JP2001505525A

JP2001505525A - クロストリジウム・ジフィシル・トキシンａの精製方法及び単一特異性抗体

Info

Publication number: JP2001505525A
Application number: JP52932096A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．ドイッチェ、ジョン
Original assignee: リーラボラトリーズインコーポレイテッド
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2001-04-24
Also published as: WO1996030494A1; EP0763100B1; US5610023A; AU4378296A; DE69535754D1; EP0763100A4; DK0763100T3; CA2191774A1; EP0763100A1

Abstract

(57)【要約】不純トキシンＡを固定化単一特異性ポリクローナル抗体と反応させることを包含する、クロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡの精製方法が提供される。このポリクローナル抗体は、ヒドラジド活性化アガロースゲルのようなヒドラジド基含有マトリックスに結合される。この固定化抗体はトキシンＡに特異的であり、トキシンＡ含有溶液からトキシンＡを顕著に精製する。この方法により精製されるトキシンＡに対して生じた抗体は、従来技術の精製トキシンＡから生成される抗体よりも活性の高いものである。

Description

【発明の詳細な説明】クロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡの精製方法及び単一特異性抗体発明の分野本発明は、一般には、クロストリジウム・ジフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡの製造及び精製に関する。特には、本発明は、精製トキシンＡ及び偽膜性大腸炎の診断に用いられる抗体の調製におけるその使用に関する。発明の背景クロストリジウム・ジフィシルは、ヒト及び動物において、穏やかな下痢から生命を脅かす偽膜性大腸炎にまでわたる各種の胃腸疾患を生じる。Ｃ．ジフィシルが、抗生物質の使用による正常大腸フローラの排除とそれに続くこのトキシン産生細菌の成長の結果として、ヒトにおいて偽膜性大腸炎を引き起こすことは広く受け入れられている。４４％もの高さの死亡率が報告されている。この疾患の治療は可能であるが、原因生物の存在を確定し、結腸における特徴的な病巣を示すことにより達成し得る正しい診断に依存する。Ｃ．ジフィシルは、トキシンＡ及びトキシンＢと命名される、組織培養哺乳動物細胞に対して細胞毒性である２種類の毒素を産生する。この細胞毒性に加えて、トキシンＡは腸毒性をも有する。トキシンＡは腸ループ内で体液の滞留を引き起こし、腸粘膜に広範な損傷を引き起こす。疾患の間、両毒素が典型的に産生されるのではあるが、Ｃ．ジフィシル検出の原則的実験室診断方法はトキシンＡの検出に向けられている。例えば、トキシンＡの存在についての商用ラテックス試験がミズーリ州カンザスシティーのＭａｒｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．の一事業部であるＭａｒｉｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって市販されていた。残念ながら、この商用試験はトキシンＡに対して非特異的であることが後続の研究者によって見出された。Ｌｙｅｒｌｙら、，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ，２３：６２２−６２３（１９８６）を参照。病原性Ｃ．ジフィシルを検出する方法の１つはヒトの糞便を培養することを包含し、これは長期のインキュベーションのための専用設備を必要とし、非病原性Ｃ．ジフィシル株による妨害という不利な点を有する。トキシンＢを検出する別の方法は組織培養細胞を用いる細胞毒性検定である。しかしながら、この方法はトキシンＡの検出にはうまく機能しない。トキシンＡは効力の点で大きく劣る細胞毒であるため、組織培養検定で検出することはより困難である。トキシンＡ検出のための開発された他の方法は、トキシンＡに対する特異性抗体の使用に基づいている。これらの方法には、Ｌｙｅｒｌｙら、，Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，１７：７２− ７８（１９８３）及びＬａｕｇｈｔｏｎら、，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４９：７８１−７８８（１９８４）によって教示される酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。Ｌｙｅｒｌｙらは１ｎｇ（５ｎｇ／ｍｌ）量でのトキシンＡの検出を報告した。これに対して、Ｌａｕｇｈｔｏｎらは０．１ｎｇ（１．０ｎｇ／ｍｌ）レベルでの検出を報告した。トキシンＡに対するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ検定はＬｙｅｒｌｙら、，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，２１：１２−１４（１９８５）によって報告されており、４ｎｇ（０．０２μｇ／ｍｌ）のトキシンＡを検出することが可能であった。この検出レベルは、通常は、Ｃ．ジフィシルに関連する下痢を患う患者からの糞便試料中での毒素の検出に十分である。他の抗体依存性試験はラテックス凝集試験（ＬＡＴ）である。ここでは、抗体がラテックス・ビーズ上に固定化され、可溶性トキシンＡによるこのビーズの凝集が可視化される。Ｗｉｌｋｉｎｓらの米国特許４，５３０，８３３号は、イオン交換クロマトグラフィー工程とそれに続く等電点沈殿を包含する細胞培養上清からのトキシンＡの精製方法を教示する。この特許は、不純トキシンＡ溶液のｐＨ及びモル濃度を、それぞれ、好ましくは５．５及び０．０１に調整することにより精製トキシンＡが達成されることを教示する。蛋白精製に等電点沈殿を用いることの不利な点の１つは、所望の蛋白質に類似する特性を有する他の蛋白質が凝集し、所望の蛋白質と共に沈殿して等電点沈殿を形成することである。このため、この沈殿は、再懸濁及び再遠心により洗浄しなければならない。これは、所望の蛋白質の損失を生じる。加えて、沈殿工程に先立つプロセス及び沈殿工程を含むプロセスは、沈殿工程を制御するために、非常に注意深く制御されなければならない。イオン交換カラムからの画分が注意深くかつむらなくプールされなければ、多少の蛋白質がトキシンＡと共に沈殿する。トキシンＡの精製に関する等電点沈殿の別の不利な点は、沈殿蛋白質のペレット化が高速で行われるとトキシンＡの変性が生じ得ることである。このため、この蛋白質は免疫検定において、又は抗体生成の免疫原として用いられる場合に活性ではなくなる。また、蛋白質の等電点沈殿は蛋白質の三次構造の変化を引き起こすことがある。特に、トキシンＡは非常に疎水性の蛋白質であり、幾つかの洗浄工程について低イオン強度バッファに晒すことは部分的な変性をもたらす結果となることがある。トキシンＡ精製の別の方法がＷｉｌｋｉｎｓらの米国特許５，０９８，８２６号に教示されている。この方法は、トキシンＡの不純溶液を、ヒト抗原Ｘ、Ｙ、又はＩの１以上の末端非還元構造特性を有する固定化試薬と接触させることを包含する。これらの構造は多糖類であることが知られており、それらを不溶性マトリックス、例えば、シリカゲル、アガロース、ラテックス・ビーズ等に結合することにより固定化することが可能である。トキシンＡはこの固定化試薬に結合し、次いでより純粋な形態で試薬から溶離する。この方法は、抗原Ｘ、Ｙ、又はＩの１つを要する。これらは入手するのに比較的高価であり、したがって、有用量のトキシンＡの実用的精製方法ではない。トキシンＡに対するポリクローナル抗体の生成は、当該技術分野において公知である。Ｅｈｒｉｃｈら、，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．２８：１０４１−４３（１９８０）は、Ｃ．ジフィシルを培養し、ウサギに接種して不純Ｃ．ジフィシル調製品に対するポリクローナル抗体を生成する手順を教示している。このようなポリクローナル抗体は、多数の蛋白質が培養上清中に存在するため、毒素に対して単一特異的ではない。したがって、毒素特異的ポリクローナルベースのＥＩＡの性能は、ポリクローナル抗血清の比較的低い毒素特異性力価及び高レベルの非特異的反応性のため、期待に背くものであった。したがって、Ｃ．ジフィシル・トキシンＡの診断及び検出のための迅速かつ正確な検定の他に、トキシンＡの精製方法が必要とされている。安定して純粋かつ変性していない蛋白質を生じ、多量の蛋白質の精製に用いることが可能なトキシンＡの精製方法が必要であることが、上記により理解できる。このように高純度の活性蛋白質によって産性された抗体は、それ自体、より活性が高いものである。発明の要約本発明は、クロストリジウム・ジフィシルからのトキシンＡの精製方法に向けられている。実質的に純粋なトキシンＡが提供され、これはトキシンＡに対する抗体の生成に有用である。したがって、本発明は抗体、特には、トキシンＡに対する高感受性を有するポリクローナル抗体にも向けられている。Ｃ．ジフィシル・トキシンＡの診断及び検出のためのキットも開示される。本発明のさらなる目的、利点及び新規の特徴は、一部は以下の説明において説明され、一部は以下を検証することにより当該技術分野における熟練者に明らかになり、又は本発明を実施することにより学ぶことができる。本発明の目的及び利点は、添付の請求の範囲において特に指摘される装置及び組み合わせにより実現し、かつ得ることが可能である。好ましい態様の詳細な説明Ｃ．ジフィシルによって引き起こされる偽膜性大腸炎を検出するための組成物及び方法が提供される。具体的には、トキシンＡの新規精製及び生成方法が開示される。さらに、Ｃ．ジフィシルのトキシンＡに特異的なポリクローナル抗体が提供される。これらの抗体は、Ｃ．ジフィシルの検出及び診断のための検定にその用途を見出す。定義ここで用いられる“実質的に純粋”又は“精製トキシンＡ”という用語は、トキシンＡ調製品が、当該技術分野において公知の分析技術によって試験した場合に、汚染物質を実質的に含まないことを示す。 “部分的に純粋”又は“部分的に精製されたトキシンＡ”という用語は、汚染物質が全てではないが幾らか除去されたトキシンＡ調製品を指す。 “活性トキシンＡ”という用語は、ＥＬＩＳＡ及びラテックス・ビーズ上に固定化された精製ウサギ抗−Ｃ．ジフィシル抗体を用いるラテックス凝集試験を含む、当該分野において現在用いられるトキシンＡ検定に対して陽性結果を示すトキシンＡを指す。 “変性”という用語は、その本来の、又は自然の構造もしくは特性を失った蛋白質、より具体的にはトキシンＡ、を指す。 “トキシンＡに対する単一特異性抗体”という用語は、トキシンＡ以外のＣ．ジフィシルの抗原に対するいかなる決定部位をも有していない抗体を指す。説明本発明は、高活性を有するトキシンＡの高度に再現可能な精製方法を包含する。本方法の再現可能性は、一般に、及び、特に抗原として用いられる蛋白質の精製に対して、蛋白精製方法の非常に望ましい特徴である。抗原調製品が純粋であるほど、精製される抗体はより特異的にその抗原に向かう。加えて、ＦＤＡの認可を申請する製品の調製に関与する方法にとって、再現性は最優先のものである。トキシンＡは、当該技術分野において周知の通りに培養することが可能なＣ．ジフィシル細胞によって産性される。以下の参考文献にはＣ．ジフィシルの培養が記述されており、これらは参照することによりここに組み込まれる：ＳｔｅｒｎｅおよびＷｅｎｔｚｅｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１７５−１８３（１９５０）；Ｅｈｒｉｃｈら、，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２８：１０４１−４３（１９８０)；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：１０３２ −４０。本発明は、固定化ポリクローナル抗体への未精製又は部分的に精製されたトキシンＡの可逆的な結合を包含する。ポリクローナル抗体を酸化し、次いで、ヒドラジド活性化アガロースゲルのようなヒドラジド基含有樹脂に結合又は固定化する。得られる固定化試薬は、トキシンＡに対して高度に選択的であり、精製試薬としてのその使用は高度に精製されたトキシンＡを生じる。この精製方法は、免疫親和性工程がトキシンＡに対して非常に選択的であり、かつ蛋白生成物がむらのない組成物、すなわち高純度及び高活性トキシンＡであるため、沈殿を用いる方法よりも再現性が高い。また、複数の、潜在的に変性を生じる洗浄及び再懸濁工程を必要としない。加えて、トキシンＡを樹脂に選択的に結合及び溶離するプロセスは、トキシンＡを恒久的に変性または不活性化することがない。したがって、本発明の精製された高活性のトキシンＡを用いることにより、より活性な単一特異性ポリクローナル抗体を生成することが可能である。本発明の方法は、免疫親和性樹脂が多くの用途に対して安定かつ再利用可能であるため、従来の免疫親和性法よりも経済的である。樹脂材料はかなり安価であり、免疫親和性樹脂はトキシンＡ含有溶液に結合抗体分子当たり２つのトキシンＡ結合部位を提供することにより高い結合性能を有する。本発明の精製方法は免疫親和性精製を包含する。免疫親和性精製の利点は、その手順の過程で蛋白質が遠心／再水和工程を受けないことである。したがって、この方法は制御され、非常に再現性が高い。クロストリジウム・ジフィシルの培養濾過液をここに記述されるように免疫親和性カラムに直接かけることができる。あるいは、免疫親和性カラムにかける前に、トキシンＡのさらなる精製工程を実施することができる。このような工程には、高速遠心とそれに続く濾過、硫酸アンモニウム沈殿のような沈殿、及びイオン交換、アフィニティ、またはサイズ排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーが含まれる。本発明の免疫親和性カラムはヒドラジド活性化アガロースを用いる。すなわち、抗体は多糖を介してヒドラジド活性化アガロースに固定化される。このような方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｏ’ ＳｈａｎｎｅｓｓｙおよびＷｉｌｃｈｅｋ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１−８（１９９０）；Ｄｏｍｅｎら、，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．，５１０：２９３−３０２（１９９０）；Ｐａｌｍｅｒら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：２３９３（１９６３）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０７６６（１９８２）を参照。これらの参考文献の全ては参照することによりここに組み込まれる。生物学的分子の精製へのヒドラジド基含有樹脂の使用は公知の技術である。前述のＯ’ＳｈａｎｎｅｓｓｙおよびＷｉｌｃｈｅｋを参照。アガロース・ビーズが末端ヒドラジド基を有するスペーサー・アームを備える市販調製品を利用することができる。これらのヒドラジド基は、炭水化物基の酸化によって生じるもののようなアルデヒド基と反応する。炭水化物基は、主として、抗体分子上のＦｃ領域に位置する。一方、抗原結合部位は抗体のＦａｂ領域に位置する。したがって、ヒドラジド基含有樹脂に結合している抗体は、これらの免疫親和性樹脂がより良好な親和性材料として機能し得るようにそれらの抗原結合部位の両者が抗原に供されるよう配向する。加えて、このようなヒドラジド−アガロースゲルの長いスペーサー・アームは、他のタイプの抗体−樹脂と比較して、抗原に対するより高い結合性能を可能とするように思われる。アセテート沈殿トキシンＡによって得られる抗体を免疫親和性精製トキシンＡによって得られる抗体と比較した場合、ＬＡＴにおいてラテックス上に固定化された精製抗体を用いると、免疫親和性精製トキシンＡに由来する抗体については約１２．５−２５ｎｇ／ｍｌの範囲の平均終点が見出されるのに対して、アセテート沈殿トキシンＡに由来する抗体では約２５−３５ｎｇ／ｍｌの平均終点が見出される。ＬＡＴはＥＬＩＳＡよりも厳密に制御される検定であり、より一貫した結果が得られる。ＬＡＴはＷｉｌｋｉｎｓらの米国特許４，８７９，２１８号及び５，０９８，８２６号並びにＬｙｅｒｌｙら、，Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，２１：１２−１４（1９８５）に記述される通りに行うことが可能であり、これらの開示は参照することによりここに組み込まれる。精製トキシンＡは、Ｃ．ジフィシルによって引き起こされる疾患の研究並びに診断試験及び治療計画の設計に有用である。特には、精製トキシンＡはトキシンＡに対する抗体の調製に必要である。この抗体は、上に引用される参考文献に記述されるもののような生物学的試料中のトキシンＡの存在を検出するためのＥＬＩＳＡ、ＬＡＴ、及び他の検出試験に用いられる。あらゆる免疫検定の開発において、最初に考慮されることは検定において用いられる抗血清の品質である。この抗血清が感受性ではないか、あるいは他の非所望もしくは関連蛋白質との交差反応性を有する場合には、その検定は所望の感受性を持たない。培養上清中にはＣ．ジフィシルによって発現される３０以上の蛋白質が存在する。最終トキシンＡ生成物中に存在するこれらの蛋白質のいかなるものも、抗原として用いられる生成物の有効性を消失させる。したがって、高度に純粋な変性していないトキシンＡを提供する、多量のトキシンＡを精製する改良法が必要である。トキシンＡに対して高度に特異的であり、かつ高度の再現性を有する経済的な生成方法が必要である。ここに開示されるように精製されるトキシンＡで適当な動物を免疫することにより、本発明によって単一特異性抗体を産性することが可能である。本発明のトキシンＡを用いてモノクローナル抗体を調製することも可能である。単一特異性ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ試験及びＬＡＴにおいて高い活性を示す。本発明のトキシンＡに対して生じた抗体は、ＬＡＴにおいて、アセテート沈殿トキシンＡに対して生じた抗体より２倍まで活性であった。本発明の第２態様において、この精製高活性トキシンＡを用いて、当該技術分野において公知の方法により、ポリクローナル抗体を産生することが可能である。例えば、Ｅｈｒｉｃｈら、，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．，２８：１０４１− ４３（１９８０）及びＥ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）に教示される方法を用いることができる。最初の工程はトキソイドの調製及びこのトキソイドを用いるウサギの免疫である。次いで、トキシンＡ−アジュバントを調製し、免疫に用いる。その後、集めた血清をプロテインＡで精製する。上記Ｃ．ジフィシル・トキシンＡの生成及び精製、並びに抗体の調製におけるその使用が以下の実施例により説明される。この実施例は制限することを意図するものではない。実験蛋白精製Ｓｔｅｒｎｅら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：１７５−１８３（１９５０）及びＬｙｅｒｌｙら、，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．１７：７２−７８（１９８３）（ここに組み込まれる）によって一般的に記述されるように、Ｃ．ジフィシルを、脳−心臓輪液（ＢＨＩ）ブロス培地中に懸垂された透析バッグ中の０．８５％塩化ナトリウム中で培養した。各々３００−５００ｍｌの０．８５％ＮａＣｌを保持する５つの透析バッグを、２０Ｌべルコ・スピンナー・フラスコ（ＢｅｌｌｃｏＳｐｉｎｎｅｒｆｌａｓｋ）中の１５ＬのＢＨＩブロス培地中に収容した。各チューブに、０．８５％塩化物で１：１０希釈した１８−２４時間培養物３ｍｌを接種した。細胞を嫌気的に約４日、３９℃＋／−１℃で培養した。２−８℃で、１０，０００ＲＣＦで３０分間遠心することにより細胞を沈降させた後、上清をデカントし、０．４５ミクロン・フィルターによる濾過により清透化した。ＰＴＨＫ１００，０００ＭＷパケット型限外濾過膜を備えるミニタン・ウルトラフィルトレーション・システム（ＭｉｎｉｔａｎＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）のような装置を用いて、培養上清を濃縮して洗浄した。この上清を、０．０２％ナトリウムアジドを含有する５０ｍＭトリス・バッファ、ｐＨ７．５の濾過培養上清の出発容量の２倍量を用いて洗浄した。洗浄後、洗浄した培養上清を約２５０−３００ｍｌに濃縮した。次に、洗浄し、かつ濃縮した培養上清をイオン交換クロマトグラフィーにかけた。よく機能するイオン交換樹脂はＤＥＡＥ−セファロースである。３００−４００ｍｌカラムを、５０ｍＭトリス・バッファ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌで、２−８℃で平衡化した。このカラムにトキシンＡ含有溶液をかけ、それによりトキシンＡが保持された。次いで、５０−２５０ｍＭＮａＣｌの勾配を用いて、溶離液を２８０ｎｍで監視しながら、蛋白質を溶離させた。０．０５ＡＵＦＳを超える吸光度を有する画分を、一方のディメンション（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）において画分を、かつ第２のディメンションにおいて参照抗−トキシンＡ抗体を用いて作動する交差ＩＥＰにかけた。粗製トキシンＡ画分をプールして集めた。これらの画分は、２−８℃で１週間、−２０℃でより長期間保存することが可能である。免疫親和性カラム免疫親和性分離カラムは、一般には、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌのＣａｒｂｏＬｉｎｋ^TMゲルについての１９８９製品情報冊子においてＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌによって教示される方法に従って調製する。２０ｍｇの親和性精製抗−トキシンＡ抗体を、等重量の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、１：１の組み合わせを室温で６０分間インキュベートすることにより酸化した。次いで、この混合物を、０．１ＭＮａＰｉ、ｐＨ７．０で平衡化し、実行する１．６× ２０ｃｍセファデックスＧ−２５カラムにかけた。溶離液を２８０ｎｍで監視し、蛋白質含有画分をプールした。ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌによって“ＣａｒｂｏＬｉｎｋ”の商標で販売されているヒドラジド基含有アガロース・ゲル・ビーズ２０ｍｌを同じバッファで洗浄した後、酸化抗体と結合させた。この混合物を室温で１６−１８時間インキュベートし、次いで小カラム（２．５×１０ｃｍ）を形成して、そこで同じバッファを用いて洗浄した。このカラムを２８０ｎｍで監視して未結合蛋白質を監視した。カラムを５床容積の脱イオン水、次いで５床容積の１ＭＮａＣｌ、さらに再度５床容積の脱イオン水で洗浄した。このカラムは、５０ｍＭＮａＣｌ及び０．０１％ナトリウムアジドを含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で平衡化し、そこに保存することが可能である。使用するために、この免疫親和性カラムを約１６０ｍｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で平衡化した。イオン交換カラムから取り出された部分的に精製したトキシンＡは、この免疫親和性分離カラムで以下のように精製することができる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質検定に基づき、７５ｍｇの粗製トキシンＡをカラムにかける。このカラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５を用いて、２８０ｎｍでカラム溶離液を監視しながら、ピークがカラムから溶出するまで洗浄及び作動させる。カラムを、２８０ｎｍでの溶離液の結果を監視しながら、１％ツィーン２０を含有する１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７で洗浄した。精製トキシンＡはカラムから１ピークとして溶離し、これを５０ｍ１の０．２５Ｍトリス、ｐＨ８．０を収容する容器に集めた。精製トキシンＡの蛋白質濃度をＢＣＡ検定で測定した。この蛋白質溶液を、ＹＭ３０メンブランを備えるアミコン・シングル・チャネル・コンセントレーター（ＡｍｉｃｏｎＳｉｎｇｌｅＣｈａｎｎｅｌＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）モデル８０５０のようなアミコン濃縮器を用いて、１．２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製トキシンＡは−２０℃で１年まで保存することができる。カラム再生この免疫親和性カラムは少なくとも２０回まで再利用することが可能である。トキシンＡがカラムから溶出した後、カラムを１００−１５０ｍｌの１ＭＮａＣｌ、次いで１００ｍｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で洗浄する。次いで、カラムを０．０１％ナトリウムアジドを含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で平衡化し、これを２−８℃で再利用の準備ができるまで保存することができる。トキシンＡ抗体トキシンＡに対する抗体の調製は、一般には、Ｅｈｒｉｃｈら、，Ｉｎｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍｕｎ．２８，１０４１−１０４３（１９８０）（ここに組み込まれる）の方法によって行った。ウサギに対する精製トキシンＡの毒性のため、ウサギを精製トキシンＡで最初に免疫することは不可能であるが、むしろトキシンＡのトキソイドで最初に免疫しなければならない。トキソイドは、その毒性は破壊されるが、注射により抗体の形成を誘発することを可能とするように処理した毒素である。トキソイドは、免疫親和性カラムから精製したトキシンＡをホルムアルデヒドと混合することにより調製した。１ｍｌの１．２ｍｇ／ｍｌトキシンＡを５ｍｌの無菌生理食塩水で希釈した。１ｍｌの３７％ホルムアルデヒドを８．２５ｍｌの無菌生理食塩水で希釈した。調製した４％ホルムアルデヒド溶液６ｍｌを希釈したトキシンＡに添加し、この混合物を３７℃ ＋／−２℃の水浴中で１８ないし２４時間インキュベートした。このトキソイド −トキシンＡ溶液を等容量のフロイントアジュバントと混合し、この溶液をウサギの免疫に用いた。最初の２回の注射にはフロイント完全アジュバントを用い、その後はフロイント不完全アジュバントを用いた。表１に示される免疫スケジュールをトキソイド免疫に用いた。各免疫の前日に新鮮なトキソイドを調製するべきである。一度トキソイドとフロイントアジュバントとのエマルジョンを調製したならば、それは２時間以内に注射するべきである。＊ＰＯＰ＝ポピティール（ｐｏｐｉｔｉｅｌ）＊ＩＭ＝筋肉内第３６日に各々のウサギから血液を集め、ＥＬＩＳＡ検定を用いて抗−トキシンＡ力価を測定した。１：５０００より大きいか、等しい終点が許容し得るものと考えられた。力価が許容し得るものではなかった場合には、別のトキソイド注射でウサギに追加免疫し、第４４＋／−１日に力価を再試験した。一度トキシンＡのトキソイドに対する防御力価が達成されたら、ウサギを精製トキシンＡに対して免疫することが可能である。トキシンＡを無菌生理食塩水で約０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、この溶液をフロイント不完全アジュバントで約０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。各々のウサギをこの溶液１ｍｌで免疫した。ウサギを表２の免疫スケジュールに従って免疫した。免疫スケジュールのおおよそ第２７日に、これらの動物を、上述の通りに、抗体力価について試験した。力価が１：４０，０００をほぼ満足する高さ、またはこれよりも高い場合には、ウサギから採血し、血清を集めた。必要である場合には、高速遠心及び／又は濾過により前述の方法で調製された血清を清透化し、次いで、７０％硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。沈殿したグロブリンを２０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７．４に再懸濁した後、プロテインＡカラムで精製した。ラテックス−結合抗体の調製ラテックス凝集試験において用いるため、以下の手順を用いて抗体をラテックスに結合させる。ウサギ抗−Ｃ．ジフィシルトキシンＡ抗体を調製し、０．０１％ナトリウムアジドを含有する２０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ６．０で透析した。この溶液の蛋白質濃度を約２．０ｍｇ／ｍｌに調整した。５０ｍｌの２．５％（ｗ／ｖ）固体カルボキシル化ポリスチレンラテックスを４本の２５０ｍｌ遠心ボトルに収容した。７０ｍｌの２０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ６．０を各ボトルに添加し、これらのボトルを１１，０００ＲＣＦで３０−４０分間遠心した。液体を注ぎ出し、ビーズを１２０ｍｌの同じバッファに再懸濁した。（全てのラテックス懸濁液について、ラテックスは最初に最小容量のバッファに再懸濁しなければならない。）前と同様にボトルを遠心し、洗浄工程を繰り返した。次いで、ビーズを同じバッファ１２０ｍｌに再懸濁し、５０ｍｇの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩及び１２．５ｍｇのスルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドを各ボトルに添加した。このラテックス懸濁液を、攪拌しながら、室温で２時間インキュベートした。１１，０００ＲＣＦで３０−４０分間遠心することにより懸濁液をペレット化して上清を注ぎ出し、ペレットの各々を１２０ｍｌの２０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ６．０に再懸濁した。この懸濁液を前と同様にペレット化し、この工程を繰り返した。１５ｍｇのバッファを交換した抗体をラテックス懸濁液の各々に添加し、得られたラテックス−抗体懸濁液を攪拌しながら室温で１８−２０時間インキュベートした。懸濁液の各々に２．５ｍｌの１Ｍ２−アミノエタノールを添加し、得られた溶液を攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、このラテックス−抗体を１０，０００ＲＣＦで３０−４０分間ペレット化して上清をデカントし、ペレットの各々を０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．２５％ツィーン２０、０．２％ナトリウムアジド、及び０．２％ＢＳＡを含有する２５０ｍｌの０．１Ｍグリシン −ＮａＯＨ、ｐＨ８．２に再懸濁した。このラテックス−抗体を１０，０００ＲＣＦで３０−４０分間ペレット化し、この工程を繰り返した。ＬＡＴ遠心管内で１容量のトキシンＡ含有溶液を０．５ｍｌ検体バッファと混合し、３０秒間渦攪拌した。次いで、この管を最低１５００×ｇで１５分間遠心した。典型的なＬＡＴ試験カードを用いて、３５μｌの検体上清を試験カードの試験円に置き、３５μｌを陰性円に置いた。３５μlのＣ．ジフィシル培養濾過液を陽性円に置いた。３５μｌのトキシンＡ固定化ラテックス・ビーズを試験及び陽性円に置いた。３５μｌの正常ウサギ抗体固定化ラテックス・ビーズを陰性円に置いた。各円の内容物を分離アプリケーター・スティックで混合し、各円の表面全体に広げた。臨床用ローテーターを用いて、１００ｒｐｍで意図する時間、試験カードを回転させた。蛍光の下で顕微鏡により試験結果を読み取った。抗体の活性表３は、アセテート沈殿トキシンＡに対して生じた抗体と免疫親和性精製トキシンＡに対して生じた抗体との比較の結果を示す。トキシンＡ試料はアセテート沈殿によって調製した試料である。抗体は上記説明に従って調製した。休止期間の後、ウサギを２週間毎に採血し、その血液を上述の通りに精製し、上述の通りにラテックス・ビーズに結合させた。上述のＬＡＴ手順を抗体の比較に用いた。これらのデータから理解されるように、本発明に従って調製されてラテックス凝集試験に用いられた抗体により、平均終点１２．５−２５ｎｇ／ｍｌの結果が得られた。アセテート沈殿を用いて調製された抗体では、平均終点２５−３５ｎｇ／ｍｌの結果が得られた。前述の本発明の好ましい態様の説明は、説明及び記述の目的で提示されている。これが全てであることを、あるいは発明を開示される形態そのものに限定することを意図するものではなく、上述の教示に照らして、明らかに多くの変形及び変種が可能である。発明の範囲はここに添付される請求の範囲によって定義されることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．クロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡの精製方法であって、トキシンＡ抗体をヒドラジド基含有マトリックスに結合させ；トキシンＡを含有する溶液を、該トキシンＡが該結合抗体マトリックス上に選択的に保持されるように該マトリックスと接触させ；及び精製トキシンＡを該抗体マトリックスから溶離する、ことを包含する方法。２．前記抗体がウサギから生成されたポリクローナル抗体である請求項１の方法。３．前記ポリクローナル抗体がプロテインＡで精製される請求項２の方法。４．前記抗体がメタ−過ヨウ素酸ナトリウムで酸化される請求項１の方法。５．前記マトリックスがヒドラジド活性化アガロース・ビーズである請求項１の方法。６．前記結合抗体マトリックスがカラムに形成される請求項１の方法。７．クロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡの精製方法であって、クロストリジウム・ジフィシル細胞を培養し；該細胞培養物の固体から上清を分離し；イオン交換カラムで該上清を部分的に精製してトキシンＡ強化溶液を生じ；及び該部分的に精製されたトキシンＡ含有溶液を、ヒドラジド基含有マトリックスに結合する抗−トキシンＡ抗体を含む免疫親和性カラムで精製する、ことを包含する方法。８．請求項１の方法によって調製されるクロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡ。９．トキシンＡ含有溶液からヒドラジド基含有樹脂上にトキシンＡを選択的に保持し、該樹脂から精製トキシンＡを選択的に溶離することにより調製されるクロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡ。１０．ヒドラジド基含有樹脂に結合する抗−トキシンＡ抗体を含む免疫親和性カラムで精製されるトキシンＡに応答して生成されるクロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡ抗体であって、トキシンＡに対して単一特異性である抗体。１１．抗体がウサギにおいて生成される請求項１０による抗体。１２．ヒドラジド基含有樹脂がヒドラジド活性化アガロースである請求項１０による抗体。１３．請求項１の方法により生成されるトキシンＡでウサギを免疫することにより生成されるクロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡ抗体。１４．密封状態に収容することに特殊化されている、クロストリジウム・ジフィシル・トキシンＡを検出するためのキットであって、固定に共有結合しているトキシンＡに特異的な抗体を具備し、該抗体がヒドラジド基含有樹脂に結合している抗−トキシンＡ抗体を含む免疫親和性カラムで精製されるトキシンＡに応答して調製されるキット。１５．前記固定がラテックスである請求項１４のキット。１６．前記抗体が単一特異性ポリクローナル抗体である請求項１４のキット。１７．患者においてＣ．ジフィシル・トキシンＡの存在を検出する方法であって、該患者からの試料をポリクローナル抗体を有するラテックス粒子と接触させ；及び凝集の存在または非在を観察することを包含し、ここで、該ポリクローナル抗体が、ヒドラジド基含有樹脂に結合しているトキシンＡ抗体を含む免疫親和性カラムで精製されるトキシンＡを用いるウサギの免疫により調製される方法。