CN101242859B

CN101242859B - 作为聚合物缀合前药中的连接团的n,n-二（羟乙基）甘氨酰胺

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Publication number: CN101242859B
Application number: CN2006800305060A
Authority: CN
Inventors: D·费特尔; H·拉乌; T·韦格; U·赫泽尔
Original assignee: Complex Biosystems GmbH
Current assignee: Ascendis Pharma GmbH
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2026-06-21
Also published as: GB0512705D0; PL1909845T3; GB2427360A; WO2006136586A2; MX2007016547A; EP1909845A2; WO2006136586A3; US20100291021A1; JP5121068B2; BRPI0612536A2; AU2006260914B2; ES2390816T3; AU2006260914A1; JP2008543916A; CN101242859A; US8980242B2; SI1909845T1; CY1113204T1; CA2613208C; CA2613208A1

Abstract

本发明描述了聚合物前药，其包括经由至少一个永久键连接到N-二(羟乙基)甘氨酸连接团的至少一种聚合物。该N-二(羟乙基)甘氨酸连接团通过临时键合连接到含胺生物活性部分。所述含胺生物活性部分-如药物-可通过裂解临时键合而被释放。在一个实施例中，所述前药或相应的聚合物前药连接团试剂具有以下结构：(式Ia)，其中T是D或A(D是含胺生物活性部分的残基，且A是离去基团)，X是间隔部分如R13-Y1，Y1是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或者含有游离电子对的任何杂原子，或者不存在，R13选自取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，R2和R3独立地选自氢、酰基或羟基的保护基。R4至R12独立地选自氢、X-R1、取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、羧酰胺，R1是聚合物。在其它实施例中聚合物R1位于其它位置。

Description

作为聚合物缀合前药中的连接团的N,N-二(羟乙基)甘氨酰胺

领域

本发明涉及具有与生物活性实体如肽、蛋白、天然产物或合成化学化合物的氨基的临时键合(linkage)的聚合物前药。

背景

通常，药物递送中的聚合物或者以非共价方式将药物通过物理化学方法配制于溶剂-聚合物混合物中使用，或者通过将聚合物试剂永久共价连接至药物官能团之一而使用。

非共价药物包封法已用于长效释放模式的贮库制剂。通常，将药物与聚合物材料混合，以使药物分布遍及本体聚合物材料中的方式处理。该聚合物-药物聚集物可以被成形为以注射用混悬液施用的微粒，或者该聚合物-药物聚集物被配制成单次快速浓注施用的凝胶。当聚合物膨胀或聚合物降解允许药物扩散到本体聚合物外部时发生药物释放。该降解过程可以是自动水解的或者酶催化的。基于快速浓注施用药物-聚合物凝胶的上市药物的实例是Lupron Depot。基于混悬微粒的上市药物的实例是NutropinDepot。

非共价方法的缺点在于：为了防止不受控制的、爆发型药物释放，必须通过营造立体上高度拥挤的环境而使药物包封高度有效。抑制非结合、水溶性药物分子的释放需要强大的、经常通过疏水部分介导的范德华接触。许多构象敏感药物如蛋白质或肽在包封处理期间和/或在后续的包封药物贮存期间变得功能异常。此外，这类含氨基药物容易与聚合物降解产生发生副反应(参见例如D.H.Lee等人，J.Contr.Rel.，2003，92，291-299)。此外，药物释放机制对生物降解的依赖性会引起患者间差异。

或者，药物可以通过永久共价键与聚合物缀合。该方法被用于不同种类的分子中，从所谓的小分子到天然产物再到较大的蛋白质类。

许多小分子药物如生物碱类和抗肿瘤药在水性液体中显示低溶解度。增溶这些小分子化合物的一种方法是将所述小分子化合物与亲水性(水溶性)聚合物缀合。为此目的，已描述了多种水溶性聚合物，如人血清白蛋白、葡聚糖、凝集素类、聚(乙二醇)(PEG)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(N-羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(二乙烯基醚-共-马来酸酐)、透明质酸(R.Duncan，Nature Rev.Drug Disc，2003，2，347-360)。

癌症治疗中的主要挑战是将细胞毒剂选择性地靶向肿瘤细胞。将小分子抗癌药聚集到肿瘤组织并降低这些药物不需要的副作用的有希望的方法是将细胞毒素连接至大分子载体。聚合物药物缀合物对肿瘤的被动靶向作用是基于所谓的增加渗透性和保持效果(EPR)，如Matsumura，Y.和Maeda，H.在Cancer Res.，1986，vol 6，6387-6392中所述。为此，已有多种聚合物-药物缀合物作为抗癌药进入临床研究。

从1970年代后期以来，已经广泛研究了用聚乙二醇对生物分子进行共价修饰。通过增加溶解度、降低免疫原性以及因降低肾清除率和经酶蛋白质水解而增加体内循环半衰期，所谓的PEG化蛋白质已显示出改进的治疗效果(参见例如Caliceti P.，Veronese F.M.，Adv.Drag Deliv.Rev.2003，55，1261-1277)。

然而，当聚合物与药物共价缀合时，许多生物分子如INF-α2、沙奎那韦或生长抑素是无活性的或者显示出降低的生物学活性(T.Peleg-Shulman等人，J.Med.Chem.，2004，47，4897-4904)。

为了避免由非共价聚合物混合物或永久共价连接所致的缺点，优选地可以使用药物与聚合物载体化学缀合的前药方法。在该聚合物前药中，生物活性部分(药物、治疗性的生物学分子等)通常通过临时键连接到聚合物载体部分，该临时键在载体部分与药物分子的羟基、氨基或羧基之间形成。

前药是本身几乎无活性的治疗剂，但可预期转化成活性代谢物(参见B.Testa，J.M：Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism，Wiley-VCH，2003，第4页)。载体前药方法可以以这样的方式应用：药物在体内自聚合物释放以恢复其生物活性。如果希望药物缓慢或受控释放，则前药的生物活性与所释放药物相比降低是有利的。此时，可以施用相对大量的前药而无伴发的副作用和剂量过高的风险。随着时间延续发生药物释放，从而减少了反复和频繁施用药物的需要。

前药活化可如下进行：酶或非酶裂解载体和药物分子之间的临时键，或者两者相继进行，即酶步骤继之以非酶重排，如图1所示。在无酶体外环境如水性缓冲溶液中，临时键如酯或酰胺可以发生水解，但是相应的水解速度可以非常缓慢且不是治疗可用的。在体内环境中，通常存在酯酶或酰胺酶，且该酯酶或酰胺酶可引起显著的、从两倍直至若干数量级的水解动力学的催化加速作用(参见例如R.B.Greenwald等人，J.Med.Chem.1999，42(18)，3857-3867)。

根据IUPAC定义

(如http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem/(2004年3月8日访问)所给出)

前药

前药是在表现出其药理学作用之前经历生物转化的任意化合物。因此前药可以看作是含有特定的、无毒性保护基的药物，该保护基以暂态方式使用来改变或消除母体分子中不期望的性质。

载体连接的前药(载体前药)

载体连接的前药含有临时键合的所给活性物质与暂态载体基团，其产生改进的物理化学和药动学性质并且在体内可以容易地被除去，通常通过水解裂解。图示于图1。

级联(cascade)前药

级联前药是一种载体前药，其中载体基团的裂解仅在暴露活化基团之后才变得有效。

聚合物级联前药

聚合物级联前药是一种含有所给活性物质与暂态聚合物载体基团的临时键合的载体前药，其中载体的裂解仅在暴露活化基团之后才变得有效。

生物前体前药

生物前体前药是一种前药，其不是指与载体基团的连接，而是由活性成分本身的分子修饰产生。该修饰产生新化合物，该新化合物能够通过代谢或化学方式转化，所得化合物为活性成分。

生物转化

生物转化是物质经活有机体或酶制剂的化学转化。

其它定义：

连接团

存在于载体前药中的控制裂解的化学结构或基团，其既不由载体实体提供，也不由药物提供。

前药分为两类，即生物前体和载体连接的前药。生物前体不含有载体基团，且通过代谢产生官能团而被活化。在载体连接的前药中，活性物质通过临时键合与载体部分连接。该载体可以是生物学惰性的(例如PEG)，或者可以具有靶向性质(例如抗体)。本发明涉及聚合物载体连接的或大分子的前药，其中载体本身是大分子如载体蛋白或多糖或聚乙二醇。

载体前药的裂解产生生物活性增加的分子实体(药物)和至少一种副产物，即载体。裂解之后，该生物活性实体将显示出至少一种之前缀合的且因此被保护的官能团，该基团的存在通常有助于药物的生物活性。

为了实现前药方案，药物分子中至少一个所选官能团被用于连接载体聚合物。优选的官能团是羟基或氨基。因此，连接化学和水解条件均取决于所用官能团的种类。在简单的一步裂解机理中，前药的临时键合的通常特征为内在不稳定性或酶依赖性。在伴有或不伴有酶催化的水性环境中，该键合对水解的敏感性控制了聚合物载体与药物之间的裂解动力学。

众多大分子前药在文献中述及，其中所述临时键合是不稳定的酯键。在这些情况下，由生物活性实体提供的官能团为羟基或羧酸(例如Y.Luo，MR Ziebell，GD Prestwich，“靶向癌细胞的透明质酸-紫杉醇抗肿瘤生物缀合物”，Biomacromolecules 2000，1，208-218；J Cheng等人，“直链、基于β-环糊精的聚合物和它们的喜树碱缀合物”，Bioconjugate Chem.2003，14，1007-1017；R.Bhatt等人，“20(S)-喜树碱的聚(L-谷氨酸)缀合物的合成和体内抗肿瘤活性”，J.Med.Chem.2003，46，190-193；R.B.Greenwald，A.Pendri，CD.Conover，H.Zhao，Y.H.Choe，A.Martinez，K.Shum，S.Guan，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667；B.Testa，J.M：Mayer inHydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism，Wiley-VCH，2003，第8章)。

特别是对于治疗性生物大分子以及某些小分子药物，可能需要将大分子载体连接到生物活性实体的氨基(即蛋白质的N-末端或赖氨酸氨基基团)。如果掩蔽药物的生物活性需要缀合生物活性实体的某一氨基，例如位于活性中心或牵涉于受体结合的区域或表位中的氨基，即是这种情况。而且，在制备前药期间，氨基可能被处理得更具化学选择性并且作为缀合载体和药物的更佳手段，原因是与羟基性或酚性基团相比，它们具有更大的亲核性。这对于含有大量种类不同反应性官能度的蛋白质而言特别准确，其中非选择性缀合反应会产生不需要的产物混合物，该混合物需要大量定性或者纯化，且可降低反应产率和产物的疗效。

与酯键相比，酰胺键以及脂族氨基甲酸酯类对抗水解通常要稳定得多，而且酰胺键的裂解速度对于载体连接的前药的治疗应用而言太慢。因此，为了控制前药酰胺键的裂解能力，加入结构性化学成分如邻近基团是有益的。这类既非由载体实体也非由药物提供的额外的控制裂解化学结构被称为“连接团”。前药连接团对所给临时键的水解速度具有强烈影响。这些连接团的化学性质的变化允许在很大程度上调控(engineering)该连接团的性质。

含胺生物活性部分经靶向释放特异性酶的前药活化的若干实例已被公开。酶依赖性的前提条件在于：连接团的结构具有被相应内源性酶识别为底物的结构基序(如图2所示)。在这些情况下，临时键的裂解以由酶催化的一步法进行。G.Cavallaro等人，Bioconjugate Chem.2001，12，143-151描述了抗肿瘤药经由蛋白酶纤溶酶(protease plasmin)的酶促释放。阿糖胞苷经由三肽序列D-Val-Leu-Lys偶联至聚合物α，β-聚(N-羟乙基)-DL-天冬酰胺(PHEA)。阿糖胞苷的酶促释放是通过蛋白酶纤溶酶而实现，该蛋白酶纤溶酶在各种肿瘤团块中的浓度相对较高。

前药裂解的酶催化加速对于器官和细胞靶向应用而言是需要的性质。如果选择性裂解键合的酶特别地存在于所选用于治疗的器官和细胞类型中，则生物活性实体的靶向释放得以实现。

酶依赖性临时键合的典型性质是其相对于水解的稳定性。酶依赖性临时键合本身不会经历将释放药物至可诱导通常给药方案中药物疗效程度的速率的自动水解。仅在酶存在下，酶对酶依赖性临时键合的攻击引起酶依赖性临时键合裂解的显著加速，并同时增加游离药物的浓度。

已经描述了由特异性酶如β-内酰胺酶(R.Satchi-Fainaro等人，Bioconjugate Chem.2003，14，797-804)和半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶B(R.Duncan等人，J.Contr.Release 2001，74，135-146)活化的抗肿瘤聚合物前药的其它实例。Wiwattanapatapee等人(2003)描述了用于结肠递送5-氨基水杨酸的树状聚体前药。药物分子通过偶氮键与“3代”PAMAM树状聚体缀合。5-氨基水杨酸在结肠中通过称为偶氮还原酶的细菌酶释放(W.R.Wiwattanapatapee，L.Lomlim，K.Saramunee，J.Controlled Release，2003，88：1-9)。

大多数酶促裂解的主要缺点是患者间的差异性。个体之间的酶水平可能显著不同，导致通过酶促裂解的前药活化的生物差异性。酶水平还可因施用部位的不同而异。例如已知在皮下注射的情况下，身体的某些区域比之于其它区域产生更可预期的治疗效果。为了降低该不可预期的效果，非酶促裂解或分子内催化特别受到关注(参见例如B.Testa，J.M：Mayer inHydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism，Wiley-VCH，2003，第5页)。

此外，对于该酶依赖性载体连接的前药，难以建立药代动力学性质的体内-体外相关性。在缺乏可靠的体内-体外相关性的情况下，释放模式的优化成为一项繁重的任务。

应用临时键合连接到存在于药物分子中的氨基的其它聚合物前药基于级联机制。通过连接团化合物使级联解离成为可能，该连接团化合物由掩蔽基团和活化基团的结构组合组成。所述掩蔽基团借助第一临时键合如酯或氨基甲酸酯与所述活化基团连接。所述活化基团通过第二临时键合如氨基甲酸酯与药物分子的氨基连接。第二临时键合(如氨基甲酸酯)的稳定性或对水解的敏感性取决于是否存在掩蔽基团。在掩蔽基团存在时，第二临时键合高度稳定并且不太可能以治疗可用动力学释放药物。在掩蔽基团不存在时，该键合变得高度不稳定，引起迅速裂解和药物释放。

第一临时键合的裂解在级联机制中是限速步骤。该第一步骤可引起活化基团的分子重排如1，6-消除。该重排使得第二临时键合非常不稳定以致诱导其裂解。理想的是，第一临时键合的裂解速率与所给治疗方案中药物分子所需释放速率相同。此外，期望第二临时键合的裂解在其不稳定性被第一临时键合裂解诱导之后基本上即时发生(参见图3)。

基于1，6-消除的该聚合物前药的实例已由R.B.Greenwald等人，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667和PCT专利申请WO-A-99/30727，F.M.H.DeGroot等人(WO02083180和WO04043493A1)以及D.Shabat等人(WO04019993A1)描述。

基于三甲基封闭内酯化的含氨基聚合物前药的实例已由R.B.Greenwald等人，J.Med.Chem.2000，43(3)，457-487；PCT专利申请No.WO-A-02/089789)描述。在该前药系统中，取代的o-羟基苯基-二甲基丙酸通过酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团作为第一临时键合与PEG连接，借助酰胺键作为第二临时键合与药物分子的氨基连接。在药物释放中决定速度的步骤是第一键合的酶促裂解。该步骤继之以经由内酯化的快速酰胺裂解，释放芳族内酯副产物。

由Greenwald、DeGroot和Shabat描述的上述前药系统的缺点是：在临时键合裂解之后，释放高度反应性和潜在毒性的芳族小分子副产物如醌甲基化物或芳族内酯。潜在毒性实体以与药物1∶1的化学计算量释放，并且可假定高体内浓度。

基于1，6-消除的、具有芳族活化基团的一组不同的级联前药在结构上分离掩蔽基团和载体。这可通过使用聚合物载体和活化基团之间的永久键实现。这一稳定的键不参与级联裂解机制。如果载体不作为掩蔽基团且活化基团借助稳定的键与载体偶联，则可避免潜在毒性副产物如活化基团的释放。该活化基团和聚合物的稳定连接还抑制具有不确定药理学的药物-连接团中间体的释放。

Antczak等人(Bioorg Med Chem 9(2001)2843-48)描述了一种试剂，该试剂形成含胺药物分子的大分子级联前药系统的基础。在该方法中，抗体作为载体，稳定的键连接抗体至活化基团，其携带有可酶促裂解的掩蔽基团。酶促除去酯连接的掩蔽基团后，第二临时键裂解并释放药物化合物，如图4所示。

D.Shabat等人(Chem.Eur.J.2004，10，2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基团的聚合物前药系统。在该系统中，掩蔽基团通过氨基甲酸酯键连接至活化基团。活化基团经由酰胺键永久连接至聚丙烯酰胺聚合物。经催化性抗体酶促活化掩蔽基团后，掩蔽基团通过环化而裂解并释放药物。药物释放后活化基团仍然连接至聚丙烯酰胺聚合物。

M.-R.Lee等人(Angew.Chem.2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基团以及可酶促裂解的酯连接的掩蔽基团的类似前药系统。

然而在这些连接团中，1，6-消除步骤仍产生高度反应性的芳族中间体。即使芳族部分仍然永久地连接到聚合物载体，仍可引起具有潜在毒性和免疫原作用的副反应。

由于这些原因，需要提供形成含胺活性剂聚合物前药的新连接团技术，该技术使用脂族前药连接团，其不是酶依赖型的且在裂解期间不产生反应性芳族中间体。

A.J.Garman等人(A.J.Garman，S.B.Kalindjan，FEBS Lett.1987，223(2)，361-365 1987)使用PEG5000-马来酸酐用于可逆地修饰组织型纤溶酶原激活物和尿激酶中的氨基。通过裂解马来酰胺酸键合、在pH7.4缓冲溶液中温育，自PEG-uPA缀合物再生功能酶，这遵循一级动力学，半衰期为6.1h。该马来酰胺酸键合的缺点是缺乏较低pH值下缀合物的稳定性。这将马来酰胺酸键合的可用性限制于在碱性(高)pH值下稳定的活性剂，因为活性剂聚合物缀合物的纯化必须在碱性(高pH)条件下进行，以防止前药过早裂解。

最近，R.B.Greenwald等人(Greenwald等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734以及WO 2004/108070A2)描述了基于N，N-二-(2-羟乙基)甘氨酰胺(N-二(羟乙基)甘氨酸)连接团的PEG级联前药系统。在Greenwald等人的论文和专利申请中描述的系统中，两个PEG载体分子经由临时键连接至与药物分子氨基偶联的N-二(羟乙基)甘氨酸分子上。前药活化的前两步是酶促裂解连接PEG载体分子和N-二(羟乙基)甘氨酸活化基团的羟基的第一临时键合。描述了导致不同前药活化动力学的PEG和N-二(羟乙基)甘氨酸之间不同的键合。前药活化的第二步骤是裂解连接N-二(羟乙基)甘氨酸活化基团至药物分子氨基的第二临时键合(图5)。该系统的主要缺点是：聚合物通过临时键与N-二(羟乙基)甘氨酸连接团连接，以及该第二临时N-二(羟乙基)甘氨酸酰胺键合的慢水解速率(在磷酸盐缓冲溶液中t_1/2＞3h)，这导致N-二(羟乙基)甘氨酸-修饰的前药中间体释放，与母体原始药物分子相比，该前药中间体可显示不同的药代动力学、免疫原性、毒性和药效学性质。

发明详述

本发明解决了上述缺点。本发明提供了聚合物前药，其特征在于经由N-二(羟乙基)甘氨酸连接团连接聚合物至含胺药物分子的伯或仲氨基，其中聚合物经由永久键合连接至N-二(羟乙基)甘氨酸连接团，且N-二(羟乙基)甘氨酸连接团和含胺药物分子之间的键是临时键合。N-二(羟乙基)甘氨酸在本申请中用作N，N-二(2-羟乙基)-甘氨酰或N，N-二(2-羟乙基)-甘氨酰胺或N，N-二(2-羟基)甘氨酸的同义词。由于存在载体与N-二(羟乙基)甘氨酸连接团之间的永久键，本发明的聚合物前药确保了未修饰原始药物分子的释放(图6)。

本发明提供式Ia、Ib或Ic的聚合物前药及相应的聚合物连接团试剂。

其中T、X和R1至R12定义如下：

通过聚合物取代的N-二(羟乙基)甘氨酸残基的水解裂解自本发明聚合物前药释放原始药物是通过式Ia聚合物前药示例说明，其中R2至R12是氢。

如上所述，原始药物自聚合物载体的释放可通过酶促或非酶促步骤介导，如pH-依赖性水解或分子内环化。在本发明优选的实施方案中，裂解通过非酶促方式实现。本发明聚合物前药在pH 7.4的水性缓冲溶液中、在37℃的裂解动力学半衰期优选为3小时至6个月、更优选1天至3个月、且最优选1天至2个月。

式Ia、Ib或Ic中的X、T、R1至R12的定义

T是D或A

在本发明的结构是聚合物前药连接团试剂的情况下，T是A，且A是离去基团。适合的离去基团A的非限制性实例包括但不限于氯、溴、氟、硝基苯氧基、咪唑基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基苯并三唑基、N-羟基偶氮苯并三唑基、五氟苯氧基、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基或本领域技术人员已知的任何其它离去基团。

在本发明的结构是聚合物前药的情况下，T是D，且D是含胺生物活性物质的残基，该生物活性物质包括但不限于小分子生物活性部分或生物聚合物如蛋白质、多肽和寡核苷酸(RNA、DNA)、核酸肽(PNA)。

注意在本说明书中经常提及前药。真正的前药在T是含胺生物活性物质或部分的残基时成立。如果T是离去基团A，则通式表示聚合物前药连接团试剂。简而言之，聚合物前药连接团试剂也被称为本说明书中的前药。根据上下文应当理解所指的是真正的前药还是聚合物前药连接团试剂。

适合的有机小分子生物活性部分非限制性地包括如具有至少一个伯氨基团或仲氨基团的心血管剂、中枢神经系统活性剂、抗感染剂、抗肿瘤剂、抗菌剂、抗真菌剂、镇痛剂、避孕剂、抗炎剂、甾体剂、血管舒张剂和血管收缩剂等部分。该类化合物的非排他性实例是柔红霉素、阿霉素、伊达比星、米托蒽醌、氨鲁米特、金刚烷胺、氨苯砜、乙胺丁醇、磺胺嘧啶(sulfadiazin)、磺胺甲嘧啶(sulfamerazin)、磺胺甲

唑(sulfamethoxazol)、磺胺甲氧吡嗪(sulfalen)、克林沙星、莫西沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星、新霉素B、大观霉素、卡那霉素A、美罗培南、多巴胺、多巴酚丁胺、赖诺普利、5-羟色胺、氨磺丁脲(carbutamid)、阿西维辛(acivicin)等。

具有至少一个游离氨基的适合的蛋白质和多肽包括但不限于ACTH、腺苷脱氨酶、agalsidase、白蛋白、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、α-1蛋白酶抑制剂(API)、组织纤维蛋白溶原酶激活剂、anistreplase、安克洛酶丝氨酸蛋白酶、抗体类(单克隆或多克隆，以及片段或融合物)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑肽酶、门冬酰胺酶、biphalin、骨形态发生蛋白质、降钙素(鲑鱼)、胶原酶、脱氧核糖核酸酶、内啡肽、恩夫韦地(enfuvirtide)、脑啡肽、红细胞生成素、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、纤溶酶、融合蛋白、促卵泡激素、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖素、胰高血糖素样肽如GLP-1、葡糖脑苷脂酶、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、磷脂酶-活化蛋白(PLAP)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、血红蛋白、乙型肝炎疫苗、蛭素、透明质酸酶、艾杜糖苷酸酶、免疫球蛋白、流感疫苗、白细胞介素类(1α、1β、2、3、4、6、10、11、12)、IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)、胰岛素类、干扰素类(α2a、α2b、α2c、β1a、β1b、γ1a、γ1b)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子类、乳糖酶、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)、左甲状腺素、黄体生成素、莱姆(lyme)疫苗、利尿钠肽、胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、甲状旁腺激素、PDGF、胃蛋白酶、血小板激活因子乙酰基水解酶(PAF-AH)、催乳素、蛋白C、抑生长肽、胰泌素、舍莫瑞林、超氧化物歧化酶(SOD)、促生长素(生长激素)、生长抑素、链激酶、蔗糖酶、破伤风毒素片段、tilactase、凝血酶、胸腺素、促甲状腺激素、促甲状腺素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体-IgG Fc、组织纤溶酶原激活物(tPA)、TSH、尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗类、植物蛋白例如凝集素和蓖麻毒蛋白。

本文还包括具有体内生物活性的任何合成的多肽或多肽的任何部分。此外，还包括由重组DNA方法制备的蛋白，包括上述蛋白的突变型、抗体片段、单联结合蛋白、催化抗体和融合蛋白。

优选的蛋白是抗体、降钙素、G-CSF、GM-CSF、红细胞生成素类、血红蛋白类、白细胞介素类、胰岛素类、干扰素类、SOD、生长激素、TNF、TNF-受体-IgG Fc和GLP-1。

X是间隔部分如R13-Y1。

Y1是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或者含有游离电子对的任何杂原子，或者不存在。

R13选自取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基等。

R2和R3独立地选自氢、酰基、包括聚合酰基，或羟基保护基如三苯甲基、甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，以及其它本领域技术人员已知的保护基。适合的保护基描述于TW Greene，P.G.M.Wuts，“有机合成中的保护基”，1999，John Wiley & Sons，第3版。

R4至R12独立地选自氢、X-R1、取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、氰基、羟基、硝基、卤素、羧基、羧酰胺等。

R4至R12优选独立地选自氢、取代或未取代的直链、支链或环状C₁至C₈烷基或杂烷基。

R4至R12最优选是氢。

本发明上下文中的术语“杂烷基”表示(直链、环状或支链)烷基链，其中烷基链在任意位置含有一个或多个杂原子或基团或者被一个或多个杂原子或基团取代，所述杂原子独立地选自O、S、N、P、Si、Cl、F、Br、I等，所述基团独立地选自羧酰胺、羧酸酯、膦酸酯、磷酸酯、双键或三键、氨基甲酸酯、脲、硫脲、硫代氨基甲酸酯、肟、氰基、羧基、羰基等。

R1是聚合物。

适合的聚合物的非限制性实例是基于聚烷氧基的聚合物如聚(丙二醇)或聚(乙二醇)、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸和衍生物、藻酸盐、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜聚糖、琼脂糖、纤维素、淀粉、羟乙基淀粉(HES)和其它基于碳水化合物的聚合物、聚(乙烯醇类)、聚(

唑啉类)、聚(酐类)、聚(原酸酯类)、聚(碳酸酯类)、聚(氨基甲酸乙酯类)、聚(丙烯酸类)、聚(丙烯酰胺类)如聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)(HMPA)、聚(丙烯酸酯类)、聚(甲基丙烯酸酯类)如聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(有机磷腈类)(poly(organophosphazenes))、聚(硅氧烷类)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(氰基丙烯酸酯类)、聚(酯类)如聚(乳酸)或聚(乙醇酸类)、聚(亚胺基碳酸酯类)、聚(氨基酸类)如聚(谷氨酸)、胶原、明胶、共聚物类、接枝共聚物类、交联聚合物类、水凝胶类以及来自上述聚合物的嵌段共聚物类。

水凝胶可定义为吸收大量水的三维、亲水或两亲性聚合物网状物。该网状物由均聚物或共聚物组成，由于存在共价化学或物理(离子、疏水性相互作用、缠绕)交联而不能溶解。该交联物提供网状结构和物理完整性。水凝胶表现与水具有热力学相容性，这使得它们在水性介质中膨胀(参见：N.A.Peppas，P.Bures，W.Leobandung，H.Ichikawa，“药物制剂中的水凝胶”，Eur.J.Pharm.Biopharm.2000，50，27-46)。所述网状物的链以这样的方式连接，即存在孔并且这些孔的大部分的尺寸为1至1000nm。通过选择特定聚合条件，水凝胶可以以无定形凝胶的形式获得或者为珠状树脂。这种软珠粒具有1至1000微米的直径。

水凝胶可以从上述聚合物或共聚物合成，并且通过自由基、阴离子或阳离子、通过化学反应如缩合或加成反应进行物理交联或化学交联，如W.E.Hennink and CF.van Nostrum，Adv.Drug Del.Rev.2002，54，13-36中所述。

进一步的实例包括支化或超支化(hyperbranched)聚合物。这些聚合物的实例包括树状聚体和其它密集星形聚合物(dense star polymer)(R.Esfand，D.A.Tomalia，Drug Discov Today，2001，6(8)，427-436；P.M.Heegaard，U.Boas，Chem.Soc.Rev.2004(33(1)，43-63；S.M.Grayson，JM.Frechet，Chem.Rev.2001，101(12)，3819-3868)。

R1还可以是生物聚合物如蛋白质。这些聚合物的非限制性实例包括白蛋白、抗体、转铁蛋白、纤维蛋白、酪蛋白和其它血浆蛋白。

各R1聚合物可以携带一个或多个生物活性物质，该生物活性物质通过与本文所述的第二前药连接团或本领域技术人员已知的任何其它连接团缀合而连接至聚合物。所述聚合物可具有其它取代基，并且可以被官能化以连接至间隔部分X。这些官能团的非限制性实例包括羧酸和活化衍生物、氨基、马来酰亚胺、硫醇、磺酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、羟基、醛、酮、肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸和衍生物、膦酸和衍生物、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基、芳化剂如芳基氟、羟胺、二硫化物如二吡啶基二硫、乙烯基砜、乙烯基甲酮、重氮烷类、重氮乙酰基化合物、环氧化物、环氧乙烷和氮丙啶。

R1聚合物的优选官能团包括但不限于硫醇、马来酰亚胺、氨基、羧酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、醛和卤代乙酰基。

尤其优选的官能团包括硫醇、马来酰亚胺、氨基、羧酸和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物和碳酸酯及其衍生物。

X和R1之间形成的适合的键或基团的非限制性实例包括二硫化物、S-琥珀酰亚胺基、酰胺基、氨基、羧酸酯、磺酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、肟、硫醚、腙、脲、硫脲、磷酸酯、膦酸酯等。

X和R1之间形成的优选的键或基团包括S-琥珀酰亚胺基、酰胺基、氨基甲酸酯和脲。

优选地，R1聚合物是适当水合的、可降解或可排泄的，对哺乳动物无毒或无免疫原性。优选的R1聚合物包括基于聚烷氧基的聚合物如聚乙二醇和描述于Nektar Inc.2003 catalog“Nektar Molecule Engineering-Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”中的那些聚乙二醇试剂，和支化的、超支化的、交联聚合物和水凝胶类，以及蛋白类如白蛋白。

聚合物前药的一般性合成工艺

本发明聚合物前药的代表性实例的合成描述于实施例部分。

本发明前药可以以各种不同的方式制备。图8显示了合成本发明式Ic的聚合物前药的第一种一般途径。

在该第一种方法中，通过用原料(II)替换固定化原料(III)的离去基团A，提供固相固定化中间体(IV)。任选地，该取代可以在溶液中用可溶性原料(III)进行。(III)中的X可以用适合的保护基PG保护。适合的保护基描述于TW Greene，P.G.M.Wuts，“有机合成中的保护基”，1999，John Wiley& Sons，第3版。

将中间体(V)从固相中裂解，并且所有保护基用试剂如三氟乙酸或DTT裂解。然后使中间体(V)与聚合物R1反应，得到聚合物前药(Ica)。

式Ib的聚合物前药可以通过如上对式Ic前药所述的本领域技术人员已知的类似方法、使用例如原料IIa制备。

图9显示了合成本发明式Ia聚合物前药的第二种一般途径。

在该第二种方法中，固相固定化中间体(VII)从原料(VI)、通过一个或两个亲核取代步骤或者一个或两个还原烷基化步骤提供。任选地，该取代或还原烷基化步骤可以在溶液中用可溶性原料(VI)进行。(III)中的X可以用适合的保护基PG保护。

将中间体(V)从固相中裂解，并且所有保护基用试剂如三氟乙酸或DTT裂解。然后使中间体(VIII)与聚合物R1反应，得到聚合物前药(Iaa)。

图10显示了合成本发明式Ia聚合物前药的另一种一般途径。

在该方法中，固相固定化中间体(X)从原料(IX)、通过一个或两个亲核取代步骤或者一个或两个还原烷基化步骤提供。任选地，该取代或还原烷基化步骤可以在溶液中用可溶性原料(IX)进行。(X)中的X可以用适合的保护基PG保护。将中间体(XI)从固相中用试剂如六氟异丙醇裂解，但不裂解保护基。

在第一途径中，将中间体(XI)用试剂如碳二亚胺类和N-羟基琥珀酰亚胺活化，得到(XII)。使中间体(XII)与含胺药物分子反应，得到中间体(XIII)。将保护基PG从中间体(XIII)裂解之后，使该化合物与聚合物R1反应，得到聚合物前药Iaa。

在第二途径中，将保护基用试剂如三氟乙酸或DTT从(XI)中裂解，使残基与聚合物R1反应，得到中间体(XIV)。将中间体(XIV)用试剂如碳二亚胺类和N-羟基琥珀酰亚胺活化，得到中间体(XV)，使其与含胺药物反应，形成聚合物前药Iaa。

在第三途径中，将保护基PG从活化中间体(XII)中裂解，使残基与聚合物R1反应，得到中间体(XV)，然后使其与含胺药物反应，形成聚合物前药Iaa。

应当理解，根据本发明所述并携带合成相应聚合物前药中所述和所用的保护基或离去基团的连接团结构被视为在本发明范围内。

聚合物前药在分子治疗中的应用

本发明的关键优势是从聚合物前药释放未修饰的生物活性部分。在Greenwald等人(Greenwald等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734)描述的前药中，生物活性部分从聚合物载体中释放，作为N-二(羟乙基)甘氨酸修饰的药物分子而具有不可预测的药代动力学、免疫原性、毒性和药效学特征。在本发明前药中释放N-二(羟乙基)甘氨酸修饰的药物分子是不可能的，因为聚合物载体与N-二(羟乙基)甘氨酸连接团永久键合。

对于聚合物前药，需要临时键合的裂解动力学在人体血液中(pH7.4，37℃)存在的条件下进行。最重要的是，该临时键合的裂解应该基于水解，并且不呈现或仅呈现极有限的对存在于人血液中的化学或生物化学或物理化学实体如酶、盐或结合蛋白的依赖性。

本发明聚合物前药的进一步关键优势是它们的优势非酶促裂解：前药的体内半衰期至少为前药在pH7.4的无酶缓冲溶液中的半衰期的50％。这种优势非酶促裂解使得在施用于活有机体之后对释放速率具更好的预测性和控制性，并且降低了患者间的差异性。

现已令人惊奇地发现：连接N-二(羟乙基)甘氨酸连接团与药物分子氨基的临时键合的裂解速率可通过由N-二(羟乙基)甘氨酸连接团的不同取代或聚合物连接介导的邻近基团效应来控制。通过基本上非酶促的化学反应来控制释放速率，该化学反应又依赖于该连接团的分子结构。化学结构的系统性或随机性修饰、例如通过改变聚合物在N-二(羟乙基)甘氨酸连接团上的连接位点，使得可以产生具有不同释放速率的前药连接团。因此，可能产生多种前药连接团，并根据给定医药或治疗应用所提出的要求选择快速或慢速裂解的前药连接团。

不依赖于酶的释放控制使得不需要包封的贮库型制剂成为可能。到目前为止，许多生物相容性材料如大孔径水凝胶类不能用于贮库型制剂，原因是它们缺乏包封性能。对于大多数治疗应用而言，生物活性部分将自这种适当水合且机械上软性的生物相容性材料中释放得太快。结合本发明所述的前药连接团，可以优化载体材料的生物相容性，因为释放仅仅受到连接团裂解动力学的控制，并且不需要聚合物载体本身的化学和酶促降解。

附图说明

图1显示载体连接的前药。

图2显示酶依赖性载体连接的前药。

图3显示级联前药，其中掩蔽基团是载体的一部分。

图4显示酶依赖性级联前药，其中掩蔽基团与载体分离，且载体被永久地连接到活化基团。

图5显示具有N-二(羟乙基)甘氨酸活化基团的载体连接的级联前药，其中掩蔽基团是载体的一部分。

图6显示具有N-二(羟乙基)甘氨酸连接团的载体连接的前药，其中载体被永久地连接到N-二(羟乙基)甘氨酸连接团。

图7显示聚合物前药的体内裂解。

图8显示一般合成方法。

图9显示一般合成方法。

图10显示一般合成方法。

实施例

材料

Fmoc-氨基酸、树脂和PyBOP购自Novabiochem，并根据产品目录命名。Fmoc-Ado-OH得自Neosystem。所有其它化学品购自Sigma Aldrich。重组人胰岛素来自ICN Biomedicals(USA)。马来酰亚胺-PEG5k得自Nektar(USA)。5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(混合的异构体)得自Molecular Probes。

分析

质谱法(MS)在Waters ZQ 4000 ESI仪上进行，如果必要，光谱通过Waters软件MaxEnt解析。尺寸排阻色谱法使用配备Superdex 200柱的Amersham Bioscience AEKTAbasic系统(Amersham Bioscience)进行。

1的合成：

将1g(5.5mmol)3，6-二氧杂辛烷-1，8-二硫醇溶于10ml DMF，加入1g(3.6mmol)三苯甲基氯和1ml吡啶。将该溶液在室温搅拌30min，将单-S-三苯甲基保护的3，6-二氧杂辛烷-1，8-二硫醇通过RP-HPLC纯化(产率850mg，2mmol，56％)。

将300mg(0.71mmol)S-三苯甲基-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二硫醇溶于5ml19/1(v/v)甲醇/水中，加入300μl表氯醇、500μl吡啶和50μl DIEA。将该溶液在40℃搅拌14小时，然后加入50ml水。过滤收集沉淀物，在真空中干燥。将沉淀物溶于5ml二烷，加入100μl水和500μl 2-氨基乙醇。将该溶液在60℃搅拌72小时。加入1ml乙酸后，将产物1通过RP-HPLC纯化(产率：215mg，0.4mmol，56％)。

MS[M+Na]⁺＝564.9(MW+Na计算值＝564.8g/mol)。

2的合成：

2是如1所述、使用1g 1，4-二硫苏糖醇合成。

MS[M+Na]⁺＝536.8(MW+Na计算值＝536.7g/mol)。

3和4的合成：

Lys28 ivDde侧链保护的GLP(7-36)(序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR-酰胺)在Rink-酰胺树脂上、使用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories，Heidelberg，德国)合成。将N-末端fmoc-保护基除去，将树脂用DCM洗涤，干燥。将50mg树脂(0.11mmol/g，5.5μmol)混悬于42mg溴乙酸(300μmol)和47μl(300μmol)DIC在500μl DMF中的溶液中。在室温将该混合物振摇30分钟。用DMF洗涤树脂6次之后，将该树脂在20mg 2和10μl DIEA在200μl DMF中的溶液中温育2小时。用DMF洗涤树脂6次之后，通过用含5％肼的DMF温育树脂3次，将ivDde保护基裂解达20分钟。将树脂各用DMF和DCM洗涤6次。从树脂裂解肽和保护基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基甲硅烷/水进行90min而完成。在氮气流下除去挥发性物质。将3a通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

MS：[M+3H]³⁺＝1204.2，[M+2H]²⁺＝1806.3(MW计算值＝3609g/mol)。

对于3b的合成，将150mg树脂(0.11mmol/g，16.5μmol)混悬于126mg溴乙酸(900μmol)和141μl(900μmol)DIC在1.5ml DMF中的溶液中。将该混合物在室温振摇30分钟。用DMF洗涤树脂6次之后，将该树脂在60mg2和30μl DIEA在600μl DMF中的溶液中温育2小时。用DMF洗涤树脂6次之后，通过用含5％肼的DMF温育树脂3次，将ivDde保护基裂解达20分钟。将树脂各用DMF洗涤6次。

将20mg Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(50μmol)与8.2μl DIC(50μmol)、8mg HOBt(50μmol)和0.5ml DMF混合，在室温温育30分钟。然后将树脂与反应混合物温育2小时，用DMF洗涤树脂6次。用含20％哌啶的DMF除去Fmoc保护基达15分钟。用DMF洗涤树脂6次，与12mg 5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(25μmol)和10μl DIEA在500μl DMF中的溶液温育1小时。将树脂各用DMF和DCM洗涤6次，干燥。从树脂中裂解肽和保护基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基甲硅烷/水进行90分钟而完成。在氮气流下除去挥发性物质。将3b通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

MS：[M+3H]³⁺＝1372.0，[M+2H]²⁺＝2057.5(MW计算值＝4113g/mol)。

对于4的合成，将50mg树脂(0.11mmol/g，5.5μmol)混悬于25mg boc-β丙氨酸(80μmol)、29μl DIEA和42mg PyBop(80μmol)在500μl DMF中的溶液中。将该混合物在室温振摇30分钟。用DMF洗涤树脂6次之后，通过用含5％肼的DMF温育树脂3次，将ivDde保护基裂解达20分钟。如上述偶联溴乙酸。用DMF洗涤树脂6次之后，将树脂在20mg 2和10μl DIEA在200μl DMF中的溶液中温育14小时。将树脂各用DMF和DCM洗涤6次。从树脂中裂解肽和保护基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基甲硅烷/水完成。在氮气流下除去挥发性物质，将4通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

MS：[M+3H]³⁺＝1227.9，[M+2H]²⁺＝1841.4(MW计算值＝3680g/mol)。

5和6的合成

如3和4所述、分别使用20mg 1合成5和6。

5：MS：[M+3H]⁴⁺＝1213.4，[M+2H]³⁺＝1819.3(MW计算值＝3637g/mol)

6：MS：[M+3H]⁴⁺＝1237.4，[M+2H]³⁺＝1855.2(MW计算值＝3708g/mol)

化合物14的合成方案

化合物11的合成

将750mg 6-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)己酸(2.9mmol)和180mg红磷(5.8mmol)混悬于7ml CCl₄中，分两批加入600μl Br₂(11.7mmol)。将反应混合物在90℃搅拌5小时。冷却之后，将该混合物用20ml水和20ml二乙醚稀释，用NaHCO₃中和。通过加入NaHSO₃还原过量的Br₂。将分离的有机层用NaHCO₃水溶液萃取。合并水层，用浓HCl酸化。过滤收集粗产物，从EtOH-水中重结晶。

产率350mg(36％)。

MS[M+Na]⁺＝364.2(MW+Na计算值＝363.0g/mol)。

化合物13的合成

侧链保护的GLP(7-36)(序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺)在Rink-酰胺树脂上、使用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories，Heidelberg，德国)合成。将N-末端fmoc-保护基除去，将树脂用DCM洗涤，干燥。

将3.6mg 11(10μmol)、1.5mg HOBt(10μmol)和1.6μl DIC(10μmol)在300μl DMF中的溶液加至10mg荷载的树脂(0.22mmol/g，2.2μmol)中，将该混合物在RT振摇3小时。用DMF和DCM洗涤树脂之后，加入19mg二(2-羟乙基)胺(180mmol)在400ml DMF中的溶液，将该混悬液在70℃温育2小时，得到12。用DMF和EtOH洗涤树脂，然后在60℃用400μl1/99(v/v)N₂H₄一水合物/乙醇处理1小时，除去苯邻二甲酰亚胺保护基。用EtOH和DMF洗涤之后，加入3.8mg Mmt-巯基丙酸(10mmol)、1.5mgHOBt(10μmol)和1.6μl DIC(10μmol)在300μl DMF中的溶液，将该混合物在RT振摇3小时，随后用DMF和DCM洗涤树脂。从树脂中裂解肽和保护基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基甲硅烷/水完成。在氮气流下除去挥发性物质，将13通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

13：产率1.2mg(14％)。

MS[M+2H]²⁺＝1801.4；[M+3H]³⁺＝1201.2(MW计算值＝3604g/mol)。

缀合物7、8、9、10和14的合成

将3(0.1μmol)在1/1(v/v)乙腈/水(30μl)中的溶液与马来酰亚胺-PEG5k(0.2μmol)混合于1/1(v/v)乙腈/水(50μl)和50μl 0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中。将该混合物在RT温育10分钟。使用10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)、150mM NaCl和0.005％Tween 20作为流动相，将缀合物7通过RP-HPLC纯化，通过SEC(柱：Superdex 200，流速0.75ml/min)分析，使用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)、150mM NaCl和0.005％Tween 20作为流动相。

7：SEC保留时间：19.5min。

8、9和10分别从如上所述的4、5和6合成。

14从如上所述的13合成，并通过SEC(柱：Superdex 200，流速：0.75ml/min)纯化，使用10mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)、150mM NaCl和0.005％Tween 20作为流动相。将收集的洗脱液(约1.0ml)用0.5ml含有0.05％NaN₃的缓冲溶液稀释，直接用于用于释放速率测定。

14：SEC保留时间：19.7分钟。

化合物17的合成方案

化合物16的合成

将170mg 2-氯三苯甲基氯树脂(荷载1.2mmol/g，0.2mmol)与200mgDde-Lys(Fmoc)-OH(0.4mmol)和140μl DIEA(0.8mmol)在4ml DCM中温育1.5小时。将Fmoc-保护基用哌啶/DMF裂解，用DCM和DMF洗涤树脂。将树脂在室温与209mg Trt-巯基丙酸(0.6mmol)、93mg HOBt(0.6mmol)和97μl DIC(0.6mmol)在DMF中的溶液振摇2小时。将树脂用含2％肼的DMF处理三次，除去Dde保护基。用DMF洗涤之后，加入240mg乙醇醛二聚物(glycole aldehyde dimer)(2.00mmol)、252mg NaCNBH₃(4.00mmol)和200μl乙酸在20ml DMF中的溶液，将该混合物振摇过夜，得到15。将树脂用DMF洗涤，在RT与309mg Mmt-Cl(1.00mmol)在2ml吡啶中的搅拌3小时。将树脂用DCM洗涤，干燥。用1/7(v/v)HFIP/DCM(2×2min)将产物16从树脂解离。在氮气流下除去挥发性物质，将16通过硅胶柱色谱法、使用DCM/MeOH/Et₃N(85∶15∶0.03(v/v))作为流动相纯化。

Rf(DCM/MeOH/Et₃N(85∶15∶0.03(v/v))＝0.5。

16：产率108mg(50％)。

MS[M+Na]⁺＝1131.9(MW+Na计算值＝1131.6g/mol)。

化合物17的合成

将4ml乙腈中的65mg 16(59μmol)、9.3μl DIC(60μmol)和13.8mgHOSu(120μmol)在RT搅拌3小时。蒸发溶剂，将17通过硅胶柱色谱法、使用庚烷/EtOAc/Et₃N(50∶50∶0.03(v/v))作为流动相纯化。

Rf(庚烷/EtOAc/Et₃N(50∶50∶0.03(v/v))＝0.4。

17：产率56mg(77％)，为TFA盐。

MS[M+Na]⁺＝1228.7(MW+Na计算值＝1228.6g/mol)。

化合物18的合成

N^εB29-荧光素胰岛素的合成：

将80mg(13.8μmol)rh-胰岛素溶于4ml 1/1(v/v)DMF/DMSO中，加入40μl DIEA。加入8mg(17μmol)5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯，将该溶液在室温搅拌30分钟。加入4ml 5/5/1(v/v/v)乙腈/水/乙酸，将产物N^εB29-荧光素胰岛素通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。通过用1，4-二硫苏糖醇还原N^εB29-荧光素胰岛素、蛋白酶消化和MS分析验证缀合位点。

MS：[M+2H]²⁺＝3084.0；[M+3H]³⁺＝2054.6(MW计算值＝6166g/mol)。

将DMF(20μl)中的4.4mg 16(4.0μmol)、0.6μl DIC(4.0μmol)和0.9mgHOSu(8.0μmol)在RT反应2小时。将该溶液加至DMSO(60μl)中的6.2mgN^εB29-荧光素-rh-胰岛素(1.0μmol)和DIEA(2μl)，将该混合物在RT搅拌90分钟。将反应混合物用乙酸中和，用乙腈/H₂O稀释。RP-HPLC纯化，得到适合的Mmt-和Trt-保护的中间体。

冷冻干燥之后，将该Mmt-和Trt-保护的中间体与95∶5(v/v)TFA/三乙基甲硅烷混合，搅拌5分钟。在氮气流下除去挥发性物质，将18通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

MS[M+2H]²⁺＝3238.2；[M+3H]³⁺＝2157.2(MW计算值＝6472g/mol)。

化合物19的合成

将18(1.5nmol)在1/4(v/v)乙腈/水(20μl)中的溶液与马来酰亚胺-PEG5k(1.9nmol)在1/4(v/v)乙腈/水(10μl)和50μl 0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中混合，在RT温育2分钟。将化合物通过SEC(柱：Superdex 200，流速：0.75mL/min)、使用10mM HEPES缓冲溶液(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％ Tween 20作为流动相纯化。将收集的洗脱液(约1.5mL)直接用于释放速度测定。

19：SEC保留时间：18.8分钟。

N^εB29缀合的化合物20的合成

将NMP中的8μl 83mM 17(0.6μmol)加至DMSO(60μl)中的6.2mg rh-胰岛素(1.0μmol)和DIEA(0.5μl)，将该混合物在RT搅拌90分钟。将反应混合物用乙酸中和，用乙腈/H₂O稀释。RP-HPLC纯化，得到适当的Trt-和Mmt-保护的中间体。冷冻干燥之后，将Trt-和Mmt-保护的中间体与95∶5(v/v)TFA/三乙基甲硅烷混合，搅拌5分钟。在氮气流下除去挥发性物质，将20通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。通过DTT还原和MS分析验证胰岛素修饰的位置。

MS[M+3H]³⁺＝2038.1；[M+4H]⁴⁺＝1528.1(MW计算值＝6112g/mol)。

化合物21的合成：

21如19所述从20合成。

21：SEC保留时间：18.6分钟。

22的合成

Lys28 ivDde侧链保护的GLP(7-36)(序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR-酰胺)在Rink-酰胺树脂上、使用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories，Heidelberg，德国)合成。除去N-末端fmoc-保护基，将树脂用DCM洗涤，干燥。将150mg树脂(0.11mmol/g，16.5μmol)在20mg Fmoc-Ado-OH(50μmol)、25mgPyBop(50μmol)和17μl DIEA在500μl DMF中的溶液中温育1小时。用96/2/2 DMF/哌啶/DBU除去fmoc保护基之后，用17.4mg Trt-巯基丙酸(50μmol)、25mg PyBop(50μmol)和17μl DIEA(100μmol)在500μl DMF中的溶液将树脂温育1小时。通过在500μl 9/1(v/v)DMF/肼中将树脂温育2小时而除去ivDde保护基。用DMF洗涤树脂之后，将Fmoc-Ado-OH偶联，如上所述除去fmoc保护基。然后将树脂用16mg 5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯和6μl DIEA在500ml DMF中的溶液温育2小时。从树脂中裂解肽和保护基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基甲硅烷/水进行90分钟而完成。在氮气流下除去挥发性物质。将22通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥。

MS：[M+3H]³⁺＝1345.9，[M+2H]²⁺＝2016.9(MW计算值＝4034g/mol)。

rHSA-马来酰亚胺(23)的合成

将500μl在145mM NaCl、32mM辛酸钠、0.0015％Tween-80中的3mMrHSA(1.5μmol)溶液与100μl 0.5M磷酸盐缓冲溶液pH7.0混合。加入1.5mgN，N′-二马来酰亚胺基丙酰基-2-羟基-1，3-二氨基丙烷(3.75μmol)，将该混合物在RT反应20分钟。将化合物23通过SEC(柱：Superdex 200 26/60，流速：4ml/min)、使用10mM磷酸钠缓冲溶液pH7.4、150mM NaCl作为流动相纯化。

ESI-MS＝66900(MW计算值＝66864g/mol)。

氟硼荧(Bodipy)标记的rHSA(24)的合成

将500μl在145mM NaCl、32mM辛酸钠、0.0015％Tween-80中的3mMrHSA(1.5μmol)溶液与250μl 0.5M硼酸钠缓冲溶液pH8.0混合。加入DMSO中的43μl 100mM BODIPY

TR-X，STP酯(Molecular Probes)，将该混合物在RT反应20分钟。将Bodipy标记的rHSA(24)通过SEC(柱：Superdex 200 26/60，流速：4ml/min)、使用10mM磷酸钠缓冲溶液pH7.4、150mM NaCl作为流动相纯化。

25的合成

将0.75ml 10mM磷酸钠、150mM NaCl pH6中的45mg 23与250μl0.5ml硼酸钠pH8混合，加入50μl DMSO中的8mg 22。将该溶液在室温温育20分钟。将25通过SEC(柱：Superdex 200 26/60，流速：4ml/min)、使用10mM磷酸钠缓冲溶液pH7.4、150mM NaCl作为流动相纯化。

MS：70870(MW计算值＝70898g/mol)。

26的合成

26如25所述、使用23和3b合成。

MS：70950(MW计算值＝70977g/mol)。

在体内从rHSA缀合物26释放荧光素-GLP-1

在体内荧光素-GLP-1自rHSA缀合物26的释放是通过减量法、通过测定注入大鼠之后保持与缀合物连接的荧光素-GLP-1的量而测得。这通过比较两种不同的rHSA-荧光素-GLP-1缀合物完成，其一的荧光素-标记的GLP-1以可逆连接团(缀合物26)连接至白蛋白，对照物中标记的GLP-1永久连接至rHSA(缀合物25)。为了获得高度准确的体内动力学并控制注射位置的差异性，使用了内标物。该内标物是通过共同注入未缀合的Bodipy标记的rHSA(24)而得到。

在对照试验中，使用一组5只雄性Sprague Dawley大鼠。将56nmol 25和97nmol 24在450μl 10mM磷酸钠pH7.4、150mM NaCl中的混合物经皮下注入每只大鼠中。在各时间间隔取血浆样品，测定荧光素和Bodipy荧光。将荧光素/Bodipy荧光的归一比对时间绘图(图7，三角形)。

在主试验中，使用一组3只雄性Sprague Dawley大鼠。将40nmol 26和72nmol 24在450μl 10mM磷酸钠pH7.4、150mM NaCl中的混合物经皮下注入每只大鼠中。在与对照试验中相同的各时间间隔取血浆样品，测定荧光素和Bodipy荧光。将荧光素/Bodipy荧光的归一比(normalized ratio)对时间绘图(图7，方形)。

主试验获得的数据除以由对照试验获得的数据对时间绘图，得到荧光素-GLP-1从缀合物26中的释放动力学。

在缓冲溶液pH7.4中肽或荧光素-肽自缀合物中的释放

(荧光素)-肽自(荧光素)-肽缀合物7、8、9、10、14、19、21和26中的释放是通过在水性缓冲溶液pH7.4中的连接团水解完成。将冷冻干燥的缀合物溶解于10mM HEPES缓冲溶液(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％Tween 20中。将重新溶解的缀合物和收集的(荧光素)肽缀合物的SEC洗脱液在37℃温育，在各时间间隔取样品，通过RP-HPLC(肽缀合物)在215nm处UV检测分析，或通过SEC(荧光素肽缀合物)在500nm处检测分析。分别对与原始肽或荧光素-肽的保留时间关联的峰积分，并对温育时间绘图，应用曲线拟合软件估计相应的释放半衰期。

化合物	t_1/2缓冲液pH 7.4	t_1/2体内
			7	6d	nd
8	9d	nd
			9	10d	nd
10	11d	nd
			14	12d	nd
19	22d	nd
			21	74d	nd
26	6d	3.75d

缩写：

Ado 8-氨基-3，6-二氧杂辛酸

Boc 叔丁氧基羰基

Bodipy BODIPY

TR-X

DBU 1，3-二氮杂二环[5.4.0]十一碳烯

DCM 二氯甲烷

(iv)Dde 1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己基亚基)3-甲基-丁基

DIC 二异丙基碳二亚胺

DIEA 二异丙基乙胺

DMAP 二甲氨基-吡啶

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲基亚砜

DSC 二琥珀酰亚胺基碳酸酯

EDTA 乙二胺四乙酸

eq 化学计算当量

fmoc 9-芴基甲氧基羰基

Fmoc-Ado-OH Fmoc-8-氨基-3.，6-二氧杂辛酸

HFIP 六氟异丙醇

HEPES N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)

HOBt N-羟基苯并三唑

LCMS 质谱偶联液相色谱

Mal 马来酰亚胺丙酰基

Mmt 4-甲氧基三苯甲基

MS 质谱

MW 分子量

Npys 3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(sulfenyl)

PyBOP 苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐

rHSA 重组人血清白蛋白

RP-HPLC 反相高效液相色谱法

RT 室温

SEC 尺寸排阻色谱法

Sue 琥珀酰亚胺基丙酰基

TES 三乙基甲硅烷

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

UV 紫外光

VIS 可见光

Claims

1.一种聚合物前药，包括通过至少一个酰胺键连接到N-二(羟乙基)甘氨酸连接团的至少一种聚合物，该N-二(羟乙基)甘氨酸连接团通过临时键合连接到含胺蛋白质药物，其中所述前药具有以下结构：

其中T是D；

D是含胺蛋白质药物的残基；

X是R13-Y1；

Y1是O、S、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或者含有游离电子对的任何杂原子，或者不存在；

R13选自取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基；

R2和R3是氢；

R4至R12是氢；

R1是聚(乙二醇)，且其中R1具有至少一个官能团以键合至X。

2.权利要求1的前药，其中所述蛋白质选自下组蛋白质：抗体、降钙素、G-CSF、GM-CSF、红细胞生成素、血红蛋白、白细胞介素、胰岛素、干扰素、SOD、生长激素、TNF、TNF-受体-IgG Fc、胰高血糖素样肽。

3.权利要求1的前药，其中的蛋白质是GLP-1。

4.权利要求1的前药，其中R1是聚乙二醇水凝胶。

5.权利要求1的前药，其中R1是支化或超支化聚乙二醇。

6.权利要求1的前药，其中R1是树状聚体或密集星形聚乙二醇。

7.权利要求1的前药，其中所述连接至X的R1的至少一个官能团选自下组官能团：羧酸、氨基、马来酰亚胺、硫醇、磺酸、碳酸酯、氨基甲酸酯、羟基、醛、酮、肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸、膦酸、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基、芳化剂、羟胺、二硫化物、乙烯基砜、乙烯基甲酮、重氮烷、重氮乙酰基化合物、环氧化物和氮丙啶。

8.权利要求7的前药，其中的芳化剂是芳基氟化物。

9.权利要求7的前药，其中的二硫化物是二吡啶基二硫。

10.权利要求7的前药，其中的环氧化物是环氧乙烷。

11.权利要求7的前药，其中所述至少一个官能团选自下组官能团：硫醇、马来酰亚胺、氨基、羧酸、碳酸酯、氨基甲酸酯、醛和卤代乙酰基。

12.权利要求7的前药，其中X和R1之间形成的键或基团选自下组键或基团：二硫化物、S-琥珀酰亚胺基、酰胺基、氨基、羧酸酯、磺酰氨、氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、硫醚、亚胺、肟、腙、脲、硫脲、磷酸酯、膦酸酯。

13.权利要求12的前药，其中X和R1之间形成的键或基团选自下组键或基团：S-琥珀酰亚胺基、酰胺基、氨基甲酸酯、硫醚和脲。

14.合成聚合物前药的方法，包括：

-提供式VI的起始分子，

-通过至少一个取代或还原烷基化步骤形成式VII中间体，

-将式VII中间体从所述固相裂解，将所有存在的保护基裂解，形成式VIII中间体，和

-将聚合物R1连接到式VIII中间体的X，形成聚合物前药；

其中

D是含胺蛋白质药物的残基；

X是R13-Y1，

Y1是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和碳-碳键或者含有游离电子对的任何杂原子，或者不存在，

R13选自取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，

R2和R3是氢，

R4至R12是氢，

R1是聚(乙二醇)。

15.合成聚合物前药的方法，包括：

-提供式IX的起始分子，

-通过至少一个取代或还原烷基化步骤形成式X中间体，

-将式X中间体从所述固相裂解，但不将所有存在的保护基解离，形成式XI中间体，和

-用活化试剂将式XI中间体活化，形成式XII中间体，

-使式XII中间体与含胺药物D反应，形成式XIII中间体，和

-裂解保护基PG后，将聚合物R1连接到式XIII中间体的X，形成聚合物前药；

其中

A是离去基团，

D是含胺蛋白质药物的残基；

X是R13-Y1，

R2和R3是氢，

R4至R12是氢，

R1是聚(乙二醇)。

16.合成聚合物前药的方法，包括：

-提供式XI的起始分子，

-裂解保护基PG后，将聚合物R1连接到式XI中间体的X，形成式XIV中间体；

-用活化试剂将式XIV中间体活化，形成式XV聚合物前药试剂，和

-使式XV中间体与含胺药物D反应，形成聚合物前药；

其中

A是离去基团，

D是含胺蛋白质药物的残基；

X是R13-Y1，

R13选自取代或未取代的直链、支链或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的

芳基、取代或未取代的杂芳基，

R2和R3是氢，

R4至R12是氢，

R1是聚(乙二醇)。

17.合成聚合物前药的方法，包括：

-提供式XII的起始分子，

-裂解保护基PG后，将聚合物R1连接到式XII中间体的X，形成式XV聚合物连接团试剂，和

-使式XV中间体与含胺药物D反应，形成聚合物前药；

其中

A是离去基团，

D是含胺蛋白质药物的残基；

X是R13-Y1，

R2和R3是氢，

R4至R12是氢，

R1是聚(乙二醇)。

18.权利要求15或16的方法，其中所述活化剂是碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺混合物。

19.水解权利要求1的前药的方法，包括将所述前药置于pH约7.4的溶液中的步骤。

20.权利要求19的方法，其中所述溶液是细胞外液。

21.裂解权利要求1的聚合物前药的方法，其中通过含亲核体的连接团的基本上非酶促反应，将所述含胺蛋白质药物从R1裂解。

22.权利要求21的方法，其中所述基本上非酶促反应在约7.4的pH进行。

23.权利要求21或22的方法，其中与所述载体连接的所述含胺部分在细胞外液中裂解。

24.权利要求21或22的方法，其中所述基本上非酶促反应包括水解的步骤。

25.权利要求21或22的方法，其中所述含胺部分是生物活性部分。