grupo de compuestos que consiste de daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitoxantrona, aminoglutetimida, amantadina, diafenilsulfona, etambutol, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxazol, sulfaleno, clinafloxacina, moxifloxacina, ciprofloxaxina, enoxacina, norfloxacina, neomicina B, esprectinomicina, canamicina A, meropenem, dopamina, dobutamina, lisinopril, serotonina, acivicina y carbutamida.

10. 10.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R4 a R12 se seleccionan independientemente del hidrogeno, alquilo C1 a C8 o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido.

11. 11.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R1 se selecciona del grupo de polimeros que consiste de polimeros basados en polialquiloxi como poli(propileno glicol) o poli(etileno glicol), dextrano, chitosan, acido hialuronico y derivados, alginato, xilano, manano, carragenina, agarosa, celulosa, almidon, hidroxietil almidon (HES) y otros polimeros basados en carbohidratos, poli(vinil alcoholes), poli(oxazolinas), poli(anhidrido), poli(orto esteres), poli(carbonatos), poli(uretanos), poli(acrilicos -acidos), poli(acrilamidas) tal como poli(hidroxipropilmetacrilamida) (HMPA), poli(acrilatos), poli(metacrilatos) como poli(hidroxietilmetacrilato), poli(organofosfazenos), poli(siloxanos), poli (vinilpirrolidona), poli(cianoacrilatos), poli(esteres) tales como poli(lactico acido) o poli(glicoles acidos), poli(iminocarbonatos), poli(amino acidos) tales como poli(glutamico acido), colageno, gelatina, copolimeros, copolimeros de injerto, polimeros reticulados, y copolimeros en bloque a partir de los polimeros enumerados anteriormente.

12. 12.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R1 es un hidrogel.

13. 13.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R1 es un polimero ramificado o hiper-ramificado.

14. 14.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R1 es un dendrimero o polimero denso en estrella.

15. 15.

    El profarmaco de la reivindicacion 1, en donde R1 es un biopolimero.

16. 16.

    El profarmaco de la reivindicacion 15, en donde R1 es una proteina.

17. 17.

    El profarmaco de la reivindicacion 16, en donde la proteina es albumina, un anticuerpo, fibrina, caseina o cualquier otra proteina plasmatica.

18. 18.

    El profarmaco de las reivindicaciones 1 a 17, en donde R1 ademas incluye una o mas sustancias biologicamente activas.

19. 19.

    El profarmaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde R1 tiene al menos un grupo funcional para el enlace con x.

20. 20.

    El profarmaco de la reivindicacion 19, en donde al menos un grupo funcional se selecciona del grupo de grupos funcionales que consiste del acido carboxilico y derivados activados, amino, maleimida, tiol, acido sulfonico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, hidroxil, aldehido, cetona, hidrazina, isocianato, isotiocianato, acido fosforico y derivados, acido fosfonico y derivados, haloacetilo, haluros de alquilo, acriloilo, agentes arilantes como fluoruros de arilo, hidroxilamina, disulfuros como disulfuro de piridilo, sulfona de vinilo, cetona de vinilo, diazoalcanos, compuestos de diazoacetilo, epoxido, oxirano, y aziridina.

21. 21.

    El profarmaco de la reivindicacion 19 o 20, en donde al menos un grupo funcional se selecciona del grupo de grupos funcionales que consiste de tiol, maleimida, amino, acido carboxilico y derivados, carbonato y derivados, carbamato y derivados, aldehido, y haloacetilo.

22. 22.

    El profarmaco de una de las reivindicaciones 19 a 21, en donde el enlace o grupo formado entre x y R1 se selecciona del grupo de enlaces o grupos que consisten de disulfuro, S-succinimido, amida, amino, ester carboxilico, sulfonamida, carbamato, carbonato, eter, tioeter, imina, oxima, hidrazona, urea, tiourea, fosfato, fosfonato.

23. 23.

    El profarmaco de las reivindicaciones 19 a 22, en donde los enlaces o grupos formados entre x y R1 se seleccionan del grupo de enlaces o grupos que consisten de S-succinimido, amida, carbamato, tioeter y urea.

24. 24.

    El reactivo del ligador del profarmaco polimerico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde A se selecciona del grupo de grupos salientes que consisten de cloro, bromo, fluor, nitrofenoxi, imidazolil, Nhidroxisuccinimidil, N-hidroxibenzotriazolil, N-hidroxiazobenzotriazolil, pentafluorfenoxi, N-hidroxisulfosuccinimidil o heteroarilo.

25. 25.

    El reactivo del ligador del profarmaco polimerico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las cuales T es un grupo saliente A, para la conjugacion covalente con una fraccion biologicamente activa y unido con un portador.

26. 26.

    Metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende:

    -

    suministro de una molecula inicial de Formula III

    -

    desplazamiento de A con una molecula inicial de Formula II

    -

    escision del intermedio resultante a partir de la fase solida y escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula V, y

    - fijacion de un polimero R1 con x en el intermedio de Formula V para formar el profarmaco polimerico; en donde A es un grupo saliente;

    10 D es un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa y en donde D se conecta con el ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa;

    x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1; Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un 15 par de electrones libres o esta ausente;

    R13 se selecciona a partir de un alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos; R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos

    hidroxilo.

    R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida,

    R1 es un polimero.
27. 27. Metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende:

    -

    suministro de una molecula inicial de Formula VI

    -

    formacion de un intermedio de Formula VII mediante al menos una etapa de sustitucion o alquilacion reductiva

    10 - escision del intermedio de Formula VII a partir de la fase solida y escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula VIII, y

    -

    fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula VIII para formar el profarmaco polimerico; en donde

    D es un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa y en donde D se conecta con el 15 ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa;

    x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1;

    Y1 es O, S. succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un par de electrones libres o esta ausente;

    20 R13 se selecciona a partir de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos;

    R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos hidroxilo;

    R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida,

    R1 es un polimero.
28. 28. Metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende:

    -

    suministro de una molecula inicial de Formula Ix

    10 - formacion de un intermedio de Formula x por al menos una etapa de sustitucion o alquilacion reductiva

    -

    escision del intermedio de Formula x de la fase solida sin escision de todos los grupos protectores presentes para formar un intermedio de Formula xI, y

    15 - activacion del intermedio de Formula xI con un reactivo de activacion para formar un intermedio de Formula xII

    -

    reaccion del intermedio de Formula xII con una amina que contiene el farmaco D, para formar un intermedio de Formula xIII, y

    5 - fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xIII despues de la escision del grupo protector PG, para formar el profarmaco polimerico;

    en donde D es un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa y en donde D se conecta con el ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una

    10 fraccion biologicamente activa;

    A es un grupo saliente;

    x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1;

    Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un

    par de electrones libres o esta ausente;

    15 R13 se selecciona de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos

    sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos;

    R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos

    hidroxilo; R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico

    20 sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno,

    carboxi, carboxamida,

    R1 es un polimero.
29. 29. Metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende:

    -

    suministro de una molecula inicial de Formula xI

    -

    fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xI despues de la escision del grupo protector PG para formar un intermedio de formula xIV;

    -

    activacion del intermedio de Formula xIV con un reactivo de activacion, para formar un profarmaco polimerico reactivo de Formula xV, y

    -

    reaccion del intermedio de Formula xV con una amina que contiene el farmaco D, para formar el profarmaco polimerico;

    10 en donde siendo D un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa y en donde D se conecta con el ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa;

    A es un grupo saliente; 15 x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1;

    Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un par de electrones libres o esta ausente; R13 se selecciona a partir de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos

    sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos; 20 R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos hidroxilo;

    R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida,

    R1 es un polimero.
30. 30. Metodo para la sintesis de un profarmaco polimerico que comprende:

    -

    suministro de una molecula inicial de Formula xII

    -

    fijacion de un polimero R1 a x en el intermedio de Formula xII despues de la escision del grupo protector PG, para formar un reactivo de enlace polimerico de formula xV, y

    -

    reaccion del intermedio de Formula xV con una amina que contiene el farmaco D, para formar el profarmaco polimerico; en donde D es un residuo de una amina que contiene una fraccion biologicamente activa y en donde D se conecta con el 15 ligador del profarmaco polimerico a traves de un grupo amina primario o secundario de la amina que contiene una fraccion biologicamente activa; A es un grupo saliente; x es una fraccion espaciadora tal como R13-Y1; Y1 es O, S, succinimida, maleimida, enlaces carbono-carbono insaturados o cualquier heteroatomo que contiene un

    20 par de electrones libres o esta ausente; R13 se selecciona a partir de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos;

    R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrogeno, grupos acilo, o grupos protectores de los grupos hidroxilo;

    R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrogeno, x-R1, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o ciclico sustituido o no-sustituido, arilos, arilos sustituidos, heteroarilos sustituidos o no-sustituidos, ciano, nitro, halogeno, carboxi, carboxamida;

    R1 es un polimero.

    5 31. El metodo de una de las reivindicaciones 28 y 29, en donde el reactivo de activacion es una mezcla de carbodiimida-N-hidroxisuccinimida.
31. 32. El metodo de una de las reivindicaciones 28 a 30, en donde A se selecciona a partir de cloro, bromo, fluor, nitrofenoxi, imidazolil, N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxibenzotriazolil, N- hidroxilazo-benzotriazolil, pentafluorfenoxi y Nhidroxisulfosuccinimidil.

    10 33. Un metodo para hidrolizar el profarmaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 que comprende una etapa de colocar el profarmaco en solucion con un pH de aproximadamente 7.4.
32. 34. El metodo de la reivindicacion 33, en donde la solucion es un fluido extra-celular.